KR20190050946A - 황금싹 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름 기능성 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황금의 싹추출물 및 상기 추출물 유래의 Chrysin-7-O-glucuronide이 함유된 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포독성 및 피부 부작용이 없는 항산화, 주름개선 및 피부노화 억제 기능성 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

황금싹 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름 기능성 조성물{Antioxidant, skin-whitening and anti-wrinkle composition comprising the extract of S. baicalensis sprout and its active components}

본 발명은 황금(Scutellaria baicalensis Georgi)의 싹 추출물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 황금싹 유기용매 추출물 및 상기 추출물로부터 분리한 Chrysin-7-O-glucuronide를 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

황금(속썩은 풀, Scutellaria baicalensis Georgi)은 꿀풀과에 속하는 다년생 초본으로서 황금의 주피를 벗긴 뿌리를 약용으로 한다. 뿌리에는 35% 이상의 페놀화합물을 포함하며 노란색을 띄기 때문에 황금이라 불린다.

황금의 주성분은 1930년 황금 뿌리에서 wogonin이 분리된 이후 현재까지 baicalin, baicalein 및 wogonin을 비롯하여 50 여종의 flavones가 분리 정제되었다(Kim et al., 2013; Tang & Eisenbrand, 1992; Zhou et al., 1997).

오래전부터 황금은 민간처방 약재로 사용되었을 뿐만 아니라 한방에서는 뿌리를 말린 것을 이질(dysentery), 발열(pyrexia), 황달(jaundice) 및 옹(carbuncle)의 치료제로 사용되고 있다(Huang et al., 2005; Lam et al., 2000).

황금에는 유효성분으로 baicalein, biacalin, chrysin, oroxylin-A, wogonin 및 wogonoside 등과 같은 30여종 이상의 flavonoid가 함유되어 있으며, 그 중 baicalin이 가장 많이 함유되어 있다. baicalein은 항염증, 항당뇨, 항균, 항알레르기, 항바이러스, 항고혈압 및 항산화 등의 효능이 보고되었다(Burnett et al., 2007; Choufani et al., 2011; Jung et al., 2012; Lu et al., 2011).

피부는 노화가 진행됨에 따라 여러 가지 대사활성이 저하되며 세포활성이 떨어진다. 노화는 자연노화(내인성노화)와 광 노화로 나눌 수 있다. 자연노화는 콜라겐 합성과 콜라겐의 전사 이후에 일어나는 과정으로 노화에 따라 피부가 얇고, 건조해지며 주름이 생기고 피부의 matrix metalloproteinases인자가 줄어들며 발생한다. 광노화는 자외선이 원인으로 자외선에 의해 염증인자(tumor necrosis factor-α, tumor necrosis factor-γ, nitric oxide)등이 생성됨에 따라 콜라겐의 합성이 억제되며 콜라겐 분해하는 효소들의 발현에 되면서 광노화를 유도하여 피부 홍반, 거칠기, 주름, 흑화 등을 만들게 된다(Seo et al., 2001, Cadenas et al., 1989).

황금추출물에 대한 효능은 항산화, 항염효과, 향균효과, 미백효과, 자외선 차단 효과가 보고되어있다. 그러나, 지금까지 황금싹에 대한 효능은 보고되어 있지 않다. 본 발명자들은 황금의 싹추출물 유래의 Chrysin-7-O-glucuronide이 콜라겐 합성을 증가시키고 멜라닌합성 저해 및 항산화효능을 확인하였다.

콜라겐은 인체내에서 전구체(procollagen)형태로 합성 된 다음 세포 밖으로 배출되어 pN collagen(전구체 중 C-terminal propeptide가 잘려나간 형태), pC collagen(전구체 중 N-terminal propeptide가 잘려나간 형태)등 다양한 중간산물을 거쳐 완성된 collagen을 형성하는 것으로 보고되고 있다.

인체내에서는 항상 collagen의 분해와 합성이 반복되는데 나이가 들어감에 따라 그 균형은 붕괴되어 합성보다는 분해가 훨씬 많게 된다. 이로 인하여 피부의 주름이 발생하고 피부의 노화가 진행된다(Austic et al., 1985).

또한, 광노화로 인해 주름 뿐만 아니라 색소침착으로 인한 주근깨, 일광흑색점, 색소성모반등의 퇴행성 만성변화가 발생한다. 멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생물고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체로표피의 기저층에 존재 하는 수지상 돌기세포로 색소를 형성하고, UV나 melanocyte stimulation hormone (MSH), 다양한 사이토카인(Cytokines), 성장인자(growth factors)등 내적, 외적 인자들의 광범위한 변화에 대해 반응한다. (Wolf et al., 2004, Ormerod et al., 1989, Ormerod et al., 2001).

멜라닌 세포에서 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)을 전구물질로 하여 tyrosine → DOPA → DOPA quinone → indole-5,6- dihydroquinone으로 변화하고, indole-5,6-dihydroquinone의 중합체가 멜라닌이다. 이러한 멜라닌생성을 예방하기 위해서는, 다른 물질의 산화를 방지하는 비타민E, 체내 과산화물을 제거하는 SOD 등 산화방지 메커니즘을 도와줄 수 있는 항산화물질이 필요하다(박주아 외 2012, 표애자 외 2013, Kang, W.K. et al., 2006).

본 발명과 관련된 선행기술로는 대한민국 등록특허 10-1750994호에 황금 즉 이 뿌리(root)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 SASP 억제를 통한 암, 동맥경화, 알츠하이머, 관절염 또는 당뇨병 관련 질환 치료 및 예방제에 관한 것이 공지되어 있다. 그러나 지금까지 Chrysin-7-O-glucuronid가 다량 함유된 황금의 싹(sprout) 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름 기능성 화장료 또는 식품 조성물에 대해서는 공지된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 황금의 씩 추출물 및 Chrysin-7-O-glucuronide가 함유된 황금의 싹추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름 기능성 화장료 또는 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 황금의 싹(sprout)을 생육하여 이를 에탄올로 추출하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 황금싹의 에탄올추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 용매 분획하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 에탄올추출물의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 각 분획물의 성분을 분석하여 생리활성물질을 분리 정제 및 동정하는 단계로 이루어지고, 상기 단계에서 수득한 황금의 싹 에탄올 추출물 각 순차 용매 분획물의 항산화, 미백 및 항주름 생리활성을 측정하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 황금의 싹 유기용매 추출물 및 황금싹 유래의 Chrysin-7-O-glucuronide가 함유된 추출물은 항산화, 항주름 및 미백효를 갖는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 황금의 싹의 재배 과정을 나타낸 다이어그램이다.
도 2는 본 발명에 따른 황금의 싹추출물과 그의 용매 분획물 및 그로부터 유래하는 유기화합물1의 분리정제 및 동정의 과정을 나타낸 다이어그램이다.
도 3은 본 발명에 따른 황금의 싹추출물의 50% 에탄올 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 황금의 싹추출물의 유기화합물1의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 황금의 싹추출물 유래의 유기화합물1의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 황금의 싹추출물 유래의 유기화합물1의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 황금의 싹추출물의 DCFH-DA를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 황금의 싹추출물의 멜라닌 합성 저해능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 황금의 싹추출물의 콜라겐 합성능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 황금의 싹추출물 유래의 유기화합물1의 콜라겐 합성능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 하기 화학식(I)을 가지는 Chrysin-7-O-glucuronide가 함유된 황금의 싹추출물(이하, 황금싹추출물이라 함)을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 항주름 기능성 조성물을 제공한다.

… [화학식 I]

본 발명에 따르면 상기 황금싹 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부틸렌글리콜, 프로판디올 또는 이들의 혼합 용매에 의해 추출될 수 있으며, 가장 바람직하게는 50% 에탄올 추출물이다.

또, 본 발명에 따르면 황금의 싹 추출은 시간 및 온도는 엄격히 제한되지는 않으나 가장 바람직하게는 실온에서 24시간씩 2회 추출하는 것이다.

본 발명에 따라 제조된 상기 황금싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 화장수, 로션, 크림 및 에센스 등으로 제형화 할 수 있다.

본 발명은 하기의 구체적인 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 보다 구체적으로 설명되나, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.

실시예1. 본 발명 황금싹 추출물의 제조

황금의 종자를 오존(O₃)에 살균한 다음 d-H₂O에 20±2℃에서 4시간 침지시킨 후 무광하에 20±2℃에서 방치하여 3일간 발아시켰다. 침지시간이 이보다 길면 발아율이 저하되고 이보다 짧으면 발아기간이 30% 연장되었다. 발아된 종자는 빛 조건 하에 5~6일간 재배한 다음 20℃에서 24시간 무광하에서 더 재배하여 황금싹을 수확하였다(도1). 상기 단계에서 수득한 생육한 황금의 싹을 열풍건조기를 이용하여 건조한 후 건조한 황금싹 100g에 20배의 50% 에탄올로 24시간 실온에서 추출하였다. 상기 단계에서 얻은 추출물을 여과, 감압농축 및 동결건조하여 본 발명 황금싹 추출물을 얻어 항산화, 미백 및 항주름 활성검정용 및 유효성분 분리동정을 위한 공시재료로 사용하였다.

실시예2. 본 발명 황금의 싹추출물 분획물 제조

*상기 실시예1에 따라 제조한 황금싹 추출물을 헥산(Haxane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)로 순차적으로 용매 분획하여 각각의 분획물을 수득하였다. 상기 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 본 발명 황금싹추출물의 항산화, 미백 및 항주름 활성 검정용 및 유효성분 분리동정을 위한 공시재료로 사용하였다.

실험예1. 본 발명 황금싹 추출물 및 그 분획물의 HPLC 분석

본 발명 황금싹 추출물 및 그 분획물의 HPLC 분석을 위해 상기 실시예1 내지 실시예2에서 수득한 본 발명 황금싹 에탄올 추출물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물의 성분 분석을 HPLC(Waters2695)를 통하여 분석하였다. 이를 위해 분석컬럼은 ODS 컬럼(Kromasil C18 4.5 x 250mm, 5um)를 이용하였고 전기용매로는 1% Acetic acid 정제수와 Acetonitrile을 60분 동안 10:90(v/v)에서 100:0(v/v) 혼합비로 변화시켜 분석하였다. 전기용매 유속은 1mL/min, 컬럼 온도는 30℃, 시료 주입량은 10ug/mL 농도로 10uL씩 주입하여 267nm에서 분석하였다.

실험 결과, 도3 내지 4에서 알 수 있듯이 본 발명 황금싹 추출물은 33분에 분획된 에탄올 분획물로 이행되었고, 나머지 성분은 에틸아세테이트 분획물로 이행되었음을 확인하였다.

실험예2. 본 발명 유기화합물 1의 분리 동정

상기 실시예1에서 수득한 황금싹 에탄올 추출물을 감압 흡입여과기를 이용하여 여액만 농축하여 얻은 추출물 12.7g 중 12g을 100% 증류수에 현탁하여 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 부탄올 순으로 분획하였다. 상기 단계에서 얻은 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물 700mg을 순상실리카겔컬럼 크로마토그래피를 실시하여 얻은 freaction을 TLC로 확인하여 패턴이 비슷한 fraction을 모아 sephadex LH-20을 실시하여 유기화합물1 3.0mg을 얻었다. 상기에서 얻은 유기화합물1을 HPLC, ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석을 통하여 동정하였다.

HPLC 분석은 상기 실험예1의 방법과 동일한 방법으로 수행하였고, ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석은 유기화합물 1을 NMR용매 CD3OD에 용해하여 500mHz 및 125mHZ NMR 기기를 이용하여 스펙트럼을 얻었다(표1).

실험 결과, 도4에서 알 수 있듯이 본 발명 유기화합물1은 순도 높게 분리된 것을 확인하였다. 또, 도5 내지 도6 및 표1에서 알 수 있듯이 유기화합물1의 화학 구조가 Chrysin-7-O-glucuronide임을 확인하였다(화학식1).

실험예3. 본 발명 황금싹 에탄올추출물의 항산화 활성 검정

본 발명에 따른 상기 [화학식1]을 함유하는 황금싹 에탄올추출물의 항산화 활성을 검정하기 위해 DCFH-DA(2'7'-dichloro flurescin0diacetate)를 이용하여 검정하였다. 이를 위해 피부 섬유아세포(HDFn)를 DMEM(10% 혈청 및 1% 항생제 첨가) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 well당 1x10⁵ 세포수가 되도록 배양하였다. 상기 단계에서 수득한 피부 섬유아세포를 상기 실시예1에서 수득한 본 발명에 따른 황금싹 에탄올 추출물에 30, 60 및 120ug/mL 농도로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 20분간 배양한 후 산화스트레스 유발 물질인 H₂O₂ 1mM 및 DCFHDA 20M을 첨가한 후 excitation 485nm, emission 535nm 조건으로 spectrofluorophotomer로 측정하였다. 시료를 넣지않고 항산화 활성을 측정한 처리군을 대조군으로 이용하였고 항산화 활성은 하기 수학식1의 방법으로 계산하였다. 모든 실험은 3번 반복하여 실험하였다.

실험 결과, 도7에서 알 수 있듯이 농도의존적으로 항산화 활성이 나타냈으며, 120ug/mL 농도로 처리한 실험군에서는 활성산소의 농도는 15.23% 감소하는 것을 확인하였다.

실험예4. 본 발명 황금싹 추출물의 미백 활성검정

본 발명에 따른 상기 화학식I이 함유된 황금싹 추출물의 미백 활성검정을 위해 멜라닌 합성 저해실험을 통해 미백 원료로서의 효능을 평가하였다. 이를 위해 murine melanoma(B-16 F1) 세포를 FBS가 함유된 DMEM배지에 1x10개로 접종하고, 상기 실시예1에서 수득한 본 발명 황금싹 추출물을 30, 60 및 120ug/mL 농도로 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 80% 이상 되도록 배양하였다. 상기 단계에서 배양한 세포에서 배지를 제거 후 트립신을 처리하여 회수하였다. 회수한 세포를 5,000~10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 상기 단계에서 얻은 펠렛은 60℃에서 건조 후 cell lysis buffer를 넣고 60℃ 항온조에 넣어 멜라닌을 얻었고 405nm에서 흡광도를 측정하여 세포당 멜라닌 함량을 구하였다. 황금싹 에탄올추출물을 첨가하지 않은 처리군을 대조군으로 이용하였고, 모든 실험은 3번 반복하여 실험하였다.

실험 결과, 도8에서 알 수 있듯이 본 발명 황금싹 에탄올추출물을 30, 60, 120ug/mL로 처리했을 때 농도의존적으로 미백 활성이 증가하였으며, 120ug/mL 농도로 처리한 실험구에서는 활성산소의 농도를 25% 감소시키는 효과를 확인하였다.

실험예5. 본 발명 황금싹 추출물 및 유기화합물1의 콜라겐합성 증대효과

상기 실시예1 및 실험예2에서 수득한 본 발명에 따른 황금싹 추출물과 [화학식I]의 유기화합물의 콜라겐 합성 증대효과를 검정하기 위해 피부 섬유아세포(HDFn)를 48well plate에 5x10⁴ cells/well 농도로 배지 0.3mL에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 단계에서 얻은 세포에 상기 실시예1에서 수득한 본 발명 황금싹 추출물이 30, 60 및 120ug/mL 농도로 처리 또는 상기 실험예2에서 수득한 유기화합물1을 10 및 50ug/mL 농도로 처리한 새로운 배지에 접종 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 단계에서 얻은 세포를 enzymes-linked immunoassay kit(Takara)를 이용하여 콜라겐 전구체의 C-말단의 함량을 측정하였고, 콜라겐 용액을 이용하여 standard curve를 그려 배지에 있는 콜라겐 함량을 계산하였다. 황금싹 추출물 및 유기화합물1을 처리하지 않은 처리군을 대조군으로 이용하였고, 모든 실험은 3번 반복하여 실험하였다.

실험 결과, 도9에서 알 수 있듯이 본 발명 황금싹 추출물을 30, 60, 120ug/mL로 처리했을 때 각각 24, 32, 42%씩 콜라겐 생성이 증가함을 확인하였으며, 상기 모든 농도에서 세포독성은 나타나지 않았다.

또, 도10에서 알 수 있듯이 유기화합물1을 10 및 50ug/mL 농도로 각각 세포에 처리하였을 때 농도의존적으로 콜라겐 생성이 증가했으며, 50ug/mL 농도로 처리한 실험구에서는 콜라겐 생성이 23% 증가하였다. 상기 모든 농도에서 세포독성은 나타나지 않았다.

이상의 실험 결과로부터 본 발명에 따른 유기화합물1을 포함한 황금싹 추출물의 항산화, 미백 및 항주름 기능성 효과를 확인하였다.

이하, 본 발명을 사용하기에 바람직하고 다양한 화장품 제형을 개시하지만 본 발명의 권리범위가 개시된 제형에 제한되지 않음은 물론이다.

제조예1. 화장수

상기 실시예1에서 수득한 본 발명 황금싹 에탄올추출물이 함유된 화장수를 하기 표2와 같이 제조하였다.

원료	원 료	함량(중량%)
1	본 발명 황금싹 에탄올추출물	10.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

제조예2. 로션상기 실시예1에서 수득한 본 발명 황금싹 에탄올추출물이 함유된 로션을 하기 표3과 같이 제조하였다.

원료	원 료	함량(중량%)
1	본 발명 황금싹 에탄올추출물	10.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비단 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비단 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린신 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

제조예3. 크림상기 실시예1에서 수득한 본 발명 황금싹 에탄올추출물이 함유된 크림을 하기 표4와 같이 제조하였다.

함량	원 료	함량(중량%)
1	본 발명 황금싹 에탄올추출물	10.0
2	스테아린산	2.0
3	세틸알콜	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비단모소스테아레이트	0.5
6	솔비단세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀스	4.0
10	스쿠알란	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	정제수	잔량

제조예4. 에센스 제조상기 실시예1에서 수득한 본 발명 황금싹 에탄올추출물이 함유된 에센스를 하기 표5와 같이 제조하였다.

함량	원 료	함량(중량%)
1	본 발명 황금싹 에탄올추출물	10.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	젱제수	잔량

이상 설명한 바와 같이 본 발명 황금싹 에탄올추출물과 이로부터 분리정제동정하여 얻은 유기화합물1은 항산화, 미백 및 항주름 기능성 효과가 뛰어나므로 화장료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. 황금의 종자를 오존에 살균한 다음 d-H₂O에 20±2℃에서 4시간 침지시킨 후 무광하에 20±2℃에서 4시간 방치한 다음 무광하에 발아시킨 발아종자를 빛 조건하에서 5~6일간 재배한 다음 20℃에서 24시간 무광하에서 더 재배하여 수확한 황금싹을 열풍건조한 후 에탄올로 추출한 황금싹 추출물
2. 제1항의 에탄올로 추출한 황금싹 추출물의 에틸아세테이트 분획물
3. 제2항의 분획물은 하기 화학식(I)의 구조를 갖는 Chrysin-7-O-glucuronide가 유효성분으로 포함된 화장료 조성물
   

   

   … [화학식 I]
   

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