KR20190072672A - 일종의 il6r 차단을 통한 crs 완화에 사용되는 car-t 형질 전환 벡터와 그의 구축방법 및 용도 - Google Patents

일종의 il6r 차단을 통한 crs 완화에 사용되는 car-t 형질 전환 벡터와 그의 구축방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20190072672A
KR20190072672A KR1020197017090A KR20197017090A KR20190072672A KR 20190072672 A KR20190072672 A KR 20190072672A KR 1020197017090 A KR1020197017090 A KR 1020197017090A KR 20197017090 A KR20197017090 A KR 20197017090A KR 20190072672 A KR20190072672 A KR 20190072672A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
sequence
lentivirus
vector
car
Prior art date
Application number
KR1020197017090A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102157196B1 (ko
Inventor
웨이 치
레이 위
리칭 캉
저우 위
Original Assignee
상하이 유니카-테라피 바이오-메디슨 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이 유니카-테라피 바이오-메디슨 테크놀로지 컴퍼니 리미티드 filed Critical 상하이 유니카-테라피 바이오-메디슨 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20190072672A publication Critical patent/KR20190072672A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102157196B1 publication Critical patent/KR102157196B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464419—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/00051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

본 발명은 암피실린 내성 유전자를 포함하는 AmpR 서열; 원핵 리플리콘 pUC Ori 서열; 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열; eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사 후 조절 엘리먼트; 인간 EF1α 프로모터; 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트; IL6RscFv1/2/3인 인간 IL6R의 인간화 단 쇄 항체; IRES 리보솜 결합 서열; IL6 신호 펩타이드; 인간 항체 Fc 단편; 및 일체적으로 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체를 포함하는 IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터를 개시하였다. 또한 본 발명은 상기 벡터의 구축방법 및 CRS를 완화시키는 약물의 제조에 있어서의 상기 벡터의 용도를 개시하였다.

Description

일종의 IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터와 그의 구축방법 및 용도
본 발명은 의학 생물학 분야에 속하며, 구체적으로, 일종의 벡터, 특히 IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 벡터의 구축 방법 및 용도에 관한 것이다.
종양면역 요법의 이론적 근거는 면역계가 종양관련 항원을 인식하고, 생체가 종양세포에 대한 공격을 조절하는(고도로 특이적인 세포 용해) 능력을 가지고 있다는 것이다. 1950년대, 버넷(Burnet)과 토마스(Thomas)는 생체 내에서 자주 나타나는 돌연변이된 종양세포는 면역계에 의해 인식되고 제거된다는 "면역 감시"이론을 제기하였으며, 종양 면역 요법에 이론적 토대를 마련해 주었다[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease. Lancet, 1967; 1: 1171-4]. 그 뒤로, 사이토카인 요법, 단일클론항체 요법, 입양면역 요법, 백신 요법 등 다양한 종양면역 요법이 임상에 연속적으로 적용되었다.
2013년에 더 선진적인 종양면역 요법인 CAR-T 요법이 성공적으로 임상에 사용되었으며, 전무후무한 임상적 효능을 나타내었다. CAR-T, 정식 명칭은 Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy이며, 키메라 항원 수용체 T 세포 면역요법이다. 임상에서 가장 선진적인 CAR-T 요법은 노바티스사의 CLT019가 있으며, CLT019를 이용하여 재발성 난치성 급성림프구성 백혈병 환자를 치료하며, 6개월 이상의 종양 무진행성생존율이 67%에 달했으며, 그 중 제일 긴 응답시간은 2년 이상에 달했다. 중국 상하이에 본사를 두고 있는 상하이 유니카 테라피 바이오 메디컬 기술 유한회사(Shanghai Unicar-Therapy Bio-Medicine technology co., LTD)는 병원과 협력하여, 재발성 난치성 급성림프구성 백혈병 환자 36명을 공동으로 치료하였으며, 그 중 24명이 완화되었으며, 완화비율이 66.6%에 달했다. 이는 항암연구에서 획기적인 돌파였다. CAR-T세포요법은 암을 치료할 수 있는 가능성이 높은 방법의 한가지이며, 《Science》잡지에서 2013년도 10대 과학기술의 돌파성 선두 기술임을 평가 받았다.
CAR-T요법의 효과는 현저하나 치료과정에서 특별한 유형의 임상 증후군을 나타내며, 임상에서 발열, 저혈압, 오한으로 나타내며, 또한 혈청중의 일련의 사이토카인 레벨의 현저한 증가와 관련된 신경계통의 증상을 나타내며, 이를 사이토카인 방출 증후군(Cytokine Release Syndrome，CRS)이라고 한다. 발생 메커니즘은 항원과 T세포 수용체가 결합된 후, T세포를 활성화시키며, T세포가 활성화된 후 IL-6를 포함한 일련의 사이토카인을 방출하여, 일종의 전신성 염증반응을 일으키는 것이며, IL-6 신호 경로는 도 1A에 표시된 바와 같다. 적절한 시기에 치료하지 않으면, 폐부 감염, 비정상적인 혈액응고지수, 비정상적인 간 기능, 중요한 장기 손상, 심지어 폐부종을 유발하여 환자의 사망을 초래할 수 있다.
현재 임상에서는 항히스타민계 약물(예하면, Puermin) 또는 코르티코 스테로이드(예를 들면, 히드로코르티손, Hydrocortisone)의 정맥주사를 통해 염증반응을 억제하지만 이에 상응하는 CAR-T세포가 종양에 대한살상작용도 억제되어, 이러한 환자들로 하여금 비교적 높은 재발율을 나타내어, CAR-T 치료의 효과에 영향을 미치게 한다.
다른 하나의 비교적 실행 가능한 방안은 상업화 토실리주맵(Tocilizumab)(Actemra®)을 사용하여 CRS 발생정도를 제어하는 것이다. 토실리주맵은 일종의 인간IL-6수용체 단일클론 항체(Tocilizumab)이며, 토실리주맵과 IL-6수용체는 특이적 결합을 일으켜, IL-6 신호 전달을 차단함으로써 급성기반응(Acute phase response)을 경감시키며, 헵시딘 생성물을 감소시키며, B세포 활성화를 감소시키며, 골 흡수 및 연골전환을 감소시키며, T림프구가 Th17세포로의 분화를 억제시켜, 염증반응을 효과적으로 제어할 수 있다. 그러나, 토실리주맵 단일항체를 사용하는 비용이 매우 높으며, 10kg 체중 당 토실리주맵 한대의 가격은 약 RMB2000원이며, 성인 환자는 보통 한번에 5대를 필요로 하여, 일반 가정에서 감당하기 힘들다.
따라서, CAR-T치료의 치료 효과에 영향주지 않으면서, 낮은 비용 방법으로CRS의 발생을 제어하거나 완화시키는 것이 본 분야의 기술적 난제로 되었다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제의 한가지는, IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터를 제공하는 것이다. 우선, 원가를 절감하여 항체 약물을 구매하는 비싼 비용을 절약하였다. 두 번째로, 체내에서 scFv유전자의 전달 효율이 낮은 문제를 방지할 수 있다. 세 번째는, 렌티 바이러스로 형질도입 된 IL6R scFv 유전자를 통해, 세포 내 단백질 번역 시스템을 효과적으로 이용하여, 상응한 IL6R scFv를 대량 발현시켜, 체액순환을 통해, CAR-T치료에 영향주지 않으면서 양호한 IL6R 차단 효과를 얻을 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 기술적 과제는 상기 벡터의 구축방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 기술적 과제는 상기 벡터의 용도를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 기술적 해결수단을 이용한다.
본 발명의 한 방면에서, IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터를 제공하며, 상기 벡터는,
서열번호 1에 표시된 것과 같은 표적균주의 대량 증식에 사용되는 암피실린 내성 유전자를 포함하는 AmpR 서열;
서열번호 2에 표시된 것과 같은 플라스미드 복제에 사용되는 원핵 리플리콘pUC Ori 서열;
서열번호 3에 표시된 것과 같은 진핵세포내에서 복제를 강화시키는데 사용되는 바이러스 리플리콘 SV40 Ori서열;
서열번호 11에 표시된 것과 같은 형질전환 유전자의 발현율의 증가에 사용되는 eWPRE 강화형프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트;
서열번호 12에 표시된 것과 같은 키메라 항원 수용체 유전자의 진핵 전사에 사용되는 인간EF1α 프로모터;
렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트;
서열번호 21에 표시된 것과 같은 IL6RscFv1, 또는 서열번호 22에 표시된 것과 같은 IL6RscFv2, 또는 서열번호 23에 표시된 것과 같은 IL6RscFv3인 인간IL6R의 인간화 단쇄 항체;
서열번호 25에 표시된 것과 같은 단백질의 동시 전사 발현에 사용되는 IRES 리보솜 결합 서열;
서열번호 26에 표시된 것과 같은 IL6 신호 펩타이드;
서열번호 27에 표시된 것과 같은 인간 항체 Fc 단편; 및
일체적으로 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본 발명의 바람직한 해결수단에 있어서, 상기 인간 IL6R의 인간화 단쇄 항체는 서열번호 21에 표시된 것과 같은 IL6RscFv1이다.
상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 2세대 렌티바이러스 벡터 또는 3세대 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 3세대 렌티바이러스 벡터이다. 상기 2세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호 8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트를 포함한다. 상기 3세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호 8로 표시된 RRE시스 엘리먼트, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트, 및 서열번호 4로 표시된 RSV 프로모터를 포함한다.
본 발명의 바람직한 해결수단에 있어서, 상기 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR의 조성에 사용하는 키메라 항원 수용체는, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩타이드, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호 17로 표시된 것 과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호 20으로 표시된 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역을 포함한다. 상기 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체는, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩타이드, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호 17로 표시된 것 과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호 20으로 표시된 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역, 및 서열번호 28로 표시된 것과 같은 CD28 키메라 수용체 공동자극인자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 해결수단에 있어서, 상기 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트는 6개의 뉴클레오티드의 강화 돌연변이를 갖고 있으며, 구체적으로, g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T이다.
본 발명의 두 번째 방면에 있어서, 일종의 상기 IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질전환 벡터의 구축방법을 제공하며, 하기 단계를 포함한다.
(1) 서열번호 1로 표시된 것과 같은 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR서열, 서열번호 2로 표시된 것과 같은 원핵 리플리콘 pUC Ori서열, 서열번호 3으로 표시된 것과 같은 바이러스 리플리콘 SV40 Ori서열, 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티 바이러스 패키징 시스 엘리먼트, 서열번호 11로 표시된 것과 같은 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트를 렌티바이러스 백본 플라스미드에 저장한다.
(2) 서열번호 12로 표시된 것과 같은 인간 EF1α 프로모터, 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체로 2세대 CAR 또는 3세대 CAR로 조성하는 설계방안, 효소절단, 연결, 재조합 반응을 통해 렌티바이러스 백본 플라스미드에 클로닝하여, 2세대 CAR 또는 3세대 CAR 디자인의 재조합 렌티바이러스 플라스미드를 얻는다.
(3) 상기 인간 IL6R의 인간화 단쇄 항체 IL6RscFv1, IL6RscFv2 또는 IL6RscFv3, IRES 리보솜 결합서열, IL6 신호 펩타이드 및 인간유래 항체 Fc를 각각 재조합 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하여, IL-6R 차단 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2 또는 pCAR19-IL6RscFv3을 얻는다.
(4) 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2 또는 pCAR19-IL6RscFv3을 각각 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G와 함께 HEK293T/17세포에 형질 주입시키며, HEK293T/17세포내에서 유전자 전사 발현을 진행한 후, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 패키징에 성공시켜 세포 배양액 상층에 방출시키며, 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함한 상청액을 수집한다.
(5) 얻은 재조합 렌티바이러스 상청액을 흡인여과, 흡착, 용출에 의한 이온교환 방법으로 정제하여 각각 재조합 렌티바이러스 벡터를 얻는다.
본 발명의 바람직한 해결수단에 있어서, 단계(3)에서, 인간 EF1α 프로모터는 전체 CAR 유전자의 발현을 작동시킨다. CAR 단백질은 세포막 표면에 위치하여, CD19 항원을 인식하며, T세포 증식과 사이토카인 분비를 자극하여, 다운스트림 신호 전달경로의 발현을 활성화시킨다. scfv 영역과 CD19 항원이 결합할 경우, 신호는 키메라 수용체를 통해 세포 내로 전달되며, 이로써 T세포 증식, 사이토카인 분비증가, 항 세포사멸 단백질 분비 증가, 세포사멸 지연, 표적 세포의 용해를 포함하는 일련의 생물학적 효과를 일으킨다. IRES 리보솜 결합 서열에 의해 IL6RscFv와 Fc의 융합단백질을 동시에 발현시키며, IL6 신호 펩타이드의 유도 하에 세포 밖으로 분비되며, IL6R와의 결합을 통해 IL-6와 IL6R의 결합을 차단시켜, 이로써 IL6의 신호 경로를 차단하여, CRS 억제 효과를 얻는다.
본 발명의 바람직한 기술적 해결수단에 있어서, 단계 (5)에서, 상기 흡인여과 단계에서 상청액 체적을 200ml 내지 2000ml로, 진공도를 -0.5MPA 내지 -0.9MPA로 제어하여, 웰 막힘으로 인한 벡터의 손실을 방지하며, 상기 흡착단계에서 용액의 pH값을 6 내지 8로 제어하여, pH 변화에 의한 벡터의 비활성화를 방지하며, 상기 용출단계에서 용출액의 이온강도를 0.5M 내지 1.0M로 제어하여, 이온강도의 변화에 의한 불완전 용출 또는 벡터의 비활성화를 방지한다.
본 발명의 세 번째 방면에서, CRS 완화 약물의 제조에 있어서의 상기 벡터의 용도를 제공한다.
기존기술에 비해, 본 발명은 하기 유익한 효과를 갖고 있다.
본 발명의 IL6 신호펩타이드, 인간 IL6R의 단쇄항체, IRES 리보솜 결합서열, 인간유래항체 Fc단편, 인간 EF1α 프로모터, CD8 leader 키메라 수용체 신호펩타이드, CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, Optimal Linker C, CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, CD137 키메라 수용체 공동자극인자, TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역을 재조합 렌티바이러스 벡터에 넣어 구축하며, 인간 EF1α 프로모터로 전체 CAR 유전자 발현을 구동시킨다. CAR 단백질은 세포막 표면에 위치하여, CD19 항원을 인식하며, T세포 증식과 사이토카인 분비를 자극하여, 다운스트림 신호 전달경로의 발현을 활성화시킨다. scfv 영역과 CD19 항원이 결합할 경우, 신호는 키메라 수용체를 통해 세포 내로 전달되며, 이로써 T세포 증식, 사이토카인 분비증가, 항 세포사멸 단백질 분비 증가, 세포사멸 지연, 표적세포의 용해를 포함한 일련의 생물학적 효과를 일으킨다. IRES 리보솜 결합 서열에 의해 IL6RscFv와 Fc의 융합단백질을 동시에 발현시키며, IL6 신호 펩타이드의 유도 하에 세포 밖으로 분비되며, IL6R와의 결합을 통해 IL-6와 IL6R의 결합을 차단시켜, 이로써 IL6의 신호 경로를 차단하여, CRS 억제 효과를 얻는다.
본 발명에서 이용하는 IL6R의 차단방법은, 2세대 또는 3세대 CAR 디자인 방안에 응용할 수 있다. 3세대 CAR 디자인은 2세대 디자인에 비해, CD28 키메라 수용체 공동 자극인자(서열번호 28)를 증가하였으며, 문헌에 따르면, 더 강한 신호 증폭 작용을 갖고 있다고 보고하였다[Eleanor J. Cheadle, et al. CAR T cells: driving the road from the laboratory to the clinic. Immunological Reviews 2014. Vol. 257: 91-106].
본 발명에 사용된 렌티바이러스 벡터 컬럼정제 시스템(도 7에 도시됨)은, 본 출원인이 개발한 렌티바이러스 대형 생산공정이다(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시). 일반적으로 사용되는 초원심분리 방법 또는 고속원심분리 방법은 원심분리 침강의 원리를 이용하여 렌티바이러스 입자를 분리하는 것이며, 필연적으로 비슷한 침강계수를 갖는 많은 불순물이 남아 있어 후속 실험에 부정적 효과를 가져오게 된다. 또한, 튜브 적재 공정이 복잡하고, 작업이 번거롭고, 여러 차례의 용기 전환으로 인해 더 많은 오염 기회를 가져온다. 그러나, 본 회사에서 개발한 렌티바이러스 벡터 컬럼의 정제 과정은 반자동화 조작이며, 100레벨 실험구역에서 전체 공정이 완료되어, 수동 조작의 번거로움， 실수 및 오염 확률을 방지하며, 회수된 렌티바이러스 벡터는 내독소, 마이코플라즈마, 숙주DNA 잔류 등 표준에서 임상기준에 완전히 도달하였다. 후속 조치를 통해 완전 자동화된 정제 장비를 개발할 수 있다.
본 발명에 사용된 CAR 디자인은 2세대 렌티바이러스 벡터 구조에도 적용될 수 있다 (2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시). 2세대 및 3세대 렌티바이러스 벡터간의 구조적 차이는(도 2B에 도시된 바와 같이), 주로 3세대 렌티바이러스 벡터가 2세대 벡터 5'LTR의 U3 영역을 RSV 프로모터로 대체한 것이며, 이로써 U3 전사시 Tat 단백질에 대한 의존성을 제거함으로써 렌티바이러스 구조 유전자에서 Tat 서열을 제거할 뿐만 아니라, 렌티바이러스 게놈의 전사 레벨 및 전사 지속성을 제고시켰다. 2세대와 3세대 렌티바이러스 벡터에 있어서 주로 게놈의 전사 방식이 다르며, 따라서 본 발명에서 사용된 CAR 디자인은 이 두 세대의 렌티바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 벡터 백본은 바람직하게 3세대 렌티바이러스 벡터이며(도 2A에 나타낸 바와 같이)(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시), 3'SIN LTR은 U3영역을 제거하여, 렌티바이러스 벡터의 자기 복제 가능성을 제거하여 안전성을 크게 향상시켰다. cPPT 및 WPRE 엘리먼트의 증가를 얻었으며, 형질전환 효율 및 형질전환 유전자의 발현 효율을 향상시켰다. RSV 프로모터를 이용하여 렌티바이러스 패키징(lentiviral vector packaging) 과정에서 코어(core) RNA의 전사를 지속적이고 효과적으로 유지할 수 있도록 하며, 인간의 EF1α 프로모터를 사용하여, CAR 유전자가 인체 내에서 장시간 지속적으로 발현될 수 있게 하였다.
본 출원인에 의해 개발된 3세대 렌티바이러스 백본 플라스미드(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시)는 강화된 WPRE 엘리먼트를 사용하며, 펜실베이니아 대학 Carl H. June 등Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptormodified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011;365:725-33.)이 사용한 WPRE 엘리먼트에 비해, 6개의 뉴클레오타이드 향상 돌연변이(g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T)가 존재하며, 일차 전사 생성물의 폴리아데닐화를 향상시키고, 세포 내 mRNA의 함량을 증가시키며, 형질전환 유전자의 발현 효율을 향상시킬 수 있다.
본 출원에서 사용한 렌티빌(Lentiva) 패키징 시스템은 헬퍼 바이러스가 없는 4개의 플라스미드 패키징 시스템이며(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시), 네 가지 플라스미드를 통해 공동으로 HEK293T/17세포에 형질 주입되어, 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성한다. 재조합 후의 렌티바이러스 벡터는 복제 결핍형 벡터이며, 외래 단편을 숙주 유전자에 통합시켜 일차적으로 사용할 수 있으며, 복제 및 증식을 진행할 수 없어 안전성이 크게 제고되었다.
본 발명에서 사용한 것은 IL-6R 단쇄 항체 차단기술이며, 단쇄 항체(single chain antibody fragment，scFv)는, 항체 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 15 내지 20개의 아미노산의 짧은 펩타이드(링커, linker)를 통해 연결되어 형성된다. ScFv는 항원에 대한 친화 활성을 잘 유지할 수 있으며, 분자량이 작고, 투과력이 강하며 항원성이 약한 등 특징을 갖고 있다. 본 발명에서 사용하는 인간IL6R 차단 단쇄 항체 디자인에 있어서, T세포에서 효과적으로 과발현될 수 있으며 세포밖으로 분비할 수 있으며, IL-6과 IL6R의 결합을 효과적으로 차단할 수 있으며, IL6신호 경로의 활성화를 차단할 수 있으며, T세포 사멸 실험에서, QPCR 검출은 PBMC에서 C- 반응성 단백질의 mRNA의 전사 수준을 효과적으로 억제 할 수 있고, 세포 배양 상층액에서 C-반응성 단백질의 함량을 감소시키며, IL-6R 차단 효과 평가 실험을 통해 본 발명의 벡터가 IL-6 신호 전달 경로를 생체 내에서 억제하여, CRS의 증상을 경감시키고 완화할 수 있음을 증명하였다.
본 발명에서 사용한 scFv 단편과 항체 Fc 단편은 모두 인간화 개조를 거쳐, 체내의 인간 항 마우스 항체（Human anti-mouse antibodies, HAMA）의 생성을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, scFv의 반감기와 작용효과를 제고시킬수 있다.
본 발명에서 사용한 scfv 단편의 링커 디자인(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시)은, 사이토카인의 분비, CAR-T세포의 체외 살상작용 및 임상치료 효과를 현저히 제고시킬 수 있다.
본 발명에서는 IL6R scFv의 작용방식(도 1B에 나타낸 바와 같이)을 사용하였다. 우선, 원가를 절감하여 항체 약물을 구매하는 비싼 비용을 절약하였다. 두 번째로, 체내에서 scFv 유전자의 전달 효율이 낮은 문제를 피하였다. 세 번째로, 렌티 바이러스로 형질도입 된 IL6R scFv 유전자를 통해, 세포 내 단백질 번역 시스템을 효과적으로 이용하여, 상응한 IL6R scFv를 대량 발현시켜, 체액순환을 통해, 양호한 IL6R 차단 효과를 얻었다. 본 발명에서는 일련의 IL6R항체의 유전자 서열, 아미노산 서열 등 생물학 정보방면의 정보를 선별하여, IL6R scFv의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 예측하였으며, IL6R scFv 조합의 이차구조 및 물리화학적 성질을 분석하였으며, 가용성 발현 및 간접적 ELISA법을 통해 IL6R scFv의 친화력 상수를 측정하였으며, 그 중에서 3가닥의 scFv를 선택하여 세포기능 레벨을 검출하여, 최종적으로 IL6RscFv1이 최선의 선택임을 확정하였으며, 미래에 임상연구 단계에 진입할 수 있다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 백본은 서로 다른 치료성 유전자를 탑재하여, 입양성 세포치료 영역에 널리 사용할 수 있으며, IL6R scFv 유전자의 탑재는 IL6R의 차단에 사용되었다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 인간 T림프구 세포에서의 CD19 키메라 항원 수용체의 발현을 실현할 수 있으며, T림프구 세포가 CD19 양성세포에 대한 살상작용을 유도하고 활성화시켰으며, 임상에서 B임파세포 백혈병, B림프종 및 다발성 골수종의 치료에 사용할 수 있다. 인간 T림프구 세포 내 인터류킨-6수용체(IL-6R)의 scFv를 발현시켜, IL6R을 효과적으로 차단시켜，IL-6 신호 경로를 차단하였으며, 임상에서 사이토카인 방출 증후군 CRS의 완화에 사용된다. 따라서, 본 발명에서는 저 원가 방법을 통해 CRS의 발생을 제어하거나 완화시키는 동시에 CAR-T 치료 효과에 영향주지 않아, 본 분야의 기술적 문제를 해결하였으며, 예상치 못한 기술적 효과를 얻었다.
본 발명의 상기 IL-6R 단쇄 항체의 발현 카셋트 및 그의 유전자의 발현 산물은 급성 B림프성 백혈병(ALL)에서 CRS 증상을 제거하거나 경감시키는 CAR19-T（CD19-CAR-T）치료에 적용할뿐만 아니라, 췌장암, 신경교종, 골수종 등과 같은 모든 유형의 종양의 CAR-T 치료로 인한 CRS 증상을 완화시키는데 사용될 수 있으며, 심지어 기타 유형의 치료로 인한 CRS 의 완화에 적용할 수 있다.
도 1A는 본 발명의 IL-6 신호 전달 경로의 개략도이다.
도 1B는 본 발명의 IL6R scFv 작용방식 개략도이다.
도 2는 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 구조 개략도이다. 그 중, 도 2A는 본 발명에서 사용한 3세대 렌티바이러스의 구조 개략도이며, 도 2B는 2세대와 3세대 렌티바이러스의 구조 비교도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 구축한 본 발명의 상기 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조 흐름도이다. 그 중, 도 (A)는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 구조 개략도이다. 도 (B)는 pCAR19-Basic2 플라스미드의 개략도이다. 도 (C)는 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2, pCAR19-IL6RscFv3, pCAR19-scFv0 플라스미드의 개략도이다. 도 (D)는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP-의 구조 개략도이다. 도 (E)는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-R의 구조 개략도이다. 도 (F)는 막 단백질 pEnv-G의 구조 개략도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1의 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 도 4A는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 효소 절단 예측 개략도이다. 그 중, lane1은 pLenti-3G Basic2의 Cla I+BamH I 효소 절단 예측이며, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 5854bp이며; lane 2는 1kb DNA ladder Marker 예측이며, 위로부터 아래로 밴드가 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5 kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; 도 4B는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 그 중, lane1은 pLenti-3G Basic2의 Cla I+BamH I효소 절단 전기영동 결과이며, lane2는 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예 1의 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-Basic2의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 도 5A는 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-Basic2의 효소 절단 예측 개략도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5 kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며, lane2는 pCAR19-Basic2의 Nde I+Hpa I효소 절단 예측이며, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 6511bp, 2014bp이며, 도 5B는 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-Basic2의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동결과이며, lane2는 pCAR19-Basic2의 Nde I+Hpa I효소 절단 전기영동 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2 및 pCAR19-IL6RscFv3의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 도 6A는 pCAR19-IL6RscFv1의 효소 절단 예측도이며. 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이고, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCAR19-IL6RscFv1의 ApaL I 효소 절단 예측이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 4230bp, 2137bp, 1726bp, 1246bp, 1054bp, 497bp이며; 도 6B는 pCAR19-IL6RscFv1의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane2는 pCAR19-IL6RscFv1의 ApaL I효소 절단 전기영동 결과이며; 도 6C는 pCAR19-IL6RscFv2의 효소 절단 예측도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb,3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCAR19-IL6RscFv2의 Kpn I효소 절단 예측이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 8335bp, 2555bp이며; 도 6D는 pCAR19-IL6RscFv2의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며; lane2는 pCAR19-IL6RscFv2의 Kpn I효소 절단 전기영동결과이며; 도 6E는 pCAR19-IL6RscFv3의 효소 절단 예측도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCAR19-IL6RscFv3의 Pvu II효소절단 예측이며; 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 7703bp, 2364bp, 823bp이며; 도 6F는 pCAR19-IL6RscFv3의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중 lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane2는 pCAR19-IL6RscFv3의 Pvu II효소 절단 전기영동 결과이며; 도 6G는 pCAR19-scFv0의 효소 절단 예측도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCAR19-scFv0의 Sac II 효소절단 예측이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 5577bp, 3835bp, 895bp, 347bp이며; 도 6H는 pCAR19-scFv0의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane2는 pCAR19-scFv0의 Sac II효소 절단 전기영동 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 재조합 렌티바이러스 벡터의 정제 흐름도이다.
도 8은 본 발명의 실시예 2의 재조합 렌티바이러스 벡터의 역가검출 결과의 개략도이다.
도 9는 본 발명의 실시예 2의 재조합 렌티바이러스 벡터의 부동한 정제방법에 따른 마이코플라즈마의 검출 결과 개략도이다. 그 중, lane1은 DL2000 marker이며. 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 2kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp이며; lane2는 양성 대조군이며; lane3은 음성 대조군이며; lane4는 PBS이며; lane5는 물이며; lane6은 lvCAR19-IL6RscFv1이며; lane7은 lvCAR19-IL6RscFv2이며; lane8은 lvCAR19-IL6RscFv3이며, lane9는 lvCAR19-scFv0이다.
도 10은 본 발명의 실시예 3의 mRNA 상대적 발현량을 나타내는 막대그래프이며, 그 중, 도 10A는 RT-QPCR 결과 개략도이며, CAR 유전자가 PBMC세포내에서 고 효율적으로 전사함을 나타낸다. 도 10B는 RT-QPCR 결과 개략도이며, scFv 유전자가 PBMC세포내에서 고 효율적으로 전사함을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 실시예 3의 CAR 단백질 발현양의 WB 검출도이며, CAR 단백질은 PBMC세포 내에서 고 효율적으로 발현됨을 나타내며, 도 11A에서, M은 단백질 Marker이며, lane1은 PBMC블랭크 세포이며, lane2는 대조 바이러스 MOCK이며, lane3은 lvCAR19-IL6RscFv1이며, lane4는 lvCAR19-IL6RscFv2이며, lane5는 lvCAR19-IL6RscFv3이며, lane6은 lvCAR19-scFv0이며, 도 11B는 beta-actin 참조 밴드이다.
도 12는 본 발명의 실시예 3에서 scFv 단백질 발현 양의 ELISA 검출 결과도이며, 결과는 scFv 단백질이 PBMC세포에서 고 효율적으로 발현됨을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 실시예 3에서 재조합 렌티바이러스 벡터로 형질전환된 PBMC를 부동한 감염다중도 조건하에서 공동 배양하여, 24시간 후 표적 세포에 대한 사멸 상황을 검출한 개략도이다.
도 14는 본 발명의 실시예 3에서 부동한 주효세포가 각각 표적세포와의 공동 배양조건하에, 12시간 mRNA 전사 레벨의 변화 상황의 개략도이다.
도 15는 본 발명의 실시예 3에서 부동한 그룹의 상청액을 12시간 배양한 후, PBMC에서 CRP mRNA 전이 레벨의 변화 상황 개략도이다.
아래 구체적인 실시형태를 결합하여 본 발명을 더 한층 설명하고자 한다. 하기 특정된 실시형태는 예를 드는 방식으로 나타내며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위를 이탈하지 않는 상황에서, 본 발명의 주요 특징은 각종 실시양태에 사용할 수 있다.
실시예 1 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조
1. 재료
1) 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G, HEK293T/17세포, 동종 재조합 효소는 스오우(상하이)생물의약과학기술유한회사((Shanghai)BIO-PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.)에서 제공하였다.
2) 프라이머: 프라이머 디자인 원칙에 따라 DNA 단편과 표적 부위의 증폭에 필요한 프라이머를 고안하였으며, 상기 프라이머는 상하이 생물회사에서 합성하였다. 구체적으로 하기와 같다.
EF1α-F：5'-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3' (서열번호 29)
EF1α-R：5'-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3' (서열번호 30)
CD8 leader-F：5'-ggtgtcgtgaggatccgccaccatggccttaccagtgaccgc-3'
(서열번호 31)
CD8 leader-R：5'-GTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTG-3'(서열번호 32)
VL-F：5'-cacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatc-3'(서열번호 33)
VL-R：5'-TGTGATCTCCAGCTTGGTCC-3'(서열번호 34)
OLC-VH-F：5'-caagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcg
ggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtca-3'(서열번호 35)
VH-R：5'-TGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3'(서열번호 36)
CD8 Hinge-F：5'-AGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCC-3'(서열번호 37)
CD8 Hinge-R：5'-GTAGATATCACAGGCGAAGTCCA-3'(서열번호 38)
CD8 Transmembrane-F：5'-cgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggc-3'(서열번호 39)
CD8 Transmembrane-R：5'-TCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTG- 3'(서열번호 40)
CD137-F：5'-aaacggggcagaaagaaactc-3'(서열번호 41)
CD137-R：5'-TGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3'(서열번호 42)
TCR-F：5'-agagtgaagttcagcaggagcg-3'(서열번호 43)
TCR-R：5'-GGAGAGGGGCGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGC-3'(서열번호 44)
IRES-F：5'-GCCCTGCCCCCTCGCTAAGCCCCTCTCCCTCCCC-3'(서열번호 45)
IRES-R：5'- CCAGGGAGAAGGCAACTGGACCGAAGGCGCTTGTGGAGAAGGAGTTC
ATGGTGGCATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGA -3'(서열번호 46)
IL6Rs1-F：5'-GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCAGACATCCAGATGACCCAGAG -3'(서열번호 47)
IL6Rs1-R：5'- GCAGCTTTTCGGTTCTGAGGAGACTGTGACGAGGCT -3'(서열번호 48)
IL6Rs2-F：5'-GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCAGAAATTGTGATGACCCAGAG -3'(서열번호 49)
IL6Rs2-R：5'-GCAGCTTTTCGGTTCGCTGCTCACGGTCACGGTGGT -3'(서열번호 50)
IL6Rs3-F：5'- GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCAGATATTCAGATGACCCAGAG -3'(서열번호 51)
IL6Rs3-R：5'- GCAGCTTTTCGGTTCGCTGCTCACGGTCACGGTGGT -3'(서열번호 52)
s0-F：5'- GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCATTGTTCTGGATTCCTGCTTCCA -3'(서열번호 53)
s0-R：5'- GCAGCTTTTCGGTTCTGCAGAGACAGAGACCAGAGT -3'(서열번호 54)
Fc-F：5'- GAACCGAAAAGCTGCGATAAAAC -3'(서열번호 55)
Fc-R：5'- CTAGCAATCTAGAGGTTATTTGCCCGGGCTCAGGCTCA -3'(서열번호 56)
WPRE-QPCR-F：5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(서열번호 57)
WPRE-QPCR-R：5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(서열번호 58)
Actin-QPCR-F：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'(서열번호 59)
Actin-QPCR-R：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'(서열번호 60)
CAR-QPCR-F：5'-GACTTGTGGGGTCCTTCTCCT-3'(서열번호 61)
CAR-QPCR-R：5'-GCAGCTACAGCCATCTTCCTC-3'(서열번호 62)
IL6-QPCR-F：5'-GGATTCAATGAGGAGACTT-3'(서열번호 63)
IL6-QPCR-R：5'-ATCTGTTCTGGAGGTACT-3'(서열번호 64)
CRP-QPCR-F：5'- GACATTGGAAATGTGAACATGT-3'(서열번호 65)
CRP-QPCR-R：5'- CACAGCTGGGGTTTGGTGA-3'(서열번호 66)
Fc-QPCR-F：5'- GACATTGGAAATGTGAACATGT-3'(서열번호 67)
Fc-QPCR-R：5'- CACAGCTGGGGTTTGGTGA-3'(서열번호 68)
3) 서열번호 12 내지 서열번호 68로 표시된 DNA 서열은 상해제루이생물공정유한회사(Shanghai Generay Biotech Co, Ltd.)에서 합성하였으며, 뉴클레오티드 건조분말 또는 플라스미드 형식으로 보존된다.
4) 도구 효소 Nde I, Hpa I, Pvu II, Sac II, ApaL I, BamH I, Kpn I, Cla I, T4 DNA 연결효소는 모두 NEB회사에서 구매하였다.
5) 고 충실도 효소 PrimeSTAR, RN는 Takara회사에서 구매하였다.
6) 0.22μm 내지 0.8μm PES 필터는 millipore회사에서 구매하였다.
7) 플라스미드 추출 키트 및 아가로스 겔 회수 키트는 모두 MN회사에서 구매하였다.
8) 수용성 세포TOP10은 tiangen회사에서 구매하였다.
9) NaCl, KCl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4, Trypsin, EDTA, CaCl2, NaOH, PEG6000 모두 상하이 생공(上海生工)에서 구매하였다.
10) Opti-MEM, FBS, DMEM, 1640, Pen-Srep, Hepes은 invitrogen회사에서 구매하였다.
11) Biotinylated protein L, proteinG-HRP은 GeneScript회사에서 구매하였다.
12) 겨자무과산화효소로 표식한 2차항체, DAB 작업용액은 모두 베이징 쭝싼진쵸우에서 구매하였다.
13) ECL+plusTM Western blotting system은 Amersham회사에서 구매하였다.
14) DNeasy키트는 상하이 제루이회사(上海捷瑞公司)에서 구매하였다.
15) 림프 세포 분리액은 썬쩐 다커웨이회사(Shenzhen Dakewe Biotech Co., Ltd)에서 구매하였다.
16) phycoerythrin(PE)-conjugated streptavidin은 BD Bioscience회사에서 구매하였다.
17) SA-HRP, TMB기질 용액, ELISA 반응정지용액은 상하이 이성회사(上海翊加公司)에서 구매하였다.
18) 마이코플라즈마 검사키트, 내독소 검사키트, CD19+K562 세포는 스오우(상하이)회사에서 구매하였다.
19) LDH 테스트 키트는 promega회사에서 구매하였다.
2. 재조합 렌티바이러스 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0의 구축방법
도 3을 참조로 하면, 본 발명의 상기 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조방법은 하기와 같다.
1) 인간 EF1α 프로모터, CD8 leader 키메라 수용체 신호펩타이드, CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, Optimal Linker C, CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, CD137 키메라 수용체 공동자극인자, TCR 키메라 수용체 T세포 활성화영역 단편을 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2에 클로닝하여, 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-Basic2를 얻으며, 다시 scFv 단편과 Fc 단편을 각각 pCAR19-Basic2에 연결시켜, IL-6R 차단 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2, pCAR19-IL6RscFv3 및 대조 pCAR19-scFv0을 얻었다.
(1) 렌티바이러스 플라스미드 pLenti-3G Basic2를, Cla I와 BamH I 제한효소를 사용하여 이중 효소 절단을 하며, 생성물은 1.5%의 아가로스 겔 전기영동을 통해5854bp의 단편 V1을 확인하였으며(도 4에 표시), 겔을 회수하여 Eppendorf 튜브에 넣고, MN회사의 아가로스 겔 추출키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure pct00001
표 1 아가로스 겔 회수 단계
(2）프라이머 EF1α-F와 EF1α-R를 사용하여, 합성된 서열번호 12를 주형으로, 표 2의 반응계를 이용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 1208bp의 단편a를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure pct00002
표 2 50 μl PCR 반응계
(3) 프라이머 CD8 leader-F와 CD8 leader-R를 사용하고, 합성된 서열번호 13을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 101bp의 단편 b를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(4) 프라이머 VL-F와 VL-R를 사용하고, 합성된 서열번호 14를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 336bp의 단편 c를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(5) 프라이머 OLC-VH-F와 VH-R를 사용하고, 합성된 서열번호 16을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 421bp의 단편 d를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(6) 프라이머 CD8 Hinge-F와 CD8 Hinge-R를 사용하고, 합성된 서열번호 17을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 147bp의 단편 e를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(7) 프라이머 CD8 Transmembrane-F와 CD8 Transmembrane-R를 사용하고, 합성된 서열번호 18을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 100bp의 단편 f를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(8) 프라이머 CD137-F와 CD137-R를 사용하고, 합성된 서열번호 19를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 142bp의 단편 g를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(9) 프라이머 TCR-F와 TCR-R를 사용하고, 합성된 서열번호 20을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 355bp의 단편 h를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(10) 각각 1μl의 DNA 단편 b, c, d를 주형으로 하고, 표 3의 반응계를 사용하였으며, 프라이머를 제외한 것을 Eppendorf 튜브에 넣었다. PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ6cycle이며, 프라이머 CD8 leader-F/VH-R을 첨가하고,（98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 40sec）ⅹ24cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 814bp의 단편 i를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure pct00003
표 3 50 μl 중첩 PCR 반응계
(11) 각각 1μl의 DNA 단편 e, f, g, h를 주형으로 하고, 표 3의 반응계를 사용하였으며, 프라이머를 제외한 것을 Eppendorf 튜브에 넣었다. PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ6cycle이며, 프라이머CD8 Hinge-F/TCR-R을 첨가하고, (98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ24cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 704bp의 단편 j를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(12) 토탈 5μl의 DNA 단편 V1, a, i, j를, 1:1:1:1의 몰비로 Eppendorf 튜브에 첨가하고, 15μl의 동족 재조합 효소 반응액을 첨가하였으며, 균일하게 혼합 후 42℃에서 30분 동안 배양하고 얼음 위에 전이시켜 2 내지 3분 동안 놓아두었으며, 반응액을 50μl TOP10에 넣고 천천히 회전시켜 내용물을 균일하게 혼합시키고, 얼음에 30분간 놓아두었으며, 튜브를 42℃로 예열한 온수욕에 넣고 90초 동안 열 충격을 진행한 후 튜브를 빠르게 빙욕에 전이시키고 세포를 2 내지 3분 동안 냉각시켰으며, 튜브 당 900 μl LB 배양액을 가한 후, 튜브를 37℃의 진탕기로 전이시켜 1시간 동안 배양하여 세균이 소생하도록 하고, 100μl의 전환된 균액을 취하여 Amp LB 아가로스 플레이트에 도포하고, 플레이트를 거꾸로 하여, 항온 배양기에서 37℃하에 16시간동안 배양하였다. 클론을 취하여 군락 PCR 동정을 진행하여, 정확한 콜로니, 즉 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-Basic2를 동정하였으며, 정확한 콜로니에 대해 효소 절단 동정을 진행하였다(도 5를 참조).
(13) 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-Basic2에 대해, Sal I와 Nhe I 제한효소를 사용하여 이중 효소 절단을 진행하며, 생성물은 1.5%의 아가로스 겔 전기영동을 통해 8491bp의 단편 V2을 확인하였으며, 겔을 회수하여 Eppendorf 튜브에 넣고, MN회사의 아가로스 겔 추출키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(14) 프라이머 IRES-F와 IRES-R을 사용하며, 합성한 서열번호 25를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 605bp의 단편 k를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(15) 프라이머 IL6Rs1-F와 IL6Rs1-R을 사용하며, 합성한 서열번호 21를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 754bp의 단편l를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(16) 프라이머 IL6Rs2-F와 IL6Rs2-R을 사용하며, 합성한 서열번호 22를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 777bp의 단편 m을 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(17) 프라이머 IL6Rs3-F와 IL6Rs3-R을 사용하며, 합성한 서열번호 23을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 774bp의 단편 n을 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(18) 프라이머 s0-F와 s0-R을 사용하며, 합성한 서열번호 24를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 729bp의 단편 o를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(19) 프라이머 Fc-F와 Fc-R을 사용하며, 합성한 서열번호 27를 주형으로, 표2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 726bp의 단편 p를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(20) 토탈 5μl의 DNA 단편（V2, k, l, p）, （V2, k, m, p）, （V2, k, n, p）, （V2, k, o, p）를, 1:1:1:1의 몰비로 Eppendorf 튜브에 첨가하고, 15μl의 동족 재조합 효소 반응액을 첨가하였으며, 균일하게 혼합 후 42℃에서 30분 동안 배양하고 얼음 위에 전이시켜 2 내지 3분 동안 놓아두었으며, 반응액을 50μl TOP10에 넣고 천천히 회전시켜 내용물을 균일하게 혼합시키고, 얼음에 30분간 놓아두었으며, 튜브를 42℃로 예열한 온수욕에 넣고 90초동안 열 충격을 진행한 후 튜브를 빠르게 빙욕에 전이시키고 세포를 2 내지 3분 동안 냉각시켰으며, 튜브 당 900 μl LB 배양액을 가한 후, 튜브를 37℃의 진탕기로 전이시켜 1시간 동안 배양하여 세균이 소생하도록 하고, 100μl의 전환된 균액을 취하여 Amp LB 아가로스 플레이트에 도포하고, 플레이트를 거꾸로 하여, 항온 배양기에서 37℃하에 16시간동안 배양하였다. 콜로니를 취하여 군락 PCR 동정을 진행하여, 정확한 콜로니, 즉 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2, pCAR19-IL6RscFv3 및 대조 pCAR19-scFv0을 동정하였으며, 정확한 콜로니에 대해 효소 절단 동정을 진행하였다(도 6을 참조).
2. 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0의 패키징
(1) 완전배지: 예열된 신선한 배지를 취하여, 10%FBS +5ml Pen-Srep를 가하고, 상하로 전도시켜 균일하게 혼합하였다.
(2) 1XPBS용액：NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g를 계량하여, 1000ml 비커에 넣고, 900ml Milli-Q grade 초순수를 넣어 용해시키고 용해가 끝난 후, 1000ml 메스실린더를 이용하여 1000ml로 정량하였으며, 121℃ 고온에서 습열 멸균을 20분 동안 진행하였다.
(3) 0.25% Trypsin용액: Trypsin 2.5g, EDTA 0.19729g을 계량하여 1000ml 비커에 넣고, 900ml 1XPBS를 가하여 용해시켰으며, 용해가 끝난 후, 1000ml 메스실린더로 1000ml로 정량하였으며, 0.22μM 여과시켜 균을 제거하였으며, 장기적으로 사용할 시 -20℃ 냉장고에 보관하였다.
(4) 0.5M CaCl2용액: 36.75g CaCl2를 계량하고 400ml Milli-Q grade 초순수로 용해시켰으며, Milli-Q grade 초순수로 총 체적을 500ml로 정량하고 균일하게 혼합하였다. 0.22μm 여과하여 균을 제거하고 50ml 원심분리 튜브에 분주하였으며, 튜브 당 45ml정도이고, 4℃에 보존하였다.
(5) 2XHBS용액: 4.09g NaCl, 0.269g Na2HPO4, 5.96g Hepes를 계량하고, 400ml Milli-Q grade 초순수로 용해시키고, pH기를 보정한 후, 2M NaOH 용액으로 HBS용액의 pH를 7.05로 조절하였다. 튜브 당 HBS의 PH를 조절하는데 2M NaOH를 3ml정도 소모하였다.
(6) 액체질소탱크에서 냉동 보존된 HEK293T/17세포를 취하여 신속히 37℃ 수욕으로 전이하였으며, 1 내지 2분 후 슈퍼클린벤치에 전이시켜, 무균 조작으로 냉동바이알 중의 액체를 전부 10cm2 배양 플레이트에 전이시키고, 10%FBS를 함유한 DMEM를 8mL/10cm2 dish로 보충하고, 24시간 후 현미경하에서 세포를 관찰하였으며, 세포포화 정도가 80%보다 클 경우 계대배양시켰다.
(7) 세포 상태가 양호하고, 오염이 없는 HEK293T/17세포를 선택하여, 2 내지 6개 배양접시를 한 조로 하여, 세포를 트립신 소화시킨 후, 전동 피펫으로 4 내지 12ml의 완전 배지를 취하고, 소화 후 배양접시마다 2ml를 가하였으며, 배양접시의 건조를 방지하였다. 1ml의 피펫으로 모든 세포를 단일 세포 현탁액으로 피펫팅하여, 배양 플라스크로 옮겼다.
(8) 상기 2 내지 6개의 배양접시 중의 잔존 세포를 배양 플라스크에 옮기고, 배지로 배양접시를 재차 세척하였다.
(9) 배양 플라스크의 뚜껑을 닫고 아래위로 10번 정도 뒤집어 흔들어 세포 현탁액을 균일하게 혼합하였으며, 세포를 8 내지 24개의 10cm2 배양접시에 전이시켰으며, 배양 접시 당 세포밀도는 약 4 Х 106개/10ml 완전 배지 정도였다. 세포밀도가 예상한 것 보다 차이가 많이 나면, 세포를 계수하여, 4Х106개/접시 양으로 접종하였다.
(10) 6개 배양접시를 쌓는데 상하접시의 배합에 주의를 해야 한다. 배양접시를 좌우, 전후로 여러 번 흔들어 세포가 충분히 도포되게 한 후, 5% CO2배양기에 넣었다. 나머지 세포도 동일하게 처리하였다.
(11) 계대 세포를 검사하였으며, 세포 포화도가 70 내지 80%여야 하며, 윤곽이 포만하고, 부착이 양호해야 하며, 세포 배양접시에 균일하게 분포되어야 한다.
(12) 세포를 위해 배양액을 교체하고, 배양접시를 신선한 완전배지로 대체하고, 접시 당 9ml이며, 배양기의 CO2농도 설정치를 8%로 향상시켰다.
(13) N+0.5에 따라 DNA/CaCl2용액을 제조하였다, 접시 당 HEK293T/17 세포의 형질주입 플라스미드 양은 하기 비율에 따라 사용한다. 재조합 렌티바이러스 플라스미드(20μg), pPac-GP (15μg), pPac-R (10μg), pEnv-G (7.5μg). 새로운 5ml 원심분리 튜브 한 개를 취하여, 0.5M CaCl2：0.25ml, 재조합 렌티바이러스 플라스미드 20μg: pPac-GP 15μg: pPac-R 10μg: pEnv-G 7.5μg를 가하고, 초순수를 보충하여 0.5ml되게 하며 뚜껑을 닫아, 충분히 균일하게 혼합하였다.
(14) 또 다른 5ml 원심분리 튜브 한 개를 취하여, 0.5ml DNA/CaCl2 용액을 가하였다. 볼텍스 믹스를 열고, 한 손으로 5ml 원심분리 튜브의 상단을 쥐어 튜브 하단이 믹서에 접속하게 하여, 액체가 튜브 벽에서 확산되어 유동하도록 하며, 다른 한 손으로 1mL 피펫을 쥐고 0.5mL 2ХHBS용액을 흡수하여 원심분리 튜브에 천천히 떨어뜨리면서 유속을 제어하며, 30초 동안 전부 떨어뜨리는 것이 적당하다. 2ХHBS를 가한 후, 지속적으로 5초 동안 진탕 시키며, 진탕이 끝나면 직접 형질주입이 필요한 세포에 가할 수 있다.
(15) 하나의 배양접시의 세포에, 원심분리 튜브 중의 1mL 칼슘 형질주입액을 떨어뜨렸으며, 될수록 칼슘 형질주입 시약이 전체 배양접시에 분포되도록 하였다.
(16) 칼슘 형질주입액을 가한 후, 배양접시에 표기를 해놓고, 배양접시를 다른 5% CO2 배양기에 넣었다. 배양접시가 수평으로 놓이게끔 확보하였으며, 6개 이상의 배양접시를 쌓지 말아야 한다. 5% CO2배양기에 6 내지 8시간 방치한다.
(17) 첫 번째 배양기의 CO2농도 설정치를 5%로 다시 돌려놓았다.
(18) 24시간 후, 세포 상태를 검사하였다. 세포 포화도가 약 80 내지 85%이며, 상태가 양호해야 한다. 배지를 흡수하여 버리고 10ml 새로운 DMEM 완전 배지로 교체하였다.
(19) 48시간 후, 형질주입 효율을 관찰하였다. 대부분의 세포는 여전히 벽에 부착하였다. 95%를 초과하는 세포가 모두 녹색형광을 갖고 있음이 발견되었다. 동일한 바이러스 패키징 상청액을 같이 수집하며, 배양접시에 10ml 신선한 배지를 계속 첨가하였다.
(20) 72시간 후, 다시 동일한 바이러스 상청액을 같이 수집하였으며, 두 번 수집한 바이러스를 함께 둘 수 있으며, 배양 접시를 버렸다. 이때 수집한 상청액에는 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0이 포함되어 있다.
실시예 2 재조합 렌티바이러스 벡터의 농축 및 검출
1. 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 정제된 재조합 렌티바이러스 벡터(도 7에 표시된 바와 같다)
(1) 수집한 상청액을 Thermo 진공펌프를 사용하여, 0.22μm 내지 0.8μm의 PES 필터로 흡인 여과하여 불순물을 제거하였다.
(2) 1.5M NaCl 250 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）를 1:1 내지 1:10의 비율로 상청액에 첨가하였다.
(3) 2개의 이온 교환 컬럼을 직렬로 배치하고, 4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）용액으로 컬럼을 순차적으로 통과시켰다.
(4) 단계 2에서 얻은 용액을 연동 펌프를 통해 1 내지 10 ml/분의 속도로 이온 교환 컬럼에 주입하였다.
(5) 모든 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 10ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）용액으로 1회 세척하였다.
(6) 시료 주입량에 따라 1 내지 5ml 1.5M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）를 사용하여 용출하였으며, 용출액을 수집하였다.
(7) 용출액을 25 내지 50μl당 한 개 튜브에 나누어 넣고, -80℃ 냉장고에 냉동 보관하여 장기간 보존하였다.
2. 적정농도 측정
(1) 24웰 플레이트를 사용하여 293T 세포를 접종하였다. 웰당 세포는 5Х104개이며, 첨가한 배지의 체적은 500ul이며, 서로 다른 종류의 세포성장속도에는 일정한 차이가 있으며, 바이러스 감염시 세포 포화도는 40% 내지 60%이다.
(2) 3개의 무균 EP 튜브를 준비하며, 튜브 당 90ul의 신선한 완전배지(고당 DMEM+10%FBS)를 가하여 세포를 접종한 24시간 후, 2개 웰의 세포를 취하여 혈구계수판으로 수량을 체크하여, 감염시 세포의 실제 수량을 확정하여, N로 표기하였다.
(3) 측정하려는 바이러스 원액 10μl를 제1튜브에 넣고 가볍게 흔들어 균일하게 혼합한 후, 10μl를 취하여 제2튜브에 넣었으며, 이렇게 마지막 튜브까지 순차적으로 조작하였다. 튜브 당 410μl 완전 배지(고당 DMEM+10%FBS）를 가하여, 최종 체적을 500ul로 하였다.
(4) 감염이 시작된 지 20시간 후, 배양 상청액을 제거하고, 500ul 완전 배지(고당 DMEM+10%FBS）로 교체하여, 5%CO2에서 48시간 지속적으로 배양하였다.
(5) 72시간 후, 형광 발현 상황을 관찰하였으며, 정상 조건하에, 희석배수의 증가에 따라 형광 세포수는 상응하게 감소되며, 이를 사진 찍었다.
(6) 0.2ml 0.25% 트립신-EDTA용액으로 세포를 소화시키고, 37℃에 1분동안 방치하였다. 배지로 전체 세포면을 세척하고 원심분리시켜 세포를 수집하였다. DNeasy 키트의 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 튜브 당 200μl 용출액을 가하여 DNA를 세척하고 정량화 하였다.
(7) 표적 DNA를 준비하여, qPCRmix 토탈 튜브Ⅰ를 측정하였다(QPCR 프라이머 서열은 서열번호 57---서열번호 58이다).
Figure pct00004
n = 반응수(number of reactions). 예를 들면: 총 반응수는 40이며, 1ml 2Х TaqMan Universal PCR Master Mix, 4μl forward primer, 4μl reverse primer, 4μl probe 및 788μl H2O를 혼합하였다. 진탕 후 얼음위에 놓았다.
(8) 참조 DNA를 준비하여 qPCRmix튜브Ⅱ를 검출하였다(QPCR 프라이머 서열은 서열번호 59---서열번호 60이다).
Figure pct00005
n = number of reactions. 예를 들면: 총 반응수는 40이며, 1ml 2Х TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10ХRNaseP primer/probe mix 및 700μl H2O를 혼합하였다. 진탕 후 얼음위에 놓았다.
(9) 사전에 냉각시킨 96웰 PCR 플레이트에서 PCR계를 제조하였다. 총 튜브Ⅰ에서 각각 45μl를 취하여 A 내지 D의 각 행의 웰에 넣고, 총 튜브Ⅱ에서 각각 45μl를 취하여 E 내지 G의 각 행의 웰에 넣었다.
(10) 5μ의 플라스미드 표준품과 테스트용 샘플 게놈 DNA를 취하여 각각 A 내지 D행에 가하고, 매개 샘플을 1차 반복하였다. 또 따로 웰 하나를 남겨 5μl의 물을 넣어 주형프리 대조로 하였다（no-template control）.
(11) 5μ의 게놈 표준액과 테스트용 샘플 게놈 DNA를 취하여 각각 E 내지 G행에 가하고, 매개 샘플을 1차 반복하였다. 또 따로 웰 하나를 남겨 5μl의 물을 넣어 주형프리 대조로 하였다（no-template control）.
(12) 정량적 PCR기는 ABI PRISM 7500 정량 시스템이다. 사이클링 조건은: 50℃ 2분, 95℃ 10분, 이어서 95℃ 15초, 60℃ 1분인 40개 사이클이다.
데이터 분석: 측정된 DNA 샘플 중 통합된 렌티바이러스 벡터 카피 수를 게놈 수를 사용하여 보정하여, 게놈 당 통합된 바이러스 카피 수를 얻었다.
적정농도（integration units per ml，IU ml-1）의 계산 공식은 하기와 같다.
IU ml1 = (C×N×D×1000)/V
그 중: C =게놈 당 통합된 평균 바이러스 카피 수
N = 감염 시 세포 수량（약 1Х105
D = 바이러스 벡터의 희석 배수
V = 첨가한 희석된 바이러스의 체적수
(13) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0의 적정농도 결과(도 8에 표시된 바와 같다)
3. 내독소 측정
(1) 내독소 작업 표준품은 15EU/대이다.
(2) 투구게 시약 감수성 λ＝0.25EU/ml, 0.5ml/튜브
(3) 내독소 표준품 희석: 내독소 표준품 한대를 준비하여, 각각 BET 용액으로 비율에 따라 4λ 및 2λ로 희석 용해하고, 밀봉 막으로 입구를 밀봉하고, 15분동안 진탕용해시켰다. 희석 시 한번 희석할 때마다 볼텍스 믹서기에서 30초동안 균일하게 혼합시켰다.
(4) 로딩: 투구게 시약 몇 개를 취하여, 개 당 BET용액 0.5ml를 가하여 용해시키고, 몇 개의 무 내독소 튜브에 분주하였으며, 튜브 당 0.1ml이다. 그 중 2개 튜브는 음성 대조튜브이며, BET용액을 0.1ml 가하였다.
2개 튜브는 양성 대조튜브이고, 2λ 농도의 내독소 작업 표준품용액 0.1ml를 가하였다.
2개는 샘플 양성 대조튜브이고, 0.1ml의 2λ 내독소 표준품 용액을 포함한 샘플용액(20배 희석한 테스트 샘플 1ml + 4λ의 내독소 표준품 용액 1ml=2ml의 2λ 내독소 표준품 용액을 포함한 40배 희석 샘플)을 가하였다.
샘플튜브에 0.1ml의 샘플을 가하며, 희석비율은 표 5를 참조로 하며, 37±1℃ 수욕(또는 배양기)에서 60±1min 보온시켰다.
Figure pct00006
표 5 내독소 희석비율 및 상응한 내독소 함량
(5) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0의 내독소 검출결과(표 6에 표시한 바와 같다), 내독소 함량이 0 내지 2.5 EU/ml이며, 요구에 부합된다.
Figure pct00007
표 6 렌티바이러스 재조합 바이러스의 내독소 검출결과
4. 마이코플라즈마의 검출 및 비교
(1) 실험 3일전, 세포 샘플을 무 항생제 배지에서 배양하였다.
(2) 1ml세포 현탁액（세포수는 1×105보다 크다）을 수집하여, 1.5ml 원심분리 튜브에 넣었다.
(3) 13000×g에서 1분 동안 원심분리하여, 침전을 수집하고, 배지를 제거하였다.
(4) 500ul PBS을 가하여, 피펫으로 피펫팅하거나 또는 볼텍스 믹스로 진탕시키고, 다시 현탁시켜 침전시켰다. 13000×g에서 5분 동안 원심분리하였다.
(5) 단계 4를 다시 한번 반복하였다.
(6) 50μl Cell Lysis Buffer을 가하고, 피펫으로 피펫팅하여 충분히 혼합한 후, 55℃ 수욕에서 20분 동안 배양하였다.
(7) 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하였다.
(8) 13000×g에서 5분 동안 원심분리한 후，5μl 상청액을 취하여 주형으로 하였으며, 25μl PCR의 반응계는: ddH20 6.5μl, Myco Mix 1μl, 2x Taq Plus Mix Master(Dye Plus) 12.5μl, 주형 5μl이다. PCR 사이클링 조건은：95℃ 30sec, （95℃ 30sec, 56℃ 30sec, 72℃ 30sec）×30cycle, 72℃ 5min이다.
(9) 마이코 플라즈마 검출 결과로부터(도 9에 표시한 바와 같다), 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0이 모두 마이코 플라즈마를 포함하지 않았음을 알 수 있다.
실시예 3 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0의 기능 측정
1. CAR 유전자의 세포 수준 발현 검출
(1) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0와 대조 바이러스 MOCK로 PBMC 세포를 감염시킨 후, 수집한 세포를 RT-PCR을 이용하여 CAR 유전자와 scFv 유전자의 mRNA 전사 수준을 검출하여, CAR 유전자와 scFv 유전자의 발현을 검증하였으며, CAR 유전자의 scFv 유전자의 mRNA의 전사 수준이 증가하면, CAR 유전자와 scFv 유전자의 전사 수준이 성공적으로 발현되었음을 설명한다.
(2) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0와 대조 바이러스 MOCK로 PBMC 세포를 감염시킨 후, 수집한 세포를 western blot을 이용하여 CAR 단백질의 발현 수준을 검출하여, CAR 유전자의 발현을 검증하였으며, CAR 단백질의 수준이 증가하면, CAR 유전자의 번역 수준이 성공적으로 발현되었음을 설명한다.
(3) 재조합 렌티바이러스 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0와 대조 바이러스 MOCK로 각각 PBMC세포를 감염시키고, 세포배양 상청액을 수집하여, ELISA를 진행하여 scFv 단백질의 발현 수준을 검출하였으며, scFv 유전자의 발현을 검증하였으며, scFv 단백질의 발현 레벨이 높아지면 scFv 유전자의 번역 레벨 발현이 성공하였음을 설명한다.
(4) MOI=15인 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0와 대조 바이러스 MOCK로 각각 세포를 감염시키고, 48시간 후에 6웰 플레이트에서 추출한 세포의 토탈 RNA 및 토탈 단백질에 대해 형광 정량적 PCR 및 면역 블랏팅 실험을 진행하였다. 구체적인 단계: 6웰 플레이트의 4웰을 코팅하고, 각 웰에 상응한 PBS 및 RN을 가하고, 4℃에서 하룻밤 지냈다. 12시간 후에 MOI=15로 바이러스를 코팅하고, 37℃ 배양기에 넣어 5시간 두었다. 6웰 플레이트를 취하여, 바이러스 상청액을 제거하고, PBS로 두 번 세척하고, 1Х106/웰로 PBMC (림프구 세포 분리액으로 인간 혈중에서 분리)로 코팅한 후, 500ul의 배지(10%혈청, 20U/ml IL-2, Polybrene 8ug/ml를 포함)를 넣었다. 20분 동안 방치하고, 1000g에서, 20℃에서 30분 동안 원심분리하고, 37℃에서 48시간 배양하였다.
(5) 6웰 플레이트에서 PBMC 세포의 토탈 RNA를 Trizol 방법으로 추출하고, cDNA를 역전사에 의해 증폭시켰으며, QPCR 프라이머(서열은 서열번호 61 내지 서열번호 62)와 scFv 유전자 QPCR 프라이머(서열은 서열번호 67 내지 서열번호 68)를 사용하여 형광 정량 PCR 실험을 진행하였으며, 반응계는 표 7을 참고로 하며, 참조Actin을 대조군으로 하여, mRNA의 전사 정황을 검증하였다.
Figure pct00008
표 7 20μl qPCR 반응계
(6) 웨스턴 블롯(Western Blot)은 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 통해 PBMC로부터 추출한 토탈 단백질을 상대적 분자량에 따라 분리하는 것이다. 습식 트랜스퍼(4℃, 400 mA, 120min)를 통해, 단백질을 PVDF막에 전이시켰다. 블로킹 용액(5% 탈지우유를 함유한 TBST 용액)으로 실온에서 PVDF막을 1시간 동안 블로킹하고, 블로킹 용액으로 1:1000으로 Biotinylated protein L을 희석한 후, 블로킹한 PVDF막으로 실온에서 배양하고 4℃에서 하룻밤을 지냈다. TBST로 막을 3번 세척하였으며, 매번 10분 동안 세척하였다. 블로킹 용액으로 1:500으로 상응한 SA-HRP를 희석하였으며, 실온에서 PVDF 막을 2시간 동안 배양하였으며, TBST으로 막을 3번 세척하였으며, 매번 10분 동안 세척하였다. Amersham회사의 ECL+plusTM Western blotting System 키트를 이용하여 현상하였다. X선 현상을 통해 밴드를 나타낸 필름을 얻었다.
(7) 효소면역분석법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)에서, 1:2, 1:5, 1:10로 희석한 세포 배양 상청액을 96웰 플레이트에 도포시키는 동시에 음성대조, 양성 대조 및 블랭크 웰을 설정하고 4℃에서 하룻밤을 지냈다. 다음날 3차례 세척하고, 반응 웰에 신선한 0.1ml의 1:10000로 희석한 proteinG-HRP를 넣고, 37℃에서 30 내지 60분 동안 배양하고, 세척하고, 마지막으로 정제수로 세척하였다. 반응 웰에 TMB 기질 용액 0.1ml을 넣고, 37℃에서 10 내지 30분 동안 배양하였다. 각 반응 웰에 ELISA 반응 정지액 0.05ml를 넣었다. 마이크로 플레이트 리더로, 405nm에서, 각 웰의 OD값을 구하였다.
(8) RT-QPCR 검출을 통해, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC를 감염시킨 후의 CAR 유전자와 scFv 유전자의 전사 수준이 블랭크 세포에 비해 현저히 제고됨을 확인하였으며(도 10에 표시된 바와 같이), 이는 CAR 유전자와 scFv 유전자의 전사 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
(9) 웨스턴 블롯((Western Blot)의 결과는, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC을 감염시킨 후, CAR단백질의 발현 레벨은 대조 바이러스 MOCK와 블랭크(blank) 세포에 비해 현저히 증가되었음을 표명하며(도 11에 표시된 바와 같이), CAR 유전자의 번역 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
(10) 효소면역측정법(ELISA)의 결과는, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC를 감염시킨 후 scFv 단백질의 발현 수준은 대조 바이러스MOCK와 블랭크 세포에 비해 현저히 증가되었으며(도 12에 표시된 바와 같이), 이는 scFv유전자의 번역 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
2. 세포 사멸 실험 효과 평가
(1) 각각 CD19+K562세포와 PBMC세포를 배양하였다.
(2) 실험 시작 4일전, MOI=15인 lvCAR19-IL6RscFv1， lvCAR19-IL6RscFv2， lvCAR19-IL6RscFv3，lvCAR19-scFv0 바이러스로 PBMC세포를 감염시키고, 72 내지 96h 배양한 후 실험을 시작할 수 있다.
(3) 표적세포（CD19+K562）4x105cells과 주효세포（lvCAR19-IL6RscFv1， lvCAR19-IL6RscFv2， lvCAR19-IL6RscFv3，lvCAR19-scFv0을 각각 PBMC 세포에 형질주입）2.8x106cells를 수집하였으며, 800g에서 6min 원심분리하여, 상청액을 제거하였다.
(4) 1ml 1xPBS용액으로 각각 표적세포와 주효세포를 다시 현탁시키기고, 800g에서, 6분동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다.
(5) 단계 3을 한번 반복하였다.
(6) 700ul배지（1640배지+10% FBS）로 주효세포를 다시 현탁시키고, 2ml배지（1640배지+10% FBS）로 표적세포를 다시 현탁시켰다.
(7) 주효세포와 표적세포의 비가 1:1, 5:1, 10:1인 실험 웰을 설정하였으며, 대조군을 설정하고, 군 당 3개 반복으로 하였다.
(8) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(9) 37℃ 5%CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다.
(10) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(11) 매개 웰에서 50μl의 상청액을 취하여, 새로운 96웰 플레이트에 넣고, 웰 당 50ul 기질 용액을 가하였다(빛 차단 조작).
(12) 빛을 차단하여 25분 동안 배양하였다.
(13) 매개 웰에 50ul 정지액을 가하였다.
(14) 마이크로 플레이트 리더로 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(15) 3개 반복 웰에서 평균치를 얻었다. 모든 실험 웰, 표적세포 웰 및 주효세포 웰의 흡광도 값에서 배지 배경 흡광도의 평균값을 뺐으며, 표적 세포의 최대치의 흡광도 값에서 체적 보정 대조 흡광도 값의 평균값을 감하였다.
(16) 단계 15에서 얻은 보정을 거친 값을 하기 공식에 대입하여, 매개 주효세포와 표적세포 비에서 생성된 세포독성 백분율을 계산하였다. 결과는 도 13에 표시된 바와 같이, lvCAR19-IL6RscFv1， lvCAR19-IL6RscFv2， lvCAR19-IL6RscFv3， lvCAR19-scFv0 재조합 렌티바이러스 벡터가 형질 도입된 PBMC세포는 몇 개의 주효세포와 표적세포의 비의 조건하에서 사멸 효율이 PBMC 블랭크 세포와 대조 바이러스에 비해 현저히 높았으며, 이는 scFv 유전자의 발현이 CAR 유전자의 기능에 대한 영향이 비교적 적음을 설명한다.
사멸 효율= （실험 웰주효세포 웰표적세포 웰）/（표적 세포의 최대 웰표적 세포 웰）X100%
3. IL-6R 차단 효과 평가(IL-6과 CRP mRNA전사 레벨)
(1) 각각 CD19+K562세포와 PBMC세포를 배양하였다.
(2) 실험 시작 4일전, MOI=15인 lvCAR19-IL6RscFv1， lvCAR19-IL6RscFv2， lvCAR19-IL6RscFv3， lvCAR19-scFv0 바이러스로 PBMC세포를 감염시키고, 72 내지 96h 배양한 후 실험을 시작할 수 있다.
(3) 표적세포（CD19+K562）4x105cells과 주효세포（lvCAR19-IL6RscFv1， lvCAR19-IL6RscFv2， lvCAR19-IL6RscFv3， lvCAR19-scFv0을 각각 PBMC 세포에 형질주입）2.8x106cells를 수집하였으며, 800g에서 6min 원심분리하여, 상청액을 제거하였다.
(4) 1ml 1xPBS 용액으로 각각 표적세포와 주효세포를 다시 한번 현탁시키고, 800g에서 6min 원심분리하여, 상청액을 제거하였다.
(5) 단계 4를 한번 반복하였다.
(6) 700ul배지（1640배지+10%FBS）로 주효세포를 다시 한번 현탁시키고, 2ml배지（1640배지+10%FBS）로 표적세포를 다시 현탁시켰다.
(7) 주효세포와 표적세포의 비가 10:1인 실험 웰을 설정하였으며, 대조군을 설정하였다.
(8) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(9) 37℃ 5%CO2 배양기에서 12시간 동안 배양하고, 1000xg에서 2분 동안 플레이트 원심분리하여, 세포를 수집하여 토탈 mRNA를 추출하였으며, cDNA 역전사를 거쳐, IL-6 mRNA 전사 레벨을 검출하였다.
(10) 상청에 블랭크 PBMC세포를 넣고, 계속하여 37℃ 5%CO2 배양기에서 함께 24시간 배양하였으며, 1000xg, 2분 동안 플레이트 원심분리하였으며, 세포를 수집하여 토탈 mRNA를 추출하였으며, cDNA 역전사를 거쳐, CRP mRNA 전사 레벨을 검출하였다.
(11) IL-6 유전자 QPCR 프라이머(서열은 서열번호 63 내지 서열번호 64)와 CRP 유전자 QPCR 프라이머(서열은 서열번호 65 내지 서열번호 66)를 사용하여 형광 정량 PCR 실험을 진행하였으며, 반응계는 표 6을 참고로 하며, 참조 Actin을 대조군으로 하여, mRNA의 전사 상황을 검증하였다.
(12) RT-QPCR 검출 결과에 따르면, lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0 형질 주입된 PBMC와 표적 세포를 배양한 후, IL-6 유전자의 mRNA 수준이 Mock 그룹과 블랭크 세포 그룹에 비해 현저히 높아졌으며, lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0 네개 그룹 사이의 IL-6 유전자의 mRNA 수준은 큰 차이가 없었다(도 14에 표시된 바와 같다). 그 후에 서로 다른 그룹의 상청 배양의 PBMC 세포 중 CRP 유전자의 mRNA 수준의 검출을 통해, lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3, lvCAR19-scFv0 3 그룹은 대조 바이러스 lvCAR19-scFv0 그룹에 비해, CRP mRNA 전사 수준이 현저히 감소되었으며, 그 중, lvCAR19-IL6RscFv1 그룹의 CRP 유전자의 mRNA 전사 수준의 감소가 가장 현저하였다(도 15에 표시된 바와 같이). 이는 lvCAR19-IL6RscFv1, lvCAR19-IL6RscFv2, lvCAR19-IL6RscFv3 그룹이 모두 IL-6 신호 경로를 효과적으로 차단함을 설명하며(그 중, lvCAR19-IL6RscFv1이 IL-6 신호 통로를 차단하는 효과가 제일 현저하다), 더 한층 임상에서 CRS를 효과적으로 완화시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Unicar-Therapy Bio-Medicine Technology Co., Ltd. <120> IL6R BLOCK CAR-T TRANSGENIC VECTOR FOR ALLEVIATING CRS,PREPARATION METHOD THEREOF,AND APPLICATION OF THE SAME <130> GBSHHY003 <150> PCT/CN2017/110654 <151> 2017-11-13 <150> 2016111033192 <151> 2016-12-05 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 1 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840 tcactgatta agcattggta a 861 <210> 2 <211> 674 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 2 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 60 ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 120 actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 180 gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 240 ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 300 gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 360 acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 420 tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 480 gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 540 cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 600 cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 660 ccttttgctc acat 674 <210> 3 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 3 atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60 tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120 ggcttttttg gaggcctaga cttttgc 147 <210> 4 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 4 gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 60 cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 120 tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 180 gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacg 228 <210> 5 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 5 ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60 tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120 gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180 <210> 6 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 6 tgctagagat tttccacact gactaaaagg gtctgaggga tctctagtta ccagagtcac 60 acaacagacg ggcacacact acttgaagca ctcaaggcaa gctttattga ggcttaagca 120 gtgggttccc tagttagcca gagagctccc aggctcagat ctggtctaac cagagagacc 180 cagtacaagc aaaaagcaga tcttattttc gttgggagtg aattagccct tcca 234 <210> 7 <211> 353 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 7 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc 60 ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg 120 agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa 180 tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga tcattatata 240 atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac accaaggaag 300 ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag caa 353 <210> 8 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 8 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233 <210> 9 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 9 tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta 60 gttggagtaa taaatctctg gaacagattg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag 120 agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca 180 agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt 240 taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt 300 aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 360 accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 420 agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg 480 acggttaac 489 <210> 10 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 10 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60 agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttta 119 <210> 11 <211> 592 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 11 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592 <210> 12 <211> 1178 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 12 gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60 gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240 tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300 cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360 agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420 ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480 tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540 aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600 cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660 cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720 gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780 ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840 cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900 cctcagccgt cgcttcatgt gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960 agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020 agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080 tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140 tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178 <210> 13 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 13 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 14 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 14 gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagatcac a 321 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 15 ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 16 gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60 acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120 ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180 tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300 tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 17 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 17 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgatatcta c 141 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 18 atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60 tactgc 66 <210> 19 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 19 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 20 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 20 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 21 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 21 gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60 atcacctgta gagccagcca ggacatcagc agttacctga attggtacca gcagaagcca 120 ggaaaggctc caaagctgct gatctactac acctccagac tgcactctgg tgtgccaagc 180 agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca 240 gaggacatcg ctacctacta ctgccaacag ggtaacacgc ttccatacac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360 ggatctcagg tccaactgca ggagagcggt ccaggtcttg tgagacctag ccagaccctg 420 agcctgacct gcaccgtgtc tggctactca attaccagcg atcatgcctg gagctgggtt 480 cgccagccac ctggacgagg tcttgagtgg attggataca ttagttatag tggaatcaca 540 acctataatc catctctcaa atccagagtg acaatgctga gagacaccag caagaaccag 600 ttcagcctga gactcagcag cgtgacagcc gccgacaccg cggtttatta ttgtgcaaga 660 tccctagctc ggactacggc tatggactac tggggtcaag gcagcctcgt cacagtctcc 720 tca 723 <210> 22 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 22 gaaattgtga tgacccagag cccggcgacc ctgagcgtga gcccgggcga acgcgcgacc 60 attacctgcc gcgcgagcca gggcattagc agctggctgg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggccaggcgc cgcgcctgct gatttatggc gcgagcaccc gcgcgaccgg cattccggcg 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag tatagcagct ggccgccgta tacctttggc 300 cagggcacca aactggaaat taaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 360 ggcggatctg aagtgcagct ggtggaaagc ggcggcaacc tggtgcagcc gggccgcagc 420 ctgcgcctga gctgcgcggc gagcggcttt atttttgatg attatgcgat gcattgggtg 480 cgccaggcgc cgggcaaagg cctggaatgg gtgagcggca ttagctggaa cagcggcagc 540 attggctatg cggatagcgt gaaaggccgc tttaccatta gccgcgataa cgcgaaaaac 600 agcctgtatc tgcagatgaa cagcctgcgc gcggaagata ccgcgctgta ttattgcgcg 660 aaagatggcg gcagcagctg gctgccgttt gtgtattatt atggcatgga tgtgtggggc 720 cagggcacca ccgtgaccgt gagcagc 747 <210> 23 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 23 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc gtgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcattagc agcaactttg cgtggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatggc gcgagcagcc tggaaagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagagc 240 gaagattttg cgagctatta ttgccagcag gcgaacagct ttccgtatac ctttggccag 300 ggcaccaaac tggaaattaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360 ggatctgaag tgcagctggt ggaaagcggc ggcggcctgg tgcagccggg ccgcagcctg 420 cgcctgagct gcgcggcgag cggctttatt tttgatgatt atgcgatgca ttgggtgcgc 480 caggcgccgg gcaaaggcct ggaatgggtg agcggcatta gctggaacag cggcagcatt 540 ggctatgcgg atagcgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgataacgc gaaaaacagc 600 ctgtatctgc agatgaacag cctgcgcgcg gaagataccg cgctgtatta ttgcgcgaaa 660 gatggcggca gcagctggct gccgtttgtg tattattatg gcatggatgt gtggggccag 720 ggcaccaccg tgaccgtgag cagc 744 <210> 24 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 24 ttgttctgga ttcctgcttc catcagtgat gttgtgatga cccaaactgt cagtcttgga 60 gatcaagctt ccatctcttg cagatctagt cagaaccttg tacacaacaa tggaaacacc 120 tatttatatt ggttcctgca gaagtcaggc cagtctccaa agctcctgat ttatagggct 180 tccatccgat tttctggggt cccagacagg ttcagtggca gtggatcaga gacagatttc 240 acactcaaga tcagcagagt ggaggcttat ttctgctttc aaggtacaca tgttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 360 tcgggtggcg gcggatctga ggtgctgctg caacagtctg gacctgagct ggtgaagata 420 ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactggat gaagcagagc 480 catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta agagtggtaa ttccatctac 540 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 600 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct atgactggtc tgcctggttt 660 gctttctggg gccaagggac tctggtctct gtctctgca 699 <210> 25 <211> 575 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 25 gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60 gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120 ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180 gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240 aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct cacctcaagc gtattcaaca 420 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480 gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540 ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataat 575 <210> 26 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 26 atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60 gtgttgcctg ctgccttccc tgcccca 87 <210> 27 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 27 gaaccgaaaa gctgcgataa aacccatacc tgcccgccgt gcccggcgcc ggaactgctg 60 ggcggcccga gcgtgtttct gtttccgccg aaaccgaaag ataccctgat gattagccgc 120 accccggaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgagccatg aagatccgga agtgaaattt 180 aactggtatg tggatggcgt ggaagtgcat aacgcgaaaa ccaaaccgcg cgaagaacag 240 tataacagca cctatcgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcatcagga ttggctgaac 300 ggcaaagaat ataaatgcaa agtgagcaac aaagcgctgc cggcgccgat tgaaaaaacc 360 attagcaaag cgaaaggcca gccgcgcgaa ccgcaggtgt ataccctgcc gccgagccgc 420 gaagaaatga ccaaaaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaaaggctt ttatccgagc 480 gatattgcgg tggaatggga aagcaacggc cagccggaaa acaactataa aaccaccccg 540 ccggtgctgg atagcgatgg cagctttttt ctgtatagca aactgaccgt ggataaaagc 600 cgctggcagc agggcaacgt gtttagctgc agcgtgatgc atgaagcgct gcataaccat 660 tatacccaga aaagcctgag cctgagcccg ggcaaa 696 <210> 28 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 28 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 29 attcaaaatt ttatcgatgc tccggtgccc gtcagt 36 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 30 tcacgacacc tgaaatggaa ga 22 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 31 ggtgtcgtga ggatccgcca ccatggcctt accagtgacc gc 42 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 32 gtgtcatctg gatgtccggc ctggcggcgt g 31 <210> 33 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 33 cacgccgcca ggccggacat ccagatgaca cagactacat c 41 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 34 tgtgatctcc agcttggtcc 20 <210> 35 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 35 caagctggag atcacaggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc 60 tgaggtgaaa ctgcaggagt ca 82 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 36 tgaggagacg gtgactgagg t 21 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 37 agtcaccgtc tcctcaacca cgacgccagc gcc 33 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 38 gtagatatca caggcgaagt cca 23 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 39 cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggc 33 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 40 tctttctgcc ccgtttgcag taaagggtga taaccagtg 39 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 41 aaacggggca gaaagaaact c 21 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 42 tgctgaactt cactctcagt tcacatcctc cttcttcttc 40 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 43 agagtgaagt tcagcaggag cg 22 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 44 ggagaggggc gtcgacttag cgagggggca gggc 34 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 45 gccctgcccc ctcgctaagc ccctctccct cccc 34 <210> 46 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 46 ccagggagaa ggcaactgga ccgaaggcgc ttgtggagaa ggagttcatg gtggcattat 60 catcgtgttt ttcaaagga 79 <210> 47 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 47 gttgccttct ccctggggct gctcctggtg ttgcctgctg ccttccctgc cccagacatc 60 cagatgaccc agag 74 <210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 48 gcagcttttc ggttctgagg agactgtgac gaggct 36 <210> 49 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 49 gttgccttct ccctggggct gctcctggtg ttgcctgctg ccttccctgc cccagaaatt 60 gtgatgaccc agag 74 <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 50 gcagcttttc ggttcgctgc tcacggtcac ggtggt 36 <210> 51 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 51 gttgccttct ccctggggct gctcctggtg ttgcctgctg ccttccctgc cccagatatt 60 cagatgaccc agag 74 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 52 gcagcttttc ggttcgctgc tcacggtcac ggtggt 36 <210> 53 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 53 gttgccttct ccctggggct gctcctggtg ttgcctgctg ccttccctgc cccattgttc 60 tggattcctg cttcca 76 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 54 gcagcttttc ggttctgcag agacagagac cagagt 36 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 55 gaaccgaaaa gctgcgataa aac 23 <210> 56 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 56 ctagcaatct agaggttatt tgcccgggct caggctca 38 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 57 cctttccggg actttcgctt t 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 58 gcagaatcca ggtggcaaca 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 59 catgtacgtt gctatccagg c 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 60 ctccttaatg tcacgcacga t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 61 gacttgtggg gtccttctcc t 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 62 gcagctacag ccatcttcct c 21 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 63 ggattcaatg aggagactt 19 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 64 atctgttctg gaggtact 18 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 65 gacattggaa atgtgaacat gt 22 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 66 cacagctggg gtttggtga 19 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 67 gacattggaa atgtgaacat gt 22 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <220> <221> misc_feature <223> Primer <400> 68 cacagctggg gtttggtga 19

Claims (10)

  1. 서열번호 1에 표시된 것과 같은 표적균주의 대량 증식에 사용되는 암피실린 내성 유전자를 포함하는 AmpR 서열;
    서열번호 2에 표시된 것과 같은 플라스미드 복제에 사용되는 원핵 리플리콘 pUC Ori 서열;
    서열번호 3에 표시된 것과 같은 진핵세포내에서 복제를 강화시키는데 사용되는 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열;
    서열번호 11에 표시된 것과 같은 형질전환 유전자의 발현율의 증가에 사용되는 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트;
    서열번호 12에 표시된 것과 같은 키메라 항원 수용체 유전자의 진핵 전사에 사용되는 인간 EF1α 프로모터;
    렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트;
    서열번호 21에 표시된 것과 같은 IL6RscFv1, 또는 서열번호 22에 표시된 것과 같은 IL6RscFv2, 또는 서열번호 23에 표시된 것과 같은 IL6RscFv3인 인간 IL6R의 인간화 단쇄 항체;
    서열번호 25에 표시된 것과 같은 단백질의 동시 전사 발현에 사용되는 IRES 리보솜 결합 서열;
    서열번호 26에 표시된 것과 같은 IL6 신호 펩타이드;
    서열번호 27에 표시된 것과 같은 인간 항체 Fc 단편; 및
    일체적으로 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 인간 IL6R의 인간화 단쇄 항체는 서열번호 21에 표시된 것과 같은 IL6RscFv1인 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 2세대 렌티바이러스 벡터이며, 상기 2세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호 8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 3세대 렌티바이러스 벡터이며,
    상기 3세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호 8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트, 및 서열번호 4로 표시된 RSV 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체는, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩타이드, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호 17로 표시된 것 과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호 20으로 표시된 TCR키메라 수용체 T세포 활성화 영역을 포함하며,
    상기 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체는, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩타이드, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호 17로 표시된 것 과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호 20으로 표시된 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화영역, 및 서열번호 28로 표시된 것과 같은 CD28 키메라 수용체 공동자극인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 청구항 1 내지 5의 임의의 한 항에 있어서.
    상기 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트는 6개의 뉴클레오티드의 강화 돌연변이를 갖고 있으며, 구체적으로, g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T인 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. (1) 서열번호 1로 표시된 것과 같은 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR 서열, 서열번호 2로 표시된 것과 같은 원핵 리플리콘 pUC Ori 서열, 서열번호 3으로 표시된 것과 같은 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열, 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티 바이러스 패키징 시스 엘리먼트, 서열번호 11로 표시된 것과 같은 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트를 렌티바이러스 백본 플라스미드에 저장하는 단계;
    (2) 서열번호 12로 표시된 것과 같은 인간 EF1α 프로모터, 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체로 2세대 CAR 또는 3세대 CAR로 조성하는 설계방안, 효소절단, 연결, 재조합 반응을 통해 렌티바이러스 백본 플라스미드에 클로닝하여, 2세대 CAR 또는 3세대 CAR 디자인의 재조합 렌티바이러스 플라스미드를 얻는 단계;
    (3) 상기 인간 IL6R의 인간화 단쇄 항체 IL6RscFv1, IL6RscFv2 또는 IL6RscFv3, IRES 리보솜 결합서열, IL6 신호 펩타이드 및 인간유래 항체 Fc를 각각 재조합 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하여, IL-6R 차단 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2 또는 pCAR19-IL6RscFv3을 얻는 단계;
    (4) 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCAR19-IL6RscFv1, pCAR19-IL6RscFv2 또는 pCAR19-IL6RscFv3을 각각 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G와 함께 HEK293T/17세포에 형질 주입시키며, HEK293T/17세포내에서 유전자 전사 발현을 진행한 후, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 패키징에 성공시켜 세포 배양액 상층에 방출시키며, 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함한 상청액을 수집하는 단계;
    (5) 얻은 재조합 렌티바이러스 상청액을 흡인여과, 흡착, 용출에 의한 칼럼 정제 방법으로 정제하여 각각 재조합 렌티바이러스 벡터를 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 1 내지 6의 임의의 한 항의 IL6R 차단을 통한 CRS 완화에 사용되는 CAR-T 형질전환 벡터의 구축방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    단계 (3)에서, 인간 EF1α 프로모터는 전체 CAR 유전자의 발현을 작동시키며; CAR 단백질은 세포막 표면에 위치하여, CD19 항원을 인식하며, T세포 증식과 사이토카인 분비를 자극하여, 다운스트림 신호 전달경로의 발현을 활성화시키며; scfv 영역과 CD19 항원이 결합할 경우, 신호는 키메라 수용체를 통해 세포 내로 전달되며, 이로써 T세포 증식, 사이토카인 분비증가, 항 세포사멸 단백질 분비 증가, 세포사멸 지연, 표적 세포의 용해를 포함하는 일련의 생물학적 효과를 일으키며; IRES 리보솜 결합 서열에 의해 IL6RscFv와 Fc의 융합단백질을 동시에 발현시키며; IL6 신호 펩타이드의 유도 하에 세포 외에 분비되며, IL6R과의 결합을 통해 IL-6와 IL6R의 결합을 차단시켜, 이로써 IL6의 신호 경로를 차단하여, CRS 억제 효과를 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    단계 (5)에서, 상기 흡인여과 단계에서 상청액 체적을 200ml 내지 2000ml로, 진공도를 -0.5MPA 내지 -0.9MPA로 제어하여, 웰 막힘으로 인한 벡터의 손실을 방지하며; 상기 흡착단계에서 용액의 pH값을 6 내지 8로 제어하여, pH 변화에 의한 벡터의 비활성화를 방지하며; 상기 용출단계에서 용출액의 이온강도를 0.5M 내지 1.0M로 제어하여, 이온강도의 변화에 의한 불완전 용출 또는 벡터의 비활성화를 방지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. CRS를 완화시키는 약물의 제조에 있어서의 청구항 1 내지 6의 임의의 한 항에 기재된 벡터의 용도.
KR1020197017090A 2016-12-05 2017-11-13 일종의 il6r 차단을 통한 crs 완화에 사용되는 car-t 형질 전환 벡터와 그의 구축방법 및 용도 KR102157196B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611103319.2A CN108148863B (zh) 2016-12-05 2016-12-05 一种封闭il6r的用于缓解crs的car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN201611103319.2 2016-12-05
PCT/CN2017/110654 WO2018103502A1 (zh) 2016-12-05 2017-11-13 一种封闭il6r的用于缓解crs的car-t转基因载体及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190072672A true KR20190072672A (ko) 2019-06-25
KR102157196B1 KR102157196B1 (ko) 2020-09-22

Family

ID=62470631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197017090A KR102157196B1 (ko) 2016-12-05 2017-11-13 일종의 il6r 차단을 통한 crs 완화에 사용되는 car-t 형질 전환 벡터와 그의 구축방법 및 용도

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11066680B2 (ko)
EP (1) EP3550020A4 (ko)
JP (1) JP6783009B2 (ko)
KR (1) KR102157196B1 (ko)
CN (1) CN108148863B (ko)
WO (1) WO2018103502A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11384350B2 (en) 2014-12-15 2022-07-12 The Regents Of The University Of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective T cell mediated killing
CA3008162A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
HUE061424T2 (hu) 2015-10-30 2023-06-28 Univ California Növekedési faktor bétára reagáló polipeptidek transzformálása és azok felhasználási módszerei
CA3039136A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments
CA3084476A1 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Cellectis Targeted gene integration of nk inhibitors genes for improved immune cells therapy
CN113677356A (zh) * 2019-01-07 2021-11-19 湖南思为康医药有限公司 用于降低毒性的共表达嵌合抗原受体和il-6拮抗剂的修饰免疫细胞及其在过继细胞疗法中的用途
CN110055224B (zh) * 2019-04-03 2023-06-30 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
CN110846344A (zh) * 2019-11-18 2020-02-28 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种表达il-6r阻断抗体的靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞及制备方法、应用
CN110749735A (zh) * 2019-11-27 2020-02-04 合肥中科干细胞再生医学有限公司 一种示踪剂

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014011984A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Toxicity management for anti-tumor activity of cars

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6637415B2 (ja) * 2013-10-15 2020-01-29 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート キメラ抗原受容体ｔ細胞スイッチおよびその使用
CN105640990A (zh) * 2016-01-06 2016-06-08 奥思达干细胞有限公司 一种治疗乳腺癌的car-t细胞制剂及其制备方法
CN105602992B (zh) * 2016-03-17 2019-06-21 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-t转基因载体及其构建方法和应用
JP7208010B2 (ja) * 2016-03-29 2023-01-18 ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア 癌を標的とするキメラ抗原受容体
CN105950663B (zh) * 2016-05-17 2019-04-02 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种靶向cd30的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105950664B (zh) * 2016-05-17 2019-03-29 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105950662B (zh) * 2016-05-17 2019-04-30 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CA3039136A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments
CN106636090B (zh) * 2016-10-11 2019-08-09 上海优卡迪生物医药科技有限公司 人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用
CN107245500B (zh) * 2017-05-27 2019-05-17 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014011984A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Toxicity management for anti-tumor activity of cars
JP2015522081A (ja) * 2012-07-13 2015-08-03 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｃａｒの抗腫瘍活性のための毒性管理

Also Published As

Publication number Publication date
JP6783009B2 (ja) 2020-11-11
CN108148863A (zh) 2018-06-12
KR102157196B1 (ko) 2020-09-22
JP2019535302A (ja) 2019-12-12
CN108148863B (zh) 2019-12-17
WO2018103502A1 (zh) 2018-06-14
EP3550020A1 (en) 2019-10-09
US11066680B2 (en) 2021-07-20
US20190292564A1 (en) 2019-09-26
EP3550020A4 (en) 2019-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102266751B1 (ko) 인간 PD-1를 녹다운시킨 siRNA, 재조합발현 CAR-T 벡터 및 그의 제조방법과 용도
KR102157196B1 (ko) 일종의 il6r 차단을 통한 crs 완화에 사용되는 car-t 형질 전환 벡터와 그의 구축방법 및 용도
KR102266755B1 (ko) 인간 인터류킨 6의 siRNA, 재조합 발현 CAR-T 벡터 및 그의 제조 방법 및 용도
KR102157197B1 (ko) 일종의 pdl1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 car-t 형질전환 벡터 및 그의 구축방법과 용도
CN107245500B (zh) 一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN112673092B (zh) 工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途
CN107325185B (zh) 基于octs-car的抗psca及pdl1双靶向嵌合抗原受体、编码基因及表达载体
CN108018312B (zh) 一种t淋巴细胞白血病的car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107337736B (zh) Octs-car双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用
CN107267555B (zh) 一种基于octs技术的恶性胶质瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107287207B (zh) 一种用于体内示踪和人工清除car-t细胞的标签和应用
KR20170108946A (ko) Fc 수용체-유사 5를 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
CN111108207A (zh) 用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体的基因疗法
CN107299110B (zh) 一种基于octs技术的胰腺癌、恶性间皮瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
KR20230002501A (ko) 코로나바이러스 백신
CN116249779A (zh) 免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途
WO2018106724A1 (en) Optimized lentiviral vector for stem cell gene therapy of hemoglobinopathies
CN107674862B (zh) 类似嵌合抗原受体修饰的cik及其制备方法与应用
CN117295529A (zh) 使用耳畸蛋白双载体系统治疗感觉神经性听力损失的方法
CN107177632B (zh) 一种基于octs技术的髓系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107164410B (zh) 一种基于octs技术的前列腺癌car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108660111B (zh) Car-cik转基因细胞及其制备方法和应用
CN107326089A (zh) 一种基于NGS检测Septin9基因启动子甲基化的方法及其应用
CN113072645A (zh) 一种靶向EphA2抗原的癌症疫苗
CN114805578B (zh) 一种白细胞免疫球蛋白样受体亚家族b成员2的羊驼纳米抗体、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right