KR102157197B1 - 일종의 pdl1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 car-t 형질전환 벡터 및 그의 구축방법과 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1에 표시된 것과 같은 암피실린 내성 유전자를 포함하는 AmpR 서열; 서열번호 2에 표시된 것과 같은 원핵 리플리콘 pUC Ori 서열; 서열번호 3에 표시된 것과 같은 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열; 서열번호 11에 표시된 것과 같은 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트; 서열번호 12에 표시된 것과 같은 인간 EF1α 프로모터; 서열번호 21에 표시된 것과 같은 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트; PDL1scFv1, 서열번호 22에 표시된 것과 같은 PDL1scFv2, 또는 서열번호 23에 표시된 것과 같은 PDL1scFv3인 인간 PDL1의 인간화 단쇄 항체; 서열번호 25에 표시된 것과 같은 IRES 리보솜 결합 서열; 서열번호 26에 표시된 것과 같은 IL6 신호 펩타이드; 서열번호 27에 표시된 것과 같은 인간 항체 Fc 단편; 및 일체적으로 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체를 포함하는 PDL1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터를 개시하였다, 또한 본 발명은 상기 벡터의 구축방법 및 면역회피 억제의 약물 제조에 있어서의 상기 벡터의 용도를 제공하였다.

Description

일종의 PDL1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질전환 벡터 및 그의 구축방법과 용도
본 발명은 의학 생물학 분야에 속하며, 구체적으로, 일종의 벡터, 특히 PDL1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 벡터의 구축 방법 및 용도에 관한 것이다.
종양면역 요법의 이론적 근거는 면역계가 종양관련 항원을 인식하고, 생체가 종양세포에 대한공격을 조절하는(고도로 특이적인 세포 용해) 능력을 가지고 있다는 것이다. 1950년대, 버넷(Burnet)과 토마스(Thomas)는 생체 내에서 자주 나타나는 돌연변이된 종양세포는 면역계에 의해 인식되고 제거된다는 "면역 감시"이론을 제기하였으며, 종양 면역 요법에 이론적 토대를 마련해주었다[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease. Lancet, 1967; 1: 1171-4]. 그 뒤로, 사이토카인 요법, 단일클론항체 요법, 입양면역 요법, 백신 요법 등 다양한 종양면역 요법이 임상에 연이어 적용되었다.
2013년에 더 선진적인 종양면역 요법인 CAR-T 요법이 성공적으로 임상에 사용되었으며, 전무후무한 임상적 효능을 나타내었다. CAR-T, 정식 명칭은 Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy이며, 키메라 항원 수용체 T 세포 면역요법이다. 임상에서 가장 선진적인 CAR-T 요법은 노바티스사의 CLT019가 있으며, CLT019를 이용하여 재발성 난치성 급성림프구성 백혈병 환자를 치료하며, 6개월 이상의 종양 무진행성 생존율이 67%에 달했으며, 그 중 제일 긴 응답시간은 2년 이상에 달했다. 중국 상하이에 본사를 두고 있는 상하이 유니카 테라피 바이오 메디컬 기술 유한회사(Shanghai Unicar-Therapy Bio-Medicine technology co., LTD)는 병원과 협력하여, 재발성 난치성 급성림프구성 백혈병 환자 36명을 공동으로 치료하였으며, 그 중 24명이 완화되었으며, 완화비율이 66.6%에 달했다. 이는 항암연구에서 획기적인 돌파였다. CAR-T세포 요법은 암을 치료할 수 있는 가능성이 높은 방법의 한가지이며, 《Science》잡지에서 2013년도 10대 과학기술의 돌파성 선두 기술임을 평가 받았다.
CAR-T요법의 효과는 현저하나, 실체 종양의 치료과정에서 여러 가지 어려움을 겪었는데, 그 중 가장 중요한 이유중의 하나는 PD1/PDL1 억제성 면역관문이며(도 1A에 표시된 바와 같이), 이들은 억제 신호 전달과 결합하여 T세포의 면역활성을 억제하며, 면역 내성에 중요한 역할을 하는 동시에 종양세포의 회피를 촉진시키는 중요한 원인으로도 되고 있다.
PD-1 (또는 CD279)은 일종의 면역 억제성 수용체이며, CD28 패밀리 구성원의 제Ⅰ형 막 관통 단백질에 속하며, 프로그램화된 세포 사멸 분자-1 수용체는 1992년에 Ishida 등[Ishida Y,Agata Y,Shibahara K,et al. Induced expression of PD-1,a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death〔J〕. EMBO J,1992,11（11）: 3887-3895.]이 감수잡종형성방법을 사멸된 T세포 하이브리도마에 사용하는데서 이름이 지정되었다. 인간 PD-1 유전자는 2q37.35 염색체에 존재하며, 하나의 약 55kD의 막 관통 단백질을 코딩한다. PD-1은 활성화된 T세포, B세포, 단핵세포와 수지상 세포 표면에서 광범위하게 발현되며, PD-1 구조는 CTLA-4와 30%의 상동성을 갖고 있으며, 세포 내 영역에 2개의 티로신 잔기가 존재하며, 각각 N 말단의 하나의 면역 수용체 티로신 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)와 C 말단의 하나의 면역 수용체 티로신 의존성 스위치 모티프(immunoreceptor tyrosin-based switch motif，ITSM)의 구성에 참여한다. 세포 외 영역은 하나의 IgV양 구조영역으로 조성되며, 다수의 글리코실화 부위를 포함하며 심한 글리코실화가 일어나고, 상기 구조영역은 리간드에 결합되어, T세포 활성화를 억제시키는 기능을 발휘한다 [리잉(李瑛), 죠우순창(焦糠昌) 등,. PD-1/PD-L1 신호경로가 종양 면역 회피 중에서의 작용 및 임상적 의의[J]. Acad J Chin PLA Med Sch, Jul 2015,36(7).].
PD-L1은 다수의 암 조직에서 과량으로 발현되며, NSCLC, 흑색종, 유방암, 신경교종, 림프종, 백혈병, 및 각종 비뇨계 종양, 소화도 종양, 생식계 종양 등을 포함한다[Intlekofer AM,Thompson CB. At the bench: preclinical rationale for CTLA-4 and PD-1 blockade as cancer immunotherapy[J]. J Leukoc Biol, 2013, 94(1):25-39.]. Parsa는 마우스와 인간의 종양세포에서, T세포가 비정상적으로 분비한 IFN-γ가 종양 세포의 PD-L1의 높은 발현을 유도함을 발견하였다[Ding H,Wu X,Wu J,et al. Delivering PD-1 inhibitory signal concomitant with blocking ICOS co-stimulation suppresses lupus-like syndrome in autoimmune BXSB mice[J]. Clin Immunol, 2006,118(2/3):258-267.]. PD-L1의 높은 발현은, RAS 및 PI3K/AKT 신호경로의 억제를 통해 세포주기체크포인트 단백질과 세포증식 관련 단백질 발현을 조절함으로써, 최종적으로 T세포 증식의 억제를 일으킨다[11]. Dong 등은, 체외실험과 마우스 모델에서 PD-1/PD-L1 신호경로의 활성화가 특이적 CTL 세포자멸을 유도하며, CTL의 세포 살상효과의 감수성을 저하시켜, 종양세포의 면역 회피를 촉진함을 발견하였다[Dong H, Strome SE, Strome SE, Salomao Dr, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion[J]. Nat Med, 2002, 8(8):793-800].
현재, 임상에서 주로 상품화된 PD-1 단일항체를 사용하여 면역관문억제제로 하며, 이로써 종양세포의 면역회피를 억제한다. 2014년 9월3일에, Bristol-Myers Squibb 회사의 항PD-1 약물 Opdivo（Nivolumab）가 일본에서 정식으로 상장하였으며, 일본 국내에서 이러한 약물은 현재 여전히 흑생종 환자에만 한한다. 약물은 100mg 당 729849엔（약 RMB 43000원） 가격이다. 체중 1kg당 2mg의 사용량을 필요로 함으로, 체중 50kg인 사람은 100mg을 필요로 한다. 또한, 체중이 10kg씩 증가할 때마다 약물량이 20mg(150200엔, 약 RMB8778원)증가해야 하며, 3주간이 한 개 치료 과정이다. 가격이 상당히 비싸서 일반 가정에서는 감당하기 힘들다.
따라서, CAR-T 치료 효과에 영향주지 않으면서, 저 비용 방법으로 종양 세포 면역 회피의 발생을 억제하는 하는 것이 CAR-T 치료의 한가지 기술적 난제로 된다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제의 하나는 일종의 PDL1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질전환 벡터 및 그의 구축방법과 용도를 제공하는 것이다. 우선, 원가 절감으로 항체 약물을 구매하는 비싼 비용을 절약하였다. 두 번째로, 체내에서 scFv 유전자의 전달 효율이 낮은 문제를 방지할 수 있다. 세 번째는, 렌티 바이러스로 형질도입된 PDL1 scFv 유전자를 통해, 세포 내 단백질 번역 시스템을 효과적으로 이용하여, 상응한 PDL1 scFv를 대량 발현시켜, 체액순환을 통해, CAR-T 치료에 영향주지 않으면서 양호한 PDL1 차단 효과를 얻을 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 기술적 과제는 상기 벡터의 구축방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 기술적 과제는 상기 벡터의 용도를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 기술적 해결수단을 이용한다.
본 발명의 한 방면에서, PDL1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터를 제공하며, 상기 벡터는,
서열번호 1에 표시된 것과 같은 표적균주의 대량 증식에 사용되는 암피실린 내성 유전자를 포함하는 AmpR 서열;
서열번호 2에 표시된 것과 같은 플라스미드 복제에 사용되는 원핵 리플리콘pUC Ori 서열;
서열번호 3에 표시된 것과 같은 진핵세포내에서 복제를 강화시키는데 사용되는 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열;
서열번호 11에 표시된 것과 같은 형질전환 유전자의 발현율의 증가에 사용되는 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사 후 조절 엘리먼트;
서열번호 12에 표시된 것과 같은 키메라 항원 수용체 유전자의 진핵 전사에 사용되는 인간 EF1α 프로모터;
렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트;
서열번호 21에 표시된 것과 같은 PDL1scFv1, 또는 서열번호 22에 표시된 것과 같은 PDL1scFv2, 또는 서열번호 23에 표시된 것과 같은 PDL1scFv3인 인간 PDL1의 인간화 단쇄 항체;
서열번호 25에 표시된 것과 같은 발현 단백질의 동시 전사에 사용되는 IRES 리보솜 결합 서열;
서열번호 26에 표시된 것과 같은 IL6 신호 펩타이드;
서열번호 27에 표시된 것과 같은 인간 항체 Fc 단편; 및
일체적으로 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본 발명의 바람직한 기술적 해결수단에 있어서, 상기 인간 PDL1의 인간화 단쇄 항체는 서열번호 21에 표시된 것과 같은 PDL1scFv1이다.
상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 2세대 렌티바이러스 벡터 또는 3세대 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 3세대 렌티바이러스 벡터이다. 상기 2세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호 8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트를 포함한다. 상기 3세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호 8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트, 및 서열번호 4로 표시된 RSV 프로모터를 포함한다.
본 발명의 바람직한 기술적 해결수단에 있어서, 상기 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체는, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩타이드, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호 17로 표시된 것 과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호 20으로 표시된 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역을 포함한다. 상기 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체는, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩타이드, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호 17로 표시된 것 과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호 20으로 표시된 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역, 및 서열번호 28로 표시된 것과 같은 CD28 키메라 수용체 공동자극인자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 기술적 해결수단에 있어서, 상기 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사 후 조절 엘리먼트는 6개의 뉴클레오티드의 강화 돌연변이를 갖고 있으며, 구체적으로, g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T이다.
본 발명의 두 번째 방면에 있어서, 일종의 상기 PDL1 차단을 통한 면역 회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질전환 벡터의 구축방법을 제공하며, 하기 단계를 포함한다.
(1) 서열번호 1로 표시된 것과 같은 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR 서열, 서열번호 2로 표시된 것과 같은 원핵 리플리콘 pUC Ori 서열, 서열번호 3으로 표시된 것과 같은 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열, 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티 바이러스 패키징 시스 엘리먼트, 서열번호 11로 표시된 것과 같은 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사 후 조절 엘리먼트를 렌티바이러스 백본 플라스미드에 저장한다.
(2) 서열번호 12로 표시된 것과 같은 인간 EF1α 프로모터, 일체적으로 조성, 인식, 전달 및 가동하는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체로 2세대 CAR 또는 3세대 CAR로 조성하는 설계방안, 효소절단, 연결, 재조합 반응을 통해 렌티바이러스 백본 플라스미드에 클로닝하여, 2세대 CAR 또는 3세대 CAR 디자인의 재조합 렌티바이러스 플라스미드를 얻는다.
(3) 상기 인간 PDL1의 인간화 단쇄 항체 PDL1scFv1, PDL1scFv2 또는PDL1scFv3, IRES 리보솜 결합서열, IL6 신호 펩타이드 및 인간유래 항체 Fc를 각각 재조합 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하여, PDL1 녹다운 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-PDL1scFv1, pCARmm-PDL1scFv2 또는 pCARmm-PDL1scFv3을 얻는다.
(4) 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-PDL1scFv1, pCARmm-PDL1scFv2 또는 pCARmm-PDL1scFv3을 각각 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G와 함께 HEK293T/17세포에 형질 주입시키며, HEK293T/17세포내에서 유전자 전사 발현을 진행한 후, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 패키징에 성공시켜 세포 배양액 상층에 방출시키며, 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함한 상청액을 수집한다.
(5) 얻은 재조합 렌티바이러스 상청액을 흡인여과, 흡착, 용출에 의한 이온교환 방법으로 정제하여 각각 재조합 렌티바이러스 벡터를 얻는다.
본 발명의 바람직한 기술적 해결수단에 있어서, 단계 (3)에서, 인간 EF1α 프로모터는 전체 CAR 유전자의 발현을 작동시킨다. CAR 단백질은 세포막 표면에 위치하여, BCMA 항원을 인식하며, T세포 증식과 사이토카인 분비를 자극하여, 다운스트림 신호 전달경로의 발현을 활성화시킨다. scfv 영역과 BCMA 항원이 결합할 경우, 신호는 키메라 수용체를 통해 세포 내로 전달되며, 이로써 T세포 증식, 사이토카인 분비증가, 항 세포사멸 단백질 분비 증가, 세포사멸 지연, 표적 세포의 용해를 포함하는 일련의 생물학적 효과를 일으킨다. IRES 리보솜 결합 서열에 의해 PD1scFv와 Fc의 융합단백질을 동시에 발현시키며, IL6 신호 펩타이드의 유도 하에 세포 밖으로 분비되며, PDL1와의 결합을 통해 PD1와 PDL1의 결합을 차단시켜, 이로써 PD1/PDL1의 신호 경로를 차단하고, 면역회피 억제 효과를 얻는다.
본 발명의 바람직한 기술적 해결수단에 있어서, 단계 (5)에서, 상기 흡인여과 단계에서 상청액 체적을 200ml 내지 2000ml로, 진공도를 -0.5MPA 내지 -0.9MPA로 제어하여, 웰 막힘으로 인한 벡터의 손실을 방지하며, 상기 흡착단계에서 용액의 pH값을 6 내지 8로 제어하여, pH 변화에 의한 벡터의 비활성화를 방지하며, 상기 용출단계에서 용출 액의 이온강도를 0.5M 내지 1.0M로 제어하여, 이온강도의 변화에 의한 불완전 용출 또는 벡터의 비활성화를 방지한다.
본 발명의 세 번째 방면에서, 면역회피 억제 약물의 제조에 있어서의 상기 벡터의 용도를 제공한다.
기존기술에 비해, 본 발명은 하기 유익한 효과를 갖고 있다.
본 발명에서 사용된 벡터 백본은 3세대 렌티바이러스 벡터이며(도 2A에 나타낸 바와 같이) (2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시), 3'SIN LTR은 U3영역을 제거하여, 렌티바이러스 벡터의 자기 복제 가능성을 제거하여 안전성을 크게 향상시켰다. cPPT 및 WPRE 엘리먼트의 증가를 얻었으며, 형질전환 효율 및 형질전환 유전자의 발현 효율을 향상시켰다. RSV 프로모터를 이용하여 렌티바이러스 패키징(lentiviral vector packaging) 과정에서 코어(core) RNA의 전사를 지속적이고 효과적으로 유지할 수 있도록 하며, 인간의 EF1α 프로모터를 사용하여, CAR 유전자가 인체 내에서 장시간 지속적으로 발현될 수 있게 하였다.
본 발명에서 사용하는 3세대 렌티바이러스 백본 플라스미드(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시)는 eWPRE 엘리먼트를 사용하여, 일반적인 WPRE에 비해, 초기 전사 생성물의 폴리아데닐화를 향상시킬 수 있으며, 세포 내 mRNA의 함량을 증가시키고, 형질 전환 유전자의 발현효율을 증가시킨다.
본 발명에 사용된 렌티바이러스 벡터 컬럼정제 방법(도 7에 도시됨)(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시)은 일반적으로 사용되는 초원심분리 방법 또는 고속원심분리 방법과 달리 반자동화 조작이며, 수동 조작의 번거로움， 실수를 방지하며, 회수한 렌티바이러스 벡터 내독소, 마이코플라즈마, 숙주 DNA 잔류 등 표준에서 임상기준에 완전히 도달하였다.
본 발명에 사용된 렌티바이러스 벡터 시스템(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시)은, 3세대 렌티바이러스 벡터이며, 3'SIN LTR에서 U3 영역을 제거하여, 렌티바이러스 벡터의 자가복제 가능성을 제고하여, 안전성을 대폭 제고시켰다. cPPT와 eWPRE 엘리먼트를 증가시켰고, 형질전환 효율 및 형질전환 유전자의 발현 효율을 향상시켰다. RSV 프로모터를 이용하여 렌티바이러스 패키징 과정에서 코어(core) RNA의 전사를 지속적이고 효과적으로 유지할 수 있도록 하며, 인간의 EF1α 프로모터를 사용하여, CAR 유전자가 인체 내에서 장시간 지속적으로 발현될 수 있게 하였다.
본 발명에서 사용한 scfv 단편의 링커 디자인(2016년 3월 17일에 출원된 "결핍성 재조합 렌티바이러스의 복제에 기초한 CAR-T 형질전환 유전자 벡터 및 이의 구축방법 및 용도" 발명 특허에서 이미 개시)은, 사이토카인의 분비, CAR-T 세포의 체외 살상 작용 및 임상치료 효과를 현저히 제고시킬 수 있다.
본 발명에서 사용한 것은 PDL1 단쇄 항체 차단기술이며, 단쇄 항체(single chain antibody fragment，scFv)는, 항체 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 15 내지 20개의 아미노산의 짧은 펩타이드(링커, linker)를 통해 연결되어 형성된다. ScFv는 항원에 대한 친화 활성을 잘 유지할 수 있으며, 분자량이 작고, 투과력이 강하며 항원성이 약한 등 특징을 갖고 있다.
본 발명에서 사용하는 인간 PDL1 차단 단쇄 항체 디자인에 있어서, T세포에서 효과적으로 과발현될 수 있으며 세포 밖으로 분비될 수 있으며, PD1과 PDL1의 결합을 효과적으로 차단할 수 있으며, PD1/PDL1 신호 경로의 전달억제신호를 차단할 수 있으며, T세포 사멸 실험에서, QPCR 검사를 통해 T세포에서 IL2, TNFα, IFNγ의 mRNA의 전사 수준을 효과적으로 제고시킬 수 있고, T세포 활성화 관련 유전자의 억제작용을 제거하여, 앞으로 생체 내에서 PD1/PDL1의 신호경로를 차단하여, 면역회피를 억제하는 효과에 이를 수 있으며, CAR-T 세포치료가 실체 종양에 대한 치료효과를 제고시킬 수 있다.
본 발명에서 사용한 scFv 단편과 항체 Fc 단편은 모두 인간화 개조를 거쳐, 체내의 인간 항 마우스 항체（Human anti-mouse antibodies, HAMA）의 생성을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, scFv의 반감기와 작용효과를 제고시킨다.
본 발명에서는 PDL1 scFv의 작용방식(도 1B에 나타낸 바와 같이)을 사용하였다. 우선, 원가를 절감하여 항체 약물을 구매하는 비싼 비용을 절약하였다. 두 번째로, 체내에서 scFv 유전자의 전달 효율이 낮은 문제를 피하였다. 세 번째로, 렌티 바이러스로 형질도입된 PDL1 scFv 유전자를 통해, 세포 내 단백질 번역 시스템을 효과적으로 이용하여, 상응한 PDL1 scFv를 대량 발현시켜, 체액순환을 통해, 양호한 PDL1 차단 효과를 얻었다. 본 발명에서는 일련의 PDL1 항체의 유전자 서열, 아미노산 서열 등 생물학 정보방면의 정보를 선별하여, PDL1 scFv의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 예측하였으며, PDL1 scFv 조합의 이차구조 및 물리화학적 성질을 분석하였으며, 가용성 발현 및 간접적 ELISA법을 통해 PDL1 scFv의 친화력 상수를 측정하였으며, 그 중에서 3가닥의 scFv를 선택하여 세포기능 레벨을 검출하여, 최종적으로 PDL1scFv1이 최선의 선택임을 확정하였으며, 미래에 임상연구 단계에 진입할 수 있다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 백본은 서로 다른 치료성 유전자를 탑재하여, 입양성 세포치료 영역에 널리 사용할 수 있으며, PDL1 scFv 유전자의 탑재는 PDL1의 차단에 사용되며, 면역 하향 조절 신호경로를 억제하여, 이로써 종양의 면역회피를 억제하였다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 인간 T림프구 세포에서의 BCMA 키메라 항원 수용체의 발현을 실현할 수 있으며, T림프구 세포가 BCMA 양성세포에 대한 살상작용을 유도하고 활성화시켰으며, 임상에서 다발성 골수종(MM)의 치료에 사용된다. 인간 T림프구 세포내에 발현하는 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1(Programmed cell death 1 death 1 ligand 1, PDL1)의 scFv는 PDL1을 효과적으로 차단하여, 면역 하향 조절 신호경로를 차단하며, 임상에서 종양의 면역회피에 사용하여, CAR-T 세포 면역치료의 치료효과를 제고시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조합 렌티바이러스 벡터는 다발성 골수종(MM)의 CAR-T 치료에 신뢰성 형질전환 유전자를 제공하는 동시에 종양의 면역회피 메커니즘을 차단하여, CAR-T 세포 치료 효과를 제고하였으며, 환자가 부담하는 의료 비용을 대폭 감소시키고, 본 분야의 기술적 문제를 해결하였으며, 예상외의 기술적 효과를 얻었다.
본 발명에서 기술한 PDL1 단쇄 항체의 발현 카셋트 및 그의 유전자의 발현 산물은, 다발성 골수종(MM)에서 종양의 면역회피 메커니즘을 제거하거나 경감시키는 CAR-T치료에 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 췌장암, 신경교종, 골수종 등과 같은 유형의 종양의 면역 회피 메커니즘을 억제하는 치료에 적용할 수 있다.
도 1A는 본 발명의 PD1/PDL1신호 전달 경로의 개략도이다.
도 1B는 본 발명의 PDL1 scFv 작용방식 개략도이다.
도 2는 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 구조 개략도이다. 그 중, 도 2A는 본 발명에서 사용한 3세대 렌티바이러스의 구조 개략도이며, 도 2B는 2세대와 3세대 렌티바이러스의 구조 비교도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 구축한 본 발명의 상기 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조 흐름도이다. 그 중, 도 (A)는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 구조 개략도이다. 도 (B)는 pCARmm-Basic2 플라스미드의 개략도이다. 도 (C)는 pCARmm-PDL1scFv1, pCARmm-PDL1scFv2, pCARmm-PDL1scFv3, pCARmm-scFv0 플라스미드의 개략도이다. 도 (D)는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP의 구조 개략도이다. 도 (E)는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-R의 구조 개략도이다. 도 (F)는 막 단백질 pEnv-G의 구조 개략도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1의 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 도 4A는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 효소 절단 예측 개략도이다. 그 중, lane1은 pLenti-3G Basic2의 Cla I+BamH I 효소 절단 예측이며, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 5854bp이며; lane 2는 1kb DNA ladder Marker예측이며, 위로부터 아래로 밴드가 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5 kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; 도 4B는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 그 중, lane1은 pLenti-3G Basic2의 Cla I+BamH I효소 절단 전기영동 결과이며, lane2는 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1의 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-Basic2의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 도 5A는 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-Basic2의 효소 절단 예측 개략도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5 kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며, lane2는 pCARmm-Basic2의 Xba I+Xho I효소 절단 예측이며, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 6839bp, 1692bp이며, 도 5B는 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-Basic2의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane2는 pCARmm- Basic2의 Xba I+Xho I효소 절단 전기영동 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-PDL1scFv1, pCARmm-PDL1scFv2와 pCARmm-PDL1scFv3, pCARmm-scFv0의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이다. 도 6A는 pCARmm-PDL1scFv1의 효소 절단 예측도이며. 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이고, 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCARmm-PDL1scFv1의BsrG I 효소 절단 예측이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 9592bp, 1298bp이며; 도 6B는 pCARmm-PDL1scFv1의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane2는 pCARmm-PDL1scFv1의 BsrG I효소 절단 전기영동 결과이며; 도 6C는 pCARmm-PDL1scFv2의 효소 절단 예측도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCARmm-PDL1scFv2의 Sal I효소 절단 예측이며, 밴드는 위에서 아래도 순차적으로 8484bp, 1588bp, 818bp이며; 도 6D는 pCARmm-PDL1scFv2의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며; lane2는 pCARmm-PDL1scFv2의 sal I효소 절단 전기영동결과이며; 도 6E는 pCARmm-PDL1scFv3의 효소 절단 예측도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCARmm-PDL1scFv3의 Pvu II효소절단 예측이며; 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 3354bp, 2364bp, 1920bp, 1460bp, 823bp, 733bp이며; 도 6F는 pCARmm-PDL1scFv3의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중 lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane2는 pCARmm-PDL1scFv3의 Pvu II효소 절단 전기영동 결과이며; 도 6G는 pCARmm-scFv0의 효소 절단 예측도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며; lane2는 pCARmm-scFv0의 Kpn I 효소절단 예측이며, 밴드는 위에서 아래로 순차적으로 7028bp, 3626bp, 895bp, 347bp이며; 도 6H는 pCARmm-scFv0의 효소 절단 아가로스 겔 전기영동도이며, 그 중, lane1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane2는 pCARmm-scFv0의 Kpn I효소 절단 전기영동 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 재조합 렌티바이러스 벡터의 정제 흐름도이다.
도 8은 본 발명의 실시예 2의 재조합 렌티바이러스 벡터의 역가검출 결과의 개략도이다.
도 9는 본 발명의 실시예 2의 재조합 렌티바이러스 벡터의 서로 다른 정제방법에 따른 마이코플라즈마의 검출 결과 개략도이다. 그 중, lane1은 DL2000 marker이며. 밴드는 위로부터 아래로 순차적으로 2kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp이며; lane2는 양성 대조군이며; lane3은 음성 대조군이며; lane4는 PBS이며; lane5는 물이며; lane6은 lvCARmm-PDL1scFv1이며; lane7은 lvCARmm-PDL1scFv2이며; lane8은 lvCARmm-PDL1scFv3이며, lane9는 lvCARmm-scFv0이다.
도 10은 본 발명의 실시예 3의 mRNA 상대적 발현양을 나타내는 막대 그래프이며, 그 중, 도 10A는 RT-QPCR 결과 개략도이며, CAR 유전자가 PBMC세포내에서 고 효율적으로 전사함을 나타낸다. 도 10B는 RT-QPCR 결과 개략도이며, scFv 유전자가 PBMC세포내에서 고 효율적으로 전사함을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 실시예 3의 CAR 단백질 발현양의 WB 검출도이며, CAR 단백질은 PBMC 세포 내에서 고 효율적으로 발현됨을 나타내며, 도 11A에서, M은 단백질 Marker이며, lane1은 PBMC블랭크 세포이며, lane2는 대조 바이러스 MOCK이며, lane3은 lvCARmm-PDL1scFv1이며, lane4는 lvCARmm-PDL1scFv2이며, lane5는 lvCARmm-PDL1scFv3이며, lane6은 lvCARmm-scFv0이며, 도 11B는 beta-actin 참조 밴드이다.
도 12는 본 발명의 실시예 3에서 scFv 단백질 발현양의 ELISA 검출 결과도이며, 결과는 scFv 단백질이 PBMC세포에서 고 효율적으로 발현됨을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 실시예 3에서 재조합 렌티바이러스 벡터로 형질전환된 PBMC를 서로 다른 감염다중도 조건하에서 공동 배양하여, 24시간 후 표적 세포에 대한 사멸 상황을 검출한 개략도이다.
도 14는 본 발명의 실시예 3에서 서로 다른 주효세포가 각각 표적세포와의 공동 배양조건하에, 24시간 PD1 mRNA 전사 레벨의 변화 상황의 개략도이다.
도 15는 본 발명의 실시예 3에서 서로 다른 주효세포가 각각 표적세포와의 공동 배양조건하에, 24시간 사이토카인 전사 레벨의 변화 상황 개략도이며, 그 중, 도 15A는 RT-QPCR 결과로서 IL2 유전자가 각 실험그룹 PBMC 세포내에서의 mRNA 전사 수준을 나타내며, 도 15B는 RT-QPCR 결과 TNFα 유전자가 각 실험그룹 PBMC 세포내에서의 mRNA 전사 수준을 나타내며, 도 15C는 RT-QPCR 결과 IFNγ유전자가 각 실험그룹 PBMC 세포내에서의 mRNA 전사 수준을 나타낸다.
아래 구체적인 실시양태를 결합하여 본 발명을 더 한층 설명하고자 한다. 이 부분에서 특정된 실시양태는 예를 드는 방식으로 나타내며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위를 이탈하지 않는 상황에서, 본 발명의 주요 특징은 각종 실시양태에 사용할 수 있다.
실시예 1 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조
1. 재료
1) 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G, HEK293T/17세포, 동종 재조합 효소는 스오우(상하이)생물의약 과학기술유한회사에서 제공하였다.
2) 프라이머: 프라이머 디자인 원칙에 따라 DNA단편과 표적 부위의 증폭에 필요한 프라이머를 고안하였으며, 상기 프라이머는 상해 생물회사에서 합성하였다. 구체적으로 하기와 같다.
EF1α-F：5'-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3' (서열번호 29)
EF1α-R：5'-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3' (서열번호 30)
CD8 leader-F：5'-ggtgtcgtgaggatccgccaccatggccttaccagtgaccgc-3'
(서열번호 31)
CD8 leader-R：5'- GGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTG -3'(서열번호 32)
VL-F：5'- cacgccgccaggccggacatccagatgacccagagcc -3'(서열번호 33)
VL-R：5'- ACGCTTGATCTCCAGTTTGGT -3'(서열번호 34)
OLC-VH-F：5'-actggagatcaagcgtggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgg
gtggcggcggatctcaggtgcagctggtccagag-3'(서열번호 35)
VH-R：5'-GCTGGACACGGTCACTAGTGTG-3'(서열번호 36)
CD8 Hinge-F：5'- AGTGACCGTGTCCAGCACCACGACGCCAGCGCC -3'(서열번호 37)
CD8 Hinge-R：5'-GTAGATATCACAGGCGAAGTCCA-3'(서열번호 38)
CD8 Transmembrane-F：5'-cgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggc-3'(서열번호 39)
CD8 Transmembrane-R：5'-TCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTG-3'(서열번호 40)
CD137-F：5'-aaacggggcagaaagaaactc-3'(서열번호 41)
CD137-R：5'-TGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3'(서열번호 42)
TCR-F：5'-agagtgaagttcagcaggagcg-3'(서열번호 43)
TCR-R：5'-GGAGAGGGGCGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGC-3'(서열번호 44)
IRES-F：5'-GCCCTGCCCCCTCGCTAAGCCCCTCTCCCTCCCC-3'(서열번호 45)
IRES-R：5'- CCAGGGAGAAGGCAACTGGACCGAAGGCGCTTGTGGAGAAGGAGTTC
ATGGTGGCATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGA -3'(서열번호 46)
PDL1s1-F：5'-GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCAGATATTGTGCTGACCCAGAG -3'(서열번호 47)
PDL1s1-R：5'- GCAGCTTTTCGGTTCGCTGCTCACGGTCACCAGGGT -3'(서열번호 48)
PDL1s2-F：5'-GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCAGATATTCAGATGACCCAGAGC -3'(서열번호 49)
PDL1s2-R：5'-GCAGCTTTTCGGTTCGCTGCTCACGGTCACCAGGGT -3'(서열번호 50)
PDL1s3-F：5'- GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCAGATATTGTGCTGACCCAGAGC -3'(서열번호 51)
PDL1s3-R：5'- GCAGCTTTTCGGTTCCGCGCTCGCGGTCACCAGGGT -3'(서열변호 52)
s0-F：5'- GTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTG
CCCCATTGTTCTGGATTCCTGCTTCCA -3'(서열번호 53)
s0-R：5'- GCAGCTTTTCGGTTCTGCAGAGACAGAGACCAGAGT -3'(서열번호 54)
Fc-F：5'- GAACCGAAAAGCTGCGATAAAAC -3'(서열번호 55)
Fc-R：5'- CTAGCAATCTAGAGGTTATTTGCCCGGGCTCAGGCTCA -3'(서열번호 56)
WPRE-QPCR-F：5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(서열번호 57)
WPRE-QPCR-R：5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(서열번호 58)
Actin-QPCR-F：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'(서열번호 59)
Actin-QPCR-R：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'(서열번호 60)
CAR-QPCR-F：5'-GACTTGTGGGGTCCTTCTCCT-3'(서열번호 61)
CAR-QPCR-R：5'-GCAGCTACAGCCATCTTCCTC-3'(서열번호 62)
PD1-QPCR-F：5'- TGCAGCTTCTCCAACACAT-3'(서열번호 63)
PD1-QPCR-R：5'- CTTGTCCGTCTGGTTGCT-3'(서열번호 64)
IL2-QPCR-F：5'- CACCAGGATGCTCACATTTAAGT-3'(서열번호 65)
IL2-QPCR-R：5'- GTCCCTGGGTCTTAAGTGAAAGT-3'(서열번호 66)
Fc-QPCR-F：5'- GACATTGGAAATGTGAACATGT-3'(서열번호 67)
Fc-QPCR-R：5'- CACAGCTGGGGTTTGGTGA-3'(서열번호 68)
TNFα-QPCR-F：5'- TCTCTAATCAGCCCTCTG-3'(서열번호 69)
TNFα-QPCR-R：5'- GGGTTTGCTACAACATGG-3'(서열번호 70)
IFNγ-QPCR-F：5'- GACTAATTATTCGGTAACTGA-3'(서열번호 71)
IFNγ-QPCR-R：5'- GATGCTCTTCGACCTCGAAACA -3'(서열번호 72)
3)서열번호15 내지 서열번호 72로 표시된 DNA 서열은 상해 제루이 생물공정유한회사(上海捷瑞生物工程有限公司)에서 합성하였으며, 뉴클레오티드 건조분말 또는 플라스미드 형식으로 보존된다.
4) 도구 효소 Xba I, Xho I, Pvu II, Sal I, BsrG I, BamH I, Kpn I, Cla I, T4 DNA 연결효소는 모두 NEB회사에서 구매하였다.
5) 고 충실도 효소 PrimeSTAR, RN는 Takara회사에서 구매하였다.
6) 0.22μm 내지 0.8μm PES 필터는 millipore회사에서 구매하였다.
7) 플라스미드 추출 키트 및 아가로스 겔 회수 키트는 모두 MN회사에서 구매하였다.
8) 수용성 세포 TOP10은 tiangen회사에서 구매하였다.
9) NaCl, KCl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4, Trypsin, EDTA, CaCl2, NaOH, PEG6000 모두 상하이 생공(上海生工)에서 구매하였다.
10) Opti-MEM, FBS, DMEM, 1640, Pen-Srep, Hepes은 invitrogen회사에서 구매하였다.
11) Biotinylated protein L, proteinG-HRP은 GeneScript회사에서 구매하였다.
12) 겨자무과산화효소로 표식한 2차항체, DAB 작업용액은 모두 베이징 쭝싼진쵸우에서 구매하였다.
13) ECL+plusTM Western blotting system은 Amersham회사에서 구매하였다.
14) DNeasy 키트는 상하이 제루이회사(上海捷瑞公司)에서 구매하였다.
15) 림프 세포 분리액은 썬쩐 다커웨이회사에서 구매하였다.
16) phycoerythrin(PE)-conjugated streptavidin은 BD Bioscience회사에서 구매하였다.
17) SA-HRP, TMB 기질 용액, ELISA 반응정지용액은 상하이 이성회사(上海翊加公司)에서 구매하였다.
18) 마이코플라즈마 검사키트, 내독소 검사키트, BCMA-K562 세포, BCMA-PDL1-K562세포는 스오우(상하이)회사에서 구매하였다.
19) LDH 테스트 키트는 promega회사에서 구매하였다.
2. 재조합 렌티바이러스 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0의 구축방법
도 3을 참조로 하면, 본 발명의 상기 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조방법은 하기와 같다.
1) 인간 EF1α 프로모터, CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩타이드, BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, Optimal Linker C, BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막 관통 영역, CD137 키메라 수용체 공동자극 인자, TCR 키메라 수용체 T 세포 활성화 영역 단편을 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G Basic2에 클로닝하여, 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-Basic2를 얻으며, 다시 scFv 단편과 Fc 단편을 각각 pCARmm-Basic2에 연결시켜, IL-6R 차단 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-PDL1scFv1, pCARmm-PDL1scFv2, pCARmm-PDL1scFv3 및 대조 pCARmm-scFv0을 얻었다.
(1) 렌티바이러스 플라스미드 pLenti-3G Basic2를, Cla I와 BamH I 제한효소를 사용하여 이중 효소 절단을 하며, 생성물은 1.5%의 아가로스 겔 전기영동을 통해5854bp의 단편 V1을 확인하였으며(도 4에 표시), 겔을 회수하여 Eppendorf 튜브에 넣고, MN회사의 아가로스 겔 추출키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure 112019060698216-pct00001
표 1 아가로스 겔 회수 단계
（2）프라이머 EF1α-F와 EF1α-R를 사용하여, 합성된 서열번호 12를 주형으로, 표 2의 반응계를 이용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 1208bp의 단편 a를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure 112019060698216-pct00002
표 2 50 μl PCR 반응계
3）프라이머 CD8 leader-F와 CD8 leader-R를 사용하고, 합성된 서열번호 13을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 101bp의 단편 b를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(4) 프라이머 VL-F와 VL-R를 사용하고, 합성된 서열번호 14를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 336bp의 단편 c를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(5) 프라이머 OLC-VH-F와 VH-R를 사용하고, 합성된 서열번호 16을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 421bp의 단편 d를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(6) 프라이머 CD8 Hinge-F와 CD8 Hinge-R를 사용하고, 합성된 서열번호 17을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 147bp의 단편 e를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(7) 프라이머 CD8 Transmembrane-F와 CD8 Transmembrane-R를 사용하고, 합성된 서열번호 18을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 100bp의 단편 f를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(8) 프라이머 CD137-F와 CD137-R를 사용하고, 합성된 서열번호 19를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 142bp의 단편 g를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(9) 프라이머 TCR-F와 TCR-R를 사용하고, 합성된 서열번호 20을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 355bp의 단편 h를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(10) 각각 1μl의 DNA 단편 b, c, d를 주형으로 하고, 표 3의 반응계를 사용하였으며, 프라이머를 제외한 것을 Eppendorf 튜브에 넣었다. PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ6cycle이며, 프라이머 CD8 leader-F/VH-R을 첨가하고,（98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 40sec）ⅹ24cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 814bp의 단편 i를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure 112019060698216-pct00003
표 3 50 μl 중첩 PCR 반응계
(11) 각각 1μl의 DNA 단편 e, f, g, h를 주형으로 하고, 표 3의 반응계를 사용하였으며, 프라이머를 제외한 것을 Eppendorf 튜브에 넣었다. PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ6cycle이며, 프라이머CD8 Hinge-F/TCR-R을 첨가하고, （98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ24cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 704bp의 단편 j를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(12) 토탈 5μl의 DNA 단편 V1, a, i, j를, 1:1:1:1의 몰비로 Eppendorf 튜브에 첨가하고, 15μl의 동족 재조합 효소 반응액을 첨가하였으며, 균일하게 혼합 후 42℃에서 30분 동안 배양하고 얼음 위에 전이시켜 2 내지 3분 동안 놓아두었으며, 반응액을 50μl TOP10에 넣고 천천히 회전시켜 내용물을 균일하게 혼합시키고, 얼음에 30분간 놓아두었으며, 튜브를 42℃로 예열한 항온수욕조에 넣고 90초동안 열충격을 진행한 후 튜브를 빠르게 빙욕에 전이시키고 세포를 2 내지 3분 동안 냉각시켰으며, 튜브 당 900 μl LB 배양액을 가한 후, 튜브를 37℃의 진탕기로 전이시켜 1시간 동안 배양하여 세균이 소생하도록 하고, 100μl의 전환된 균액을 취하여 Amp LB 아가로스 플레이트에 도포하고, 플레이트를 거꾸로 하여, 항온 배양기에서 37℃하에 16시간동안 배양하였다. 클론을 취하여 군락 PCR 동정을 진행하여, 정확한 콜로니, 즉 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-Basic2를 동정하였으며, 정확한 콜로니에 대해 효소 절단 동정을 진행하였다(도 5를 참조).
(13) 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-Basic2에 대해, Sal I와 Nhe I 제한효소를 사용하여 이중 효소 절단을 진행하며, 생성물은 1.5%의 아가로스 겔 전기영동을 통해 8491bp의 단편 V2를 확인하였으며, 겔을 회수하여 Eppendorf 튜브에 넣고, MN회사의 아가로스 겔 추출키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(14) 프라이머 IRES-F와 IRES-R을 사용하며, 합성한 서열번호 25를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 605bp의 단편 k를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(15) 프라이머 PDL1s1-F와 PDL1s1-R을 사용하며, 합성한 서열번호 21을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 754bp의 단편 l을 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(16) 프라이머 PDL1s2-F와 PDL1s2-R을 사용하며, 합성한 서열번호 22를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 777bp의 단편 m을 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(17) 프라이머 PDL1s2-F와 PDL1s2-R을 사용하며, 합성한 서열번호 23을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 774bp의 단편 n을 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(18) 프라이머 s0-F와 s0-R을 사용하며, 합성한 서열번호 24를 주형으로, 표2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 729bp의 단편 o를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(19) 프라이머 Fc-F와 Fc-R을 사용하며, 합성한 서열번호 27를 주형으로, 표2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 2min）ⅹ35cycle, 72℃ 10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 726bp의 단편 p를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1을 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(20) 토탈 5μl의 DNA 단편（V2, k, l, p）, （V2, k, m, p）, （V2, k, n, p）, （V2, k, o, p）를, 1:1:1:1의 몰비로 Eppendorf 튜브에 첨가하고, 15μl의 동족 재조합 효소 반응액을 첨가하였으며, 균일하게 혼합 후 42℃에서 30분 동안 배양하고 얼음 위에 전이시켜 2 내지 3분 동안 놓아두었으며, 반응액을 50μl TOP10에 넣고 천천히 회전시켜 내용물을 균일하게 혼합시키고, 얼음에 30분간 놓아두었으며, 튜브를 42℃로 예열한 항온수욕조에 넣고 90초동안 열충격을 진행한 후 튜브를 빠르게 빙욕에 전이시키고 세포를 2 내지 3분 동안 냉각시켰으며, 튜브 당 900 μl LB 배양액을 가한 후, 튜브를 37℃의 진탕기로 전이시켜 1시간 동안 배양하여 세균이 소생하도록 하고, 100μl의 전환된 균액을 취하여 Amp LB 아가로스 플레이트에 도포하고, 플레이트를 거꾸로 하여, 항온 배양기에서 37℃하에 16시간동안 배양하였다. 콜로니를 취하여 군락 PCR 동정을 진행하여, 정확한 콜로니, 즉 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-PDL1scFv1、pCARmm-PDL1scFv2, pCARmm-PDL1scFv3 및 대조 pCARmm-scFv0을 동정하였으며, 정확한 콜로니에 대해 효소 절단 동정을 진행하였다(도 6을 참조).
2. 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0의 패키징
(1) 완전배지: 예열된 신선한 배지를 취하여, 10%FBS +5ml Pen-Srep를 가하고, 상하로 전도시켜 균일하게 혼합하였다.
(2) 1XPBS용액： NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g을 계량하여, 1000ml 비커에 넣고, 900ml Milli-Q grade 초순수를 넣어 용해시키고 용해가 끝난 후, 1000ml 메스실린더를 이용하여 1000ml로 정량하였으며, 121℃ 고온에서 습열 멸균을 20분 동안 진행하였다.
(3) 0.25%Trypsin용액: Trypsin 2.5g, EDTA 0.19729g을 계량하여 1000ml 비커에 넣고, 900ml 1XPBS를 가하여 용해시켰으며, 용해가 끝난 후, 1000ml 메스실린더로 1000ml로 정량하였으며, 0.22μM 여과시켜 균을 제거하였으며, 장기적으로 사용할 시 -20℃ 냉장고에 보관하였다.
(4) 0.5M CaCl2용액: 36.75g CaCl2를 계량하고 400ml Milli-Q grade 초순수로 용해시켰으며, Milli-Q grade 초순수로 총 체적을 500ml로 정량하고 균일하게 혼합하였다. 0.22μm 여과하여 균을 제거하고 50ml 원심분리 튜브에 분주하였으며, 튜브 당 45ml정도이고, 4℃에 보존하였다.
(5) 2XHBS용액: 4.09g NaCl, 0.269g Na2HPO4, 5.96g Hepes를 계량하고, 400ml Milli-Q grade 초순수로 용해시키고, pH기를 보정한 후, 2M NaOH 용액으로 HBS용액의 pH를 7.05로 조절하였다. 튜브 당 HBS의 pH를 조절하는데 2M NaOH를 3ml정도 소모하였다.
(6) 액체질소탱크에서 냉동 보존된 HEK293T/17세포를 취하여 신속히 37℃ 수욕으로 전이하였으며, 1 내지 2분 후 슈퍼클린벤치에 전이시켜, 무균 조작으로 냉동바이알 중의 액체를 전부 10cm2 배양 플레이트에 전이시키고, 10%FBS를 함유한 DMEM를 8mL/10cm2 dish로 보충하고, 24시간 후 현미경하에서 세포를 관찰하였으며, 세포포화 정도가 80%보다 클 경우 계대배양시켰다.
(7) 세포 상태가 양호하고, 오염이 없는 HEK293T/17세포를 선택하여, 2 내지 6개 배양접시를 한 조로 하여, 세포를 트립신 소화시킨 후, 전동 피펫으로 4 내지 12ml의 완전 배지를 취하고, 소화 후 배양접시마다 2ml를 가하였으며, 배양접시의 건조를 방지하였다. 1ml의 피펫으로 모든 세포를 단일 세포 현탁액으로 피펫팅하여, 배양 플라스크로 옮겼다.
(8) 상기 2 내지 6개의 배양접시 중의 잔존 세포를 배양 플라스크에 옮기고, 배지로 배양접시를 재차 세척하였다.
(9) 배양 플라스크의 뚜껑을 닫고 아래 위로 10번 정도 뒤집어 흔들어 세포 현탁액을 균일하게 혼합하였으며, 세포를 8 내지 24개의 10cm2 배양접시에 전이시켰으며, 배양 접시 당 세포밀도는 약 4 Х 106개/10ml 완전 배지 정도였다. 세포밀도가 예상한 것 보다 차이가 많이 나면, 세포를 계수하여, 4Х106개/접시 양으로 접종하였다.
(10) 6개 배양접시를 쌓는데 상하접시의 배합에 주의를 해야 한다. 배양접시를 좌우, 전후로 여러 번 흔들어 세포가 충분히 도포되게 한 후, 5% CO2 배양기에 넣었다. 나머지 세포도 동일하게 처리하였다.
(11) 계대 세포를 검사하였으며, 세포 포화도가 70 내지 80%여야 하며, 윤곽이 포만하고, 부착이 양호해야 하며, 세포 배양접시에 균일하게 분포되어야 한다.
(12) 세포를 위해 배양액을 교체하고, 배양접시를 신선한 완전배지로 대체하고, 접시 당 9ml이며, 배양기의 CO2 농도 설정치를 8%로 향상시켰다.
(13) N+0.5에 따라 DNA/CaCl2용액을 제조하였다, 접시 당 HEK293T/17 세포의 형질주입 플라스미드 양은 하기 비율에 따라 사용한다. 재조합 렌티바이러스 플라스미드(20μg), pPac-GP (15μg), pPac-R (10μg), pEnv-G (7.5μg). 새로운 5ml 원심분리 튜브 한 개를 취하여, 0.5M CaCl2：0.25ml, 재조합 렌티바이러스 플라스미드 20μg: pPac-GP 15μg: pPac-R 10μg: pEnv-G 7.5μg를 가하고, 초순수를 보충하여 0.5ml되게 하며 뚜껑을 닫아, 충분히 균일하게 혼합하였다.
(14) 또 다른 5ml 원심분리 튜브 한 개를 취하여, 0.5ml DNA/CaCl2 용액을 가하였다. 볼텍스 믹스를 열고, 한 손으로 5ml 원심분리 튜브의 상단을 쥐어 튜브 하단이 믹서에 접속하게 하여, 액체가 튜브 벽에서 확산되어 유동하도록 하며, 다른 한 손으로 1mL 피펫을 쥐고 0.5mL 2ХHBS용액을 흡수하여 원심분리 튜브에 천천히 떨어뜨리면서 유속을 제어하며, 30초 동안 전부 떨어뜨리는 것이 적당하다. 2ХHBS를 가한 후, 지속적으로 5초 동안 진탕시키며, 진탕이 끝나면 직접 형질주입이 필요한 세포에 가할 수 있다.
(15) 하나의 배양접시의 세포에, 원심분리 튜브 중의 1mL 칼슘 형질주입 액을 떨어뜨렸으며, 될수록 칼슘 형질주입 시약이 전체 배양접시에 분포되도록 하였다.
(16) 칼슘 형질주입액을 가한 후, 배양접시에 표기를 해놓고, 배양접시를 다른 5% CO2 배양기에 넣었다. 배양접시가 수평으로 놓이게끔 확보하였으며, 6개 이상의 배양접시를 쌓지 말아야 한다. 5% CO2 배양기에 6 내지 8시간 방치하였다.
(17) 첫 번째 배양기의 CO2 농도 설정치를 5%로 다시 돌려놓았다.
(18) 24시간 후, 세포 상태를 검사하였다. 세포 포화도가 약 80 내지 85%이며, 상태가 양호해야 한다. 배지를 흡수하여 버리고 10ml 새로운 DMEM 완전 배지로 교체하였다.
(19) 48시간 후, 형질주입 효율을 관찰하였다. 대부분의 세포는 여전히 벽에 부착하였다. 95%를 초과하는 세포가 모두 녹색형광을 갖고 있음이 발견되었다. 동일한 바이러스 패키징 상청액을 같이 수집하며, 배양접시에 10ml 신선한 배지를 계속 첨가하였다.
(20) 72시간 후, 다시 동일한 바이러스 상청액을 같이 수집하였으며, 두 번 수집한 바이러스를 함께 둘 수 있으며, 배양 접시를 버렸다. 이때 수집한 상청액에는 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0이 포함되어 있다.
실시예 2 재조합 렌티바이러스 벡터의 농축 및 검출
1. 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 정제된 재조합 렌티바이러스 벡터(도 7에 표시된 바와 같다)
(1) 수집한 상청액을 Thermo 진공펌프를 사용하여, 0.22μm 내지 0.8μm의 PES 필터로 흡인 여과하여 불순물을 제거하였다.
(2) 1.5M NaCl 250 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）를 1:1 내지 1:10의 비율로 상청액에 첨가하였다.
(3) 2개의 이온 교환 컬럼을 직렬로 배치하고, 4ml 1M NaOH, 4ml 1M NaCl, 5ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）용액으로 컬럼을 순차적으로 통과시켰다.
(4) 단계 2에서 얻은 용액을 연동 펌프를 통해 1 내지 10 ml/분의 속도로 이온 교환 컬럼에 주입하였다.
(5) 모든 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 10ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）용액으로 1 회 세척하였다.
(6) 시료 주입량에 따라 1 내지 5ml 1.5M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）를 사용하여 용출하였으며, 용출액을 수집하였다.
(7) 용출액을 25 내지 50μl의 튜브에 나누어 넣고, -80℃ 냉장고에 냉동 보관하여 장기간 보존하였다.
2. 적정농도 측정
(1) 24웰 플레이트를 사용하여 293T 세포를 접종하였다. 웰당 세포는 5Х104개이며, 첨가한 배지의 체적은 500ul이며, 서로 다른 종류의 세포성장 속도에는 일정한 차이가 있으며, 바이러스 감염시 세포 포화도는 40% 내지 60%이다.
(2) 3개의 무균 EP 튜브를 준비하며, 튜브 당 90ul의 신선한 완전배지(고당 DMEM+10%FBS)를 가하여 세포를 접종한 24시간 후, 2개 웰의 세포를 취하여 혈구계수판으로 수량을 체크하여, 감염시 세포의 실제 수량을 확정하여, N으로 표기하였다.
(3) 측정하려는 바이러스 원액 10μl를 제1튜브에 넣고 가볍게 흔들어 균일하게 혼합한 후, 10μl를 취하여 제2튜브에 넣었으며, 이렇게 마지막 튜브까지 순차적으로 조작하였다. 튜브 당 410μl 완전 배지（고당 DMEM+10%FBS）를 가하여, 최종 체적을 500ul로 하였다.
(4) 감염이 시작된 지 20시간 후, 배양 상청액을 제거하고, 500ul 완전 배지（고당 DMEM+10%FBS）로 교체하여, 5%CO2에서 48시간 지속적으로 배양하였다.
(5) 72시간 후, 형광 발현 상황을 관찰하였으며, 정상조건하에, 희석배수의 증가에 따라 형광 세포수는 상응하게 감소되며, 이를 사진 찍었다.
(6) 0.2ml 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 세포를 소화시키고, 37℃에 1분동안 방치하였다. 배지로 전체 세포면을 세척하고 원심분리시켜 세포를 수집하였다. DNeasy 키트의 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 튜브 당 200μl 용출액을 가하여 DNA를 세척하고 정량화 하였다.
(7) 표적 DNA를 준비하여, qPCRmix 토탈 튜브Ⅰ를 측정하였다(QPCR 프라이머 서열은 서열번호 57---서열번호 58이다).
Figure 112019060698216-pct00004
n = 반응수(number of reactions). 예를 들면: 총 반응수는 40이며, 1ml 2Х TaqMan Universal PCR Master Mix, 4μl 포워드 프라이머, 4μl 리버스 프라이머, 4μl probe 및 788μl H2O를 혼합하였다. 진탕 후 얼음 위에 놓았다.
(8) 참조 DNA를 준비하여 qPCRmix튜브Ⅱ를 검출하였다(QPCR 프라이머 서열은 서열번호 59---서열번호 60이다).
Figure 112019060698216-pct00005
n = 반응수(number of reactions). 예를 들면: 총 반응수는 40이며, 1ml 2Х TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10ХRNaseP primer/probe mix 및 700μl H2O를 혼합하였다. 진탕 후 얼음위에 놓았다.
(9) 사전에 냉각시킨 96웰 PCR 플레이트에서 PCR계를 제조하였다. 총 튜브Ⅰ에서 각각 45μl를 취하여 A 내지 D의 각 행의 웰에 넣고, 총 튜브Ⅱ에서 각각 45μl를 취하여 E 내지 G의 각 행의 웰에 넣었다.
(10) 5μ의 플라스미드 표준 품과 테스트용 샘플 게놈 DNA를 취하여 각각 A 내지 D행에 가하고, 매개 샘플을 1차 반복하였다. 또 따로 웰 하나를 남겨 5μl의 물을 넣어 주형프리 대조로 하였다(no-template control).
(11) 5μ의 게놈 표준액과 테스트용 샘플 게놈 DNA를 취하여 각각 E 내지 G행에 가하고, 매개 샘플을 1차 반복하였다. 또 따로 웰 하나를 남겨 5μl의 물을 넣어 주형프리 대조로 하였다(no-template control).
(12) 정량적 PCR기는 ABI PRISM 7500 정량 시스템이다. 사이클링 조건은: 50℃ 2분, 95℃ 10분, 이어서 95℃ 15초, 60℃ 1분인 40개 사이클이다.
데이터 분석: 측정된 DNA샘플 중 통합된 렌티바이러스 벡터 카피 수를 게놈 수를 사용하여 보정하여, 게놈 당 통합된 바이러스 카피 수를 얻었다.
적정농도（integration units per ml，IU ml-1）의 계산 공식은 하기와 같다.
IU ml-1 = (C ХNХ DХ1000)/V
그 중: C =게놈 당 통합된 평균 바이러스 카피 수
N = 감염시 세포 수량（약 1Х105）
D = 바이러스 벡터의 희석 배수
V = 첨가한 희석된 바이러스의 체적 수
(13) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0의 적정농도 결과(도 8에 표시된 바와 같다)
3. 내독소 측정
(1) 내독소 작업 표준 품은 15EU/대이다.
(2) 투구게 시약 감수성 λ＝0.25EU/ml, 0.5ml/튜브
(3) 내독소 표준품 희석: 내독소 표준품 한대를 준비하여, 각각 BET 용액으로 비율에 따라 4λ 및 2λ로 희석 용해하고, 밀봉 막으로 입구를 밀봉하고, 15분동안 진탕 용해시켰다. 희석시 한번 희석할 때마다 볼텍스 믹서기에서 30초동안 균일하게 혼합시켰다.
(4) 로딩: 투구게 시약 몇 개를 취하여, 개 당 BET용액 0.5ml를 가하여 용해시키고, 몇 개의 무 내독소 튜브에 분주하였으며, 튜브 당 0.1ml이다. 그 중 2개 튜브는 음성 대조튜브이며, BET용액을 0.1ml 가하였다.
2개 튜브는 양성 대조튜브이고, 2λ 농도의 내독소 작업 표준품 용액 0.1ml를 가하였다.
2개는 샘플 양성 대조튜브이고, 0.1ml의 2λ 내독소 표준품 용액을 포함한 샘플용액(20배 희석한 테스트 샘플 1ml + 4λ의 내독소 표준품 용액 1ml=2ml의 2λ 내독소 표준품 용액을 포함한 40배 희석 샘플)을 가하였다.
샘플튜브에 0.1ml의 샘플을 가하며, 희석비율은 표 5를 참조로 하며, 37±1℃ 수욕(또는 배양기)에서 60±1min 보온시켰다.
Figure 112019060698216-pct00006
표 5 내독소 희석비율 및 상응한 내독소 함량
(5) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0의 내독소 검출결과(표 6에 표시한 바와 같다), 내독소 함량이 0 내지 2.5 EU/ml이며, 요구에 부합된다.
Figure 112019060698216-pct00007
표 6 렌티바이러스 재조합 바이러스의 내독소 검출결과
4. 마이코플라즈마의 검출 및 비교
(1) 실험 3일전, 세포샘플을 무 항생제 배지에서 배양하였다.
(2) 1ml세포 현탁액(세포수는 1Х105보다 크다)을 수집하여, 1.5ml 원심분리 튜브에 넣었다.
(3) 13000×g에서 1분 동안 원심분리하여, 침전을 수집하고, 배지를 제거하였다.
(4) 500ul PBS을 가하여, 피펫으로 피펫팅하거나 또는 볼텍스 믹스로 진탕시키고, 다시 현탁시켜 침전시켰다. 13000×g에서 5분 동안 원심분리하였다.
(5) 단계 4를 다시 한번 반복하였다.
(6) 50μl 세포 용출 버퍼(Cell Lysis Buffer)를 가하고, 피펫으로 피펫팅하여 충분히 혼합한 후, 55℃ 수욕에서 20분 동안 배양하였다.
(7) 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하였다.
(8) 13000×g에서 5분 동안 원심분리한 후，5μl 상청액을 취하여 주형으로 하였으며, 25μl PCR의 반응계는: ddH20 6.5μl, Myco Mix 1μl, 2x Taq Plus Mix Master(Dye Plus) 12.5μl, 주형 5μl이다. PCR 사이클링 조건은：95℃ 30sec, （95℃ 30sec, 56℃ 30sec, 72℃ 30sec）×30cycle, 72℃ 5min이다.
(9) 마이코 플라즈마 검출 결과로부터(도 9에 표시한 바와 같다), 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0이 모두 마이코 플라즈마를 포함하지 않았음을 알 수 있다.
실시예 3 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0의 기능 측정
1. CAR 유전자의 세포 수준 발현 검출
(1) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0와 대조 바이러스 MOCK로 PBMC 세포를 감염시킨 후, 수집한 세포를 RT-PCR을 이용하여 CAR 유전자와 scFv 유전자의 mRNA 전사 수준을 검출하여, CAR 유전자와 scFv유전자의 발현을 검증하였으며, CAR 유전자의 scFv 유전자의 mRNA의 전사 수준이 증가하면, CAR 유전자와 scFv 유전자의 전사 수준이 성공적으로 발현되었음을 설명한다.
(2) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0와 대조 바이러스 MOCK로 PBMC 세포를 감염시킨 후, 수집한 세포를 western blot을 이용하여 CAR 단백질의 발현 수준을 검출하여, CAR 유전자의 발현을 검증하였으며, CAR 단백질의 수준이 증가하면, CAR 유전자의 번역 수준이 성공적으로 발현되었음을 설명한다.
(3) 재조합 렌티바이러스 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0와 대조 바이러스 MOCK로 각각 PBMC세포를 감염시키고, 세포배양 상청액을 수집하여, ELISA를 진행하여 scFv단백질의 발현 수준을 검출하였으며, scFv 유전자의 발현을 검증하였으며, scFv단백질의 발현 레벨이 높아지면 scFv 유전자의 번역 레벨 발현이 성공하였음을 설명한다.
(4) MOI=15인 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0와 대조 바이러스 Mock로 각각 세포를 감염시키고, 48시간 후에 6웰 플레이트에서 추출한 세포의 토탈 RNA 및 토탈 단백질에 대해 형광 정량적 PCR 및 면역 블럿팅 실험을 진행하였다. 구체적인 단계: 6웰 플레이트의 4웰을 코팅하고, 각 웰에 상응한 PBS 및 RN을 가하고, 4℃에서 하룻밤 지냈다. 12시간 후에 MOI=15로 바이러스를 코팅하고, 37℃ 배양기에 넣어 5시간 두었다. 6웰 플레이트를 취하여, 바이러스 상청액을 제거하고, PBS로 두 번 세척하고, 1Х106/웰로 PBMC(림프구 세포 분리액으로 인간 혈중에서 분리)로 코팅한 후, 500ul의 배지(10%혈청, 20U/ml IL-2, Polybrene 8ug/ml를 포함)를 넣었다. 20분 동안 방치하고, 1000g에서, 20℃에서 30분 동안 원심분리하고, 37℃에서 48시간 배양하였다.
(5) 6웰 플레이트에서 PBMC 세포의 토탈 RNA를 Trizol 방법으로 추출하고, cDNA를 역전사에 의해 증폭시켰으며, CAR 유전자의 QPCR 프라이머(서열은 서열번호 61 내지 서열번호 62)와 scFv유전자 QPCR 프라이머(서열은 서열번호 67 내지 서열번호 68)를 사용하여 형광 정량 PCR 실험을 진행하였으며, 반응계는 표 7을 참고로 하며, 참조 Actin을 대조군으로 하여, mRNA의 전사 정황을 검증하였다.
Figure 112019060698216-pct00008
표 7 20μl qPCR 반응계
(6) 웨스턴 블롯(Western Blot)은 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 통해 PBMC로부터 추출한 토탈 단백질을 상대적 분자량에 따라 분리하는 것이다. 습식 트랜스퍼(4℃, 400 mA, 120min)를 통해, 단백질을 PVDF막에 전이시켰다. 블로킹 용액(5% 탈지우유를 함유한 TBST 용액)으로 실온에서 PVDF막을 1시간 동안 블로킹하고, 블로킹 용액으로 1:1000으로 Biotinylated protein L을 희석한 후, 블로킹한 PVDF막으로 실온에서 배양하고 4℃에서 하룻밤을 지냈다. TBST로 막을 3번 세척하였으며, 매번 10분 동안 세척하였다. 블로킹 용액으로 1:500으로 상응한 SA-HRP를 희석하였으며, 실온에서 PVDF 막을 2시간 동안 배양하였으며, TBST으로 막을 3번 세척하였으며, 매번 10분 동안 세척하였다. Amersham회사의 ECL+plusTM Western blotting System 키트를 이용하여 현상하였다. X선 현상을 통해 밴드를 나타낸 필름을 얻었다.
(7) 효소면역분석법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에서, 1:2, 1:5, 1:10로 희석한 세포 배양 상청액을 96웰 플레이트에 도포시키는 동시에 음성대조, 양성 대조 및 블랭크 웰을 설정하고 4℃에서 하룻밤을 지냈다. 다음날 3차 세척하고, 반응 웰에 신선한 0.1ml의 1:10000로 희석한 proteinG-HRP를 넣고, 37℃에서 30 내지 60분 동안 배양하고, 세척하고, 마지막으로 정제수로 세척하였다. 반응 웰에 TMB 기질 용액 0.1ml을 넣고, 37℃에서 10 내지 30분 동안 배양하였다. 각 반응 웰에 ELISA 반응 정지액 0.05ml를 넣었다. 마이크로 플레이트 리더로, 405nm에서, 각 웰의 OD값을 구하였다.
(8) RT-QPCR 검출을 통해, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC를 감염시킨 후의 CAR 유전자와 scFv 유전자의 전사 수준이 블랭크 세포에 비해 현저히 제고됨을 확인하였으며(도 10에 표시된 바와 같이), 이는 CAR 유전자와 scFv 유전자의 전사 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
(9) 웨스턴 블롯((Western Blot)의 결과는, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC을 감염시킨 후, CAR 단백질의 발현 레벨은 대조 바이러스 MOCK와 블랭크(blank) 세포에 비해 현저히 증가되었음을 표명하며(도 11에 표시된 바와 같이), CAR 유전자의 번역 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
(10) 효소면역측정법(ELISA)의 결과는, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC를 감염시킨 후 scFv 단백질의 발현 수준은 대조 바이러스 MOCK와 블랭크 세포에 비해 현저히 증가되었으며(도 12에 표시된 바와 같이), 이는 scFv유전자의 번역 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
2. 세포 사멸 실험 효과 평가
(1) 각각 BCMA-K562세포와 PBMC세포를 배양하였다.
(2) 실험 시작 4일전, MOI=15인 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0 바이러스로 PBMC세포를 감염시키고, 72 내지 96h 배양한 후 실험을 시작할 수 있다.
(3) 표적세포（BCMA+K562）4x105cells과 주효세포（lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0을 각각 PBMC 세포에 형질주입）2.8x106cells를 수집하였으며, 800g에서 6min 원심분리하여, 상청액을 제거하였다.
(4) 1ml 1xPBS용액으로 각각 표적세포와 주효세포를 다시 현탁시키기고, 800g에서, 6분동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다.
(5) 단계 3을 한번 반복하였다.
(6) 700ul 배지（1640 배지+10% FBS）로 주효세포를 다시 현탁시키고, 2ml 배지（1640배지+10% FBS）로 표적세포를 다시 현탁시켰다.
(7) 주효세포와 표적세포의 비가 1:1, 5:1, 10:1인 실험 웰을 설정하였으며, 대조군을 설정하고, 군 당 3개 반복으로 하였다.
(8) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(9) 37℃ 5%CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
(10) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(11) 매개 웰에서 50μl의 상청액을 취하여, 새로운 96웰 플레이트에 넣고, 웰 당 50ul 기질 용액을 가하였다(빛 차단 조작).
(12) 빛을 차단하여 25분 동안 배양하였다.
(13) 매개 웰에 50ul 정지액을 가하였다.
(14) 마이크로 플레이트 리더로 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(15) 3개 반복 웰에서 평균치를 얻었다. 모든 실험 웰, 표적세포 웰 및 주효세포 웰의 흡광도 값에서 배지 배경 흡광도의 평균값을 감하였으며, 표적 세포의 최대치의 흡광도 값에서 체적 보정 대조 흡광도 값의 평균값을 감하였다.
(16) 단계 15에서 얻은 보정을 거친 값을 하기 식에 대입하여, 매개 주효세포와 표적세포 비에서 생성된 세포독성 백분율을 계산하였다. 결과는 도 13에 표시된 바와 같이, lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0 재조합 렌티바이러스 벡터가 형질 도입된 PBMC세포는 몇 개의 주효세포와 표적세포의 비의 조건하에서 사멸 효율이 PBMC 블랭크 세포와 대조 바이러스에 비해 현저히 높았으며, 이는 scFv 유전자의 발현이 CAR 유전자의 기능에 대한 영향이 비교적 적음을 설명한다.
사멸 효율=（실험 웰주효세포 웰표적세포 웰）/（표적 세포의 최대 웰표적 세포 웰）X100%
3. PDL1 차단 효과 평가(PD1, IL2, TNFα, IFNγ mRNA 전사 레벨)
(1) 각각 BCMA-PDL1-K562세포와 PBMC세포를 배양하였다.
(2) 실험 시작 4일전, MOI=15인 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0 바이러스로 PBMC세포를 감염시키고, 72 내지 96h 배양한 후 실험을 시작할 수 있다.
(3) 표적세포（BCMA-PDL1-K562）4x105cells과 주효세포（lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0을 각각 PBMC 세포에 형질주입）2.8x106cells를 수집하였으며, 800g에서 6min 원심분리하여, 상청액을 제거하였다.
(4) 1ml 1xPBS 용액으로 각각 표적세포와 주효세포를 다시 한번 현탁시키고, 800g에서 6min 원심분리하여, 상청액을 제거하였다.
(5) 단계 4를 한번 반복하였다.
(6) 700ul 배지（1640배지+10% FBS）로 주효세포를 다시 한번 현탁시키고, 2ml배지（1640배지+10% FBS）로 표적세포를 다시 현탁시켰다.
(7) 주효세포와 표적세포의 비가 10:1인 실험 웰을 설정하였으며, 대조군을 설정하였다.
(8) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(9) 37℃ 5%CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하고, 1000xg에서 2분 동안 플레이트 원심분리하여, 세포를 수집하여 토탈 mRNA를 추출하였으며, cDNA 역전사를 거쳐, PD1, IL2, TNFα, IFNγ mRNA 전사 레벨을 검출하였다.
(10) PD1 유전자 QPCR 프라이머(서열은 서열번호 63 내지 서열번호 64)와 IL2 유전자 QPCR 프라이머(서열은 서열번호 65 내지 서열번호 66), TNFα 유전자 QPCR 프라이머（서열번호 69 내지 서열변호 70）， IFNγ 유전자 QPCR 프라이머（서열번호 71 내지 서열번호 72）를 사용하여 형광 정량 PCR 실험을 진행하였으며, 반응계는 표 6을 참고로 하며, 참조 Actin을 대조군으로 하여, mRNA의 전사 상황을 검증하였다.
(11) RT-QPCR 검출 결과에 따르면, lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0 형질 주입된 PBMC와 표적세포를 배양한 후, PD1 유전자의 mRNA 수준과 Mock 그룹과 블랭크 세포그룹에 비해 현저히 높아졌으며, lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3, lvCARmm-scFv0 네 개 그룹 사이의 PD1유전자의 mRNA 수준은 큰 차이가 없었다（도 14에 표시한 바와 같이），이는, T세포가 활성화 된 후, PD1의 발현 수준도 동시에 증가하였음을 설명한다. 그 후에 IL2, TNFα, IFNγ mRNA전사 수준에 대한 검출을 통해 lvCARmm-PDL1scFv1, lvCARmm-PDL1scFv2, lvCARmm-PDL1scFv3 세개 그룹과 대조 바이러스 lvCARmm-scFv0 그룹에 비해, IL2, TNFα, IFNγ mRNA 전사 수준이 현저히 높아졌으며, 그 중 lvCARmm-PDL1scFv1 그룹의 IL2, TNFα, IFNγ 유전자의 전사 mRNA 수준이 가장 현저히 제고되었음을 발견하였으며（도 15에 표시한 바와 같이）, IL2, TNFα, IFNγ 유전자의 발현 수준이 높을 수록, T세포가 더욱 활성화 상태에 있음을 설명하며, lvCARmm-PDL1scFv1 그룹이 PD1/PDL1 신호 경로를 효과적으로 차단할 수 있어, T세포 활성화 관련 유전자의 억제작용을 해제함을 설명하며, 면역 회피의 억제 효과에 달하여, CAR-T세포치료에서 실체 종양에 대한 치료효과를 향상시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Unicar-Therapy Bio-Medicine Technology Co., Ltd. <120> PDL1 BLOCK CAR-T TRANSGENIC VECTOR FOR SUPPRESSING IMMUNE ESCAPE, PREPARATION METHOD THEREOF, AND APPLICATION OF THE SAME <130> GBSHHY004 <150> PCT/CN2017/110656 <151> 2017-11-13 <150> 2016111032946 <151> 2016-12-05 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 1 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 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<211> 180 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 5 ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60 tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120 gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180 <210> 6 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 6 tgctagagat tttccacact gactaaaagg gtctgaggga tctctagtta ccagagtcac 60 acaacagacg ggcacacact acttgaagca ctcaaggcaa gctttattga ggcttaagca 120 gtgggttccc tagttagcca gagagctccc aggctcagat ctggtctaac cagagagacc 180 cagtacaagc aaaaagcaga tcttattttc gttgggagtg aattagccct tcca 234 <210> 7 <211> 353 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence is synthetized <400> 7 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc 60 ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg 120 agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa 180 tactgggaca 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Claims (10)

  1. 서열번호 1에 표시된 것과 같은 표적균주의 대량 증식에 사용되는 암피실린 내성 유전자 AmpR에 상응하는 염기서열;
    서열번호 2에 표시된 것과 같은 플라스미드 복제에 사용되는 원핵 리플리콘 pUC Ori에 상응하는 염기서열;
    서열번호 3에 표시된 것과 같은 진핵세포내에서 복제를 강화시키는데 사용되는 바이러스 리플리콘 SV40 Ori에 상응하는 염기서열;
    서열번호 11에 표시된 것과 같은 형질전환 유전자의 발현율의 증가에 사용되는 마멋 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트(WPRE; Woodchuck hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element)에 상응하는 염기서열;
    서열번호 12에 표시된 것과 같은 키메라 항원 수용체 유전자의 진핵 전사에 사용되는 인간 EF1α 프로모터에 상응하는 염기서열;
    렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열;
    서열번호 21에 표시된 것과 같은 PDL1scFv1에 상응하는 염기서열, 또는 서열번호 22에 표시된 것과 같은 PDL1scFv2에 상응하는 염기서열, 또는 서열번호 23에 표시된 것과 같은 PDL1scFv3에 상응하는 염기서열인 인간 PDL1의 인간화 단쇄 항체에 상응하는 염기서열;
    서열번호 25에 표시된 것과 같은 발현 단백질의 동시 전사에 사용되는 IRES 리보솜 결합 서열에 상응하는 염기서열;
    서열번호 26에 표시된 것과 같은 IL6 신호 펩타이드에 상응하는 염기서열;
    서열번호 27에 표시된 것과 같은 인간 항체 Fc 단편에 상응하는 염기서열; 및
    2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체에 상응하는 염기서열을 포함하며,
    여기서, 2세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체에 상응하는 염기서열은, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 리더(CD8 leader)에 상응하는 염기서열, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL에 상응하는 염기서열, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C에 상응하는 염기서열, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH에 상응하는 염기서열, 서열번호 17로 표시된 것과 같은 CD8 힌지(CD8 Hinge)에 상응하는 염기서열, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 막 관통 영역(CD8 Transmembrane)에 상응하는 염기서열, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 공동자극인자(CD137 costimulatory factor)에 상응하는 염기서열，및 서열번호 20으로 표시된 TCR 활성화 영역(T-cell recepter activation domains)에 상응하는 염기서열을 포함하며,
    3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체에 상응하는 염기서열은, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 리더(CD8 leader)에 상응하는 염기서열, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL에 상응하는 염기서열, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C에 상응하는 염기서열, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH에 상응하는 염기서열, 서열번호 17로 표시된 것과 같은 CD8 힌지(CD8 Hinge)에 상응하는 염기서열, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 막 관통 영역(CD8 Transmembrane)에 상응하는 염기서열, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 공동자극인자(CD137 costimulatory factor)에 상응하는 염기서열，서열번호 20으로 표시된 TCR 활성화 영역(T-cell recepter activation domains)에 상응하는 염기서열, 및 서열번호 28로 표시된 것과 같은 CD28 공동자극인자(CD28 costimulatory factor)에 상응하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는
    PDL1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 인간 PDL1의 인간화 단쇄 항체에 상응하는 염기서열은 서열번호 21에 표시된 것과 같은 PDL1scFv1에 상응하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 2세대 렌티바이러스 벡터이며, 상기 2세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR에 상응하는 염기서열, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR에 상응하는 염기서열, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 서열번호 8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 3세대 렌티바이러스 벡터이며,
    상기 3세대 렌티바이러스 벡터는 서열번호 5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR에 상응하는 염기서열, 서열번호 6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR에 상응하는 염기서열, 서열번호 7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 서열번호 8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 서열번호 9로 표시된 env 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 서열번호 10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 및 서열번호 4로 표시된 RSV 프로모터에 상응하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 마멋 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트(WPRE; Woodchuck hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element)에 상응하는 염기서열은 6개의 뉴클레오티드의 돌연변이를 갖고 있으며, 구체적으로, g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T인 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. (1) 서열번호 1로 표시된 것과 같은 암피실린 내성 유전자 AmpR에 상응하는 염기서열, 서열번호 2로 표시된 것과 같은 원핵 리플리콘 pUC Ori에 상응하는 염기서열, 서열번호 3으로 표시된 것과 같은 바이러스 리플리콘 SV40 Ori에 상응하는 염기서열, 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티 바이러스 패키징 시스 엘리먼트에 상응하는 염기서열, 서열번호 11로 표시된 것과 같은 마멋 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트(WPRE; Woodchuck hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element)에 상응하는 염기서열을 렌티바이러스 백본 플라스미드에 저장하는 단계;
    (2) 서열번호 12로 표시된 것과 같은 인간 EF1α 프로모터에 상응하는 염기서열, 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체에 상응하는 염기서열로 2세대 CAR 또는 3세대 CAR로 조성하는 효소절단, 연결, 재조합 반응을 통해 렌티바이러스 백본 플라스미드에 클로닝하여, 2세대 CAR 또는 3세대 CAR를 포함하는 재조합 렌티바이러스 플라스미드를 얻는 단계로서,
    여기서, 2세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체에 상응하는 염기서열은, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 리더(CD8 leader)에 상응하는 염기서열, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL에 상응하는 염기서열, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C에 상응하는 염기서열, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH에 상응하는 염기서열, 서열번호 17로 표시된 것과 같은 CD8 힌지(CD8 Hinge) 에 상응하는 염기서열, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 막 관통 영역(CD8 Transmembrane)에 상응하는 염기서열, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 공동자극인자(CD137 costimulatory factor)에 상응하는 염기서열，및 서열번호 20으로 표시된 TCR 활성화 영역(T-cell recepter activation domains)에 상응하는 염기서열을 포함하며,
    3세대 CAR의 조성에 사용되는 키메라 항원 수용체에 상응하는 염기서열은, 서열번호 13으로 표시된 것과 같은 CD8 리더(CD8 leader)에 상응하는 염기서열, 서열번호 14로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL에 상응하는 염기서열, 서열번호 15로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C에 상응하는 염기서열, 서열번호 16으로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH에 상응하는 염기서열, 서열번호 17로 표시된 것 과 같은 CD8 힌지(CD8 Hinge)에 상응하는 염기서열, 서열번호 18로 표시된 것과 같은 CD8 막 관통 영역(CD8 Transmembrane)에 상응하는 염기서열, 서열번호 19로 표시된 것과 같은 CD137 공동자극인자(CD137 costimulatory factor)에 상응하는 염기서열，서열번호 20으로 표시된 TCR 활성화 영역(T-cell recepter activation domains)에 상응하는 염기서열, 및 서열번호 28로 표시된 것과 같은 CD28 공동자극인자(CD28 costimulatory factor)에 상응하는 염기서열을 포함하는, 단계;
    (3) 상기 인간 PDL1의 인간화 단쇄 항체 PDL1scFv1, PDL1scFv2 또는 PDL1scFv3에 상응하는 염기서열, IRES 리보솜 결합서열에 상응하는 염기서열, IL6 신호 펩타이드에 상응하는 염기서열 및 인간유래 항체 Fc에 상응하는 염기서열을 각각 재조합 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하여, PDL1 녹다운 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-PDL1scFv1, pCARmm-PDL1scFv2 또는 pCARmm-PDL1scFv3을 얻는 단계;
    (4) 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARmm-PDL1scFv1, pCARmm-PDL1scFv2 또는 pCARmm-PDL1scFv3을 각각 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G와 함께 HEK293T/17세포에 형질 주입시키며, HEK293T/17세포내에서 유전자 전사 발현을 진행한 후, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 패키징에 성공시켜 세포 배양액 상층에 방출시키며, 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함한 상청액을 수집하는 단계;
    (5) 얻은 재조합 렌티바이러스 상청액을 흡인여과, 흡착, 용출에 의한 칼럼정제 방법으로 정제하여 각각 재조합 렌티바이러스 벡터를 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 1 내지 4 및 청구항 6 중 어느 한 항의 PDL1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 CAR-T 형질 전환 벡터의 구축방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    단계 (3)에서, 인간 EF1α 프로모터는 전체 CAR 유전자의 발현을 작동시키며; CAR 단백질은 세포막 표면에 위치하여, BCMA 항원을 인식하며, T세포 증식과 사이토카인 분비를 자극하여, 다운스트림 신호 전달경로의 발현을 활성화시키며; scfv 영역과 BCMA 항원이 결합할 경우, 신호는 키메라 수용체를 통해 세포 내로 전달되며, 이로써 T세포 증식, 사이토카인 분비증가, 항 세포사멸 단백질 분비 증가, 세포사멸 지연, 표적 세포의 용해를 포함하는 일련의 생물학적 효과를 일으키며; IRES 리보솜 결합 서열에 의해 PDL1scFv와 Fc의 융합단백질을 동시에 발현시키며; IL6 신호 펩타이드의 유도 하에 세포 외에 분비되며, PDL1와의 결합을 통해 PD1과 PDL1의 결합을 차단시켜, 이로써 PD1/PDL1의 신호 경로를 차단하여, 면역회피 효과를 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    단계 (5)에서, 상기 흡인여과에서 상청액 체적을 200ml 내지 2000ml로, 진공도를 -0.5MPA 내지 -0.9MPA로 제어하여, 웰 막힘으로 인한 벡터의 손실을 방지하며; 상기 흡착에서 용액의 pH값을 6 내지 8로 제어하여, pH 변화에 의한 벡터의 비활성화를 방지하며; 상기 용출에서 용출액의 이온강도를 0.5M 내지 1.0M로 제어하여, 이온강도의 변화에 의한 불완전 용출 또는 벡터의 비활성화를 방지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1 내지 4 및 청구항 6 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 포함하는, 면역회피 억제용 약학 조성물.
KR1020197017093A 2016-12-05 2017-11-13 일종의 pdl1 차단을 통한 면역회피 억제에 사용되는 car-t 형질전환 벡터 및 그의 구축방법과 용도 KR102157197B1 (ko)

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