KR101617664B1 - 마유의 정제방법, 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 마유의 정제방법, 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세히는, 도축된 말고기로부터 지방 축적이 잘되어 있는 말지방 부위를 선별한 후 이물질 및 고기를 제거하는 선별 단계; 상기 선별된 말지방을 잘게 자르고 Vit-E 아세테이트를 첨가하여 70 ~ 100℃에서 녹이는 추출 단계; 및 상기 추출된 마유를, 마유 중량 대비 1 ~ 10 중량%의 활성탄을 사용하여 여과하는 정제 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 마유의 정제방법, 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 마유의 주요 성분의 손상을 최소화 하고, 인체에 유해한 화학적 물질을 사용 하지 않고 특정연속공정방법으로 제조된 정제 마유를 유효성분으로 한다. 항염 활성과 항산화 단백질 Nrf-2의 활성을 증진 시키는 마유를 피부에 적용시킴으로써, 항상 외부에 노출되어 있어 스트레스를 받는 피부의 항상성을 유지하고 활성 산소에 의한 피부 노화 방지 및 항염 효과가 뛰어나므로 진보된 개념의 저자극성 피부친화적 항노화 화장품을 개발 할 수 있다.

Description

마유의 정제방법, 및 이를 함유하는 화장료 조성물{METHOD OF REFINING HORSE-OIL, AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은, 마유의 정제방법, 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

세포 내에서는 에너지 연소과정에서 자연스럽게 활성산소가 발생되며, 이들 활성산소를 중화할 수 있는 항산화 반응이 동시에 일어난다. 활성산소 생성반응과 항산화 반응이 균형적으로 일어나면, 인체는 정상 성장과 대사가 이루어진다. 그러나 발생되는 활성산소가 세포내에서 처리할 수 있는 항산화 반응의 용량을 초과하게 되면 세포는 산화적 스트레스에 빠지고, 암과 당뇨, 심장병 등 각종 만성 질병 및 노화와 같은 현상을 일으키게 된다.

이를 방지하기 위하여, 세포는 해로운 물질을 해독하고 세포 산화·환원 항상성을 유지하기 위하여 복잡한 신호전달 기작을 발생시킨다. 이러한 신호전달 기작 중 하나는 세포를 보호하고 해독 효소들의 발현을 유도하는데, 제 1단계에서 cytochrome P450 효소에 의하여 활성산소의 발생을 촉진시키는 생체이물(xenobiotic)을 수산화(hydroxylation) 시키고 이 반응을 통하여 물을 생성한다고 알려져 있다. 이후 phase II 시스템 효소 반응을 통하여 완전한 수용성 외부 기질 (hydrophilic xenobiotics)로 변화 되고, 마지막으로 Phase I/II 반응을 통하여 생성된 수용성 외부 기질은 phase III 반응을 통하여 최종적으로 세포 외로 배출된다.

NF-E2 related factor 2 (Nrf-2)는 산화적 스트레스로부터 인체를 보호하고 생체이물 (xenobiotic)의 해독 역할을 하는 phase II 효소라 불리는 일련의 단백질을 조절하는 주 조절자로 알려져 있다. 산화적 스트레스가 없는 경우 세포질내 Nrf2는 Keap1 단백질에 결합되어 끊임없이 유비퀴티네이션(ubiquitination)되어 분해되므로 그 활성이 억제된다. 반면에, 과도한 산화적 스트레스가 있는 경우, Nrf2는 Keap1 단백질로부터 유리되어 핵 내로 이동되고 항산화효소 유전자 프로모터 내에 존재하는 항산화반응요소(ARE, antioxidant response element)에 결합하여 항산화효소를 발현시켜 산화적 스트레스를 제거하려고 한다. 이러한 역할을 통하여 Nrf2는 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

내독소 (endotoxin)로 잘 알려진 LPS (lipopolysaccaride)는 그람-음성세균의 세포외막에 존재하며, 단핵식세포 (macrophage 또는 monocyte)로부터 다양한 염증 발병 인자로 강력한 염증 매개물인 나이트릭 옥사이드 (Nitric oxide, NO)는 NO 합성효소 (NOS)에 의해 L-알지닌으로부터 생성되며, UV와 같은 외부 스트레스나 엔도톡신 또는 사이토카인과 같은 물질에 의해 많은 종류의 세포에서 생성된다. 상기와 같은 염증 자극들은 세포 내의 유도성 NOS (iNOS)의 발현을 증가시키고, 이를 통하여 세포내에서 NO 생성을 유도하여, 대식 세포를 활성화시킴으로써 염증 반응을 일으킬 수 있다.

최근 피부 노화에 관련 있는 활성산소 제거를 위한 항산화제 및 NO의 생성을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 이러한 연구에 의해 개발된 물질의 경우 몇 가지 부작용이 문제되고 있다.

천연 유래 물질로 이러한 부작용이나 세포독성에 대한 위험이 없거나 적으면서, 항산화 및 항염 효과가 우수하여, 부작용이 없을 뿐 아니라 그 함량의 제한 없이 화장품에 사용될 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 특히, 최근에는 소비자들의 욕구에 부응하기 위하여 천연 원료를 이용한 화장료에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있는 실정이다.

마유(馬油, horse oil)는 말의 지방 조직에서 추출한 지방성분 중국의 고전의학서 명의별록(名醫別錄) 및 본초강목(本草綱目)에는 마유 크림의 효능으로 ‘머리카락을 나게 한다’, ‘손발이 트는 것을 낫게 한다’, ‘혈액순환을 도와준다’ 등의 기록이 전해지며, 5~6세기경 중국에서 의약품으로 사용된 기록이 있을 정도로 예로부터 아시아 지역에서 화상이나 아토피 피부염 치료제로 널리 사용되어 왔다. 마유의 주요 성분으로는 팔미톨레산과 세라마이드 등이 있으며, 보습, 피부 보호, 세포 재생 촉진, 자외선 차단, 항균 등의 효능이 있다. 뿐만 아니라 마유는 그 성분이 사람의 피지와 매우 흡사하여, 사람 피부와 친화성이 높으며 불포화지방산이 약 60% 이상 포함되어 있어 피부에 불포화지방산을 공급할수 있는 화장품 원료로 각광 받고 있다.

한국등록특허 제10-0530215 B1 (정제 마유를 이용한 화장품 조성물 및 그 제조방법)에는 마유를 이용한 화장품 조성물에 관한 것으로, 특히 이질감이 없어 피부에 발랐을 때 상쾌한 촉감 및 마무리 후 산뜻한 촉감을 제공하는 마유를 이용한 화장품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

한국공개특허 제10-2012-0044105 A (마유 함유 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물)에는 마유를 함유 생약 추출물을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로, 마유 함유 생약 추출물은 항산화 효과, 일산화질소 생성 억제, 싸이토카인 IL-10의 발현증가, IgE의 발현을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물에 관한 것이다.

그러나 상기 문헌 어디에도 피부 항상성 유지 및 항염 효과를 증진하는 마유의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 대한 개시는 없었다. 이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 소재들에 있어서 화장료로의 응용 가능성을 연구한 결과, 마유를 인체에 유해한 화학적 물질을 가하지 않고 특정연속공정으로 정제 하여, 피부항상성 유지 및 항염 효과를 증진하는 마유를 제조 할 수 있었고, 이에 본 발명을 완성 하게 되었다.

KR 10-0530215 B1 (2005.11.15.) KR 10-2012-0044105 A (2012.05.07.)

본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 마유의 주요 성분의 손상을 최소화 하고, 인체에 유해한 화학적 물질을 사용 하지 않고 특정연속공정방법으로 정제된 마유를 제공 하고, 항산화 단백질 Nrf2 관련 ARE의 활성 및 항염 활성이 증진된 마유의 제조방법 및 피부항상성 유지, 항염 효과가 뛰어난 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서,

도축된 말고기로부터 지방 축적이 잘되어 있는 말지방 부위를 선별한 후 이물질 및 고기를 제거하는 선별 단계;

상기 선별된 말지방을 잘게 자르고 Vit-E 아세테이트를 첨가하여 70 ~ 100℃에서 녹이는 추출 단계; 및

상기 추출된 마유를, 마유 중량 대비 1 ~ 10 중량%의 활성탄을 사용하여 여과하는 정제 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 마유의 정제방법을 제공한다.

또한 본 발명의 정제방법에 있어서, 상기 정제 단계 이후 마유를 4 ~ 10℃에서 저온에서 숙성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마유의 정제방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 정제된 마유를, 전체 조성물 중량 대비, 0.001 ~ 10 중량% 범위 이내로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, Nrf-2 활성 증진, 일산화질소 생성 억제에 의한 항염, 및 피부장벽 강화에서 선택되는 1종 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서,화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업 베이스류 중에서 선택되는 1종 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, Nrf-2 활성 증진 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 정제 마유을 제공한다.

본 발명은 마유의 주요 성분의 손상을 최소화 하고, 인체에 유해한 화학적 물질을 사용 하지 않고 특정연속공정방법으로 제조된 정제 마유를 유효성분으로 한다. 항염 활성과 항산화 단백질 Nrf-2의 활성을 증진 시키는 마유를 피부에 적용시킴으로써, 항상 외부에 노출되어 있어 스트레스를 받는 피부의 항상성을 유지하고 활성 산소에 의한 피부 노화 방지 및 항염 효과가 뛰어나므로 진보된 개념의 저자극성 피부친화적 항노화 화장품을 개발 할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 마유에 대한 HaCaT-ARE-GFP-luciferase 세포에서 ARE 유도능을 나타낸 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 마유에 대하여 RAW 264.7 세포에서 세포독성평가 및 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

종래의 마유 정제방법은, 산/알칼리 처리한 후, 백토 등으로 여과하는 방식을 사용하였으나, 이렇게 하면, 화학반응에 의해 말기름의 유효활성 성분이 분해 또는 변화되는 등의 문제가 있고(결국, 효능/효과의 저하로 이어짐), 잔류 화학물질을 완벽하게 제거할 수 없기 때문에, 잔류물의 정제된 마유의 식품, 화장품, 의약품 용도로의 사용에 있어서, 순도가 크게 문제될 수 있었다. 특히, 잔류 화학물질 성분은 피부 자극 또는 세포 독성 등 인체 적용 시에 트러블을 야기할 우려가 있다.

그러나, 본 발명에서는, 인체에 유해할 수 있는 성분을 정제과정 중에 일체 사용하지 않음으로써, 이에 대한 문제를 불식시키고, 식품, 화장품, 의약품 용도로 사용하기에 적합할 뿐 아니라, 활성 성분이 그대로 유지된 고순도 마유를 제공할 수 있다.

이를 구현하기 위한 본 발명의 일측면은,

도축된 말고기로부터 지방 축적이 잘되어 있는 말지방 부위를 선별한 후 이물질 및 고기를 제거하는 선별 단계;

상기 선별된 말지방을 잘게 자르고 Vit-E 아세테이트를 첨가하여 70 ~ 100℃에서 녹이는 추출 단계; 및

상기 추출된 마유를, 마유 중량 대비 1 ~ 10 중량%의 활성탄을 사용하여 여과하는 정제 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 마유의 정제방법이다.

여기서, ‘Vit-E’는 비타민 E를 약칭하는 용어이다.

상기 말고기는 특별히 제한되지는 않으나, 영양 성분 및 활성 성분 함량이 풍부하고 청정지역에서 자란 제주산 말고기를 사용하는 것이 바람직하다.

종래에는 정제 단계를 산성 백토를 이용하여 주로 정제하였는데, 백토는 기름의 정제작용이 강하다는 장점이 있지만, 백토 속에 여러 광물질과 중금속이 함유되어 있어, 마유의 유용성분을 일부 산패시키거나, 정제 후의 마유에 중금속을 잔류시키는 문제점이 있다. 이러한 산패된 성분이나 중금속 성분은 피부 자극 또는 세포 독성 등 인체 적용 시에 트러블을 야기할 우려가 있다.

이에 본 발명에서는 산성 백토 대신에 마유의 유용성분과 화학적 반응 우려가 없을 뿐 아니라, 그 자체로서도 인체에 무해한 활성탄을 사용한다. 사용되는 활성탄은, 마유 중량 대비 1 ~ 10 중량%가 바람직한데, 1 중량% 미만에서는 정제가 잘 이루어지지 않고, 10 중량% 초과에서는 활성탄 양에 따른 정제 효과 증대 정도는 포화된 상태임에 반해 활성탄에 흡착되어 소모되는 마유의 양만 증가되는 상황이므로 바람직하지 아니하다.

상기 추출 단계 및 정제 단계는, 통상의 기술자의 필요에 따라, 수회 반복적으로 수행될 수도 있다. 다만, 도축된 말지방은 보관 상태에 따라 불포화 지방산의 산화가 쉽고, 냄새와 색이 변하기 때문에, 가급적 도축후 빠른 시간 내에 정제가 이루어져야 한다.

종래에는 말지방으로부터 마유를 추출하기 위해, 단순히 말지방을 고온 스팀 등으로 2시간 이상 가열하는 방식을 사용하였는데, 이때 말지방에 수용액 상태의 물질을 가하게 되면 마유 특성상 산패가 빨리 진행되기 때문에, 마유 추출 및 정제시에는 최대한 유의하여야 한다.

이에 본 발명에서는 이러한 산패의 문제점을 해결하기 위해, Vit-E 아세테이트를 첨가하여 마유를 녹여 추출함으로써, 마유의 산패를 근본적으로 막고, Vit-E 아세테이트에 의한 지용성 성분 용해작용에 의해, 마유의 유용성분이 보다 잘 추출되도록 한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계 이후 마유를 4 ~ 10℃에서 저온에서 숙성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 숙성을 통해, 잡내 등을 유발할 수 있는 유기 휘발성 성분을 날려버리고, 마유의 안정성을 높힐 수 있다. 이 때 저온 상태를 유지함으로써, 마유의 유용성분의 산패를 막을 수 있다. 숙성 시간은, 통상의 기술자가 적절하게 조절할 수 있지만, 산패 등을 고려하여 가급적 12시간 이내인 것 바람직하고, 8시간 이내인 것이 더 바람직하다.

또한, 본 발명의 다른 측면은,

상기 본 발명의 정제방법으로 정제된 마유를 포함하는 화장료 조성물이다.

상기 정제 마유는, 조성물 중량 대비, 0.001 ~ 10 중량% 범위 이내로 포함하는 것이 바람직한데, 0.001 중량% 미만에서는 원하는 효능을 내기에 부족할 수 있고, 10 중량% 초과에서는, 세포독성증가, 생체 유래물질 제제의 보관 안정성 및 제제화 문제 등이 발생할 우려가 있어 바람직하지 않다.

본 발명의 마유를 포함하는 화장료 조성물은, Nrf-2 활성 증진, 일산화질소 생성 억제에 의한 항염, 및 피부장벽 강화에서 선택되는 1종 이상의 효과를 가진다.

여기서, ‘Nrf2’는, ‘NF-E2-related factor-2’의 약어로서, antioxidant-response element (ARE)에 결합하여 다양한 항산화 유전자들의 발현을 조절하는 필수 전사인자이다. ‘Nrf2’라는 용어는 통상의 기술자에게 널리 사용되므로, 이에 대한 정의는 통상적으로 사용되는 것을 그대로 따르고, 이에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.

특히, 마유는, 항산화 단백질 Nrf-2와 관계된 ARE의 활성을 증진시켜, 피부 항상성을 유지하고 활성 산소에 의한 피부 노화 방지 및 뛰어난 항산화 효과를 나타낸다. 또한, 일산화질소(NO)생성을 억제하여 뛰어난 항염 효과를 나타낸다. 이에 대한, 보다 상세한 이해는 후술할 실시예 및 실험예를 통하여 이루어질 수 있을 것이다.

상기 마유를 함유한 화장료 조성물은, 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업 베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 비교예, 시험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예로 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

실시예

실시예 1

제주도가 원산지인 도축된 말고기로부터 지방 축적이 잘되 있는 신선한 말지방 부위를 이물질 및 고기를 제거하여 선별하였다. 상기 선별된 1kg의 말지방을 잘게 자르거나 분쇄하여 Vit-E acetate를 첨가하여 70 ~ 100℃에서 2시간 가열하여 지방을 액화시켜 여과하여 마유를 추출하였다. 추출된 마유에 활성탄을 마유 중량대비 1 ~ 10%를 사용하여 45 ~ 65℃ 감압 조건에서 정제를 진행 하였으며, 이를 1 um, 0.45 um 필터로 여과하여 백색의 정제 마유를 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 “실시예1” 이라하고, 하기 시험예 에서 사용 하였다.

비교예 1

제주도가 원산지인 도축된 말고기로부터 지방 축적이 잘되 있는 신선한 말지방 부위를 이물질 및 고기를 제거하여 선별하였다. 상기 선별된 1kg의 말지방을 잘게 자르거나 분쇄하여 70 ~ 100℃에서 2시간을 가열하여 지방을 액화시켜 여과하여 마유를 추출하였다. 추출된 마유에 활성탄을 마유 중량대비 1 ~ 10%를 사용하여 45 ~ 65℃ 감압 조건에서 정제를 진행 하였으며, 이를 1 um, 0.45 um 필터로 여과하여 얻은 정제마유를 4 ~ 10℃ 온도에서 저온 숙성하는 단계를 거쳐 백색의 정제 마유를 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 “비교예1” 이라하고, 하기 시험예에서 사용 하였다.

비교예 2

제주도가 원산지인 도축된 말고기로부터 지방 축적이 잘되 있는 신선한 말지방 부위를 이물질 및 고기를 제거하여 선별하였다. 상기 선별된 1kg 말지방과 물을 50:50의 중량비로 개량하여 70℃ ~ 100℃ 에서 2시간을 가열하여 지방을 액화시켜 여과하여 마유를 추출하였다. 이후 마유에 함유되어 있는 인지질, 단백질 및 기타 점질물을 제거하기 위하여 원료 마유를 0.1%의 농도를 유지하고 있는 인산으로 처리를 한 다음, 이를 60∼70℃의 물로 충분히 수세한다. 탈검 공정을 위해 마유의 지방산을 제거하기 위해 인산 처리된 상기 원료 마유에 2.5%의 농도로 희석된 가성소다를 다시 가하여 이를 60∼70℃의 물로 충분히 수세한다. 마유 중에 소량 존재하는 수분을 제거하고 탈색 및 탈취를 위해 5%중량 산성백토를 가한 다음, 110∼120℃로 가온하여 충분히 교반될 때 까지 교반한다. 충분히 교반, 가열된 마유를 1 um, 0.45 um 필터로 여과하여 정제된 마유를 얻었다. 이와 같이 수득된 마유를 “비교예2”라 하고, 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1

HaCaT -ARE- GFP - luciferase 세포에서 ARE 유도능 활성

본 발명의 마유에 대한 Nrf2 활성을 유도능 활성을 알아보기 위하여, HaCaT-ARE-GFP-luciferase 세포를 사용 하였다. HaCaT-ARE-GFP-luciferase 세포는 human keratinocyte 세포주인 HaCaT 세포에 Nrf2 단백질이 결합하는 anti-oxidant response element (ARE)가 삽입되어 있는 세포로 약물에 의해 ARE가 활성화되면 GFP, Luciferse를 동시 발현하게 된다.

HaCaT-ARE-GFP-luciferase 세포에 실시예 1, 및 비교예 1, 비교예 2에서 제조된 마유를 각각 0.1%, 1%, 5%, 10%의 농도로 24 시간 처리하고 이후 각각의 luciferase 값을 측정하고, Student t-test를 통하여 활성도를 통계처리를 하여 ARE 유도능을 비교하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1 마유를 처리한 결과 농도 의존적으로 Nrf2 전사인자 발현이 증가되는 것을 알 수 있었으며, 10% 처리시 6배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 2

세포독성실험

본 발명의 마유에 대한 세포 독성을 측정하기 위하여, 쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 한국 세포주 은행에서 구입하여 사용하였다. 상기 세포의 배양에 사용된 Antibiotic , Fetal bovine serum (FBS), Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)는 Gibco/RBL(USA)에서 구입하였다. 상기 RAW 264.7 세포는 1 % antibiotic과 10 % FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였으며, 2 일에 한번 씩 계대 배양을 실시하였다. RAW 264.7 세포를 24 웰 플레이트에 웰 당 1.8 × 10⁵ cells/mL 세포로 분주하여 부착시킨 후 37 ℃, 5 % 농도의 CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 24 시간 배양 후 실시예1, 비교예1, 비교예2 에 대한 세포독성 유발 유무를 MTT 분석을 통해 확인하였다. 상기 MTT분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. MTT 분석은 세포 생존율을 측정하는 대표적인 방법으로, 대사가 왕성한 살아있는 세포는, 세포 내 mitochondria의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성의 노란색인 3-(4,5-dimethylthiaxo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 환원시켜 자주색을 띠는 비수용성 formazan을 형성 한다. RAW 264.7 cell를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.8 × 10⁵ cells/mL로 96 well plate에 넣고 18 시간 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시에 처리하고 24 시간 배양하였다. 이후 MTT 용액 50 μL를 첨가하여 4 시간 동안 반응 시켰다. 배양배지를 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)를 200 μL를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, microplate reader를 사용하여 540 nm 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생장률을 평가하였다.

도 2에 나타낸 봐와 같이, 상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 마유에 대해 모든 처리농도에서 세포독성을 거의 유발하지 않음을 확인할 수 있었다.

시험예 3

일산화 질소 (NO) 생성 억제 활성 측정 실험

본 발명의 마유에 대한 항염 효과를 확인하기 위하여, 염증을 일으키는 물질 중 하나인 일산화질소 (NO)의 생성억제능을 분석 하였다. 상기 시험예 2에서 배양한 RAW 264.7 세포를 이용하였으며, 실시예1 및 비교예1, 비교예2 에서 제조된 마유와 Lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL)를 함께 처리하여 NO 생성을 유도한 다음, 그리스 반응 (Greiss reaction)을 통하여 NO 생성 저해능을 분석하였다. 그리스 반응은 배양 세포로부터 생성되어 배지로 방출된 NO의 양을 정량적으로 분석하는 방법으로 24 시간의 시료 처리 후 세포 배양 배지 100 μL를 96-웰 플레이트에 분주한 후 그리스 반응용액 A (5 % 인산용액에 용해시킨 1 % 설파닐아미드 용액), B (0.1 % 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드) 완충액을 1:1로 섞어 96-웰 플레이트에 100 μL씩 분주하고 NO 생성에 따른 색의 변화를 멀티-플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서의 흡광도로 측정하였으며, 그 값은 3 회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다. 하기 도2 에서 나타낸 바와 같이, LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하였고, iNOS inhibitor인 2-amino- 4-methylpyridine은 NO의 생성을 95.7% 억제함을 확인할 수 있었다.

도 2에서 나타낸 바와 같이 실시예 1에서 제조된 마유 5%, 마유 10%를 처리한 결과 LPS 단독 처리군과 비교해 볼때 NO의 생성을 각각 44.9 %, 60.8% 억제하는 것으로 나타나 높은 NO 생성 억제 활성을 보였다. 반면 비교예 1에서 제조된 마유 5%, 10%를 처리한 결과 각각 21%, 34.3%로 실시예1 결과 보다 미미한 NO생성 억제 활성을 보였다.

실시예 2, 및 비교예 3

마유를 함유하는 크림 제제(제형)

상기 실시예 1에서 제조한 마유를 함유하는 크림의 성분구성을 하기 표 1와 같이 구성하여 제조하였다.

번호	성 분	실시예 2	비교예 3
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	실시예 1(마유)	5.0	-
	비교예 2(마유)	-	5.0
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향	미량	미량

상기 표 1의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 15 및 17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1 내지 11 및 16을 80℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 15 및 17의 용액에 투입하고 호모믹서 (Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다.

시험예 5

피부 일차 자극 평가

상기 실시예 2, 및 비교예 3의 화장료 조성물을 이용하여 실시한 피부 1차 자극 정도를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 피험자 선정은 선정조건을 만족하고 제외조건에 해당사항이 없는 성인 30명 이상 선정하여 수행하였으며, 피험자의 척추를 제외한 등의 평평한 부위로 착색이나 피부손상이 없는 부위에 첩포하였다. 피부 자극정도 평가는 Frosch & Kligman, CTFA(Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) guideline에 의해 평가하였으며 결과 계산은 하기 표 2의 등급 판정 기준에 따라 아래의 수학식 1을 이용하여 피부반응도를 판정하였다. 또한 시험 물질의 피부자극정보는 아래의 수학식 2을 이용하여 하기 표 3의 피부 자극 지수표를 참조하여 판정하였다.

기호	등급	판정 기준
+	1	약간의 홍반, 반점 또는 미만성(diffuse)
++	2	증등도의 균일한 홍반
+++	3	부종을 동반한 심한 홍반
++++	4	부종과 소수포를 동반한 심한 홍반

피부자극지수	구분	비고
0.00 ~ 0.25	비자극성	6.25%
0.26 ~ 1.00	약한 자극성	25.0%
1.01 ~ 2.50	중등도 자극성	62.5%
2.51 ~ 4.00	강한 자극성	100.0%

하기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 실시예 2, 및 비교예 3의 크림을 24시간 첩포 하고, 첩포 제거 1시간, 24시간 후의 피부반응을 연구자가 육안으로 평가하여 피부자극 지수 및 피부자극 정도를 관찰 한 결과, 제형 실시예1은 비자극성, 제형 비교예1은 약한자극성 으로 판정되었다.

시험제품	피부자극지수	피부자극정도
실시예 2	0.03	비 자극성
비교예 3	0.85	약한자극성

시험예 7

피부장벽 강화 측정

피부장벽기증의 측정방법 중 진피에서 각질층을 통한 수분손실을 측정하는 경표피수분손실 (TEWL:transepidermal water loss)측정은 각질층 상태의 평가와 피부장벽기능의 간전평가로 흔히 이용되고 있으며, 피부 표면의 수분함량은 수분함량에 따른 정전 용량 (capacitance)을 측정함으로써 수분 함량의 상대적 크기를 측정하였다. 피험자 선정은 선정조건을 만족하고 제외조건에 해당사항이 없는 성인 30명 이상 선정하여 수행하였으며, 피부 손상 개선 도움 측정은 실시예 2와 비교예 3의 사용 전 TEWL 측정하고 SLS 손상을 유도한 뒤의 Vapometer 경표피 수분손실량 (TEWL) 측정하였다.

하기 표5 에서 나타낸 바와 같이, 마유가 함유되지 않은 제형 비교예 1에서 피부 TEWL 측정값은 처음 측정 시 17.32±11.27, 2주 후 16.41±9.62였고, 마유가 함유된 제형 실시예 1에서는 처음 측정시 18.13±5.32, 2주 후 11.25±10.53이었다. 크림 사용 전후의 TEWL의 평균 변화량은 대조제품에서 0.91±8.15, 시험제품에서 6.88±5.21로, 시험제품 사용 2주 후에 감소된 것으로 관찰되었다. 이는 2주간 사용 이후 수분 손실량이 감소되었고, 이는 마유가 함유된 제형 실시예 1의 크림을 사용함으로써 수분 손실이 감소됨으로써 피부장벽이 강화되었음을 보여주는 결과이다.

실험		0주	2주	개선효과
TEWL	실시예 2	18.13±5.32	16.41±9.62	6.88±5.21
	비교예 3	17.32±11.27	16.41±9.62	0.91±8.15

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

[제형예1] 유연화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	마유	1.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

[제형예2] 수렴화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	마유	1.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

[제형예3] 영양화장수

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	마유	3.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

[제형예4] 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	마유	3.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

[제형예5] 팩

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	마유	3.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

Claims (8)

1. 도축된 말고기로부터 지방 축적이 잘되어 있는 말지방 부위를 선별한 후 이물질 및 고기를 제거하는 선별 단계;
   상기 선별된 말지방을 잘게 자르고 Vit-E 아세테이트를 첨가하여 70 ~ 100℃에서 녹이는 추출 단계; 및
   상기 추출된 마유를, 마유 중량 대비 1 ~ 10 중량%의 활성탄을 사용하여 여과하는 정제 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 마유의 정제방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 정제 단계 이후 마유를 4 ~ 10℃에서 저온에서 숙성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마유의 정제방법.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에서 정제된 마유를, 전체 조성물 중량 대비, 0.001 ~ 10 중량% 범위 이내로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 피부의 항상성 유지, 활성산소에 의한 피부노화 방지 및 항산화 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 청구항 3에 있어서,화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업 베이스류 중에서 선택되는 1종 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 청구항 3에 있어서, 일산화질소 생성 억제에 의한 항염 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 청구항 3에 있어서, 피부장벽 강화 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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