KR20190123780A

KR20190123780A - 항염증제

Info

Publication number: KR20190123780A
Application number: KR1020197029589A
Authority: KR
Inventors: 타쿠야 니이; 아키후미 하기; 요시 츠보타니
Original assignee: 가부시기가이샤오오쓰까세이야꾸고오죠오
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2019-11-01
Also published as: AU2018256060B2; CA3058592C; ES2956040T3; AU2018256060A1; EP3628314A4; CA3058592A1; JPWO2018193904A1; JP6802365B2; EP3628314A1; SG11201908629WA; TWI675658B; TW201841631A; WO2018193904A1; CN110494132A; KR102253831B1; RU2738845C1; PH12019550207A1; EP3628314B1; US11229615B2; US20210121417A1

Abstract

본 발명은, 신규의 항염증제로 이용할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.
올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염을 포함하는 조성물을 이용함으로써, 구내염, 구강 점막염, 치은염, 폐렴 등의 염증을 개선 및/또는 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 바람직하게는 폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머를 더 포함한다.

Description

항염증제

본 발명은, 올라넥시딘(Olanexidine) 또는 그 약리학상 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 항염증제에 관한 것이다.

올라넥시딘은, 화학명 1-(3, 4-디클로로벤질)-5-옥틸비구아니드라는 높은 살균 활성을 갖는 화합물이다. 그 글루콘산염인 올라넥시딘 글루콘산염은, 넓은 살균 스펙트럼을 갖고, 살균 효과가 단시간에 나타나고, 또한 그 활성이 장시간 지속된다. 또한, 올라넥시딘 글루콘산염의 수용액은, 안정성이 높고, 장기간 보존할 수 있고, 게다가, 피부에 대한 자극성이나 독성이 낮아, 안전성 면에서도 우수하다. 그 뿐 아니라, 올라넥시딘 글루콘산염의 수용액은, 색, 냄새 및 맛에 문제가 없으므로, 제제화하기 쉽다(특허문헌 1). 그러므로, 올라넥시딘 글루콘산염은, 수술 부위(수술야)의 피부의 소독에 주로 이용되고 있다.

그러나, 올라넥시딘이나 그 염이 항염증 작용을 나타내는 것은, 지금까지 알려지지 않았다. 또한, 올라넥시딘 글루콘산염은 점막에 대하여 자극성을 갖기 때문에, 올라넥시딘 글루콘산염의 구강 점막 등의 점막에 대한 적용은 어렵다.

특허문헌 1: 일본 특허공개공보 2005-289959호

본 발명의 과제는, 신규의 항염증제로 이용할 수 있는 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 열심히 연구를 거듭한 결과, 올라넥시딘이나 그 염이 항염증 작용을 나타내는 것을 예상외로 발견했다. 또한, 올라넥시딘 글루콘산염과, 폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머를 포함하는 조성물을 이용함으로써, 올라넥시딘 글루콘산염의, 구강 점막 등의 점막에 대한 적용이 가능해지는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 아래와 같다.

(1) 올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염을 포함하는, 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물.

(2) 올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염이, 올라넥시딘 글루콘산염인 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 조성물.

(3) 폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 조성물.

(4) 염증이, 구내염, 구강 점막염, 치은염, 및 폐렴으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(5) 염증이 암 치료에 의한 구강 점막염이며,

0.01~1.5%(w/v)의 올라넥시딘 글루콘산염;

폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(6) 폴록사머가, 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123), 폴리옥시에틸렌(54)폴리옥시프로필렌(39)글리콜(Pluronic P-85), 및 폴리옥시에틸렌(196)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic F-127)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 (3)~(5) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(7) 폴록사머가, 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123)인 것을 특징으로 하는 상기 (6)에 기재된 조성물.

(8) 올라넥시딘 글루콘산염의 농도가, 0.05~0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(9) 폴록사머의 농도가, 0.1~5.0%(w/v)인 것을 특징으로 하는 상기 (3)~(8) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(10) 액제(液劑) 또는 함수제(含嗽劑)인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(9) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(11) 암 치료가, 화학 요법, 방사선 치료, 또는 화학 요법과 방사선 치료의 동시 병용 요법인 것을 특징으로 하는 상기 (5)~(10) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

또한, 본 발명의 실시의 다른 형태로, 상기 본 발명의 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물을 염증의 개선이나 예방(치료)을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 염증의 개선이나 예방(치료)을 하는 방법이나, 상기 본 발명의 암 치료에 의한 구강 점막염 개선용 및/또는 예방용 조성물을, 암 치료에 의한 구강 점막염의 개선이나 예방(치료)을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 암 치료에 의한 구강 점막염의 개선이나 예방(치료)을 하는 방법이나, 염증의 개선이나 예방(치료)에 사용하기 위한 올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염을 포함하는 조성물이나, 암 치료에 의한 구강 점막염의 개선이나 예방(치료)에 사용하기 위한, 0.01~1.5%(w/v)의 올라넥시딘 글루콘산염과, 폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머를 포함하는 조성물이나, 상기 본 발명의 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물을 조제하기 위한, 올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염의 사용이나, 상기 본 발명의 암 치료에 의한 구강 점막염 개선용 및/또는 예방용 조성물을 조제하기 위한, 0.01~1.5%(w/v)의 올라넥시딘 글루콘산염과, 폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머의 사용을 들 수 있다.

본 발명에 의해, 신규의 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은, 폐렴, 구내염, 치은염, 폐렴 등의 폭넓은 염증에 적용 가능하다. 또한, 본 발명의 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물(항염증제)은, 암의 화학 요법, 방사선 치료, 또는 화학 요법과 방사선 치료의 병용 요법을 받고 있는 환자의 구강 점막염을 개선 및/또는 예방할 수 있고, 나아가서는, 환자의 커뮤니케이션 기능 저해, 수면 장애, 동통, 삼킴 장애(식사 섭취량의 감소) 등의 QOL 저하나, 화학 요법, 방사선 치료의 Dose 준수 방해를 막을 수 있다.

도 1은 실시예 1의, 호기성 배양에 의한 구강 내 세균수의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 세로축의 세균수는 대수값으로 나타냈다.
도 2는 실시예 1의, 연쇄상 구균 선택 배지에서의 배양에 의한 구강 내 세균수의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 세로축의 세균수는 대수값으로 나타냈다.
도 3은 실시예 1의, 혐기성 배양에 의한 구강 내 세균수의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 세로축의 세균수는 대수값으로 나타냈다.
도 4는 실시예 1의, 세균 계수기에 의한 구강 내 세균수의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 세로축의 세균수는 대수값으로 나타냈다.
도 5는 실시예 2의, 올라네딘(등록상표) 소독액(OPB)과 타제(他濟)의 비교 시험 결과를 나타내는 도면이다. 세로축의 세균수는 대수값으로 나타냈다.
도 6은 실시예 3의, 살균 효력에 미치는 올라넥시딘 농도의 영향을 검토한 결과를 나타내는 도면이다. 세로축의 세균수는 대수값으로 나타냈다.
도 7은 실시예 4의, 각 군의 체중 변화를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 4의, 육안적 관찰 결과를 나타내는 표이다. 표 중의 수치는 구내염 grade를 나타내고, 망점은 백혈구 감소 유사 증상(각화(角化) 항진, 비후(肥厚) 등)을 보인 군을 나타낸다.
도 9는 실시예 4의, 마지막 날의 각 군의 협낭(頰囊)의 사진이다.
도 10은 실시예 4의, 병리 조직학적 검사 결과를 나타내는 표이다.
도 11은 실시예 5의, 육안적 관찰 결과를 나타내는 표이다. 표 중의 수치는 구내염 grade를 나타내고, 망점은 백혈구 감소 유사 증상(각화 항진, 비후 등)을 보인 군을 나타낸다.
도 12는 실시예 5의, 병리 조직학적 검사 결과를 나타내는 표이다.
도 13은 실시예 6의, 햄스터 구강에서의 생존균수를 나타내는 도면이다. 세로축의 세균수는 대수값으로 나타냈다.
도 14는 실시예 6의 구내염 grade를 나타내는 도면이다. 구내염 grade를 세로축에 나타낸다.
도 15는 실시예 7의 구내염 grade를 나타내는 도면이다. 구내염 grade를 세로축에 나타낸다.
도 16은 실시예 8의 구내염 grade를 나타내는 도면이다. 구내염 grade를 세로축에 나타낸다.
도 17은 실시예 9의, 병리학적 검사 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 실시예 9의, HE 염색 표본의 현미경 사진이다.
도 19는 실시예 10의, 혈액학적 검사 및 생화학적 검사의 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 실시예 11의, 올라네딘(Olanedine)(등록상표) 소독액(OPB)에 의한 SEAP 발현의 저해율을 나타내는 도면이다.
도 21은 실시예 12의, 올라네딘(등록상표) 소독액(OPB)에 의한 NO 산생(産生) 저해를 나타내는 도면이다.

본 발명의 조성물은, 올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염을 포함하는 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물이다. 올라넥시딘의 약리학상 허용되는 염으로는, 약리학상 공지된 것을 이용할 수 있고, 예를 들어, 염산염, 탄산염, 탄산수소염, 구연산염, 글루콘산염, 젖산염, 아세트산염, 글루셉테이트(gluceptate), 주석산염 등을 예시할 수 있지만, 물에 대한 용해성의 관점에서 올라넥시딘 글루콘산염이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 있어서, 올라넥시딘은 항염증 작용을 나타낼 수 있는 농도로 포함되어 있으면 되고, 올라넥시딘 글루콘산염 환산으로 0.001~20%(w/v), 바람직하게는 0.005~15%(w/v), 보다 바람직하게는 0.01~10%(w/v), 보다 더 바람직하게는 0.1~5%(w/v)를 예시할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 구강 점막 등의 점막에 적용하는 경우, 올라넥시딘의 농도는, 올라넥시딘 글루콘산염 환산으로 0.01~1.5%(w/v)가 바람직하고, 0.05~0.5%(w/v)가 보다 바람직하고, 0.1~0.3%(w/v)가 보다 더 바람직하다. 그리고, 본 발명의 조성물을 구강 점막에 적용하는 경우, 올라넥시딘 글루콘산염의 농도가 0.01%(w/v)보다 낮으면 구강 세균의 살균 효력을 충분히 얻지 못하고, 1.5%(w/v)를 초과하면, 구강 점막에 대한 자극이 너무 강해지기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 조성물은, 적용 부위에 대한 자극을 저감시키기 위해, 1종 또는 2종 이상의 폴록사머를 더 포함할 수도 있다. 여기서 폴록사머로는, 폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체로서, 적용 부위에 대한 자극을 저감시키는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123), 폴리옥시에틸렌(54)폴리옥시프로필렌(39)글리콜(Pluronic P-85), 및 폴리옥시에틸렌(196)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic F-127)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 폴록사머가 바람직하고, 그 중에서도 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123), 폴리옥시에틸렌(3)폴리옥시프로필렌(17)글리콜(Pluronic L-31), 폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(20)글리콜(Pluronic L-44), 폴리옥시에틸렌(120)폴리옥시프로필렌(40)글리콜(Pluronic F-87), 폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜(Pluronic F-68)을 예시할 수 있다.

상기 폴록사머 중에서도, 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123), 폴리옥시에틸렌(54)폴리옥시프로필렌(39)글리콜(Pluronic P-85), 및 폴리옥시에틸렌(196)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic F-127)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 폴록사머가 바람직하고, 그 중에서도 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123)이 보다 바람직하다.

폴록사머의 농도로는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 0.1~5.0%(w/v), 바람직하게는 0.1~4.0%(w/v), 보다 바람직하게는 0.1~3.0%(w/v), 보다 더 바람직하게는 0.1~2.0%(w/v), 가장 바람직하게는 0.1~1.5%(w/v)를 들 수 있다. 또한, 올라넥시딘 글루콘산염과 폴록사머의 농도비는, 1:2~1:20이 바람직하고, 1:5~1:10인 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 조성물을 구강 점막에 적용하는 경우, 올라넥시딘 글루콘산염 농도 0.3%(w/v) 이상의 고농도 영역에서는, 올라넥시딘 글루콘산염에 의한 구강 점막에 대한 자극이 보다 강하기 때문에, 폴록사머량을 보다 많게 하는 편이, 올라넥시딘 글루콘산염에 의한 자극(각화 항진)을 억제하는데 바람직하다.

본 명세서에 있어서, 「염증」이란, 자가 면역 질환 등의 내적 요인, 또는, 세균·바이러스 감염, 외상, 물리적 자극(열, 한랭, 방사선, 전기 등), 화학 물질 등의 외적 요인에 의해, 발적, 열감, 종창, 동통과 같은 징후가 발생하는 생체 반응을 의미한다. 본 발명에서의 염증으로는, 본 발명의 조성물을 적용할 수 있는 염증이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 Toll 유사 수용체가 관여하는 염증, 보다 바람직하게는 세균 감염에 의한 염증을 들 수 있다. 또한, 염증 부위로는, 뇌, 눈, 기관, 혈관, 폐, 간, 심장, 췌장, 위, 장, 장간막, 신장, 피부, 비염막, 구강 점막, 잇몸 혹은 관절을 예시할 수 있고, 구체적으로는, 뇌염, 기관지염, 혈관염, 폐렴, 간염, 심근염, 췌장염, 장염, 위염, 복막염, 신장염, 구내염, 구강 점막염, 치은염, 관절염, 허혈후 재관류 장애에 기인하는 염증, 이식후 면역 거부에 기인하는 염증, 화상, 다발성 장기 부전에 기인하는 염증, 수술 후에 발생하는 염증, 및 동맥 경화증에 기인하는 염증을 들 수 있고, 그 중에서도, 구내염, 구강 점막염, 치은염, 및 폐렴을 바람직하게 예시할 수 있다. 본 명세서에 있어서 구강 점막염이란, 암 치료에 의해 구강 점막에 발생한 염증을 말하고, 구내염이란, 암 치료에 관계없이 구강 점막에 발생한 염증을 말한다. 또한, 본 발명의 조성물은, 암 치료에 의한 구강 점막염 개선용 및/또는 예방용과 같은 특정 용도를 갖는 조성물일 수도 있지만, 일 양태에 있어서, 본 발명은, 암 치료에 의한 구강 점막염 개선용 및/또는 예방용과 같은 용도를 갖는 조성물을 제외한다.

본 발명의 조성물은, 염증 부위의 피부나, 구강 점막, 잇몸, 소화관, 기관, 폐 등의 점막에 적용할 수 있다. 투여 방법으로는, 주사(정맥내, 근육내, 피하, 피내, 복강내 등), 경구, 경피, 흡입, 구강내에 대한 도포, 잇몸에 대한 도포, 함수(含嗽) 등을 들 수 있고, 이들의 투여 방법에 따라 적절히 제제화할 수 있다. 또한, 선택할 수 있는 제형도 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 주사제(용액, 현탁액, 유탁액, 용시 용해용(用時溶解用) 고형제 등), 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 액제, 함수제, 리포화제, 연고제, 겔제, 외용 산제, 스프레이제, 흡입 산제 등으로부터 폭넓게 선택할 수 있다. 또한, 이들의 제제 조제 시, 관용적인 부형제, 안정화제, 결합제, 활택제, 유화제, 삼투압 조정제, pH 조정제, 기타 착색제, 붕해제 등, 통상적으로 의약에 이용되는 성분을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물을 구강 내에 적용하는 경우, 구강 내에 적용하는데 적합한 어떠한 제형이어도 되지만, 바람직하게는 액제, 함수제를 들 수 있다. 또한, 사탕류, 캔디류, 젤리류, 트로치류, 껌류 등의, 입안에서 서서히 용해 또는 붕해되는 고형 조성물이어도 된다. 또한, 필요에 따라, 풍미(風香味)를 부여하거나 착색하는 목적으로 이용되는 각종 첨가물을 더 함유할 수 있다. 풍미 부여를 목적으로 하는 첨가물로는, 예를 들어 합성 향료, 천연 향료, 아스파탐, 아세설팜칼륨, 수크랄로오스, 알리탐, 네오탐, 감초 추출물(글리실리진), 사카린, 사카린나트륨, 스테비아 추출물, 스테비아 가루(Powdered stevia) 등의 감미료를 들 수 있다. 착색을 목적으로 하는 첨가물로는, 카라멜, 천연 착색료, 합성 착색료를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은, 유화제(글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 레시틴 등), 안정제, 방부제 등의 첨가물을 함유할 수도 있다. 이들 첨가제는, 단독으로 사용할 수도, 2종 이상 조합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 조성물을 액제 또는 함수제로 투여하는 경우의 1회당 투여량으로는, 염증이 발생한 부위나 중증도(重篤度)에 따라 임의로 결정할 수 있지만, 1~100 mL, 바람직하게는 2~50 mL, 보다 바람직하게는 5~40 mL, 가장 바람직하게는 10~30 mL를 들 수 있다.

본 발명의 조성물을 투여하는 시기로는, 염증이 발생한 부위나 중증도, 또는 염증의 개선도에 따라 임의로 결정할 수 있지만, 식후 또는 기상 후 혹은 취침 전을 들 수 있다. 혹은, 2~8시간 간격으로, 바람직하게는 4~6시간 간격으로 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 조성물은, 수술 전의 환자, 오랄 케어 후의 환자에게 투여함으로써, 염증을 예방할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여 기간으로는, 염증의 개선도에 따라 임의로 결정할 수 있지만, 1주간~3개월, 바람직하게는 1주간~2개월, 보다 바람직하게는 1주간~1개월, 가장 바람직하게는 1~2주간을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 암 치료로는, 암의 화학 요법, 방사선 치료, 또는 화학 요법과 방사선 치료의 동시 병용 요법을 들 수 있다. 암의 화학 요법이란, 항암제에 의한 암의 치료 전반을 가리킨다. 본 발명에서 사용되는 항암제로는, 구강 점막염을 일으키기 쉬운 플루오로우라실(5-FU), 테가푸르·기메라실(Gimeracil)·오테라실(Oteracil) 칼륨(S-1), 테가푸르·우라실(UFT) 등의 불화피리미딘계 대사 길항제, 메토트렉세이트 등의 엽산 대사 길항제, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 페플로마이신, 악티노마이신 D 등의 항종양성 항생 물질, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 에토포시드 등의 식물 알카로이드, 시스플라틴, 카보플라틴, 네다플라틴(Nedaplatin) 등의 백금 제제를 들 수 있고, 특히 5-FU 등의 불화피리미딘계 대사 길항제를 바람직하게 예시할 수 있다. 이들 항암제는, 단독으로 이용할 수도, 2종 이상을 병용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 방사선 치료란, 악성 종양부에 방사선을 조사하여 암세포의 증식을 억제하는 것을 목적으로 한 치료이며, 그 치료에 사용되는 방사선으로는, X선, 전자선 등을 들 수 있다. 또한, 화학 요법과 방사선 치료의 동시 병용 요법은, 암의 국소 요법인 방사선 요법을 항암제와 병용함으로써, 방사선의 효과를 강화하는 치료법을 가리킨다. 방사선 치료의 대상 부위는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 두경부, 특히 구강 내나 인두부에 대한 방사선 치료를 예시할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들의 예시에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 필리핀원숭이를 이용한 구강 내 살균 효력 시험

본 시험에서는 간이 세균 계수기와 배양법을 병용하여, 시험 물질(살균 소독제로 0.1%(w/v) 올라넥시딘 글루콘산염 및 0.47% 포비돈요오드, 음성 대조약으로 생리 식염액)의 필리핀원숭이 구강 내 세균에 대한 살균 효력을 비교, 검토했다.

1-1 시험 물질

피험 물질은 올라네딘(등록상표) 소독액 1.5%(이하 「1.5%OPB」 등이라 하는, 올라넥시딘 글루콘산염으로 1.508%(w/v)를 포함하는 액, 가부시키가이샤오오츠카세이야쿠코죠 제품)를 15배 희석하여, 올라넥시딘 글루콘산염 농도가 0.1%(w/v)가 되도록 조제했다(0.1% OPB). 대조 물질의 이소딘 가글(ISODINE GARGLE)액 7%(이하 「7%PVP-I」 등이라 한다, Meiji Seika파마가부시키가이샤 제품)는 15배 희석하고(0.47%PVP-I), 생리 식염액(Saline, 가부시키가이샤오오츠카세이야쿠코죠 제품)은 그대로 이용했다.

1-2 시험 동물

사용 시 연령 2세 11개월~3세 11개월령의 필리핀원숭이(수컷, 캄보디아산, 가부시키가이샤이브바이오사이언스 제품)를 이용했다.

1-2-1 군 구성

각 동물의 구강 내를 시험 부위로 했다. 9마리의 동물을 사용하여, 0.1% OPB, 0.47% PVP-I 및 Saline을 도포하기 위해, 1군당 시험 부위는 3군데로 했다. 시험 물질 도포 전, 도포 10분 후, 6시간 후 및 24시간 후의 총 4회 세균을 채취했다.

1-2-2 동물 번호 및 시료 번호

아래의 표 1과 같이 동물 번호 및 시료 번호를 할당했다. 그리고, 동물 번호 1~3의 베이스라인 세균수를 측정하여, 세균수가 많은 순서로 saline, 0.1% OPB, 0.47% PVP-I에 의한 시험에 제공했다. 마찬가지로, 동물 번호 4~6은 세균수가 많은 순서로 0.1% OPB, 0.47% PVP-I, saline에 의한 시험에 제공하고, 동물 번호 7~9는 세균수가 많은 순서로 0.47% PVP-I, saline, 0.1% OPB에 의한 시험에 제공했다.

1-3-1 마취

필리핀원숭이에 케타랄(케타민으로 50 mg/mL, 다이이치산쿄프로파마가부시키가이샤 제품)과 세락타르(Selactar) 2%주사액(자일라진으로 2.0g/100 mL, 바이엘야쿠힝가부시키가이샤 제품)의 2:1 혼합액을 체중 1 kg당 0.5 mL를 근육 주사하여, 전신 마취했다.

1-3-2 도포

〔1〕마우스 퓨어 구강 케어 스펀지(카와모토산교가부시키가이샤 제품)를 2개 넣은 컨테이너(250 mL, 코닝가부시키가이샤 제품)에 시험 물질 100 mL를 따랐다.

〔2〕스펀지 내의 공기를 빼고 충분히 담갔다.

〔3〕구강 내에 약 2분간 도포했다.

1-3-3 세균 채취 1

〔1〕멸균이 끝난 장갑으로 멸균 면봉을 이용하여, 원숭이 구강 내로부터 세균을 채취했다(구강 내 양측벽을 2회씩 앞뒤로 문질러 채취했다).

〔2〕5 mL 샘플링액(10%(w/v) 폴리소르베이트 80, 0.04%(w/v) 인산 이수소칼륨, 0.1%(w/v) TritonX-100, 1.01%(w/v) 무수 인산 일수소나트륨, 2%(w/v) 대두 레시틴, 5%(w/v) 폴리옥시에틸렌(20)세틸에테르, H7.8~7.9) 안에 면봉을 넣었다.

1-3-4 세균 채취 2

〔1〕정압(定壓) 검체 채취 기구(DU-AE01NT-H, 파나소닉헬스케어사 제품)에 측정 소모품(DU-AC02NP-H, 파나소닉헬스케어사 제품)의 면봉을 장착했다.

〔2〕원숭이의 혀 위에 면봉을 정압으로 꽉 눌러 약 1 cm 간격으로 3회 앞뒤로 문질렀다.

1-3-5 평판 배양법에 의한 구강 내 세균수 측정

신 GMP 미생물 시험법 2), 식품 위생 검사 지침 3)을 참고로 한천 평판 혼석법 및 한천 평판 표면 도말법을 실시했다.

〔1〕1-3-3에서 세균을 회수한 샘플링액을 격렬하게 교반하여, 이것을 회수균액으로 했다.

〔2〕회수균액 0.5 mL를 10배 희석하고, 또한 동일한 조작에 의해 희석을 반복하여 10배 희석 계열(5 단계)을 제작했다.

〔3〕회수균액 및 단계 희석된 희석액을 1 mL씩 샬레에 분주했다. 이것에 약 47℃에서 보존한 측정 배지(TSA+)를 약 15 mL 가하여 혼석 평판을 제작했다. 또한, 회수균액 및 단계 희석된 희석액을 100μL씩 혈액 한천 배지 및 MS 한천 배지에 분주하여, 펴바름 봉(bacteria spreader)을 이용하여 표면 도말했다.

〔4〕측정 배지(TSA+)의 고화(固化) 후, 혼석 평판을 도치하여, 콜로니 계수가 가능해질 때까지 배양했다. 또한, 표면 도말 평판은 도치하여, 콜로니 계수가 가능해질 때까지, 혐기성 조건하에서 배양했다.

〔5〕혼석 평판 및 표면 도말 평판에서 증식한 콜로니를 콜로니 계수기(DC-3, 애즈원가부시키가이샤)를 이용하여 계수했다. 콜로니 수가 너무 많아서 콜로니 간의 구별이 불가능한 혼석 평판은, TNTC(too numerous to count)로 하여 계수하지 않았다.

1-3-6 세균 계수기에 의한 구강 내 세균수 측정

〔1〕세균 계수기(DU-AA01, 파나소닉헬스케어사 제품)의 뚜껑을 열었다.

〔2〕측정 소모품의 센서 칩을 세균 계수기에 장착했다.

〔3〕측정 소모품의 일회용 컵을 세균 계수기에 세팅했다.

〔4〕일회용 컵 중심에, 세균을 채취한 면봉을 세팅했다.

〔5〕세균 계수기의 뚜껑을 닫았다.

1-4 결과

1-4-1 평판 배양법에 의한 구강 내 세균수 측정

(1) 호기성 배양

결과를 도 1에 나타낸다. 베이스라인 구강 내 세균수는 1.73×10⁵~4.20×10⁶이었다. Saline 도포 후의 구강 내 세균수는 거의 일정했다. 시험 물질 도포 10분 후의 생균수는, Saline, 0.1%OPB 및 0.47%PVP-I에서 각각, 6.48×10⁵ CFU, 4.65×10³ CFU 및 2.35×10⁴ CFU, 도포 6시간 후 각각, 1.66×10⁶ CFU, 1.47×10³ CFU 및 4.93×10⁵ CFU, 24시간 후 각각, 4.67×10⁵ CFU, 5.58×10⁴ CFU 및 1.22×10⁶ CFU였다.

(2) 연쇄상 구균 선택 배지에서의 배양

결과를 도 2에 나타낸다. 베이스라인 구강 내 세균수는 2.85×10⁵~7.60×10⁷이었다. Saline 도포 후의 구강 내 세균수는 거의 일정했다. 시험 물질 도포 10분 후의 생균수는, Saline, 0.1%OPB 및 0.47%PVP-I에서 각각, 1.26×10⁶ CFU, 5.97×10³ CFU 및 7.33×10⁴ CFU, 도포 6시간 후 각각, 5.51×10⁶ CFU, 2.79×10⁴ CFU 및 2.20×10⁶ CFU, 24시간 후 각각, 1.71×10⁶ CFU, 4.30×10⁵ CFU 및 7.81×10⁶ CFU였다.

(3) 혐기성 배양

결과를 도 3에 나타낸다. 베이스라인 구강 내 세균수는 2.45×10⁵~1.65×10⁷이었다. Saline 도포 후의 구강 내 세균수는 거의 일정했다. 시험 물질 도포 10분 후의 생균수는, Saline, 0.1%OPB 및 0.47%PVP-I에서 각각, 2.70×10⁶ CFU, 1.33×10⁴ CFU 및 7.33×10⁴ CFU, 도포 6시간 후 각각, 3.22×10⁶ CFU, 1.38×10⁴ CFU 및 1.80×10⁶ CFU, 24시간 후 각각, 1.71×10⁶ CFU, 3.04×10⁵ CFU 및 1.40×10⁶ CFU였다.

1-4-2 세균 계수기에 의한 구강 내 세균수 측정

결과를 도 4에 나타낸다. 베이스라인 구강 내 세균수는 1.29×10⁶~>1.00×10⁸이었다. 시험 물질 도포 10분 후의 생균수는, Saline, 0.1% OPB 및 0.47% PVP-I에서 각각, 2.84×10⁶ CFU, < 3.49×10⁵ CFU 및 5.09×10⁵ CFU, 도포 6시간 후 각각, 2.04×10⁷ CFU, 5.58×10⁵ CFU 및 8.98×10⁶ CFU, 24시간 후 각각, 4.10×10⁷ CFU, 3.14×10⁷ CFU 및 3.14×10⁷ CFU였다.

평판 배양법에 의한 세균수 측정, 세균 계수기에 의한 세균수 측정의 어느 것에 있어서도, 동일한 경향의 결과를 얻을 수 있었다. 즉, 0.1% OPB군은 도포 6시간 후까지 세균수를 낮은 값으로 유지하지만, 0.47% PVP-I군은 도포 10분 후까지밖에 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 양쪽 군 모두 24시간 후에는 세균수가 회복되어 있었다. 0.47% PVP-I군의 지속성이 인정되지 않았던 것은, PVP-I가 구강 내의 유기물에 의해 불활성화의 영향을 받기 쉽기 때문이라고 생각된다. 구강 내 살균 소독 효과는, 0.1% OPB쪽이 지속성을 가져 우수하다고 생각되었다.

실시예 2

2. 햄스터를 이용한 구강 내 살균 시험 1

본 시험에서는, 정상 햄스터 구강 내 점막에 대한 함수제(살균 소독제)의 살균 효력을, 타제와 비교 검토하는 것을 목적으로 했다. 살균 활성의 지속성을 검토하기 위해, 시험 물질 함수 후~24시간까지 시점(전치, 직후, 8시간 후, 24시간 후)을 취해, 세균 계수기 및 배양법을 이용하여 세균수를 계측했다.

2-1 시험 물질

피험 물질과 대조 물질을 합쳐 시험 물질로 했다.

2-1-1 피험 물질 1

명칭: 0.1%OPB-1

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

2-1-2 피험 물질 2

명칭: 0.1% OPB-2

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

Lipidure(등록상표) 1.0 w/v%

2-1-3 대조 물질 1

명칭/약칭: 기제/Base

조성: Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

2-1-4 대조 물질 2

명칭/약칭: Peridex(등록상표)/0.12%CHG

조성: 클로로헥시딘 글루콘산염 0.12 w/v%

2-1-5 대조 물질 3

명칭/약칭: 이소딘 가글액 0.47%0.47%PVP-I

조성: 이소딘 가글액 7%(7%PVP-I, Meiji Seika파마가부시키가이샤 제품)의 15배 희석액

2-2 사용 동물

입하 시 6주령의 햄스터, Slc:Syrian, 수컷을 이용하여 각 군 4마리로 시험을 수행했다.

2-3 시험 방법

2-3-1 마취

가스 마취[도입 마취: 공기 3.0L/min에 3%이소플루란(Isoflurane)(마일란세이야쿠가부시키가이샤 제품), 지속 마취는 적절히 농도를 조정]를 실시했다.

2-3-2 시험 물질 투여

마취하에서, 햄스터를 앙와위(仰臥位)로 고정하고, 한쪽 협낭에 시험 물질을 1 mL씩 주입했다. 30초 후, 시험 물질을 배출하고, 여분의 협낭 내의 시험 물질을 멸균 면봉으로 흡수했다.

2-3-3 세균 채취

시험 물질 투여 전, 0 hr, 8 hr, 24 hr의 총 4 시점에, 마취하에서 양 협낭 내로부터 멸균 면봉을 이용하여 세균을 채취했다. 채취 후의 면봉은 5 mL SCDLP 배지에 침지 후 교반하여, 세균 계수용 샘플로 했다.

2-3-4 생존균수의 측정

신 GMP 미생물 시험법 1), 식품 위생 검사 지침서 2)를 참고로 한천 평판 혼석법을 실시했다.

〔1〕세균 계수용 샘플 500μL를 채취하고, 4.5 mL의 희석액을 이용하여, 10¹배~10⁶배의 10배 희석 계열을 제작했다.

〔2〕세균 계수용 샘플 원액 및 각 희석균액 1 mL씩 멸균 샬레에 분주했다.

〔3〕상기 샬레에, 신속하게 약 47℃로 설정한 항온조에서 보온한 측정 배지(TSA+) 15 mL를 분주했다.

〔4〕측정 배지의 고화 후, 혼석 평판을 인큐베이터 내에 도치하고, 콜로니를 계수할 수 있을 때까지 35℃에서 배양했다(약 2일간).

〔5〕배양 후, 혼석 평판에서 증식한 콜로니를 육안으로 계수했다. 콜로니 수가 너무 많아서 콜로니 간의 구별이 불가능한 혼석 평판은, TNTC(too numerous to count)로 하여 계수하지 않았다.

〔6〕콜로니 수에 희석 배율을 곱하여, 생존균수를 산출했다.

2-4 결과

결과를 도 5 및 표 2에 나타낸다.

시험 물질 투여 전의 구강 내 세균수는, 군 사이에 차이가 없었다. 시험 물질 투여 직후의 살균 효력은, 0.1%OPB-1 = 0.1%OPB-2 > 0.12%CHG > 0.47%PVP-I > Base이며, 투여 8시간 후는, 0.1%OPB-1 = 0.1%OPB-2 = 0.12%CHG > 0.47%PVP-I = Base이며, 24시간 후는 군 사이에 차이는 없었다. 이상의 결과로부터, 구강 내 살균 효력은 0.1%OPB와 0.12%CHG는 동등 정도이며, 0.47%PVP-I는 즉효성이 약하고 지속 활성은 인정되지 않았다.

본 시험에서 0.47%PVP-I의 살균 활성이 낮았던 이유로, 구강 내의 단백질 등에 의한 불활성화가 크게 기여하고 있다고 생각되었다. 0.12%CHG는 0.1%OPB와 마찬가지로 지속 활성을 갖는 구강 내 살균 소독제라고 생각되었다.

실시예 3

3. 햄스터를 이용한 구강 내 살균 시험 2

본 시험에서는, 정상 햄스터 구강 내 점막에 대한 함수제(살균 소독제)의 살균 효력에 미치는 올라넥시딘 농도의 영향을 검토하는 것을 목적으로 했다.

3-1 시험 물질

피험 물질과 대조 물질을 합쳐 시험 물질로 했다.

3-1-1 피험 물질 1

명칭: 0.1%OPB-1

조성: 올라넥시딘 글루콘산염...0.10 w/v%

폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(20)글리콜...0.07 w/v%

폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜...0.10 w/v%

3-1-2 피험 물질 2

명칭: 0.1%OPB-2

조성: 올라넥시딘 글루콘산염...0.10 w/v%

폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(20)글리콜...0.07 w/v%

폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)...1.00 w/v%

3-1-3 피험 물질 3

명칭: 0.5%OPB-3

조성: 올라넥시딘 글루콘산염...0.50 w/v%

폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(20)...0.36 w/v%

폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)...5.00 w/v%

3-1-4 피험 물질 4

명칭: 1%OPB-2

조성: 올라넥시딘 글루콘산염...1.00 w/v%

폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(20)글리콜...0.72 w/v%

폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜...10.00 w/v%

3-1-5 대조 물질

명칭: 기제

조성: 폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(20)글리콜...0.07 w/v%

폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜...0.10 w/v%

3-2 사용 동물

입하 시 6주령의 햄스터, Slc:Syrian, 수컷을 이용하여 각 군 3마리로 시험을 수행했다.

3-3 시험 방법

3-3-1 마취

가스 마취[도입 마취: 공기 3.0L/min에 3%이소플루란(마일란세이야쿠가부시키가이샤 제품), 지속 마취는 적절히 농도를 조정]를 실시했다.

3-3-2 시험 물질 투여

마취하에서, 햄스터를 앙와위로 고정하고, 한쪽 협낭에 시험 물질을 1 mL씩 주입했다. 1분 후, 시험 물질을 배출하고, 여분의 협낭 내의 시험 물질을 멸균 면봉으로 흡수했다.

3-3-3 세균 채취

시험 물질 투여 전, 0 hr, 1 hr, 3 hr, 6 hr의 총 5 시점에, 마취하에서 양 협낭 내로부터 멸균 면봉을 이용하여 세균을 채취했다. 채취 후의 면봉은 5 mL SCDLP 배지에 침지 후 교반하여, 세균 계수용 샘플로 했다.

3-3-4 생존균수의 측정

생존균수의 측정은, 2-3-4와 동일한 방법으로 수행했다.

3-4 결과

결과를 도 6에 나타낸다. 결과로부터, 0.1%OPB로 지속적(6시간 후)으로 세균수를 낮은 값으로 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, OPB 농도가 0.5 w/v%이상에서, 지속 활성이 보다 우수했다.

실시예 4

4. 햄스터를 이용한 구강 점막 자극성 시험 1

본 시험에서는, 0.1%올라넥시딘 글루콘산염의 기제 조성을 바꾼 검토 제제를 햄스터의 협낭에 14일간 반복 투여하여, 자극성 정도를 비교 검토했다.

4-1 피험 물질

4-1-1 피험 물질 1

명칭: 0.1%OPB-1

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

4-1-2 피험 물질 2

명칭: 0.1%OPB-2

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic L-31 1.0 w/v%

4-1-3 피험 물질 3

명칭: 0.1%OPB-3

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

4-1-4 피험 물질 4

명칭: 0.1%OPB-4

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-85 1.0 w/v%

4-1-5 피험 물질 5

명칭: 0.1%OPB-5

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic F-127 1.0 w/v%

4-1―6 피험 물질 6

명칭: 0.1%OPB-6

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.14 w/v%

Pluronic F-68 1.0 w/v%

4-1-7 피험 물질 7

명칭: 0.1%OPB-7

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Trehalose 5.0 w/v%

4-2 사용 동물

입하 시 8주령의 햄스터, Slc:Syrian, 수컷을 이용하여 각 군 3마리로 시험을 수행했다.

4-3 시험 방법

4-3-1 피험 물질 적용 방법

(1) 적용량

우(右)협낭에 피험 물질 1 mL를 적용했다.

(2) 적용 방법

〔1〕가스 마취에 의해 마취를 도입했다[도입 마취: 공기 3.0L/min에 3%이소플루란(마일란세이야쿠가부시키가이샤 제품)].

〔2〕유지 마취하(농도는 적절히 조정)에서 동물을 앙와위로 고정하고, 면봉을 이용하여 동물의 협낭을 꺼내, 한 손으로 꺼낸 협낭을 가볍게 집었다.

〔3〕생리 식염액 및 면봉으로 협낭 점막에 부착된 사료 등의 이물질을 제거하고, 청결하게 한 후 협낭을 원래대로 되돌렸다.

〔4〕1 mL 주사기 및 경구 투여용 존데(Sonde)를 이용하여, 우협낭에는 피험 물질 1 mL를 적용하고, 좌(左)협낭에는 1 mL 주사기에 장착된 빈 경구 투여용 존데를 삽입·제거했다.

〔5〕적용 30초 후, 피험 물질이 기도 내로 역류하지 않도록 동물을 복와위(腹臥位)로 반전시켜 배출했다. 구강 내의 여분의 피험 물질은 면봉을 이용하여 모두 제거했다.

〔6〕적용 부위의 볼(頰) 점막의 색조 등을 관찰·기록하고, 동물의 경부에 햄스터용 컬러를 장착한 후, 동물을 케이지로 돌려보냈다.

〔7〕상기 조작을 1일 2회(아침·저녁), 14일간 반복했다.

4-3-2 검사 및 관찰

(1) 일반 상태의 관찰

각 군의 전체 예에 대하여, 적용 기간 중은, 시험 물질의 적용 전 및 적용 종료 시에 일반 상태 관찰을 수행했다(Day1~Day14). 또한, 적용 기간 종료일의 다음날에도 관찰을 수행했다(Day15).

(2) 체중 측정

각 군의 전체 예에 있어서, 적용 기간 중은, 시험 물질의 적용 전에 체중을 측정했다(Day1~Day14). 또한, 적용 기간 종료일의 다음날에도 측정을 수행했다(Day15). 단, 체중계 고장 때문에 Day13, 14는 체중을 측정하지 않았다.

(3) 적용 부위의 육안적 관찰 방법

각 군의 전체 예의 협낭에 대하여, 적용 기간 중은, 시험 물질의 적용 전 및 적용 종료 시에 협낭 점막의 상태를 관찰하여, 평점화(評點化)를 기록했다(Day1~Day14). 또한, 적용 기간 종료일의 다음날(24±2시간)에도 관찰을 수행했다(Day15). 관찰 부위는 각 시험 물질의 접촉 부위 볼 점막으로 했다. 그리고, 육안적 관찰의 평가법은 아래의 표 3(ISO 10993-10, Annex B. 3 「Table B. 2 Grading system for oral and penile reactions」)에 기재되어 있는 관찰 기준 및 평가점에 따라, 홍반 및 가피(痂皮) 형성의 정도로 평가점(구내염 grade)을 매겼다. 또한, 그 밖에 보여진 소견에 대해서도 기록했다. 얻어진 관찰 결과를 바탕으로, 각 군에 대하여 시험 물질마다, 각 동물의 점막에서의 평가점을 합하고, 관찰수 및 동물수로 나눠 평균값(소수 첫째 자리 반올림)를 구해, 종합 평가의 참고 자료로 했다.

(4) 병리학적 검사

각 동물에 대하여, 적용 기간 종료일 다음날의 육안적 관찰의 종료 후, 이소플루란 마취하에서 방혈 치사시키고, 좌우 협낭을 채취하여, 10%중성 완충 포르말린액으로 고정했다. 통상적인 방법에 따라 HE 염색의 표본을 제작하여, 병리학적 검사를 실시했다. 그리고, 육안적 관찰의 평가법은 ISO 10993-10, Annex B. 3 「Table B. 3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction」에 기재되어 있는 기준에 따라, 상피, 백혈구 침윤, 혈관 충혈 및 부종의 각 항목에 대하여 소견 또는 그레이드를 기록했다. 또한, 그 밖에 인정된 소견에 대해서도 기록했다.

(5) 종합 평가

관찰 기간 중의 일반 상태 및 체중 추이를 참고로 하여, 볼 점막의 육안적 관찰 결과 및 병리학적 관찰 결과로부터 얻어진 각 시험 물질의 반응 정도를 바탕으로, 각 시험 물질의 구강 점막에 대한 영향을 종합적으로 평가했다.

4-4 결과

4-4-1 일반 상태

어느 동물에도 이상은 인정되지 않았다.

4-4-2 체중

결과를 도 7에 나타냈다. 0.1%OPB-5군은 체중이 거의 변화하지 않았다. 다른 군은 평균값이 서서히 증가했다.

4-4-3 적용 부위의 육안적 관찰

결과를 도 8에 나타내고, 마지막 날의 각 군의 협낭을 도 9의 Photo1~8에 나타냈다. 모든 제제에서 홍반 등의 자극성이 거의 인정되지 않았다. 그러나, 0.1%OPB-1, -2, -6, -7 및 -8에서는, 백혈구 감소 유사 증상(각화 항진, 비후)이 인정되었다. 한편, 0.1%OPB-3, -4 및 -5에서는 전혀 이상이 인정되지 않았다.

4-4-4 병리 조직학적 검사

결과를 도 10에 나타냈다. ISO 10993-10, Annex B. 3 「Table B. 3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction」에 기재되어 있는 평가 기준에 따라, 상피(세포 변성, 화생(化生) 및 진무름), 백혈구 침윤, 혈관 충혈 및 부종의 그레이드 매김에 의해, 개체마다의 염증 지수 및 군마다의 염증 지수의 평균을 산출했다. 또한, 평가 기준 이외의 소견에 대해서도 기록했다. 그 결과, 평균값은 0.1%OPB-3군에서는 변화는 인정되지 않았다. 0.1%OPB-1군을 포함하는 다른 군에서는, 상피의 세포 변성 및 극소~중등도의 백혈구 침윤이 인정되고, 염증 지수는 1~3의 극소로 평가되었다. 이들 군에서는, 평가 기준 이외의 소견으로, 경미한 세포간 부종 및 경미 내지 경도의 과다 각화가 인정되었다.

이상의 결과로부터, 0.1%OPB-3에서 사용한 기제 Pluronic P-123은, 올라넥시딘 글루콘산염의 구강 점막 적용 제제의 기제로 특히 유용하다는 것이 시사되었다. 또한, 육안적 관찰로 전혀 이상이 보이지 않았던 0.1%OPB-4 및 -5에서 사용한 Pluronic P-85 및 Pluronic F-127도, 올라넥시딘 글루콘산염의 구강 점막 적용 제제의 기제로 사용할 수 있는 것이 시사되었다.

실시예 5

5. 햄스터를 이용한 구강 점막 자극성 시험 2

실시예 4의 자극성 시험에 있어서, 기제 Pluronic P-123이, 올라넥시딘 글루콘산염의 구강 점막 적용 제제의 기제로 유용하다는 것이 시사되었다. 따라서, 본 시험에서는, 자극이 없는 제제를 제작하기 위한 기제로 Pluronic P-123을 채용하고, 계속해서 OPB 농도 및 기제 농도의 검토를 수행했다. 시험계는, 햄스터 협낭에 대한 반복 투여로 하고, 기간을 2주간에서 4주간으로 늘려 실시했다.

5-1 피험 물질

5-1-1 피험 물질 1

명칭: 0.1%OPB-1

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 0.50 w/v%

5-1-2 피험 물질 2

명칭: 0.1%OPB-2

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

5-1-3 피험 물질 3

명칭: 0.1%OPB-3

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 0.50 w/v%

Lipidure(등록상표) 1.0 w/v%

5-1-4 피험 물질 4

명칭: 0.1%OPB-4

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

Lipidure(등록상표) 1.0 w/v%

5-1-5 피험 물질 5

명칭: 0.3%OPB-1

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.30 w/v%

Pluronic L-44 0.22 w/v%

Pluronic P-123 1.50 w/v%

5-1-6 피험 물질 6

명칭: 0.3%OPB-2

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.30 w/v%

Pluronic L-44 0.22 w/v%

Pluronic P-123 3.0 w/v%

5-1-7 피험 물질 7

명칭: 0.3%OPB-3

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.30 w/v%

Pluronic L-44 0.22 w/v%

Pluronic P-85 1.50 w/v%

5-1-8 피험 물질 8

명칭: 0.3%OPB-4

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.30 w/v%

Pluronic L-44 0.22 w/v%

Pluronic P-85 3.0 w/v%

5-1-9 피험 물질 9

명칭: 0.5%OPB-1

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.50 w/v%

Pluronic L-44 0.36 w/v%

Pluronic P-123 2.50 w/v%

5-1-10 피험 물질 10

명칭: 0.5%OPB-2

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.50 w/v%

Pluronic L-44 0.36 w/v%

Pluronic P-123 5.0 w/v%

5-1-11 피험 물질 11

명칭: 0.5%OPB-3

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.50 w/v%

Pluronic L-44 0.36 w/v%

Pluronic P-123 2.50 w/v%

Lipidure(등록상표) 1.0 w/v%

5-1-12 피험 물질 12

명칭: 0.5%OPB-4

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.50 w/v%

Pluronic L-44 0.36 w/v%

Pluronic P-123 5.0 w/v%

Lipidure(등록상표) 1.0 w/v%

5-2 사용 동물

5-3 시험 방법

5-3-1 피험 물질 적용 방법

(1) 적용량

좌협낭에 피험 물질 1 mL를 적용했다.

(2) 적용 방법

〔4〕1 mL 주사기 및 경구 투여용 존데를 이용하여, 좌협낭에는 피험 물질 1 mL를 적용하고, 우협낭에는 1 mL주사기에 장착된 빈 경구 투여용 존데를 삽입·제거했다.

〔5〕적용 30초 후, 피험 물질이 기도 내로 역류하지 않도록 동물을 복와위로 반전시켜 배출했다. 구강 내의 여분의 피험 물질은 면봉을 이용하여 모두 제거했다.

〔6〕적용 부위의 볼 점막의 색조 등을 관찰·기록하고, 동물을 케이지로 돌려보냈다.

〔7〕상기 조작을 1일 2회(아침·저녁), 28일간 반복했다.

5-3-2 검사 및 관찰

(1) 일반 상태의 관찰

각 군의 전체 예에 대하여, 적용 기간 중은, 시험 물질의 적용 전 및 적용 종료 시에 일반 상태 관찰을 수행했다(Day1~Day28). 또한, 적용 기간 종료일의 다음날에도 관찰을 수행했다(Day29).

(2) 체중 측정

각 군의 전체 예에 있어서, 적용 기간 중은, 시험 물질의 적용 전에 체중을 측정했다(Day1~Day28). 또한, 적용 기간 종료일의 다음날에도 측정을 수행했다(Day29).

(3) 적용 부위의 육안적 관찰 방법

각 군의 전체 예의 협낭에 대하여, 적용 기간 중은, 시험 물질의 적용 전에 협낭 점막 상태를 관찰하여, 평점화를 기록했다(Day1~Day28). 또한, 적용 기간 종료일의 다음날(24±2시간)에도 관찰을 수행했다(Day29). 관찰 부위는 각 시험 물질의 접촉 부위 볼 점막으로 했다. 그리고, 육안적 관찰의 평가법은 상기의 표 3(ISO 10993-10, Annex B. 3 「Table B. 2 Grading system for oral and penile reactions」)에 기재되어 있는 관찰 기준 및 평가점에 따라, 홍반 및 가피 형성의 정도로 평가점(구내염 grade)을 매겼다. 또한, 그 밖에 보여진 소견에 대해서도 기록했다. 얻어진 관찰 결과를 바탕으로, 각 군에 대하여 시험 물질마다, 각 동물의 점막에서의 평가점을 합하여, 관찰수 및 동물수로 나눠 평균값(소수 첫째 자리 반올림)을 구해, 종합 평가의 참고 자료로 했다.

(4) 병리학적 검사

(5) 종합 평가

5-4 결과

5-4-1 일반 상태

어느 동물에도 이상은 인정되지 않았다.

5-4-2 체중

모든 군에서 경시적으로 체중이 증가하고, 군 사이에 따른 차이는 거의 없었다.

5-4-3 적용 부위의 육안적 관찰

결과를 도 11에 나타냈다. 모든 제제에서 홍반 등의 자극성이 인정되지 않았다(평가점 0). 그러나, 0.3%농도 이상의 OPB에서는, 백혈구 감소 유사 증상(각화 항진, 비후)이 인정되었다. 한편, 0.1%농도의 OPB에서는 전혀 이상이 인정되지 않았다.

5-4-4 병리 조직학적 검사

결과를 도 12에 나타냈다. ISO 10993-10, Annex B. 3 「Table B. 3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction」에 기재되어 있는 평가 기준에 따라, 상피(세포 변성, 화생 및 진무름), 백혈구 침윤, 혈관 충혈 및 부종의 그레이드 매김에 의해, 개체마다의 염증 지수 및 군마다의 염증 지수의 평균을 산출했다. 또한, 평가 기준 이외의 소견에 대해서도 기록했다. 그 결과, 0.1%OPB의 각 군에서는 염증성 반응은 인정되지 않았다. 0.3%농도 이상의 OPB 각 군에서는, 상피의 변성 및 백혈구 침윤이 인정되고, 염증 지수는 1~3에서 모두 극소의 반응이었다. 평가 기준 이외의 소견으로, 0.1%OPB군에서는 일부의 개체에 경미~경도의 과다 각화가 인정되고, 0.3%농도 이상의 OPB 각 군에서는, 경미~중간 정도의 과다 각화 및 경미한 극세포 증생(增生)이 인정되었다. 그 외 대조군(우협낭: Sham-ope측)에서 인정된 표피 내 미소 농양은 자연 발증성 병변으로 생각되었다.

실시예 6

6. 5-FU 유발 햄스터 구내염 모델에서의 효력 시험 1

본 시험에서는, 5-FU 유발 구내염 모델에서의 OPB 제제의 효력을 시험했다. 구체적으로는, 5-FU 유발 구내염 모델에 있어서, 0.1%OPB로 구강 내를 함수했을 때의 구강 내 세균수의 경시적인 측정 및 구내염 평가를 수행했다.

6-1 시험 물질

피험 물질과 대조 물질을 합쳐 시험 물질로 했다.

6-1-1 피험 물질

명칭: 0.1%OPB

조성: 올라넥시딘 글루콘산염...0.10 w/v%

폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(20)글리콜...0.14 w/v%

폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜...0.10 w/v%

6-1-2 대조 물질

명칭: 기제

폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜...0.10 w/v%

6-2 사용 동물

입하 시 6주령의 햄스터, Slc:Syrian, 수컷을 이용하여 각 군 5마리로 시험을 수행했다.

6-3 시험 방법

6-3-1 마취

6-3-2 구내염 모델 제작

마취하에서, 5-FU를 60 mg/kg이 되도록 햄스터의 복강 내에 투여했다. 투여는 day0, day2의 총 2회로 했다.

Day4에 마취하에서, 햄스터의 협낭을 적출했다. 협낭에 저장된 먹이·실험 동물용 깔개를 제거하고, 생리 식염액을 흡수시킨 커팅면(綿)으로 가볍게 닦아냈다. 정밀 와이어 브러시(φ2.34 mm, 선플렉스가부시키가이샤 제품)로 협낭의 표층(각질층)을 브러싱했다. 브러싱 후, 협낭을 구강 내로 되돌렸다.

6-3-3 시험 물질 투여

마취하에서, 햄스터를 앙와위로 고정하고, 한쪽 협낭에 시험 물질을 1 mL씩 주입했다. 30초 후, 시험 물질을 배출하고, 여분의 협낭 내의 시험 물질을 멸균 면봉으로 흡수했다. 이 함수 조작에 의한 투여는 1일 2회로 했다. 투여는 구내염 장애가 피크에 달한 후에는 실시하지 않았다.

6-3-4 세균 채취

Day0, 4, 7, 10, 17에 있어서, 1회째의 시험 물질 투여 전, 0 hr, 6 hr 후의 총 4 시점에, 마취하에서 양 협낭 내로부터 멸균 면봉을 이용하여 세균을 채취했다. 단, day10, 17에 있어서 시험 물질을 적용하지 않았던 경우는, 1회만의 채취로 했다. 채취 후의 면봉은 5 mL SCDLP 배지에 침지 후 교반하여, 세균 계수용 샘플로 했다.

6-3-5 생존균수의 측정

신 GMP 미생물 시험법 1), 식품 위생 검사 지침 2)를 참고로 한천 평판 혼석법을 실시했다.

〔1〕세균 계수용 샘플 500μL를 채취하여, 4.5 mL의 희석액을 이용하여, 10¹배~10⁴배의 10배 희석 계열을 제작했다.

〔4〕측정 배지의 고화 후, 혼석 평판을 인큐베이터 내에 도치하고, 콜로니를 계수 가능할 때까지 35℃에서 배양했다(약 2일간).

6-3-6 생존균수의 산출

6-3-5 항을 바탕으로 채용한 콜로니 수에 희석 배수를 곱하여 생존균수(CFU/mL)를 구했다. 채용 콜로니 수는 소수점 이하 둘째 자리를 반올림하여 표시했다. 아래 식에 의해 생존균수(CFU/swab)를 계산했다.

A: 채용 콜로니 수

생존균수(CFU/swab)=A×희석 배수×샘플액량(5 mL)

또한, 생존균수의 대수값으로부터 Log Reduction을 다음 식으로 구했다. Log Reduction은 소수점 이하 셋째 자리를 반올림하여 표시했다. 생존균수 1 이하의 대수값은 0으로 했다.

B: 베이스라인의 생균수 대수값

C: 시험 물질 도포 후의 생균수 대수값

Log Reduction=B-C

6-3-7 통계학적 해석

각 군의 생균수(CFU/swab)와 그 대수값의 평균값 및 표준 편차를 구했다. 생균수는 소수점 이하 첫째 자리를 반올림하여 정수로 표시했다. 생균수의 대수값은 소수점 이하 셋째 자리를 반올림하여 표시했다. 그리고, 생균수가 0인 경우는 생균수의 대수값은 0으로 했다. 또한, 탐색 시험을 위해 검정은 수행하지 않았다.

6-3-8 구내염 평가

아래의 표 4를 바탕으로, 구내염 grade를 평가했다.

Grade	상태
0	홍반, 혈관 확장 없음
1	홍반 및 혈관 확장
2	표재성 점막 진무름을 동반하는 심각한 홍반
3	점막 궤양 형성(25%)
4	점막 궤양 형성(50%)
5	점막 궤양 형성(100%)

6-4 결과

6-4-1 세균수

결과를 표 5 및 도 13에 나타낸다. Day0, 4, 10에 있어서는, 0.1%OPB군에서 투여 후의 세균수 감소가 현저했지만, 구내염의 중증화가 현저했던 day7에서는, 세균수 감소값이 미량이었다.

6-4-2 구내염 grade

결과를 도 14에 나타냈다. 0.1%OPB군에 있어서, 구내염 grade가 현저하게 낮았다.

본 시험에 있어서, 0.1%OPB군의 day7의 세균수 감소값이 낮았던 원인으로, 세균 채취 방법 혹은 침출액 과다에 의한 살균 활성의 저하를 생각할 수 있었다. 본 시험에 있어서, 0.1%OPB를 투여하여 구강 내를 청결하게 유지하는 것이 구내염 중증화를 경감시키는 것이 시사되었다.

실시예 7

7. 5-FU 유발 햄스터 구내염 모델에서의 효력 시험 2

본 시험에서는, 5-FU 유발 햄스터 구내염 모델에 있어서, 0.1%올라넥시딘 글루콘산염과 0.1%CHG의 구내염 경감 효과를 비교 검토했다.

7-1 시험 물질

피험 물질과 대조 물질을 합쳐 시험 물질로 했다.

7-1-1 피험 물질 1

명칭: 0.1%OPB

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

7-1-2 피험 물질 2

명칭: Peridex(등록상표)/0.1%CHG

제조원: 3M ESPE Dental Products

조성: 클로로헥시딘 글루콘산염 0.12 w/v%

7-1-3 대조 물질

명칭: 기제

7-2 사용 세균

본 시험에는, 구강 내의 상주균인 황색포도구균(Staphylococcusaureus, ATCC 번호:6538, Microbiologics, Inc.사 제품)을 이용했다.

7-3 사용 동물

7-4 시험 방법

7-4-1 시험균액의 조제

〔1〕보관되어 있는 세균 펠릿이 들어간 바이알을 꺼내 실온으로 되돌렸다.

〔2〕바이알로부터 세균 펠릿을 1개 꺼내, 멸균 튜브로 옮겼다.

〔3〕0.5 mL의 생리 식염액을 가했다.

〔4〕멸균 면봉으로 세균 펠릿을 뭉개, 균현탁액으로 했다.

〔5〕TSA 평판에 균현탁액을 멸균 면봉으로 직경 약 2 cm의 원형 에리어에 접종하여, 백금이를 이용하여 접종 에리어로부터 획선 접종했다.

〔6〕획선 접종된 TSA 평판을 도치하고, 콜로니를 형성할 때까지 배양했다.

〔7〕형성된 콜로니 중에서 단일 콜로니를 선택하고, 백금선으로 채취하여 카지톤(casitone) 배지에 찔러넣었다.

〔8〕찔러넣은 카지톤 배지를, 균의 증식을 확인할 수 있을 때까지 배양했다.

〔9〕균의 증식을 확인 후, 냉장 보관했다(설정값 2~8℃).

〔10〕카지톤 배지에서 냉장 보관된 시험균의 일부를 백금선으로 채취하여, MHB 배지 5 mL를 넣은 14 mL 멸균 튜브로 옮겨, 균이 증식 할 때까지 정치 배양했다.

〔11〕배양 후, 배양액 10μL를 멸균 팁으로 채취하여, 다시 MHB 배지 5 mL를 넣은 14 mL 멸균 튜브로 옮겨, 균이 증식할 때까지 정치 배양했다.

〔12〕배양 후, MHB 배지에서 계대 배양한 시험균 배양액 약 5 mL를 15 mL 코니컬 튜브에 회수하고, 생리 식염액을 8 mL 첨가한 후, 완만하게 교반했다.

〔13〕3000 rpm, 10분간, 23℃에서 원심(냉각 원심기 5800, 로터 RS-720, 가부시키가이샤쿠보타세이사쿠쇼 제품)하여, 상청액을 폐기했다.

〔14〕침전된 시험균에 증류수(오오츠카 증류수, 가부시키가이샤오오츠카세이야쿠코죠 제품) 1 mL를 첨가하여, 현탁했다.

〔15〕균현탁액을 14 mL 멸균 튜브에 옮기고, 탁도를 McFarland Standard(품번 70900, 시스멕스·비오메리으가부시키가이샤 제품)를 이용하여 판정했다. McFarland 5가 되도록, 생리 식염액을 가하여 균액 농도를 조절했다.

〔16〕McFarland 5로 한 균현탁액을, 시험균액으로 했다.

7-4-2 마취

가스 마취[도입 마취: 공기 3.0L/min에 3%이소플루란(마일란세이야쿠가부시키가이샤), 지속 마취는 적절히 농도를 조정]를 실시했다.

7-4-3 구내염 모델 제작

마취하에서, 5-FU를 60 mg/kg이 되도록 햄스터의 복강 내에 투여했다. 투여는 day0, day2의 총 2회로 했다. Day4에 마취하에서, 햄스터의 협낭을 적출했다. 협낭에 저장된 먹이·실험 동물용 깔개를 제거하고, 생리 식염액을 흡수시킨 커팅면으로 가볍게 닦아냈다. 정밀 와이어 브러시(φ2.34 mm, 선플렉스가부시키가이샤 제품)로 협낭의 표층(각질층)을 브러싱했다. 브러싱 후, 협낭을 구강 내로 되돌렸다.

7-4-4 시험 물질 투여

마취하에서, 햄스터 협낭에 면봉을 이용하여 1일 2회 도포(군분리일로부터 4일간)했다. 단, 4일째는 오전만의 1회 투여로 했다.

7-4-5 시험균액 도포

마취하에서, 7-4-1에서 조제한 시험균액을, 오전의 시험 물질 투여 전에 햄스터 협낭에 백금이를 이용하여 1일 1회 도포(군분리일로부터 5일간)했다.

7-4-6 구내염 평가

상기의 표 4를 바탕으로, 구내염 grade를 평가했다.

7-4-7 통계학적 해석

각 군의 grade의 평균값 및 표준 편차를 구하고, 평균값만으로 그래프를 작성했다. 탐색적인 해석을 위해 검정은 수행하지 않았다.

7-5 결과

결과를 도 15에 나타냈다. 0.1%OPB군은 기제 및 0.1%CHG군과 비교하여 구내염 중증화를 경감하는 경향이었다. 기제군과 0.1%CHG군은 거의 동일한 grade이며 차이는 없었다. 구내염의 중증화 경감 효과로부터, 0.1%OPB쪽이, 0.1%CHG와 비교하여 도포된 세균 혹은 협낭 점막의 상주균에 대한 살균 효력이 우수한 것을 생각할 수 있었다.

실시예 8

8. 5-FU·방사선 조사 병용에 의해 유발된 햄스터 구내염 모델에서의 효력 시험

본 시험에서는, 5-FU·방사선 조사 병용에 의해 유발된 햄스터 구내염 모델에 있어서, Pluronic P-123을 기제로 한 0.1%OPB 제제를 함수법에 의해 적용하고, 구내염 경감 효과를 비교 검토했다.

8-1 시험 물질

피험 물질과 대조 물질을 합쳐 시험 물질로 했다.

8-1-1 피험 물질

명칭: OPB

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

8-1-2 대조 물질

명칭/약칭: 기제/Base

조성: Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

8-2 사용 동물

입하 시 6주령의 햄스터, Slc:Syrian, 수컷을 이용하여 각 군 8마리로 시험을 수행했다.

8-3 시험 방법

8-3-1 마취

(1) 방사선 조사 시

솜노펜틸(somnopentyl)(등록상표)(쿄리츠세이야쿠가부시키가이샤 제품)을 40 mg/kg이 되도록 복강 내에 투여했다.

(2) 구내염 평가 및 시험 물질 투여 시

8-3-2 구내염 모델 제작

(1) 방사선 조사

Day0에, 마취하에서 햄스터의 협낭을 면봉으로 적출했다. 협낭에 저장된 먹이·실험 동물용 깔개를 제거하고, 생리 식염수를 흡수시킨 커팅면으로 가볍게 닦아냈다. 성형한 아크릴판 위에 몸, 협낭을 모두 고정하고, 조사 부위의 협낭 이외를 납으로 덮고, [선반 널 거리: 12.5 cm, 관전압: 160 kV, 관전류: 6.2 mA]의 조건으로 방사선을 조사(40 Gy)했다. 단, 조사는 1개체당 한쪽 협낭으로 하고, 각 군 좌협낭과 우협낭에 4마리씩 되도록 할당했다.

(2) 5-FU 투여

Day0, 5, 10의 총 3회, 5-FU를 60 mg/kg이 되도록 햄스터의 복강 내에 투여했다.

8-4-3 시험 물질 투여

8-4-4 구내염 평가

상기 표 4를 바탕으로, 구내염 grade를 평가했다.

8-4-5 통계학적 해석

각 군의 구내염 grade의 평균값 및 표준 편차를 구해 그래프를 작성했다. 탐색적인 해석을 위해 검정은 수행하지 않았다.

8-5 결과

결과를 도 16에 나타냈다. 구내염 grade의 최대값은 base군이 4.9, OPB군이 4.3이며, 또한 일어섬도 base군쪽이 빨랐다. 모델의 강도가 강했던 영향도 있고, day40에 있어서도 궤양이 낫지 않는 개체도 있었기 때문에 완전하게 전체 예에서 치유는 되지 않았지만, OPB군쪽이 명백하게 치유가 빨랐다.

실시예 9

9. 래트(rat) 치은염 모델에서의 효력 시험

본 시험에서는, 래트 치은염 모델에 있어서, 0.1%올라넥시딘 글루콘산염의 치은염에 대한 치료 효과를 검토했다.

9-1 시험 물질

피험 물질과 대조 물질을 합쳐 시험 물질로 했다.

9-1-1 피험 물질

명칭: OPB

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

9-1-2 대조 물질

명칭/약칭: 기제/Base

조성: Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

9-2 사용 세균

본 시험에는, 치은염 기인균인 포르리포모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis, ATCC 번호:33277, Microbiologics, Inc.사 제품)를 이용했다.

9-3 사용 동물

입하 시 5주령의 래트, Jcl:Wistar, 수컷을 이용하여 각 군 5마리로 시험을 수행했다.

9-4 시험 방법

9-4-1 시험균의 조제(보존 이외의 모든 조작은 혐기 챔버 내에서 수행했다)

〔1〕보관되어 있는 세균 펠릿이 들어간 바이알을 꺼내 혐기 챔버에 넣었다.

〔3〕0.5 mL의 조제 TSB 배지를 가했다.

〔4〕멸균 면봉으로 세균 펠릿을 뭉개, 균현탁액으로 했다.

〔5〕균현탁액을 CDC 혐기성 균용 양(羊) 혈액 한천 배지에 접종했다.

〔6〕혐기 조건하(37℃)에서 3~4일간 배양했다.

〔7〕형성된 콜로니 중에서 단일 콜로니를 선택하고, 다시 마찬가지로 CDC 혐기성 균용 양 혈액 한천 배지에 접종했다.

〔8〕균의 증식을 확인 후, 3 mL의 조제 TSB 배지를 가하여 스프레더로 현탁하여, 글리세롤 스톡을 제작했다.

〔9〕상기 스톡을 냉동 보존했다.

〔10〕스톡으로부터 CDC 혐기성 균용 양 혈액 한천 배지에 접종하여 혐기 조건하에서 배양했다.

〔11〕균의 증식을 확인 후, 적당량의 조제 TSB 배지에서 현탁하고, 일부를 꺼내 탁도를 McFarland Standard를 이용하여 McFarland5로 했다. 희석 배율을 계산하고, 잔존하고 있는 현탁액으로부터 1×10¹⁰CFU/mL가 되도록 균액 농도를 조정했다.

〔12〕상기를 시험균액으로 했다.

9-4-2 마취

(1) 코튼사 삽입, 부검 시

펜토바르비탈 나트륨 수용액을 복강 내에 40 mg/kg 투여했다.

(2) 세균 접종, 시험 물질 투여

가스 마취[도입 마취: 공기 1.0L/min에 5%이소플루란(마일란세이야쿠가부시키가이샤), 지속 마취는 적절히 농도를 조정]를 실시했다.

9-4-3 코튼사 삽입

마취 후, 전용대에 배위로 고정하여 아래 이마를 들어 올려 위턱 오른쪽 제 1 어금니와 제 2 어금니 사이에 코튼사를 삽입했다.

9-4-4 세균 접종

마취 후, 시험균액 0.2 mL를 코튼사 삽입 부위에 접종했다. 이 조작은 2시간 간격으로 실시했다.

9-4-5 시험 물질 투여

마취 후, 시험 물질 1 mL를 구강 내에 세정 투여했다. 이 조작은 1일 2회로 했다.

9-4-6 관찰 및 검사

(1) 일반 상태

코튼사 삽입일로부터 부검일까지 1일 1회 실시했다.

(2) 체중 측정

코튼사 삽입일로부터 부검시까지 총 2회 실시했다.

(3) 부검

마취하에서, 복부 대동맥을 절단하여 방혈사시켜, 부검을 실시했다.

(4) 병리 조직학적 검사

적출한 위턱을 10v/v% 중성 완충 포르말린액으로 고정하고, 탈지, 탈회 후, HE 염색 표본을 제작했다. 각 표본당 염증성 변화에 대하여 병리 검사했다.

9-4-7 통계학적 해석

각 군의 체중의 평균값 및 표준 편차를 산출한다. 검정은 수행하지 않았다.

9-5 결과

일반 상태에 이상은 인정되지 않고, 체중에 군 사이의 차이는 없었다.

병리학적 검사 결과를 도 17에 나타냈다. 또한, HE 염색 표본의 현미경 사진을 도 18에 나타낸다.

OPB 투여군에서는, 잇몸의 중층 편평 상피에서의 호중구의 침윤이 8/10예, 세포간 수종이 1/10예 및 궤양이 1/10예에서 모두 경미하게 인정되었다. 잇몸의 고유층에서의 호중구의 침윤이 8/10예 및 출혈이 1/10예에서 모두 경미하게 인정되었다. 한편, base 투여군에서는, 잇몸의 중층 편평 상피에서의 호중구의 침윤이 경미 8/10예 및 경도 2/10예에서 인정되었다. 세포간 수종이 2/10예, 과다 각화가 2/10예, 표피 비후가 2/10예 및 궤양이 1/10예에서 모두 경미하게 인정되었다. 잇몸의 고유층에서의 호중구의 침윤이 경미 6/10예 및 경도 3/10예에서 인정되었다. 출혈 및 수종이 모두 1/10예에서 경미하게 인정되었다.

9-6 고찰

잇몸의 중층 편평 상피에서의 호중구의 침윤, 세포간 수종, 과다 각화, 표피 비후 및 고유층에서의 호중구의 침윤 및 수종은 모두 염증에 관련된 변화이며, 처치에 기인하여 발생했다고 생각되었다. 이들 중 어느 변화도 base 투여군과 비교하여 OPB 투여군에서 빈도 및 정도 모두 낮은 경향이었던 점에서, OPB 투여에 의한 염증 경감 효과가 인정되었다.

실시예 10

10. 래트 폐렴 모델에서의 효력 시험

본 시험에서는, 래트의 오연성 폐렴 모델에 있어서, 0.1%올라넥시딘 글루콘산염의 폐렴에 대한 치료 효과를 검토했다.

10-1 시험 물질

피험 물질과 대조 물질을 합쳐 시험 물질로 했다.

10-1-1 피험 물질

명칭: OPB

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 0.10 w/v%

Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

10-1-2 대조 물질

명칭/약칭: 기제/Base

조성: Pluronic L-44 0.07 w/v%

Pluronic P-123 1.0 w/v%

10-2 사용 동물

입하 시 7주령의 래트, Crl:CD(SD), 수컷을 이용하여 시험을 수행했다.

10-3 군 구성

기관 내 투여일 아침에 체중을 측정하고, 층별 무작위화 할당에 의해 아래의 표 6에 나타내는 4군(1~4군)에 할당했다. 할당에서 제외한 6마리를 층별 무작위화 할당에 의해 아래의 표 6에 나타내는 2군(5, 6군)에 할당하고, 타액 채취용 개체로 했다.

10-4 시험 방법

10-4-1 마취

(1) 구강 내 세정, 타액 채취

솜노펜틸을 복강 내에 40 mg/kg이 되도록 투여했다.

(2) 기관 내 투여 시, 기관지 폐포 세정액(BALF) 채취 시

10-4-2 구강 내 세정

마취하에서, 시험 물질을 멸균 면봉에 함침시켜 구강 내에 충분량 도포했다.

10-4-3 타액 채취

마취하에서, 0.1%염산 필로카르핀(5 mg/kg)을 복강 내 투여했다. 과잉 분비되는 타액을 회수했다. 회수한 타액은, 중화제 함유 영양 배지에 가하여 정치했다. 그 후, 원심(r. t., 3000 rpm, 10 min)하고, 침사(沈渣)를 동량의 생리 식염액으로 현탁하여, 기관 내 투여액으로 했다.

10-4-4 기관 내 투여

타액 채취 후, 마취하에서 인두경을 이용하여 기관 내에 투여용 튜브를 유치하고, 타액 혹은 생리 식염액을 0.1 mL 투여했다.

10-4-5 BALF 채취

기관 내 투여 6, 24시간 후, 마취하에서 정중 절개하고, 복부 대동맥 절개에 의해 방혈하여 안락사시켰다. 그 후, 폐를 노출시켜, 기관지 기시부(起始部)에 카테터를 삽입했다. 그 라인으로부터 0.1%BSA, 0.05mM EDTA-2 Na 함유 PBS 용액(이하, PBS) 8 mL로 3회 세정하여(각 회 2회 주입 회수를 반복한다), 세정액을 채취했다(BALF). BALF를 원심(200 g, 4℃, 10 min)하고, 상청액은 다른 보존 튜브에 분취하여, LDH 농도 측정, 사이토카인류 측정(ELISA)용으로 했다. 침사는 PBS 1 mL로 현탁하여 혈액학적 검사용으로 했다.

10-4-6 타액 채취용 동물의 취급

기관 내 투여 종료 후, 타액 채취용 동물은 과마취하에서 방혈시켜 안락사시켰다.

10-4-7 사이토카인(TNF-α, IL-6) 농도 측정

키트 첨부의 프로토콜에 따라 측정했다.

10-4-8 혈액학적 검사

현탁한 침사에 대하여, 다항목 자동 혈구 계수 장치를 이용하여 혈액학적 해석을 실시했다.

10-4-9 생화학적 검사

채취한 BALF 상청액에 대하여, 자동 분석 장치 7180(가부시키가이샤히타치하이테크놀로지스)을 이용하여 LDH 농도를 측정했다.

10-4-10 통계학적 해석

탐색적인 해석을 위해 검정은 수행하지 않았다.

10-5 결과

혈액학적 검사 및 생화학적 검사의 결과를 도 19에 나타냈다.

혈액학적 검사로부터는 양 군 사이에 차이가 없었다. IL-6에 관해서는 24시간값에 있어서 OPB군에서 2.5배 정도 낮은 값이 되었다. TNF-α에 관해서는, 양 시점에서 OPB군이 낮은 값이 되었다.

따라서, OPB로 구강 내를 처리한 쪽이, 타액의 삼킴에 의한 폐에서의 염증성 반응은 낮은 것이 시사되었다.

실시예 11

11. 올라넥시딘의 TLR Reporter Cell Line을 이용한 항염증 작용의 검토

실시예 6~10으로부터, 올라넥시딘에는 구내염, 치은염, 폐렴에 대하여 항염증 작용을 갖는 것이 나타났다. 염증은, LPS나 LTA를 인식하는 수용체인 Toll-like receptor 4(TLR-4), Toll-like receptor 2(TLR-2)를 통한 면역 응답과 관련된 것이 밝혀져 있다(ChemMedChem. 2016 Jan 19;11(2):154-65, Biotechnol Adv. 2012 Jan-Feb;30(1):251-60, J Dent Res. 2016 Jul;95(7):725-33).

올라넥시딘은, TLR-4 및 TLR-2에 대한 안타고니스트(유사) 작용에 의해 염증을 억제하고 있을 가능성이 있다. 따라서, 본 시험에서는 이것을 명백히 하기 위해, TLR-4, TLR-2나 리포터 유전자(SEAP)를 안정 발현한 사람 유래 세포를 이용한 리포터 어세이에 의해, 올라넥시딘의 TLR-4 및 TLR-2에 대한 안타고니스트(유사) 작용을 확인한다.

11-1 피험 물질

명칭: 1.5%OPB

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 1.5 w/v%

11-2 세포

아래의 표 7에 기재된 세포를 이용했다.

11-3 시험 방법

11-3-1 올라넥시딘의 TLR-4에 대한 안타고니스트(유사) 작용의 검토

-사용 세포: HEK293-TLR4 발현 세포

-사용 배지

전배양: DMEM+FBS(종농도(終濃度) 10%)+페니실린(종농도 100 unit/mL)+스트렙토마이신(종농도 100μg/mL)

샘플 투여, 투여 후 배양: DMEM+FBS(종농도 5%)

-활성 측정: SEAP assay kit(Novus Biologicals사 제품)

-단백질량 정량: BCA protein assay(후나코시가부시키가이샤 제품)

〔1〕세포를 1.0×10⁵cell/well/100μL가 되도록, 10%FBS DMEM으로 조정하고, 96 well plate(콜라겐 처리)에 뿌려, 40 h 배양(37℃, 5%CO₂).

〔2〕1.5%OPB를, 아래의 표 8에 나타내는 농도가 되도록 5%FBS를 이용하여 희석한다.

〔3〕LPS를 20 ng/mL(종농도 10 ng/mL)가 되도록 5%FBS를 이용하여 조제한다.

〔4〕배지를 제거 후, OPB 배지 50μL, LPS 배지 50μL의 순서로 배지를 가하여 8 h 배양(37℃, 5%CO₂).

〔5〕배양 후, 상청액을 50μL 별도의 96 well plate로 옮겨, SEAP assay를 수행한다.

〔6〕상청액의 나머지를 제거한 96 well plate에, 0.1%SDS-0.1N NaOH를 50μL 가하여, over night로 동결(-20℃)시킨다. 융해 후, BCA protein assay를 수행한다.

〔7〕리포터 유전자인 SEAP의 발현량을 단백질 농도로 교정(較正)하여, OPB 농도마다의 저해율을 산출했다.

11-3-2 올라넥시딘의 TLR-2에 대한 안타고니스트(유사) 작용의 검토

-사용 세포: HEK293-TLR2 발현 세포

-사용 배지

전배양: DMEM+FBS(종농도 10%)+페니실린(종농도 100 unit/mL)+스트렙토마이신(종농도 100μg/mL)

샘플 투여, 투여 후 배양: DMEM+FBS(종농도 1%)

-활성 측정: SEAP assay kit(Novus Biologicals사 제품)

〔1〕세포를 1.0×10⁵cell/well/100μL가 되도록, 10%FBS DMEM으로 조정하고, 96 well plate(콜라겐 처리)에 뿌려, 36 h 배양(37℃, 5%CO₂).

〔2〕1.5%OPB를, 상기 표 8에 나타내는 농도가 되도록 1%FBS를 이용하여 희석한다.

〔3〕LTA를 2μg/mL(종농도 1μg/mL)가 되도록 1%FBS를 이용하여 조제한다.

〔4〕배지를 제거 후, OPB 배지 50μL, LTA 배지 50μL의 차례로 배지를 가하여 12 h 배양(37℃, 5%CO₂).

〔7〕리포터 유전자인 SEAP의 발현량을 단백질 농도로 교정하여, OPB 농도마다의 저해율을 산출했다.

11-4 결과

결과를 도 20에 나타낸다.

OPB 농도가 상승함에 따라, SEAP의 저해율이 높아져 있고(IC₅₀: 약 10μg/mL), OPB가, TLR4, TLR2에 대한 안타고니스트(유사) 작용을 나타내는 것이 밝혀졌다. 이 결과로부터, OPB가, TLR4, TLR2를 통한 면역 응답을 저해함으로써, 항염증 작용을 갖는 것이 시사되었다.

실시예 12

12. 마우스 마크로파지 유사 세포주 RAW264.7을 이용한 올라넥시딘의 항염증 작용의 검토

마우스 마크로파지 유사 세포주 RAW264.7은, LPS나 LTA로 자극하면, 그들을 인식하는 수용체를 통해 면역 응답을 시작하고, 염증성 메디에이터인 NO의 산생을 수행한다. 따라서, 올라넥시딘이 LPS 자극에 의한 염증에 대한 항염증 작용을 갖는지 어떤지를, RAW264.7 세포로부터의 NO 산생을 지표로 하여 확인한다.

12-1 피험 물질

명칭: 1.5%OPB

조성: 올라넥시딘 글루콘산염 1.5 w/v%

12-2 세포

아래의 표 9에 기재된 세포를 이용했다.

12-3 시험 방법

12-3-1 올라넥시딘의 LPS 자극에 대한 항염증 작용의 검토

-사용 세포: RAW264.7

-사용 배지

샘플 투여, 투여 후 배양: DMEM+FBS(종농도 5%)-활성 측정: Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit(Griess Reagents사 제품)

-단백질량 정량: 세포를 염색하기 어렵고, 값이 불안정해지므로 측정하지 않음.

〔1〕세포를 1.0×10⁵cell/well/100μL가 되도록, 10%FBS DMEM으로 조정하고, 96 well plate(무처리)에 뿌려, 24 h 배양(37℃, 5%CO₂).

〔2〕1.5%OPB를, 상기 표 8에 나타낸 농도가 되도록 5%FBS를 이용하여 희석한다.

〔3〕LPS를 200 ng/mL(종농도 100 ng/mL)가 되도록 5%FBS를 이용하여 조제한다.

〔5〕배양 후, 상청액을 50μL 별도의 96 well plate로 옮겨, Nitrate/Nitrite colorimetric assay를 수행한다.

12-3-2 올라넥시딘의 대장균(LPS 산생균) 자극에 대한 항염증 작용의 검토

-사용 세포: RAW264.7

-사용 배지

샘플 투여, 투여 후 배양: DMEM+FBS(종농도 1%)

-활성 측정: Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit(Griess Reagents사 제품)

〔2〕1.5%OPB를, 상기 표 8에 나타낸 농도가 되도록 1%FBS를 이용하여 조제한다.

〔3〕배지를 제거 후, OPB 배지 50μL를 가하여 37℃, 5%CO₂로 정치한다.

〔4〕MHB에서 하룻밤 배양한 대장균을, McF 1이 되도록 조제하고, 5%DMEM으로 300배 희석한다. 추가로, Ampicillin을 종농도 50μg/mL가 되도록 첨가한다.

〔5〕OPB 배지를 첨가한 플레이트에, 추가로 조제한 균배지 50μL를 가하고, 밀폐하여 24 h 배양한다(37℃, 5%CO₂).

〔6〕배양후 상청액을 50μL 별도의 96 well plate로 옮겨, Nitrate/Nitrite colorimetric assay를 수행한다.

12-4 결과

결과를 도 21에 나타낸다.

OPB 농도가 상승함에 따라, NO 생성이 감소하고 있어, OPB가 NO 생성 저해 작용을 나타내는 것이 밝혀졌다(IC₅₀: 약 10μg/mL). 이 결과로부터, OPB가 항염증 작용을 갖는 것이 시사되었다.

산업상 이용 가능성

본 발명에 의해, 광범위한 염증성 질환에 적용 가능한, 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 조성물을 암 치료에 의한 구강 점막염 개선용 및/또는 예방용 조성물로 이용함으로써, 화학 요법, 방사선 치료를 받고 있는 환자의 커뮤니케이션 기능 저해, 수면 장애, 동통, 삼킴 장애(식사 섭취량의 감소) 등의 QOL의 저하나, 화학 요법, 방사선 치료의 Dose 준수 방해를 막을 수 있으므로, 산업상 유용성은 높다.

Claims

올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염을 포함하는, 염증 개선용 및/또는 예방용 조성물.
제 1항에 있어서,
올라넥시딘 또는 그 약리학상 허용되는 염이, 올라넥시딘 글루콘산염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
염증이 구내염, 구강 점막염, 치은염, 및 폐렴으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
염증이 암 치료에 의한 구강 점막염이며,
0.01~1.5%(w/v)의 올라넥시딘 글루콘산염;
폴리옥시프로필렌쇄(POP) 및 상기 POP를 사이에 두는 2개의 폴리옥시에틸렌쇄(POE)로 이루어지는 블록 공중합체인 폴록사머;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
폴록사머가 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123), 폴리옥시에틸렌(54)폴리옥시프로필렌(39)글리콜(Pluronic P-85), 및 폴리옥시에틸렌(196)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic F-127)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서,
폴록사머가 폴리옥시에틸렌(42)폴리옥시프로필렌(67)글리콜(Pluronic P-123)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
올라넥시딘 글루콘산염의 농도가 0.05~0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
폴록사머의 농도가, 0.1~5.0%(w/v)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
액제 또는 함수제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
암 치료가 화학 요법, 방사선 치료, 또는 화학 요법과 방사선 치료의 동시 병용 요법인 것을 특징으로 하는 조성물.