KR20200010129A - 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법은, (a) 말 복부 지방을 분쇄하는 단계, (b) 효소를 생리식염수에 투입하여 효소 수용액을 제조하는 단계, (c) 상기 분쇄된 말 복부 지방에 효소 수용액을 투입하고 볼텍싱(Voltexing)하여 1차 혼합액을 제조하는 단계, (d) 상기 1차 혼합액을 항온기에서 반응시키는 단계, (e) 상기 항온기에서 반응시킨 1차 혼합액을 오토클레이빙시키는 단계, (f) 상기 오토클레이빙된 1차 혼합액을 필터로 여과하여 마유 추출액을 수득하는 단계, 그리고 (g) 상기 수득된 마유 추출액을 정제하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의한 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법을 이용하면 수분함량이 낮은 고순도, 고수율의 마유 추출액을 수득할 수 있는 장점이 있다.

Description

효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법{Method for extracting and purifying horse oil using enzyme}

본 발명은 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법에 관한 것이다.

마유(Horse oil)는 초식동물인 말에서 추출한 기름으로 중국과 일본에서는 고대부터 그 효능을 알고 쓰여왔다. 마유에는 불포화지방산이 다량(65 %) 포함되어 피부 침투력, 보습 작용, 건강한 피부 유지, 외부 자극으로부터 피부 보호 작용, 및 항아토피 효과가 있어 민감한 피부에 사용되어 왔다.

중국의 전통의학서인 본초강목에 의하면 마유는 피부 재생제로 사용하였다고 기록되어 있으며, 일본에서도 에도시대 때부터 사용되어 온 것으로 전해지고 있다. 이러한 이유로 국내에도 마유를 이용한 화장품들이 만들어지고 있다.

마유는 다른 동물 오일 보다 많은 양의 불포화 지방산을 함유하고 있으며, 특히 피부의 침투성이 우수한 불포화지방산 올레닉 산(oleic acid)의 함량이 많다. 또한, 마유는 피부보호와 보습뿐만 아니라 피부 교원질(콜라겐)을 분해하여 피부 노화의 원인이 되는 콜라게나제(collagenase)의 활성을 막아주어 노화 방지 기능성이 있어 우수한 화장품의 원료로 이용될 수 있다.

일반적으로 지방산은 모든 유지류의 주요성분으로 유지의 92∼95%를 차지하고 있다. 마유는 다른 동물성 지방과 비교할 때 불포화지방산 구성비가 특히 높고 이러한 분포는 인간의 지방과 유사해 인체 피부에 적용해도 피부 트러블이 없는 장점이 있다. 또한 마유는 융점이 식물성 오일에 비해 높으며, 체온과 비슷한 30∼40 ℃라는 점에서 인체의 피부에 빠른 침투가 가능한 장점이 있다. 특히 불포화 지방산 가운데 팔미톨레인 산(palmitoleic acid)의 구성비는 인체의 팔미톨레인 산의 구성비와 거의 같다.

상기 팔미톨레인 산은 인체의 피부를 구성하는 피지의 주요 성분으로 강력한 항균, 항염 작용을 하여 피부를 보호할 뿐만 아니라 인슐린 분비를 촉진시키는 것으로 알려진 기능성 물질이다. 또한, 마유는 타 동물에 비해 팔미톨레인 산이 2∼3 배가 많아 피부 트러블 진정 효과의 관련성에 중요한 물질로 인식되고 있다. 따라서 마유는 아토피나 화상 등으로부터 세균감염을 억제하여 상처를 치유할 수 있어 피부질환 및 재생에 효능이 있다고 알려져 있다.

특허문헌 1 KR 10-1617664B1 (2016.05.03. 공고) 특허문헌 2 KR 10-0893648B1 (2019.04.17. 공고)

본 발명의 목적은 (a) 말 복부 지방을 분쇄하는 단계, (b) 효소를 생리식염수에 투입하여 효소 수용액을 제조하는 단계, (c) 상기 분쇄된 말 복부 지방에 효소 수용액 투입하고 볼텍싱(Voltexing)하여 1차 혼합액을 제조하는 단계, (d) 상기 1차 혼합액을 항온기에서 반응시키는 단계, (e) 상기 항온기에서 반응시킨 1차 혼합액을 오토클레이빙시키는 단계, (f) 상기 오토클레이빙된 1차 혼합액을 필터로 여과하여 마유 추출액을 수득하는 단계, 그리고 (g) 상기 수득된 마유 추출액을 정제하는 단계를 포함하는 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법은, (a) 말 복부 지방을 분쇄하는 단계, (b) 효소를 생리식염수에 투입하여 효소 수용액을 제조하는 단계, (c) 상기 분쇄된 말 복부 지방에 효소 수용액을 투입하고 볼텍싱(Voltexing)하여 1차 혼합액을 제조하는 단계, (d) 상기 1차 혼합액을 항온기에서 반응시키는 단계, (e) 상기 항온기에서 반응시킨 1차 혼합액을 오토클레이빙시키는 단계, (f) 상기 오토클레이빙된 1차 혼합액을 필터로 여과하여 마유 추출액을 수득하는 단계, 그리고 (g) 상기 수득된 마유 추출액을 정제하는 단계를 포함한다.

상기 (b) 단계의 효소는, 단백질 가수분해 효소인 파파인(Papain)일 수 있다.

상기 (b) 단계는, 0.9 % 농도의 생리식염수에 효소를 투입하여 0.8~8 중량%(w/v) 농도의 효소 수용액을 제조할 수 있다.

상기 (d) 단계는 45~65 ℃에서 18~30 시간 동안 반응시킬 수 있다.

상기 (e) 단계는 115~125 ℃에서 50~70 분 동안 수행될 수 있다.

상기 (f) 단계의 수득된 마유 추출액의 수득율은 88~91 %일 수 있다.

상기 (g) 단계는 마유 추출액에 0.05~0.2 중량%(w/v) 농도의 인산을 투입하고 탈검한 후 65~75 ℃의 증류수로 1차 세척하는 과정과, 상기 1차 세척된 마유 추출액에 2~3 중량%(w/v) 농도의 NaOH를 1:0.5~2 중량비로 투입하고 탈산한 후 65~75 ℃의 증류수로 2차 세척하는 과정과, 상기 2차 세척된 마유 추출액에 3~7 중량%(w/v)의 산성백토를 투입한 후 순차적으로 탈수, 탈색 및 탈취하는 과정과, 상기 탈취된 마유 추출액을 95~105 ℃의 온도에서 교반하면서 가열하는 과정을 포함한다.

상기 (g)단계의 정제된 마유 추출액의 수득율은 88~91 %일 수 있다.

상기 (g) 단계의 정제된 마유 추출액의 수분 함량은 0.01~0.03 %일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 마유는 상기한 방법으로 추출 및 정제된 마유를 제공한다.

본 발명에 의한 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법을 이용하면 수분함량이 낮은 고순도, 고수율의 마유 추출액을 수득할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예 따른 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 고형분을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 산가를 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 요오드가를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 수분 함량을 비교한 그래프이다.
도 6a 내지 6c는 가스 크로마토그래피-불꽃 이온화 검출기를 이용하여 말, 돼지, 및 소의 지방산 프로파일을 나타낸 것이다.

이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 약, 실질적으로 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법을 도 1을 참조하여 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예 따른 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법을 나타낸 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법은, (a) 말 복부 지방을 분쇄하는 단계(S100), (b) 효소를 생리식염수에 투입하여 효소 수용액을 제조하는 단계(S200), (c) 상기 분쇄된 말 복부 지방에 효소 수용액을 투입하고 볼텍싱(Voltexing)하여 1차 혼합액을 제조하는 단계(S300), (d) 상기 1차 혼합액을 항온기에서 반응시키는 단계(S400), (e) 상기 항온기에서 반응시킨 1차 혼합액을 오토클레이빙시키는 단계(S500), (f) 상기 오토클레이빙된 1차 혼합액을 필터로 여과하여 마유 추출액을 수득하는 단계(S600), 그리고 (g) 상기 수득된 마유 추출액을 정제하는 단계(S700)를 포함한다.

상기 (a) 단계는 말 복부 지방을 분쇄하는 단계(S100)이다.

상기 (a) 단계(S100)의 말 복부 지방은 Image J 프로그램을 이용하여 도축된 말고기의 지방면적을 측정하고 지방을 선별한 후 이물질을 제거한 것일 수 있다.

상기 말 복부 지방의 분쇄하는 분쇄기는 특별히 제한하지는 않으나, 본 발명에서는 고기분쇄기(Living, Beihing, China)를 사용하였다.

상기 말고기는 특별히 제한되지는 않으나, 영양 성분 및 활성 성분 함량이 풍부하고, 청정지역에서 자란 제주산 말의 고기를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 (b) 단계는 효소를 생리식염수에 투입하여 효소 수용액을 제조하는 단계(S200)이다.

구체적으로, 상기 (b) 단계(S200)는, 0.9 % 농도의 생리식염수에 효소를 투입하여 0.8~8 중량%(w/v) 농도의 효소 수용액을 제조할 수 있으며, 바람직하게는 2 ~ 7 중량%(w/v)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2~6 중량%(w/v)일 수 있다.

상기 효소 수용액의 농도가 0.8 중량%(w/v) 미만이면 마유 추출 수율이 떨어지고, 8 중량%(w/v)를 초과하면 마유 추출 수율이 떨어지고 투입량 대비 경제적으로 바람직하지 못하다. 즉, 상기 범위에서 가장 좋은 수율로 마유를 추출할 수 있다.

상기 (b) 단계(S200)의 효소는 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), α-키모트립신(α-chymotrypsin), 파파인(Papain), 알카라제(Alcalase), 뉴트라제(Neutrase) 및 플라보자임(Flavourzyme)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1 종 이상 것일 수 있으며, 바람직하게는 파파인(Papain)일 수 있다.

상기 파파인(Papain)은 파파야 과실에서 결정 상태로 얻어지는 단백질 가수분해 효소이며, 단백질을 주로 염기성 아미노산, 류신 글리신 등의 카르복실 쪽의 펩타이드 결합이 있는 곳을 분해하는 특징이 있다.

상기 (c) 단계는 상기 분쇄된 말 복부 지방에 효소 수용액을 투입하고 볼텍싱(Voltexing)하여 1차 혼합액을 제조하는 단계(S300)이다.

상기 (c) 단계(S300)는 상기 분쇄된 말 복 복부 지방을 효소 수용액으로 가수분해 하기 위한 준비단계이다.

따라서, 상기 분쇄된 말 복부 지방에 상기 각각의 농도로 제조된 효소 수용액을 투입하고 볼텍싱하여 1차 혼합액을 제조한다.

상기 (d) 단계는 상기 1차 혼합액을 항온기에서 반응시키는 단계(S400)이다.

즉, 상기 분쇄된 말 복부 지방을 효소 수용액을 이용하여 마유를 가수분해하는 단계이다.

상기 (d) 단계(S400)에서 항온기의 온도는 45~65 ℃일 수 있으며, 바람직하게는 50~64 ℃일 수 있으며, 보다 바람직하게는 55~62 ℃일 수 있다.

상기 항온기의 온도가 45 ℃ 미만이면, 마유 추출 수율이 떨어지고, 65 ℃를 초과하여도 마유 추출 수율이 떨어지는 문제점이 있다. 즉, 상기 범위에서 가장 좋은 수율로 마유를 추출할 수 있다.

또한, 상기 항온기에서 반응시간은 18~30 시간일 수 있으며, 바람직하게는 22~28 보다 바람직하게는 22~26 시간 일 수 있다.

상기 반응시간 역시 상기 범위를 벗어날 경우 수율이 떨어지는 문제점이 있다.

상기 (e) 단계는 상기 항온기에서 반응시킨 1차 혼합액을 오토클레이빙시키는 단계(S500)이다.

상기 (e) 단계(S500)는 상기 항온기에서 가수분해된 1차 혼합액에서 마유를 추출하는 단계이다.

구체적으로 상기 (e) 단계(S500)는 115~125 ℃에서 50~70 분 동안 수행될 수 있다.

여기서, 상기 오토클레이빙은 내열, 내압성 용기(오토클레이브)를 이용하여 고온, 고압하에서 합성, 분해, 승화 및 추출 등의 화학처리를 하는 것을 의미하며, 통상의 기술이므로 이에 대한 설명은 생략한다.

상기 (f) 단계(S600)는 상기 오토클레이빙된 1차 혼합액을 필터로 여과하여 마유 추출액을 수득하는 단계이다.

상기 (f) 단계(S600)는 0.45 ㎛ Syringe filter(Hyundai micro, Korea)를 이용하여 수행될 수 있다.

상기 (f) 단계(S600)의 수득된 마유 추출액의 수득율은 88~91 %이다.

상기 (g) 단계는 상기 수득된 마유 추출액을 정제하는 단계(S700)이다.

구체적으로 상기 (g) 단계(S700)는 마유 추출액에 0.05~0.2 중량%(w/v) 농도의 인산을 투입하고 탈검한 후 65~75 ℃의 증류수로 1차 세척하는 과정과, 상기 1차 세척된 마유 추출액에 2~3 중량%(w/v) 농도의 NaOH를 1:0.5~2 중량비로 투입하고 탈산한 후 65~75 ℃의 증류수로 2차 세척하는 과정과, 상기 2차 세척된 마유 추출액에 3~7 중량%(w/v)의 산성백토를 투입한 후 순차적으로 탈수, 탈색 및 탈취하는 과정과, 상기 탈취된 마유 추출액을 95~105 ℃의 온도에서 교반하면서 가열하는 과정을 포함한다.

상기 (g)단계(S700)의 정제된 마유 추출액의 수득율은 88~91 %일 수 있다.

상기 (g) 단계(S700)의 정제된 마유 추출액의 수분 함량은 0.01~0.03 %일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 상기한 방법으로 제조된 마유를 제공한다.

본 발명은 상기한 추출 및 정제 방법에 따란 제조된 마유를 제공한다.

상기 마유의 불포화 지방산 함량은 59.09 %일 수 있으며, 그 중 피부 침투성이 우수한 올레닉산 및 레놀레 산의 함량은 45.19이다.

또한, 상기 마유에는 고형분의 함량이 0.0032 % 이하로 포함되어 불용 불순물이 낮은 고순도의 추출된 것이고, 유지의 산파 정도를 측정할 수 있는 산가는 0.094로 식용에 적합한 것이다.

더불어, 마유의 요오드가는 93.71로 높은 높은 불포화도를 나타내며, 수분의 함량이 0.02%로 고순도로 제조된 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

하기의 실시예 및 실험예에서는 말의 지방을 소, 돼지와 비교하기 위하여 각 동물로부터 지방을 추출하고 지방산의 함량을 GC분석하여 성분을 비교하였다.

또한, 말 오일의 추출 수율을 확인하기 위하여 파파인 효소 및 고온, 고압의 방법으로 최적 추출 조건을 확인하였고, 고순도 마유를 얻기 위해 정제 후 식품공전에 준하여 품질관리 시험을 진행하였다.

재료 준비

본 발명에서 사용된 말(Equus ferus caballus) 지방은 육안으로 90 % 이상을 차지하는 말의 복부 지방으로 -70 ℃의 초저온 냉동고(Deep freezer)에 보관하여 사용하였으며, 효소(Papain latex, Sigma 사 제품번호 P3375)는 구입하여 0.9 % 생리식염수(Daihan Pharm. Co., Seoul, Korea)에 희석하여 사용하였다.

마유 추출방법

실시예: 효소처리에 의한 마유 추출

먼저, 말 복부 지방은 Image J 프로그램을 이용하여 지방면적을 측정하고 선별한 후 고기 분쇄기(Living, Beijing, China)를 이용하여 분쇄하였다.

다음으로, 파파인은 0.9 % 생리식염수에 희석하여 0, 0.2, 1, 5.0, 및 10 중량%(w/v) 농도의 파파인 수용액을 제조하였다.

다음으로, 분쇄된 말 복부 지방에 파파인 수용액을 투입하고 볼텍싱(Voltexing)하였으며, 30, 40, 50, 60, 70, 및 80 ℃의 항온기에서 0, 5, 12, 24, 36, 및 48 시간 반응시킨 다음 121 ℃에서 60 분 동안 오토클레이빙(Autoclaving)하였다.

다음으로, 0.45 ㎛ Syringe filter(Hyundai micro, Korea)로 여과하여 마유 추출액을 수득하였다.

다음으로 마유 정제를 위해, 마유 추출액에 0.1 중량%(w/v) 인산을 처리하고 탈검한 후 70 ℃의 증류수로 충분히 수세하였다.

다음으로, 수세한 마유 추출액과 2.5 중량%(w/v) NaOH를 1:1로 처리하여 탈산과정을 거친 후 70 ℃ 증류수로 수세하였다.

마지막으로, 탈산과정을 마친 마유 추출액에 5 중량%(w/v)의 산성백토를 첨가하여 탈수, 탈색, 탈취 과정을 거친 후 100 ℃의 온도로 교반하면서 가열하여 최종 정제된 마유추출액을 수득하였다.

비교예 1

말 복부 지방은 Image J 프로그램을 이용하여 지방 면적을 측정하고 선별한 후 고기 분쇄기(Living, Beijing, China)를 이용하여 분쇄하였다.

다음으로, 분쇄된 말 복부 지방(마지)에 Vit-E acetate를 첨가한 다음 100 ℃에서 2 시간 액화시킨 후 여과하였다.

마지막으로, 활성탄을 이용하여 정제하고 65 ℃에서 감압 정제하여 0.45 ㎛ syringe Filter(Hyundai Micro, Korea)로 여과하였다(등록특허, 10-1617664, 참조).

비교예 2

마지는 비교예 1과 동일하게 처리하여 사용하되, 분쇄 후 100 ℃에서 5시간 동안 액화시킨 후 여과하였다.

다음으로, 0.1 중량%(w/v) 인산으로 처리한 후 70 ℃의 증류수로 수세하였다.

다음으로, 2.5 중량%(w/v) NaOH을 처리하고 70 ℃의 증류수로 수세한 후 5 중량%(w/v)의 산성백토를 첨가 한 뒤 100 ℃에서 가열하고 필터 프레스를 이용하여 여과하였다(등록특허 10-0893648 참조).

실험예 1: 파파인 농도에 따른 마유 추출 수율 측정

파파인 농도에 따른 마유 추출 수율을 측정하였다.

파파인을 0.9 % 생리식염수에 희석하여 0, 0.2, 1, 5, 및 10 중량%(w/v)의 파파인 수용액을 제조하였다. 분쇄된 말 복부 지방에 각각의 파파인 수용액으로 처리하고 볼텍싱(Voltexing)하였으며 60 ℃의 항온기에서 24 시간 반응시킨 후 121 ℃에서 60 분 동안 오토클레이빙(autoclaving)하였다.

수율은 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리 후 상등액의 oil층만 분리하여 측정하였다.

실험예 2: 파파인 반응시간에 따른 마유 추출 수율 측정

파파인의 반응시간에 따른 마유 추출 수율을 측정하였다.

먼저, 파파인을 0.9 % 생리식염수에 희석하여 5 중량%(w/v) 파파인 수용액을 제조하고, 분쇄된 말 복부 지방에 상기 5 중량%(w/v)의 파파인 수용액을 처리한 다음 볼텍싱(Voltexing)하였다.

다음으로, 60 ℃의 항온기에서 0, 5, 12, 24, 36, 48 시간별로 반응시킨 후 121 ℃에서 60 분 동안 오토클레이빙(autoclaving)하였다.

수율은 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리 후 상등액의 oil층만 분리하여 측정하였다.

실험예 3: 파파인 처리 온도에 따른 마유 추출 수율 측정

파파인의 처리 온도에 따른 마유 추출 수율을 측정하였다.

먼저, 파파인을 0.9 % 생리식염수에 희석하여 5 중량%(w/v) 파파인 수용액을 제조하고, 분쇄된 말 복부 지방에 상기 5 중량%(w/v)의 파파인 수용액을 처리한 다음 볼텍싱(Voltexing)하였다.

다음으로, 30, 40, 50, 60, 70, 및 80 ℃의 항온기에서 24 시간 반응시킨 후 121 ℃에서 60 분 동안 오토클레이빙(autoclaving)하였다.

수율은 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리 후 상등액의 oil층만 분리하여 측정하였다.

실험예 4: 추출된 마유의 지방산 분석

추출한 조지방은 식품 공전의 지방산 제 2법(Food and Drug Administration 2015)에 따라 처리한 시험용액을 가스 크로마토그래피-불꽃 이온화 검출기(gas chromatography-flame ionization detector, 7890A, Agilent, Santa Clara, CA, USA, GC-FID)를 이용하여 포화지방 및 트랜스지방을 분석하였다.

상기 GC-FID 조건은 하기의 표 1에 표시하였다.

FAPAS 분석도 동일한 방법으로 2 회 반복 실시하였다. 디텍터(Detector)는 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector, Agilent 사, FID)를 사용하였으며 분석 온도는 285 ℃였다. 지방산 분석을 위해 SPTM-2560(Supelco, St. Louis, MO, USA, 100 m × 0.25 mM × 0.20 μM) 컬럼(column)을 사용하였다. 인젝터(Injector)는 분할비(split ratio)를 200:1로 한 분할모드(split mode)로써 온도는 225 ℃였다. 캐리어 가스(Carrier gas)는 He를 사용하였으며, 컬럼 유속(column flow rate)은 0.75 ml/min였다. 컬럼의 온도는 초기에 100 ℃ 에서 4 분간 유지한 후 분당 3 ℃씩 승온시켜 208 ℃에서 5 분간 유지한 뒤 분당 2 ℃씩 승온시켜 244 ℃에서 15 분 이상 유지시켰다.

표준물질은 37 component FAME MIX(47885-U, Supelco, St. Louis, MO, USA)를 사용하였고 시험용액 중 각 지방산 메틸 에테르 (methyl ether)는 표준물질의 크로마토그램과 보유시간(retention time)을 비교하여 확인하였다. 추출 유지 중 포화지방 및 트랜스지방의 함량은 탄소 계수 4∼24를 대상으로 37 종의 지방산을 분석하였다.

실험예 5: 마유의 고형분 측정

시료를 n-헥산(n-hexane)에 용해시키고 무게를 측정한 건조된 유리필터(glass filter)에 필터링한 다음 유리필터를 다시 건조하여 유리필터의 필터링 전, 후 건조된 무게를 측정하였다.

고형분은 다음 식에 의하여 구하였으며, 측정은 3 회 반복하였다.

w = (m2-m1)/m0 × 100

m0: 시료 무게(g)

m1: 필터링 전 유리필터의 무게(g)

m2: 필터링 후 유리필터의 무게(g)

실험예 6: 마유의 산가 측정

마유의 산가 측정은 식품공전에 준하여 실시하였다.

시료를 삼각 플라스크에 취한 후 에탄올(ethanol, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)과 에테르(ether, Sigma-Aldrich Co.)가 1:2 부피비(v/v)로 혼합된 혼합용액 20 mL를 넣어 유지를 녹인 다음 지시약(Penolphthalein solution, Sigma-AldrichCo.)을 투입하고 연분홍색이 될 때까지 0.1 N 수산화칼륨(Sigma-Aldrich Co.)을 에탄올용액으로 적하 하였다.

측정은 3 회 반복하였고 공시험을 병행하였으며, 산가의 계산식은 다음과 같다.

산가(Acid value)=5.611×(a-b)×f/sample weight(g)

a: 0.1 N 에탄올성 수산화칼륨용액의 소비량(mL)

b: 공시험의 0.1N 에탄올성 수산화칼륨용액의 소비량(mL)

f: 0.1 N 에탄올성 수산화칼륨용액의 역가(=1.0)

실험예 7: 마유의 요오드가 측정

마유의 요오드가 측정은 식품공전에 준하여 실시하였다.

시료를 삼각 플라스크에 취한 후 시클로헥산 20 ml를 넣어 유지를 녹인 다음 위이스(Wijs) 시액을 투입하여 혼합한 후 밀봉하여 차광하여 20 ~ 30 ℃에서 30 분간(요오드가 100 이상이면 1 시간) 방치하였다. 방치 후 요오드화칼륨용액을 혼합한 다음 지시약(전분 시액)을 투입하고 엷은 홍색이 될 때까지 0.1 mol/l 티오황산나트륨용액으로 적하 하였다.

측정은 3 회 반복하였고 공시험을 병행하였으며, 요오드가 계산식은 다음과 같다.

요오드가(Iodine value)=(a-b)×1.269/S

a: 공시험액의 0.1 mol/l 티오황산나트륨액의 소비량(mL)

b: 검액의 0.1 mol/l 티오황산나트륨액의 소비량(mL)

S: 시료의 양

실험예 8: 마유의 수분 측정

마유의 수분 측정은 축산물 시험법에 고시된 Karl Fisher법으로 측정하였다.

피리딘(Pyridine) 및 메탄올의 존재하에 물이 요오드와 이황산가스에 정량적으로 반응하는 것을 이용하여 Karl Fisher 시액을 이용하여 시료의 수분을 측정하였다.

측정은 3회 반복 하였으며, 수분 함량의 계산식은 다음과 같다.

수분 함량(Moisture content)=a×f/sample weight (g)

a: 검사시료의 적정에 소비된 Carl Fisher 시액의 양(mL)

f: 시약의 역가

[실험결과]

1. 파파인 효소 농도에 따른 마유 추출 수율 분석

하기의 표 2는 파파인 처리농도에 따른 마유 추출 수율을 나타낸 것이다.

표 2를 참조하면, 5 중량%(w/v) 파파인 수용액을 이용하였을 때 말 복부 지방 회수율이 89.5 %로 가장 높았으며, 다음으로 1 중량%(w/v) 그리고 10 중량%(w/v) 파파인 수용액 순으로 높게 나타났다. 또한, 효소 처리하지 않고 생리식염수만 처리한 군(대조군)의 수율은 58 %로 나타났으며, 대조군에 비하여 5 중량%(w/v) 파파인 수용액으로 처리한 것이 20.1 % 더 높은 수율을 나타냈다.

2. 파파인 반응시간에 따른 마유 추출 수율 분석

하기의 표 3은 파파인 반응시간에 따른 마유 추출 수율을 나타낸 것이다.

표 3을 참조하면, 24 시간 처리한 시료의 수율이 89.5%로 가장 높았으며, 파파인 수용액 처리 후 바로 고압, 고온으로 오토클레이브(autoclave)한 시료(대조군)의 경우, 수율이 80.53 %로 24 시간 반응한 시료에 비하여 수율이 8.97 % 낮았다. 또한, 36 및 48 시간 등 항온시간이 길어질수록 수율이 감소하였다.

3. 파파인 처리온도에 따른 마유 추출 수율 분석

표 4를 참조하면, 온도가 60 ℃까지 증가할수록 수율이 증가하였으며, 60 ℃ 에서 최고 수율인 89.5 % 나타냈으며, 60 ℃를 기점으로 온도가 증가할수록 수율이 감소하였다.

종합해보면, 본 발명에 따른 파파인 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법은 5 중량%(w/v) 파파인 수용액과 분쇄된 말 복부 지방을 1:1로 혼합하고, 24 시간 동안 반응시킨 후 121 ℃에서 1 시간 동안 고온, 고압에서 추출한 후 정제과정을 거친 것이 가장 우수한 수율을 나타내는 것을 확인하여 실시예 1로 지정하였고, 이후 실험을 실시하였다. 또한, 앞서 비교예 1 및 2와 수율 등의 효과 비교를 실시하였다.

4. 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2 정제 수율 분석

상기의 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 추출 조건은 표 5와 같다.

본 발명의 표 5와 같이 최종 정제된 마유 추출액의 실시예 1, 비교예 1 및 2의 마유 추출 수율을 분석하여 하기의 표 6에 나타냈었다.

상기 실시예 1의 마유 정제과정은 추출된 마유를 0.1 중량 중량%(w/v) 인산으로 처리하여 탈검한 후 70 ℃의 증류수로 충분히 수세한 다음 2.5 중량%(w/v)의 NaOH를 상기 마유와 1:1 중량비로 처리하여 탈산과정을 거치 후 다시 70 ℃의 증류수로 충분히 수세하고, 마유에 5 중량% 산성백토를 첨가하여 탈수, 탈색, 탈취 과정을 거친 다음 100 ℃로 교반하면서 가열하는 것이다.

표 6에서 확인할 수 있듯이, 비교예 1 및 2의 수율은 63.33 %, 53.33 %인 반면 실시예 1의 경우 89.50 %의 높은 수율로 수득할 수 있는 것을 확인할 수 있다.

5. 지방산 분석 결과

하기의 표 7은 동물 종에 따른 지방산 함량을 나타낸 것이다.

*포화: Saturation (S)/불포화: Unsaturation (U)

표 7을 참조하면 말, 돼지, 및 소에서 추출된 오일의 불포화 지방산 중 말에서 추출한 마유의 불포화 지방산 함량은 57.09 %이며, 돼지에서 추출한 돈지의 불포화지방산 함량은 57.79 %이며, 소에서 추출한 우지의 불포화지방산 함량은 53.24 %로 확인되었다.

말과 돼지 오일의 불포화지방산 함량은 비슷했으며 소 오일이 약 4 % 정도 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 올레닉 산의 함량은 돼지의 오일에서 높게 나타났으며, 팔미트 산(palmtic acid)과 팔미톨레인 산의 함량은 돼지와 소의 오일에 비해 말의 오일에서 더 높은 함량을 나타냈다. 불포화지방산인 리놀레 산(linoleic acid, C18:1)의 함량은 말, 돼지의 오일에서 유사하였으며, 포화지방산인 팔미트 산은 마유에서 더 높게 나타났으며, 불포화지방산인 팔미톨레인 산은 다른 돈지(lard)나 우지(tallow)에 비하여 유의적으로 높은 수치를 나타냈다.

실시예 1에 따라 추출된 마유의 지방산 분석결과 불포화지방산 함량은 57.09 %이였으며, 그 중 피부의 침투성이 우수한 것으로 보고된 올레닉 산과 리놀레 산의 함량의 합은 45.19 %으로, 이는 불포화 지방산 중 약 80 %을 차지하는 것으로 확인되었다.

6. 추출 방법에 따른 지방산의 함량 분석

마유 추출 방법에 따른 지방산 함량을 분석하였다.

하기의 표 8은 추출 방법에 따른 마유의 지방산 함량을 나타낸 것이다.

표 8을 참조하면, 추출된 지방산의 함량 중 올레닉 산 이 가장 많았으며 다음은 포화지방산인 팔미트 산이 많았다.

Heating 추출 방법(비교예 1)을 이용하였을 경우 불포화지방산 함량이 56.81 %, autoclaving 추출 방법(비교예 2)을 이용하였을 경우 57.17 %, 효소를 이용한 추출 방법(실시예 1)을 이용했을 경우에 57.52 %로 불포화지방산 함량에는 큰 차이가 없었다.

7. 추출된 마유 내 고형분 분석 결과

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 고형분을 비교한 그래프이다.

마유 내 고형분은 International Organization for Standardization(ISO)의 실험방법인 ISO 663(2007)의 변법으로 수행하였다.

시료는 시중에 판매되고 있는 일본산 마유(일본 북해도 마유, ST-Oil)와 실시예 1을 비교 시험하였다.

도 2를 참조하면, 실시예 1의 경우 마유에 포함된 고형분의 함량은 0.0032 %로 불용 불순물이 거의 없는 것으로 나왔으며, 대조군인 ST-Oil(일본 북해도산 마유)과 비교하였을 때 0.0001 % 차이로 큰 차이가 있지 않았다.

8. 추출된 마유의 산가 분석 결과

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 산가를 비교한 그래프이다.

산가는 유지의 산패 정도를 측정하는 지표로서, 유지가 산패 또는 가열 분해되는 중에 향미에 영향을 미치며 자동산화의 촉진, 발연점 저하 등의 부수적인 품질 저하를 일으키는 유리지방산의 함량을 나타낸다.

도 3을 참조하면, 실시예 1에 따른 마유의 산가는 0.094이고, 대조군인 ST-Oil의 산가는 0.020로 0.074 정도 산가가 더 높은 것을 확인할 수 있다.

실시예 1에 따른 마유 추출액은 대조군에 비하여 높은 산가를 나타냈지만 산가가 1 미만으로 식용에 적합한 것으로 확인되었다.

9. 추출된 마유의 요오드가 분석 결과

도 4는 본 발명의 일 실시예 1에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 요오드가를 비교한 그래프이다.

요오드가는 유지 100 g에 흡수되는 할로겐의 양을 요오드의 g 수로 환산하여 시료에 대한 백분율로 나타낸 것이며, 지질의 불포화도를 나타내는 값을 나타낸다.

지방산 분자 중에 이중결합이 존재하면 할로겐 분자(Cl2, Br2, I2)가 지방산의 이중결합에 첨가 반응이 일어나는 원리로 측정한다. 따라서 일정량의 유지에 흡수되는 요오드의 양이 많으면 지방산 분자 중에 이중결합의 수가 많다는 것을 의미하며 불포화도가 높다는 것을 의미한다.

도 4를 참조하면, 실시예 1의 마유의 요오드가는 93.71이었으며, 대조군인 ST-Oil은 100.11인 것을 확인할 수 있다.

10. 추출된 마유의 수분 함량 분석 결과

도 5는 본 발명의 일 실시예 1에 따른 마유와 대조군(일본 북해도 마유, ST-Oil)의 수분 함량을 비교한 그래프이다.

정제된 마유의 순도와 정제 정도를 확인하기 위하여 Karl Fischer법으로 수분함량을 측정하였다.

도 5를 참조하면, 실시예 1의 마유의 수분 함량은 0.02 %이였으며, 대조군인 일본 북해도산 마유(ST-Oil)의 수분함량은 0.013 %으로 실시예 1의 마유의 수분 함량이 더 낮은 것을 확인할 수 있다.

이상, 본 발명을 바람직한 실시예를 사용하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

S100: 말 복부 지방 분쇄 단계 S200: 효소 수용액 제조 단계
S300: 1차 혼합액 제조 단계 S400: 1차 혼합액 반응 단계
S500: 오토클레이빙 단계 S600: 마유 추출액 수득 단계
S700: 마유 추출액 정제 단계

Claims (10)

1. (a) 말 복부 지방을 분쇄하는 단계,
   (b) 효소를 생리식염수에 투입하여 효소 수용액을 제조하는 단계,
   (c) 상기 분쇄된 말 복부 지방에 효소 수용액을 투입하고 볼텍싱(Voltexing)하여 1차 혼합액을 제조하는 단계,
   (d) 상기 1차 혼합액을 항온기에서 반응시키는 단계,
   (e) 상기 항온기에서 반응시킨 1차 혼합액을 오토클레이빙시키는 단계,
   (f) 상기 오토클레이빙된 1차 혼합액을 필터로 여과하여 마유 추출액을 수득하는 단계, 그리고
   (g) 상기 수득된 마유 추출액을 정제하는 단계를 포함하는, 효소를 이용한 마유 추출 및 정제 방법.
2. 제1항에서,
   상기 (b) 단계의 효소는, 단백질 가수분해 효소인 파파인(Papain)인 것을 특징으로 하는, 마유 추출 및 정제 방법.
3. 제1항에서,
   상기 (b) 단계는,
   0.9 % 농도의 생리식염수에 효소를 투입하여 0.8~8 중량%(w/v) 농도의 효소 수용액을 제조하는 것임을 특징으로 하는, 마유 추출 및 정제 방법.
4. 제1항에서,
   상기 (d) 단계는 45~65 ℃에서 18~30 시간 동안 반응시키는 것임을 특징으로 하는, 마유 추출 및 정제 방법.
5. 제1항에서,
   상기 (e) 단계는 115~125 ℃에서 50~70 분 동안 수행되는 것임을 특징으로 하는, 마유 추출 및 정제 방법.
6. 제1항에서,
   상기 (f) 단계의 수득된 마유 추출액의 수득율은 88~91 %인 것을 특징으로 마유 추출 및 정제 방법.
7. 제1항에서,
   상기 (g) 단계는 마유 추출액에 0.05~0.2 중량%(w/v) 농도의 인산을 투입하고 탈검한 후 65~75 ℃의 증류수로 1차 세척하는 과정과,
   상기 1차 세척된 마유 추출액에 2~3 중량%(w/v) 농도의 NaOH를 1:0.5~2 중량비로 투입하고 탈산한 후 65~75 ℃의 증류수로 2차 세척하는 과정과,
   상기 2차 세척된 마유 추출액에 3~7 중량%(w/v)의 산성백토를 투입한 후 순차적으로 탈수, 탈색 및 탈취하는 과정과,
   상기 탈취된 마유 추출액을 95~105 ℃의 온도에서 교반하면서 가열하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 마유 추출 및 정제 방법.
8. 제1항에서,
   상기 (g)단계의 정제된 마유 추출액의 수득율은 88~91 %인 것을 특징으로 마유 추출 및 정제 방법.
9. 제1항에서,
   상기 (g) 단계의 정제된 마유 추출액의 수분 함량은 0.01~0.03 %인 것을 특징으로 하는 마유 추출 및 정제 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 마유 추출 및 정제 방법에 의해 제조된 마유.

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