WO2022203097A1 - 스트레스 과립의 조절제인 atxn2를 제어하여 tdp-43 단백질의 과잉생산을 억제하는 중추신경계질환의 예방 및 치료 조성물 - Google Patents

스트레스 과립의 조절제인 atxn2를 제어하여 tdp-43 단백질의 과잉생산을 억제하는 중추신경계질환의 예방 및 치료 조성물 Download PDF

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central nervous
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박성수
최윤정
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디어젠 주식회사
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing and treating central nervous system diseases, and more particularly, to a composition for preventing and treating central nervous system diseases that inhibits the overproduction of TDP-43 protein by controlling ATXN2, a stress granule regulator.
  • Abnormal protein accumulation such as RNA/DNA binding protein TDP-43 and stress granules, and their mutations are a type of early dementia. It was discovered in amyotrophic lateral sclerosis (ALS), which causes disability, and interest in the association between these proteins and brain diseases is increasing.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) is involved in the exon splicing of various genes, including the survival motor neuron (SMN) gene, which is related to motor neuron disease.
  • SNN survival motor neuron
  • a cell When a cell is put into a stressful situation by factors, it is a key protein that contributes to the generation of an aggregated mass of proteins, RNA, and DNA, collectively called stress granules.
  • stress granules is a protein encoded by the TAR DNA-binding protein gene, and regulates mRNA safety, transport and local translation in neurons in the central nervous system.
  • dysfunction-related diseases are caused by several gene mutations.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • FTD frontotemporal dementia
  • Ataxin 2 is an RNA binding protein with multiple roles in RNA metabolism by acting as a modulator of stress granules. It is generally known that aggregate proteins such as TDP-43 in stress granules induce the formation of pathological protein aggregates in amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and aggregation of granules enhances the level of insoluble TDP-43 and dissolves stress granules It was later reported that TDP-43 inclusions could persist.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Korean Patent No. 10-1924269 discloses that ALS is related to ubiquitin-proteosome system (UPS) damage, and UPS damage is closely related to TDP-43/ATXN2. It has been disclosed that inclusion formation may be directly involved as a biomarker for Alzheimer's and neurodegenerative disorders.
  • UPS ubiquitin-proteosome system
  • the present inventors selected epiandrosterone and topiramate, which are binding substances that can effectively inhibit ATXN2, through a drug-protein interaction prediction algorithm, and inhibited the formation of stress granules due to overexpression of TDP-43 with respect to these two substances to reduce muscle atrophy.
  • epiandrosterone and topiramate which are binding substances that can effectively inhibit ATXN2
  • the drug-protein interaction prediction algorithm through a drug-protein interaction prediction algorithm, and inhibited the formation of stress granules due to overexpression of TDP-43 with respect to these two substances to reduce muscle atrophy.
  • An object of the present invention is to inhibit ATXN2 containing as an active ingredient any one selected from the group consisting of Epiandrosterone, Topiramate, and pharmaceutically acceptable salts thereof to inhibit abnormal aggregation of TDP-43, thereby inhibiting cell stress granules (stress).
  • ATXN2 containing as an active ingredient any one selected from the group consisting of Epiandrosterone, Topiramate, and pharmaceutically acceptable salts thereof to inhibit abnormal aggregation of TDP-43, thereby inhibiting cell stress granules (stress).
  • the present invention inhibits ATXN2 containing any one selected from the group consisting of Epiandrosterone, Topiramate, and pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient to inhibit abnormal aggregation of TDP-43.
  • ATXN2 containing any one selected from the group consisting of Epiandrosterone, Topiramate, and pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient to inhibit abnormal aggregation of TDP-43.
  • the central nervous system disease may be amyotrophic lateral sclerosis or frontal lobe dementia.
  • the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of central nervous system diseases caused by the generation of stress granules in cells according to the present invention significantly lowers the generation of stress granules by inhibiting ATXN2 and abnormal aggregation of TDP-43. Through the effect, it can be usefully used for the prevention and development of therapeutic agents for amyotrophic lateral sclerosis or frontal lobe dementia.
  • 1 is a graph showing the results of stress granule generation experiments when TDP43-tGFP U2O2 stable cell line is subjected to oxidative stress and treated with 1 ⁇ M epiandrosterone or 1 ⁇ M topiramate.
  • FIG. 2 is a graph showing the experimental results of the ratio of cells without aggregated granules to the total number of cells when stress granules due to TDP-43 protein aggregation were generated.
  • the present invention inhibits ATXN2 containing any one selected from the group consisting of Epiandrosterone, Topiramate, and pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient to inhibit abnormal aggregation of TDP-43, thereby forming stress granules of cells It provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of central nervous system diseases caused by the production.
  • the central nervous system disease of the present invention is not particularly limited as long as it is a central nervous system disease caused by the generation of stress granules in cells, but preferably amyotrophic lateral sclerosis or frontal dementia.
  • the central nervous system disease amyotrophic lateral sclerosis
  • SOD1 superoxide dismutase-1
  • microglial cells are caused by cell death caused by a genetic program, and are a disease in which motor neurons are destroyed by blocking or lack of supply of neurotrophic factors.
  • the frontal lobe dementia which is the central nervous system disease, is caused by a genetic disorder or a spontaneous disorder (disorder occurring for unknown reasons) due to degeneration of the frontal and temporal lobes of the brain, and the frontal and temporal lobes are atrophied to reduce the size of nerve cells It is a cranial nerve disease in which mental functions such as memory, thinking, judgment, and learning ability gradually decline due to the loss of
  • Epiandrosterone is a naturally occurring steroid synthesized in the adrenal cortex, gonad, brain and gastrointestinal tract, and It functions to enhance or regulate brain function, and when it is deficient, it is organic brain syndrome, showing symptoms of memory impairment, confusion and delirium, and is associated with diseases related to the brain such as depression, irritability and judgment disorder.
  • the Topiramate increases the inhibitory signal (GABAa-mediated inhibitory impulse) through GABA ( ⁇ -aminobutyric acid) and inhibits AMPA ( ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid) and kinate glutamate receptor.
  • GABAa-mediated inhibitory impulse GABA
  • AMPA ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid
  • kinate glutamate receptor kinate glutamate receptor.
  • It is an anticonvulsant drug that has a blocking action and contains various mechanisms such as a function of regulating various ion channels, and is used as an antiepileptic drug in the treatment of brain diseases. Therefore, the known pharmaceutical uses of Epiandrosterone and Topiramate are irrelevant to the present invention.
  • the present invention uses a Molecule transformer Drug Target Interaction (MT-DTI) deep learning artificial intelligence model (Shin et al., 2019) to predict the binding force between drug-protein to regulate TDP-43 protein and bind to ATXN2. Epiandrosterone and Topiramate are selected as substances.
  • the drug-protein interaction prediction algorithm (MT-DTI, Molecule transformer Drug Target Interaction) is expensive and time-consuming in the existing DTI (Drug Target Interaction) prediction model.
  • MT-DTI effectively models complex chemical structures by reflecting the Self-Attention mechanism in the model to overcome the insignificant limitation that the candidate substance derived from the program leads to an actual drug.
  • PubChem's 97 million compound database was used for pre-learning to increase the precision within the program for predicting drug-protein interactions.
  • the Molecule transformer Drug Target Interaction (MT-DTI) deep learning artificial intelligence model (Shin et al. , 2019), the substances identified in the Molecule transformer Drug Target Interaction (MT-DTI) deep learning artificial intelligence model were selected for small molecule compounds published in PubChem, ChEMBL, DrugBank, etc.
  • the transcriptome data set for each substance treatment of the connectivity map (CMAP) was analyzed and compared (Subramanian et al., 2017), and the results were confirmed on the binding score for binding to ATXN2 and the RNA expression profile. epiandrosteron and topiramate were selected as
  • TDP43-tGFP U2O2 stable cell line TDP43-tGFP U2O2 stable cell line ( Innoprot, Spain) was used to generate and generate stress granules due to TDP-43 protein aggregation induced by oxidative stress.
  • the effect of the pharmaceutical composition according to the present invention will be described, and it is clear that the present invention is not limited by the Examples to be described later.
  • TDP43-tGFP U2O2 stable cell line (Innoprot, Spain) was used, and for initial cell proliferation, 10% fetal bovine serum and 10 mg/mL puromycin, 50 mg/mL in DMEM/Nutrient mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich) Using a nutrient medium (complete growth medium) containing mL hygromycin, it was cultured for 24 hours at a temperature of 37 °C, in an environment of 5% carbon dioxide.
  • TDP-43 protein was induced by treatment with Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) at a concentration of 5 mM and incubation for 16-24 hours. While exchanging the culture medium in which the cells were cultured, 10 ⁇ M arimoclomol as a positive control group, 1 ⁇ M epiandrosterone, and 1 ⁇ M topiramate as an experimental group were treated, and as a negative control, a well containing only untreated cells was used (positive control group: 10 ⁇ M). arimoclomol, negative control group: untreated TDP43-tGFP U2O2 stable cell line, experimental group: epiandrosterone at 1 ⁇ M, topiramate at 1 ⁇ M).
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • the ratio of stress granule free cells/total cells was calculated by checking the number of individuals in which stress granules were not formed, and the results are shown in Table 2 and FIG. 2 .

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Abstract

본 발명은 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 Epiandrosterone, Topiramate 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 활성성분으로 포함하는 ATXN2를 억제하여 TDP-43단백질의 비정상적인 응집을 저해함으로써 중추신경계질환인 근위축성 측삭경화증과 전두엽성 치매 세포의 스트레스 과립의 생성을 현저히 저하시키는 효과를 통해 근위축성 측삭경화증 또는 전두엽성 치매의 예방 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

스트레스 과립의 조절제인 ATXN2를 제어하여 TDP-43 단백질의 과잉생산을 억제하는 중추신경계질환의 예방 및 치료 조성물
본 발명은 중추신경계질환의 예방 및 치료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스트레스 과립의 조절제인 ATXN2를 제어하여 TDP-43 단백질의 과잉생산을 억제하는 중추신경계질환의 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.
RNA/DNA결합 단백질인 TDP-43와 스트레스 과립과 같은 비정상적인 단백질 축척과 이들의 돌연변이가 조기 치매의 일종으로서 언어장애와 행동장애를 동반하는 전측두엽성 치매 또는 전두엽성 치매(FTD: frontotemporaldementia)와 운동성 장애를 유발하는 근위축성 측삭경화증 또는 루게릭병(ALS: amyotrophic lateral sclerosis)에서 발견되어 이들 단백질과 뇌질환과의 연관성에 대해 관심이 높아지고 있다.
TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43)은 운동신경세포병과 관련이 있는 survival motor neuron (SMN) 유전자를 비롯한 다양한 유전자의 엑손(exon splicing)에 관여하는 것으로 산화, 노화, 독성 등 내/외부적 요인들에 의해 세포가 스트레스 상황에 놓이게 되면 stress granule으로 통칭하는 단백질, RNA, DNA 등이 응집된 덩어리가 발생하는데 기여하는 핵심적인 단백질이다. 또한, TAR DNA-binding protein 유전자에 의해 암호화되는 단백질로, 중추신경계 내 신경세포에서의 mRNA 안전성, 수송 및 국소 번역을 조절한다. TDP-43의 과잉생산의 원인으로 여러 유전자 돌연변이에 의해 기능 장애 관련 질병이 유발되며, 특히 TDP-43 유전자의 DNA 염기서열 하나의 변화가 유전자 자기조절 기능의 고장을 일으킴으로써 단백질의 과잉발현을 초래하고 전두엽성 치매나 근위축성 측삭 경화증과 관련된 다른 유전자들의 발현 이상을 초래하며 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis (ALS))과 전두엽성 치매 (frontotemporal dementia (FTD))의 발생에 핵심적인 것으로 확인되었으며, ALS 환자의 약 90~95%에서 이러한 스트레스 과립 (stress granule)과 같은 비정상적인 응집체가 발견된다고 보고되었다.
Ataxin 2는 스트레스 과립의 조절제로서 작용하여, RNA 대사에서 다수의 역할을 갖는 RNA 결합 단백질이다. 일반적으로 스트레스 과립에서 TDP-43과 같은 응집 단백질이 근위축성 측삭경화증 (ALS)에서 병리학적 단백질 응집체의 형성을 유도한다고 알려졌으며, 과립의 응집은 불용성 TDP-43의 수준을 향상시키고, 응력 과립 용해 후에 TDP-43 내포물이 지속될 수 있다고 보고되었다.
또한, 한국등록특허 제10-1924269호에서 ALS는 ubiquitin-proteosome system(UPS) 손상과 관련되고, UPS 손상은 TDP-43/ATXN2와 밀접한 관련이 있다고 개시하였으며, 미국의 등록특허 US09958460에서 TDP-43 내포 형성이 알츠하이머와 신경변성 장애을 위한 바이오마커로서 직접 관여할 수 있음이 개시되었다.
그러나 TDP-43의 원래의 역할이 세포의 생장, 유지에 관여하기 때문에, 이를 직접 억제하는 것은 세포에 치명적으로 작용하기 때문에, ataxin-2 (ATXN2)가 TDP-43의 조절신호 경로에 관여하는 것을 관련 학계에서 연구되고 있으나, ATXN2를 ALS와 FTD를 치료하는 하나의 병리학적 기전으로만 제시될 뿐 다양한 연구에도 불구하고 ATXN2의 효과적인 억제에 의한 ALS와 FTD의 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 따라서, 본 발명에서는 ATXN2를 효과적으로 억제할 수 있는 결합물질인 epiandrosterone과 topiramate를 인공지능 기반 결합도 예측 기법으로 선별하고 이들에 의한 스트레스 과립 형성을 현저히 저하하는 효과를 확인함으로써 ALS와 FTD의 예방 및 치료를 위한 신약 후보물질로서 발굴할 수 있을 것으로 기대된다.
이에, 본 발명자들은 ATXN2를 효과적으로 억제할 수 있는 결합물질인 epiandrosterone과 topiramate를 약물-단백질 상호작용 예측 알고리즘 통해 선별하고, 이 두 물질에 대하여 TDP-43의 과발현으로 인한 스트레스 과립 형성을 억제하여 근위축성 측삭경화증과 전두엽성 치매 질환에 대한 효과적인 치료를 위한 후보물질로서 그 효과를 실험으로서 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 Epiandrosterone, Topiramate 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 활성성분으로 포함하는 ATXN2를 억제하여 TDP-43의 비정상적인 응집을 저해함으로써 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Epiandrosterone, Topiramate 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 활성성분으로 포함하는 ATXN2를 억제하여 TDP-43의 비정상적인 응집을 저해함으로써 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 중추신경계 질환은 근위축성 측삭경화증 또는 전두엽성 치매일 수 있다.
본 발명에 따른 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 ATXN2를 억제하고 TDP-43의 비정상적인 응집을 저해함으로써 스트레스 과립의 생성을 현저히 저하하는 효과를 통해 근위축성 측삭경화증 또는 전두엽성 치매의 예방 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 TDP43-tGFP U2O2 stable cell line에 산화적 스트레스를 주고 1μM의 epiandrosterone 또는 1μM의 topiramate를 처리하였을 때 스트레스 과립 생성 실험 결과 그래프이다.
도 2는 TDP-43 단백질 응집으로 인한 스트레스 과립이 생성되었을 때, 전체 세포 수 대비 응집 과립이 없는 세포의 비율 실험 결과 그래프이다.
이하 발명을 구체적인 내용을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 Epiandrosterone, Topiramate 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 활성성분으로 포함하는 ATXN2를 억제하여 TDP-43의 비정상적인 응집을 저해함으로써 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 중추신경계 질환은 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환이라면 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 근위축성 측삭경화증 또는 전두엽성 치매일 수 있다.
상기 중추신경계질환인 근위축성 측삭경화증은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase-1: SOD1)라 불리는 유전자의 변이 또는 미세아교세포(Microglial cells)와 별아교세포(Astrocytes)라 불리는 면역세포의 신경손상과 미세아교세포(Microglial cells)는 유전적 프로그램에 의해 일어나는 세포사를 원인으로 발생하며 신경영양인자의 공급이 차단되거나 결핍되어 운동 신경 세포가 파괴되는 질환이다.
또한, 상기 중추신경계질환인 전두엽성 치매는 뇌의 전두엽 및 측두엽이 퇴화로 인한 유전성 장애 또는 자발성 장애(알 수 없는 이유로 발생하는 장애)로 인해 발생하며, 전두엽 및 측두엽이 위축되어 크기가 줄어들고 신경세포를 상실하여 기억력, 사고력, 판단력 및 학습 능력 등 정신 기능이 서서히 쇠퇴하는 뇌신경질환이다.
본 발명은 Epiandrosterone, Topiramate 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 중추신경계 질환에 대한 새로운 용도를 규명하여 완성한 것으로서, 상기 Epiandrosterone은 부신 피질, 생식선, 뇌 및 위장관에서 합성되는 자연 발생 스테로이드이며 신체의 면역과 뇌 기능을 증진시키거나 조절하는 기능을 하며, 결핍되었을 때 기질성 뇌증후군으로 기억장애, 혼돈 및 섬망 증상을 보이고, 우울증, 지각 과민성 및 판단장애 등의 뇌와 관련된 질환과 연관이 있으며, 또한, 상기 Topiramate은 가바(GABA, γ-aminobutyric acid)를 통한 억제 신호(GABAa-mediated inhibitory impulse)를 증가시키고 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid)와 kinate glutamate receptor를 차단하는 작용을 하며 여러 이온 채널들을 조절하는 기능 등의 다양한 기전을 포함하는 항경련제이며, 뇌질환과 관련된 치료에서는 항간질 약제로 사용된다. 따라서, 상기 Epiandrosterone 및 Topiramate의 알려진 약학적 용도는 본 발명과는 무관하다.
본 발명은 약물-단백질간의 결합력을 예측하는 Molecule transformer Drug Target Interaction (MT-DTI) deep learning 인공지능 모델(Shin et al., 2019)을 이용하여 TDP-43 단백질을 조절하고 ATXN2에 결합할 수 있는 물질로서 Epiandrosterone과 Topiramate를 선별한 것으로서, 본 발명에서 상기 약물-단백질 상호작용 예측 알고리즘 (MT-DTI, Molecule transformer Drug Target Interaction) 은 기존의 DTI(Drug Target Interaction) 예측모델에서 고비용과 많은 시간이 소요되고 프로그램에서 도출된 후보물질이 실제 신약으로 이어지는 경우가 미미한 한계를 극복하기 위해 새로운 약물-단백질 상호작용 예측 알고리즘 모델로서, MT-DTI는 Self-Attention 메커니즘을 모델에 반영해 복잡한 화학구조를 효과적으로 모델링하고 PubChem의 9,700만개 화합물 데이터베이스를 사전학습에 이용하여 약물과 단백질 상호 작용 예측을 위한 프로그램 내의 정밀도를 높인 것이다.
구체적으로 TDP-43 단백질을 조절하는 ATXN2에 결합할 수 있는 물질을 확인하고 선별하기 위하여 약물-단백질 간의 결합력을 예측하는 Molecule transformer Drug Target Interaction (MT-DTI) deep learning 인공지능 모델 (Shin et al., 2019)을 이용하여, Molecule transformer Drug Target Interaction (MT-DTI) deep learning 인공지능 모델에서 확인된 물질을 PubChem, ChEMBL, DrugBank 등에 공개된 저분자 화합물들에 대하여 선별하였다.
그 후 도출된 물질들을 기반으로 connectivity map (CMAP)의 물질 처리 별 transcriptome data set을 분석하고 대조하여(Subramanian et al., 2017), ATXN2에 결합하는 결합 점수와 RNA expression profile 상에서 결과를 확인하여 최종적으로 epiandrosteron과 topiramate을 선정한 것이다.
또한, 선정된 상기 epiandrosteron과 topiramate이 ATXN2를 억제하여 TDP-43의 비정상적인 응집을 저해함으로써 세포의 스트레스 과립 생성으로 인해 발생하는 중추신경계 질환의 예방 및 치료 효과를 확인하였는데, 구체적으로 치료 효과는 스트레스를 받는 상황에서 TDP43을 과발현하여 스트레스 과립을 형성하고, TDP-43단백질에 융합된 형광단백질 (GFP)로 인해 스트레스 과립을 특징적으로 형광현미경을 통해 관찰할 수 있는 세포주인 TDP43-tGFP U2O2 stable cell line(Innoprot, Spain)을 이용하여 산화 스트레스로 유도된 TDP-43 단백질 응집으로 인한 스트레스 과립이 생성 및 생성되었을 때 전체 세포 수 대비 응집 과립이 없는 세포의 비율을 통하여 확인할 수 있는데 이에 대해서는 실시예를 통하여 본 발명에 따른 약학적 조성물의 효과를 설명하며, 후술하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않음은 명백하다.
<실시예: epiandrosterone 및 topiramate의 효과 확인>
TDP43-tGFP U2O2 stable cell line (Innoprot, Spain)을 사용하였으며 초기 세포를 증식시키기 위하여 DMEM/Nutrient mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich)에 10% fetal bovine serum과 10 mg/mL puromycin, 50 mg/mL hygromycin을 넣은 영양배지(complete growth medium)을 이용하여 37℃의 온도, 5% 이산화탄소의 환경에서 24시간 배양하였다.
현미경으로 확인한 약 90% confluency 밀집도에서, 10,000개의 세포를 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 이때에 5mM의 농도로 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 16-24시간 동안 배양하여 TDP-43 단백질의 발현을 유도하였다. 세포들을 배양한 배양액을 교환하면서 양성대조군으로 10μM arimoclomol, 실험군으로 1μM의 epiandrosterone, 1μM의 topiramate를 처리하였고, 음성대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포만 있는 웰(well)을 사용하였다(양성대조군: 10μM arimoclomol, 음성대조군: 처리하지 않은 TDP43-tGFP U2O2 stable cell line, 실험군: 1μM의 epiandrosterone, 1μM의 topiramate).
각각 30분씩 배양하였고, 30분 후 기존의 배양액을 제거하고 250μM의 sodium arsenite를 포함한 배양액을 처리하여 세포에 산화적 스트레스가 형성되는 환경을 만들었다.
세포에 실험물질 처리를 완료한 후에, 형광현미경을 통해 형광단백질(GFP) 및 스트레스 과립의 응집을 확인하고 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타냈다.
또한, 스트레스 과립이 형성하지 않는 개체들의 수를 확인하여 stress granule free cells/total cells의 비율을 계산하여 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타냈다.
모든 실험은 각 실험군 별로 3 well씩 준비하여 실험하였으며, 이에 따라 3번의 반복을 통해 총 9번의 측정값의 평균을 내어 확인하였으며, 최종적으로 집계된 결과치를 스트레스만 유도한 음성대조군의 수치에 대하여 t-test를 실시하였으며 통계적인 유의성은 *p<0.05이다.
실험군 약효물질
처리농도		 세포 당 발생한 stress granule 숫자 (mean±sem)
IPTG (무처리군) 0μM 2.30±0.17
IPTG+NaAsO2 (음성대조군) 0μM 6.14±0.66
IPTG+NaAsO2+Arimoclomol (양성대조군) 10μM 3.68±0.32*
IPTG+NaAsO2+Epiandrosterone 1μM 4.13±0.30*
IPTG+NaAsO2+Topiramate 1μM 4.03±0.29*
실험군
 약효물질
처리농도		 Granule-free cells/total cells 비율(mean±sem)
IPTG (무처리군) 0μM 0.34±0.029
IPTG+NaAsO2 (음성대조군) 0μM 0.15±0.026
IPTG+NaAsO2+Arimoclomol (양성대조군) 10μM 0.25±0.030*
IPTG+NaAsO2+Epiandrosterone 1μM 0.24±0.031*
IPTG+NaAsO2+Topiramate 1μM 0.32±0.034*
상기 표 1 및 도면 1의 결과를 보면, 1μM epiandrosterone 및 1μM topiramate를 처리한 실험군과 양성대조군인 10μM arimoclomol 처리군에서 sodium arsenite만을 처리한 음성대조군에 비해 통계적으로 유의미한 stress granule의 저하효과가 나타났다. 음성대조군이 세포마다 약 6개의 stress granule이 형성될 때에 1μM epiandrosterone, 1μM topiramate, 10μM arimoclomol의 효과는 세포마다 약 3.5개의 수준으로 유사하였으며, 통계적으로 유의미하지 않은 차이를 나타냈지만, 농도적인 측면에서는 양성대조군인 arimoclomol 보다 10배 적은 농도의 epiandrosterone과 topiramate를 통해 유사한 결과를 얻어낸 것이어서 양성 대조군에 비교하여 stress granule의 저하 효과는 현저한 것임을 확인할 수 있다.
Stress granule의 직접적인 계수와 별개로, stress granule의 발생 여부를 두고 granule free를 계수하여 전체 세포 수에 대한 비율을 측정한 결과인 표 2 및 도 2에서도 stress granule이 생성되지 않은 세포의 비율도 표 1 및 도1의 결과와 유사한 결론이 도출되었다.
따라서, 세포에 산화적 스트레스를 주어 epiandrosterone와 topiramate를 처리하였을 때 TDP-43 단백질의 과발현에 의한 ATXN2에 결합하는 스트레스 과립의 응집을 효과적으로 감소시키는 결과를 확인하였으며, 결과적으로 epiandrosterone와 topiramate이 중추신경계 (Central nervous system, CNS) 질환, 예를 들어 근위축성 측삭경화증 또는 전두엽성 치매의 질병의 예방 및 치료를 위한 유용한 조성물이다.

Claims (2)

  1. Epiandrosterone, Topiramate 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 활성성분으로 포함하는 ATXN2를 억제하여 TDP-43의 비정상적인 응집을 저해함으로써 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 중추신경계 질환이 근위축성 측삭경화증 또는 전두엽성 치매인 것을 특징으로 하는 세포의 스트레스 과립(stress granule) 생성으로 인해 발생하는 중추신경계질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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