KR102266751B1 - 인간 PD-1를 녹다운시킨 siRNA, 재조합발현 CAR-T 벡터 및 그의 제조방법과 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 PD-1을 녹다운시킨 siRNA, 재조합 발현 CAR-T 벡터 및 제조방법과 용도를 제공하였다. 그중 PD-1을 녹다운시킨 siRNA는 발현 프레임 및 그의 siRNA 발현 산물은 CAR-T 치료를 통한 다발성 골수종(MM)에서 종양의 면역 탈출 메커니즘의 제거 또는 경감에 사용될 뿐만 아니라, 또한 췌장암, 뇌신경교종, 골수종 등 유형의 종양 치료 시 면역 탈출 메커니즘 억제에 사용할 수 있다.

Description

인간 PD-1를 녹다운시킨 siRNA, 재조합발현 CAR-T 벡터 및 그의 제조방법과 용도
본 발명은 종양 면역 요법의 기술분야에 속하며, 구체적으로, 인간 프로그램화된 사멸 수용체1(PD-1)을 녹다운시킨 siRNA, 재조합 발현CAR-T벡터(특히, 일종의 PD-1을 녹다운시켜 종양의 면역탈출 메커니즘을 제거시키거나 경감시키는 CAR-T 형질전환 유전자 벡터) 및 그의 제조방법과 용도에 관한 것이다.
종양면역 요법의 이론적 근거는 면역계가 종양관련 항원을 인식하고, 종양세포에 대한 신체의 공격을 조절하는(고도로 특이적인 세포 용해) 능력을 가지고 있다는 것이다. 1950년대, 버넷(Burnet)과 토마스(Thomas)는 인체에서 늘 나타나는 돌연변이 된 종양세포는 면역계에 의해 인식되고 제거된다는 "면역 감시"이론을 제기하였으며, 종양 면역 요법에 이론적 토대를 마련해주었다[Burnet FM. Immunological aspects of malignant disease, Lancet, 1967; 1:1171-4]. 이어서, 사이토카인 요법, 단일클론항체 요법, 입양면역 요법, 백신 요법 등 다양한 종양면역 요법이 임상에 연이어 적용되었다.
2013년에 더 선진적인 종양면역 요법인 CAR-T 요법이 임상에서 성공적으로 사용되었으며, 전무후무한 임상적 효능을 나타내었다. CAR-T, 정식 명칭은 Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy이며, 키메라 항원 수용체 T 세포 면역요법이다. 임상에서 가장 선진적인 CAR-T 요법은 CLT019를 이용하여 재발성 불응성 급성림프구 백혈병 환자를 치료하며, 6개월 이상의 종양 무진행성 종양의 생존율이 67%에 달했으며, 그중 제일 긴 응답시간은 2년 이상에 달했다. 중국 상하이에 본사를 두고 있는 상하이 유니카 테라피 바이오 메디컬 기술 유한회사(Shanghai Unicar-Therapy Bio-Medicine technology co.,LTD)는 병원과 협력하여, 재발성 불응성 급성림프구 백혈병 환자 36명을 공동으로 치료하였으며, 그중 24명이 완화되었으며, 완화비율이 66.6%에 달했다. 이는 항암연구에서 획기적인 돌파엿다. CAR-T세포 요법은 암을 치료할 수 있는 가능성이 높은 방법의 한가지이며, 《Science》잡지에서 2013년도 10대 과학기술의 돌파성 선두임을 평가받았다.
CAR-T요법의 효과는 현저하나, 실체 종양의 치료과정에서 여러가지 곤난을 겪으며, 그중 가장 중요한 이유중의 하나는 PD1/PDL1억제성 면역관문이며(도1A에 표시된 바와 같이), 이들은 억제 신호 전달과 결부하여 T세포의 면역활성을 억제하며, 면역 내성에 중요한 역할을 하는 동시에 종양세포의 탈출을 촉진시키는 중요인 원인으로도 되고 있다.
PD-1(또는 CD279)은 일종의 면역 억제성 수용체이며, CD28 페밀리 성원의 제I형 막관통 단백질에 속하며, 프로그램화된 세포 사멸분자-1 수용체는 1992년에 Ishida 등[Ishida Y,Agata Y,Shibahara K,et al. Induced expression of PD-1,a novel member of the immunoglobulin gene superfamily,upon programmed cell death〔J〕.EMBO J,1992,11（11）:3887-3895.]이 감수잡종형성 방법을 사멸된 T세포 하이브리도마에 사용하는데서 얻은 명명이다. 인간PD-1 유전자는 2q37.35 염색체에 존재하며, 하나의 약 55kD의 막관통 단백질을 코딩한다. PD-1은 활성화된 T세포, B세포, 단핵세포와 수지상 세포 표면에서 광범위하게 발현되며, PD-1구조는 CTLA-4와 30%의 상동성을 갖고 있으며, 세포내 영역에 2개의 티로신 잔기가 존재하며, 각각 N말단의 하나의 면역 수용체 티로신 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)와 C말단의 하나의 면역 수용체 티로신 의존성 스위치 모티프(immunoreceptor tyrosin-based switch motif，ITSM)의 구성에 참여한다. 세포 외 영역은 하나의 IgV유사 구조영역으로 조성되며, 다수의 글리코실화 부위를 포함하며 심각히 글리코실화 되며, 상기 구조영역은 리간드에 결합되어, T세포 활성화를 억제시키는 기능을 발휘한다[리잉, 죠우순창 등, PD-1/PD-L1 신호경로가 종양 면역 탈출중에서의 작용 및 임상적 의의, [J]. Acad J Chin PLA Med Sch, Jul 2015,36(7).].
PD-L1은 다수의 암 조직에서 과량으로 발현되며, NSCLC, 흑색종, 유방암, 신경교종, 림프종, 백혈병, 및 각종 비뇨계암, 소화도암, 생식계 종양 등을 포함한다[Intlekofer AM,Thompson CB. At the bench:preclinical rationale for CTLA-4 and PD-1 blockade as cancer immunotherapy[J]. J Leukoc Biol,2013,94(1):25-39.]. Parsa는 마우스와 인간의 종양세포에서, T 세포가 비정상적으로 분비한 IFN-γ가 종양 세포의 PD-L1의 높은 발현을 유도함을 발견하였다[Ding H,Wu X,Wu J,et al.Delivering PD-1 inhibitory signal concomitant with blocking ICOS co-stimulation suppresses lupus-like syndrome in autoimmune BXSB mice[J]. Clin Immunol, 2006,118(2/3):258-267.]. PD-L1의 높은 발현은, RAS 및 PI3K/AKT 신호경로의 억제를 통해 세포주기 검출 포인트의 단백질과 세포증식 관련 단백질 발현을 조절함으로써, 최종적으로 T세포 증식의 억제를 초래한다[11]. Dong 등은, 체외실험과 마우스 모델에서 PD-1/PD-L1 신호경로의 활성화가 특이적CTL 아포토시스를 유도하며, CTL의 세포 살상효과의 감수성을 저하시켜, 종양세포의 면역 탈출을 촉진함을 발견하였다[Dong H, Strome SE, Strome SE, Salomao Dr, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion[J]. Nat Med, 2002, 8(8):793-800].
현재, 임상에서 주로 상품화된 PD-1 단일항체을 사용하여 면역관문억제제로 하며, 이로써 종양세포의 면역탈출을 억제한다. 2014년 9월3일에, Bristol-Myers Squibb 회사의 항PD-1 약물 Opdivo（Nivolumab）가 일본에서 정식으로 상장하였으며, 일본 국내에서 이러한 약물은 현재 여전히 흑생종 환자에만 한한다. 약물은 100mg 당 729849엔（약 RMB 43000원） 가격이다. 체중 1kg이 2mg의 사용량을 필요로 하므로, 체중 50kg인 사람은 100mg을 필요로 한다. 또한, 체중이 10kg이 증가할 때마다 약물량이 20mg(150200엔, 약 RMB8778원) 증가해야 하며, 3주간이 한 차례의 치료 과정이다. 가격이 상당히 비싸서 일반 가정에서는 감당하기 힘들다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 결점을 극복하기 위하여, 인간 PD-1를 녹다운시킨 siRNA, 재조합 발현 CAR-T 벡터 및 그의 제조방법과 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 하기 실시양태를 통해 실현된다.
본 발명의 제1목적은 일종의 인간PD-1를 녹다운시킨 siRNA를 제공하는 것이며, 상기 siRNA는 하기 중의a 내지 g중의 임의의 한 쌍에서 선택된다.
a. 서열번호41과 서열번호42로 표시된 뉴클레오티드 서열;
b. 서열번호43 과 서열번호44로 표시된 뉴클레오티드 서열;
c. 서열번호45 와 서열번호46으로 표시된 뉴클레오티드 서열;
d. 서열번호47 과 서열번호48로 표시된 뉴클레오티드 서열;
e. 서열번호49 와 서열번호50으로 표시된 뉴클레오티드 서열;
f. 서열번호51 과 서열번호52로 표시된 뉴클레오티드 서열;
g. 서열번호53 과 서열번호54로 표시된 뉴클레오티드 서열.
진일보적으로, 바람직하게 a.서열번호41과 서열번호42로 표시된 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 두번째 목적은 종양의 면역탈출 메커니즘을 제거하거나 경감시키는 약물을 제조하는데 있어서의 상기 siRNA의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 상기 siRNA를 포함하는 제조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
진일보적으로, 상기 발현벡터는 렌티바이러스 발현벡터, 역전사 바이러스 발현벡터, 아데노바이러스 발현벡터, 아데노 관련 바이러스 발현벡터 또는 플라스미드이며, 바람직하게는 상기 siRNA를 포함하는 렌티바이러스 발현벡터이다.
진일보적으로, 상기 렌티바이러스 발현벡터는, 서열번호2로 표시된 것과 같은 플라스미드의 복제에 사용되는 원핵 리플리콘 pUC Ori서열; 서열번호1로 표시된 것과 같은 표적 균주의 대량 증식에 사용되는 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR서열; 서열번호3으로 표시된 것과 같은 진핵세포내에서의 복제를 강화시키는 바이러스 리플리콘 SV40 Ori서열; 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트; 서열번호11로 표시된 것과 같은 진핵세포의 녹색형광의 발현에 사용되는 ZsGreen1 녹색형광 단백질; 서열번호12로 표시된 것과 같은 발현 단백질의 공동 전사에 사용되는 IRES 리보솜 결합 서열; 서열번호15로 표시된 것과 같은 키메라 항원 수용체 유전자의 진핵 전사에 사용되는 인간 EF1α 프로모터; 일체적으로 인식, 전달 및 가동되는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR를 조성하기 위한 항CD19 키메라 항원 수용체의 코딩 유전자; 서열번호13으로 표시된 것과 같은 형질전환 유전자의 발현율의 증가에 사용되는 eWPRE 강화형 프레리독 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트; 서열번호14로 표시된 것과 같은 세포내 siRNA 전사에 사용되는 인간 RNA 중합효소 III 프로모터 hU6을 포함한다.
진일보적으로, 상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 2세대 렌티바이러스 벡터를 사용하며, 예를 들면 서열번호5로 표시된 것과 같은 렌티바이러스5 terminal LTR, 서열번호6으로 표시된 것과 같은 렌티바이러스3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호7로 표시된 것과 같은 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호8로 표시된 것과 같은 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호9로 표시된 것과 같은 env 시스 엘리먼트, 서열번호10으로 표시된 것과 같은 cPPT 시스 엘리먼트를 포함한다.
진일보적으로, 상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 3세대 렌티바이러스 벡터를 사용하며, 서열번호5로 표시된 것과 같은 렌티바이러스5 terminal LTR, 서열번호6으로 표시된 것과 같은 렌티바이러스3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호7로 표시된 것과 같은 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호8로 표시된 것과 같은 RRE시스 엘리먼트, 서열번호9로 표시된 것과 같은 env 시스 엘리먼트, 서열번호10으로 표시된 것과 같은 cPPT 시스 엘리먼트, 상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트 및 서열번호4로 표시된 RSV 프로모터를 포함한다.
진일보적으로, 상기 eWPRE 강화형 프레리독 B형간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트는 6개의 뉴클레오티드의 강화 돌연변이를 갖고 있으며, 구체적으로, g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T이다.
진일보적으로, 상기 항BCMA 키메라 항원 수용체(2세대 CAR)는, 순차적으로 연결된 서열번호16으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, 서열번호17로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호18로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호19로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호20으로 표시된 것과 같은 CD8 Hinge키메라 수용체 힌지, 서열번호21로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통 영역, 서열번호22로 표시된 것과 같은 CD137키메라 수용체 공동자극인자 및 서열번호23으로 표시된 TCR키메라 수용체T세포 활성화 영역을 포함한다.
진일보적으로, 상기 항BCMA 키메라 항원 수용체(3세대 CAR)는, 순차적으로 연결된 서열번호16으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, 서열번호17로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호18로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호19로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄VH, 서열번호20으로 표시된 것과 같은 CD8 Hinge키메라 수용체 힌지, 서열번호21로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통 영역, 서열번호24로 표시된 CD28 키메라 수용체 공동자극인자, 서열번호22로 표시된 CD137 키메라 수용체 공동자극인자 및 서열번호23으로 표시된 것과 같은 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역을 포함한다.
본 발명의 네번째 목적은 상기 siRNA를 포함하는 렌티바이러스 발현벡터의 제조방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR서열（예를 들면 서열번호1로 표시된）, 원핵 리플리콘 pUC Ori서열（예를 들면 서열번호2로 표시된）, 바이러스 리플리콘 SV40 Ori서열（예를 들면 서열번호3으로 표시된）, 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티 바이러스 패키징 시스 엘리먼트, ZsGreen1 녹색형광단백질（예를 들면 서열번호11로 표시된）, IRES 리보솜 결합서열（예를 들면 서열번호12로 표시된）, eWPRE 강화형 프레리독 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트（예를 들면 서열번호13으로 표시된）, 인간 RNA 중합효소III 프로모터 hU6（예를 들면 서열번호14로 표시된）을 렌티바이러스 백본 플라스미드（pLenti-3G silencer）에 저장한다.
(2) 인간 EF1α 프로모터（예를 들면 서열번호15로 표시된）, 일체적으로 인식, 전달 및 가동되는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR를 조성하기 위한, 항BCMA 키메라 항원 수용체로 2세대 CAR 또는 3세대 CAR를 조성하는 설계방안, 효소절단, 연결, 재조합 반응을 통해 렌티바이러스 백본 플라스미드에 클로닝하여 2세대 CAR 또는 3세대 CAR 디자인의 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-silencer을 얻는다.
(3) 상기 siRNA및 서열번호55와 서열번호56으로 표시된 negative control서열을 각각 단계（2）에서 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하여, PD-1녹다운 재조합 렌티바이러스 플라스미드（pCARbcma-1453 내지 pCARbcma-1459 및 negative control pCARbcma-1460）를 얻는다.
(4) 단계(3)에서 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드（pCARbcma-1453 내지 pCARbcma-1460）를 각각 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G와 함께 HEK293T/17 세포에 형질주입시키며, HEK293T/17 세포내에서 유전자 전사 발현을 진행한 후, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 패키징에 성공시켜 세포 배양액 상청액 중에 방출시키며, 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함한 상청액을 수집한다.
(5) 얻은 재조합 렌티바이러스 상청액을 흡인여과, 흡착, 용출에 의한 이온교환 방법으로 정제하여 각각 재조합 렌티바이러스 벡터를 얻는다.
진일보적으로, 단계(1)에서, 상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 2세대 렌티바이러스 벡터를 사용하며, 서열번호5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트를 포함한다. 상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 3세대 렌티바이러스 벡터를 사용하며, 서열번호5로 표시된 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호6으로 표시된 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호7로 표시된 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호8로 표시된 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호9로 표시된 env 시스 엘리먼트, 서열번호10으로 표시된 cPPT 시스 엘리먼트, 상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트 및 서열번호4로 표시된 RSV 프로모터를 포함한다.
진일보적으로, 단계(2)에서, 상기 일체적으로 인식, 전달 및 가동되는 2세대 CAR를 조성하기위한 항BCMA 키메라 항원 수용체는, 순차적으로 연결된 서열번호16으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, 서열번호17로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호18로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호19로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호20으로 표시된 것과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호21로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통 영역, 서열번호22로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호23으로 표시된 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역을 포함한다. 상기 일체적으로 인식, 전달 및 가동되는 3세대 CAR를 조성하기 위한 항BCMA 키메라 항원 수용체는, 순차적으로 연결된 서열번호16으로 표시된 것과 같은 CD8 leader키메라 수용체 신호 펩티드, 서열번호17로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호18로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호19로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호20으로 표시된 것과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호21로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통 영역, 서열번호24로 표시된 것과 같은 CD28 키메라 수용체 공동자극인자， 서열번호22로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자，및 서열번호23으로 표시된 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역을 포함한다.
진일보적으로, 단계(1)에서, 상기 eWPRE 강화형 프레리독 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트는 6개의 뉴클레오티드의 강화 돌연변이를 갖고 있으며, 구체적으로, g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T이다.
진일보적으로, 단계(2)에서, 인간 EF1α 프로모터는 전체 CAR 유전자의 발현을 작동시킨다. CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드는 CAR 코딩 서열의 N 말단에 위치하며, CAR 단백질이 세포막에 위치하게끔 인도한다. CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, Optimal Linker C, CD19 단쇄 항체 중쇄 VH는 scfv 영역을 이루며, CD19 항원의 인식에 사용된다. CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지는 scfv를 세포막 외측에 고정시키는데 사용된다. CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통 영역은 전체 키메라 수용체를 세포막에 고정시키는데 사용된다. CD137 키메라 수용체 공동자극인자는 T 세포 증식과 사이토카인 분비를 자극하는데 사용된다. TCR 키메라 수용체 T 세포 활성화영역은 다운스트림 신호 전달경로의 발현을 활성화시킨다. Scfv 영역과 CD20 항원이 결합할 경우, 신호는 키메라 수용체를 통해 세포내로 전달되며, 이로써 T 세포 증식, 사이토카인 분비증가, 항 세포자멸 단백질 분비 증가, 세포사멸 지연, 표적 세포의 용해를 포함하는 일련의 생물학적 효과를 나타낸다.
진일보적으로, 단계(4)에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 형광 표식 zsGreen1을 갖는 버전과 형광 표식 zsGreen1을 갖지 않는 버전을 갖고 있으며, 형광 표식을 갖는 버전은 체외실험에 사용되며, 형광 표식을 갖지 않는 버전은 임상 실험에 사용된다.
진일보적으로, 단계(5)에서, 상기 흡입여과 단계에서 상청액 체적을 200ml 내지 2000ml로, 진공도를 -0.5MPA 내지 -0.9MPA로 제어하여, 웰 막힘으로 인한 벡터의 손실을 방지한다. 상기 흡착단계에서 용액의 PH값을 6 내지 8로 제어하여, PH 변화에 의한 벡터의 비활성화를 방지한다. 상기 용출단계에서 용출액의 이온강도를 0.5M 내지 1.0M로 제어하여, 이온강도의 변화에 의한 불완전 용출 또는 벡터의 불활성화를 방지한다.
본 발명의 다섯번째 목적은 CAR-T 종양치료 과정에서 종양 면역 탈출을 제거하거나 경감시키는 약물의 제조에 있어서, 상기 siRNA를 포함하는 재조합 발현 벡터의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 여섯번째 목적은 상기 CART 세포가 siRNA로 수식된 T 림프세포인 일종의 CART 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다발성 골수종, 췌장암, 뇌신경교종, 골수종 치료약물을 제조하는데 있어서의 상기 CAR-T 세포의 용도를 제공하는 것이다.
이러한 간섭효과는 오랫동안 지속될 수 있으며, 세포 분열 후에도 여전히 효과가 있다. 또한, RNAi는 매우 좋은 서열 특이성을 갖고 있다[Kisielow, M. et al. (2002) Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small interfering RNA, J. of Biochemistry 363: 1-5]. 따라서, RNAi 시스템은 특이적으로 한가지 유형의 전사물을 녹다운시킬 수 있으며, 서열이 비슷한 기타 mRNA에 영향을 주지 않는다. 이러한 특성은 siRNA 시스템이 유전자 발현 억제, 유전자 기능연구와 약물표적 검증 방면에서의 잠재력과 가치를 나타낸다. 또한, siRNA 시스템은 (1)유전자의 과발현 또는 잘못된 발현에 의한 질병; (2)유전자 돌연변이에 의한 질병을 포함한 관련질병의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 인간 RNA 중합 효소 III 프로모터 hU6, 인간 EF1α 프로모터, CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, Optimal Linker C, BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통영역, CD137 키메라 수용체 공동자극 인자, TCR 키메라 수용체 T 세포 활성화 영역을 재조합 렌티바이러스 벡터에 넣어 구성하고, 인간 EF1α 프로모터를 사용하여 전체 CAR 유전자의 발현을 작동시킨다. CAR 단백질은 세포막 표면에 고정되어 BCMA 항원을 인식하고 T 세포 증식 및 사이토카인 분비를 자극하여, 다운스트림 신호 전달 경로의 발현을 활성화시킨다. scfv 영역이 BCMA 항원과 결합하면, 신호는 키메라 수용체를 통해 세포내로 전달되어, T 세포 증식, 사이토카인 분비 증가, 항세포 자멸 단백질 분비 증가, 세포사멸 지연 및 표적 세포 용해와 같은 일련의 생물학적 효과를 나타낸다. RNA 중합 효소 III 프로모터 hU6으로 PD1siRNA 발현을 작동시키고, RISC 복합체의 작용을 통해, PD-1 mRNA를 분해시키며, PD-1의 단백질 합성을 억제하고, PD1의 PDL1과의 결합을 차단하여, PD1/PDL1 신호경로를 차단하며 면역 탈출을 억제하는 효과를 달성한다.
본 발명에서 사용한 발현벡터는, 플라스미드의 복제에 사용되는 원핵 리플리콘(pUC ori), 표적 균주의 대량 증식에 사용되는 원핵 선별마커(AmpR）, 진핵 세포내의 복제의 강화에 사용되는 바이러스 리플리콘（SV40 Ori）, 레틴바이러스 패키징에 사용되는 레틴바이러스 패키징 시스 엘리먼트（RSV, 5 terminal LTR, 3 terminal Self-Inactivating LTR, Gag, RRE, env, cPPT）, 세포내 siRNA 전사에 사용되는 인간 RNA 중합 효소 III 프로모터（hU6）, 진핵세포 녹색형광 발현에 사용되는 진핵 형광 표식 단백질（ZsGreen1）, 단백질의 공동 전사 발현에 사용되는 공동발현 엘리먼트（IRES）, 키메라 항원 수용체 유전자의 진핵 전사에 사용되는 진핵 프로모터(（EF1α）, 일체적으로 인식, 전달 및 가동되는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR를 조성하는 데 사용되는 키메라 항원 수용체（CD8 leader, BCMA VL, Optimal Linker C, BCMA VH, CD8 Hinge, CD8 Transmembrane, CD28(서열번호 24), CD137, TCR）, 형질전환 유전자의 발현 효율의 강화에 사용되는 전사 후 조절 엘리먼트（eWPRE）를 포함한다.
본 발명은 펩티드를 포함한 약물 조성물에 관한 것이며, 구체적으로 하기에 관한 것이다.
1. 인간 RNA 중합 효소 III 프로모터 hU6, 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR 서열, 원핵 리플리콘 pUC Ori 서열, 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열, RSV 프로모터, 인간 EF1α 프로모터, 렌티바이러스 5 terminal LTR, 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, Gag 시스 엘리먼트, RRE 시스 엘리먼트, env 시스 엘리먼트, cPPT 시스 엘리먼트, IRES 리보솜 결합 서열, ZsGreen1 녹색형광 단백질, WPRE 프레리독 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트의 재조합 렌티바이러스 백본 벡터, 이러한 재조합 렌티바이러스 벡터 백본은 부동한 치료성 유전자에 게재되어 입양 세포치료 분야에 광범위하게 사용되며, 부동한 siRNA에 게재되어 유전자의 과발현, 잘못된 발현 및 유전자의 돌연변이로 인한 질병에 광범위하게 사용된다.
2. 재조합 렌티바이러스 벡터 백본, PD1-siRNA, CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 단쇄 항체 힌지 Linker C, BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통영역, CD28 키메라 수용체 공동 자극인자, CD137 키메라 수용체 공동 자극인자, TCR 키메라 수용체 T세포 활성화 영역으로 재조합 렌티바이러스 벡터를 제조 및 형성하며, 상기 방법으로 얻은 재조합 렌티바이러스 벡터는 인간 T림프구 세포에서의 BCMA 키메라 항원 수용체의 발현을 실현하며, T림프세포가 BCMA 양성 세포에 대한 사멸작용을 유도 및 활성화시키며, 임상에서 다발성 골수종(MM)의 치료에 사용된다. 인간 T 림프세포내에서 프로그램화된 사멸 수용체1(PD-1)의 siRNA를 발현하며, T 세포 표면에서의 프로그램화된 사멸 수용체1의 발현 수준을 효과적으로 감소시켜, PD-1/PD-L1 면역 음성조절 신호경로를 차단하여, 임상에서 종양의 면역 탈출을 억제하는 데 사용할 수 있으며, CAR-T세포 면역 치료 효과를 향상시킨다.
본 발명에서는 PD-1에 대한 siRNA 유전자 침묵 기술을 사용하였으며, 20세기 90년 이후로, 연구인원들은 이중가닥 RNA(“dsRNA”)가 단백질의 발현을 억제할 수 있음을 발견하였다. 이러한 유전자 침묵 기능은 인간의 질병을 치료함에 있어서 광범위한 잠재력을 가지고 있어, 많은 연구자들과 상업적 실체는 현재 상당한 자원을 투자하여 이러한 기술에 기반한 치료방법을 발전시키고 있다.
메커니즘의 관점에서 보면, dsRNA가 식물과 무척추동물의 세포에 진입한 후, 제III형 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의해 siRNA로 분해된다.[Sharp, RNA interference-2001, Genes Dev.2001, 15:485]. 제III형 엔도뉴클레아제 다이서는 dsRNA를 2염기 돌출 3'스티키 말단을 가진 19 내지 23bp의 siRNA로 분해한다. [Bernstein, Caudy, Hammond, & Hannon, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 2001, 409:363]. SiRNA는 RNA유도형 사이렌싱 복합체(RISC)와 결합되며, 복합체 중의 하나 또는 다수의 나선효소에 의해 이중가닥의 siRNA로 풀리며, 상보적 안티센스 가닥은 표적 인식을 유도한다. [Nykanen, Haley, & Zamore, ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway, Cell 2001, 107:309]. 상응한 표적 mRNA와 결합한 후, RISC 복합체중의 하나 또는 다수의 엔도뉴클레아제는 표적mRNA을 절단시켜 mRNA 침묵을 일으킨다. [Elbashir， Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs, Genes Dev 2001, 15:188]
본 발명에 의해 고안된 PD1 siRNA 서열은 21개 bp 뉴클레오티드를 포함하며, N2[CG]N8[AU]N8[AU]N2의 올리고 뉴클레오타이드 배열 패턴을 사용하였고, 상보적인 서열간에 스템-루프(stem-loop) 헤어핀 구조를 사용하였으며, siRNA 패턴、GC 퍼센트、열 내에서의 T 또는 A 또는G、consecutiver GC、3'end nt 패턴、열역학 값(thermodynamic value)、siRNA 타겟、동일성(identity)、정렬(alignment) 등 조건을 통해 선별하여, siRNA 디자인의 간섭 성공율을 크게 향상시켰다.
본 발명에 사용된 인간 RNA 중합 효소 III 프로모터 hU6는 PD1 siRNA를 전사하고, PD-1의 발현 시스템을 억제하였으며, T세포 사멸 실험에서 QPCR 검출을 통해 PD-1 mRNA의 전사 수준을 효과적으로 억제할 수 있고, T세포 표면의 PD-1 수용체 발현량을 효과적으로 감소시켜, PD-1/PDL-1의 신호경로를 차단시켜, 면역 탈출을 억제하는 효과에 달할 수 있다. 향후에 임상에 사용하여, CAR-T세포내의 PD-1 발현 수준을 억제하여, CAR-T 세포가 체내에서의 종양에 대한 사멸효과를 강화시킬 수 있다.
본 발명은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 siRNA를 전달한다(도 2에 도시됨). 우선, 비용을 절감하였으며, 체외에서 PD1 siRNA를 합성하는 비싼 비용을 피할 수 있다. 다음, 체내에서의 PD1 siRNA의 비효율적인 전달 문제를 피할 수 있다. 그다음, 인간 RNA 중합 효소 III 프로모터 hU6를 이용하여 PD1 siRNA를 발현시키며, 세포 내 RNA 전사 시스템을 효과적으로 이용하여, 대량의 상응한 PD1 siRNA를 발현시키며, 일련의 효소 작용을 통해 우수한 유전자 침묵 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용된 벡터 백본은 3세대 렌티바이러스 벡터이며(도 3A에 나타낸 바와 같이), 3'SIN LTR은 U3영역을 제거하여, 렌티바이러스 벡터의 자기 복제 가능성을 제거하여 안전성을 크게 향상시켰다. cPPT 및 WPRE 엘리먼트를 증가시켰고, 형질전환 효율 및 형질전환 유전자의 발현 효율을 향상시켰다. RSV 프로모터를 이용하여 렌티바이러스 벡터 패키징(lentiviral vector packaging) 과정에서 코어(core) RNA의 전사를 지속적이고 효과적으로 유지할 수 있으며, 인간의 EF1α 프로모터를 사용하여, CAR 유전자가 인체 내에서 장시간 지속적으로 발현될수 있게 하였다.
본 발명에서 사용한 siRNA 녹다운 방식은 3세대 CAR 디자인 방식에도 적용될 수 있다. 3세대 CAR 디자인은 2세대 디자인과 비교하여 CD28 키메라 수용체 공동자극인자(서열번호24)를 증가시켰다.
본 발명에 사용된 렌티바이러스 벡터 컬럼 정제 시스템(도 8에 도시됨)은, 본 회사에서 개발한 렌티바이러스 대형 생산공정이다. 일반적으로 사용되는 초원심분리 방법 또는 고속원심분리 방법은 원심분리 침강의 원리를 이용하여 렌티바이러스 입자를 분리하는 것이며, 필연적으로 비슷한 침강계수를 갖는 많은 불순물이 남아있어 후속 실험에 악영향을 미치게 된다. 또한, 튜브 적재 공정이 복잡하고, 작업이 번거롭고, 여러 차례의 용기 전환으로 인해 더 많은 오염 기회를 가져온다. 그러나, 본 발명의 렌티바이러스 벡터 컬럼 정제 공정은 반자동화 조작이며, 100레벨 실험구역에서 전체 공정이 완료되어, 수동 조작의 번거러움과 오염 가능성을 방지하며, 회수된 렌티바이러스 벡터는 내독소 및 마이코플라즈마 등 지표가 임상기준에 완전히 도달하였다. 후속 조치를 통해 완전 자동화된 정제 장비를 개발할 수 있다.
본 발명에서 사용된 CAR 디자인은 2 세대 렌티바이러스 벡터 구조에도 적용될 수 있다. 2세대 및 3세대 렌티바이러스 벡터간에 구조적 차이를 갖고 있으며(도 3B에 도시된 바와 같이), 주로 3세대 렌티바이러스 벡터는 2세대 벡터 5''LTR의 U3 영역을 RSV 프로모터로 대체하여, U3 전사시 Tat 단백질에 대한 의존성을 제거하였다. 렌티바이러스 구조 유전자에서 Tat 서열을 제거할 뿐만 아니라, 렌티바이러스 게놈의 전사 레벨, 및 전사 지속성을 제고시켰다. 2 세대와 3세대 렌티바이러스 벡터에 있어서 주로 게놈의 전사 방식이 다르며, 따라서 본 발명에서 사용된 CAR 디자인은 이 두 세대의 렌티바이러스 벡터에 적용될 수 있다.
본 발명의 3세대 렌티바이러스 백본 플라스미드는 강화된 WPRE 엘리먼트를 사용하며, 펜실베이니아 대학 Carl H. June등（Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptormodified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011;365:725-33.）이 사용한 WPRE 엘리멘트에 비해, 6개의 뉴클레오타이드 향상 돌연변이(g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T)가 존재하며, 일차 전사 생성물의 폴리아데닐화를 향상시키고, 세포내 mRNA의 함량을 증가시키며, 형질전환 유전자의 발현 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 렌티빌(Lentiva) 패키징 시스템은 헬퍼 바이러스가 없는 4개의 플라스미드 패키징 시스템이며, 네가지 플라스미드를 통해 공동으로 HEK293T/17세포에 형질주입되어, 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성한다. 재조합 후의 렌티바이러스 벡터는 복제 결핍형 벡터이며, 외래 단편을 숙주 유전자에 통합시켜 일차적으로 사용할 수 있으나, 복제 및 증식을 진행할 수 없어 안전성이 크게 제고되었다.
본 발명에 사용된 렌티바이러스 벡터는 형광 표식 zsGreen1을 갖고 있는 버전 및 형광 표식 zsGreen1을 갖고 있지 않는 버전이 있으며, 형광 표식 버전은 체외 실험에 사용되며, 형광 표식을 갖고 있지 않는 버전은 임상실험에 사용된다.
본 발명에 사용된 scfv 단편의 링커 디자인은 사이토카인의 분비, 체외에서의 CAR-T 세포의 살상 작용 및 임상 치료 효과를 현저하게 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 다발성 골수암(MM)의 CAR-T치료에 신뢰성 있는 형질전환을 제공할 수 있으며, 동시에 종양의 면역 탈출 메커니즘을 차단시켜, CAR-T 세포 치료 효과를 제고시켜, 환자가 감당하는 의료 원가를 대폭 낮출 수 있다.
본 발명의 PD-1 녹다운 siRNA 발현 카셋트 및 그의 siRNA 발현 산물은 CAR-T를 통한 다발성 골수종(MM)의 치료에서 종양의 면역 탈출 메커니즘의 제거 또는 경감에 사용될뿐만 아니라, 또한 CAR-T를 통해 췌장암, 뇌신경교종, 골수종 등 유형의 종양 치료시 면역 탈출 메커니즘 억제에 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 PD-1/PD-L1 신호 전달 경로이다.
도 2는 본 발명에 따른 렌티바이러스의 PD1 siRNA 전달 방법의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 구조 개략도이다. 그중, 도 3(A)은 본 발명에서 사용한 3세대 렌티바이러스 벡터의 구조 개략도이며, 도 3(B)는 2세대와 3세대 렌티바이러스 벡터의 구조적 대조이다.
도 4는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조 흐름도이다. 그중, 도(A)는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G silencer의 구조 개략도이다. 도(B)는 pCARbcma-silencer 플라스미드의 개략도이다. 도(C)는 pCARbcma-1453 내지 pCARbcma-1460 플라스미드의 개략도이다. 도(D)는 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP의 구조 개략도이다. 도(E)는 렌티바이러스 패키징 플라스미드pPac-R의 구조 개략도이다. 도(F)는 막 단백질 pEnv-G의 구조 개략도이다.
도 5는 렌티바이러스 플라스미드 pLenti-3G silencer의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스겔 전기영동도이다. 그중, 도 5A는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G silencer의 효소 절단 예측 개략도이다. 그중, lane 1은 1kb DNA ladder Marker이며, 위로부터 아래로 밴드가 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5 kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며, lane 2는 pLenti-3G silencer의 Cla I+BamH I 효소절단 예측이며, 위로부터 아래로 밴드는 순차적으로 7381bp, 23bp이며, 도 5B는 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G silencer의 효소 절단 아가로스겔 전기영동도이다. 그중, lane 1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동 결과이며, lane 2는 pLenti-3G silencer의 Cla I+BamH I 효소 절단 전기영동 결과이다.
도 6은 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-silencer의 효소 절단 예측 및 효소 절단 아가로스겔 전기영동도이다. 그중, 도 6A는 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-silencer의 효소 절단 예측 개략도이며, 그중, lane 1은 1kb DNA ladder Marker이며, 위로부터 아래로 밴드는 순차적으로 10kb, 8kb, 6kb, 5 kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 750bp, 500bp, 250bp이며, lane 2는 pCARbcma-silencer의 Pvu I 효소 절단 예측이며, 위로부터 아래로 밴드는 순차적으로 8898bp, 896bp, 249bp이며, 도 6B는 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-silencer의 효소 절단 아가로스겔 전기영동도이다. 그중, lane 1은 1kb DNA ladder Marker의 전기영동결과이며, lane 2는 pCARbcma-silencer의 Pvu I효소 절단 전기영동 결과이다.
도 7은 PD-1 녹다운 재조합 바이러스 플라스미드 pCARbcma-1453 내지 pCARbcma-1460의 측정 대조결과이다. 그중, A는 pCARbcma-1453의 서열측정 대조결과이며. B는 pCARbcma-1454의 서열측정 대조결과이며, C는 pCARbcma-1455의 서열측정 대조결과이며, D는 pCARbcma-1456의 서열측정 대조결과이며, E는 pCARbcma-1457의 서열측정 대조결과이며, F는 pCARbcma-1458의 서열측정 대조결과이며, G는 pCARbcma-1459의 서열측정 대조 결과이며, H는 pCARbcma-1460의 서열측정 대조결과이다.
도 8은 이온교환 크로마토그래피로 재조합 렌티바이러스 벡터를 정제하는 흐름도이다.
도 9는 재조합 렌티바이러스 벡터의 적정농도 검출결과이다.
도 10은 재조합 렌티바이러스 벡터의 부동한 정제방법의 마이코플라즈마의 검출 결과이며, lane 1은 DL2000 marker이며, 위로부터 아래로 밴드는 순차적으로 2kb, 1kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100bp이며, lane 2는 양성 대조이며, lane 3은 음성대조이며, lane 4는 PBS이며, lane5는 물이며, lane 6은 lvCARbcma-1453이며, lane 7은 lvCARbcma-1454이며, lane 8은 lvCARbcma-1455이며, lane 9는 lvCARbcma-1456이며, lane 10은lvCARbcma-1457이며, lane 11은 lvCARbcma-1458이며, lane 12는 lvCARbcma-1459이며, lane 13은 lvCARbcma-1460이다.
도 11은 mRNA 상대적 발현양의 막대 그래프이다.
도 12는 CAR단백질 발현양의 WB 검출도이다. 그중 도 12A에서, lane 1은 PBMC 블랭크 세포이며, lane 2는 대조 바이러스 MOCK이며, lane 3은 lvCARbcma-1453이며, lane 4는 lvCARbcma-1454이며, lane 5는 lvCARbcma-1455이며, lane 6은 lvCARbcma-1456이며, lane 7은 lvCARbcma-1457이며, lane 8은 lvCARbcma-1458이며, lane 9는 lvCARbcma-1459이며, lane 10은 lvCARbcma-1460이며, 도 12B는 beta-actin 밴드이다.
도 13은 PD-1 녹다운 재조합 렌티바이러스 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460을 형질주입한 CAR-T세포와 표적세포를 24h 배양한 후 RT-QPCR 검출을 통한 PD-1의 mRNA 전사 수준이다.
도 14는 부동한 주효세포와 표적세포를 각각 10:1의 비율로 공동 배양조건하에서의 24시간 후 표적 세포에 대한 사멸상황을 나타내며, E는 주효세포이고, T는 표적세포이다.
구체적인 실시양태
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 실시예에서 특정 조건을 표기하지 않은 실험 방법은 통상적인 조건에 따라 또는 제조자가 권장하는 조건에 따라 진행한다.
실시예 1 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조
1. 재료
1) 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G silencer, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G, HEK293T/17세포, 동종 재조합 효소, Oligo Annealing Buffer는 스오우(상하이)생물의약 과학기술유한회사에서 제공하였다.
2) 프라이머: 프라이머 디자인 원칙에 따라 DNA 단편과 표적 부위의 증폭에 필요한 프라이머를 고안하였으며, 상기 프라이머는 상해 생물회사에서 합성하였다. 구체적으로 하기와 같다.
EF1α-F：5'-ATTCAAAATTTTATCGATGCTCCGGTGCCCGTCAGT-3' (서열번호25)
EF1α-R：5'-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3' (서열번호26)
CD8 leader-F：5'-GGTGTCGTGAGGATCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC-3' (서열번호27)
CD8 leader-R：5'-GTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTG-3'(서열번호28)
VL-F：5'-CACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACCCAGAGCC-3'(서열번호29)
VL-R：5'-ACGCTTGATCTCCAGTTTGGT-3'(서열번호30)
OLC-VH-F：5'-ACTGGAGATCAAGCGTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAGGTGCAGCTGGTCCAGAG-3'(서열번호31)
VH-R：5'-GCTGGACACGGTCACTAGTGTG-3'(서열번호32)
CD8 Hinge-F：5'-AGTGACCGTGTCCAGCACCACGACGCCAGCGCC-3'(서열번호33)
CD8 Hinge-R：5'-GTAGATATCACAGGCGAAGTCCA-3'(서열번호34)
CD8 Transmembrane-F：5'-CGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGC-3'(서열번호35)
CD8 Transmembrane-R：5'-TCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTG-3'(서열번호36)
CD137-F：5'-AAACGGGGCAGAAAGAAACTC-3'(서열번호37)
CD137-R：5'-TGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3'(서열번호 38)
TCR-F：5'-AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCG-3'(서열번호39)
TCR-R：5'-GGAGAGGGGCGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGC-3'(서열번호40)siRNA1453-F：5'-CCGGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCTCGAGTCATGCGGTACCAGTTTAGCATTTTTTG-3'(서열번호41)
siRNA1453-R：5'-AATTCAAAAAATGCTAAACTGGTACCGCATGACTCGAGGCTCATGCGGTACCAGTTTAG-3'(서열번호42)
siRNA1454-F：5'-CCGGCATTGTCTTTCCTAGCGGAATCTCGAGTCCGCTAGGAAAGACAATGGTTTTTTTG-3'(서열번호43)
siRNA1454-R：5'-AATTCAAAAAAACCATTGTCTTTCCTAGCGGACTCGAGATTCCGCTAGGAAAGACAATG-3'(서열번호44)
siRNA1455-F：5'-CCGGAGGCGCAGATCAAAGAGAGTTCTCGAGCTCTCTTTGATCTGCGCCTTGTTTTTTG-3'(서열번호45)
siRNA1455-R：5'- AATTCAAAAAACAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCTCGAGAACTCTCTTTGATCTGCGCCT-3'(서열번호46)
siRNA1456-F：5'- CCGGCCCTGTGGTTCTATTATATTACTCGAGATATAATAGAACCACAGGGAATTTTTTG-3'(서열번호47)
siRNA1456-R：5'- AATTCAAAAAATTCCCTGTGGTTCTATTATATCTCGAGTAATATAATAGAACCACAGGG-3'(서열번호48)
siRNA1457-F：5'- CCGGGGAACCCATTCCTGAAATTATCTCGAGAATTTCAGGAATGGGTCCAATTTTTTG-3'(서열번호49)
siRNA1457-R：5'-AATTCAAAAAATTGGAACCCATTCCTGAAATTCTCGAGATAATTTCAGGAATGGGTTCC-3'(서열번호50)
siRNA1458-F：5'-CCGGCAGGCCTAGAGAAGTTTCAGGCTCGAGTGAAACTTCTCTAGGCCTGCATTTTTTG-3'(서열번호51)
siRNA1458-R：5'-AATTCAAAAAATGCAGGCCTAGAGAAGTTTCACTCGAGCCTGAAACTTCTCTAGGCCTG-3'(서열번호52)
siRNA1459-F：5'-CCGGCAGGACTCATGTCTCAATGCCCTCGAGCATTGAGACATGAGTCCTGTGTTTTTTG-3'(서열번호53)
siRNA1459-R：5'-AATTCAAAAAACACAGGACTCATGTCTCAATGCTCGAGGGCATTGAGACATGAGTCCTG-3'(서열번호54)
siRNA1460-F：5'-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3'(서열번호55)
siRNA1460-R：5'-AATTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-3'(서열번호56)
PD-1-QPCR-F：5'-TGCAGCTTCTCCAACACAT-3'(서열번호57)
PD-1-QPCR-R：5'-CTTGTCCGTCTGGTTGCT-3'(서열번호58)
WPRE-QPCR-F：5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(서열번호59)
WPRE-QPCR-R：5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(서열번호60)
Actin-QPCR-F：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'(서열번호61)
Actin-QPCR-R：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'(서열번호62)
CAR-QPCR-F：5'-GACTTGTGGGGTCCTTCTCCT-3'(서열번호63)
CAR-QPCR-R：5'-GCAGCTACAGCCATCTTCCTC-3'(서열번호64)
3) 서열번호15 내지 서열번호64로 표시된 DNA서열은 상해 제루이 생물공정유한회사에서 합성하였으며, 뉴클레오티드 건조분말 또는 플라스미드 형식으로 보존된다.
4) 도구 효소 BspE I, EcoR I, BamH I, Pvu I, Cla I, T4 DNA 연결효소는 모두 NEB회사에서 구매하였다.
5) 고 충실도 효소 PrimeSTAR, RN는 Takara회사에서 구매하였다.
6) 0.22μm 내지 0.8μm PES 필터는 millipore회사에서 구매하였다.
7) 플라스미드 추출 키트 및 아가로스겔 회수 키트는 모두 MN회사에서 구매하였다.
8) 수용성 세포 TOP10은 tiangen회사에서 구매하였다.
9) NaCl, KCl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4, Trypsin, EDTA, CaCl2, NaOH, PEG6000 모두 상하이 생공에서 구매하였다.
10) Opti-MEM, FBS, DMEM, 1640, Pen-Srep, Hepes은 invitrogen회사에서 구매하였다.
11) Biotinylated protein L은 GeneScript회사에서 구매하였다.
12) 겨자무과산화효소로 표식한 2차항체, DAB 작업용액은 모두 베이징 쭝싼진쵸우에서 구매하였다.
13) ECL+plusTM Western blotting system은 Amersham회사에서 구매하였다.
14) DNeasy 키트는 상하이 제루이회사에서 구매하였다.
15) 림프 세포 분리액은 썬쩐 다커웨이회사에서 구매하였다.
16) SA-HRP는 상하이 이성회사에서 구매하였다.
17) 마이코플라즈마 검사키트, 내독소 검사키트, BCMA-K562, BCMA-PDL1-K562 세포주는 스오우(상하이)회사에서 구매하였다.
18) LDH 테스트 키트는 promega회사에서 구매하였다.
2. 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460의 제조방법
도 4를 보면, 본 발명의 상기 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조방법은 하기와 같다.
1) 인간 EF1α 프로모터, CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, Optimal Linker C, BCMA 단쇄 항체 중쇄 VH, CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통영역, CD137 키메라 수용체 공동자극 인자, TCR 키메라 수용체 T 세포 활성화 영역 단편을 렌티바이러스 백본 플라스미드 pLenti-3G silencer에 클로닝하여, 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-silencer를 얻으며, 다시 siRNA단편을 각각 pCARbcma-silencer에 연결시켜, PD-1 녹다운 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-1453 내지 pCARbcma-1460를 얻었다.
(1) 렌티바이러스 플라스미드 pLenti-3G silencer에 대해, Cla I와 BamH I 제한효소를 사용하여 이중 효소 절단을 하며, 생성물은 1.5%의 아가로스겔 전기영동을 통해 7381bp의 단편V1을 확인하였으며(도 5에 표시), 겔을 회수하여 Eppendorf 튜브에 넣고, MN회사의 아가로스겔 추출키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure 112019025115884-pct00001
（2）프라이머 EF1α-F와 EF1α-R를 사용하고, 합성된 서열번호15를 주형으로, 표 2의 반응계를 이용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃3min, （98℃10sec, 55℃15sec, 72℃2min）ⅹ35cycle, 72℃10min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 1208bp의 단편a를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure 112019025115884-pct00002
（3）프라이머 CD8 leader-F와 CD8 leader-R를 사용하고, 합성된 서열번호16을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃3min, （98℃10sec, 55℃15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 101bp의 단편b를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(4) 프라이머 VL-F와 VL-R를 사용하고, 합성된 서열번호17를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃3min, （98℃ 10sec, 55℃15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 336bp의 단편c를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(5) 프라이머 OLC-VH-F와 VH-R를 사용하고, 합성된 서열번호19를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 421bp의 단편d를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(6) 프라이머 CD8 Hinge-F와 CD8 Hinge-R를 사용하고, 합성된 서열번호20을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 147bp의 단편e를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(7) 프라이머 CD8 Transmembrane-F와 CD8 Transmembrane-R를 사용하고, 합성된 서열번호21을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 100bp의 단편f를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(8) 프라이머 CD137-F와CD137-R를 사용하고, 합성된 서열번호22를 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 142bp의 단편g를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(9) 프라이머 TCR-F와 TCR-R를 사용하고, 합성된 서열번호23을 주형으로, 표 2의 반응계를 사용하였으며, PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 55℃ 15sec, 72℃ 30sec）ⅹ35cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 355bp의 단편h를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(10) 각각 1μl의 DNA 단편b, c, d를 주형으로 하고, 표 3의 반응계를 사용하였으며, 프라이머를 제외한 것을 Eppendorf 튜브에 넣었다. PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min, （98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ6cycle이며, 프라이머 CD8 leader-F/VH-R을 첨가하고,（98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 40sec）ⅹ24cycle, 72℃ 5min이였다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 814bp의 단편i를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
Figure 112019025115884-pct00003
(11) 각각 1μl의 DNA 단편 e, f, g, h를 주형으로 하고, 표 3의 반응계를 사용하였으며, 프라이머를 제외한 것을 Eppendorf 튜브에 넣었다. PCR 사이클링 조건은: 98℃ 3min,（98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ6cycle이며, 프라이머CD8 Hinge-F/TCR-R을 첨가하고, （98℃ 10sec, 60℃ 10sec, 72℃ 30sec）ⅹ24cycle, 72℃ 5min이다. 생성물은 1.5% 아가로스겔 전기영동을 통해 704bp의 단편j를 확인하였으며, 겔을 컷팅하여 Eppendorf 튜브에 회수하고, MN회사의 아가로스 겔 회수 키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(12) 토탈 5μl의 DNA 단편 V1, a, i, j를, 1:1:1:1의 몰비로 Eppendorf 튜브에 첨가하고, 15μl의 동족 재조합 효소 반응액을 첨가하였으며, 균일하게 혼합 후 42℃에서 30분 동안 배양하고 얼음위에 전이시켜 2 내지 3분 동안 놓아두었으며, 반응액을 50μl TOP10에 넣고 천천히 회전시켜 내용물을 균일하게 혼합시키고, 얼음에 30분간 놓아두었으며, 튜브를 42℃로 예열한 온수욕에 넣고 90초동안 열충격을 진행한 후 튜브를 빠르게 빙욕에 전이시키고 세포를 2 내지 3분 동안 냉각시켰으며, 튜브 당 900 μl LB 배양액을 가한 후, 튜브를 37℃의 진탕기로 전이시켜 1시간 동안 배양하여 세포가 소생하도록 하고, 100μl의 전환된 균액을 취하여 Amp LB 아가로스 플레이트에 도포하고, 플레이트를 거꾸로 하여, 항온 배양기에서 37℃하에 16시간동안 배양하였다.
(13) 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-silencer에 대해, BspE I와EcoR I 제한효소를 사용하여 이중 효소 절단을 진행하며, 생성물은 1.5%의 아가로스겔 전기영동을 통해 10035bp의 단편V2을 확인하였으며, 겔을 회수하여 Eppendorf 튜브에 넣고, MN회사의 아가로스겔 추출키트를 사용하여 상응한 단편을 회수하였으며(표 1 참조), 생성물의 순도와 농도를 측정하였다.
(14) 합성된 siRNA1453-F/R 내지 siRNA1460-F/R을 각각 oligo annealing buffer를 이용하여 20μM로 용해시키고, 상응한 F와 R를 각각 30μl를 취하여 혼합하였다. 이어서, siRNA1453-F/R 내지 siRNA1460-F/R 혼합물을 수욕에서 95℃하에 5분간 가열한 후, 수욕 뚜껑을 열어 실온에서 자연적으로 실온까지 냉각시켜, 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드 단편을 형성하였다. 1μl를 취하여 연결반응에 사용하며(표 4 참조), 4℃에서 16h 연결시키고, 얼음위에 전이시켜 2 내지 3분간 놓아두고, 반응액을 50μl TOP10에 넣고 천천히 회전시켜 내용물을 균일하게 혼합하였으며, 얼음에 30분간 놓아둔 후, 튜브를 42℃로 예열한 온수욕에 넣고 90초동안 열충격을 진행한 후 튜브를 빠르게 빙욕에 전이시키고 세포를 2 내지 3분 동안 냉각시켰으며, 튜브 당 900 μl LB 배양액을 가한 후, 37℃의 진탕기에 전이시켜 1시간 동안 배양하여 세포가 소생하게 하고, 100μl의 전환된 균액을 취하여 Amp LB 아가로스 플레이트에 도포하고, 플레이트를 거꾸로 하여, 항온 배양기에서 37℃하에 16시간동안 배양하였다.
콜로니를 취하여 균체 PCR 동정을 진행하였으며, 정확한 콜로니가 PD-1 녹다운 재조합 렌티바이러스 플라스미드 pCARbcma-1453 내지 pCARbcma-1460임을 동정하였으며, 정확한 콜로니에 대해 서열측정 동정을 진행하였다(도 7 참조).
Figure 112019025115884-pct00004
2. 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460의 패키징
(1) 완전배지: 예열된 신선한 배지를 취하여, 10%FBS +5ml Pen-Srep를 가하고, 상하로 전도시켜 균일하게 혼합하였다.
(2) 1XPBS 용액：NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g를 측정하여, 1000ml 비커에 넣고, 900ml Milli-Q grade 초순수를 넣어 용해시키고 용해가 끝난 후, 1000ml 실린더를 이용하여 1000ml로 정량하였으며, 121℃ 고온에서 습열 멸균을 20분 동안 진행하였다.
(3) 0.25% Trypsin 용액: Trypsin 2.5g, EDTA 0.19729g을 측정하여 1000ml 비커에 넣고, 900ml 1XPBS를 가하여 용해시켰으며, 용해가 끝난 후, 1000ml 실린더로 1000ml로 정량하였으며, 0.22μM 여과시켜 균을 제거하여, 장기적으로 사용할 시 -20℃ 냉장고에 보관하였다.
(4) 0.5M CaCl2용액: 36.75g CaCl2를 측정하고 400ml Milli-Q grade 초순수로 용해시켰으며, Milli-Q grade 초순수로 총 체적을 500ml로 정량하고 균일하게 혼합하였다. 50ml 원심분리 튜브에 분주하였으며, 튜브 당 45ml정도이고, 4℃에 보존하였다.
(5) 2XHBS 용액: 4.09g NaCl, 0.269g Na2HPO4, 5.96g Hepes를 측정하고, 400ml Milli-Q grade 초순수로 용해시키고, pH기를 보정한 후, 2M NaOH 용액으로 HBS 용액의 pH를 7.05로 조절하였다. 튜브 당 HBS의 PH를 조절하는데 2M NaOH를 3ml 정도 소모하였다.
(6) 액체질소탱크에서 냉동 보존된 HEK293T/17 세포를 취하여 신속히 37℃ 수욕으로 전이하였으며, 1 내지 2분 후 슈퍼클린벤치에 전이시켜, 무균 조작으로 냉동바이알 중의 액체를 전부 10cm2 배양 플레이트에 전이시키고, 10% FBS를 함유한 DMEM를 8mL/10cm2 dish로 보충하고, 24시간 후 현미경하에서 세포를 관찰하였으며, 세포포화 정도가 80%보다 클 경우 계대배양시켰다.
(7) 세포 상태가 양호하고, 오염이 없는 HEK293T/17세포를 선택하여, 2 내지 6개 배양접시를 한 조로 하여, 세포를 트립신 소화시킨 후, 전동 피펫으로 4 내지 12ml의 완전 배지를 취하고, 소화 후 배양접시마다 2ml를 가하였으며, 배양접시의 건조를 방지하였다. 1ml의 피펫으로 모든 세포를 단일 세포 현탁액으로 피펫팅하여, 배양 플라스크로 옮겼다.
(8) 상기 2 내지 6개의 배양접시 중의 잔존 세포를 배양 플라스크에 옮기고, 배지로 배양접시를 재차 세척하였다.
(9) 배양 플라스크의 뚜껑을 닫고 아래위로 10번 정도 뒤집어 흔들어 세포현탁액을 균일하게 혼합하였으며, 세포를 8 내지 24개의 10cm2 배양접시에 전이시켰으며, 배양 접시 당 세포밀도는 약 4 × 106개/10ml 완전 배지 정도였다. 세포밀도가 예상한 것 보다 차이가 많이 나면, 세포를 계수하여, 4× 106개/접시 양으로 접종하였다.
(10) 6개 배양접시를 쌓는데 상하접시의 배합에 주의를 해야 한다. 배양접시를 좌우, 전후로 여러 번 흔들어 세포가 충분히 도포되게 한 후, 5% CO2 배양기에 넣었다. 나머지 세포도 동일하게 처리하였다.
(11) 계대 세포를 검사하였으며, 세포 포화도가 70 내지 80%여야 하며, 윤곽이 포만하고, 부착이 양호해야 하며, 세포 배양접시에 균일하게 분포되어야 한다.
(12) 세포를 위해 배양액을 교체하고, 배양접시를 신선한 완전배지로 대체하고, 접시 당 9ml이며, 배양기의 CO2 농도 설정치를 8%로 향상시켰다.
(13) N+0.5에 따라 DNA/CaCl2 용액을 제조하였다, 접시 당 HEK293T/17 세포의 형질주입 플라스미드 양은 하기 비율에 따라 사용한다. 재조합 렌티바이러스 플라스미드(20μg), pPac-GP (15μg), pPac-R (10μg), pEnv-G (7.5μg). 새로운 5ml 원심분리 튜브 한개를 취하여, 0.5M CaCl2：0.25ml, 재조합 렌티바이러스 플라스미드 20μg: pPac-GP 15μg: pPac-R 10μg: pEnv-G 7.5μg를 가하고, 초순수를 보충하여 0.5ml되게 하며 뚜겅을 닫아, 충분히 균일하게 혼합하였다.
(14) 또 다른 5ml 원심분리 튜브 한 개를 취하여, 0.5ml DNA/CaCl2 용액을 가하였다. 볼텍스 믹스를 열고, 한 손으로 5ml 원심분리 튜브의 상단을 쥐어 튜브 하단이 믹서에 접속하게 하여, 액체가 튜브 벽에서 확산되어 유동하도록 하며, 다른 한 손으로 1mL 피펫을 쥐고 0.5mL 2×HBS 용액을 흡수하여 원심분리 튜브에 천천히 적가시키면서 유속을 제어하며, 30초 동안 적가를 완성하는 것이 적당하다. 2×HBS를 가한 후, 지속적으로 5초 동안 진탕시키며, 진탕이 끝나면 직접 형질주입이 필요한 세포에 가할 수 있다.
(15) 하나의 배양접시의 세포를 취하여, 원심분리 튜브 중의 1mL 칼슘 형질주입액을 적가하였으며, 될수록 칼슘 형질주입 시약이 전체 배양접시에 분포되도록 하였다.
(16) 칼슘 형질주입액을 가한 후, 배양접시에 표기를 해놓고, 배양접시를 다른 5% CO2 배양기에 도로 넣었다. 배양접시가 수평으로 놓이게끔 확보하였으며, 6개 이상의 배양접시를 쌓지 않아야 한다. 5% CO2 배양기에 6 내지 8시간 놓았다.
(17) 첫번째 배양기의 CO2 농도 설정치를 5%로 다시 돌려 놓았다.
(18) 24시간 후, 세포 상태를 검사하였다. 세포 포화도가 약 80 내지 85%이며, 상태가 양호해야 한다. 배지를 흡수하여 버리고 10ml 새로운 DMEM 완전 배지로 교체하였다.
(19) 48시간 후, 형질주입 효율을 관찰하였다. 대부분의 세포는 여전히 벽에 부착하였다. 95%를 초과하는 세포가 모두 녹색형광을 갖고 있음이 발견되었다. 동일한 바이러스 패키징 상청액을 같이 수집하며, 배양접시에 10ml 신선한 배지를 계속 첨가하였다.
(20) 72시간 후, 다시 동일한 바이러스 상청액을 같이 수집하였으며, 두번 수집한 바이러스를 함께 둘 수 있으며, 배양 접시를 버렸다. 이때 수집한 상청액에는 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460이 포함되어 있다.
실시예 2 재조합 렌티바이러스 벡터의 농축 및 검출
1. 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 정제된 재조합 렌티바이러스 벡터(도 8에 표시된 바와 같다)
(1) 수집한 상청액을 Thermo 진공펌프를 사용하여, 0.22μm 내지 0.8μm의 PES 필터로 흡인 여과하여 불순물을 제거하였다.
(2) 1.5M NaCl 250 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）를 1:1 내지 1:10의 비율로 상청액에 첨가하였다.
(3) 2 개의 이온 교환 컬럼을 직렬로 배치하고, 4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）용액으로 컬럼을 순차적으로 통과시켰다.
(4) 단계 2에서 얻은 용액을 연동 펌프를 통해 1 내지 10 ml/분의 속도로 이온 교환 컬럼에 주입하였다.
(5) 모든 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 10ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）용액으로 1 회 세척하였다.
(6) 시료 주입량에 따라 1-5ml 1.5M NaCl 25 mM Tris-HCl（pH 6 내지 8）를 사용하여 용출하였으며, 용출액을 수집하였다.
(7) 용출액을 25 내지 50μl의 튜브에 나누어 넣고, -80℃ 냉장고에 냉동보관하여 장기간 보존하였다.
2. 적정농도 측정
(1) 24웰 플레이트를 사용하여 293T 세포를 접종하였다. 웰당 세포는 5×104개이며, 첨가한 배지의 체적은 500ul이며, 부동한 종류의 세포생장 속도에는 일정한 차이가 있으며, 바이러스 감염시 세포 포화도는 40% 내지 60%이다.
(2) 3개의 무균 EP 튜브를 준비하며, 튜브 당 90ul의 신선한 완전배지(고당 DMEM+10% FBS)를 가하여 세포를 접종한 24시간 후, 2개 웰의 세포를 취하여 혈구계수판으로 수량을 체크하여, 감염시 세포의 실제 수량을 확정하여, N으로 표기하였다.
(3) 측정하려는 바이러스 원액 10μl를 제1튜브에 넣고 가볍게 흔들어 균일하게 혼합한 후, 10μl를 취하여 제2튜브에 넣었으며, 이렇게 마지막 튜브까지 조작하였다. 튜브 당 410μl 완전 배지（고당 DMEM+10% FBS）를 가하여, 최종 체적을 500ul로 하였다.
(4) 감염이 시작된 지 20시간 후, 배양 상청액을 제거하고, 500ul 완전 배지（고당 DMEM+10% FBS）로 교체하여, 5% CO2에서 48시간 지속적으로 배양하였다.
(5) 72시간 후, 형광 발현 상황을 관찰하였으며, 정상조건하에, 희석배수의 증가에 따라 형광 세포수는 상응하게 감소되며, 이를 사진 찍었다.
(6) 0.2ml 0.25% 트립신-EDTA용액으로 세포를 소화시키고, 37℃에서 1분 동안 놓아두었다. 배지로 전체 세포 면을 세척하고 원심분리시켜 세포를 수집하였다. DNeasy 키트의 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 튜브 당 200μl 용출액을 가하여 DNA를 세척하고 정량화하였다.
(7) 표적 DNA를 준비하여, qPCRmix 토탈 튜브Ⅰ를 측정하였다(QPCR 프라이머 서열은 서열번호59---서열번호60이다).
Figure 112019025115884-pct00005
n = number of reactions. 예를 들면: 총 반응수는 40이며, 1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix, 4μl forward primer, 4μl reverse primer, 4μl probe 및 788μl H2O를 혼합하였다. 진탕 후 얼음위에 놓았다.
(8) 참조 DNA를 준비하여 qPCRmix튜브Ⅱ를 검출하였다(QPCR 프라이머 서열은 서열번호61---서열번호62이다).
Figure 112019025115884-pct00006
n = number of reactions. 예를 들면: 총 반응수는 40이며, 1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix 및 700μl H2O를 혼합하였다. 진탕 후 얼음위에 놓았다.
(9) 사전 냉각된 96웰 PCR 플레이트에서 PCR계를 제조하였다. 총 튜브Ⅰ에서 각각 45μl를 취하여 A 내지 D의 각 행의 웰에 넣고, 총 튜브 Ⅱ에서 각각 45μl를 취하여 E 내지 G의 각 행의 웰에 넣었다.
(10) 5μ의 플라스미드 표준액과 테스트용 샘플 게놈 DNA를 취하여 각각 A 내지 D행에 가하고, 매개 샘플을 1차 반복하였다. 또 따로 웰 하나를 남겨 5μl의 물을 넣어 주형프리 대조로 하였다（no-template control）.
(11) 5μ의 게놈 표준액과 테스트용 샘플 게놈 DNA를 취하여 각각 E 내지 G행에 가하고, 매개 샘플을 1차 반복하였다. 또 따로 웰 하나를 남겨 5μl의 물을 넣어 주형프리 대조로 하였다（no-template control）.
(12) 정량적 PCR기는 ABI PRISM 7500 정량 시스템이다. 사이클링 조건은: 50℃ 2분, 95℃10분, 이어서 95℃15초, 60℃1분인 40개 사이클이다.
데이터 분석: 측정된 DNA샘플 중 통합된 렌티바이러스 벡터 카피 수를 게놈 수를 사용하여 보정하여, 게놈 당 통합된 바이러스 카피 수를 얻었다.
적정농도（integration units per ml，IU ml-1）의 계산 공식은 하기와 같다.
IU ml-1 = (C×N×D×1000)/V
그중: C =게놈 당 통합된 평균 바이러스 카피 수
N = 감염 시 세포 수량（약 1×105）
D = 바이러스 벡터의 희석 배수
V = 첨가한 희석된 바이러스의 체적수
(13) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460의 적정농도 결과(도 9에 표시된 바와 같다).
3. 내독소 측정
(1) 내독소 작업 표준품은 15EU/대이다.
(2) 투구게 시약 감수성 λ＝0.25EU/ml, 0.5ml/튜브
(3) 내독소 표준품 희석: 내독소 표준품 한대를 준비하여, 각각 BET 용액으로 비율에 따라 4λ 및 2λ로 희석 용해하고, 밀봉막으로 입구를 밀봉하고, 15분동안 진탕용해시켰다. 희석 시 한번 희석할 때마다 볼텍스 믹서기에서 30초동안 균일하게 혼합시켰다.
(4) 로딩: 투구게 시약 몇개를 취하여, 개 당 BET 용액 0.5ml를 가하여 용해시키고, 몇개의 무 내독소 튜브에 분주하였으며, 튜브 당 0.1ml이다.
그중 2개 튜브는 음성 대조튜브이며, BET 용액을 0.1ml 가하였다.
2개 튜브는 양성 대조튜브이고, 2λ 농도의 내독소 작업 표준품용액 0.1ml를 가하였다.
2개는 샘플 양성 대조튜브이고, 0.1ml의 2λ 내독소 표준품 용액을 포함한 샘플용액(20배 희석한 테스트 샘플 1ml + 4λ의 내독소 표준품 용액 1ml=2ml의 2λ 내독소 표준품 용액을 포함한 40배 희석 샘플)을 가하였다.
샘플튜브에 0.1ml의 샘플을 가하며, 희석비율은 표 5를 참조로 하며, 37±1℃ 수욕(또는 배양기)에서 60±1min 보온시켰다.
Figure 112019025115884-pct00007
(5) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460의 내독소 검출결과(표 6에 표시한 바와 같다), 내독소 함량이 0 내지 2.5 EU/ml이며, 요구에 부합된다.
Figure 112019025115884-pct00008
4. 마이코플라즈마의 검출 및 비교
(1) 실험 3일전, 세포샘플을 무 항생제 배지에서 배양하였다.
(2) 1ml세포 현탁액（세포수는 1×105보다 크다）을 수집하여, 1.5ml 원심분리 튜브에 넣었다.
(3) 13000×g에서 1분 동안 원심분리하여, 침전을 수집하고, 배지를 제거하였다.
(4) 500ul PBS을 가하여, 피펫으로 피펫팅 하거나 또는 볼텍스 믹스로 진탕시키고, 다시 현탁시켜 침전시켰다. 13000×g에서 5분 동안 원심분리하였다.
(5) 단계4를 다시 한번 반복하였다.
(6) 50μl Cell Lysis Buffer을 가하고, 피펫으로 피펫팅하여 충분히 혼합한 후, 55℃ 수욕에서 20분 동안 배양하였다.
(7) 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하였다.
(8) 13000×g에서 5분 동안 원심분리한 후，5μl 상청액을 취하여 주형으로 하였으며, 25μl PCR의 반응계는: ddH20 6.5μl, Myco Mix 1μl, 2x Taq Plus Mix Master (Dye Plus) 12.5μl, 주형5μl이다. PCR 사이클링 조건은：95℃ 30sec, （95℃ 30sec, 56℃ 30sec, 72℃ 30sec）×30cycle, 72℃ 5min이다.
(9) 마이코 플라즈마 검출 결과로부터(도 10과 표 7에 표시한 바와 같다), 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460이 모두 마이코 플라즈마를 포함하지 않았음을 알 수 있다.
Figure 112019025115884-pct00009
실시예 3 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460의 기능 측정
1. CAR유전자의 세포 수준 발현 검출
(1) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460와 대조 바이러스 MOCK로 PBMC 세포를 감염시킨 후, 수집한 세포를 RT-PCR을 이용하여 CAR mRNA 전사 수준을 검출하여, CAR 유전자의 발현을 검증하였으며, CAR mRNA의 전사 수준이 증가하면, CAR 유전자의 전사 수준이 성공적으로 발현되었음을 설명한다.
(2) 재조합 렌티바이러스 벡터 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460와 대조 바이러스 MOCK로 PBMC 세포를 감염시킨 후, 수집한 세포를 western blot을 이용하여 CAR단백질의 발현 수준을 검출하여, CAR유전자의 발현을 검증하였으며, CAR 단백질의 수준이 증가하면, CAR 유전자의 번역 수준이 성공적으로 발현되었음을 설명한다.
(3) MOI=15인 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460와 대조 바이러스 MOCK로 각각 세포를 감염시키고, 48시간 후에 6웰 플레이트에서 추출한 세포의 토탈 RNA 및 토탈 단백질에 대해 형광 정량적 PCR 및 면역 블럿팅 실험을 진행하였다. 구체적인 단계: 6웰 플레이트의 4웰을 코팅하고, 각 웰에 상응한 PBS 및 RN을 가하고, 4℃에서 하룻밤 지냈다. 12시간 후에 MOI=15로 바이러스를 코팅하고, 37℃ 배양기에 넣어 5시간 두었다. 6웰 플레이트를 취하여, 바이러스 상청액을 제거하고, PBS로 두번 세척하고, 1×106/웰로 PBMC (림프구 세포 분리액으로 인간 혈중에서 분리)로 코팅한 후, 500ul의 배지(10%혈청, 20U/ml IL-2, Polybrene 8ug/ml를 포함)를 넣었다. 20분 동안 방치하고, 1000g에서, 20℃에서 30 분 동안 원심분리하고, 37℃에서 48 시간 배양하였다.
(4) 6웰 플레이트에서 PBMC 세포의 토탈 RNA를 Trizol 방법으로 추출하고, cDNA를 역전사에 의해 증폭시켰으며, QPCR 프라이머(서열은 서열번호63 내지 서열번호64)를 사용하여 형광 정량 PCR실험을 진행하였으며, 반응계는 표 8를 참고로 하며, 참조 Actin을 대조군으로 하여, mRNA의 전사 정황을 검증하였다.
Figure 112019025115884-pct00010
(5) 웨스턴 블롯(Western Blot)은 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 통해 PBMC로부터 추출한 토탈 단백질을 상대적 분자량에 따라 분리하는 것이다. 습식 트랜스퍼(4℃, 400 mA, 120min)를 통해, 단백질을 PVDF막에 전이시켰다. 블로킹 용액(5% 탈지우유를 함유한 TBST 용액)으로 실온에서 PVDF막을 1시간 동안 블로킹하고, 블로킹 용액으로 1:10000으로 Biotinylated protein L을 희석한 후, 블로킹한 PVDF막으로 실온에서 배양하고 4℃에서 하룻밤을 지냈다. TBST로 막을 3번 세척하였으며, 매번 10분 동안 세척하였다. 블로킹 용액으로 1:500으로 상응한 SA-HRP를 희석하였으며, 실온에서 PVDF 막을 2시간 동안 배양하였으며, TBST으로 막을 3번 세척하였으며, 매번 10분 동안 세척하였다. Amersham회사의 ECL+plusTM Western blotting System 키트를 이용하여 현상하였다. X선 현상을 통해 밴드를 나타낸 필름을 얻었다.
(6) RT-QPCR 검출을 통해, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC를 감염시킨 후의 CAR 유전자의 전사 수준이 대조 바이러스 MOCK와 블랭크 세포에 비해 현저히 제고됨을 확인하였으며(도 11과 표 9에 표시된 바와 같이), 이는 CAR 유전자의 전사 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
Figure 112019025115884-pct00011
(7) 웨스턴 블롯((Western Blot)의 결과는, 재조합 렌티바이러스 벡터가 PBMC을 감염시킨 후, CAR단백질의 발현 레벨은 대조 바이러스 MOCK와 블랭크(blank) 세포에 비해 현저히 증가되었음을 표명하며(도 12로 표시된 바와 같이), CAR 유전자의 번역 수준 발현에 성공하였음을 설명한다.
2. PD-1 녹다운 효과 평가(PD-1 mRNA 전사 수준)
(1) 각각 BCMA-K562세포와 PBMC 세포를 배양하였다.
(2) 실험 시작 4일 전, MOI=15인 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460의 바이러스로 PBMC 세포를 감염시키며, 72 내지 96h 배양 후 실험을 시작할 수 있다.
(3) 표적 세포（BCMA-K562）4x105cells와 주효세포（lvCARbcma-1453-PBMC 내지 lvCARbcma-1460-PBMC세포）2.8x106cells를 수집하고, 800g에서 6분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다.
(4) 1ml 1xPBS 용액으로 표적세포와 주효세포를 다시 현탁시키고, 800g에서 6분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다.
(5) 단계(4)를 한번 반복하였다.
(6) 700μl 배지（1640배지+10% FBS）로 주효세포를 다시 현탁시키고, 2ml 배지（1640배지+10% FBS）로 표적세포를 다시 현탁시켰다.
(7) 주효 및 표적 세포 비율이 10:1인 실험 웰을 설치하고, 블랭크 대조군을 설치하였다.
(8) 250xg에서, 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(9) 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 공동배양하고, 1000xg, 2분 동안 플레이트 원심분리를 하고, 세포를 수집하여 PD-1 mRNA 전사 수준을 측정하였다.
(10) Trizol법으로 상기 혼합 세포의 토탈 RNA를 추출하고, 역전사를 통해 cDNA를 증폭시켰으며, QPCR 프라이머(서열은 서열번호57 내지 서열번호58이다)를 사용하여 형광 정량 PCR 실험을 진행하였다. 반응계는 표 6를 참조로 하며, 참조 액틴(Actin)은 대조군이며, 이의 mRNA의 전사 상황을 검증하였다.
(11) RT-QPCR 검출 결과는, 일부분 PD-1 녹다운 재조합 렌티바이러스 벡터로PBMC를 감염시키고, 표적 단백질과 함께 배양한 후, PD-1 유전자의 mRNA는 대조 바이러스 lvCARbcma-1460에 비해 현저히 감소되었으며(도 13과 표 10에 표시된 바와 같이), 이는 PD1siRNA가 PD-1 유전자의 전사 수준에 대해 녹다운 작용을 함을 설명하며, 그중, lvCARbcma-1453의 녹다운 효과가 제일 좋으며, 70% 이상에 달한다. 블랭크 군은 표적세포에 의해 활성화되지 않기에 PD-1 전사 수준이 향상되지 않았다.
Figure 112019025115884-pct00012
3. 세포 사멸 실험 효과 평가
(1) 각각 BCMA-PDL1-K562 세포와 PBMC 세포를 배양하였다.
(2) 실험 시작 4일전, MOI=15인 lvCARbcma-1453 내지 lvCARbcma-1460 바이러스로 PBMC 세포를 감염시키고, 72 내지 96h 후 실험을 시작할 수 있다.
(3) 표적세포（BCMA-PDL1-K562）4x105cells과 주효세포（CART 세포）2.8x106cells를 수집하였으며, 800g에서 6min 원심분리하여, 상청액을 제거하였다.
(4) 1ml 1xPBS 용액으로 각각 표적세포와 주효세포를 다시 현탁시키기고, 800g에서, 6분동안 원심분리하고 상청액을 제거하였다.
(5) 단계3을 한번 반복하였다.
(6) 700ul 배지（1640배지+10% FBS）로 주효세포를 다시 현탁시키고, 2ml 배지（1640배지+10% FBS）로 표적세포를 다시 현탁시켰다.
(7) 주효세포와 표적세포의 비가 10:1인 실험 웰을 설정하였으며, 대조군을 설정하고, 군 당 3개 반복으로 하였다.
(8) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(9) 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
(10) 250xg에서 5분 동안 플레이트 원심분리하였다.
(11) 매개 웰에서 50㎕의 상청액을 취하여, 새로운 96웰 플레이트에 넣고, 매 웰에 50㎕ 기질 용액을 가하였다(빛 차단 조작).
(12) 빛을 차단하여 25분 동안 배양하였다.
(13) 매개 웰에 50ul 정지액을 가하였다.
(14) 마이크로 플레이트 리더로 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(15) 3개 반복 웰에서 평균치를 구하였다. 모든 실험 웰, 표적세포 웰 및 주효세포 웰의 흡광도 값에서 배지 배경흡광도의 평균값을 감하고, 표적 세포의 최대치의 흡광도 값에서 체적 보정 대조 흡광도 값의 평균값을 감하였다.
(16) 단계15에서 얻은 보정을 거친 값을 하기 식에 대입하여, 매개 주효세포와 표적세포 비에서 생성된 세포독성 백분율을 계산하였다. 결과는 도 14에 표시된 바와 같이, PD-1녹다운 재조합 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 PBMC세포는 10:1의 주효세포와 표적세포의 비의 조건하에서 사멸 효율이 PBMC 블랭크 세포에 비해 현저히 높았으며, 대조 바이러스 lvCARbcma-1453-PBMC세포가 표적 세포에 대한 살상효율이 제일 높았으며, 40%보다 높았다. lvCARbcma-1454-PBMC세포가 표적세포에 대한 살상효율이 버금으로 갔다. 나머지 lvCARbcma-1455-PBMC 내지 lvCARbcma-1458-PBMC세포가 표적 세포에 대한 살상효율은 대조 lvCARbcma-1460-PBMC세포에 비해 비슷하였으며, 도 13의 결과로부터, 표적세포 중의 PD-L1의 존재로 인해, PD-1과 결합하여 억제신호를 전달하여, T 세포의 면역활성을 억제시켜, T 세포가 표적세포에 대한 사멸효율을 대폭 감소시켰음을 알 수 있다. 그러나, PD-1 분자 발현 수준이 대폭 감소한 조건하에, 효과적으로 PD-1/PDL-1의 신호 경로의 활성을 차단할 수 있어서, T 세포가 표적세포에 대한 사멸작용을 정상적으로 발휘할 수 있게 한다. 미래에 lvCARbcma-1453 벡터 및 그의 형질주입된 T세포는 임상에 응용하여, CAR-T 세포내의 PD-1 발현 수준을 억제시키고, CAR-T-T 세포가 체내에서 종양에 대한 사멸효과를 강화시킬 수 있으며, 면역 탈출을 억제하는 효과를 얻을 수 있다.
사멸 효율= （실험 웰주효세포 웰표적세포 웰）/（표적 세포의 최대 웰표적 세포 웰）X100%
이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 구체적으로 설명했지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 동등적인 변형 또는 대체를 실시할 수 있으며, 이러한 동등한 변형 또는 대체는 모두 청구항에서 한정한 범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Unicar Biomedical Technology Co., Ltd. <120> siRNAs Knocking down human PD-1 and Recombinant Expression CAR-T Vector and Their Construction Methods and Applications <130> HPCT17-14125 <160> 64 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 1 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 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ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592 <210> 14 <211> 256 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 14 ccccttcacc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 60 tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 120 gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 180 ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 240 gtggaaagga cgaaac 256 <210> 15 <211> 1178 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 15 gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60 gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240 tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300 cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360 agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420 ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480 tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540 aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600 cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660 cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720 gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780 ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840 cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900 cctcagccgt cgcttcatgt gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960 agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020 agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080 tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140 tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178 <210> 16 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 16 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 17 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 17 gacatccaga tgacccagag ccctagctca ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60 attacctgct ccgccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctccaacc tgcactccgg cgtgcccagc 180 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgat ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaggaagc tcccctggac tttcggccag 300 ggcaccaaac tggagatcaa gcgt 324 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 18 ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45 <210> 19 <211> 363 <212> DNA <400> 19 caggtgcagc tggtccagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggagtg gatgggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcgc caggggcgcc 300 atctacgacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363 <210> 20 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 20 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgatatcta c 141 <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 21 atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60 tactgc 66 <210> 22 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 22 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 23 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 23 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 24 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 24 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 25 attcaaaatt ttatcgatgc tccggtgccc gtcagt 36 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 26 tcacgacacc tgaaatggaa ga 22 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 27 ggtgtcgtga ggatccgcca ccatggcctt accagtgacc gc 42 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 28 gtgtcatctg gatgtccggc ctggcggcgt g 31 <210> 29 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 29 cacgccgcca ggccggacat ccagatgacc cagagcc 37 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 30 acgcttgatc tccagtttgg t 21 <210> 31 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 31 actggagatc aagcgtggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc 60 tcaggtgcag ctggtccaga g 81 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 32 gctggacacg gtcactagtg tg 22 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 33 agtgaccgtg tccagcacca cgacgccagc gcc 33 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 34 gtagatatca caggcgaagt cca 23 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 35 cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggc 33 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 36 tctttctgcc ccgtttgcag taaagggtga taaccagtg 39 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 37 aaacggggca gaaagaaact c 21 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 38 tgctgaactt cactctcagt tcacatcctc cttcttcttc 40 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 39 agagtgaagt tcagcaggag cg 22 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 40 ggagaggggc gtcgacttag cgagggggca gggc 34 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 41 ccggctaaac tggtaccgca tgagcctcga gtcatgcggt accagtttag cattttttg 59 <210> 42 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 42 aattcaaaaa atgctaaact ggtaccgcat gactcgaggc tcatgcggta ccagtttag 59 <210> 43 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 43 ccggcattgt ctttcctagc ggaatctcga gtccgctagg aaagacaatg gtttttttg 59 <210> 44 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 44 aattcaaaaa aaccattgtc tttcctagcg gactcgagat tccgctagga aagacaatg 59 <210> 45 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 45 ccggaggcgc agatcaaaga gagttctcga gctctctttg atctgcgcct tgttttttg 59 <210> 46 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 46 aattcaaaaa acaaggcgca gatcaaagag agctcgagaa ctctctttga tctgcgcct 59 <210> 47 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 47 ccggccctgt ggttctatta tattactcga gatataatag aaccacaggg aattttttg 59 <210> 48 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 48 aattcaaaaa attccctgtg gttctattat atctcgagta atataataga accacaggg 59 <210> 49 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 49 ccggggaacc cattcctgaa attatctcga gaatttcagg aatgggtcca attttttg 58 <210> 50 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 50 aattcaaaaa attggaaccc attcctgaaa ttctcgagat aatttcagga atgggttcc 59 <210> 51 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 51 ccggcaggcc tagagaagtt tcaggctcga gtgaaacttc tctaggcctg cattttttg 59 <210> 52 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 52 aattcaaaaa atgcaggcct agagaagttt cactcgagcc tgaaacttct ctaggcctg 59 <210> 53 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 53 ccggcaggac tcatgtctca atgccctcga gcattgagac atgagtcctg tgttttttg 59 <210> 54 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 54 aattcaaaaa acacaggact catgtctcaa tgctcgaggg cattgagaca tgagtcctg 59 <210> 55 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 55 ccggttctcc gaacgtgtca cgtctcgaga cgtgacacgt tcggagaatt ttttg 55 <210> 56 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 56 aattcaaaaa attctccgaa cgtgtcacgt ctcgagacgt gacacgttcg gagaa 55 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 57 tgcagcttct ccaacacat 19 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 58 cttgtccgtc tggttgct 18 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 59 cctttccggg actttcgctt t 21 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 60 gcagaatcca ggtggcaaca 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 61 catgtacgtt gctatccagg c 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 62 ctccttaatg tcacgcacga t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 63 gacttgtggg gtccttctcc t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 64 gcagctacag ccatcttcct c 21

Claims (15)

  1. 인간 PD-1을 녹다운시키는 siRNA 코어 서열을 포함하는 shRNA로서, 여기서 상기 shRNA는 하기 a 내지 g 중 어느 하나로부터 선택되는, shRNA.
    a. 서열번호41과 서열번호42로 표시된 뉴클레오티드,
    b. 서열번호43과 서열번호44로 표시된 뉴클레오티드,
    c. 서열번호45와 서열번호46으로 표시된 뉴클레오티드,
    d. 서열번호47과 서열번호48로 표시된 뉴클레오티드,
    e. 서열번호49와 서열번호50으로 표시된 뉴클레오티드,
    f. 서열번호51과 서열번호52로 표시된 뉴클레오티드,
    g. 서열번호53과 서열번호54로 표시된 뉴클레오티드.
  2. 청구항 1의 shRNA를 포함하는, 종양 치료에 사용하는 CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell, 키메라 항원 수용체 T 세포) 치료제용 약학 조성물.
  3. 청구항 1의 shRNA를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 발현벡터는 렌티바이러스 발현벡터, 역전사 바이러스 발현벡터, 아데노바이러스 발현벡터, 아데노 관련 바이러스 발현벡터 또는 플라스미드인 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 렌티바이러스 발현벡터는, 서열번호2로 표시된 것과 같은 플라스미드의 복제에 사용되는 원핵 리플리콘 pUC Ori서열; 서열번호1로 표시된 것과 같은 표적 균주의 대량 증식에 사용되는 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR서열; 서열번호3으로 표시된 것과 같은 진핵세포내에서 복제를 강화시키는 바이러스 리플리콘 SV40 Ori서열; 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트; 서열번호11로 표시된 것과 같은 진핵세포의 녹색형광의 발현에 사용되는 ZsGreen1 녹색형광 단백질; 서열번호12로 표시된 것과 같은 발현 단백질의 공동 전사에 사용되는 IRES 리보솜 결합 서열; 서열번호14로 표시된 것과 같은 키메라 항원 수용체 유전자의 진핵 전사에 사용되는 인간 EF1α 프로모터; 일체적으로 인식, 전달 및 가동되는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR의 조성에 사용되는 항BCMA 키메라 항원 수용체의 코딩 유전자; 서열번호13으로 표시된 것과 같은 형질전환 유전자의 발현율의 증가에 사용되는 eWPRE 강화형 프레리독 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트; 서열번호14로 표시된 것과 같은 세포내 siRNA 전사에 사용되는 인간 RNA 중합효소 III 프로모터 hU6을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 2세대 렌티바이러스 벡터를 사용하며, 서열번호5로 표시된 것과 같은 렌티바이러스5 terminal LTR, 서열번호6으로 표시된 것과 같은 렌티바이러스3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호7로 표시된 것과 같은 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호8로 표시된 것과 같은 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호9로 표시된 것과 같은 env 시스 엘리먼트, 서열번호10으로 표시된 것과 같은 cPPT 시스 엘리먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 렌티바이러스 패키징 시스 엘리먼트는 3세대 렌티바이러스 벡터를 사용하며, 서열번호5로 표시된 것과 같은 렌티바이러스 5 terminal LTR, 서열번호6으로 표시된 것과 같은 렌티바이러스 3 terminal Self-Inactivating LTR, 서열번호7로 표시된 것과 같은 Gag 시스 엘리먼트, 서열번호8로 표시된 것과 같은 RRE 시스 엘리먼트, 서열번호9로 표시된 것과 같은 env 시스 엘리먼트, 서열번호10으로 표시된 것과 같은 cPPT 시스 엘리먼트 및 서열번호4로 표시된 것과 같은 RSV 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 eWPRE 강화형 프레리독 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트는 6개의 뉴클레오티드의 강화 돌연변이를 갖고 있으며, 구체적으로, g.396G>A, g.397C>T, g.398T>C, g.399G>A, g.400A>T, g.411A>T인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  9. 청구항 5에 있어서,
    상기 항BCMA 키메라 항원 수용체는 순차적으로 연결된 서열번호16으로 표시된 것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, 서열번호17로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호18로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호19로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호20으로 표시된 것과 같은 CD8 Hinge 키메라 수용체 힌지, 서열번호21로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통 영역, 서열번호22로 표시된 것과 같은 CD137키메라 수용체 공동자극인자 및 서열번호23으로 표시된 것과 같은 TCR 키메라 수용체 T세포 활성화영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  10. 청구항 5에 있어서,
    상기 항BCMA 키메라 항원 수용체는 순차적으로 연결된 서열번호16으로 표시된것과 같은 CD8 leader 키메라 수용체 신호 펩티드, 서열번호17로 표시된 것과 같은 BCMA 단쇄 항체 경쇄 VL, 서열번호18로 표시된 것과 같은 Optimal Linker C, 서열번호19로 표시된 것과 같은 CD19 단쇄 항체 중쇄 VH, 서열번호20으로 표시된 것 과 같은 CD8 Hinge키메라 수용체 힌지, 서열번호21로 표시된 것과 같은 CD8 Transmembrane 키메라 수용체 막관통 영역, 서열번호24로 표시된 것과 같은 CD28 키메라 수용체 공동자극인자, 서열번호22로 표시된 것과 같은 CD137 키메라 수용체 공동자극인자 및 서열번호23으로 표시된 것과 같은 TCR 키메라 수용체 T 세포 활성화영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  11. 청구항 1의 shRNA를 포함한 렌티바이러스 발현 벡터의 제조방법으로서,
    (1) 서열번호1로 표시된, 암피실린 내성 유전자를 포함한 AmpR 서열; 서열번호2로 표시된, 원핵 리플리콘 pUC Ori 서열; 서열번호3으로 표시된, 바이러스 리플리콘 SV40 Ori 서열; 서열번호11로 표시된, 렌티바이러스 패키징에 사용되는 렌티 바이러스 패키징 시스 엘리먼트, ZsGreen1 녹색형광단백질; 서열번호12로 표시된, IRES 리보솜 결합서열; 서열번호13으로 표시된, eWPRE 강화형 프레리독 B형 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트; 서열번호14로 표시된, 인간 RNA 중합효소 III 프로모터 hU6을 렌티바이러스 백본 플라스미드에 저장하는 단계,
    (2) 서열번호15로 표시된, 인간 EF1α 프로모터, 일체적으로 인식, 전달 및 가동되는 2세대 CAR 또는 3세대 CAR을 조성하기 위한 항BCMA 키메라 항원 수용체로 2세대 CAR 또는 3세대 CAR로 조성하는 설계방안, 효소절단, 연결, 재조합 반응을 통해 렌티바이러스 백본 플라스미드에 클로닝하여 2세대 CAR 또는 3세대 CAR 디자인의 재조합 렌티바이러스 플라스미드를 얻는 단계,
    (3) 상기 shRNA 및 서열번호55와 서열번호56으로 표시된 negative control 서열을 각각 단계（2）에서 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드에 클로닝하여, PD-1녹다운 재조합 렌티바이러스 플라스미드를 얻는 단계,
    (4) 단계(3)에서 얻은 재조합 렌티바이러스 플라스미드를 각각 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pPac-GP, pPac-R 및 막 단백질 플라스미드 pEnv-G와 함께 HEK293T/17세포에 형질주입시키며, HEK293T/17세포내에서 유전자 전사 발현을 진행한 후, 재조합 렌티 바이러스 벡터의 패키징에 성공시켜 세포 배양액 상청액에 방출시키며, 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함한 상청액을 수집하는 단계,
    (5) 얻은 재조합 렌티바이러스 상청액을 흡입여과, 흡착, 용출에 의한 이온교환 방법으로 정제하여 각각 재조합 렌티바이러스 벡터를 얻는 단계
    를 포함하는 청구항 1의 shRNA를 포함한 렌티바이러스 발현 벡터의 제조방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    단계 (5)에서, 상기 흡입여과 단계에서 상청액 체적을 200ml 내지 2000ml로, 진공도를 -0.5MPA 내지 -0.9MPA로 제어하여, 웰 막힘으로 인한 벡터의 손실을 방지하며, 흡착단계에서 용액의 PH값을 6 내지 8로 제어하여, PH 변화에 의한 벡터의 비활성화를 방지하며, 용출단계에서 용출액의 이온강도를 0.5M 내지 1.0M로 제어하여, 이온강도의 변화에 의한 불완전 용출 또는 벡터의 불활성화를 방지하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 청구항 3 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 재조합 발현벡터를 포함하는, 종양 치료에 사용하는 CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell, 키메라 항원 수용체 T 세포) 치료제용 약학 조성물.
  14. CAR-T세포가 청구항 1의 shRNA로 수식된 T림프 세포인, CART 세포.
  15. 청구항 13에 있어서,
    종양은 골수종, 췌장암 또는 뇌신경교종인, 종양 치료에 사용하는 CAR-T 치료제용 약학 조성물.
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