KR20190090088A - 선택적 에스트로겐 수용체 조절자와 복합된 성 스테로이드 전구체에 의한 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증의 치료 - Google Patents

선택적 에스트로겐 수용체 조절자와 복합된 성 스테로이드 전구체에 의한 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증의 치료 Download PDF

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KR20190090088A
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Abstract

민감한 온혈 동물에서 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증의 발생을 경감 또는 제거하면서, 유방암, 자궁암 또는 자궁내막암에 걸릴 위험은 감소시키고, 또한 골다공증, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 근육질량 손실, 비만, 알츠하이머병, 인식 상실, 기억 상실 또는 질 건조증의 발전을 저해함으로써 유리한 효과를 갖는 신규한 방법으로서, 성 스테로이드 전구체, 특히 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA) 및 항에스트로겐 또는 선택적 에스트로겐 수용체 조절자, 특히 하기의 일반식을 갖는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
Figure pat00045

유효 성분(들)의 전달을 위한 약학적 조성물과 유용한 키트(들) 역시 본 발명에 의해 개시된다.

Description

선택적 에스트로겐 수용체 조절자와 복합된 성 스테로이드 전구체에 의한 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증의 치료{TREATMENT OF HOT FLUSHES, VASOMOTOR SYMPTOMS, AND NIGHT SWEATS WITH SEX STEROID PRECURSORS IN COMBINATION WITH SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR MODULATORS}
본 발명은 2009년 6월 16일에 출원된 미국 가출원 No. 61/187,549 및 2010년 6월 1일에 출원된 미국 정규 출원 No. 12/791,174에 의해 우선권 주장하여 출원된 것으로서, 상기 출원의 내용들은 모두 여기에 참고로서 병합된다.
본 발명은 여성의 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 (vasomotor symptom) 및 도한증의 새로운 치료법에 관한 것이다. 특히, 상기 치료법은 유방암 또는 자궁내막암에 걸릴 될 위험을 줄이기 위해 성 스테로이드 전구체와 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM)을 복합하여 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 전술한 복합 투여를 실시하기 위한 키트와 약학적 조성물도 제공한다. 환자에 대한 전술한 복합 투여는 안면 홍조, 혈관 운동성 증상, 도한증 및 수면 장애의 발생을 감소시키거나 제거한다. 더욱이 이 복합 처치를 받음으로써 환자들에게서 유방암 및/또는 자궁내막암의 발생 위험을 줄일 수 있다고 생각된다. 골다공증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 알츠하이머병, 인지 상실, 기억 장실, 불면증, 심장 혈관계 질병, 인슐린 내성, 당뇨병 및 비만 (특히 복부 비만)의 가능성 또는 습득 위험의 감소와 같은 부가적인 이점 역시 제공된다.
관련 기술
여기서 논의되는 모든 참고 자료의 인용이 축약된 인용 형식을 사용하여 하기에 제시된다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
다수의 질병, 질환 및 바람직하지 않은 증상이 외인성 성 스테로이드 또는 그 전구체의 투여에 대해 유리하게 반응한다는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 에스트로겐은 골 손실율을 감소시키는 반면, 안드로겐은 골 형성을 자극함으로써 골 질량 형성을 나타낸다고 생각된다. 호르몬 대체 치료 (예를 들면 에스트로겐의 투여)는 폐경기 증상의 치료에 사용될 수 있다. 프로게스틴은 에스트로겐에 의해 유발되는 자궁내막 증식과 자궁내막암의 위험에 대응하기 위해 자주 사용된다. 광범위하게 다양한 증상과 장애의 치료 또는 예방 목적의 에스트로겐, 안드로겐성 화합물 및/또는 프로게스틴의 사용은 많은 문제점을 갖는다. 안드로겐성 화합물로 여성을 처치하는 것은 남성화 부작용을 초래하는 바람직하지 않은 부작용을 만들 수 있다. 또한, 환자들에게 성 스테로이드를 투여하는 것은 환자들이 어떤 질병에 걸릴 위험을 증가시킬 수 있다. 예를 들면 여성의 유방암은 에스트로겐성 활성에 의해 악화된다.
또한 안드로겐성 화합물은 HRT (hormone replacement therapy, 호르몬 대체 요법) (Pye et al., 1985)에 의해 흔히 유발되는 유방 통증의 처치에 유용하다는 것이 알려져 왔다. 사실, 에스트로겐 대체 치료는 치료의 중단을 가져올 수 있는 심한 유방 통증을 초래할 수 있다.
보다 효과적인 호르몬 치료 및 부작용과 위험의 감소가 요구된다. 본 발명의 복합 치료와 약학 조성물 및 키트는 그와 같은 치료에 사용될 수 있으며, 이와 같은 요구를 해결할 수 있을 것으로 생각된다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 안면 홍조, 혈관 운동성 증상, 도한증 및 수면 장애를 치료하거나 이들 질환의 발생이나 질환에 걸릴 위험을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유방암 및/또는 자궁내막암, 골다공증, 심장 혈관계 질병, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병, 비만 (특히 복부 비만) 및 질 건조증에 걸릴 위험을 최소화하면서 상기 질병을 치료하거나 이들 질병에 걸릴 위험을 감소하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용하기에 적합한 키트와 약학 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 이들 제품은 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증으로 이루어지는 군에서 선택되는 증상의 발생을 감소 또는 제거하기 위해 그 내용물을 사용하기 위한 지시와 함께 포장된다.
일 실시의 형태에서, 본 발명은 안면 홍조, 혈관 운동성 증상, 도한증 및 수면 장애의 발생을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것과 함께 상기 제거 또는 감소를 필요로 하는 환자에게 성 스테로이드의 전구체 또는 그 전구 약물의 치료적으로 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
성 스테로이드 전구체는 디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-설페이트, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올, 4-안드로스텐-3,17-디올 및 상술한 부가 제제들 중 어느 하나의 전구 약물로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 부가적인 유익한 영향 또는 골다공증, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 아테롬성 동맥 경화증, 고혈압, 알츠하이머병, 인슐린 내성, 당뇨병, 근육 질량 손실, 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환에 걸릴 위험의 감소를 제공하고, 상기 유익한 영향은 상기 환자에게 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것과 함께 상기 유익한 영향을 필요로 하는 환자에게 성 스테로이드의 전구체 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 투여함으로써 얻어진다.
다른 실시의 형태에서, 본 발명은,
a) 약학적으로 수용가능한 첨가제, 희석제 또는 캐리어;
b) 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량;
c) 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 실시의 형태에서 본 발명은,
a) 약학적으로 수용가능한 첨가제, 희석제 또는 캐리어;
b) 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량;
c) 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 포함하는 알약, 정제, 캡슐, 젤, 크림, 오뷸 (ovule) 또는 좌약을 제공한다.
다른 실시의 형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 포함하는 약학 제제를 함유하는 제1 용기를 포함하고; 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 포함하는 약학 제제를 함유하는 제2 용기를 더 포함하는 키트를 제공한다.
다른 실시의 형태에서, 본 발명은 처치 또는 감소를 필요로 하는 환자에게서, 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA), 디하이드로에피안드로스테론-설페이트 (DHEA-S), 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올 (5-디올) 및 4-안드로스텐-3,17-디올로 이루어진 군에서 선택되는 성 스테로이드 전구체의 레벨을 증가시킴으로써, 또한 복합 처치의 일부로서 상기 환자에게 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM)의 치료적 유효량을 투여하는 것을 더 포함함으로써 안면 홍조, 혈관 운동성 증상, 도한증 및 수면 장애의 발생을 치료 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
여기서 사용되는, "순수 SERM"은 생리적 또는 약학적 농도에서 유방과 자궁내막 조직에서 어떠한 에스트로겐 활성도 갖지 않는 SERM을 의미한다.
또 다른 실시의 형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체의 치료적 유효량을 함유하는 제1 용기를 포함하고, 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자의 치료적 유효량을 함유하는 제2 용기를 더 포함하는 키트를 제공한다.
다른 실시의 형태에서, 본 발명은 하나의 용기 내의 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학 조성물은:
a) 약학적으로 수용가능한 첨가제, 희석제 또는 캐리어;
b) 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체의 치료적 유효량; 및
c) 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자의 치료적 유효량을 포함한다.
다른 실시의 형태에서, 본 발명은 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증으로부터 선택되는 증상의 발생을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 제거 또는 감소를 필요로 하는 환자에게 (ⅰ) 성 스테로이드 전구체 또는 그 전구 약물의 치료적 유효량을 (ⅱ) 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐 또는 이들의 전구 약물의 치료적 유효량과 함께 투여하는 것을 포함한다.
다른 실시의 형태에서, 본 발명은 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증으로 이루어진 군에서 선택되는 증상의 감소 또는 제거를 위한 약학 조성물을 제공하며, 상기 약학 조성물은:
(a) 약학적으로 수용가능한 첨가제, 희석제 또는 캐리어;
(b) 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체 또는 그 전구 약물; 및
(c) 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐 또는 이들의 전구 약물을 포함하며,
여기서 상기 약학 조성물은 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 증상의 감소 또는 제거를 위해 상기 조성물의 사용을 지시하는 포장을 구비한다.
다른 실시의 형태에서, 본 발명은 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증으로 이루어진 군에서 선택되는 증상의 감소 또는 제거를 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 (ⅰ) 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체 또는 그 전구 약물을 함유하는 제1 용기, (ⅱ) 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐 또는 이들의 전구 약물을 함유하는 제2 용기, (ⅲ) 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 증상의 감소 또는 제거를 위해 상기 키트를 사용하기 위한 지시를 포함한다.
여기서 사용되는 바와 같이 다른 화합물과 "함께" 환자에게 투여되는 화합물은, 비록 상기 화합물들이 시간 상 근접하게 투여되지 않더라도, 환자가 두 가지 화합물의 생리학적 효과를 동시에 얻을 수 있을 정도로 상기 다른 화합물의 투여에 충분히 근접하게 투여된다. 화합물들이 복합 처치의 일부로서 투여될 때, 그들은 함께 투여된다. 여기서 논의되는 바람직한 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 바람직하게는 디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-설페이트, 안드로스트-5-엔-3β, 17β-디올 또는 4-안드로스텐-3,17-디온, 특히 디하이드로에피안드로스테론인 바람직한 성 스테로이드 전구체와 함께 사용된다.
에스트로겐 대체 치료는 폐경으로 인한 질병들, 즉 골다공증, 안면 홍조, 질 건조증, 관상 동맥 심장 질환 (Cummings 1991)의 예방과 치료를 위해 폐경기 여성에게 흔히 사용되지만, 만성적 에스트로겐 투여와 관련하여 몇 가지 바람직하지 않은 효과를 나타낸다. 특히, 에스트로겐에 의해 발생되는 자궁 및/또는 유방암 위험의 인식가능한 증가 (Judd, Meldrum et al., 1983; Colditz, Hankinson et al., 1995)는 이 치료의 주된 문제점이다. 본 발명의 저자들은 성 스테로이드 전구체의 투여에 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM)을 부가함으로써 이들 바람직하지 않은 효과를 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.
한편, SERM 단독으로는 안면 홍조와 땀흘림과 같은 폐경기 증상에 대해 유익한 영향을 거의 갖지 않는다. 출원인은 폐경기 증상의 SERM 치료에 성 스테로이드 전구체를 부가함으로써 안면 홍조와 땀흘림을 감소시키거나 심지어 제거할 수 있다고 생각한다. 안면 홍조와 땀흘림은 폐경의 첫 번째 징후이며, 환자가 폐경기 치료를 수용하거나 수용하지 않는 것은 통상 안면 홍조와 땀흘림 감소의 성공 여부에 달려있다는 점에 주목하는 것이 중요하다.
여기서 사용되는, 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM)은 직접 또는 그 활성 대사 산물을 통해 유방 조직에서는 에스트로겐 수용체 안타고니스트 ("항에스트로겐")으로 작용하지만, 뼈 조직과 혈청 콜레스테롤 수준에서는 (즉, 혈청 콜레스테롤을 감소시킴으로써) 에스트로겐성 또는 에스트로겐과 유사한 효과를 제공하는 화합물이다. 생체 외에서 또는 인간 또는 래트의 유방 조직에서 에스트로겐 수용체 안타고니스트로서 기능하는 비스테로이드성 화합물은 (특히 화합물이 인간 유방암 세포에서 항에스트로겐으로서 작용할 경우), SERM으로서 작용할 가능성이 있다. 반대로, 스테로이드성 항에스트로겐은 혈청 콜레스테롤에 어떤 긍정적인 영향도 나타내지 않는 경향을 갖기 때문에 SERM으로서 기능하지 않는 경향을 갖는다. 본 발명자들이 SERM으로서 기능하는 것으로 시험하고 밝혀낸 비스테로이드성 항에스트로겐에는 EM-800, EM-652.HCl, 랄록시펜, 타목시펜, 4-하이드록시-타목시펜, 토레미펜, 4-하이드록시-토레미펜, 드롤록시펜, LY 353 381, LY 335 563, GW-5638, 라소폭시펜, 바제독시펜 (TSE 424; WAY-TSE 424; WAY 140424;　1-[[4-[2-(헥사하이드로-1H-아제핀-1-일)에톡시]페닐]메틸]-2-(4-하이드록시페닐)-3-메틸-1H-인돌-5-올), 피펜독시펜 (ERA 923; 2-(4-하이드록시페닐)-3-메틸-1-[[4-[2-(1- 피페리디닐)에톡시]페닐]메틸]-1H-인돌-5-올) 및 이독시펜이 포함되지만, 이들 화합물에 제한되는 것은 아니다.
그러나, 본 발명자들은 또한 모든 SERM들이 동일한 방식으로 반응하지 않으며, 두 개의 하위 분류으로 나뉠 수 있다는 것을 발견했다: "순수 SERM" 및 "혼합 SERM"이다. 따라서 EM-800과 EM-652.HCl과 같은 어떤 SERM들은 생리학적 또는 약학적 농도에서 유방 및 자궁내막 조직에서 어떤 에스트로겐 활성도 갖지 않고, 래트에서 고콜레스테롤성 및 고트리글리세라이드성 효과를 갖는다. 이들 SERM은 "순수 SERM"으로 불릴 수 있을 것이다. 유선에서의 강력하고 순수한 항에스트로겐 활성 때문에 EM-652.HCl형 순수 SERM은 이상적인 SERM이다. 랄록시펜, 타목시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시-타목시펜 (1-(4-디메틸아미노에톡시페닐)-1-(4-하이드록시페닐)-2-페닐-but-1엔), 토레미펜, 4-하이드록시-토레미펜 [(Z)-(2)-2-[4-(4-클로로-1-(4-하이드록시페닐)-2-페닐-1-부테닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민), LY 353 381, LY 335 563, GW-5638, 라소폭시펜, 이독시펜 및 바제독시펜과 같은 다른 SERM은 유방 및 자궁내막에서 약간의 에스트로겐성 활성을 갖는다. 이들 두 번째 계열의 SERM은 "혼합 SERM"이라 불릴 수 있다. 이들 "혼합 SERM"의 원하지 않는 에스트로겐 활성은 도 5 및 6의 생체 외 시험과 도 7의 유방암의 생체 내 시험에서 볼 수 있는 바와 같이 순수 "SERM"의 부가에 의해 저해될 수 있다. 누드 마우스에서 인간 유방암종의 이종 이식편은 인간 유방암 모델의 이용가능한 가장 가까운 모델이기 때문에, 본 발명자들은 누드 마우스에서 ZR-75-1 유방암 이종 이식편의 생장에 대한 EM-800 및 타목시펜의 효과를 단독으로, 그리고 복합해서 비교했다.
SERM은 에스트로겐, 특히 유방, 자궁 및 자궁내막 조직에서 암의 위험을 증가시킬 수 있는 성 스테로이드 전구체의 외인성 전구체로부터 형성되는 에스트로겐의 잠재적인 부작용에 대응해야 하기 때문에, 출원인은 본 발명의 SERM이 유방, 자궁 및 자궁내막 조직에서 순수 항에스트로겐으로서 작용하는 것이 매우 중요하다고 생각한다. 특히, 출원인은 2위치에서 2S의 절대 배열을 갖는 본 발명의 벤조피란 유도체가 그 라세미 혼합물보다 더 적절하다고 생각한다. 따라서 미국 특허 제 6,060,503호에서 2S 배열을 갖는 광학적으로 활성인 벤조피란 항에스트로겐이, 에스트로겐-악화된 유방 및 자궁내막암을 치료하기 위해 개시되며, 이들 화합물은 라세미 혼합물보다 상당히 더 효과적이라는 것을 보여주고 있다 (미국 특허 제 6,060,503호의 도 1-5 참조).
2S 배열의 거울상 이성질체는 순수한 상태로서 산업적으로 얻기 어렵기 때문에 출원인은 10중량% 미만, 바람직하게는 5중량% 미만, 더욱 바람직하게는 2중량% 미만의 2R 거울상 이성질체의 혼합이 바람직하다고 생각한다.
도 1은 레트에서 혈청 트리글리세라이드 (A) 및 콜레스테롤 (B) 수준에 대한 9개월 동안의 DHEA (10 mg, 경피적으로 1일 1회) 또는 EM-800 (75 ㎍, 경구, 1일 1회)의 단독 또는 복합 치료 효과를 나타낸다. 데이터는 실험값 대 각각의 대조군의 평균 ±SEM. **: P<0.01로서 나타낸다.
도 2는 난소 절제 래트에서 EM-800과 랄록시펜의 증가된 복용량 (0.01, 0.03, 0.1, 0.3 및 1 mg/kg)으로 37주간 치료한 경우 전체 혈청 콜레스테롤 수준에 대한 효과를 나타낸다. 비교는 비처치 래트와 17β-에스트라디올 (E2);** p<0.01 이식 난소 절제 동물에 대해 실험값 대 OVX 대조군 래트로 행해진다.
도 3은 A) 에스트론이 보충된 난소 절제된 (OVX) 누드 마우스에서 경피적으로 평균 1일 2회 투여된 DHEA의 증가된 복용량 (0.3 mg, 1.0 mg 또는 3.0 mg)의 ZR-75-1 종양 크기에 대한 효과를 나타낸다. 비히클이 단독으로 투여된 대조군 OVX 마우스가 부가적인 대조군으로서 사용된다. 초기 종양의 크기를 100%로 취한다. DHEA는 등쪽 피부에 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜의 0.02 ㎖ 수용액으로 경피적으로 (p.c.) 투여되었다. B) 에스트론 보충된 OVX 누드 마우스에서 ZR-75-1종양 무게에 대한, 9.5개월 간의 증가된 복용량의 DHEA 또는 EM-800 (본 발명의 SERM)의 단독 또는 복합 치료의 효과를 나타낸다. **, p < 0.01, 처치된 마우스 대 에스트론 보충된 대조군 OVX 마우스.
도 4는 난소 절제된 (OVX) 에스트론 보충 누드 마우스에서 평균 ZR-75-1 종양 크기에 대한 9.5개월 간의 항에스트로겐 EM-800의 증가된 경구 복용 (15 ㎍, 50㎍ 또는 100 ㎍) (B) 또는 EM-800 (15 ㎍)과 복합된 DHEA (0.3, 1.0 또는 3.0 ㎎) 또는 EM-800 단독 투여(A)의 효과를 나타낸다. 초기 종양의 크기를 100%로 취한다. 비히클을 단독으로 투여받은 대조군 OVX 마우스가 부가적인 대조군으로서 사용되었다. 에스트론은 하루에 한 번 0.5 ㎍의 복용량으로 피하 투여되었으며, DHEA는 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜에 용해되어 0.02 ㎖의 부피로 하루에 2번 등 쪽 피부 영역에 가해졌다. 비교는 역시 비히클만을 수용한 OVX동물들과 행해졌다.
도 5는 인간 이시카와 세포에서 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 EM-800, (Z)-4-OH-타목시펜, (Z)-4-OH-토레미펜 및 랄록시펜의 증가된 농도의 영향을 나타낸다. 알칼리성 포스파타제 활성은 1.0 nM E2의 존재 또는 부재 하에 지시된 화합물의 증가된 농도에 5일간 노출 후 측정되었다.데이터는 4개 웰의 평균 ±SEM으로서 나타낸다. SEM이 사용된 기호와 중복될 때는 기호만이 표시된다 (Simard, Sanchez et al., 1997).
도 6은 인간 이시카와 암종 세포에서 항에스트로겐 EM-800에 의한 (Z)-4-OH-타목시펜, (Z)-4-OH-토레미펜, 드롤록시펜 및 랄록시펜의 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 자극 효과의 차단을 나타낸다. 알칼리 포스파타제 활성은 30 또는 100 nM EM-800의 존재 또는 부재 하에 지시된 화합물의 3 또는 10 nM에 대해 5일간 노출 후 측정되었다. 데이터는 대조군에서의 데이터가 16개의 웰에서 얻어진 것을 제외하고는 8개 웰의 평균 ±SD로 나타낸다 (Simard, Sanchez et al., 1997).
도 7은 인간 유방암 ZR-75-1 이종 이식편의 생장에 대한 타목시펜의 자극 효과가 EM-652.HCl의 동시 투여에 의해 완전히 차단되는 것을 나타낸다. EM-652.HCl 자체만으로는 그 순수한 항에스트로겐 활성으로 인해 타목시펜의 부재 하에서 종양 생장에 어떤 영향도 갖지 않는다.
도 8은 폐경의 파라미터에 대한 표준 ERT (에스트로겐) 또는 HRT (에스트로겐 + 프로게스틴)과, 디하이드로에피안드로스테론 및 SERM 아콜비펜 복합의 효과를 비교하여 나타낸다. 디하이드로에피안드로스테론에 대한 아콜비펜의 부가는 디하이드로안드로스테론으로부터 형성된 에스트로겐의 잠재적인 부정적 효과에 대응할 것이다.
도 9는 래트의 유선 부분을 나타낸다:
a) 비처치 동물. 소엽(lobule, L)은 몇 개의 폐포 (alveoli)로 이루어진다. 인서트(Insert). 고배율은 폐포를 나타낸다.
b) EM-800 (0.5 ㎎/㎏, 하루 당 b w)으로 12주간 처치된 동물. 소엽(L)의 크기가 감소된다. 인서트(Insert). 고배율은 위축된 폐포 세포를 나타낸다.
도 10은 래트의 자궁내막 부분을 나타낸다.
a) 비처치 동물. 내강 상피 (luminal epithelium, LE)는 원주 상피세포의 특징을 갖는데 비해, 샘 상피 (glandular epithelium, GE)는 입방형이다. 기질은 몇 개의 세포 요소와 콜라겐 섬유를 함유한다.
b) 12주 동안 EM-800 (0.5 ㎎/㎏, 하루 당 b w)으로 처치된 동물. 내강 상피의 높이가 눈에 띄게 감소한다. 샘 상피 세포는 활성을 갖지 않는 비염색성 세포질이다. 기질은 기질의 세포 간 요소들의 감소로 인해 세포성이 높다.
도 11은 동시에 에스트론으로 처치된 난소 절제 마우스에 대해 9일간 경구 투여된 증가된 농도의 EM-652.HCl, 라소폭시펜 (유리 염기; 활성 및 비활성 거울상 이성질체) 및 랄록시펜의 자궁 무게에 대한 영향을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01 대 E1-처치된 대조군.
도 12는 동시에 에스트론으로 처치된 난소 절제 마우스에 대해 9일간 경구 투여된 증가된 농도의 EM-652.HCl, 라소폭시펜 (유리 염기; 활성 및 비활성 거울상 이성질체) 및 랄록시펜의 질 무게에 대한 영향을 나타낸다. **p<0.01 대 E1-처치된 대조군.
도 13은 난소 절제 마우스에 대해 9일간 경구 투여된 1㎍과 10㎍의 EM-652.HCl, 라소폭시펜 (유리 염기; 활성 및 비활성 거울상 이성질체) 및 랄록시펜의 자궁 무게에 대한 영향을 나타낸다. **p<0.01 대 OVX 대조군.
도 14는 난소 절제 마우스에 대해 9일간 경구 투여된 1㎍과 10㎍의 EM-652.HCl, 라소폭시펜 (유리 염기; 활성 및 비활성 거울상 이성질체) 및 랄록시펜의 질 무게에 대한 영향을 나타낸다. **p<0.01 대 OVX 대조군.
도 15는 난소 절제 래트에서 소주골 (trabecular bone) 부피에 대한 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA) 단독 또는 플루타미드 또는 EM-800과의 12개월 간의 복합 처치의 영향을 나타낸다. 비처치 동물은 부가적인 대조군으로 부가되었다. 데이터는 평균 ±SEM** p<0.01 대 OVX 대조군으로서 나타낸다.
도 16은 난소 절제 래트에서 소주골 수에 대한 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA) 단독 또는 플루타미드 또는 EM-800과의 12개월 간의 복합 처치의 영향을 나타낸다. 비처치 동물은 부가적인 대조군으로 부가되었다. 데이터는 평균 ±SEM** p<0.01 대 OVX 대조군으로서 나타낸다.
도 17은 비처치 대조군 (A), 난소 절제된 대조군 (B), DHEA만으로 처치 (C) 또는 플루타미드 (D) 또는 EM-800 (E)과 조합하여 처치된 난소 절제 래트의 경골 근위부 골간단부를 나타낸다. 난소 절제된 대조군 (B)에서 소주골 (T) 양의 감소와 DHEA 처치 (C) 후에 유발된 소주골 부피 (T)의 상당한 증가를 주목하라. DHEA에 대한 플루타미드의 부가는 소주골 부피 (D)에 대한 DHEA의 영향을 부분적으로 차단하는 반면, DHEA와 EM-800의 복합은 난소 절제와 관련된 뼈 손실에 대한 완전한 보호를 제공한다. 변형된 삼색 Masson-Goldner. magn.x80. T:　골소주 (Trabeculae), GP: 성장판 (Growth Plate).
도 18은 ZR-75-1 종양 생장에 대한 항에스트로겐의 효과를 나타낸다. 난소 절제된 누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 유방암의 에스트론 유발된 생장에 대해 161일 동안 7 항에스트로겐으로 처치된 효과이다. 종양 크기는 초기 종양 면적의 퍼센트로서 표시된다 (1일 = 100%). 데이터는 평균 ± SEM (n = 18-30 종양/군); ## p<0,01 대 EM-652.HCl; ** p<0,01 vs OVX 로서 표시된다. 항에스트로겐은 에스트론과 콜레스테롤을 1:25의 비율로 함유하는 0.5cm 피하 실라스틱 이식편에 의해 얻어진 에스트론 자극 하에 50 ㎍/마우스의 복용량으로 하루에 한 번씩 경구적으로 투여되었다.
도 19는 ZR-75-1 종양 생장에 대한 항에스트로겐의 효과를 나타낸다. 난소 절제된 누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 유방 종양의 생장에 대해 161일 동안 7 항에스트로겐으로 처치된 효과이다. 종양 크기는 초기 종양 면적의 퍼센트로서 표시된다 (1일 = 100%). 데이터는 평균 ± SEM (n = 18-30 종양/군); ## p<0,01 대 EM-652.HCl; ** p<0,01 vs OVX 로서 표시된다. 항에스트로겐은 에스트로겐 자극의 부재 하에 100 ㎍/마우스의 복용량으로 하루에 한 번씩 경구적으로 투여되었다.
도 20은 ZR-75-1 종양 생장에 대한 항에스트로겐의 효과를 나타낸다. 난소 절제된 누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 종양 생장에 대해 161일 동안 항에스트로겐 타목시펜, EM-652.HCl (아콜비펜) 및 타목시펜과 EM-652.HCl의 복합 처치된 효과이다. 종양 크기는 초기 종양 면적의 퍼센트로서 표시된다 (1일 = 100%). 데이터는 평균 ± SEM (n = 18-30) 종양/군; ## p<0,01 대 EM-652.HCl; ** p<0,01 vs OVX 로서 표시된다. 항에스트로겐은 에스트로겐 자극의 부재 하에 200 ㎍/마우스의 복용량으로 하루에 한 번씩 경구적으로 투여되었다.
도 21은 응답 카테고리에 대한 항에스트로겐의 효과를 나타낸다. 난소 절제된 누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 유방 종양의 응답 카테고리에 대해 161일 동안 7 항에스트로겐 투여의 효과이다. 완전한 감소는 처치의 종료 시 종양이 검출되지 않음을 확인하는 것이다; 부분적인 감소는 원래 크기의 50% 이상이 감소된 종양에 해당한다; 안정된 응답은 50% 미만이 감소되거나 50% 이하가 진행성인 종양을 지칭하고; 진행은 원래 크기에 비교해서 50% 보다 많이 진행되었음을 의미한다. 항에스트로겐은 에스트론과 콜레스테롤을 1:25의 비율로 함유하는 0.5cm 피하 실라스틱 이식편에 의해 얻어진 에스트론 자극 하에 50 ㎍/마우스의 복용량으로 하루에 한 번씩 경구적으로 투여되었다.
도 22는 응답 카테고리에 대한 항에스트로겐의 효과를 나타낸다. 난소 절제된 누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 유방 종양의 응답 카테고리에 대해 161일 동안 7 항에스트로겐 투여의 효과이다. 완전한 감소는 처치의 종료 시 종양이 검출되지 않음을 확인하는 것이다; 부분적인 감소는 원래 크기의 50% 이상이거나 감소된 종양에 해당한다; 안정된 응답은 50% 미만이 감소되거나 50% 이하가 진행성인 종양을 지칭하고; 진행은 원래 크기에 비교해서 50%보다 많이 진행되었음을 의미한다. 항에스트로겐은 에스트론 자극의 부재 하에 200 ㎍/마우스의 복용량으로 하루에 한 번씩 경구적으로 투여되었다.
도 23은 응답 카테고리에 대한 항에스트로겐의 효과를 나타낸다. 난소 절제된 누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 유방 종양의 응답 카테고리에 대해 161일 동안 7 항에스트로겐 타목시펜, EM-652.HCl (아콜비펜) 및 타목시펜과 EM-652.HCl의 복합 투여의 효과이다. 완전한 감소는 처치의 종료 시 종양이 검출되지 않음을 확인하는 것이다; 부분적인 감소는 원래 크기의 50% 이상이 감소된 종양에 해당한다; 안정된 응답은 50% 미만이 감소되거나 50% 이하가 진행성인 종양을 지칭하고; 진행은 원래 크기에 비교해서 50% 보다 많이 진행되었음을 의미한다. 항에스트로겐은 에스트론 자극 부재 하에 200㎍/마우스의 복용량으로 하루에 한 번씩 경구적으로 투여되었다.
도 24는 16주 동안 중간 내지 심한 안면 홍조의 평균 횟수에 대한 DHEA 또는 위약의 매일 복용량에 대한 효과를 나타낸다 (*,　p<0.05 DHEA 대 위약).
도 25는 16주의 처치 동안 모든 (가벼운, 중간 정도, 심한) 안면 홍조의 평균 횟수에 대한 하루 50mg의 DHEA 또는 위약 처치의 효과를 나타낸다 (*,　p<0.05 DHEA 대 위약).
도 26은 0%, 0.5%, 1.0% 또는 1.8% 의 DHEA를 함유하는 질 좌약을 매일 투여 후 40-75세의 폐경 여성에게서 1일과 7일에 측정된 성숙 지수를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM (n=9 또는 10). *,　p　<　0.05, **, p　<　0.01, 7일째 데이터 대 1일째 데이터로 나타낸다.
도 27은 0%, 0.5%, 1.0% 또는 1.8%의 DHEA를 함유하는 질 좌약을 매일 투여 후 40-75세의 폐경 여성에게서 1일과 7일에 측정된 질 pH를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM (n=9 또는 10). *,　p　<　0.05, **, p　<　0.01, 7일째 데이터 대 1일째 데이터로 나타낸다.
DHEA의 바람직한 효과
폐경에 대해 가장 널리 알려진 사실은 난소에 의한 에스트로겐 분비가 점진적으로 감소하여 결국 중지한다는 것이다. 난소 에스트로겐 분비의 중지는 순환 17β-에스트라디올 (E2) 수준의 뚜렷한 감소로 나타난다. 자궁내막의 이상 증식과 암을 초래할 수 있는 자궁내막에 대해 단독으로 사용되는 에스트로겐의 잠재적인 해로운 자극 효과를 피하기 위한 다양한 형태의 에스트로겐과, 에스트로겐과 프로게스틴의 조합에 의한 호르몬 대체 요법의 대부분의 노력은, 폐경기 증상 및 뼈의 재흡수에 대한 에스트로겐의 긍정적 효과와 결합된 순환 E2 수준의 쉽게 측정가능한 변화에 집중된다.
에스트로겐 단독 투여에 의해 유발되는 자궁내막암의 위험을 피하기 위해 다양한 형태의 에스트로겐과, 에스트로겐과 프로게스틴의 조합에 의한 호르몬 대체 요법의 대부분의 노력이 폐경기 증상 및 뼈 재흡수에 대한 외인성 에스트로겐의 긍정적인 영향과 결합된 폐경기의 순환 17β-에스트라디올 (E2)의 급격한 감소에 집중된다.
호르몬 대체 요법 (HRT), 에스트로겐과 프로게스틴은 에스트로겐 결핍에서 초래되는 극심한 증상, 특히 안면 홍조와 도한증에 대해, 그리고 골다공증 및 가능한 심장 질환 질병의 장기간의 예방에 대해 폐경 후의 여성들에게 사용되고 있다. 프로게스틴은 장기간 에스트로겐 노출의 자극적 영향으로부터 자궁을 보호하는데 효과가 있는 반면, 그 자신의 부작용, 특히 기능 장애성 자궁 출혈을 나타낸다 (Archer et al., 1999). 이것은 흔한 부작용이며, 여성들이 첫 6-12개월 이내에 너무 빠르게 호르몬 대체 요법을 중단하는 주된 이유이다. 프레마린과 프로베라 (Prempro) 조합의 심장 혈관 질환에 대한 잠재적인 부정적 영향에 대한 5.2년의 팔로우업에서 유방암의 발생을 26% 증가시킨다는 것을 나타내는 데이터로 인해 고전적인 HRT는 많은 여성들에 의해 최근 심각하게 의문시되거나 또는 포기되고 있다 (여성 건강 계획, 2002).
인트라크리놀로지 (intracrinology)라 불리는 말초 표적 조직에서 안드로겐과 에스트로겐 형성 및 작용에 대한 증가된 이해와 (Labrie, 1991; Labrie et al., 1992a; Labrie et al., 1992b; Labrie et al., 1994; Labrie et al., 1995; Luu-The et al., 1995a; Labrie et al., 1996; Labrie et al., 1997a; Labrie et al., 1997b; Labrie et al., 1997c; Labrie et al., 1997d), 래트에서 난소 절제 후 뼈 손실을 예방하는데 있어서 안드로겐이 에스트로겐 이상의 우세한 역할을 나타내는 것에 대한 본 발명자들의 최근의 관측 (Martel et al., 1998), 그리고 폐경기 이후 여성에서도 유사한 상황의 관측 (Labrie et al., 1997c)은 성 스테로이드 대체 요법 및 노화 분야에서 시의 적절하고 잠재적으로 매우 중요한 발전을 촉진시켰다. 그와 같은 가능성은 본 발명자들의 관측에 의해 잘 지지되고 있다.
Berger et al. (2005)에서, 래트 질의 질 벽의 3개의 층에 대한 DHEA의 흥미로운 효과, 즉 고유판에서 매우 점액화된 (mucified) 상피, 증가된 근육 두께 및 증가된 콜라겐 섬유 밀집도를 볼 수 있다. 따라서 DHEA는 질 점막에 대해 안드로겐과 에스트로겐 효과를 모두 발휘해서 생리학적 대체 치료를 제공한다.
본 발명은 따라서 남성과 여성에 대한 성 스테로이드 생리학에 대한 이해 (Labrie, 1991; Labrie et al., 1992a; Labrie et al., 1992b; Labrie et al., 1994; Labrie et al., 1995a; Luu-The et al., 1995a; Labrie et al., 1997a; Labrie et al., 1997b; Labrie et al., 1997c; Labrie et al., 1997d) 및 폐경기 여성은 난소 활성 감소로 인해 에스트로겐 활성을 빼앗길 뿐 아니라, 이미 수년 동안 안드로겐 감소를 겪어왔다는 인식에서 성취된 최근의 발전에 기반한 것이다. 사실, 정상적인 여성은 남성에게서 분비되는 안드로겐의 2/3에 해당하는 양의 안드로겐을 생산한다 (Labrie et al., 1997a).
여성에게서 안드로겐 풀은, DHEA와 DHEA-S의 혈청 농도 감소와 병행해서 30살부터 점진적으로 감소된다 (Labrie et al., 1997b). 따라서, 폐경 전후 및 폐경 후에 안드로겐과 에스트로겐 대체 요법을 모두 사용해서 각각의 세포와 조직에서 이들 두 종류의 성 스테로이드 간의 생리적 균형을 유지하는 것이 타당하다고 보이며, 이 목표는 스테로이드 전구체 DHEA로부터 말초 조직에서 안드로겐과 에스트로겐의 국부 형성에 의해서만 달성될 수 있다.
DHEA, 안드로겐의 주된 원천
말초 성 스테로이드 형성에서 DHEA의 역할
인간은, 말초 조직에서 강력한 안드로겐 및/또는 에스트로겐으로 전환되는 다량의 비활성 전구체 스테로이드 DHEA 및 특히 DHEA-S를 분비하는 부신을 갖는다는 점에서 다른 몇몇 영장류와 함께 동물 종 중에서 독특하다. 성인과 여성의 혈장 DHEA-S 수준은 테스토스테론보다 500배 높고, 에스트라디올보다 10,000배 더 높아서, 안드로겐 및/또는 에스트로겐 형성을 위한 다량의 기질을 제공한다. 상술한 바와 같이, 말초 표적 조직에서 성 스테로이드의 국부 합성 및 작용은 인트라크리놀로지 (intracrinology)라고 불린다 (Labrie et al., 1988; Labrie, 1991). 이 분야에서 최근의 빠른 발전은 말초 조직에서 국부적으로 DHEA 및 DHEA-S의 안드로겐 및/또는 에스트로겐으로의 전환을 맡고 있는 스테로이드 생성 효소를 암호화하는 조직 특정 유전자 구조의 대부분이 규명됨으로써 가능했다 (Labrie et al., 1992a; Labrie et al., 1992c; Labrie et al., 1995; Luu-The et al., 1995b; Labrie et al., 1996; Labrie et al., 1997d).
인간 성 스테로이드 생리학에서 DHEA 및 DHEA-S의 주된 중요성은 성인 남성의 전체 안드로겐의 대략 50%가 이들 부신 전구체 스테로이드로부터 유래되는 반면 (Labrie et al., 1985; Belanger et al., 1986; Labrie et al., 1993), 여성의 경우 말초 조직에서 에스트로겐의 인트라크라인 형성에 대한 우리의 최선의 추정값은 폐경 전에는 대략 75%, 폐경 후에는 100%에 가까운 것이라는 추정 (Labrie, 1991)으로부터 설명될 수 있다.
난소 에스트로겐의 역할에 대한 거의 독점적인 집중은 순환 DHEA가 이미 20-30세 및 40-50세의 연령 사이에서 70%로 극적으로 감소한다는 것으로부터 그 주의를 상실했다 (Migeon et al., 1957; Vermeulen and Verdonck, 1976; Vermeulen et al., 1982; Orentreich et al., 1984; Belanger et al., 1994; Labrie et al., 1997b). DHEA는 말초 조직에서 안드로겐과 에스트로겐 양쪽으로 변환되기 때문에, 그와 같은 혈청 DHEA와 DHEA-S의 감소는 상술한 바와 같이 폐경기 여성이 에스트로겐 결핍 뿐 아니라 안드로겐 부족을 겪는 이유를 설명해준다.
상술한 바와 같이, 최근의 데이터는 이 질병의 위험 증가를 나타내는 데이터 (Colditz et al., 1995)와 함께 프로게스틴이 유방암에 부정적인 영향을 갖는다는 점을 제시한다 (Clarke and Sutherland, 1990; Musgrove et al., 1991; Horwitz, 1992). 이 맥락에서, 인간 자궁내막 상의 DHEA 자극 효과의 부재는 자궁내막에 대한 에스트로겐의 잠재적 영향을 중화시키기 위한 프로게스틴 처방의 필요성을 제거한다는 점을 이해하는 것이 중요하다 (Labrie et al., 1997c).
유방에 대해, DHEA는 래트에서 디메틸벤즈(아)안트라센 (dimethylbenz(a)anthracene) 유선 종양의 발달을 방지 (Luo et　al., 1997)하고, 생장을 저해 (Li et al., 1993)하는 것으로 알려진다. 또한 DHEA는 누드 마우스에서 인간 유방암 이종 이식편의 생장을 저해한다 (실시예 1과 Couillard et al., 1998을 참조). 따라서, 자극 효과를 갖는 에스트로겐과 프로게스틴과 대조적으로, DHEA는 여성에게서 유방암의 발달 및 생장을 저해할 것으로 기대된다.
본 발명자들의 이전 연구에서 잘 드러난 바와 같이, 생리학적인 양의 외인성 DHEA의 보충은 특정한 스테로이드 생산성 효소를 함유하는 적절한 목표 조직에서 안드로겐과 에스트로겐만을 생합성하는 것을 허용한다. 따라서 합성된 활성 안드로겐과 에스트로겐은 원래의 세포에 남아 있고, 순환계로의 아주 작은 유출만이 발생한다. 사실, DHEA 투여의 가장 놀라운 효과는 DHT 대사 산물의 글루쿠로니드 유도체, 즉 ADT-G 및 3α-디올-G의 순환 수준에 대한 것으로, 이들 대사 산물은 적절한 스테로이드 생산성 효소를 함유하는 말초 인트라크라인 조직에서 국부적으로 생산되어 부신 전구체 DHEA 및 DHEA-S로부터 DHT를 합성하여 DHT를 비활성 컨쥬게이트로 대사시킨다 (Labrie, 1991; Labrie et al., 1996). 표적 조직에서의 국부적인 생합성과 안드로겐의 작용은 이들 조직들이 안드로겐에 노출될 필요를 제거하며, 따라서 불필요한 남성화의 위험과 다른 안드로겐 관련 부작용을 최소화한다. 전체 에스트로겐 분비의 신뢰할 수 있는 파라미터 (안드로겐에 대한 글루쿠로니드와 비교할 수 있는)가 아직 이용가능하지 않다고 생각되기는 하지만 동일한 것이 에스트로겐에도 적용된다.
골 생리학에서 안드로겐과 에스트로겐의 역할
골 생리학에 대한 안드로겐의 주도적 역할은 상세하게 기록되어 있다 (Labrie et al., 1997c; Martel et al., 1998). 사실 테스토스테론과 DHT는 모두 조골세포와 같은 골육종 세포에서 α(I) 프로콜라겐 mRNA의 전사를 증가시킨다 (Benz et al., 1991). DHT를 사용한 치료는 또한 고환 절제된 래트에서 연골성 뼈를 자극하는 것으로 나타난다 (Kapur and Reddi, 1989). 더욱이, 요추, 대퇴 전자부 및 신체 전체에서 측정된 골 미네랄 밀도는 폐경기 후 여성에게서 24개월간의 치료 기간 동안 E2 단독 보다 에스트로겐 + 테스토르테론 이식편에 의해 더욱 증가되었다 (Davis et al., 1995).
더욱이 확립된 골다공증에서, 동화 작용의 스테로이드는 뼈 손실 예방을 돕는 것으로 보고되고 있다 (Hennernan and Wallach, 1957). 마찬가지로, 폐경기 후 여성의 골다공증 예방에 있어서 경피적인 E2 및 테스토스테론 이식편은 경구 에스트로겐보다 더욱 효과적이라는 것이 발견되어 왔다 (Savvas et al., 1988). 연구에서 관측되는 차이는 에스트로겐 투여의 다른 경로에서 기인하지만, 그 차이의 원인은 테스토스테론의 작용 때문일 수도 있다. 증가된 뼈 형성의 지표로서, 혈청 오스테오칼신의 증가와 뼈 형성의 표지는 에스트로겐 단독 투여에 비해 메틸 테스토스테론과 에스트로겐을 투여받은 폐경기 후 여성에게서 발견되었다 (Raisz et al., 1996). 혈청 오스테오칼신에 대한 동일한 자극 효과는 12개월 간 DHEA 경피 치료를 받은 페경기 후 여성에게도 동일하게 관측되었다 (Labrie et al., 1997c). 더욱이, 난드롤론 데카노에이트와 함께 관측되는 바와 같이 안드로겐 요법은 폐경기 후 여성에게서 척추 미네랄 밀도를 증가시킨다는 것이 발견되었다 (Need et al., 1989). 폐경기 후 여성에게서의 독특한 작용으로 인해 안드로겐이 증가된 지지를 얻고 있기는 하지만, 테스토스테론의 사용에 의한 남성화 효과가 관측된다 (Burger et al., 1984; Studd et al., 1987).
DHEA와 복부 비만
복부 비만은 인슐린 내성, 2형 당뇨병 및 아테롬성 동맥 경화증의 위험 증가와 관련된다 (Shimokata et al., 1989; Cefalu et al., 1995; Ferrannini et al., 1997; Kopelman, 2000). 다른 원인들 중에서, 호르몬 변화, 특히 부신에 의한 DHEA와 DHEA-S의 분비 감소가 관련된 요인으로 생각된다 (Tchernof et al., 1996). 래트와 마우스 모델에서, DHEA 투여는 식이 유발 비만에서 내장 지방 축적을 감소시킨다 (Yen et al., 1977; Cleary and Zisk, 1986; Mohan et al., 1990; Hansen et al., 1997). DHEA의 긍정적 효과는 노화에 따라 일어나는 인슐린 내성의 감소에서도 관측되었다 (Han et al., 1998).
12개월 동안 DHEA 크림을 처치한 폐경 후 여성에 대해 수행된 연구에서, 인슐린 내성이 감소하고, 허벅지 수준에서 피하 지방 역시 감소한 것을 발견했다 (Diamond et al., 1996). 더욱이 65-78세 남성과 여성에게 6개월 간 50㎎의 DHEA를 매일 투여한 결과 복부 내장 지방이 여성은 10.2%, 남성은 7.4% 감소했다 (Villareal and Holloszy, 2004). 같은 연구에서, 복부 피하 지방은 남성과 여성에게서 모두 6% 감소했다. 더욱이 내당 시험에 대한 혈청 인슐린 응답성은 글루코스 응답에서의 변화없이 13% 감소했고, 따라서 DHEA 투여 후 인슐린 감수성 지수에서 34%의 개선이 일어났다. DHEA 작용에서의 개선은 고콜레스테롤증을 앓고 있는 중년 남성에게서도 관찰되었다 (Kawano et al., 2003).
동일한 그룹에 의해 수행된 이전의 연구에서, 6개월 간의 DHEA의 투여는 전체 체지방 체중 (total body fat mass)을 1.4㎏ 감소시킨 반면, 제지방 체중 (fat-free mass) 는 0.9㎏ 증가시켰다 (Villareal et al., 2000).
**성욕, 안면 홍조 및 삶의 질에 대한 안드로겐의 영향
공동체 기반의 연구는 8-50% 범위의 여성이 성 기능 장애로 자체 평가하였음을 시사한다. 사실, 낮은 성욕과 성 기능 장애는 난소 절제 후 (Nathorst-Boos and von Schoultz, 1992) 뿐 아니라 20대부터 여성의 노화와 함께 증가한다 (Laumann et al., 1999). 정신사회적 및 건강 요인들은 낮은 각성과 성적 욕구와 관련되는 반면 (Dennerstein et al., 1997), 낮은 안드로겐 수치도 독립적인 역할을 한다고 생각된다 (Bachmann et al., 2002; Miller et al., 2004).
안드로겐은 오르가즘의 강도와 용이함 뿐 아니라 여성의 각성 능력과 기쁨에도 역할을 하는 것으로 알려진다. 안드로겐은 또한 팽창 (swelling)의 신경혈관 평활근 응답과 증가된 윤활에도 관련된다 (Basson, 2004). 에스트로겐은 음문과 질의 충혈성 응답에도 영향을 미친다. 에스트로겐은 분위기에도 영향을 미치기 때문에, 성적 선호에도 영향을 갖는다 (Basson, 2004). DHEA가 질 내에서 안드로겐과 에스트로겐으로 모두 변환된다는 점이 기억되어야만 한다 (Sourla et al., 1998) (Berger et al., 2005).
또한 ERT 또는 HRT에 부가되는 안드로겐의 긍정적인 영향은 전반적인 웰빙, 에너지, 기분 및 전반적인 삶의 질로 표현된다 (Sherwin and Gelfand, 1985; Sherwin, 1988). 주된 심리적 및 심신 증상, 즉 과민함, 신경과민, 기억 및 불면증의 개선이 에스트로겐 대체 요법 (ERT)에 안드로겐의 부가에 따라 관측되어 왔다 (Notelovitz et al., 1991).
성욕 및/또는 성적 만족감의 상실은 초기 폐경기에서 흔한 일이다. 호르몬 대체 요법 (HRT)에 안드로겐을 부가하는 것은 이들 문제에 대해 긍정적인 영향을 갖는다고 알려져 왔다. Shifren et al., (2000)은 패치에 의해 투여된 트랜스더멀 테스토스테론이 외과적으로 폐경된 여성에게서 성적 빈도, 즐거움과 분위기를 향상시킨다는 것을 발견했다. 효과는 테스토스테론을 매일 300㎍ 복용함으로써 나타났으며, 그와 같은 복용량은 정상의 상한값까지의 혈청 테스토스테론 수준을 유발한다. 테스토스테론 처치는 감소된 성욕에 대해 불평하는 비-안드로겐 결핍 여성에 대해서도 연구되었다 (Goldstat et al., 2003). 테스토스테론에 의한 그와 같은 처치는 위약과 비교해서 삶의 질뿐 아니라 성욕과 성기능을 향상시켰다. 마찬가지로, 통상의 안드로겐 수준을 갖는 폐경기 여성의 경우에도, 에스트로겐에 대한 메틸 테스토스테론의 부가는 에스트로겐 단독의 경우와 비교해서 성적 욕구와 빈도를 증가시켰다 (Lobo et al., 2003). 성적 흥미, 욕구의 장애를 가진 여성 중에서, 안드로겐 요법은 비교 범위의 낮은 변위 치 내에서 유리 혈청 테스토스테론을 갖는 여성에 대해 제시되었다 (Bachmann et al., 2002). 사실, 성욕 감퇴 장애 (HSDD)를 치료하기 위해 테스토스테론의 사용이 증가되어 왔다 (Sherwin and Gelfand, 1987; Davis et al., 1995; Shifren et al., 2000; Goldstat et al., 2003). 이들 임의화된 임상 시험들은 테스토스테론이 HSDD를 갖는 여성에게 효과적이라는 것을 나타낸다.
DHEA의 안드로겐성 효과는 안면 홍조의 감소에도 또한 유용하다. 사실 생식선 기능 저하 남성과 (De　Fazio et al., 1984), 폐경 이행기의 여성의 경우에도 (Overlie et al., 2002) 안면 홍조 감소에 성공적이다. 더욱이 안드로겐의 부가는 에스트로겐 단독 요법에서 성공적인 결과를 얻지 못한 여성의 안면 홍조를 완화시키는데 유효한 것으로 밝혀졌다 (Sherwin and Gelfand, 1984). 안면 홍조는 여성들이 초기에 HRT 요법을 찾게 되는 주된 원인 중 하나이고, 에스트로겐은 이 증상을 완화시키는데 매우 효과적이다.
부신 기원의 안드로겐 결핍 유형의 분명한 사례는 부신 피질 기능 저하증의 경우에서 볼 수 있다. Arlt et al., 1999은 부신 피질 기능 저하증을 앓고 있는 여성 집단에서 4개월 동안 매일 50mg의 DHEA와 위약의 효과에 대해 연구했다. DHEA 치료는 낮은 통상의 범위에서 혈청 테스토스테론을 증가시켰다. 그와 같은 치료는 성적인 생각의 빈도, 흥미, 만족감을 증가시켰다. 웰빙, 우울증, 불안감도 역시 향상되었다. 매일 300mg의 높은 복용량의 DHEA 투여에서, 성적인 영상에 대해 더 큰 정신적 (p<0.016) 및 신체적 (p<0.030) 반응이 관측되었다. 매일 50mg의 DHEA를 투여받은 여성들에 대하여 수행된 연구에서 60-70세의 여성들뿐만 아니라 70세 이상의 여성들에게서도 향상된 성욕이 관찰되었다 (Baulieu, 1999). DHEA는 또한 안면 홍조에도 긍정적인 영향을 나타내었다 (Baulieu, 1999; Stomati et al., 2000). 최근 캐나다의 조사에서, 의사들의 70.8%가 삶의 질을 향상시키기 위해 에스트로겐에 안드로겐을 부가했다 (Gelfand, 2004).
DHEA의 다른 잠재적 유용성
노화 과정에서 부신에 의한 DHEA와 DHEA-S 형성의 70-95%의 감소는 말초 표적 조직에서 안드로겐와 에스트로겐 형성의 극적인 감소를 초래하며, 이것은 인슐린 내성 (Coleman et al., 1982; Schriock et al., 1988) 및 비만 (Nestler et al., 1988; MacEwen and Kurzman, 1991; Tchernof et al., 1995)과 같은 노화 관련 질병의 발병과 매우 관련성이 클 수 있다. 사실 DHEA와 DHEA-S의 낮은 순환 수준은 유방암 환자에게서 발견되며 (Zumoff et al., 1981), DHEA가 안드로겐 생성 활성을 갖는다는 것이 일련의 동물 모델에서 발견되었다 (Schwartz et al., 1986; Gordon et al., 1987; Li et al., 1993). DHEA는 생체 외에서 (Suzuki et al., 1991), 그리고 곰팡이의 생체 내에서, HIV를 포함하는 (Henderson et al., 1992) 바이러스 질병에 대해 (Suzuki et al., 1991) 면역 조절 효과를 갖는다고 밝혀져왔다. 한편, 면역 시스템에 대한 DHEA의 자극 효과는 폐경기 후 여성들에게서 설명되었다 (Casson et al., 1993).
여성에게서 DHEA로 얻은 이전 데이터
에스트로겐 대체 요법의 사용은 에스트로겐에 의해 유발되는 자궁내막 증식에 대응하기 위해 프로게스틴의 부가를 필요로 하지만, 에스트로겐과 프로게스틴은 모두 유방암의 위험을 증가시킬 수 있다 (Bardon et al., 1985; Colditz et al., 1995). 표준 에스트로겐 (ERT) 또는 호르몬 대체 요법 (HRT)의 한계를 피하기 위해, 60-70세 여성에 대해 12개월 동안 DHEA 투여에 대한 골 미네랄 밀도, 골 형성과 전환율의 파라미터, 혈청 지질, 당 및 인슐린, 지방 조직량, 근육량, 에너지, 웰빙과 질과 자궁내막 조직학에 대한 영향에 대해 연구했다 (Diamond et al., 1996; Labrie et al., 1997c). DHEA는 간을 통한 스테로이드 전구체의 제1 통로를 피하기 위해 피하 투여되었다. 본 발명자들은 따라서 60-70세 여성들에게 12개월 동안 하루에 한 번 10% DHEA 크림 도포에 의한 만성적 대체 요법의 효과를 평가했다. 인체 측정 결과는 체중에는 변화가 없지만 12개월에서 피하 지방 두께가 9.8% 감소했음을 나타낸다 (p<0.05) (Diamond et al., 1996). 골 질량 밀도는 엉덩이에서 2.3%, 엉덩이 워드 삼각 (Ward's triangle)에서 3.75%, 요추 레벨에서 2.2% 증가했다 (모두 p<0.05). 골 미네랄 밀도에서의 이들 변화는 12개월에서 비뇨기 하이드록시프롤린 38%, 혈장에서 골 알칼리성 포스파타제 22% (모두 p<0.05)의 상당한 감소를 동반했다. 혈장 오스테오칼신에서 대조군에 대한 135% 증가 (p<0.05)가 부수적으로 관측되었으며, 따라서 골 형성에 대한 DHEA의 자극 효과를 시사한다.
컴퓨터 단층 촬영에 의한 허벅지 중간 부분의 지방과 근육 면적의 측정은 12개월에서 대퇴부 지방의 3.8% 감소 (p<0.05)와 대퇴부 근육 면적의 3.5% 증가 (p<0.05)를 보여준다 (Diamond et al., 1996). 복부 지방 측정에서 유의한 변화는 없었다. 체지방과 근육 표면적에서의 이들 변화는 공복 혈당의 12% 감소 (p<0.05)와 공복 혈장 인슐린 수준의 17% 감소(p<0.05)와 관련이 있다. DHEA에 의한 치료는 지질 또는 지단백질 프로파일에 바람직하지 않은 효과를 미치지 않는다. 사실 전체 콜레스테롤과 그 지단백질 분획에서 3-10%의 감소를 나타내는 전체적인 경향이 있었다. 혈장 트리글리세라이드는 영향을 받지 않았다.
피지 분비의 지표는 12개월의 DHEA 요법 후에 79% 증가된 후 처치 중단 후 3개월 경과 후 치료 전의 값으로 복귀하였다. DHEA 투여는 치료 시작 시에 성숙값이 0이었던 여성 10명 중 8의 경우 질 상피 성숙을 자극하였으며, 치료 전에 중간 정도의 질 성숙을 가진 여성 3명에게서 자극이 나타났다. 가장 중요하게는, 질에서 관측되는 에스트로겐성 자극 효과는 12개월의 DHEA 치료 후 모든 여성에게서 완전히 위축된 것으로 남아 있는 자궁내막에서는 발견되지 않았다 (Labrie et al., 1997c).
현재의 데이터는 특정 인트라크라인 표적 조직에서 심각한 부작용 없이 안드로겐 및/또는 에스트로겐으로의 변환을 통해 폐경기 후 여성에게서 DHEA 요법의 긍정적인 효과를 분명하게 나타낸다. DHEA에 의한 자궁내막 자극 효과의 부재는 프로게스틴 대체 요법의 필요성을 제거하며, 따라서 프로게스틴 유발성 유방암의 두려움을 피할 수 있다. 골 미네랄 밀도와 혈청 오스테오칼신 증가, 골 형성 표지에 대한 DHEA의 관측된 자극 효과는 골다공증 예방과 치료에 대한 특히 관심을 끌고, 골 생리학, 즉 골형성에 대한 DHEA의 독특한 활성을 나타내는 반면 ERT와 HRT는 골 손실 속도를 감소시킬 수 있을 뿐이다.
안드로겐의 역할이 우울증, 기억 상실, 인식 상실과 두뇌 세포 활성에 대해 제안되고 있었다 (Almeida et al., 2008, Azad et al., 2003 and Hajszan et al., 2008). 역시 DHEA로부터 두뇌에서 합성될 수 있는 에스트로겐은 알츠하이머병, 기억 상실과 인식 상실에서 유용한 역할을 갖는 것으로 나타났다 (Rocca et al., 2007). 세 가지 메타 분석은 폐경 이후 에스트로겐을 사용한 여성에게서 알츠하이머 병의 위험이 20-40% 감소한 것을 나타냈다 (Yaffe et al., 1998, Leblanc et al., 2001, Hogovorst et al., 2000). 에스트로겐은 두뇌에서 베타-아밀로이드 침착을 감소시키는 반면, 프로게스테론은 반대 효과를 갖는다 (Xu et al., 1998, Huang et al., 2004).
에스트로겐 부족과 인식 손상 또는 치매 사이의 연관은 실험 데이터에 의해 지지된다. 이들 중 에스트로겐은 난소 절제된 래트의 해마에서 수상 돌기 상의 시냅스 형성을 향상시킨다 (Mc Ewen and Alves, 1999, Monk and Brodatz, 2000). 더욱이 에스트로겐은 뇌혈류 속도와 당 대사를 향상시켜 항산화제로서 작용할 수 있다 (Mc Ewen and Alves, 1999; Monk and Brodatz, 2000; Gibbs and Aggamal, 1998). 에스트로겐은 또한 세포 내 칼슘 상승을 유발하고 미토콘드리아 손상을 초래하는 B-아밀로이드 1-42를 방지하는 것으로 알려졌다 (Chen et al., 2006, Morrison et al., 2006).
임상 연구로부터 뇌세포 보호 작용 (Rocca et al., 2007), 심혈관계 질환 (Manson et al., 2006) 및 전체 사망률 (Rocca et al., 2006)에 대한 에스트로겐의 유익한 효과에 대한 임계적 연령 창 (critical age window)이 있다는 것에 대한 분명한 증거가 있다. 가장 유익한 효과는 E2 치료가 일찍 시작될 경우, 치료가 폐경 이후 늦게 시작될 때의 부정적인 효과 없이 관찰될 수 있다 (WHI 연구). 에스트로겐은 두뇌에서 베타-아밀로이드 침착을 감소시키는 반면 프로게스테론은 반대 효과를 갖는다 (Xu et al., 1998, Huan et al., 2004).
DHEA의 유용성: 에스트로겐성 및 안드로겐성 효과의 조합
안드로겐이 ZR-75-1의 생장에 대해 직접적인 항증식성 활성을 나타낸다는 것이 관측되고 있다. 안드로겐은 또한 래트에서 DMBA-유발된 유선 암종의 생장을 저해하는 것으로 나타나고, 이 저해는 순수한 항안드로겐 플루타미드의 동시 처방에 의해 역전된다 (Dauvois et al., 1989). 종합해보면, 이들 데이터는 생체 외에서 인간 유방암 세포 상에서 DHEA의 저해 작용에 대한 안드로겐 수용체의 관련성과, 그와 같은 안드로겐의 저해 효과가 항에스트로겐의 효과에 부가적인 것임을 의미한다 (Poulin and Labrie, 1986; Poulin et al., 1988). 동일한 저해 효과는 누드 마우스에서 ZR-75-1 이종 이식편에 대해 생체 내에서도 관측되고 있다 (Dauvois et al., 1991).
본 발명자들은 DHEA가 암컷 래트 (Luo et al., 1997)와, 폐경기 후의 여성 (Labrie et al., 1997c) 모두에게서 뼈에 유용한 효과를 발휘한다는 것을 확인했다. 따라서 사실 DHEA로 치료된 암컷 래트는 전체 골격, 요추 및 대퇴골의 골 미네랄 밀도 (BMD)가 증가했다 (Luo et al., 1997).
본 발명은 여성에 있어서 성 스테로이드 생리학에 대한 이해 및 폐경기 여성은 난소에 의한 에트로겐 분비 중단에 의한 에스트로겐 결핍 뿐 아니라, 이미 수년 동안 안드로겐에 대한 감소를 겪어왔다는 인식에서 성취된 최근의 발전에 기반한 것이다. 사실, 정상적인 여성은 남성에게서 분비되는 안드로겐의 2/3에 해당하는 양의 안드로겐을 생산한다 (Labrie et al., 1997a). 여성에게서 안드로겐 풀은, DHEA와 DHEA-S의 혈청 농도 감소와 병행해서 30살부터 점진적으로 감소된다 (Labrie et al., 1997b). 따라서, 폐경 전후 및 폐경 후에 안드로겐과 에스트로겐 대체 요법을 모두 사용해서 각각의 세포와 조직에서 이들 두 종류의 성 스테로이드 간의 생리적 균형을 유지하는 것이 타당하다고 보이며, 이 목표는 스테로이드 전구체 DHEA로부터 말초 조직에서 안드로겐과 에스트로겐의 국부 형성에 의해서만 달성될 수 있다. 아콜비펜과 같은 SERM의 부가는 유방암으로부터의 보호에 대한 긍정적인 효과 뿐 아니라 SERM 투여의 다른 유익함도 증가시킨다. 도 8에서, 전형적인 ERT의 긍정적 및 부정적 효과에 의한 비교가 이루어진다.
이전의 데이터는 특정 인트라크라인 표적 조직에서 심각한 부작용 없이 안드로겐 및/또는 에스트로겐으로의 변환을 통해 폐경기 후 여성에게서 DHEA 요법의 긍정적인 효과를 나타낸다. 사실, 래트로부터 얻어진 데이터는 DHEA가 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM) 단독 사용으로 얻을 수 없는 유용한 효과를 제공할 수 있다는 것을 분명하게 나타낸다.
아콜비펜의 유용한 효과
도 7에서 누드 마우스에서 인간 유방암 ZR-75-1 이종 이식편의 생장에 대해 그 순수한 항에스트로겐성 활성이 어떤 자극 효과도 갖지 않음에 따라, 종양 생장에 대한 타목시펜의 100% 자극 효과가 EM-652. HCl에 의한 동시 처치에 의해 완전하게 차단되는 것을 볼 수 있다.
본 발명자들은 스테로이드성 항에스트로겐 플루베스트란트 (Faslodex, ICI　182,780)를 시험했고, 그것이 SERM으로서 기능하지 않으며, 항에스트로겐 플루베스트란트는 본 발명에서 유방암 예방을 위해 DHEA와 복합하여 사용될 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 의하면 SERM은 그들을 SERM 대신 항에스트로겐으로 사용하는 경우에도 종래 기술에서 알려진 것과 동일한 복용량으로 투여될 수 있다.
본 발명자들은 또한 혈청 콜레스테롤에 대한 SERM의 유용한 효과와 뼈에 대한 에스트로겐성 또는 에스트로겐 유사한 유용한 효과의 상관 관계에 대해서도 주목했다. SERM은 또한 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병 및 비만 (특히 복부 비만)에 대해서도 유용한 효과를 갖는다. 이론에 구애될 의도없이, 다수가 바람직하게 1개 내지 2개의 탄소 원자에 의해 연결된 2개의 방향족 고리를 갖는 SERM은 수용체에 의해 가장 잘 인식되는 분자 중 상기 부분의 역할에 의해 에스트로겐 수용체와 반응하는 것으로 예상된다. 바람직한 SERM은 다른 조직에서 현저한 길항체적 성질을 갖지 않으면서 유방과 통상의 자궁 조직에서 길항체적 특성을 선택적으로 가져올 수 있는 측쇄를 갖는다. 따라서 SERM은 유방에서 항에스트로겐으로서 바람직하게 기능하는 반면 놀랍게도 뼈와 혈액 (지질과 콜레스테롤 농도에 유리하게 영향을 미친다)에서는 에스트로겐으로서 (또는 에스트로겐 유사 활성을 제공하거나) 놀랍고도 바람직한 기능을 한다. 콜레스테롤과 지질에 대한 유리한 영향은 역으로 부적절한 콜레스테롤과 지질 수준에 의해 영향을 받는 것으로 알려진 아테롬성 동맥 경화증에 대해 유리한 영향으로 해석된다.
도 9에서 나타낸 바와 같이, 17β-에스트라디올의 순환 수준은 비처치 동물들에서 95.9 ± 32.4 pg/ml에서 143.5 ± 7.8 pg/ml로 상승되지만 (12주 동안 매일 경구적으로 0.5 mg/kg의 EM-800으로 치료된 동물에서 50% 증가), 유선의 뚜렷한 위축이 관측되었다. 마찬가지로, 도 10에서 자궁내막의 뚜렷한 위축이 EM-800 (0.5 mg/kg)을 투여받은 동물에게서 관측되었다. 순수한 항에스트로겐 EM-800을 투여받은 이들 비처치 동물들의 경우, 시상하부 뇌하수체 수준에서 에스트로겐의 저해 효과는 제거되었으며, 따라서 증가된 LH가 나타나고, 이것은 난소에 의한 17β-에스트라디올 분비의 2차적 증가를 초래하였다.
안면 홍조, 심혈관계 증상, 알츠하이머병, 인식 기능 상실 및 불면증은 분명히 중추신경계에 위치하는 에스트로겐 수용체과 관련된다. 아마도, 두뇌에서 에스트로겐의 낮은 수준은 부분적으로는 이들 질병을 설명할 수 있을 것이다. 외인성 에스트로겐과 특히 성 스테로이드 전구체의 투여에 의해 형성되는 것들 (즉, 에스트라디올)은 두뇌 장벽을 통과하여 에스트로겐 수용체와 결합하여 정상적인 에스트로겐성 작용을 회복할 수 있다. 반면, 본 발명의 SERM들과 특히 아콜비펜 족의 SERM은 실시예 8에 제시된 바와 같이 두뇌 장벽을 통과할 수 없다. 따라서 그들은 두뇌에서 에스트로겐의 긍정적 효과를 저해하지 않지만 유방, 자궁 및 자궁내막 조직에서 에스트로겐의 부정적 효과를 저해하여 이 조합 (SERM + 성 스테로이드 전구체)이 상술한 질병을 치료하거나 질병에 걸릴 위험을 감소시키는데 특히 유용하게 한다.
이전에 언급한 바와 같이, 안드로겐의 역할 역시 이들 모든 증상에 대해 제시되어 왔다. 사실, DHEA는 생리적 필요에 따라 두뇌에서 에스트로게과 안드로겐을 모두 제공할 수 있다.
성 스테로이드 전구체와 SERM 또는 항에스트로겐 조합의 전체적인 부가 효과
폐경기에 여성들이 의사와 상담하는 주된 이유는 안면 홍조의 발생이고, 이 문제는 에스트로겐 대체 요법에 의해 해결될 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 안면 홍조의 원인이 되는 위치는 중추 신경계 (CNS)이고, EM-652는 CNS에 대한 접근성이 매우 낮기 때문에 (데이터 첨부), 성 스테로이드 전구체 투여가 중추 신경계에서 에스트로겐 농도를 증가시키고 따라서 SERM과의 간섭 없이 안면 홍조를 제어할 것으로 기대된다. 한편, SERM은 다른 측면에서, 특히 유방과 자궁암의 위험에 대한 에스트로겐의 부정적 영향을 모두 제거할 것이다. 사실 성 스테로이드 전구체에 대한 EM-652의 부가는 유선 및 자궁에 대해 형성된 에스트로겐의 자극 효과를 차단하고, EM-652는 다른 조직에서 그 자신의 유용한 효과를 발휘하여, 예를 들면 뼈에 대해, 뼈 미네랄 밀도에 대한 난소 절제의 효과를 부분적으로 역전시킬 것이다.
본 발명자들의 데이터는, DHEA가 안면 홍조, 혈관 운동성 증상 및 도한증을 감소시킬 수 있음을 나타내기 때문에 E2의 제거에 의해 유방암의 위험을 감소시켰다. 그러나 DHEA는 에스트로겐으로 약간 변형될 수 있고, 따라서 SERM이 필요하다.
EM-652의 어떤 악영향도 어떤 파라미터에 대해서도 나타나지 않은 반면, 유방암과 자궁암 예방과 치료에 대해서는 뚜렷한 유용한 효과를 발휘할 것이다.
여기서 논의되는 바람직한 SERM 또는 항에스트로겐은: (1) 발명에 대해 민감한 것으로 언급된 모든 질병; (2) 치료와 예방 용도 모두에; 그리고 (3) 바람직한 약학 조성물과 키트에 관련된다.
치료 또는 주어진 질병에 걸릴 위험의 감소를 필요로 하는 환자는 그와 같은 질병으로 진단받거나 또는 그와 같은 질병을 얻기 쉬운 사람이다.
달리 언급되지 않는다면, 본 발명의 유효 화합물의 바람직한 복용량 (농도 및 투여 방법)은 치료 및 예방 목적 모두에 대해 동일하다. 여기서 논의되는 각 유효 성분의 복용량은 치료될 (또는 그 병에 걸릴 위험이 감소될) 질병과 무관하게 동일하다.
다르게 언급되거나 맥락으로부터 명백한 경우가 아니라면, 여기서 복용량은, 비록 부가 성분이 실시예에 제시된 바와 같이 바람직하게 포함되는 것이라고 해도, 약학적 첨가제, 희석제, 캐리어 또는 다른 성분에 의해 영향받지 않는 유효 화합물의 중량을 의미한다. 제약 산업에서 통상 사용되는 모든 복용 형태 (캡슐, 알약, 정제, 주사 등)가 여기서 적절하게 사용되며, "첨가제", "희석제" 또는 "캐리어"라는 용어는 업계에서 그와 같은 복용 형태에서 유효 성분과 함께 전형적으로 포함시키는 비유효 성분을 의미한다. 예를 들면, 전형적인 캡슐, 알약, 장용성 코팅, 고체 또는 액체 희석제 또는 첨가제, 향미제 등이 포함될 수 있다.
여기서 논의된 모든 요법에서 사용된 모든 유효성분들은 하나 이상의 다른 유효 성분을 포함할 수 있는 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 또는 그들은 각각 개별적으로, 그렇지만 시간 상 충분히 동시적으로 투여되어 환자가 결국 상승된 혈액 수준을 갖거나 그렇지 않으면 각 유효 성분 (또는 전략들)의 유용성을 동시에 누릴 수 있다. 본 발명의 몇몇 바람직한 실시의 형태에서, 예를 들면 하나 이상의 유효 성분들은 단일한 약학 조성물로 제제화된다. 본 발명의 다른 실시의 형태에서는 적어도 두 개의 별도의 용기를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 적어도 하나의 용기의 내용물은 전체적으로 또는 부분적으로 다른 적어도 하나의 용기의 내용물과 그 안에 담긴 유효 성분에 있어서 상이하다.
여기서 논의된 복합 치료는 논의 중인 질병의 치료 (또는 위험 감소)를 위한 의약의 제조에서 하나의 유효 성분 (또는 복합)의 사용을 또한 포함하며, 여기서 치료 또는 예방은 본 발명에 의한 복합의 다른 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면 하나의 실시의 형태에서, 본 발명은 생체 내에서 본 복합 치료가 유효하다고 생각되는 어떤 질병 (즉, 안면 홍조, 땀흘림, 불규칙한 생리 및 폐경과 관련된 모든 증상들)의 치료를 위해 사용하기 위한 의약의 제조에서 SERM을 성 스테로이드 전구체와 복합하여 사용하는 것을 제공한다.
에스트로겐은 유방 상피 세포의 증식을 자극하는 것으로 잘 알려져 있으며, 세포 증식 자체는 신생 조직 형성을 초래하는 불규칙한 유전적 오류를 축적함으로써 암의 위험을 증가시키는 것으로 생각된다 (Preston Martin et al., 1990). 이 개념에 기초하여, 항에스트로겐이 에스트로겐에 의해 자극된 세포 분할 속도를 감소시킬 목적으로 유방암을 예방하기 위해 도입되어 왔다.
본 발명자들은 또한 두 가지 약을 복합 처방함으로써 누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 유방암 이종 이식편의 생장에 대한 신규한 항에스트로겐 (EM-800)의 저해 효과와 성 스테로이드 전구체 (DHEA) 효과의 잠재적 상호작용에 대해 연구했다. 도 3과 도 4는 DHEA 자체가 사용된 복용량에서 종양 생장의 50-80% 저해를 초래함을 보여주며, 또한 항에스트로겐의 낮은 복용량으로 얻어진 종양 생장의 거의 완전한 저해는 DHEA에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
뼈 미네랄 밀도 (BMD) 측정의 한계는 잘 알려져 있다. 예를 들면 스테로이드성 항에스트로겐 ICI　182780으로 처치된 래트에서의 BMD 측정은 변화를 보이지 않는 반면 (Wakeling, 1993), 조직형태 계측학에서는 저해 변화를 볼 수 있었다 (Gallagher et al., 1993). 같은 차이가 타목시펜에 대해서도 보고되었다 (Jordan et al., 1987; Sibonga et al., 1996).
감소된 뼈 미네랄 밀도는 단지 감소된 뼈 강도와 관련된 이상만은 아니라는 점이 지적되어야만 한다. 따라서 그 작용에 대해 보다 잘 이해하기 위해서는 다양한 화합물과 처치에 의해 유발된 골 대사의 생화학적 파라미터의 변화를 분석하는 것이 중요하다.
DHEA와 EM-800의 조합이 뼈 대사의 중요한 생화학적 파라미터에 대해 기대하지 않았던 유용성을 발휘하고 있음을 지적하는 것이 특히 중요하다. 사실 DHEA는 단독으로는 뼈 흡수의 지표인 비뇨기 하이드로프롤린/크레아티닌 비율에 영향을 미치지 못한다. 더욱이 일일 비뇨기 칼슘 또는 인 분비에 대한 DHEA의 어떤 영향도 검출할 수 없었다 (Luo et al., 1997). EM-800은 비뇨기 하이드로프롤린/크레아티닌 비율을 48% 감소시키지만, 반면 DHEA와 마찬가지로 EM-800도 비뇨기 칼슘 또는 인 분비에는 영향을 보이지 않았다. 더욱이 EM-800은 뼈 형성의 표지인 혈청 알칼리성 포스파타제 활성에도 영향을 미치지 못한 반면, DHEA는 이 파라미터의 값을 약 75% 증가시켰다 (Luo et al., 1997).
DHEA와 EM-800의 조합의 기대하지 못했던 효과들 중 하나는 뼈 흡수 지표인 비뇨기 하이드록시프롤린/크레아티닌 비율과 관련된 것으로, DHEA와 EM-800이 조합되었을 때 69%까지 감소되었으며, 이 값은 EM-800단독으로 얻을 수 있는 저해 효과 48%와도 통계적으로 다르며 (p<0.01), DHEA 단독으로는 어떤 효과도 보이지 못했다. 따라서 EM-800에 대한 DHEA의 부가는 뼈 재흡수에 대한 EM-800의 저해 효과를 50%까지 증가시킨다. 가장 중요하게는, EM-800에 대한 DHEA의 부가의 기대하지 않았던 다른 효과는 비뇨기 칼슘의 약 84%의 감소 (23.17±1.55에서 3.71±0.75 μmol/24h/100g (p<0.01)와, 비뇨기 인의 55% 감소 (132.72±6.08에서 59.06±4.76 μmol/24h/100g (p<0.01) (Luo et al., 1997).
중요하게는 12개월간 처치된 난소 절제 래트에서 EM-800과 DHEA의 조합은 뼈 형태에 유용한 영향을 갖는다. 소주골 (trabecular bone) 부피는 뼈 강도에 있어서 특히 중요하며, 골절을 예방한다. 따라서 상술한 연구에서, DHEA만으로 처치된 난소 절제 래트에서 요추의 소주골 부피는 4.1±0.7%로부터 11.9±0.6% (p<0.01) 증가했으며, DHEA에 EM-800이 부가된 경우는 소주골 부피가 C.7±1.4% 증가했으며, 이는 비처치 대조군에서 발견되는 것과 같은 값이다 (도 15).
난소 절제 래트에서 mm당 0.57±0.08 의 값으로부터, DHEA 처치는 난소 절제된 대조군에 비교해서 소주골 수에서 137%의 증가를 초래했다. DHEA의 자극 효과는 따라서 mm당 1.27±0.1에 이르며, EM-800과 DHEA의 동시 처치는 DHEA 단독의 경우에 얻어진 것과 비교해서 소주골 수에서 28% (p<0.01)의 부가적인 증가를 초래하였다 (도 16). 마찬가지로, DHEA 처치에 대한 EM-800의 부가는 소주골 분리에서 DHEA 단독의 경우에 얻어진 것과 비교해서 부가적인 15%의 감소를 초래하였고 (p<0.05), 따라서 비처치 대조군에서 보여진 것과 다르지 않은 값에 이르게 되었다.
도 15, 16에서 제시된 수치 데이터를 보충하여, 도 17은 난소 절제된 대조군 (B)와 비교해서, 난소절제된 동물 (C)에서 DHEA에 의해 유도된 경골 근위부 골간단부에서의 소주골 부피의 증가와, DHEA 처치에 플루타미드 부가 (D) 후의 DHEA의 자극 효과의 부분적 저해를 나타낸다. 한편, EM-800과 DHEA의 복합 투여하는 난소 절제 유발된 골감소증 (E)과 비처치 대조군 (A)에서 보여지는 것과 비교할 수 있는 소주골 부피의 완전한 예방을 가져온다.
Figure pat00006
Figure pat00007
골조직 형태 계측학에 대한 DHEA의 자극 효과의 안드로겐 성분의 중요성은 또한 골 형성 및 재흡수의 표지자에 대한 DHEA의 영향에 의해 지지된다. 혈청 알칼리성 포스파타제의 농도, 골 형성 표지자 (Meunier et al., 1987, Lauffenburger et al., 1977)는 OVX 대조군에서 51±4IU/L로부터 DHEA 처치된 동물에서 201±25IU/L까지 증가되며, 이는 뼈 형성에 대한 DHEA의 자극 효과를 제시한다 (표 2). FLU는 이 파라미터에 대한 DHEA의 효과를 65%로 역전시키고, EM-800는 유의한 효과를 갖지 않는다. 한편, 콜라겐 분해 동안 방출된 하이드록시프롤린은 콜라겐 합성에서 재이용되지 않기 때문에, 그것은 콜라겐 대사 또는 용골세포 골 재흡수의 유용한 표지자이다. 최근의 연구에서, 소변의 하이드록시프롤린/크레아티닌 비율은 OVX 대조군의 11.7±1.2　μmol/mmol로부터 DHEA 처치된 래트의 7.3±1.0　μmol/mmol로 감소되었다 (표 2). FLU의 투여는 이 파라미터에 대한 DHEA의 저해 효과를 완전히 방지하며, EM-800은 DHEA의 효과에 대해 통계적으로 의미있는 영향을 갖지 않는다.
더욱이, 혈청 콜레스테롤은 DHEA 치료에 의해 2.29±0.16에서 17.8±0.16mmol/l (p<0.05)로 22% 감소하였고, 순수한 항안드로겐 FLU의 동반 처치에 의해 이 효과는 중화되었다. 한편, 순수한 항에스트로겐 EM-800의 부가는 전체 혈청 콜레스테롤 농도를 0.63±0.09mmol/l (p<0.01) 더 감소시켰고, 따라서 65%의 저해 효과에 이르렀다. 사용된 어떤 처치도 혈청 트리글리세라이드 수준에 통계적으로 의미있는 변화를 나타내는 것으로 관측되지 않았다 (표 2)
또한, 혈청 콜레스테롤에 대한 EM-800의 잠재적 저해 효과가 DHEA의 동시 처치에 의해 방지되지 않았다는 점도 흥미롭게 주목된다 (Luo et al., 1997).
폐경기 여성에게서 관측되는 골 손실은 골 형성의 2차 증가에 의해 완전히 보상되지 못한 골 재흡수율의 증가와 관련된 것으로 생각된다. 사실, 골 형성과 골 재흡수 파라미터는 골다공증에서 모두 증가되고, 골 재흡수와 골 형성 모두가 에스트로겐 대체 요법에 의해 저해된다. 따라서 골 형성에 대한 에스트로겐 대체의 저해 효과는 골 재흡수에서 에스트로겐 유발된 1차 감소가 골 형성에서의 감소를 수반하는 방식으로 골 재흡수와 골 형성 간에 결합된 매카니즘으로부터 초래되는 것으로 생각된다 (Parfitt, 1984).
해면골 (cancellous bone) 강도 및 그에 이은 골절 저항은 해면골 총량 뿐 아니라 숫자, 크기와 소주골의 분포에 의해 결정되는 골소주 미세구조에도 의존한다. 폐경 후 여성에서의 난소 기능의 손실은 전체 소주골 부피의 상당한 감소를 동반하는 것이고 (Melsen et al., 1978; Vakamatsou et al., 1985), 주로 소주골 넓이에서의 수의 감소와, 감소된 정도와 관련된다 (Weinstein and Hutson, 1987).
여기에서 논의된 징후를 위한 본 발명의 복합 요법의 측면을 촉진시키기 위해, 본 발명은 동시 투여를 위한 단일 조성물에서 SERM과 성 스테로이드 전구체를 포함하는 약학적 조성물을 고려한다. 조성물은 경구 투여, 피하 주사, 근육 주사 또는 경피 주사를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 종래의 방법으로의 투여에 적합하다. 다른 실시의 형태에서, 키트가 제공되며, 상기 키트는 분리되거나 또는 하나의 용기 내에 하나 이상의 SERM과 성 스테로이드 전구체를 포함한다. 상기 키트는 또한 경구 투여용 물질, 예를 들면 정제, 캡슐, 시럽 등 및 트랜스더멀 투여용 물질, 예를 들면 연고, 로션, 젤, 크림, 서방성 패치 등을 포함할 수 있다.
본 출원인은 SERM 또는 항에스트로겐 및 성 스테로이드 전구체의 투여가 안면 홍조 및 땀흘림의 발생의 치료 및/또는 감소에 유용하다고 생각한다. 본 발명의 유효 성분 (SERM, 항에스트로겐 또는 전구체)는 제제화될 수 있고, 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 함께 투여될 때 유효 성분은 동시에 또는 분리되어 투여될 수 있다.
경피 또는 경점막용 유효 성분은 바람직하게는 0.01-1%의 DHEA 또는 5-디올이다. 또는 유효 성분은 질내 링 또는 예컨대 유럽 특허 No.0279982에 개시된 것과 같은 구조의 종래 공지된 구조를 갖는 경피 패치 또는 질내 크림, 젤, 오뷸 또는 좌약으로 대체될 수 있다.
연고, 로션, 젤, 크림, 오뷸 (ovule) 또는 좌약 등으로 제제화될 때, 유효 성분은 인간 피부 또는 점막과 잘 맞고, 피부 또는 점막을 통해 화합물의 경피 또는 경점막 침투를 형상시키는 적절한 캐리어와 혼합된다. 적절한 캐리어는 업계에 알려진 것이고, 비제한적으로 클루셀 HF와 글락살 기제(Glaxal base)를 포함한다. 이들 중 일부는 상업적으로 이용가능하며, 예를 들면 글락살 기제는 글락살 캐나다 리미티트 컴퍼니로부터 이용가능하다. 다른 적절한 비히클들은 Koller 및 Buri에 의한 S.T.P. Pharma 3(2), 115-124, 1987에서 찾아볼 수 있다. 캐리어는 사용되는 유효 성분의 농도와 상온에서 유효 성분이 용해가능한 것이 바람직하다. 캐리어는 피부 또는 점막의 국부 영역을 통해, 그리고 바람직한 임상 효과를 일으킬 수 있는 혈류를 통한 전구체의 실질적 침투를 허용하기에 충분한 시간 동안 흐르거나 증발하지 않고 조성물이 부가될 피부 또는 점막의 국부 영역에서 저해제를 유지할 수 있는 충분한 점성을 가져야만 한다. 캐리어는 전형적으로 몇 가지 성분, 예를 들면 약학적으로 수용가능한 용매 및 증점제의 혼합물이다. 유기 및 무기 용매의 혼합물은 친수성 및 친유성 용해성, 예를 들면 물 및 에탄올과 같은 알콜에 대한 용해를 보조할 수 있다.
오뷸 또는 질 좌약 등으로 제제화될 때, 유효성분은 인간 질 점막과 잘 맞는 적절한 캐리어와 혼합된다. 바람직한 캐리어는 경화 지방 (포화 지방산의 글리세리드의 혼합물), 특히 위텝솔, 특정하게는 위텝솔 H-15 기제 (캐나다, 몬트리알, 매디스카사에서 입수 가능)이다. 패티베이스, 웨코비, 코코아 버터, 테오브로마유 또는 위텝솔 기제와의 다른 조합 등의 다른 친유성 기제가 사용될 수 있다.
바람직한 성 스테로이드 전구체는 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA) (예를 들면 멕시코 베라크루즈, 오리자바, 프로퀴나로부터 이용가능)
캐리어는 또한 연고, 로션 및 좌약과 화장품 및 의료 기술에서 잘 알려진 통상 사용되는 다양한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들면 향료, 산화방지제, 향수, 겔화제, 카르복시메틸셀룰로오스 등의 증점제, 계면활성제, 안정화제, 에몰리언트, 착색제 및 다른 유사한 제제들이 존재할 수 있다.
본 발명에 의한 치료는 무기한의 지속 (indefinite continuation)에 적합하다. SERM 또는 항에스트로겐성 화합물 및 성 스테로이드 전구체는 경구 경로를 통해 투여될 수 있으며, 또한 종래의 약학적 부형제, 예를 들면 스프레이 건조 락토즈, 미세결정 셀룰로오스 및 경구 투여를 위한 정제 또는 캡슐 형태의 마그네슘 스테아레이트와 같이 제제화될 수 있다.
유효 성분은 소디움 시트레이트, 칼슘 카보네이트 또는 디칼슘 포스페이트 등의 고형, 분체 캐리어 물질과 폴리비닐 피롤리돈, 젤라틴 또는 셀루로오즈 유도체 등의 바인더와 함께 혼합됨으로써, 가능하게는 또한 마그네슘 스테아레이트, 소디움 라우릴 설페이트, "카르보왁스" 또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 윤활제를 부가함으로써 정제 또는 드라제 코어 (dragee core)로 만들어질 수 있다. 물론, 경구 투여 형태의 경우에 향미 증진제가 추가될 수 있다.
또 다른 형태로서, 예를 들면 경질 젤라틴 뿐 아니라, 글리세린과 같은 유연제 또는 가소제를 포함하는 마감된 연질-젤라틴의 플러그 캡슐을 사용할 수 있다. 플러그 캡슐은 바람직하게는 락토즈, 사카로즈, 만니톨, 감자 전분과 같은 전분 또는 아밀로펙틴, 셀롤로오스 유도체 또는 고분산 살리실산과 같은 충전제와의 혼합물로서 분말화된 형태로 유효 성분을 함유한다. 연질 젤라틴 캡슐에서, 유효 성분은 바람직하게는 식물성 기름 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해 또는 부유되어 있다.
로션, 연고, 젤 또는 크림은 과량이 그대로 보이지 않도록 피부에 잘 문질러야 하며, 바람직하게는 적어도 4시간, 더욱 바람직하게는 적어도 6시간 동안 대부분의 경피 침투가 일어날 때까지 그 영역의 피부를 씻어내서는 안 된다.
경피 패치는 공지의 기술에 따라 전구체를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 1일 내지 4일보다 긴 기간 동안 적용되지만, 전형적으로 더 작은 표면적에 대한 유효 성분의 접촉은 유효 성분의 느리고 일정한 공급을 가능하게 한다.
개발되고 사용 중인 다수의 경피 전달 시스템은 본 발명의 유효 성분의 전달에 적합하다. 방출 속도는 전형적으로 매트릭스 확산 또는 유효 성분의 제어된 막을 통한 통과에 의해 제어된다.
경피 장치의 기계적 측면은 이 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면 여기에 참고로 병합되는 미국 특허 5,162,037호, 5,154,922호, 5,135,480호, 4,666,441호, 4,624,665호, 3,742,951호, 3,797,444호, 4,568,343호, 5,064,654호, 5,071,644호, 5,071,657호에 설명된다. 부가적인 배경 기술은 유럽 특허 0279982호 및 영국 특허 출원 2185187호에서 제공된다.
장치는 접착 매트릭스와 저수형 (reservoir-type) 경피 전달 장치를 포함하는 이 기술 분야에서 알려진 일반적인 형태일 수 있다. 장치는 유효 성분을 흡수하는 화이버 및/또는 캐리어를 결합시킨 약물 함유 매트릭스를 포함할 수 있다. 저수형 장치에서, 저수조는 캐리어와 유효 성분에 대해 불침투성인 폴리머막으로 정의될 수 있다.
경피 장치에서, 장치 그 자체는 원하는 국부 피부 표면과 유효 성분의 접촉을 유지시킨다. 그와 같은 장치에서, 유효 성분에 대한 캐리어의 점성은 크림 또는 젤의 경우보다 덜 중요하다. 경피 장치를 위한 용매 시스템은 예를 들면 올레산, 선형 알콜 락테이트 및 이프로필렌 글리콜 또는 이 기술 분야에서 알려진 다른 용매 시스템일 수 있다. 유효 성분은 캐리어에 용해되거나 부유될 수 있다.
피부에 대한 부착을 위해, 경피 패치는 중간에 뚫린 구멍을 갖는 외과적 접착 테이프 상에 위치될 수 있다. 접착은 바람직하게는 사용 전에 그것을 보호하기 위한 박리 라이너에 의해 덮여진다. 박리를 위해 적합한 전형적인 재료는 폴리에틸렌 및 폴리에틸렌 코팅된 종이를 포함하고, 바람직하게는 용이한 제거를 위해 실리콘 코팅된 것이다. 장치의 적용을 위해, 박리 라이너는 쉽게 벗겨지고, 접착제가 환자의 피부에 부착된다. 참고로 본 명세서에 병합되는 Bannon et al.,에 의한 미국 특허 5,135,480호에서, 피부에 고정하기 위한 장치에 대해 비부착성 수단을 갖는 다른 장치를 개시하고 있다.
SERM 및 항에스트로겐, 성 스테로이드 전구체만이 각각의 혈청 농도를 원하는 수준으로 허용할 수 있는 충분한 복용량과 방식으로 투여될 필요가 있다. 본 발명에 의한 복합 요법의 경우, SERM의 농도는 원하는 파라미터 내에서 유지되는 성 스테로이드 전구체와 동시에 원하는 파라미터 내에서 유지된다.
DHEA-S 및 그 유사체가 하기에서 설명하는 이유에서 또한 특히 바람직한 것으로 논의되고 있지만, 하나의 바람직한 성 스테로이드 전구체는 DHEA이다.
본 발명의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 다음의 특징을 갖는 분자 구조를 갖는다: a) 1 내지 2개의 매개 탄소 원자에 의해 간격을 두고 있는 2개의 방향족 고리로서, 이들 2개의 방향족 고리는 모두 하이드록실기 또는 생체 내에서 하이드록실기로 전환되는 기로 미치환 또는 치환되고,
b) 방향족 고리와 3차 아민 작용기를 갖는 측쇄 또는 이들의 염.
본 발명의 하나의 바람직한 SERM은 아콜비펜이다:
Figure pat00008
아콜비펜 (또는 EM-652.HCl; EM-1538라고 불림)은 강력한 항에스트로겐 EM-652의 염산염이다. 그것은 미국 특허 6,710,059 B1에 개시되어 있다. 다른 바람직한 SERM은 라소폭시펜 (오포리아; CP-336,156; (-)-시스-(5R,6S)-6-페닐-5-[4-(2-피롤리딘-1-일에톡시)페닐]-5,6,7,8-테트라하이드로나프탈렌-2-올, D-(-)-타르타레이트염) (미국, 화이저로부터 구입 가능)이다.
다른 바람직한 SERM은 미국 와이어스 에이어스 사에 의해 개발되고, 일본 10036347 (아메리칸 홈 프로덕츠 코포레이션)에 개시되고, 폐경기 골다공증에 대해 승인되었으며, WO 97/32837에서 비스테로이드성 에스트로겐 유도체로 개시된 벤즈독시펜 (TSE 424; WAY-TSE 424; WAY 140424; 1-[[4-[2-(헥사하이드로-1H-아제핀-1-일)에폭시]페닐]메틸]-2-(4-하이드록시페닐)-3-메틸-1H-인돌-5-올, 아세테이트)이다. 본 발명의 다른 바람직한 SERM은 타목시펜 (Z)-2-[4-(1,2-디페닐-1-부테닐) 페녹시]-N,N-디메틸에탄아민) (영국, 제네카사로부터 구입 가능), 토레미펜 ((Z)-2-[4-(4-클로로-1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민) (Fareston 또는 Schering-Plough의 상표로 핀란드의 오리온사로부터 구입 가능), 드롤록시펜 ((E)-3-[1-[4-[2-(디메틸아미노) 에톡시] 페닐]-2-페닐-1-부테닐] 페놀), 미국 일라이 릴리 사로부터 구입 가능: 랄록시펜 ([2-4-하이드록시페닐)-6-하이드록시벤조[b]티엔-3-일][4-[2-(1-피페리디닐) 에톡시 페닐] - 메탄온 하이드로클로라이드, LY 335124, LY 326315, .LY 335563 (6-하이드록시-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시] 페녹시]-2-(4-하이드록시페닐)벤조[b]티오펜 하이드로클로라이드) 및 아르족시펜 (LY 353381, 6-하이드록시-[4-[2-(1-피페리디닐)에폭시]페녹실]-2-(4-메톡시페닐) 벤조 [b] 티오펜 하이드로클로라이드)이다. 다른 바람직한 SERM은 이독시펜 ((E)-1-[2-[4-[1-이오도페닐)-2-페닐-1-부테닐]페녹시]에틸]피롤리딘) (미국, 스미스 클라인 비첨), 레보르멜록시펜 (3,4-트랜스-2,2-디메틸-3-페닐-4-[4-(2-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)페닐]-7-메톡시크로만) (덴마크, 노보 노르디스크, A/S, 또한 Shalmi et al.에 의해 WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037,WO 97/25038에 개시; 및 Korsgaard et al.,에 의해 WO 97/25036에 개시), GW5638 (Willson et al. 1997) 및 인돌 유도체들 (Miller et al.,에 의한 EP 0802183A1에 개시)이며, 또한 타이호 (일본)으로부터의 이프록시펜 (TAT 59; (E)-4-[1-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-2-[4-(1-메틸에틸)페닐]-1-부테닐]페놀 디하이드로젠 포스페이트), 핀란드의 오리온-파모스 파마슈티카로부터 이용가능한 오스페미펜 (FC 1271; ((Z)-2-[4-(4-클로로-1,2-디페닐-1-부테닐)페녹실]에탄올), SERM 3471, HMR 3339 및 사노피-아벤티스 (프랑스)의 HMR 3656, 독일의 쉐링 아게의 SH 646, 와이어스-에이어스에 의해 개발된 피펜독시펜 (ERA 923), WO 97/3283에 개시된 비스테로이드성 에스트로겐 유도체, QuatRx (미국)에 의해 개발된 피스페미펜 및 미국의 셀젠에 의해 개발된 CC 8490을 들 수 있다.
효능을 위해 필요로 되며, 제조사에 의해 추천된 어떤 SERM도 사용될 수 있다. 적절한 복용량은 이 기술 분야에서 알려져 있다. 시판되는 어떤 비스테로이드성 항에스트로겐도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. SERM과 동일한 활성을 갖는 어떤 화합물 (예를 들면 랄록시펜)도 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 투여되는 SERM은 바람직하게는 하루 당 체중에 대해 0.01 내지 10 mg/kg 범위의 복용량으로 투여되는 것이 바람직하며 (바람직하게는 0.05 내지 1.0 mg/kg), 경구 투여되었을 때 평균 체중을 갖는 사람에 대해 두 번의 동일한 복용량으로 바람직하게 나누어서 투여되었을 때 하루당 5mg, 특히 하루당 10mg 투여되거나, 하루에 체중 당 0.003 내지 3.0 mg/kg 범위의 투여량 (바람직하게는 0.015 내지 0.3 mg/ml), 비경구 투여될 때 (즉, 근육내, 경피 또는 피하 투여), 평균 체중을 가진 사람에 대해 바람직하게 두 번의 동일한 복용량으로 나누어서 투여될 때 하루당 1.5mg, 특히 하루당 3.0mg이 투여되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 SERM은 하기에 설명되는 약학적으로 수용가능한 희석제 또는 캐리어와 함께 투여된다.
본 발명의 바람직한 항에스트로겐의 하나는 풀베스트란트 (파스로덱스; ICI　182　7807a-[9-(4,4,5,5,5-펜타플루오로-펜틸설피닐)노닐]오에스트라-1,3,5(10)-트리엔-3,17β-디올)이며, 매달 250mg의 복용량으로 근육내 투여되고, 캐나다, 온타리오, 미시소거의 아스트라 제네카 캐나다 사로부터 이용가능하다.
여기에 추천된 모든 복용량에 대해, 주치 임상의가 개별 환자의 응답을 모니터하고 그에 따른 복용량을 조정해야 한다.
실시예
실시예 1
유선에서, 안드로겐은 전구체 스테로이드 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA)로부터 형성된다. 임상적 증거는 안드로겐이 유방암에 대해 저해 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 한편, 에스트로겐은 유방암의 발전과 생장을 자극한다. 본 발명자들은 DHEA 단독 또는 새롭게 언급된 순수한 항에스트로겐, EM-800과의 복합의, 난소 절제된 누드 마우스에서 인간 유방암 세포주 ZR-75-1에 의해 형성된 종양 이종 이식편의 생장에 대한 효과를 연구했다.
마우스에 대해 난소 절제 직후에 매일 0.5㎍의 에스트론 (에스트로겐성 호르몬)을 피하 주사했다. EM-800 (15, 50 또는 100㎍)은 하루에 한 번 경구로 투여되었다. DHEA는 하루에 두 번 (총 복용량 0.3, 1.0 또는 3.0㎎) 단독으로 또는 매일 15㎍의 EM-800의 경구 투여와 조합하여 등 피부에 적용했다. 치료에 따른 종양 크기의 변화가 첫번째 날 행해진 측정과 관련하여 주기적으로 분석되었다. 실험의 종료 시에 종양을 절개하고 무게를 쟀다.
에스트로겐을 투여하지 않은 마우스와 비교해서, 9.5개월에서 종양 크기의 9.5배의 증가가 에스트로겐 단독 투여된 난소 절제 마우스에서 관측되었다. 에스트론 보충된 난소 절제 마우스에서 5, 50 또는 100㎍의 EM-800의 투여는 종양 크기에서 각각 88%, 93% 및 94%의 저해를 가져왔다. 한편, 0.3, 1.0 또는 3.0㎎의 복용량에서 DHEA는 각각 최종 종양 무게의 67%, 82% 및 85%를 저해했다. 다른 복용량의 DHEA와 함께 또는 DHEA 없이 15㎍의 EM-800을 매일 경구 투여한 경우 종양 크기의 비교할 만한 저해가 얻어졌다. DHEA와 EM-800은 독립적으로 누드 마우스에서 에스트로겐 자극된 ZR-75-1 마우스 이종 이식편 종양의 생장을 억제했다. 소정 복용량의 DHEA의 투여는 EM-800의 저해 효과를 변경시키지 않는다.
물질 및 방법
ZR-75-1 세포
**ZR-75-1 인간 유방암 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 입수가능하고, 2mM L-글루타민, 1mM 소디움 피루베이트, 100IU 페니실린/㎖ , 100㎍ 스트렙토마이신/㎖ 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 37℃에서 95%의 공기/5% CO2의 습한 분위기 하에서 설명된 바에 따라 단층으로 통상적으로 배양되었다 (Poulin 및 Labrie, 1986; Poulin et al., 1988). 세포는 0.05% 트립신: 0.02% EDTA (w/v)로 처치된 후 매주 계대되었다. 이 리포트에서 설명된 실험들에 사용된 세포 배양은 세포주 ZR-75-1의 93 계대에서 유래되었다.
동물
암컷 동종접합성 Harlan Sprague-Dawley (nu/nu) 무흉선 마우스 (28 - 42일령)를 HSD (미국, 인디아나, 인디아나폴리스)로부터 입수하였다. 마우스는 기층류 (laminar air flow) 후드 내에 에어 필터 덮개가 있는 비닐 우리에 수용했고, 병원체 제한 조건 하에서 유지되었다. 우리, 침구, 먹이는 사용 전에 오토클레이브 처리했다. 물은 오토클레브 처리하고, pH 2.8로 산성화했으며, 임의로 제공했다.
세포 접종
마우스는 종양 세포 접종 일주일 전에 0.25㎖/동물의 아벡틱 (아밀 알콜: 0.8 g/100 ml 0.9% NaCl; 및 트리브로모 에탄올: 2g/100 ml 0.9% NaCl)의 복강내 주사에 의한 마취 하에서 양쪽 난소가 절제되었다 (OVX). 대수생장기의 1.5 x 106 ZR-75-1 세포가 0.05% 트립신/0.02% EDTA (w/v)으로 단층 처리 후에 수확되고, 25% 매트리젤 (Matrigel)을 함유하는 배양 배지 0.1ml에서 부유되고, 전술한 바와 같이 (Dauvois et al., 1991) 1인치 길이 20게이지 바늘을 사용하여 동물의 양 옆구리에 피하 접종되었다. 종양의 생장을 촉진하기 위해, 각각의 동물들은 5주 동안 매일 0.9% NaCl, 5% 에탄올, 1% 젤라틴으로 구성된 비히클의 10㎍의 에스트라디올 (E2)를 피하접종 받았다. 감지할 수 있는 ZR-75-1 종양의 출현 후, 종양 지름을 캘리퍼로 측정하고, 이 연구를 위해 0.2-0.7cm의 종양 지름을 갖는 마우스를 선택했다.
호르몬 처리
대조군 OVX군의 동물을 제외한 모든 동물에 대해 매일 0.9% NaCl, 5% 에탄올, 1% 젤라틴 0.2㎖의 0.5㎍의 에스트론 (E1)을 피하주사 투여하였다. 지시된 군에서, DHEA는 종양 생장 영역 밖의 등 피부 영역 상에 0.02㎖ 부피로 0.3, 1.0 또는 3.0㎎/동물의 복용량으로 매일 두 번 경피적으로 부가되었다. DHEA는 50% 에탄올, 50% 프로필렌 글리콜에 용해되었다. EM-800, ((+)-7-피발로일옥시-3-(4'-피발로일옥시페닐)-4-메틸-2-(4''-(2'''-피페리디노에폭시)페닐)-2H-벤조피란)은 CHUL 연구 센터의 분자내분비학 실험실의 의약화학부에서 이전에 설명된 바와 같이 합성되었다 (Gauthier et al., J. Med. Chem. 40: 2117-2122, 1997). EM-800은 4% (v/v) 에탄올, 4% (v/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 600, 1% (w/v) 젤라틴, 0.9% (w/v) NaCl에 용해되었다. 지시된 군의 동물들은 매일 15㎍, 50㎍, 또는 100㎍ 복용량의 EM-800을 단독으로 또는 DHEA와 복합하여 경구 투여받았으며, OVX군의 동물들은 비히클 (0.2 ml 4% 에탄올, 4% PEG 600, 1% 젤라틴, 0.9% NaCl)만을 투여받았다. 종양은 일주일에 한 번 버니어 캘리퍼로 측정되었다. 두 개의 수직 지름 (L 및 W)이 cm로 기록되고, 종양 면적 (㎠)이 식 L/2xW/2　x　π (Dauvois et al., 1991)을 사용하여 계산되었다. 처치의 첫번째 날에 측정된 면적을 100%로 취하고, 종양 크기의 변화가 최초 종양 면적의 백분율로서 표시되었다. 일반적인 피하 종양의 경우, 종양의 3차원 부피를 정확하게 평가하는 것이 불가능하므로, 종양 면적만이 측정되었다. 처치 291일 (또는 9.5개월) 후, 동물은 희생되었다.
응답의 카테고리가 상술한 바와 같이 평가되었다 (Dauvois et al., 1989a; Dauvois et al., 1989b; Labrie et al., 1995b). 간단하게는, 부분적인 감소는 동일하게 감소되거나 또는 원래 크기의 50% 이상인 종양에 대응하고; 안정된 응답은 원래 크기의 50%보다 작게 감소되거나 또는 그들의 원래 크기의 50%보다 작게 진행된 종양을 지칭하고, 완전한 감소는 종양이 처치 종료 시에 검출불가능한 정도인 것을 말한다. 진행은 원래 크기와 비교해서 50% 이상 진행된 종양을 말한다. 실험의 종료 시점에서, 모든 동물들을 참수하여 죽였다. 종양, 자궁 및 질은 연결 조직 및 지방조직에서 분리하여 즉시 제거하고, 칭량하였다.
통계적 분석
종양 크기에 대한 처리 효과의 통계적 의미가 DHEA, EM-800 및 시간으로 인한 영향을 평가하기 위해 분산 분석 (ANOVA)을 이용하여 분석되었고, 반복된 측정이 동일한 동물에 대해 처치의 개시와 종료 시점에서 수행되었다 (그룹 인자 내의 대상). 처치 0 시간에서 및 9.5개월 후의 반복된 측정은 동물의 임의화된 블록 (randomized block)을 구성한다. 따라서 시간은 블록 내부 효과 (within-block effect)로 분석되는 반면, 처치는 블록 간 효과 (between-block effects)로 평가된다. 주된 효과 간의 모든 상호 작용은 모델에 포함된다. 처치 인자와 그들의 상호 작용의 의미는 오류항으로서 그룹 내 대상을 사용함으로써 분석되었다. 데이터는 로그 변환되었다. ANOVA가 근거하는 가설은 잔차의 정규화 및 분산의 동질성을 가정하는 것이다.
귀납적인 쌍별 비교가 최소 유의차를 위한 피셔 테스트를 사용하여 수행되었다. 주된 효과와 체중에 대한 처치의 상호 관계 및 조직 중량이 상호 작용에 의해 표준 쌍방향 ANOVA을 이용하여 분석되었다. 모든 ANOVA는 SAS 프로그램 (SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 수행되었다. 유의차는 5% 전체 수준에서 2-테일드 테스트 (2-tailed test)로 선언되었다. 카테고리 데이터는 지시된 카테고리 응답 변수에 대해 Kruskall-Wallis 테스트로 분석되었다 (완전 응답, 부분 응답, 안정 응답, 종양 진전). 처치 효과의 모든 평가 후에, 표 4로 제시된 결과의 서브셋이 다중 비교를 위해 임계 p-값을 조정하여 분석되었다. 정확한 p-값은 StatXact 프로그램을 사용하여 계산되었다 (Cytel, Cambridge, MA, USA). 데이터는 각 그룹에서 12-15 마우스의 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)으로 표현되었다.
결과
도 3A에 나타낸 바와 같이, 인간 ZR-75-1 종양은 매일 에스트론을 0.5㎍의 경피 복용량으로 투여받은 난소 절제된 누드 마우스에서 291일 (9.5달) 후에 9.4배 증가하였고, 비히클만을 투여받은 대조군 OVX 마우스에서는 종양 크기는 연구 과정 중에 최초 값의 36.9%로 감소하였다.
경피 DHEA의 복용량을 증가시켜 처치하면 E1- 자극된 ZR-75-1 종양 생장의 점진적인 저해가 일어난다. 각각의 동물 당 매일 DHEA를 0.3 mg, 1.0 mg, 및 3.0 mg으로 처치하여 9.5개월에서 50.4%, 76.8%, 및 80.0%의 저해를 얻었다 (도 3A). 전체 종양 부하의 감소에 따라, DHEA에 의한 처치는 실험의 종료 시에 남아 있는 평균 종양 무게의 현저한 감소를 가져온다. 사실, 평균 종양 무게는 각각 DHEA를 매일 0.3, 1.0 및 3.0 mg의 복용량으로 투여받은 군의 동물의 경우, 대조군 E1- 보충된 난소 절제 누드 마우스의 1.12±0.26 g으로부터, 0.37±0.12 g (P　=.005), 0.20±0.06　g (P =.001), 및 0.17±0.06 g (P =.0009)으로 감소했다 (도 3B).
매일 복용량 15 ㎍, 50 ㎍ 및 100 ㎍ 복용량의 항에스트로겐 EM-800은 9.5개월에서 대조 동물의 종양 크기와 비교할 때, 에스트로겐 자극된 종양 크기를 각각 87.5% (P<.0001), 93.5% (P<.0001), 및 94.0% (P=.0003) 저해했다(도 4A). 세 번의 EM-800 복용량으로 얻은 종양 크기 감소는 서로 크게 다르지 않았다. 도 3B에 도시된 바와 같이, 9.5 개월의 연구 종료 시점에서의 종양 무게는 대조군 E1 보충된 OVX마우스의 1.12±0.26g로부터 각각 매일 15㎍, 50㎍ 및 100㎍ 복용량의 EM-800으로 처치된 동물에서는 0.08±0.03g, 0.93±0.01g 및 0.04±0.03g으로 감소했다 (모든 복용량의 EM-800 vs E1 보충된 OVX에서 P<.0001 ).
이미 설명한 바와 같이, 매일 15㎍의 항 에스트로겐 EM-800의 경구 복용은 9.5개월에서 측정된 에스트론 자극된 종양 크기의 87.5% 감소를 가져온다. 사용된 세 가지 복용량에서 DHEA의 부가는 항에스트로겐 EM-800의 매일 15㎍ 복용으로 얻어진 종양 크기에 대한 현저한 저해에 대해 어떤 의미있는 영향도 미치지 못한다 (도 4B). 따라서 평균 종양 크기는 에스트론 보충된 대조군 마우스의 1.12±0.26g으로부터 매일 15㎍의 항에스트로겐을 단독으로 투여받거나 또는 각각 DHEA 0.3, 1.0, 및 3.0 mg 의 복용량 (4개의 그룹간의 중요한 차이는 없었다)과 조합하여 투여받은 동물에서 0.08±0.03 g (P<.0001), 0.11±0.04 g (P=.0002), 0.13±0.07 g (P=.0004) 및 0.08 ±0.05 g (P<.0001)로 극적으로 감소된다 (도 3B).
위에서 지시된 처치로 얻어진 응답의 카테고리를 시험하는 것 역시 흥미있다. 따라서 DHEA의 복용량을 증가시킨 처치는, 비록 통계적으로 중요한 수준까지는 아니지만 (P=.088), 진행성 종양의 수를 에스트론 보충된 대조군 OVX 동물의 87.5%로부터 매일 0.3, 1.0 또는 3.0 mg의 DHEA (표 3)으로 처치된 동물에서 50.0%, 53.3%, 및 66.7%의 값으로 감소시켰다. 한편, 완전 응답은 에스트론 보충된 동물의 0%로부터 매일 0.3, 1.0, 및 3.0 mg의 DHEA를 피하 투여받은 동물에서 28.6%, 26.7%, 및 20.0%로 증가시켰다. 한편, 안정한 응답은, E1-보충된 대조군 마우스에서, 그리고 각각 상기 지시된 복용량의 DHEA를 투여받은 세 그룹의 동물에서 12.5%, 21.4%, 20.0%, 및 13.3%로 측정되었다. 대조군의 난소 절제된 마우스에서 완전, 부분 및 안정 응답의 비율은 각각 68.8%, 6.2%, 및 18.8%에서 측정되었으며, 진행성은 6.2%의 종양에서만 나타났다 (표 3).
종양의 완전 응답 또는 감소는 항에스트로겐 EM-800을 단독으로 투여 (15㎍)받거나 (P=.0006) 또는 각각 0.3 mg, 1.0 mg, 또는 3.0 mg의 DHEA와 조합하여 투여받은 동물에서 종양의 29.4%, 33.3%, 26.7%, 및 35.3%에서 이루어졌다. 한편 진행은 각각 같은 그룹의 동물에서 종양의 35.3%, 44.4%, 53.3%, 및 17.6%에서 관찰되었다. EM-800 처치된 그룹에서 단독 투여와 DHEA 조합 투여 간에는 의미있는 차이가 없다.
DHEA 또는 EM-800 처치의 유의한 효과가 종양 무게에 대해 조정된 체중에 대해서 관측되지 않았다. 에스트론 처치된 OVX 마우스는 자궁 무게가 28±5mg 으로부터 OVX 대조군 마우스에서 132±8mg 으로 증가한 반면, DHEA 복용량의 증가는 에스트론의 자극 효과에 대한 점진적인 그러나 상대적으로 적은 저해를 초래하여 가장 높은 DHEA 복용량에서 26%에 이른다(P=.0008). 동일한 도면에서, 에스트론 자극된 자궁 무게는 대조군 에스트론 보충된 마우스의 132±8mg으로부터 매일 각각 15㎍, 50㎍ 또는 100㎍ (전체 P<.0001)의 EM-800의 복용량을 경구 투여받은 경우 49±3mg, 36±2mg 및 32±1mg (모든 복용량 vs 대조군에서 P<.0001)로 감소하였다. 일 복용량 0.3 mg, 1.0 mg 또는 3.0 mg의 DHEA와 조합한 15 마이크로그램 (15㎍) EM-800에서, 자궁 무게는 각각 46±3mg, 59±5mg 및 69±3mg으로 측정되었다.
한편, 에스트론에 의한 처치는 OVX 동물에서 질 무게를 14±2mg으로부터 31±2mg로 증가시켰고 (P<.01), DHEA의 부가는 유의한 효과가 없었다. 그리고 질 무게는 EM-800의 일 복용량 15㎍, 50㎍ 또는 100㎍의 이어지는 처치에서 23±1mg, 15±1mg 및 11±1mg으로 감소되었다 (모든 복용량 vs 대조군에서 전체 p 및 쌍으로 P<.0001). 0.3 mg, 1.0 mg 또는 3.0 mg 복용량의 DHEA와 EM-800의 조합에서, 질 무게는 각각 22±1mg, 25±2mg 및 23±1mg으로 측정되었다 (모든 그룹 vs 15㎍ EM-800에 대해 N.S.) 사용된 가장 높은 복용량, 즉 일 100㎍에서, EM-800은 에스트론 보충된 OVX 동물에서 자궁 무게를 OVX 대조군의 자궁 무게와 다르지 않은 값으로 감소시켰으며, 질 무게는 OVX 대조군에서 측정된 값 미만의 값으로 감소되었다는 점이 언급되어야만 한다 (P<.05). 아마도 그의 안드로겐성 효과로 인해 DHEA는 자궁 및 질 무게에 대한 EM-800의 효과와 부분적으로 상호작용한다.
Figure pat00009
실시예 2
본 발명의 바람직한 화합물의 합성예
(S)-(+)-7-하이드록시-3-(4'-하이드록시페닐)-4-메틸-2-(4''-(2'''-피페리디노에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란하이드로클로라이드 EM-01538 (EM-652, HCl)
반응식 1
Figure pat00010
단계 A: BF3·Et2O, 톨루엔; 100℃; 1시간.
단계 C: 3,4-디하이드로피란, p-톨루엔술폰산 모노하이드레이트, 에틸 아세테이트; 질소 하에서 25℃, 16시간 후 이소프로판올에서 결정화.
*단계 D, E 및 F:
(1) 피페리딘, 톨루엔, Dean & Stark 장치, 질소 하 환류;
(2) 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운덱-7-엔, DMF, 환류 3시간;
(3) CH3MgCl, THF, -20℃ 내지 0℃ 및 실온에서 24시간;
단계 G, H: (1S)-(+)-10-캄포르술폰산, 아세톤, 물, 톨루엔, 실온, 48시간.
단계 HH: 95% 에탄올, 70℃, 그 다음 실온에서 3일.
단계 HHR: 모 알코올의 재순환 및 단계 HH의 세척
(S)-10-캄포르술폰산, 환류; 36시간, 그 다음 실온에서 16시간.
단계 I:
(1) DMF aq., Na2CO3, 에틸 아세테이트;
(2) 에탄올, 희석된 HCl;
(3) 물.
2-테트라하이드로피라닐옥시-4-하이드록시-2'-(4''-테트라하이드로피라닐옥시페닐)아세토페논(4)의 합성.
3,4-디하이드로피란(218ml, 3.39몰)과 에틸 아세테이트(520ml) 중 2,4-디하이드록시-2'-(4''-하이드록시페닐)아세토페논 3(97.6g, 0.4몰)(Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas에서 시판됨)의 현탁액을 약 25℃에서 p-톨루엔술폰산 모노하이드레이트(0.03g, 0.158m몰)로 처리하였다. 반응 혼합물을 외부 가열없이 질소 하에서 약 16시간 동안 저었다. 그리고 나서 이 혼합물을 물(100ml) 중 소디움 비카보네이트(1g)와 소디움 클로라이드(5g)의 용액으로 세척하였다. 상을 분리하고 유기상을 소금물 (20ml)로 세척하였다. 각 세척액을 50ml의 에틸 아세테이트로 역추출하였다. 모든 유기상을 모아서 소디움 술페이트를 통해 여과시켰다. 대기압에서 증류에 의해 용매(약 600ml)를 제거하고 이소프로판올(250ml)을 첨가시켰다. 대기압에서 부가적인 용매(약 300ml)를 증류시키고 이소프로판올(250ml)를 첨가시켰다. 대기압에서 부가적인 용매(약 275ml)를 증류시키고 이소프로판올(250ml)를 첨가시켰다. 이 용액을 약 25℃에서 교반과 함께 냉각시키고 약 12시간 후 결정 고체를 여과시켰으며 이소프로판올로 세척 및 건조시켰다(116.5g, 70%).
4-하이드록시-4-메틸-2-(4'-[2''-피페리디노-에톡시)페닐-3-(4'''-테트라하이드로피라닐옥시)페닐-7-테트라하이드로피라닐옥시-크로만(10)의 합성.
톨루엔(8L) 중 2-테트라하이드로피라닐옥시-4-하이드록시-2'-(4''-테트라하이드로피라닐옥시페닐)아세토페논 4 (1kg, 2.42몰), 4-[2-(1-피페리디노)에톡시]벤즈알데히드 5 (594g, 2.55몰)(Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas에서 시판됨) 및 피페리딘(82.4g, 0.97몰)(Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.에서 시판됨)의 용액을 질소 하에 Dean & Stark 장치를 이용하여 1당량의 물(44ml)이 수집될 때까지 환류시켰다. 톨루엔 (6.5L)을 대기압 하 증류에 의해 용액으로부터 제거시켰다. 디메틸포름아미드(6.5L)와 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운덱-7-엔(110.5g, 0.726몰)을 첨가시켰다. 이 용액을 실온에서 약 8시간 동안 교반시켜 캘콘(chalcone) 8과 크로마논 9를 이성질화한 다음 물과 얼음(8L) 및 톨루엔(4L)의 혼합물을 첨가시켰다. 상을 분리하고 톨루엔 층을 물(5L)로 세척하였다. 혼합된 수성 세척액을 톨루엔으로 추출하였다(3 X 4L). 혼합된 톨루엔 추출층을 소금물로 최종 세척하고(3 X 4L) 5.5L까지 대기압에서 농축시킨 다음 -10℃까지 냉각시켰다. 질소 하에서 지속적인 외부 냉각 및 교반과 함께, THF(2.5L, 7.5몰) 중 메틸마그네슘 클로라이드의 3M 용액(Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.에서 시판됨)을 첨가하고, 그 온도를 0℃ 미만으로 유지하였다. 그리나르 시약을 모두 첨가한 후, 외부 냉각을 제거하고, 이 혼합물을 실온까지 가온시켰다. 혼합물을 이 온도에서 약 24시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 다시 약 -20℃까지 냉각하고 지속적인 외부 냉각 및 교반과 함께 포화된 암모늄 클로라이드 용액(200ml)을 천천히 첨가시켰으며 그 온도를 20℃ 미만으로 유지하였다. 이 혼합물을 2시간 동안 교반시킨 다음 포화된 암모늄 클로라이드 용액(2L)과 톨루엔(4L)를 첨가하고 5분간 교반시켰다. 상을 분리하고 톨루엔으로 수성층을 추출하였다(2 X 4L). 혼합된 톨루엔 추출층을 용액이 균질해질 때까지 희석 염산으로 세척한 다음 소금물로 세척하였다(3 X 4L). 대기압 하에서 톨루엔 용액을 2L까지 최종 농축시켰다. 다음 단계에 이 용액을 직접 이용하였다.
(2R,S)-7-하이드록시-3-(4'-하이드록시페닐)-4-메틸-2-(4''-[2'''-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캄포르술폰산염(±12)의 합성.
4-하이드록시-4-메틸-2-(4'-[-2''-피페리디노]-에톡시)-페닐-3-(4'''-테트라하이드로피라닐옥시)페닐-7-테트라하이드로피라닐옥시크로만(10)의 톨루엔 용액에 아세톤(6L), 물(0.3L) 및 (S)-10-캄포르술폰산(561g, 2.42mole)(Aldrich Chemical Cmpany Inc., Milwaukee, Wis.에서 시판됨)을 첨가시켰다. 이 혼합물을 질소 하에서 48시간 동안 교반시킨 후 (2R,S)-7-하이드록시-3-(4'-하이드록시페닐)-4-메틸-2-(4''-[2'''-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캄포르술폰산염(12)를 여과시키고 아세톤으로 세척한 다음 건조시켰다(883g). 이 물질을 추가의 정제 없이 다음 단계(HH)에 이용하였다.
(2S)-7-하이드록시-3-(4'-하이드록시페닐)-4-메틸-2-(4''-[2'''-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캄포르술폰산염 (13, (+)-EM-652(1S)-CSA 염)의 합성.
95% 에탄올 중 (2R,S)-7-하이드록시-3-(4'-하이드록시페닐)-4-메틸-2-(4''-[2'''-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캄포르술폰산염 ± 12(759g)의 현탁액을 고체가 용해될 때까지 교반과 함께 약 70℃까지 가열시켰다. 교반과 함께 용액을 실온까지 가온시키고 소량의 (2S)-7-하이드록시-3-(4'-하이드록시페닐)-4-메틸-2-(4''-[2'''-피페리디노]에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 (1S)-10-캄포르술폰산염 13의 결정과 함께 유핵시켰다 (seeded). 이 용액을 실온에서 총 약 3일 동안 교반시켰다. 결정을 여과시키고 95% 에탄올로 세척한 후 건조시켰다(291g, 76%). 생성물의 수율은 94.2%이고 순도는 98.8%였다.
(S)-(+)-7-하이드록시-3-(4'-하이드록시페닐)-4-메틸-2-(4''-(2'''-피페리디노에톡시)페닐)-2H-1-벤조피란 하이드로클로라이드 EM-01538 (EM-652, HCl)의 합성.
디메틸포름아미드(11㎕, 0.15m몰) 중 화합물 13(EM-652-(+)-CSA염, 500mg, 0.726m몰)의 현탁액을 0.5M 수성 소디움 카르보네이트 용액(7.0mL, 3.6m몰)으로 처리하고 15분간 저었다. 현탁액을 에틸 아세테이트(7.0mL)로 처리하고 4시간 동안 저었다. 그 다음 유기상을 수성의 포화된 소디움 카르보네이트 용액(2 X 5mL)과 소금물(1 X 5mL)을 이용하여 세척하고 마그네슘 술페이트 하에 건조 및 농축시켰다. 에탄올(2mL) 중 생성된 분홍색 거품(EM-652) 용액을 2N 염산(400㎕, 0.80m몰)으로 처리하고, 1시간 동안 교반시켰으며, 증류수(5mL)로 처리하고 30분간 교반시켰다. 생성된 현탁액을 여과시키고 증류수(5ml)로 세척하였으며 공기 중 고 진공하에 건조시킨(65℃) 결과 크림같은 분말을 얻었다(276mg, 77%): 미세한 황백색 분말; 주사 열량 측정법: 219℃에서 용해 피크 개시, 메탄올 10 mg/ml에서 ΔH = 83 J/g　; [α]24 D = 154°　;1H NMR (300 MHz, CD3OD)
Figure pat00011
실시예 3
물질 및 방법
동물
무게 18-20g의 암컷 BALB/c 마우스 (BALB/cAnNCrlBR)를 Charles-River, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada)로부터 입수하여, 온도 (23±1℃) 및 빛 (12시간 빛/일, 7시 15분에 채광 시작)에서 우리 당 5마리를 제어된 조건 하에 수용하였다. 마우스에게는 설치류 먹이와 수돗물을 임의로 제공했다. 동물들은 이소플루란 마취 하에 양쪽 옆구리 절개를 통해 난소 절제되고 (OVX), 10마리의 그룹으로 임의로 배치되었다. 10마리의 마우스는 대조군으로서 비처치 상태로 유지되었다.
처치
첫번째 실험에서 (도 11 내지 14), 시험된 화합물, 즉 EM-652.HCl, 라소폭시펜 (유리 염기로서; 활성 및 비활성 거울성 이성질체) 및 랄록시펜은 난소 절제 2일 후부터 시작하여 9일 동안 1, 3 또는 10㎍/동물의 일 복용량으로 하루에 한 번 튜브 삽입으로 경구 투여되었다. 두번째 실험에서 (표 6), TSE 424는 난소 절제 2일 후부터 시작하여 9일 동안 1, 3, 10 또는 30㎍/동물의 일 복용량으로 하루에 한 번 튜브 삽입으로 경구 투여되었다. 두 가지의 실험에서, 항에스트로겐 활성을 평가하기 위해 에스트론 (E1, 0.06㎍, 하루에 두 번 경피 주사) 처치가 난소 절제 후 5일부터 시작되었고, 6일 간 투여되었다. 화합물은 에탄올 (4% 최종 농도)에 용해되고, 0.4% 메틸셀룰로오스에서 투여되었다. 비처치 마우스와 OVX 대조군들은 9일 동안 비히클 (4% ETOH-0.4% 메틸셀룰로오스)만을 투여받았다. 동물들을 난소 절제 후 11일 째 아침에 배대동맥 출혈로 치사시켰다. 자궁과 질을 신속하게 해부하고, 무게를 잰 다음 추가적인 조직학 검사를 위해 10% 완충 포르말린에 보관하였다.
항목 1. 결과
실험 1
도 11에 나타낸 바와 같이, 1㎍, 3㎍, 10㎍의 일 복용량으로 투여된 EM-652.HCl은 각각 에스트론 자극된 자궁 무게의 24%, 48%, 72%의 감소를 초래했고 (모든 복용량 vs 대조군에 대해 p<0.01 ), 동일 복용량에서 랄록시펜은 각각 이들 파라미터의 6% (NS), 14% (p<0.01), 43% (p<0.01)의 감소를 초래했다. 한편, 라소폭시펜 (유리 염기로서)은 사용된 가장 낮은 복용량에서 어떤 저해 효과도 갖지 않았고, 3㎍ 및 10㎍의 일 복용량에서 에스트론 자극된 자궁 무게의 25% (p<0.01) 및 44% (p<0.01)의 자극 효과를 초래했다. 라소폭시펜의 비활성 거울상 이성질체는 사용된 어떤 복용량에서도 이들 파라미터에 대해 저해 효과를 갖지 못했다.
또한 언급된 화합물들은 질 무게에 대해서도 유사한 효과를 발휘했다. EM-652.HCl의 매일 경구 투여는 1㎍, 3㎍ 및 10㎍에서 각각 10%(NS), 25% 및 53%의 자궁 무게의 저해를 가져왔고 (가장 높은 두 개의 복용량에 대해 p<0.01) (도 12), 랄록시펜은 가장 높은 복용량 (10㎍)에서만 이들 파라미터에 대해 유의한 24% (p<0.01)의 저해 효과를 발휘했다. 랄록시펜과 유사하게, 라소폭시펜 (자유 염기로서)은 사용된 가장 높은 복용량에서 유의한 37% (p<0.01)의 저해 효과를 초래했고, 비활성 거울상 이성질체는 사용된 어떤 복용량에서도 질 무게에 대해 저해 효과를 갖지 않았다.
일일 경구 복용량 1㎍과 10㎍에서 난소 절제된 마우스에 화합물들이 단독 투여될 때 (에스트론의 부재 하에서), EM-652.HCl는 사용된 두 가지의 복용량에서 자궁 무게에 유의한 자극 효과를 갖지 않았고, 반면 10㎍의 라소폭시펜과 랄록시펜은 자궁 무게에 대해 각각 93% (p<0.01) 및 85% (p<0.01)의 자극을 초래했고 (도 13), 따라서 이 파라미터에 대해 이들 두 가지 화합물들의 에스트로겐성 효과를 나타낸다.
마찬가지로, EM-652.HCl은 질 무게에 대해 유의한 자극 효과를 발휘하지 않지만 (도 14), 10㎍의 라소폭시펜과 랄록시펜의 투여는 각각 73% (p<0.01)와 56% (p<0.01)의 질 무게 자극 효과를 초래한다. 한편, 라소폭시펜의 비활성 거울상 이성질체는 자궁 및 질 무게에 어떤 자극 효과도 갖지 않는다.
실험 2:
표 4에 나타낸 바와 같이, 일 복용량 1㎍, 3㎍, 10㎍ 또는 30㎍의 TSE 424의 경구 투여는 에스트론 자극된 자궁 무게의 각각 12% (NS), 47%, 74%, 및 94%의 저해를 초래했다 (가장 높은 복용량 vs E1-대조군에 대해 p<0.01). 한편 3㎍, 10㎍ 및 30㎍의 일 복용량에서 TSE의 경구 투여는 질 무게에 대해 각각 16% (NS), 56% (p<0.01) 및 93% (p<0.01)의 저해를 가져왔다.
일 경구 복용량 3㎍ 및 30㎍에서 난소 절제된 마우스에 대한 화합물의 단독 투여 (에스트론의 부재)는 사용된 양 복용량 모두에서 자궁 및 질 무게에 대해 유의한 자극 효과를 갖지 못했다 (표 4).
Figure pat00012
*실시예 4
골 손실, 혈청 지질 및 전체 체지방에 대한 저해 효과
동물 및 처치
처치 시작 시점에서 약 220-270g의 10 내지 12주령인 암컷 Sprague-Dawley 래트들 (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada)을 사용하였다. 동물들은 실험 시작 전에 적어도 1주일 동안 환경 조건 (온도:22±3℃; 습도: 50±20%; 12시간 광-12시간 암 주기, 채광은 7:15에 시작)에 순응되었다. 동물들은 개별적으로 수용되고, 수돗물과 팰릿화된 인증된 설치류 먹이 (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO)에 자유롭게 접근이 허용되었다. 실험은 캐나다 동물 보호 협회 (CCAC) 및 실험 동물 보호에 대한 평가와 승인 위원회 (AAALAC)에 의해 승인된 동물 설비에서 수행되었고, 실험 동물의 보호와 사용에 관한 CCAC 가이드에 따라 수행되었다.
첫번째 실험에서, 154마리의 래트들이 다음과 같은 각각의 14마리의 동물로 이루어진 11개의 군에 할당되었다: 1) 비처치 대조군; 2) OVX 대조군; 3) OVX + E2 (1 mg/kg); 4) OVX + EM-652.HCl (2.5 mg/kg); 5) OVX + E2 +　EM-652.HCl; 6) OVX + 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA; 80 mg/kg); 7) OVX + DHEA + EM-652.HCl; 8) OVX + DHEA + E2; 9) OVX + DHEA + E2 + EM-652.HCl; 10) OVX + GW 5638; 11) OVX + E2 + GW 5638. 연구 첫번째 날에, 적절한 군의 동물들이 이소플루란 마취 하에 양쪽 난소가 절제되었다 (OVX). DHEA는 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜 용액으로서 등 피부에 국부적으로 적용되었고, 다른 시험 화합물들은 0.4% 메틸렌셀룰로오스 현탁액으로서 튜브 삽입으로 경구 투여되었다. 처치는 연구 2일째 시작되었고 3개월 동안 하루에 한 번 수행되었다.
두번째 실험에서, 132마리의 래트들이 다음과 같은 14 또는 15마리로 이루어진 9개의 그룹으로 임의로 할당되었다: 1) 비처치 대조군; 2)　OVX 대조군; 3) OVX + 프레마린 (0.25 mg/kg); 4) OVX + EM-652.HCl (2.5 mg/kg); 5)　OVX + 프레마린 + EM-652.HCl; 6) OVX + TSE　424 (2.5 mg/kg); 7) OVX +　프레마린 +　TSE　424; 8) OVX + 라소폭시펜 (타르타레이트 염; 라세미체; 2.5 mg/kg); 9)　OVX + 프레마린 + 라소폭시펜. 연구 1일 째, 적절한 군의 동물들이 이소플루란 마취 하에 양쪽 OVX되었다. 시험된 화합물들은 0.4% 메틸셀룰로오스 현탁액으로서 튜브 삽입에 의해 경구 투여되었다. 처치는 연구 2일째 시작되었고, 26주 간 하루에 한 번 수행되었다. 양쪽 실험에서 시험 제제를 투여받지 않은 동물들은 같은 기간 동안 적절한 비히클만으로 처치되었다.
골 미네랄 밀도 측정
처치 3개월 (실험 1) 또는 26주 (실험 2) 후에, 개별 래트들은 이소플루란 마취 하에 이중 에너지 X-레이 흡광 분석법 (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA) 및 광역 고해상도 스캔 소프트웨어에 의해 그들의 전체 체골격과 요추가 스캔되었다. 요추 (척추뼈 L2 내지 L4)의 골 미네랄 밀도 (BMD)와 전체 체조성 (지방 비율)이 측정되었다.
혈청 분석
처치 3개월 (실험 1) 또는 26주 (실험 2) 후에, 밤새 굶긴 동물들로부터 혈액 시료를 경정맥에서 수집하였다 (이소플루란 마취 하에). 시료는 혈청 제조를 위해 처리되고 분석 시까지 -80℃에서 동결되었다. 혈청 콜레스테롤 수준과 알칼리성 포스파타제 활성 (ALP)가 뵈링거 만하임 진단용 히타치 911 분석기 (Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)를 이용하여 측정되었다.
통계 분석
데이터는 평균 ±SEM으로 나타낸다. 통계적 유의성은 던칸-크래머의 다중 범위 검정 (Kramer CY; Biometrics 1956;12:307-310)에 따라 결정되었다.
결과
표 5에 나타낸 바와 같이, 난소 절제 3개월 후, 요추의 BMD는 비처치 대조군보다 OVX 대조 동물에서 10% 낮았다 (p<0.01). 사용된 복용량에서, 에스트라디올과 EM-652.HCl 단독 투여는 요추 BMD 손실을 각각 98% (p<0.01) 및 65% (p<0.05) 방지하였고, E2 및 EM-652.HCl 복합 처치는 OVX 유발된 요추 BMD 감소를 61% (p<0.05) 방지하였다. 한편, DHEA 단독 투여는 요추 BMD 감소를 43% (p<0.05) 방지하였고, DHEA+ E2 + EM-652.HCl 복합 투여는 OVX 유발된 요추 BMD 감소를 91% 방지하였고, 비처치 대조군과 다르지 않은 BMD 값을 유도했다.
표 6에서, 난소 절제 후 26주의 요추 BMD는 비처치 대조군에 비교해서 18% 낮았다 (p<0.001). 프레마린, EM-652.HCl, TSE　424 및 라소폭시펜의 투여는 단독으로 각각 요추 BMD를 54%, 62%, 49% 및 61% 방지하였다 (모든 p<0.01 vs OVX 대조군). EM-652.HCl, TSE　424 또는 라소폭시펜에 대한 프레마린의 부가는 요추 BMD값을 각각의 SERM 단독 투여에서 얻은 값과 크게 다르지 않게 만들었다 (표 6). 마찬가지로, E2 또는 EM-652.HCl에 DHEA를 부가하는 것은 요추 BMD에서 OVX 유발된 감소를 완전히 억제한다 (표 5). BMD에 대한 DHEA의 긍정적인 효과는 또한 골형성과 대사의 표지인 혈청 알칼리성 포스파타제 (ALP)에 대한 DHEA의 효과에 의해서도 지지된다. ALP 활성은 OVX 대조군 동물에서 73 ±6 IU/L로부터 DHEA-, DHEA + EM-652.HCl-, DHEA + E2- 및 DHEA + E2 + EM-652.HCl-처치 동물에서 각각 224 ± 18 IU/L, 290 ± 27 IU/L, 123 ± 8 IU/L 및d 261 ± 20 IU/L (모두 p<0.01)로 증가했고, 따라서 골 형성에 대한 DHEA의 자극 효과를 나타낸다 (표 7).
골 손실에 대한 방지 효과에 더하여, EM-652.HCl, TSE　424, 라소폭시펜, GW 5638, DHEA 및 E2는 총 체지방 비율과 혈청 지질에 대해서도 유익한 효과를 발휘한다. 난소 절제 3개월 후, 총 체지방은 22% 증가했다 (p<0.05; 표 XXX 6). EM-652.HCl의 투여는 OVX 유발된 지방 비율 증가를 완전히 방지하고, 혈청에 대한 DHEA 및/또는 E2의 부가는 지방비율을 비처치 대조 동물에서 관측되는 값 미만으로 이끌었다. 난소 절제 26주 후, 에스트로겐 결핍에 의해 유발된 40%의 지방 증가는 이어지는 프레마린, EM-652.HCl, TSE 424 또는 라소폭시펜의 투여에 의해 각각 74%, 78%, 75% 및 114%로 역전되었고, 각각의 SERM에 대한 프레마린의 부가는 OVX 유발된 지방비율 증가를 완전히 방지하였다 (표 8).
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 난소 절제 3개월 후, 비처치 대조군에 비해 혈청 콜레스테롤 수준에서 22%의 증가가 OVX 대조군 래트에서 관측되었다 (p<0.01). 사실, 혈청 콜레스테롤은 비처치 동물에서의 2.01 ±0.11 mmol/L로부터 OVX 대조군에서 2.46 ± 0.08 mmol/L 로 증가했다. E2 또는 DHEA의 투여는 단독으로 혈청 콜레스테롤 수준을 각각 1.37 ± 0.18 mmol/L 및 1.59 ± 0.10　mmol/L로 감소시키며, EM-652.HCl 단독 또는 E2 및/또는 DHEA와의 복합 투여는 콜레스테롤 수준을 비처치 동물에서 발견되는 값 (2.01 ± 0.11 mmol/L)보다 상당히 저하시킨다 (0.65 내지 0.96 mmol/L 사이). 마찬가지로, GW 5638, TSE 424 및 라소폭시펜 단독 또는 E2 또는 프레마린과의 복합 투여는 OVX 유발된 혈청 콜레스테롤 수준 증가를 완전히 방지하고, 비처치 동물에서 발견되는 값보다 더 낮은 값으로 이끈다. (표 7 및 8).
Figure pat00013
*, p<0.05; **, p<0.01, 실험 vs OVX 대조군 래트들
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
실시예 5
난소 절제된 암컷 래트들에 대한 SERM들 EM-652.HCl, TSE-424 및 ERA-923의 단독 또는 DHEA와의 복합 투여 처치의 골 손실에 대한 방지 효과
동물 및 처치
처치 시작 시점에서 약 220-270g의 10 내지 12주령의 암컷 Sprague-Dawley 래트들 (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) 을 사용하였다. 동물들은 실험 시작 전에 적어도 1주일 동안 환경 조건 (온도:22±3℃; 습도: 50±20%; 12시간 광-12시간 암 주기, 채광은 7:15에 시작)에 순응되었다. 동물들은 개별적으로 수용되고, 수돗물과 팰릿화된 인증된 설치류 먹이 (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, MO)에 자유롭게 접근이 허용되었다. 실험은 캐나다 동물 보호 협회 (CCAC) 및 실험 동물에 대한 평가와 승인 위원회 (AAALAC)에 의해 승인된 동물 설비에서 수행되었고, 실험 동물의 보호와 사용에 관한 CCAC 가이드에 따라 수행되었다.
126마리의 래트들이 다음과 같은 각각의 14마리의 동물로 이루어진 9개의 군에 배분되었다: 1) 비처치 대조군; 2) OVX 대조군; 3) OVX + EM-652.HCl (2.5 mg/kg); 4) OVX + TSE-424 (EM-4803, 2.5 mg/kg); 5) OVX + ERA-923 (EM-3527, 2.5 mg/kg); 6) OVX + 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA; 80 mg/kg); 7) OVX + DHEA + EM-652.HCl; 8) OVX + DHEA + TSE-424; 9) OVX + DHEA + ERA-923. 연구 첫번째 날에, 적절한 군의 동물들이 이소플루란 마취 하에 양쪽 난소가 절제되었다 (OVX). DHEA는 50% 에탄올-50% 프로필렌 글리콜 용액으로서 등 피부에 국부적으로 적용되었고, 다른 시험 SERM들은 0.4% 메틸렌셀룰로오스 현탁액으로서 튜브 삽입으로 경구 투여되었다. 처치는 연구 2일째 시작되었고 5주 동안 하루에 한 번 수행되었다.
골 미네랄 밀도 측정
처치 5주 후에, 개별 래트들은 이소플루란 마취 하에 이중 에너지 X-레이 흡광 분석법 (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA) 및 광역 고해상도 스캔 소프트웨어에 의해 그들의 요추, 대퇴골, 경골이 스캔되었다. 요추 (척추뼈 2 내지 4), 대퇴부 원위부 골간단 (DFM) 및 근위 경골 골간단 (PTM)의 골 미네랄 밀도 (BMD)가 측정되었다.
통계적 분석
데이터는 평균 ± SEM 으로 표현되었다. 통계적 유의성은 던컨-크래머의 다중 범위 검정 Kramer (Kramer CY 1956)에 따라 결정되었다.
결과
표 9에 나타낸 바와 같이, 난소 절제 5주 후에, 요추의 BMD는 비처치 대조군에서보다 OVX 대조군 동물에서 9% 낮았다. SERM: EM-652.HCl, TSE-424 또는 ERA-923 단독 투여의 사용된 복용량에서, 각각 요추 BMD 손실이 86%, 53% 및 78% 방지되었다. 한편, DHEA의 단독 투여는 요추 BMD 손실을 44% 방지했지만, DHEA+EM-652.HCl, DHEA+TSE-424 또는 DHEA+ERA-923 와 복합된 처치는 OVX 유발된 요추 BMD 감소를 각각 94%, 105% 및 105% 방지했다.
대퇴부 원위부 골간단 (DFM)의 골 미네랄 밀도는 난소 절제 5주 후 10% 감소했다 (표 9). SERM: EM-652.HCl, TSE-424 또는 ERA-923 단독 투여는 DFM BMD 손실을 각각 95%, 70% 및 83% 방지했다. 한편, DHEA 단독 투여는 DFM BMD 손실을 71% 방지했고, DHEA+EM=652.HCl, DHEA+TSE-424 또는 DHEA+ERA-923 복합 처치는 DFM BMD 에서 OVX 유발된 감소를 완전히 방지했고, DFM BMD 값을 비처치 대조 동물에서 관측되는 것보다 높은 값으로 이끌었다. 동일한 결과가 근위 경골 골간단 (BMD)에 대해서도 얻어졌다 (표 9).
Figure pat00017
실시예 6
인간 자궁내막 선암 이시카와 세포에서 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 본 발명의 화합물의 효과
* 물질
보존 세포 배양액의 관리
잘 분화된 자궁내막 선암종으로부터 유래된 인간 이시카와 세포주는 Dr. Erlio Gurpide (The Mount Sinai Medical Center, New York, NY)로부터 제공되었다. 이시카와 세포는 5% (vol/vol) FBS (소 태아 혈청)을 함유하는 이글스 미니멈 에세셜 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium (MEM))에 통상적으로 유지되고, 100 U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 0.1mM 비필수 아미노산 용액으로 보충된다. 세포는 37℃에서 1.5×106의 농도로 팔콘 T75 플라스크에 놓였다.
세포배양실험
실험 개시 24시간 전에, 유사 융합성 이시카와 세포의 배지를 페놀 레드-프리 햄즈 (phenol red-free Ham's) F-12와, 100U/ml 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민 및 내생성 스테로이드를 제거하기 위해 덱스트란-코팅된 챠콜로 두번 처리한 5% FBS를 보충시킨 둘벡코(Dulbecco)의 변형된 이글스 배지(DMEM)의 1:1(v/v) 혼합물로 구성된 신선한 무-에스트로겐 기본 배지(EFBM)로 대체하였다. 그 다음 0.1% 판크레아틴(Sigma)과 0.25mM HEPES에 의해 세포를 수확하고 EFBM에 재현탁시킨 다음 100㎕의 부피로 2.2x104세포/웰의 농도로 팔콘 96웰의 바닥이 평평한 마이크로타이터 플레이트에 놓고 24시간 동안 플레이트의 표면에 부착되게 하였다. 그 후에, 지시된 화합물의 농도를 함유하는 최종 부피 200㎕의 신선한 EFBM으로 배지를 교환하였다. 48시간 후 배지를 교환하고 5일 동안 세포를 배양하였다.
알칼리성의 포스파타제 분석
배양의 종료시, 마이크로타이터 플레이트를 거꾸로 하여 생장 배지를 따라내었다. 플레이트를 충분한 PBS(0.15M NaCl, 10mM 소디움 포스페이트, pH 7.4) 200㎕로 세척하였다. 그 다음 약간의 잔여 PBS를 조심스럽게 남기면서 플레이트로부터 PBS를 제거하고 세척 과정을 한번 반복하였다. 완충 살린을 따라내고, 뒤집은 플레이트에서 종이 타월 위에 조심스럽게 블로팅했다. 커버를 교체한 다음, 플레이트를 -80℃에 15분간 두고 이어서 실온에서 10분간 해빙시켰다. 플레이트를 얼음 위에 놓고 5mM p-니트로페닐 포스페이트, 0.24mM MgCl2 및 1M 디에탄올아민(pH 9.8)을 함유하는 50㎕의 빙-냉 용액을 첨가시켰다. 그 다음 플레이트를 실온까지 가온하고, p-니트로페닐로 인한 노란색이 전개되도록 하였다(8분). 효소 면역 측정의 플레이트 리더(BIO-RAD, 모델 2550 EIA Reader)에서 405nm에서 플레이트를 모니터링하였다.
계산
가중평균 반복의 비선형 제곱 회귀 (weighted interative nonlinear squares regression)를 이용하여 IC50과 복용량-응답 곡선을 산출하였다.
Figure pat00018
Figure pat00019
1nM E2 자극 % = OD 405nm 화합물 - OD 405nm 베이스 / OD 405nm 1nM E2-OD 405nm 베이스 (Labrie et al. 1999 참조)
실시예 7
인간 유방암 MCF-7 세포 증식에 대한 EM-652.HCl, TSE-424 및 라소폭시펜의 효과
방법:
보존 세포 배양액의 관리
계대 147에서 American Type Culture Collection #HTB 22으로부터 MCF-7 인간 유방암 세포를 입수하여 페놀 레드-프리 둘벡코(Dulbecco)의 변형된 이글스-햄즈(Eagle's-Ham's) F12 배지, 상기 언급한 보충물과 5% FBS에서 통상적으로 성장시켰다. MCF-7 인간 유방 선암종 세포주는 69세의 백인 여성 환자의 흉수로부터 유래되었다. MCF-7 세포는 계대 148과 165 사이에서 이용하였으며 매주 2차 배양하였다.
세포 증식 연구
늦은 대수 증식기 상의 세포를 0.1% 판크레아틴(Sigma)을 이용하여 회수하고 50ng 소의 인슐린/ml과 내생성 스테로이드를 제거하기 위해 덱스트란-코팅된 챠콜로 2회 처리한 5%(v/v) FBS를 포함하는 적절한 배지에 재현탁시켰다. 세포를 지시된 농도로 24-웰 팔콘 플라스틱 배양 플레이트(2cm2/웰)에 평판시켜 72시간 동안 플레이트의 표면에 부착되게 하였다. 그 다음 E2의 존재 또는 부재하에 99% 재증류된 에탄올 중 1000 x 보관 용액으로부터 희석시켜 얻은 지시된 농도의 화합물을 포함하는 신선한 배지로 교환하였다. 대조군 세포는 단지 에탄올 비히클(0.1% EtOH, v/v)만을 투여받았다. 2- 또는 3-일 간격으로 배지를 교환하면서 특정 기간 동안 세포를 배양하였다. DNA 함량을 측정하여 세포의 수를 결정하였다.
계산 및 통계적 분석
가중평균 반복의 비선형 제곱 회귀를 이용하여 IC50수치와 복용량-응답 곡선을 산출하였다. 모든 결과는 평균±SEM으로 표현한다.
Figure pat00020
실시예 8
누드 마우스에서 인간 ZR-75-1 유방암종의 생장에 대한 EM-652.HCl, 타목시펜, 토레미펜, 드롤록시펜, 이독시펜, GW-5638 및 랄록시펜의 효과 비교
이 실시예의 목적은, 잘-특성화된 에스트로겐-반응성 ZR-75-1 유방암 이종 이식편의 생장에 대한, 난소절제 누드 마우스 중 EM-652.HCl과 그 밖의 6개 경구용 항에스트로겐(SERM)의 촉진 효과 및 길항 효과를 비교하기 위한 것이다.
물질 및 방법
인간의 ZR-75-1 유방암 세포
인간의 ZR-75-1 유방암 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD)로부터 입수하였으며, 페놀 레드 프리 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 이 세포에 2mM L-글루타민, 1mM 소디움 피루베이트, 100 IU 페니실린/ml, 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml 및 10%(v/v) 소 태아혈청을 보충시켜 95% 공기/5% CO2의 습윤 대기 하 37 ℃에서 배양하였다. 세포를 매주 계대하여 0.083% 판크레아틴/0.3mM EDTA를 이용한 85-90% 컨플루언스에서 회수하였다.
동물 및 종양 접종
동형 접합성 암컷 nu/nu Br 무흉선 마우스(28- 내지 42-일령)를 Charles River, Inc.(Saint-Constant, Quebec, Canada)로부터 입수하였다. 마우스(우리 당 5마리)를 에어필터 덮개가 있는 비닐 우리 안에 수용하였고, 이것을 판상 에어 플로우 후드 내 병원균 제한 조건 하에서 유지시켰다. 광 주기는 광 주기 12시간과 암 주기 12시간이다 (채광 개시 7:15). 우리, 깔개 및 사료 (Agway Pro-Lab R-M-H Diet #4018)는 사용 전에 오토클레이브 처리되었다. 물은 오토클레이브 처리하여 임의 제공한다. 이소플루란-유발성 마취하에 양측 난소절제를 수행하였다. 난소절제시, 초기 종양 생장을 촉진하기 위해 에스트라디올(E2)의 이식편을 피하 삽입하였다. E2 이식편은, 에스트라디올과 콜레스테롤의 1:10(w/w) 혼합물의 0.5cm를 함유하는 1cm-길이 실래스틱 튜브 (내경: 0.062인치; 외경: 0.095인치)로 제조되었다. 난소절제 1주일 후, 2 x 106 ZR-75-1 (계대 93) 세포를 0.1㎖ RPMI-1640 배지 + 30% 마트리겔에서 길이 2.5cm- 22게이지 바늘을 통해 각 난소절제(OVX) 마우스의 양 옆구리 상에 피하 접종하였다. 4주 후, 모든 동물에서 E2 이식편을 동일한 크기의 에스트론-함유 이식편으로 대신하였다 (E1:chol, 1:25, w/w). 1주 후 임의화 및 처치를 시작하였다.
처치
처치 개시 하루 전날, 평균 면적 24.4±0.4mm2(범위 5.7 내지 50.7mm2)의 ZR-75-1 종양을 갖는 마우스 255마리를 17개의 군(종양 크기에 따라)으로 임의 할당하였고, 이 때 각 군은 15마리의 마우스로 구성된다 (총 29 또는 30개의 종양). 17개의 군은 두 개의 대조군 (OVX와 OVX + 에스트론), 에스트론 이식편을 보충하고 항에스트로겐으로 치료한 7개군 및 항에스트로겐만을 투여한 그 밖의 8개군을 포함한다. 그 다음 난소절제 대조군(OVX)과 항에스트로겐만을 투여한 군의 동물로부터 에스트론 이식편을 제거하였다. 그 후 매 6주마다 다른 9개군의 에스트론-함유 이식편을 교환하였다. 종양학 및 분자 내분비학 연구센터의 의약화학부에서 EM-652.HCl, 랄록시펜, 드롤록시펜, 이독시펜 및 GW 5638을 합성하였다. 타목시펜은 플란텍스 (이스라엘, 네타냐)로부터 구입하고 토레미펜 시트레이트는 오리온 (핀란드, 에스푸)에서 구입하였다. 에스트론 자극하에, 일일 경구 투여량 50㎍ (2mg/kg, 평균)의 항에스트로겐을 0.4%(w/v) 메틸셀룰로스의 0.2ml에 현탁시켜 공급하였다. 에스트론 자극 없이, 각 항에스트로겐 200㎍(8mg/kg, 평균)을 매일 1회 경구 투여함으로써 동물을 치료하였다. 양 대조군의 동물들에게는 0.2ml의 비히클만을 투여하였다. 적절한 농도의 항에스트로겐 현탁액을 매달 제조하고, 4℃에 보관하였으며, 일정한 교반하에 이용하였다. 분말 스톡을 밀봉하여 4℃ (이독시펜, 랄록시펜, 토레미펜, GW 5638, 드롤록시펜) 또는 실온 (타목시펜, EM-652.HCl)에 보관하였다.
종양 측정 및 검시
두개의 수직 직경을 기록하고 종양 면적(mm2)을 식: L/2 x W/2 x π로 계산하였다. 치료 첫날 측정된 면적을 100%로 하였다.
치료 161일 후, 남아있는 동물을 이소플루란으로 마취하고 방혈로 치사시켰다. 추가로 에스트로겐과 항에스트로겐의 효과를 특정하기 위해, 에스트로겐-반응성 조직, 예컨대 자궁과 질을 즉시 제거하고, 결합조직과 지방조직을 떼어낸 후 칭량하였다. Image Pro-Plus (미디어 사이버네틱스, 미국 메릴랜드)를 이용한 이미지 분석으로 자궁내막의 두께를 측정하기 위해 자궁을 준비하였다. 간단히 말해, 자궁을 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 묻었다. 마우스의 자궁 중 헤마톡실린- 및 에오신-염색된 구획을 분석하였다. 자궁 당 네 개의 이미지 (자궁뿔 당 2개)를 분석하였다. 상피세포의 평균 높이를 각 군의 모든 동물에서 측정하였다.
응답 기준
연구 종료시 또는, 실험의 진행 도중 발생하는 경우라면 각 동물의 치사 시에 종양 응답을 평가하였다. 이 경우, 적어도 연구의 중반 (84일)까지 살아남은 마우스의 데이터만이 종양의 응답 분석에 이용되었다. 간단히 말해, 완전한 감소는 실험 종료시 종양이 검출되지 않는 것을 말한다; 부분 감소는 원래 크기의 ≥50% 감소된 종양에 상응한다; 안정한 응답은 <50% 감소되거나 ≤50% 진행한 종양을 말한다; 진행은 원래 크기와 비교하여 ≥50% 진행한 종양을 언급한다.
통계적 분석
반복 측정을 위한 ANOVA에 따라서 1일부터 161일 사이, 종양의 총 표면적 변화를 분석하였다. 이 모델에는 치료, 시간 및 시간-치료 상호효과에 더하여 임의화에 의한 단계를 설명하는 용어가 포함된다. 따라서 161일째에서 개별적인 치료 효과의 의미는 시간-치료 상호작용에 의해 판단되었다. 잔차 분석은, 원 규모상의 측정값 및 시도된 어떠한 변형도 ANOVA에 의한 분석치와 꼭 맞아떨어지지 않음을 보여준다. 상피 두께에 대한 치료 효과는, 또한 임의화에서의 단계를 포함하는 일-방 ANOVA에 의해 측정되었다. 최소 자승 평균 통계를 이용하여 후쌍방식 비교를 수행하였다. 차이의 유의성을 선언하기 위해 총 타입 I 에러율(α)을 5%로 조절하였다. SAS 소프트웨어상 Proc MIXED를 이용하여 모든 계산을 실행시켰다 (SAS Institute, Carry, NC).
결과
ZR-75-1 종양 생장에 대한 길항 효과
에스트론 (OVX + E1) 단독은 23주-치료 기간 동안 ZR-75-1 종양 크기를 707% 증가시켰다 (도 18). 순수한 항에스트로겐 EM-652.HCl을 매일 경구 투여량 50㎍으로 에스트론-자극성 마우스에 투여시켜 종양의 생장을 완전히 억제하였다. 사실상, 종양의 생장 뿐 아니라 23주 치료 후, 종양의 크기가 치료 시작 시점의 초기 수치보다 26% 감소하였다 (p<0.04). EM-652.HCl로 치료한 이후 얻어지는 이 수치는 난소절제(OVX) 이후 관찰된 것과 통계적으로 다르지 않았고, 종양의 크기는 최초 종양 크기의 61% 미만으로 감소하였다. 그 밖의 6개의 항에스트로겐은, 동일 투여량(50㎍)과 치료 기간에서, 최초의 평균 종양 크기를 감소시키지 못했다. 이들 군의 종양은 OVX 대조군 및 EM-652.HCl-치료군보다 모두 상당히 커졌다 (p<0.01). 사실상, 드롤록시펜, 토레미펜, GW 5638, 랄록시펜, 타목시펜과 이독시펜을 이용한 23주 치료는, 사전 치료 값과 비교하여, 종양의 평균 크기를 사전 치료 값보다 각각 478%, 230%, 227%, 191%, 87% 및 86% 증가시켰다 (도 18).
ZR-75-1 종양 생장에 대한 촉진 효과
에스트론의 보충 없이, 일 복용량 200㎍의 타목시펜을 이용한 161일 간의 치료 이후, 종양의 평균 크기는 기준치 (baseline)보다 196%까지 증가하였다 (p<0.01 vs OVX)(도 19). 반면, 이독시펜으로 치료한 마우스의 평균 종양 크기가 (125%) 증가한 한편(p<0.01), 토레미펜으로 치료한 마우스의 종양 크기는 86%까지 증가하였다 (p<0.01)(도 19). 200㎍의 타목시펜에 200㎍의 EM-652.HCl을 첨가시킴으로써 타목시펜 단독 투여의 경우 관찰되었던 증식을 완전히 억제할 수 있었다 (도 20). 반면, EM-652.HCl(p=0.44), 랄록시펜(p=0.11), 드롤록시펜(p=0.36) 또는 GW 5638(p=0.17)만을 이용한 치료는, 실험 종료시, OVX 대조군과 비교하여 ZR-75-1 종양 크기를 유의하게 변화시키지 못했다 (도 19).
응답 카테고리에 대한 효과
에스트론 자극에 대한 50㎍ 항에스트로겐의 효과.
종양 크기에 대한 효과에 더하여, 실험 종료시 각각의 개별적인 종양에서 획득한 응답 카테고리가 치료 효능의 중요한 변수가 된다. 난소절제 마우스에서, 완전, 부분 및 안정한 응답을 종양 중 각각 21%, 43% 및 38%로 획득하였고, 진행된 종양은 없었다. 반면, 에스트론을 보충한 OVX 동물에서는 100%의 종양이 진행되었다 (도 21). 에스트론을 보충한 OVX 동물 중 EM-652.HCl-치료군에서, 완전, 부분 및 안정한 응답은 종양의 각각 17%, 17% 및 60%에서 나타났고 단지 7%만이 (30개 중 2개의 종양) 진행되었다. 에스트론 자극의 동일한 조건하에, 일 50㎍ 복용량의 그 밖의 어떠한 항에스트로겐을 이용한 치료로도 진행하는 종양의 백분율을 60% 아래로 떨어뜨릴 수 없었다. 사실상 타목시펜-치료군에서는 65%의 종양 (26개 중 17)이 진행된 한편, 토레미펜에서는 89% (28개 중 25), 랄록시펜에서는 81% (26개 중 21), 드롤록시펜에서는 100% (23개 중 23), 이독시펜에서는 71% (28개 중 20), 그리고 GW 5638에서는 77% (26개 중 20)의 종양이 진행되었다 (도 21).
에스트론 자극의 부재 하에서 응답 카테고리에 대한 200㎍ 항에스트로겐의 효과
도 22에 나타낸 바와 같이, 에스트론 자극의 부재 시, 타목시펜, 이독시펜 및 토레미펜에서는 다른 항에스트로겐보다 진행 종양의 비율이 높았다. 사실상, 일 복용량 200㎍의 타목시펜-, 이독시펜- 및 토레미펜에 의한 치료 결과, 종양 중 각각 62% (26개 중 16), 33% (24개 중 8) 및 21% (28개 중 6)가 진행 카테고리상에 존재하였다. 도 23에서 볼 수 있듯이, 타목시펜에 200㎍의 EM-652.HCl을 첨가시킴으로써 진행 종양의 백분율이 타목시펜 단독 이용시 62% (26개 중 16)으로부터 타목시펜에 EM-652.HCl 첨가시 7% (28개 중 2)까지 감소하였다.
자궁 상피세포의 두께에 대한 항에스트로겐의 효과
자궁내막 중 각 화합물의 촉진 및 길항 효과의 가장 직접적인 변수로서 자궁내막의 상피세포 높이를 측정하였다.
에스트론 자극하에 자궁 상피세포의 두께에 대한 일당 50㎍의 항에스트로겐의 효과
EM-652.HCl은, 일 경구 투여량 50㎍으로, 상피의 높이에 대한 에스트론의 자극 효과를 70%까지 억제하였다. 시험된 다른 항에스트로겐 6개의 효능은 현저하게 낮았다 (p<0.01). 사실상, 드롤록시펜, GW 5638, 랄록시펜, 타목시펜, 토레미펜 및 이독시펜은 각각 17%, 24%, 26%, 32%, 41% 및 50%까지 에스트론 자극을 억제하였다 (표 12).
에스트론 자극의 부재 하에서 자궁 상피세포의 두께에 대한 일 200㎍의 항에스트로겐의 효과
에스트론 자극의 부재 하에서, EM-652.HCl과 드롤록시펜은 상피세포의 높이를 유의하게 증가시키지 않는 유일한 시험 화합물이다 (각각 OVX 대조군 수치의 114% 및 101%). 타목시펜(155%), 토레미펜(135%) 및 이독시펜(176%)은 자궁의 상피 높이에 유의한 자극을 발휘하였다 (p<0.01 vs OVX 대조군). 또한 랄록시펜(122%)과 GW 5638(121%)은 자궁의 상피 높이에 통계적으로 유의한 자극을 발휘하였다 (p<0.01 vs OVX 대조군)(표 12). 자궁과 질의 중량에 대해 측정한 각 항에스트로겐의 촉진 및 길항 효과는 자궁의 상피 두께상에서 관찰된 패턴과 일치하였다 (데이터 제시되지 않음).
Figure pat00021
실시예 9
14 C-EM-800(20mg/kg)의 단일 경구 투여에 따른 암컷 래트의 뇌 방사능
실시예 8은 본 발명의 SERM인 1 4C-EM-800(20mg/kg)의 단일 경구 투여에 따른 래트의 뇌 방사능을 보여준다. 비교를 위해, 각각의 이들 동물 각각에서 얻은 혈액, 혈장, 간 (표 13) 및 자궁에 대한 수치를 포함시켰다. 이 결과는, 수컷과 암컷 롱-에반스 래트에 단일 경구 복용량의 1 4C-EM-800 (20mg/2ml/kg) 투여에 따라 조직 분포와 방사능의 분비로부터 얻은 것이다. 이들 숫자는, 암컷 롱-에반스 래트의 뇌에서의 총 약물-유발성 방사능의 양은 매우 적고 (ng 당량/g 조직) 투여 12시간 후에는 검출되지 않는 것을 나타낸다. 2시간째, 뇌의 방사능은 간보다 412 낮아졌고, 자궁보다 21배 낮으며, 혈액보다는 8.4배 그리고 혈장보다 13배 낮다. 총 뇌 방사능의 비율이 알려지지 않은 것은 혈액 방사능으로 인한 오염 때문이므로, 뇌 방사능에 대해 표 X1에 보여진 수치는 뇌 조직 자체의 14C(EM-800)-관련 방사능에 대한 과수치이다. 이러한 수치는, 뇌 조직 중 항에스트로겐의 수준이, 만약 존재한다면, 외생성 에스트로겐의 효과를 상쇄시키기에 지나치게 낮다는 것을 시사한다. 뇌 조직 중 검출되는 몇몇 방사능은 조직내 잔여 혈액에 의한 것임을 주목해야 한다 (표 14). 추가로 이 연구에 이용된 14C-EM-800의 방사화학 순도는 최소 96.25%이었다.
Figure pat00022
a: LREM 1129의 조사표에서 얻은 수치 (EM-800: 수컷과 암컷 롱-에반스 래트에 단일 경구 복용량의 1 4C-EM-800 (20mg/2ml/kg) 투여에 따른 조직 분산과 방사능 배출)
b: 1.2ng EM-800 당량의 정량 한계 (LOQ)
c: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 한 샘플
d: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 두 샘플
%CV: 편차 계수를 퍼센트로 표시, n=3
NC: 계산 안함.
Figure pat00023
a: LREM 1129의 조사표에서 얻은 수치 (EM-800: 수컷과 암컷 롱-에반스 래트에 단일 경구 복용량의 1 4C-EM-800 (20mg/2ml/kg) 투여에 따른 조직 분산과 방사능 분비)
b: 1.2ng EM-800 당량의 정량 한계 (LOQ)
c: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 한 샘플
d: 평균치 계산에 이용된 LOQ;0 미만의 두 샘플
%CV: 편차 계수를 퍼센트로 표시, n=3
NC: 계산 안함.
실시예 10
임상시험 ERC-205
폐경기 후 여성에게서 혈관 운동성 증상 (안면 홍조)에 대한 DHEA의 효과를 평가하기 위한 위약 통제된 임상 2상 및 3상 연구
연구 설계 요약
이것은 위약 투여와 비교한 DHEA의 혈관 운동성 증상 (안면 홍조) 감소 효과를 평가하기 위한 임의화되고, 위약 통제된 연구이다. 매 주 50회 이상의 중간 정도 또는 심한 안면 홍조를 경험하는 폐경기 후 여성들 (2주간의 일지로 측정)이 일 복용량의 위약 또는 50mg의 DHEA를 투여받기 위해 임의화되었다. 50명의 평가가능한 참가자 (arm 당 25명의 환자)에 대해 4개월 동안 각 참가자에 의해 완성된 일지에 기록된 안면 홍조의 일일 평가가 수행되었다.
Figure pat00024
2주일 간의 안면 홍조 일지 스크리닝에 의해 확인된 바와 같이 매주 50회 이상의 중간 또는 심한 안면 홍조를 경험하는 40-70세의 폐경기후 여성들이 피험자 동의서에 서명 후 등록하였다. 프로토콜은 라발대학 의료 센터의 임상시험 심사위원회 (IRB) 및 캐나다 보건부에 의해 승인되었다.
여성들은 a, b 또는 c 중 하나를 만족해야 한다:
a.적어도 1년 간 생리가 없거나,
b. 6개월 이상 12개월 미만의 기간 동안 생리가 없는 경우는 FSH 레벨이 ≥40 mIU/mL (1일 전에 60일 이내)이거나 또는 자궁 절제 시 폐경 전이었던 자궁 절제 여성 또는,
c. 이전에 양쪽 난소를 절제한 경우.
12개월의 임의화 기간 내에 통상의 팝(PAP) 도말 검사 (염증성 변화 포함)와 통상적인 양쪽 유방 X선 촬영이 가능해야한다.
질식 초음파에서 자궁 경부 두께가 4mm 미만일 것도 요구되었다.
일차 결과 변수는 4개월 간의 치료 후 16주에서 중간 내지 심한 안면 홍조의 주간 빈도에서 기준치로부터의 변화였다. 목표는 또한 모든 안면 홍조의 주간 빈도에서 기준치로부터의 변화와 주간 가중된 정도 점수 (severity score)에서의 기준치로부터의 변화도 포함한다.
**2차 결과 변수는 DHEA의 안정성 평가와 삶의 질이었다.
응답 결과 변수는 안면 홍조의 횟수와 유형을 특정하기 위해 매일 기록된 환자의 종이 기록 일지로 다음과 같다:
0 없음
1 약한 = 발한 없는 열감
2 중간 정도 = 발한을 동반한 열감 및 활동 중지의 필요성 없음
3 심한 = 활동 중지가 필요한 발한을 동반한 열감. 이것은 도한을 포함한다.
안면 홍조 일지는 임의화 전에 2주 간 스크리닝 일지로서 시작했고, 환자들은 매일 일지를 완성하고, 안면 홍조의 횟수와 정도를 기록해야 했다. 자격을 갖추기 위해서 환자들은 2주 간에 걸쳐 매주 평균 50회 이상의 중간 또는 심한 안면 홍조를 기록해야 했다 (즉, 2주의 스크리닝 일지 상에서 적어도 100회의 안면 홍조가 기록됨).
일단 임의화되면, 환자들은 초기 연구 투약 시 8회의 2주 간의 안면 홍조 일지를 완성했다. 일지는 매일 채워져야 했다. 첫번째 일지는 첫 2주간 완성되었고, 2주 방문 시에 반환되었다. 두번째 2주일 일지는 첫번째 4주 치료 기간의 다음 2주일에 거쳐 완성되었고, 4주 방문 시에 반환되었다. 4, 8, 12 및 16주 방문에서, 안면 홍조에 대한 2개의 2주간 일지가 수집되었다.
일지와 맹검 투약은 같은 날 시작되었다 (즉, 1일째. 환자는 연구 투약을 받기 시작하기로 계획된 날 깨어났을 때 안면 홍조의 기록을 시작했다).
결과
도 24 및 표 15에 나타낸 바와 같이, 중간 내지 심한 안면 홍조의 수는 스크리닝에서 주 당 70.7±4.5로부터 4주차에서 50.1±5.7 (N.S. US 위약)로, 8주차에서 40.2±6.1로, 12주차에서 34.7±5.8 (p<0.05 vs 위약) 및 16주차에서 32.2±5.8 (p<0.0.5 vs 위약)으로 감소되었다. 위약은 DHEA의 54.5%에 비교하여 32.9%의 감소를 초래했다.
동일한 효과가 모든 안면 홍조 빈도의 사전스크리닝 값의 주당 75.5±4.4로부터, 4주차에서 55.3±5.8(N.S. vs 위약), 8주차에서 44.7±6.3로, 12주차에서 39.5±5.9 로 (p<0.05 vs 위약) 및 16주차에서 36.0±5.7 (p<0.05 vs 위약)으로 관측되었다. DHEA에 대한 52.4%에 비해 위약은 34.9% 의 감소를 초래했다.
약한 안면 홍조에 대해 점수 1, 중간 안면 홍조에 대해 점수 2, 심한 안면 홍조에 대해 점수 3으로 기록할 때, 그 값은 16주 차에서 위약 그룹에서 196.3±13.6로부터 130±14.1로 변화한 것과 비교해서, DHEA 그룹에서는 187.1±13.9로부터 87.2±15.8로 변화했다 (p<0.05). 위약은 DHEA의 53.4%에 대해 18.0% 감소를 초래했고, 따라서 DHEA가 3배 더 효과 있음을 나타냈다.
표 18에 나타낸 바와 같이, DHEA의 효과는 가중된 정도 점수에서 나타나듯이, 즉 DHEA에서 99.1±15.6로 감소했고, 위약에서 68.6±15.6로 감소하여 중간 내지 심한 안면 홍조에서 더 잘 발휘되었다. 이 효과는 표 19에 더 잘 나타나 있으며, 스크리닝에서 94.7±7.9를 기록한 주당 71회 이상의 평균 안면 홍조 수를 갖는 여성군에서 88.5±7.1로부터 위약군에서는 57.8±8.3으로, DHEA 투여군에서는 31.6±11.6으로 감소했다. 그와 같은 데이터는 혈관 운동성 증상을 가장 심하게 겪는 여성에게서 DHEA에 의한 65% 이상의 저해 효과 (DHEA 64.3% vs 위약 39.0%)를 나타낸다. 사실 주당 50 내지 70회의 중간 내지 심한 안면홍조를 갖는 여성들에게서 6주차에서 사전 스크리닝의 56.7±1.3으로부터 DHEA를 처방받은 여성들에서 32.7±6.2 (43.3% 감소), 위약의 경우 24.7%의 감소를 나타냈고, 따라서 위약 효과에 비해 DHEA는 43%의 저해를 나타낸다.
약한 안면 홍조의 수는 상대적으로 낮기 때문에 (표 18 및 19 비교), 동일한 결론을 표 20에서 발견할 수 있다. 70회 이상의 약한, 중간 및 심한 안면 홍조를 갖는 여성에서 안면홍조의 수는 16주차에서 사전스크리닝에서 주 당 91.0±7.0으로부터 DHEA 처방 여성에게서 36.3±11.5로 감소했다 (60% 감소). 위약을 투여받은 여성들에게서는 모든 안면홍조의 수는 16주차에서 스크리닝에서 주 당 100.4±7.9로부터 61.3±8.9로 39.9% 감소했다. 이 데이터는 모든 정도의 안면 홍조의 가장 많은 수를 갖는 여성에서 DHEA가 50% 더 큰 효과가 있음을 나타낸다.
계산을 위해 가중된 정도 점수를 사용할 때에도 유사한 결론에 이르게 된다 (표 21). 주 당 70회 이상의 안면홍조를 나타내는 여성을 고려할 때, 점수는 DHEA 투여 여성의 경우 16주 차에서 스크리닝에서 241.6±21.1로부터 95.2±34.3로 감소했고 (61.6% 감소), 위약의 경우 16주 차에서 242.0±21.6으로부터 141.3±20.1로 감소 (41.6% 감소)했다. 스크리닝에서 주 당 50-70회의 안면홍조를 갖는 여성의 경우 DHEA를 투여받은 경우, 스크리닝에서 144.3±6.7로부터 81.6±13.6으로 (43.5% 감소), 위약군의 경우 154.2±3.7 및 118.8±20.2의 값을 나타냈다 (33.0% 감소).
결론
본 데이터는 중간 내지 심한 안면 홍조 또는 모든 안면 홍조의 횟수의 유의한 감소와 주당 가중 점수 안면 홍조의 유의한 감소에 의해 평가되는 바와 같이 혈관 운동성 증상 완화에 대한 50mg DHEA 치료의 효율성을 나타낸다.
Figure pat00025
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
Figure pat00030
Figure pat00031
실시예 11
임상 시험 ERC-213
질 위축을 갖는 폐경기 후 여성의 질 좌약 투여에 따른 DHEA 생체 안정성
연구 설계 요약
연구의 첫번째 목적은 DHEA의 매일 질내 투여 후 질 상피 세포의 성숙값을 측정하는 것이었다. 40명의 폐경 후 여성들이 임의화되어 7일 동안 다음과 같은 농도의 DHEA의 1오뷸의 일 복용량을 투여받았다: 0.0%, 0.5% (6.5 mg DHEA/오뷸), 1.0% (13 mg DHEA/오뷸) 또는 1.8% (23.4 mg DHEA/오뷸). DHEA의 전신성 생체 이용율과 그 대사 산물 역시 측정되었다.
결과
DHEA 좌약을 매일 투여한 후 일주일 경과 만에, DHEA 군에서 성숙 지수는 0.5%, 1.0% 및 1.8%에서 각각 107% (p<0.01), 75% (p<0.05) 및 150% (p<0.01)로 증가하였다 (도 26). 위약군에서는 1일과 7일 사이에 어떤 변화도 관측되지 않았다. 한편, 질 pH는 DHEA 군 0.5%, 1.0% 및 1.8%에서 각각 6.29±0.21로부터 5.75±0.27 (p<0.05), 6.47±0.23으로부터 5.76±0.22 및 6.53±0.25로부터 5.86±0.28 (p<0.05)로 감소하였다 (도 27). 위약군에서는 어떤 질 pH 변화도 관측되지 않았다.
결론
본 데이터는 DHEA의 질내 투여가 혈청 에스트로겐의 유의한 변화 없이 질 수축에 대해 긍정적인 효과를 신속하게 성취할 수 있고, 따라서 현재의 질 내 또는 전신성 에스트로겐성 제제와 관련된 유방암의 증가 위험을 피하면서, 이들 조직에서 최근 인식된 DHEA의 안드로겐성 성분의 질의 모든 층에 대한 국부적 유효성을 부가할 수 있다.
약학적 조성물 실시예
하기에 실시예에 의해 제시되지만, 그에 한정되지 않는 약학적 조성물들은 바람직한 유효 SERM 아콜비펜 (EM-652.HCl; EM-1538) 및 바람직한 성 스테로이드 전구체 디하이드로에피안드로스테론 (DHEA, 프라스테론)을 이용한다. 본 발명의 다른 화합물 또는 그 조합이 아콜비펜 또는 디하이드로에피안드로스테론을 대신하여 (또는 부가하여) 이용될 수도 있다. 유효 성분의 농도는 여기서 논의된 넓은 범위에 걸쳐 변화될 수 있다. 포함될 수도 있는 다른 성분의 함량과 유형은 이 기술 분야에서 잘 알려진 것이다.
실시예 A
Figure pat00032
실시예 B
Figure pat00033
실시예 C
Figure pat00034
실시예 D
Figure pat00035
DHEA 좌약이 위텝솔 H-15 기제 (캐나다, 몬트리얼, 메디스카)를 이용하여 제조되었다. 하드 팻, 패티베이스, 웨코비, 코코아버터, 테오브로마유 또는 위텝솔 기제와의 다른 조합 등의 다른 친유성 기제가 사용될 수도 있다. 바람직한 SERM은 EM-800과 아콜비펜이다.
키트 실시예
하기에 실시예에 의해 제시되지만, 그에 한정되지 않는 키트들은 바람직한 유효 SERM 아콜비펜 (EM-652.HCl; EM-1538), 바람직한 항에스트로겐 파스로덱스 (Faslodex) 및 바람직한 성 스테로이드 전구체 디하이드로에피안드로스테론 DHEA를 이용한다. 유효 성분의 농도는 여기서 논의된 넓은 범위에 걸쳐 변화될 수 있다. 포함될 수도 있는 다른 성분의 함량과 유형은 이 기술 분야에서 잘 알려진 것이다.
실시예 D
키트
SERM 및 성 스테로이드 전구체가 경구 투여된다
Figure pat00036
상기 제제에서 다른 SERM이 아콜비펜을 대신할 수 있으며, 마찬가지로 다른 성 스테로이드 전구체가 DHEA를 대체할 수 있다. 결합된 중량%가 바람직하게는 상기 실시예에서 주어진 단일 성 스테로이드 전구체 또는 단일 SERM에 대한 중량%인 경우, 하나 이상의 SERM 또는 하나 이상의 성 스테로이드 전구체가 포함될 수 있다.
실시예 E
키트
SERM은 경구투여되고 성 스테로이드 전구체는 질내 투여된다.
Figure pat00037
DHEA 좌약은 위텝솔 H-15 기제 (캐나다, 몬트리얼, 메디스카)를 이용하여 제조되었다. 하드팻, 패티베이스, 웨코비, 코코아버터, 테오브로마유 또는 위텝솔 기제의 다른 조합과 같은 다른 친유성 기제들이 이용될 수도 있다.
실시예 F
키트
SERM과 성 스테로이드 전구체는 질내 투여되었다.
Figure pat00038
아콜비펜 좌약은 하드 팻 (위텝솔)을 이용하여 제조되었다. 패티베이스, 웨코비, 코코아버터, 테오브로마유 또는 하드 팻의 다른 조합과 같은 다른 기제들이 이용될 수도 있다.
실시예 G
SERM은 경구 투여되고 성 스테로이드 전구체는 경피 투여되었다
Figure pat00039
실시예 H
키트
Figure pat00040
상기 제제에서 다른 SERM (토레미펜, 오스페미펜, 랄록시펜, 아르족시펜, 라소폭시펜, TSE-424, ERA-923, EM-800, SERM 3339, GW-5638)이 아콜비펜을 대체해서 사용될 수 있고, 다른 성 스테로이드 저해제가 DHEA를 대체할 수 있다. 결합된 중량%가 바람직하게는 상기 실시예에서 주어진 단일 성 스테로이드 전구체 또는 단일 SERM에 대한 중량%인 경우, 하나 이상의 SERM 또는 하나 이상의 성 스테로이드 전구체가 포함될 수 있다.
본 발명은 바람직한 실시의 형태와 실시예에 의해 설명되었지만, 그에 제한되지는 않는다. 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자들은 더 넓은 응용가능성을 쉽게 인식할 것이며, 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (24)

  1. 두뇌의 중추신경계에서 제어되는, 폐경기 도한증을 경감 또는 제거하기 위한 약학적 조성물로서,
    a) 약학적으로 수용가능한 첨가제, 희석제 또는 캐리어;
    b) 디하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에피안드로스테론-설페이트, 안드로스트-5-엔-3β,17β-디올 및 4-안드로스텐-3,17-디온으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체; 및
    c) 피펜독시펜 (ERA 923), 바제독시펜 (TSE 424, WAY 140424), EM-652 (아콜비펜의 자유염), EM-800 (아콜비펜 자유염의 디피발레이트), 및 EM-652-HCl (아콜비펜, EM-1538)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자를 포함하며,
    상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 폐경 후 여성에게 흔히 있는 유방암, 자궁암 또는 자궁내막암의 발생 위험 감소와 골 손실, 골다공증, 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병, 비만 또는 아테롬성 동맥 경화증을 예방하기 위해 사용되고,
    상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 두뇌 장벽을 통과할 수 없으며, 따라서 두뇌에서의 에스트로겐의 효과를 상쇄시킬 수 없는 것이고,
    상기 약학적 조성물은 폐경기 도한증의 경감 또는 제거를 위한 상기 약학적 조성물의 사용을 지시하는 패키징으로 제공되고,
    상기 약학 조성물은 에스트로겐 또는 프로게스틴, 또는 이들 모두를 함유하지 않으며,
    상기 도한증은 안면 홍조가 아닌 것인 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 성 스테로이드 전구체 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 모두 알약, 정제, 크림, 젤, 질내 좌약 및 질내 오뷸로 이루어지는 군에서 선택되는 약학적 전달 형태로 함께 제제화되는 것인 약학적 조성물.
  3. 두뇌의 중추신경계에서 제어되는, 폐경기 도한증의 경감 또는 제거를 위한 키트로서, (i) 그 안에 제1항에서 정의된 적어도 하나의 성 스테로이드 전구체를 함유하는 제1 용기; (ii) 그 안에 제1항에서 정의된 적어도 하나의 선택적 에스트로겐 수용체 조절자를 함유하는 제2 용기; 및 (iii) 폐경기 도한증의 경감 또는 제거를 위한 키트의 사용에 대한 지시를 포함하고,
    상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 또는 항에스트로겐은 폐경후 여성에게 흔히 있는 유방암, 자궁암 또는 자궁내막암의 발생 위험 감소와 골 손실, 골다공증, 고혈압, 인슐린 내성, 당뇨병, 비만 또는 아테롬성 동맥 경화증을 예방하기 위해 사용되며,
    상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 두뇌 장벽을 통과할 수 없으며, 따라서 두뇌에서 에스트로겐 효과를 상쇄시킬 수 없는 것이고,
    상기 키트는 에스트로겐 또는 프로게스틴 또는 이들 모두를 함유하지 않으며,
    도한증은 안면 홍조가 아닌 것인 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는:
    Figure pat00041

    이고, 2S 배열인 다수의 거울상 이성질체 부분으로 인해 광학적으로 활성인 것인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는:
    Figure pat00042

    이고, 다수의 2S 배열의 거울상 이성질체로 인해 광학적으로 활성이며;
    상기 성 스테로이드 전구체는 디하이드로에피안드로스테론인 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 유방, 자궁 또는 자궁내막 조직에서 에스트로겐 활성을 갖지 않는 것인 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 환자가 유방, 자궁 또는 자궁내막암에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 사용되는 것인 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 또한 골다공증, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 근육질량 손실, 비만, 알츠하이머병, 인식 상실, 기억 상실 또는 질 건조의 발전을 저해하기 위해 사용되는 것인 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 질내 투여를 위한 제형인 것인 약학적 조성물.
  10. 제4항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 질내 투여를 위한 제형인 것인 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구 투여를 위한 제형인 것인 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경피 투여를 위한 제형인 것인 약학적 조성물.
  13. 제3항에 있어서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는
    Figure pat00043

    이며, 2S 배열을 갖는 다수의 거울상 이성질체로 인해 광학적으로 활성인 것인 키트.
  14. 제3항에 있어서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는
    Figure pat00044

    이며, 2S 배열을 갖는 다수의 거울상 이성질체로 인해 광학적으로 활성이며, 상기 성 스테로이드 전구체는 디하이드로에피안드로스테론인 것인 키트.
  15. 제3항에 있어서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 유방, 자궁 또는 자궁 내막 조직에서 에스트로겐 활성을 갖지 않는 것인 키트.
  16. 제3항에 있어서, 상기 키트는 또한 환자가 유방암, 자궁암 또는 자궁내막암에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 사용되는 것인 키트.
  17. 제3항에 있어서, 상기 키트는 골다공증, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 근육질량 손실, 비만, 알츠하이머병, 인식 손실, 기억 손실 또는 질 건조증의 발전을 저해하기 위해 사용되는 것인 키트.
  18. 제3항에 있어서, 상기 키트의 적어도 하나의 성분은 질내 투여를 위한 제형인 것인 키트.
  19. 제14항에 있어서, 상기 키트의 적어도 하나의 성분은 질내 투여를 위한 제형인 것인 키트.
  20. 제3항에 있어서, 상기 키트의 적어도 하나의 성분은 경구 투여를 위한 제형인 것인 키트.
  21. 제3항에 있어서, 상기 키트의 적어도 하나의 성분은 경피 투여를 위한 제형인 것인 키트.
  22. 제1항에 있어서, 상기 성 스테로이드전구체는 디하이드로에피안드로스테론인 것인 약학적 조성물.
  23. 제3항에 있어서, 상기 성스테로이드 전구체는 디하이드로에피안드로스테론인 것인 키트.
  24. 제14항에 있어서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절자는 질내 투여를 위한 제형인 것인 키트.
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