KR20200085024A

KR20200085024A - 천연물질의 선택적 추출 방법

Info

Publication number: KR20200085024A
Application number: KR1020190001031A
Authority: KR
Inventors: 표재성; 김민우; 박남규; 이성미
Original assignee: 주식회사 디네이쳐
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2020-07-14
Also published as: WO2020141891A1; CN113226345B; KR20210055665A; US11752450B2; KR102298839B1; JP2022518111A; CN113226345A; EP3888668A1; EP3888668A4; US20220073484A1

Abstract

비극성 천연물질의 추출 방법이 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 비극성 천연물질의 추출 방법은, 천연물 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조하는 단계, 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하는 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다. 따라서, 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용하여 고효율로 비교적 용이하게 추출할 수 있다.

Description

천연물질의 선택적 추출 방법{METHOD OF SELECTIVE EXTRACTING NATURAL MATERIAL}

본 발명은 선택적인 천연물질의 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연물 중 선택적인 성분(비극성/극성, 난용성/수용성, HLB) 또는 물질을 물리적인 유화를 유도해 빠르게 용해 및 가용화시켜 추출하고 농축/분리 하는 기술에 관한 것으로 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용한 선택적 천연물질의 추출방법에 관한 것이다.

추출(extraction)이란 고체 또는 액체 형태의 원료에 함유된 성분을 용제로 용해하여 분리하는 것으로, 일반적인 추출 방법으로 원료가 고체인 경우 고-액 추출 방법을 사용하며, 원료가 액체인 경우 액-액 추출 방법을 사용한다.

액-액 추출 방법(liquid-liquid extraction; LLE)은 용질을 함유하고 있는 액체 혼합물에 용제를 작용시켜 혼합물 중의 특정 성분을 다른 성분들로부터 분리하는 것이다.

천연물질 내 비극성 물질을 추출하기 위하여, 일반적으로 액-액 추출 방법이 사용되며, 액-액 추출시 핵산(hexane), 클로로포름(methane dichloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등과 같이 비극성 용매는 독성이 매우 강하며, 반복적인 여러 추출 과정 그리고 비극성 용매 제거를 위한 건조 과정에 의하여 추출 과정이 매우 비효율적이고 복잡하며 공정이 길고, 추출 효율이 낮고 공정이 길어짐에 따라 높은 생산 단가를 나타내는 문제점이 있다.

예를 들어, 중대가리풀(Centipeda minima)로부터 Brevilin A를 추출하기 위한 과정은, 원료를 메탄올로 복수 회에 걸쳐 추출하고, 추출액에 헥산을 혼합하여 분획 복수 회, 클로로포름을 혼합하여 분획 복수 회, 에틸아세테이트를 혼합하여 분획 복수 회, 부틸알코올을 혼합하여 분획 복수 회를 통하여 추출하며, 추출시 중대가리풀 건조 중량 300g에서 Brevilin A는 25mg 정도 추출되어 그 추출량이 극미량으로 효율이 매우 낮다.(비특허문헌1)

다른 추출 방법으로 실험 결과, 레진 추출의 경우 추출 효율이 더 낮은 것으로 나타났고, 비누화/불검화 추출의 경우 역시 추출이 안되거나 추출 효율이 매우 낮은 것으로 나타났다.

중대가리풀의 추출물에 관하여 특허문헌 1에 개시되어 있고, 여기에서는 초임계 이산화탄소 추출법으로 천연물질을 추출하였으나, 이러한 추출법은 사용되기 위한 조건이 복잡하고 추출 시간이 상당시간 소요되며, 추출 효율 역시 매우 낮은 문제점이 있다.

이에 천연물 등에서, 비극성을 가지는 천연물질을 용이하게 고효율로 추출하여 그 추출물을 용이하게 활용할 수 있는 신규한 추출 방법의 개발이 필요하다.

특허문헌 1: 중국 등록특허공보 104840457 B

비특허문헌 1: Arch Pharm Res Vol 29, No 1, 64-66, 2006.

본 발명의 실시예들은 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용하여 천연물질을 추출하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 천연물질을 선택적으로 추출하는 방법에 따르면, 천연물 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조하는 단계, 1차 추출액에 비이온성 계면활성제, 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하는 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상분리된 용액의 상층은 친유성 가용화제 및 비극성 천연물질을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 비극성 천연물질은 Brevilin A 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 비극성 천연물질은 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 천연물 원료는 중대가리풀(Centipeda minima), Arnica 속 식물 및 Helenium 속 식물로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상분리 조성물은, 친유성 가용화제 10 내지 90중량%; 및 물 10 내지 90중량%를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상분리 조성물은 70 중량% 이하의 비이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 천연물질을 선택적으로 추출하는 방법에 따르면, 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 이용하여 천연물 원료로부터 상분리된 추출액을 제조하는 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 실시예들은 야생초 등의 원료로부터 천연물질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 특히 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용하여 고효율로 비교적 용이하게 추출할 수 있다.

또한, 독성 용매를 사용하는 액-액 추출법을 사용하지 않음으로 인하여 건조 등의 단계를 생략할 수 있으며, 용매가 인체에 무해한 물질이므로 천연물질이 함유된 추출액을 분리하여 즉시 다른 단계없이 바로 제품으로서 사용이 가능하며, 마이크로 에멀전화 또는 한계미셀농도로 인하여 제품의 흡수율을 증가시킬 수 있다.

도 1A는 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물질의 선택적 추출 방법에 관하여 설명하기 위한 도면이다.
도 1B는 기존 천연물질의 추출 방법인 액-액 추출 방법에 관하여 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 상분리 조성물의 조성 비율을 설명하기 위한 3상 상태도이다.
도 3은 본 발명의 실시예들에 따른 상분리 조성물의 조성을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예들에 따른 상분리 조성물을 이용하여 추출액을 상분리시킨 상태를 설명하기 위한 사진들이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 상분리된 상태를 촬영한 사진(좌)과 상층을 분리하여 Labrasol을 추가로 혼합하여 마이크로 에멀전화시킨 최종 처방을 촬영한 사진(우)이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 1차 추출액을 연속 희석(serial dilution)한 후, 상분리 조성물을 이용하여 상분리시킨 상태를 설명하기 위한 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 상분리 조성물의 거동을 설명하기 위한 도면이다.
도 8 및 도 9A 내지 9E는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 남성이 18일 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다.
도 10 및 도 11A 내지 11B는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 여성이 18일 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다.

이하, 본 발명의 실시예들에 따른 비극성 천연물질의 추출 방법, 이에 따라 추출된 천연물질 및 이의 용도 등에 대하여 설명하기로 한다.

그에 앞서, 본 명세서에 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 그리고, 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 '포함' 또는 '함유'의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 또는 성분의 부가를 제외시키는 것은 아니다.

본 발명에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는 데 사용되며, 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 천연물질의 추출 방법은 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)으로 지칭한다.

본 발명의 실시예에 다른 비극성 천연물질의 추출 방법은, 천연물 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조하는 단계, 1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하는 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다.

용해-유화 추출법에 따르면, 천연물 원료 내 비극성 천연물질을 추출하여 상분리 조성물을 혼합하여 용해 및 유화시킨 후, 상분리를 통하여 비극성 천연물질을 추출한다.

도 1A는 본 발명의 일 실시예에 따른 천연물질의 선택적 추출 방법에 관하여 설명하기 위한 도면이다. 도 1B는 기존 천연물질의 추출 방법인 액-액 추출 방법에 관하여 설명하기 위한 도면이다.

앞서 설명한 바와 같이, 천연물질 내 비극성 물질을 추출하기 위하여, 일반적으로 액-액 추출 방법이 사용되며, 액-액 추출시 용매들은 핵산(hexane), 클로로포름(methane dichloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등과 같이 비극성 용매로서 독성이 매우 강하며, 추출 과정이 복잡하고, 추출 효율이 낮아 높은 생산 단가 및 공정이 길어지는 문제점이 있다.

먼저 천연물 원료를 물로 세척하여 건조한다. 이때에, 예를 들어, 천연물질의 추출율을 높이기 위하여 건조된 원료를 분쇄하여 분말로 제조할 수 있다.

본 발명에 일 실시예에 있어서, 상기 천연물 원료는 중대가리풀(Centipeda minima), 삼푸트리(Litsea glutinous), Arnica 속 식물 및 Helenium 속 식물을 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 사용된 천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하여 사용하였다.

아불식초(중대가리풀, Centipeda minima)에 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌은 다수 발견되었으며, 일부 문헌에 샴푸트리(Litsea glutinous)에도 Brevilin A가 함유되어 있다고 보고한 문헌이 존재한다. 뿐만 아니라, Arnica 속 식물(Arnica longifolia , Arctium lappa , Arnica chamissonis subsp . Foliosa , Arnica chamissonis Less.) 및 Helenium 속 식물(Helenium autumnale L, Helenium alternifolium, Helenium pinnatifidum , Helenium vernale , Helenium brevifolium , and Helenium flexuosum)에도 일부 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌이 발견되었다.

예를 들어, 상기 천연물 원료들, 특히 중대가리풀은 비극성 천연물질인 Brevilin A 또는 이의 유도체를 포함하고 있다. 중대가리풀로부터 추출된 비극성 천연물질은 Brevilin A와 다양한 이의 유도체 화합물을 포함하고 있다.

중대가리풀로부터 추출된 유효성분인 상기 비극성 천연물질은 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제할 수 있다.

Brevilin A는 천연물질로서, 암세포에서 JAK(janus kinase activity)를 저해하고, STAT3 신호 전달을 억제하는 것은 널리 알려져 있다(PLoS One 8 (5) (2013) e63697).

즉, Brevilin A는 JAK-STAT 신호전달을 저해 및 억제하여, 류마티스관절염 등 자가면역 질환에 효과가 있다.

문헌 전반적으로 Brevilin A는 중대가리풀의 주요 성분이며, 이를 이용한 항암 활성에 대한 연구가 주로 이루어졌으나, 탈모 및 발모에 관한 연구는 부재한 실정이다.

예를 들어, Brevilin A는 JAK-STAT 신호전달과정의 저해 또는 억제함으로써 감기, 개창, 당뇨, 명목, 백태, 비색증, 비염, 창종, 천식, 축농증, 피부염, 학질, 해수, 해열 및 백일해(소아질환) 뿐만 아니라 류마티스 관절염과 암 또는 종양을 포함하는 자가면역 질환 및 장년성 탈모, 결발성탈모, 원형탈모, 신경성탈모, 비강성탈모, 트리코틸로 마니아, 악성탈모, 여성형탈모, 남성형 탈모, 안드로겐성탈모, 휴지기탈모, 두부백선, 전두탈모, 감모증, 유전성탈모 또는 전신탈모 등 자가면역 질환의 치료에 효과를 나타낼 수 있다.

예를 들어, 상기 비극성 천연물질은 하기의 화합물들 중 어느 하나 이상을 포함하며, 이는 Brevilin A 및 이의 유도체들의 화학 구조를 나타낸 것이다(P. Wu et al. / Phytochemistry 76 (2012) 133-140).

천연물 원료에서 천연물질을 추출하여 1차 추출액을 제조한다.

추출용매는 물, 알코올 등 여러 용매를 선택하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 알코올을 사용하였다. 바람직하게는 메탄올, 에탄올을 사용할 수 있다.

예를 들어, 추출은 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류냉각 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 초음파 추출법, 용출법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 추가적으로 통상의 분획 공정을 수행할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 추출은 천연물 원료를 알코올에 담궈 100℃ 이상의 온도에서 약 1시간 정도 열수 추출할 수 있으며, 알코올은 약 80%의 알코올을 사용할 수 있다. 예를 들어, 천연물 원료는 중대가리풀 자체를 사용하거나, 이를 분쇄한 분말을 사용할 수 있다.

예를 들어, 열수 추출에 따른 1차 추출액을 감압 농축하여 알코올 성분을 제거하는 단계를 선택적으로 진행할 수 있다. 농축하는 단계를 거치지 않은 1차 추출액을 이용하여 바로 다음 단계로 넘어가더라도 본 발명을 달성하는데 차이는 없으나, 보다 명확한 상분리 및 추출 효율의 측면에서 불필요한 알코올 성분을 제거하는 것이 바람직하다.

중대가리풀 건초 10g을 80% 에탄올 400mL으로 열수 추출 하여 380mg의 추출액을 분석한 결과, 추출액에 26mg의 Brevilin A를 함유하고 있음을 확인하였다(건초 대비 0.26%의 함량).

상기 1차 추출액에 상분리 조성물을 첨가하여 혼합한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 상분리 조성물의 조성 비율을 설명하기 위한 3상 상태도이다. 도 3은 본 발명의 실시예들에 따른 상분리 조성물의 조성을 설명하기 위한 도면이다. 도 4는 본 발명의 실시예들에 따른 상분리 조성물을 이용하여 추출액을 상분리시킨 상태를 설명하기 위한 사진들이다. 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 상분리 조성물의 거동을 설명하기 위한 도면이다.

상기 상분리 조성물은 친유성 가용화제 및 물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상분리 조성물은, 친유성 가용화제 10 내지 90중량%; 및 물 10 내지 90중량%를 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 상분리 조성물은 비이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 상기 상분리 조성물은 비이온성 계면활성제를 40 중량% 이하로 포함할 수 있다.

도 2 및 도 3을 참조하면, 도 2에는 본 발명의 상분리 조성물의 성분에 따라 혼합액에 나타나는 상태를 도시한 것이며, 친유성 가용화제, 비이온성 계면활성제 및 물의 조성비에 따라 상분리(Phase separation), 마이크로 에멀전(Microemulsion), 에멀전(emulsion)으로 용액의 상태가 변화함을 나타낸다. 도 2에서 Labrafac은 친유성 가용화제의 하나이고, Labrasol은 비이온성 계면활성제의 하나이다.

도 2의 3상 상태도를 기반으로 상분리 되는 영역의 조성비에 따라 본 발명의 상분리 조성물의 조성비를 설정하였다. 본 발명의 실시예들에 따른 상분리 조성물들은 특정 물질과 혼합하여 에멀전화되지 않고 서로 층이 분리되는 성질을 나타낸다.

따라서, 천연물 원료 내에 함유된 비극성 천연물질은 1차 추출된 이후에, 상분리 조성물과 혼합하여 친유성 가용화제와 비극성 천연물질이 하나의 층에, 그리고 나머지 물 및 기타 성분이 다른 층에 함유되어 상분리가 일어난다.

본 발명의 실시예들은 천연물 중 선택적인 성분(비극성/극성, 난용성/수용성, HLB) 또는 물질을 물리적인 유화를 유도해 빠르게 용해 및 가용화시켜 추출하고 농축/분리 하는 기술에 관한 것으로 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용한 선택적 천연물질의 추출방법에 관한 것이며, 이를 활용하여 비극성/극성 물질, 난용성/수용성 물질 또는 높은 HLB/낮은 HLB를 가지는 물질들이 혼합되어 있는 혼합물에서, 선택적으로 어느 하나의 성질을 가지는 물질을 추출하거나 이와 반대로 제거할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 상분리 조성물이 비이온성 계면활성제를 포함하는 경우, 상기 상분리 조성물을 혼합하는 단계에서, 보다 명확한 상분리를 위하여 승온시키며 혼합할 수 있다. 예를 들어, 상분리 조성물을 1차 추출액에 혼합한 혼합물을 30 내지 50℃의 온도를 유지하면서 교반할 수 있으며, 바람직하게는 35 내지 45℃의 온도를 유지하면서 교반할 수 있다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 상분리 조성물의 거동을 설명하기 위한 도면이다. 도 7을 참조하면, 1차 추출액에 상기 상분리 조성물과 혼합하게 되면 Brevilin A 및 이의 유도체, 즉 비극성 천연물질이 비이온성 계면활성제 내지 친유성 가용화제에 추출 및 용해된다. 이때 추가로 고속 혼합을 하면 혼합물 내 계면활성제 및 가용화제의 표면적이 증가하면서 추출 내지 용해되지 않은 일부 비극성 천연물질이 대부분이 용해되어 순간적인 한계미셀농도(critical micelle concentration; CMC) 상태가 되며, 이때, 혼합액의 온도가 증가함에 따라 클라우드 포인트(cloud point)를 다다르게 되면, 이온성 계면활성제와 달리 비이온성 계면활성제는 온도의 증가에 따라 용해도가 감소하므로, 혼합액의 상분리가 보다 더 명확히 나타나게 된다.

특히, 승온시켜 상분리 시키는 방법은 HLB(hydrophile-lipophile balance) 값이 비교적 높은 비이온성 계면활성제, 예를 들어, HLB 값이 12 이상인 Labrasol 등의 첨가시 유리하게 작용할 수 있다.

예를 들어, 상기 비이온성 계면활성제는 Labrasol, Crodex A-PA-(RB), Geleol, Gelot 64, Suppocire AS2X, Suppocire BML, Synperonic PE/F 127, Synperonic PE/L 44, Tefose 63 및 Oleic acid로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG) 및 Vitamin E TPGS로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득한다. 상분리된 용액을 일정시간 방치한 후, 원심분리기를 이용하여 필터(filter)하였다.

상기와 달리, 본 발명의 다른 실시예에 따른 천연물질을 선택적으로 추출하는 방법에 따르면, 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 이용하여 천연물 원료로부터 상분리된 추출액을 제조하는 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다.

즉, 상기 실시예는 천연물 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조한 후, 상분리 조성물을 혼합하여 분리하는 방식의 2단계가 아닌, 천연물 원료에 추출용매와 상분리 조성물을 함께 혼합하여 추출하는 방식으로 단일 단계로 추출 및 분리를 진행한다. 이와 같은 방식으로 추출시 추출 공정 단계 및 시간을 단축할 수 있다.

상기의 방법들에 따라 추출된 비극성 천연물질을 포함하는 상분리층에 상기 상분리 조성물의 범위를 벗어난, 마이크로 에멀전 범위의 에멀전화 조성물을 추가로 혼합하여, 에멀전화된 제품을 제조할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따라 추출된 천연물질 및 이를 포함하는 조성물 등의 제품은 독성 용매를 사용하는 액-액 추출법을 사용하지 않음으로 인하여 건조 등의 단계를 생략할 수 있으며, 용매가 인체에 무해한 물질이므로 천연물질이 함유된 추출액을 분리하여 즉시 다른 단계없이 바로 제품으로서 사용이 가능하며, 마이크로 에멀전화 또는 한계미셀농도(CMC)로 인하여 제품의 흡수율을 증가시킬 수 있다.

일반적으로 계면활성제의 사용은 계면활성제의 CMC를 이용하여 화합물의 용해도를 높여 흡수율을 증가시키게 되며, 마이크로 에멀전도 용해도 높이는 것 뿐만 아니라 흡수시키려는 물질의 사이즈를 감소시켜 흡수 사이트에서의 흡수율을 증가시킬 수 있다.

이와 같이 제조된 제품은, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클랜징폼, 헤어오일, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용웨이브제, 모발탈색제, 헤어젤, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스, 헤어스프레이 등의 제품, 피부외용제로서 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제와 카타플라즈마제 등의 제형으로 제조될 수 있고, 액상, 고체상, 기체상으로 적절히 활용될 수 있다.

이와 같은 제품은 Brevilin A 및 이의 유도체들의 효과를 적용할 수 있는 다양한 질환 개선에 효과적이며, 예를 들어, 감기, 개창, 당뇨, 명목, 백태, 비색증, 비염, 창종, 천식, 축농증, 피부염, 학질, 해수, 해열 및 백일해 (소아질환) 뿐만 아니라 류마티스 관절염, 루푸스와 암 또는 종양을 포함하는 자가면역 질환 및 장년성 탈모, 결발성탈모, 원형탈모, 신경성탈모, 비강성탈모, 트리코틸로 마니아, 악성탈모, 여성형탈모, 남성형 탈모, 안드로겐성탈모, 휴지기탈모, 두부백선, 전두탈모, 감모증, 유전성탈모 또는 전신탈모 등 자가면역 질환의 치료에 효과를 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명의 비극성 천연물질의 추출 방법에 관한 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하도록 한다.

본 발명의 추출 방법은, 천연물 원료를 열수 추출하고, 추출액에 상분리 조성물을 혼합하여 상분리 시킨 후, 일부 층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득한다.

실시예

천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하고, 세척 및 건조하였다.

중대가리풀 건초 10g을 80% 에탄올 400mL으로 열수 추출 하여 1차 추출액을 얻었다. 이후, 1차 추출액을 감압 농축하여 에탄올을 제거하였다.

감압 농축한 1차 추출액 및 상분리 조성물을 하기 표 1의 조성비에 따라 혼합한 후, 10분 간 교반하였다. 하기 표 1은 도 3의 도면에 대응되는 조성물들의 조성에 대응되는 설명이다. L1은 실시예1, L2는 실시예2에 대응되며, 이하 동일하다.

이후, 60분간 방치한 후, 상분리된 상층액을 분리하였다. 상기 상분리된 혼합액을 관찰한 결과는 도 4에 나타내었으며, 도 4는 상분리가 일어난 실시예8, 19, 29의 혼합액을 나타낸 사진이다.

	비이온성 계면활성제(중량%) - Labrasol	친유성 가용화제(중량%) - Labrafac	1차 추출액(중량%)	교반 방식
실시예1	0.4	0.5	0.1	Vortex mixer
실시예2	0.4	0.4	0.2	Sonication
실시예3	0.4	0.3	0.3	mechanical overhead stirrer
실시예4	0.3	0.2	0.5	homogenizer
실시예5	0.3	0.3	0.4	homogenizer
실시예6	0.3	0.4	0.3	순환형 인라인믹서
실시예7	0.3	0.5	0.2	순환형 인라인믹서
실시예8	0.3	0.6	0.1	순환형 인라인믹서
실시예9	0.2	0.3	0.5	순환형 인라인믹서
실시예10	0.2	0.2	0.6	순환형 인라인믹서
실시예11	0.2	0.3	0.5	순환형 인라인믹서
실시예12	0.2	0.4	0.4	순환형 인라인믹서
실시예13	0.2	0.5	0.3	순환형 인라인믹서
실시예14	0.2	0.6	0.2	순환형 인라인믹서
실시예15	0.2	0.7	0.1	순환형 인라인믹서
실시예16	0.1	0.1	0.8	순환형 인라인믹서
실시예17	0.1	0.2	0.7	순환형 인라인믹서
실시예18	0.1	0.3	0.6	순환형 인라인믹서
실시예19	0.1	0.4	0.5	순환형 인라인믹서
실시예20	0.1	0.5	0.4	순환형 인라인믹서
실시예21	0.1	0.6	0.3	순환형 인라인믹서
실시예22	0.1	0.7	0.2	순환형 인라인믹서
실시예23	0.1	0.8	0.1	순환형 인라인믹서
실시예24	0	0.9	0.1	순환형 인라인믹서
실시예25	0	0.8	0.2	순환형 인라인믹서
실시예26	0	0.7	0.3	순환형 인라인믹서
실시예27	0	0.6	0.4	순환형 인라인믹서
실시예28	0	0.5	0.5	순환형 인라인믹서
실시예29	0	0.4	0.6	순환형 인라인믹서
실시예30	0	0.3	0.7	순환형 인라인믹서
실시예31	0	0.2	0.8	순환형 인라인믹서
실시예32	0	0.1	0.9	순환형 인라인믹서

상층액 내 Brevilin A의 함량을 HPLC(Water 2960 HPLC)로 분석하였다. HPLC 분석 조건은 아래 표 2와 같다.

항목	조건
Column	SUPERSIL COLUMN ODS-I, 4.6 X 250mm, 5㎛
Mobilie phase	Solvent A (45%)	Solvent B (55%)
	0.1% formic acid in water	Methanol
Oven temp.	40℃
Flow rate	1ml/min.
Injection volume	20㎕
Run time	30 min.
Wave length	224nm

이에 따른 각 실시예별 Brevilin A 함량은 표 3에 나타내었다.

중대가리풀 건초 10g을 80% 에탄올 400mL으로 열수 추출 하여 380mg의 추출액을 HPLC로 분석하였으며, 추출액에 26mg의 Brevilin A를 함유하고 있음을 확인하였다(건초 대비 0.26%의 함량).

	상층액 Brevilin A 함량 (mg)	추출액 대비 분리된 상층액 Brevilin A 함량비 (%)
실시예1	15.37	59.12
실시예2	11.25	43.27
실시예3	10.15	39.04
실시예4	20.98	80.69
실시예5	8.72	33.54
실시예6	10.91	41.96
실시예7	12.83	49.35
실시예8	9.97	38.35
실시예9	15.71	60.42
실시예10	9.17	35.27
실시예11	12.83	49.35
실시예12	13.53	52.04
실시예13	12.95	49.81
실시예14	20.87	80.27
실시예15	12.14	46.69
실시예16	14.02	53.92
실시예17	13.00	50.00
실시예18	16.01	61.58
실시예19	13.58	52.23
실시예20	13.82	53.15
실시예21	12.71	48.88
실시예22	14.55	55.96
실시예23	18.71	71.96
실시예24	16.87	64.88
실시예25	15.34	59.00
실시예26	20.15	77.50
실시예27	14.12	54.31
실시예28	20.89	80.35
실시예29	16.31	62.73
실시예30	25.05	96.35
실시예31	23.97	92.19
실시예32	19.42	74.69

비교예1 - LLE

중대가리풀 건초 10g을 80% 에탄올 250mL으로 열수 추출 하여 1차 추출액을 얻었다. 1차 추출액은 filter 후에 증발건조시켜 0.82 g의 추출물을 얻었다.

물(DW) 10ml와 핵산(Cyclohexane) 20ml를 혼합하고 vortex mixer로 1분간 교반하고 Separating Funnel에 담아 핵산층을 분리 하였다. 그리고 3회 반복하여 수득한 핵산 층은 농축하여 HPLC 로 분석하였다.

상기에서 핵산 분획층을 제거 하고 남은 수층 추출물에 클로로포름(MC) 20mL을 혼합하고 Separating Funnel에 담아 클로로포름(MC) 층을 분리하였다. 그리고 3회 반복하여 수득한 클로로포름(MC) 층은 농축하여 HPLC 로 분석하였다.

상기에서 클로로포름(MC) 분획층을 제거 하고 남은 수층 추출물에 에틸아세테이트(EtAC) 20mL을 혼합하고 Separating Funnel에 담아 에틸아세테이트(EtAC) 층을 분리하였다. 그리고 3회 반복하여 수득한 에틸아세테이트(EtAC) 층은 농축하여 HPLC 로 분석하였다.

상기에서 에틸아세테이트(EtAC) 분획층을 제거 하고 남은 수층 추출물에 뷰탄올(n-BuOH) 20mL을 혼합하고 Separating Funnel에 담아 뷰탄올(n-BuOH) 층을 분리하였다. 그리고 3회 반복하여 수득한 뷰탄올(n-BuOH) 층은 농축하여 HPLC 로 분석하였다.

상기에서 뷰탄올(n-BuOH) 분획층을 제거 하고 남은 수층을 농축하여 HPLC 로 분석하였다.

비교예2 -RESIN

중대가리풀 건초 10g을 80% 에탄올 250mL으로 열수 추출 하여 1차 추출액을 얻었다. 1차 추출액은 filter 후에 증발 건조시키고, 물 30ml와 레진(HP-20) 1g을 혼합하고 vortex mixer로 1분간 교반하고, 250rpm으로 1시간 동안 incubation을 수행하였다. 이후, 원심 분리하여 1차 상등액을 분리(물 포함)하고 남은 레진에 에탄올 3ml를 혼합하였다. 재차 원심 분리하여 2차 상등액을 분리(에탄올 포함)하였다. 분리된 상등액 각각을 농축하고 이와 동일한 양의 에탄올에 재현탁하여 syringe filter를 이용하여 filter 후 HPLC로 분석하였다.

	Brevilin A 함량 (mg)	추출액 대비 분리된 상층액 Brevilin A 함량비 (%)
비교예1	6.02 (Cyclohexane 층)	23.00
	8.16 (MC 층)	31.17
	5.12 (EtOAC 층)	19.56
	3.6 (n-BuOH 층)	13.75
	1.7 (수 층)	6.49
비교예2	- (1차 상등액, 수층)	-
비교예2	16.28 (2차 상등액, 에탄올층)	62.62

제조예

상기 실시예32에 따라 분리된 상층액(2차 추출액)은 첨가된 친유성 가용화제 부피의 120%를 넘지않도록 농축(승온 자연 농축)하고, 농축된 상층액에 에멀전화 조성물로 Labrasol 5g을 혼합하여 마이크로 에멀전을 제조하였다. 이에 따라, micro emulsion 12mg/mL, 8.5mL, 수율 95%의 토닉 제제를 제조하였다. 이러한 에멀전은 유기용매가 아닌 물 베이스로서 안전한 부형제들을 포함하고 있는 것으로서 별도의 추가 공정없이 그 자체로 연고, 토닉 등의 다양한 형태의 제품으로 사용 가능하다(제조예1).

도 5는 본 발명의 실시예에 따른 상분리된 상태를 촬영한 사진(좌)과 상층을 분리하여 Labrasol을 추가로 혼합하여 마이크로 에멀전화시킨 최종 처방을 촬영한 사진(우)이다. 도 5의 좌측 사진은 상기 실시예32에 따라 상분리된 1차 추출액을 나타내는 사진이며, 도 5의 우측 사진은 상기 제조예1에 따라 제조된 토닉 제제를 나타내는 사진이다.

이와 달리, 상기 실시예32에 따라 분리된 상층액(2차 추출액)에 에멀전화 조성물로 Labrasol 0.3ml, Labrafac 0.5ml를 혼합하여 마이크로 에멀전화 시켰다(제조예2). 이와 달리, 상기 실시예32에 따라 분리된 상층액(2차 추출액)에 에멀전화 조성물로 Labrasol 0.3ml를 혼합하여 마이크로 에멀전화 시켰다(제조예3). 이와 달리, 상기 실시예32에 따라 분리된 상층액(2차 추출액)에 에멀전화 조성물로 Labrafac 0.1ml를 혼합하여 마이크로 에멀전화 시켰다(제조예4). 이와 달리, 상기 실시예32에 따라 분리된 상층액(2차 추출액)에 에멀전화 조성물로 Labrasol 0.5ml, Labrafac 0.5ml를 혼합하여 마이크로 에멀전화 시켰다(제조예5). 이와 달리, 에멀전화 조성물로 Labrasol 0.8ml, Labrafac 0.2ml를 혼합하여 마이크로 에멀전화 시켰다(제조예6). 이러한 에멀전화 조성물은 도 2 및 도 3의 상분리 조성물의 범위를 벗어나는 것으로, 도 2의 마이크로에멀전(Microemulsion)에 해당하는 범위로 적절히 적용 가능하다.

도 6은 본 발명의 실시예에 따른 1차 추출액을 연속 희석(serial dilution)한 후, 상분리 조성물을 이용하여 상분리시킨 상태를 설명하기 위한 사진이다.

다양한 농도의 1차추출물에서 2차 추출(Dissolution Emulsion Extract or Lipid-based drug(fr.) extract systems.)을 진행 할 때, 농도 물량과 상관 없이 친유성 가용화제(Lipds sulubilizer)에 따라 braviline- A와 그의 유도체를 선택적으로 농축하여 분리 추출할 수 있고 더욱이 미량의 추출법에 더욱 적합한 성능을 갖는다는 상태를 설명하기 위한 사진이다.

본 발명의 상분리 조성물은, 실질적으로 1차 추출액에 포함되어 있는 추출하고자 하는 비극성 천연물질의 농도와 상관 없이, 추출액에 포함되어 있는 천연물질을 모두 추출해낼 수 있다. 즉, 극미량의 물질을 효율적으로 추출 또는 제거하는데 사용될 수 있다. 도 6은 실시예32에 따라 1차 추출액을 추출한 후, 농축 없이 연속 희석(serial dilution) 후, 각각에 상분리 조성물을 혼합하여 상분리된 결과를 나타낸 것이다. 즉, 추출하고자 하는 비극성 천연물질의 농도가 낮아졌음에도 불구하고, 이와 동일 내지 유사하게 상분리된 영역이 줄어드나, 충분히 상분리를 시켜 원하는 물질을 분리해낼 수 있음을 알 수 있었다. 과일, 채소 등에 잔류하는 농약들은 대부분이 비극성(난용성/친유성)을 가지는데, 이들은 잘 씻기지 않을 뿐만 아니라 식물의 섬유질에 침착된다. 이러한 식물들에 잔류하는 농약을 제거하기 위하여 상기 상분리 조성물의 활용이 가능하다.

실험예

상기 제조예1에 따라 제조된 헤어 토닉을 일반 남성 및 여성을 대상으로 일정기간 사용에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 측정하였다. 헤어 토닉은 머리카락을 사용자의 수준에 맞추어 깨끗이 샴푸 후에 두피에 직접적으로 펴바르는 식으로 사용하였다. 여기서, 탈모량은 정확하게 측정하는 것은 다소 어려우므로 샤워 후 걸러지는 머리카락의 가닥수로 판단하였으며, 발모량은 모발진단기로 측정되는 동일 영역에서의 모발 밀도로 판단하였다.

도 8은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 남성이 18일 간 사용함에 따른 탈모량의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 9A 내지 9E는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 남성이 18일 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다. 도 10은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 여성이 18일 간 사용함에 따른 탈모량의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11A 내지 11B는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 여성이 18일 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다.

도 8 내지 11을 참조하면, 헤어 토닉을 일정용량 사용함에 따라, 점차 탈모량이 줄어듦을 알 수 있고, 실험 기간 중에 사용을 중단 함에 따라 다소 탈모량이 늘어났음을 알 수 있었다. 특히, 여성 실험자의 경우 도 10에서와 같이 대부분 일정 용량 이상의 헤어 토닉을 주기적으로 사용하였으며, 그 결과 탈모량이 지속적으로 감소하였음을 알 수 있었다. 도 9 및 도 11에서, 양 실험자들 모두 발모량이 증가하였으며, 모발 밀도가 대체로 약 15% 이상, 20% 이상까지도 증가한 것을 알 수 있었다. 추가적으로 4주 이후부터는 이 탈모량에 대해서 조화평균을 보면 초기 10 내지 150 가닥의 탈모량의 실험자들은 4주 이후 탈모량의 조화평균을 보면 50 내지 60 가닥으로 모두 안정화 되고 있는 것으로 확인할 수 있었다.

상술한 바에 있어서, 본 발명의 예시적인 실시예들을 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않으며 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 다음에 기재하는 특허청구범위의 개념과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변경 및 변형이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

천연물 원료를 추출하여 1차 추출액을 제조하는 단계;
1차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합하여 2차 추출하는 단계; 및
상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
제1항에 있어서,
상기 상분리된 용액의 상층은 친유성 가용화제 및 비극성 천연물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
제1항에 있어서,
상기 비극성 천연물질은 Brevilin A 또는 이의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
제3항에 있어서,
상기 비극성 천연물질은 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
제1항에 있어서,
상기 천연물 원료는 중대가리풀(Centipeda minima), 삼푸트리(Litsea glutinous), Arnica 속 식물 및 Helenium 속 식물로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
제1항에 있어서,
상기 상분리 조성물은, 친유성 가용화제 10 내지 90중량%; 및 물 10 내지 90중량%를 포함하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
제6항에 있어서,
상기 상분리 조성물은 60 중량% 이하의 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 이용하여 천연물 원료로부터 상분리된 추출액을 제조하는 단계; 및
상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 비극성 천연물질의 추출 방법.