KR20180136797A - 기능성 펩타이드, 성장인자 및 귤속 과피 발효물을 포함하는 피부 재생, 주름 개선 또는 항산화용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기능성 펩타이드, 성장인자 및 귤속 과피 발효물을 포함하는 항산화, 주름개선 또는 피부재생용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속(citrus) 과피 발효 추출물을 포함하는 기능성 식품, 화장료 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 항산화 효과, 콜라겐 생성 촉진 및 분해 억제로 인한 주름개선 효과 및 피부재생 효과를 통해 피부의 노화를 막아 피부를 건강하고 젊게 유지할 수 있게 해주어 기능성 식품, 화장료 및 의약품 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 항산화 효과, 콜라겐 생성 촉진 및 분해 억제로 인한 주름개선 효과 및 피부재생 효과를 통해 피부의 노화를 막아 피부를 건강하고 젊게 유지할 수 있게 해주어 기능성 식품, 화장료 및 의약품 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 기능성 펩타이드, 성장인자 및 귤속 과피 발효물을 포함하는 피부 재생, 주름 개선 또는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속(citrus) 과피 발효 추출물을 포함하는 조성물로서 활성산소 소거능, 콜라게나제 활성 저해, 세포 내 콜라겐 생성 촉진 및 표피세포 재생 촉진 효과를 나타내는 기능성 식품, 화장료 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
인체의 노화의 이론 중 가장 주목 받고 있는 이론은 활성산소에 의한 노화이다. 인체가 섭취한 산소의 약 95% 이상은 세포의 대사과정에서 생성되는 전자와 결합하여 물로 환원되지만 2∼3%의 일부 산소가 불완전 환원으로 전자를 흡수하려는 Free radical 과정에서 세포의 파괴 작용을 초래하는데 이를 활성산소(Active oxygen)라고 한다. 활성산소가 지질과 단백질로 구성된 세포막에 작용하면 지질과산화가 유발되고 최종산물인 Malondialdehyde(MDA)의 함량이 증가된다. MDA는 혈관벽 내막에서 저밀도지단백(Low Density Lipoprotein, LDL)을 화학적으로 변형시키며, 변형된 저밀도지단백은 대식세포 내에서 콜레스테롤을 새로이 합성하여 에스터가 침착되면서 포말세포를 형성하는데 이러한 세포의 산화적 손상이 생리적 기능을 저하시키므로 동맥경화, 간질환 및 각종 암 등의 질병을 초래하여 결국 노화와 유전적 장애의 요인이 되는 것으로 알려져 있다). 노화에 따라 생체에는 산화 물질인 활성산소(O2 -, OH-), 산화질소(NO), 과산화수소(H2O2) 등의 혈액 내 농도가 올라가게 되어 각종 질환과 세포의 노화가 촉진된다.
특히 활성산소는 피부 세포의 손상을 유발한다. 활성산소가 지나치게 많아지면 체내의 항산화 방어계를 무너뜨리고 그 결과 단백질, 지질, DNA와 같은 세포 성분이 손상 받게 되어 세포 기능이 변질되어 궁극적으로 피부노화가 촉진된다. 또한, 활성산소는 결합조직을 손상시킨다. 활성산소는 교원질 대사에 작용하여 직접적으로 교원질을 파괴시킬 뿐 아니라 콜라겐의 결핍을 초래하게 된다.
활성산소는 흡연, 스트레스, 과도한 운동, 피부병, 바이러스감염 및 자외선 등 우리의 건강을 위협하는 여러 인자들 뿐 아니라, 생명을 유지하는 데 필수적인 호흡과 소화의 과정 중에서도 발생한다. 그러므로 인간은 지속적으로 활성산소의 위협에 노출되어 있는 것이고, 따라서 우리 몸에는 활성산소로 인한 상해에 대한 반응으로 다양한 항산화성 기전이 있어 다양한 방법으로 세포를 보호한다). 인체의 활성산소 및 산화 물질을 억제하는 항산화력에 관여하는 요소는 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 체내 항산화 효소계와 비효소 항산화 물질이다. 체내 항산화 효소계에는 구리, 아연, 망간으로부터 생성되어 O2 -를 제거하는 SOD 효소가 대표적이고, 철을 조효소로 하여 구성된 Catalase(CAT)와 셀레늄을 조효소로 하는 Glutathion Peroxidase(GPX)는 H2O2를 제거하는데, GPX는 손상된 세포를 원래상태로 수리 복구하는 작용도 한다고 알려져 있다. 비효소 항산화 물질은 체내에서 만들어지는 것과 체외에서 공급받아야 할 것으로 나눠진다. 체내항산화 물질로는 금속결합 단백질인 Albumin, Ferritin,Transferrin과 Glutathione(GSH), Uric acid, Bilirubin, 멜라토닌 등이 있으며, 최근 주목 받는 항산화 물질로서 미토콘드리아에 존재하여 에너지 대사 및 항산화 작용에 중요한 역할을 담당하는 CoQ10조효소가 있다.
피부 노화 역시 시간의 흐름에 따라 진행되어가는 자연스러운 하나의 현상이며 인체의 노화와 마찬가지로 개인차가 있지만 원천적으로 막을 수 있는 성질의 것은 아니다.. 하지만, 피부 노화를 일으키는 원인은 시간의 흐름에 따라 진행되는 내인성 요인 뿐 아니라 흡연, 과도한 음주 섭취, 영양부족, 햇빛에 만성적인 노출 등 예방할 수 있는 외인성 요인도 존재한다. 따라서, 피부 노화 및 이로 파생된 피부 주름을 평생 예방할 수는 없더라도 늦출 수 있다는 것이 알려져 있고 화장품을 통해 피부의 노화를 늦추려 하는 시도들은 화장품 업계에서는 많이 연구가 진행되어 왔으며 아직까지 가장 뜨거운 관심과 연구가 쏠리는 분야라 할 수 있다.
화장품에서는 노화와 관련된 피부 변화로 주름, 색소침착, 탄력감소, 피부건조화, 탈모, 모발의 윤기 부족 등을 극복하려 많은 노력을 하고 있다. 피부는 노화를 통해 다양한 변화를 맞게 된다. 먼저 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고 피부에 탄력을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM) 성분이 변화하게 되는데 그 중 세포외 기질의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 주름 생성과 밀접한 관계를 가지게 되고, 피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸(proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등은 산화되어 그 기능을 잃어버림으로써 피부가 탄력을 잃고 주름이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다.
세포외 기질의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber), 탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부주름 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다.
콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제(Collagenase)와 같은 기질금속단백질 분해효소들(Matrix metalloproteases; MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 주름이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.
이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 조성물이 연구되고 있고, 피부의 주름개선 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 예컨대, 피부주름 및 기미, 색소침착 개선을 위해 널리 사용되고 있는 레티노이드류, 그 중에서도 레티놀(retinol)에 대한 피부주름 제거 임상 결과들이 다양하게 보고되고 있고, 레티놀을 함유한 화장료는 일광에 의해 형성된 피부주름살이나 피부처짐, 탄력감소 등을 효과적으로 개선하였다. 레티놀은 주름 기능성 고시원료로 등재될 정도로 효과에 대해 검증이 된 원료이나 특유의 피부자극 문제, 안정성 문제에 대해서는 끊임없이 제기가 되어 오고 있으며 높은 가격으로 고가의 제품군에서 활용이 되며 보편적 소재로 활용하기 어려운 부분이 존재한다.
따라서, 피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선하기 위해서 항산화 효능이 확인된 원료와 피부 노화 방지에 효과가 정확하게 검증된 원료를 이용한 신규 항산화, 항노화 개선 조성물 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선할 수 있는 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속(citrus) 과피 발효 추출물을 포함하는 조성물이 구성성분들 상호간의 상승효과를 나타내어, 매우 우수한 항산화 효과, 주름개선효과 및 피부재생 효과를 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속(citrus) 과피 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생, 주름 개선 또는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속(citrus) 과피 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생, 주름 개선 또는 항산화용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물을 구성하는 상기 각각의 기능성 원료들은 서로 다른 메카니즘을 통해 피부에 작용하여, 항산화, 콜라겐 생성 촉진 및 표피세포 재생 촉진을 통해 피부 노화 방지에 도움을 주며, 이들을 조합하여 사용할 경우 각각의 원료들이 상호간에 상승작용을 나타내어 단독으로 사용하는 것과 비교하여 그 효과가 현저히 상승할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속(citrus) 과피 발효 추출물이 모두 포함된 본 발명의 조성물은 상기 다섯 가지의 구성성분 중 어느 하나라도 포함이 되지 않는 조성물과 비교해 월등히 우수한 항산화 효과, 특히 DPPH(1,1-diphenyl-2picrylhydazyl)와 Hydroxyl radical 소거능을 나타내었다. 본 항산화 효과를 통해 피부의 노화 방지를 위한 조성물에 활용이 될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 바람직한 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 조성물은 콜라게나제, MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)과 같은 콜라겐 분해 효소의 활성을 저해하는 효과가 매우 우수한 것으로 확인이 되었으며, 또한 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과와 피부세포의 재생능을 향상시키는 효과 또한 매우 우수한 것으로 확인이 되어 항노화 기능성 조성물 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 바람직한 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 사람 유래의 세포에 독성을 나타내지 않아 항노화 기능성 조성물로서 활용도가 매우 높다. 본 발명에 따르면, 100 ng/ml-1000 μg/ml의 농도로 HaCat 세포 및 NIH3T3 세포에 해당 조성물을 처리한 결과, 세포 독성은 측정되지 않았으며 육안으로 세포의 형태를 확인하였을 때도 큰 변화는 관찰되지 않았다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 50℃ 온도에서도 우수한 열 안정성을 나타내며, 일광조건에서도 안정함을 확인하였다. 즉, 본 발명의 조성물은 의약품, 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있음을 의미한다.
본 발명에 있어서, 사기 '피부 재생 효과'라 함은 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대하여 피부 조직이 회복되는 것을 말한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, '주름개선 효과'라 함은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, '항산화'라 함은 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.
본 발명에서 상기 “아세틸헥사펩타이드-8”은 아르기렐린(Argireline) 또는 아세틸헥사펩타이드-3으로도 알려진 물질로서 주름 개선효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있다. 특히, 아세틸헥사펩타이드-8은 보톡스와 유사한 기전으로 근육의 이완작용을 유발하여 주름에 효과를 나타낸다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 아세틸헥사펩타이드-8은 0.005 내지 0.1%(w/v)으로 포함이 될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 내지 0.05%(w/v), 더 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v), 가장 바람직하게는 0.015 내지 0.025%(w/v)로 포함이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 “헥사펩타이드-12”은 VAL-GLY-VAL-ALA-PRO-GLY의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 항산화와 주름 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 헥사펩타이드-9은 0.005 내지 0.1%(w/v)로 포함이 될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 내지 0.05%(w/v), 더 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v), 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.025%(w/v)로 포함이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 “에시딕 섬유아세포 성장인자 (aFGF)”은 섬유아세포 성장인자의 종류 중 하나로 피부를 구성하는 각질형성세포와 섬유아세포를 자극하여 피부의 재생과 건강한 피부 상태를 회복시켜 주며 각질형성세포의 분열과 성장을 촉진하고, 섬유아세포를 자극하여 ECM의 합성을 촉진하여 주름을 예방하고 강력한 항노화 기능을 수행한다. 141개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 분자량은 16kD이다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 에시딕 섬유아세포 성장인자은 0.00001 내지 0.001%(w/v), 바람직하게는 0.00005 내지 0.001%(w/v), 더 바람직하게는 0.00005 내지 0.0005%(w/v), 가장 바람직하게는 0.0001 내지 0.00015%(w/v)로 포함이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 “인슐린 유사성장인자 (IGF-1)”은 세포의 분화, 생장에 관여하는 성장인자의 종류 중 하나로 다른 성장인자들과 연합하여 피부세포의 성장과 분열을 돕고 진피 내 collagen, fibronectin, elastin 및 keratin 같은 ECM 물질의 생성을 도와 노화 방지와 주름을 예방하는 효과를 가지고 있다. 특히 모발의 성장과 관련이 깊어 건강한 모발 형성을 도와주며 모발 손상과 탈모를 예방해 주는 효과를 가진다. 70개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 분자량은 7.69kD이다. 본 발명의 전체 조성물 대비 상기 에시딕 섬유아세포 성장인자는 0.00001 내지 0.001%(w/v), 바람직하게는 0.00001 내지 0.0005%(w/v), 가장 바람직하게는 0.00005 내지 0.00015%(w/v)로 포함이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 귤속(Citrus) 과피 발효 추출물은 귤속에 속하는 과일의 과피를 추출한 후 미생물을 통해 발효시킨 물질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 귤속 과피는 레몬, 오렌지, 감귤, 한라봉, 만다린, 라임 및 유자로 이루어진 군에서 선택된 과일의 과피일 수 있으며, 보다 바람직하게는 레몬, 오렌지, 감귤, 한라봉, 만다린, 라임 및 유자로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 과일의 과피일 수 있으며, 가장 바람직하게는 레몬 및 오렌지의 과피일 수 있다. 본 발명의 조성물에서 상기 귤속 과피 발효 추출물은 전체 조성물 대비 1 내지 10%(v/v), 바람직하게는 1 내지 8%(v/v), 가장 바람직하게는 2 내지 5%(v/v)로 포함이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 “귤속 과피 발효 추출물”은 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 레몬, 오렌지, 감귤, 한라봉, 만다린, 라임 및 유자로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 과피를 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 및
(b) 상기 과피 추출물에 락토바실러스 악시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis)로 이루어진 군에서 선택된 2종의 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효시키는 단계.
상기 (a) 단계에서 2이상의 과피를 혼합하는 비율은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 동일한 비율로 혼합된 과피 혼합물의 추출물일 수 있다. 또한, 귤속 과피를 추출하기 위한 용매로서 가장 바람직한 것은 70% 에탄올일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계는, 상기 (a) 단계에서 제조된 과피 추출물에 락토바실러스속 균주 2종을 선택하여 접종함으로써 발효시키는 단계이며, 보다 구체적으로는 선택된 2종의 균주의 배양액을 107~1010cfu/㎖로 조절하여, 상기 과피 추출물 100 중량부에 대하여 0.5~10 중량부 접종하여 2 ~ 10 일간 25 ~ 45℃에서 발효시키는 단계이다. 본 발명에서 상기 락토바실러스속 균주는 바람직하게는 락토바실러스 파라카제이 및 락토바실러스 람노서스일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 화장료 조성물, 기능성 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물이 화장료 조성물일 경우에는, 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등으로 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.
상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.
상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조 할 수 있다.
상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 이의 비제한적인 예시로는 비타민 C, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물의 기능성 식품 조성물일 경우에는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 기능성 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 피부 재생, 주름 개선 및 항산화 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
상기 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유하여 기능성 음료로도 제조가 될 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 상기 조성물이 약학적 조성물일 경우에는, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 레밍턴의 약학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001 내지 100 mg/kg(체중)이다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물이 항산화, 주름개선 및 피부재생의 효과를 나타내는 점을 감안하면, 경구투여 또는 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 주사제, 크림, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수도 있다. 상기 조성물이 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 항산화 효과, 콜라겐 생성 촉진 및 분해 억제로 인한 주름개선 효과 및 세포 재생 효과를 통해 피부의 노화를 막아 피부를 건강하고 젊게 유지할 수 있게 해주어 기능성 식품, 화장료 및 의약품 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1는 본 발명에 따른 조성물의 MMP-1 저해능을 확인한 그래프이다.
도 2은 본 발명에 따른 조성물의 세포 내 콜라겐 생성 촉진효과를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 조성물의 피부세포 재생 촉진효과를 확인한 도면이다.
도 4 및 도5은 본 발명에 따른 항노화 화장품 조성물의 열 안정성 및 광안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 항노화 화장품 조성물의 세포독성을 NIH3T3 세포, HACAT 세포에서 MTT assay를 통해 확인한 그래프이다.
도 2은 본 발명에 따른 조성물의 세포 내 콜라겐 생성 촉진효과를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 조성물의 피부세포 재생 촉진효과를 확인한 도면이다.
도 4 및 도5은 본 발명에 따른 항노화 화장품 조성물의 열 안정성 및 광안정성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 항노화 화장품 조성물의 세포독성을 NIH3T3 세포, HACAT 세포에서 MTT assay를 통해 확인한 그래프이다.
이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
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실시예
1>
실험물질 및 조성물의 제조
1-1. 실험물질
본 발명에 따른 항산화, 주름개선 및 피부세포 재생효과가 우수한 조성물은 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물을 포함한다.
상기 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12는 ㈜에이앤펩에서 solid phase 합성법을 통한 합성을 통해 확보하였으며 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1)는 미생물을 이용한 유전자 재조합 기술 (gene recombinant technology)를 통해 확보하였다. 귤속 과피 발효 추출물의 경우 레몬과 오렌지 과피의 1:1 혼합물을 70% 에탄올로 추출하고(과피:용매 중량비는 1:9) 상기 추출물에 락토바실러스 악시도필러스와 락토바실러스 파라카제이의 혼합균주 배양액을 첨가하되, 혼합균주의 배양액을 109 cfu/ml로 조절한 후 상기 추출액 100 중량부 대비 3 중량부로 첨가한 후 37℃에서 3일간 발효시켜 제조하였다.
1-2. 항노화 화장품 복합 조성물의 제조
아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물의 농도를 조절하여 총 10종의 조합을 선정하였으며, 선정된 조합 내 성분들의 조성비는 하기 표 1과 같다.
아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1)는 하기 표 1에 기재된 농도로 물에 용해하였으며(w/v), 귤속 과피 발효 추출물은 상기 방법에 따라 제조한 후 하기 표 1에 기재된 농도로 물에 첨가하여(v/v) 조성물을 제조하였다.
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실시예
2>
조성물의 항산화 활성 효과 확인
상기 실시예 1에서 제조한 조성물의 항산화 효과를 확인하기 위해 상기 표 1에 열거한 조합의 조성물을 하기와 같은 방법에 따라 DPPH 소거능 및 Hydroxy Radical 소거능 시험을 진행하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
* DPPH 소거능 시험 방법:
(1) 시료(시험물질)를 농도에 맞게 stock solution 을 만들어 준비한다. 이때 용해도가 좋지 않으면 DMSO를 사용한다. 시료를 표 1에 제시된 조성물의 농도가 5%(v/v)가 되도록 에탄올에 혼합하여 준비한다.
(2)시험에 사용할 지시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Sigma D9132) 5.9mg을 에탄올에 녹여 100ml이 되도록 준비한다.
(3) 깨끗한 신규의 96well Plate를 준비하고 각 웰에 상기 DPPH 용액을 100ul씩 넣어준다.
(4) 96well plate의 각 웰에 90ul의 에탄올을 넣는다. 준비한 시료 10ul를 처리한다.
(4) 25℃에서 30분간 교반하여 반응시킨다.
(5) UV spectrophotomer 517nm에서 O.D값을 측정한다.
* Hydroxy radical 소거능 시험 방법:
(1) 0.2M sodium phosphate monobasic, dibasic을 각각 제조하고 monobasic을 47.5ml, dibasic 202.5 ml 혼합하고 정제수로 500ml로 맞춘 후 pH를 7.4으로 조정하여 100mM phosphate buffer를 제조한다, 제조한 phosphate buffer에 2-deoxy-D-ribose (sigma D5899)10mM 이 되도록 용해하여 준비하고 0.5mM Iron(III) chloride hexahydrate (aldrich 236489)10mM hydrogen peroxide (sigma H1009) 도 buffer에 녹여 제조한다. 10mM ascorbic acid (aldrich A92902), 2.8% TCA(Trichloroacetic acid) (sigma T9159)는 수용액에 녹여 준비하고, 1% TBA (4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidine)(alfa aesar A12681)는 0.05N NaOH 수용액에 녹여 제조한다.
(2) 시료(시험물질)를 표 1에 제시된 혼합액의 농도가 5%(v/v)가 되도록 에탄올에 혼합하여 준비한다.
(3) 하기 표 2를 참조하여 상기 제조한 각각의 용액을 바이알에 분주한다.
(4) 37℃에서 1시간 incubation 한 후, 2.8% TCA를 500ul/vial 첨가하여 반응을 종료한다.
(5) 1% TBS를 500ul/vial 첨가한 후 100℃에서 15분간 가열하여 발색시킨다.
(6) 5분 동안 얼음물속에 담궈 식힌다.
(7) 5000rpm에서 5분간 원심분리 후 상등액을 250ul/96well plate에 분주한다.
(8) 532nm에서 흡광도를 측정한다.
측정 결과 하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 조합에서 양성대조군으로 사용된 EGCG(epigallo catechin gallate) 0.1%(w/v)와 비교해 DPPH 소거능(%) 및 Hydroxy radical 소거능(%) 모두 우수하게 나타났다. 특히, 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물이 모두 포함된 조합 5 및 조합 10의 경우, 어느 네 가지 물질만이 포함된 조합들과 비교해 월등히 향상된 항산화 효과를 나타내는 것으로 확인이 되었다.
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실시예
3>
콜라게나제
활성 저해 효과 확인
상기 실시예 1에서 제조한 조성물의 피부 주름 개선효과를 확인하기 위해 상기 표 1에 열거한 조합의 조성물을 이용하여 하기와 같은 방법에 따라 생체 외(In vitro) 콜라게나아제(collagenase) 활성 제해 실험을 진행하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
콜라게나아제(collagenase) 활성 저해 시험 방법은,
(1) 양성 대조군으로 EGCG (0.1 v/w%)를 에탄올에 용해하여 준비하고, 상기 표 1에 제시된 조성물(조합 1 내지 10)의 농도가 5%(v/v)가 되도록 에탄올에 혼합하여 실험물질을 준비한다.
(2) 100mM Tris-cl buffer, 100mM CaCl2 , 0.25mg/ml 콜라게나제가 포함된 mixture를 tube에 준비하고, 상기 단계(1)에서 준비한 양성 대조군 및 실험물질을 상기 mixture에 5%(v/v)의 농도로 첨가하여 반응을 진행시킨다.
(3) 상기 반응물에 25mM 시트르산을 400㎕/tube 첨가하여 반응을 종료시킨다.
(4) 이후 에틸아세테이트를 1.5㎖/tube 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)한 후 상등액을 취하여 황산나트륨 150mg/ep-tube에 옮기고, 볼텍싱 후 원심분리(10,000rpm, 3분)한다.
(5) 상등액 300㎕/ep-tube를 취하여 석영 96well 플레이트에 옮긴 후 320nm에서 흡광도를 측정한다.
측정 결과, 하기 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 대부분의 조합에서 양성 대조군인 EGCG에 비해 우수한 콜라게나제 억제능을 확인하였다. 특히, 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물이 모두 포함된 조합 5 및 조합 10의 경우, 어느 네 가지 물질만이 포함된 조합들과 비교해 월등히 향상된 콜라게나제 저해 효과를 나타내는 것으로 확인이 되었다.
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실시예
4>
MMP
-1(Matrix
Metalloproteinase11
) 생성 저해 실험
Matrix methaloprotease-1(MMP-1, collagenase) 생성을 저해하는 물질은 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하기 때문에 원료에 대한 MMP-1 생성저해 활성을 측정하여 활성을 갖는 원료는 주름을 개선하고 탄력 있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 평가 할 수가 있다. 이에, 상기 표 1에 나타낸 조성물들의 MMP-1 생성 저해능 시험을 진행 하였다.
사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 2 X 105 cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 미처리 대조군(CTL)에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 실험군에는 10종의 시료(조합 1 내지 10)와 양성 대조군으로 레티놀(Retinol)을 10 ug/ml의 농도가 되도록 처리를 하였으며, 본 발명에 따른 조성물과 이를 구성하는 각각의 구성성분과의 효능 비교를 위해 아세틸 헥사펩타이드-8(ac-Hex-8) 0.025(w/w%), 헥사펩타이드-12(Hex-12) 0.025(w/w%), 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF) 0.00015(w/w%), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 0.00015(w/w%) 또는 귤속(citrus) 과피 발효 추출물 5 (v/v%)각각을 처리하였다.
세포에 상기 각각의 물질들을 처리한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1),Human,biotrak,ELISA kit (GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 생성 저해능을 측정하였다.
이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 결과와 같이, 세포내에서 생성되는 MMP-1의 발현양이 대부분의 실험군에서 대조군인 레티놀에 비해 줄어드는 것을 확인하였다. 이들 시험군들 중에서 특히 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물이 모두 포함된 조합 5 및 조합 10이 나머지 조합들과 비교해 그 효과가 현저히 우수한 것으로 나타나 조합된 원료들간의 상승작용이 있음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로부터 피부에 MMP-1생성을 유발하는 UV가 요인으로 적용되었을 때, 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물의 조합물을 혼합하여 사용하는 것이 피부의 주름을 억제하는 효과가 뛰어나 피부 노화에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
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실시예
5>
세포 내 콜라겐
생성능
평가
MMP-1 저해능 시험에서 효과를 나타낸 상기 10종의 조성물에 대해 세포 내 collagen 생성능 시험을 진행하였다. 시험에 사용할 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 Medium 106 (cascade biologics, M-106-500) 에 1X LSGS(Low Serum Growth Supplement, cascade biologics S-003-10)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1X 105 cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 미처리 대조군(CTL)에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 시험군에는 10종의 시료(조합 1 내지 10)과 양성 대조군으로 TGF(Tumor growth factor)를 10 μg/ml의 농도가 되도록 처리 (조합표 농도로 확인가능)를 하였다. 또한, 본 발명에 따른 조성물과 이를 구성하는 각각의 구성성분과의 효능 비교를 위해 세틸 헥사펩타이드-8(ac-Hex-8) 0.025(w/w%), 헥사펩타이드-12(Hex-12) 0.025(w/w%), 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF) 0.00015(w/w%), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 0.00015(w/w%) 또는 귤속(citrus) 과피 발효 추출물 5 (v/v%)각각을 처리하였다.
세포에 상기 각각의 물질들을 처리한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Procollagen Type I C-peptide(이하 PIP) EIA kit (takara MK101)를 이용하여 Collagen 생성량을 측정하였다.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
10종의 실험군을 처리한 뒤 collagen 생성량을 측정한 결과 콜라겐의 양이 모든 실험군에서 양성 대조군인 TGF에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 이들 시험군들 중에서 특히 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물이 모두 포함된 조합 5 및 조합 10이 나머지 조합들과 비교해 그 효과가 현저히 우수한 것으로 나타나 조합된 원료들간의 상승작용이 있음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로부터 피부에서의 collagen 생성을, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물이 모두 포함된 조성물을 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내고, collagen 생성을 증가시켜 피부의 주름을 억제 할 수 있을 것으로 사료된다.
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실시예
5>
피부 세포
재생능
시험
손상된 피부 세포의 성장을 촉진, 세포 회복능을 향상시킬 수 있는 실험인 wound healing assay를 통해 기능성 펩타이드의 세포 재생 유도 효과를 검증하고자 하였다.
시험에 사용할 사람 각질세포(HACAT, Human Keratinocyte)는 DMEM 배지에 FBS를 10% 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6 well plate에 100% 차도록 자란 인간 피부 각질 세포주의 중간을 tip을 이용하여 균일하게 상처를 낸 후 PBS를 이용하여 2회 세척하여 부유 세포를 제거하고 배지에 표 1의 조성물을 5%(v/v)가 되도록 처리한다.
실험 시간은 총 12, 24시간을 기준으로 하며, 각각의 시간동안 상처의 회복 정도를 이미지 장비를 통해 관찰하여 피부세포 재생 정도를 확인하였다.
이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
미처리 대조군에 비해 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속 과피 발효 추출물이 모두 포함된 조성물(조합 5, 10)에서 세포 성장이 활발한 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 세포 재생 유도 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
<
실시예
6>
항노화 화장품 조성물의 안정성 확인 실험
본 발명의 조성물의 열 및 광 안정성을 확인하기 위하여, 조성물이 10 mg/mL의 농도가 되도록 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해하여 유리 바이알에 분주하여 넣은 후 상온에서 7, 14, 21, 28일 보관하며 열에 의한 조성물 내 펩타이드와 성장인자의 성분의 손실을 측정하고 동일한 방법으로 일광 조건에서 안정성 여부를 측정하였다(도 4 및 5). 열에 의한 펩타이드, 성장인자 손실을 측정하고 일광 조건에서 안정성 여부를 측정한 결과, 60일까지 단지 10% 미만의 성장인자와 펩타이드 손실을 나타내어 열 및 보관기간에 있어 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다.
<
실시예
7>
세포독성 실험
본 발명의 조성물이 각질세포에 대해 독성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, MTT assay를 수행였다. HACAT세포와 3T3세포를 24 well plate에 각 well당 4 X 104 cells/24well의 세포수가 되도록 seeding 한 후 24 h 동안 37 ℃, 5% CO2조건으로 항온 배양하였다. PBS로 2회 세척 후 조합 5, 9 및 10의 조성물을 농도별(10~ 1.25 v/v%)로 처리하여 24 h 동안 항온 배양하였다. 배양 후 MTT 0.5% DPBS를 배양배지와 1:9(v/v)로 혼합하여 첨가한 후 2 h 동안 CO2 incubator에서 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 570 nm에서 측정하였다.
도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 각질세포주의 일종인 HaCat 세포, 섬유아세포의 일종인 NIH3T3 세포에 대하여, 저농도에서 고농도까지 처리한 조성물에 의한 세포수의 감소는 관찰되지 않았으며, 세포들의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다
이를 통해 본 발명에 따른 조성물은 피부 관련 세포에 독성이 전혀 없음을 알 수 있으며, 이로써 본 조성물을 피부에 처리하여도 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 예측할 수 있었다.
<
제조예
1>
항노화 조성물이 함유된 크림 타입 조성물의 제조
하기 표 5에 기재된 각각의 성분들을 조성물 100 중량부에 대하여 하기 기재된 비율에 따라 첨가하였으며, “항노화 조성물”은 상기 표 1에 기재된 각각의 구성성분 비율에 따라 크림 타입 조성물에 첨가하였다.
| 성분 | 중량(%) |
| 아스퍼질러스/쌀발효여과물 | 45.445 |
| 글리세린 | 10 |
| 스테아릴알코올 | 8 |
| 부틸렌글라이콜 | 5 |
| 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 | 5 |
| 세틸알코올 | 4 |
| 글리세릴스테아레이트에스이 | 2 |
| 나이아신아마이드 | 2 |
| 1,2-헥산디올 | 2 |
| 소르비탄세스퀴올리에이트 | 1 |
| 세테아릴올리베이트 | 1 |
| 소르비탄올리베이트 | |
| 식물성스쿠알란 | 1 |
| 글리세레스-26 | 1 |
| 락토바실러스/레몬껍질발효추출물 | 3 |
| 오렌지껍질추출물 | |
| 에스에이치-폴리펩타이드-11 | |
| 에스에이치-올리고펩타이드-2 | |
| 아세틸헥사펩타이드-8 | |
| 헥사펩타이드-12 | |
| 베타인 | 1 |
| 소듐하이알루로네이트 | 0.1 |
| 팔미토일트리펩타이드-5 | 0.1 |
| 소르비탄라우레이트 | 0.01 |
| 하이드록시에칠셀룰로오스 | |
| 아세틸디펩타이드-1세틸에스터 | |
| 백화사설초추출물 | 0.5 |
| 석류추출물 | |
| 작약추출물 | |
| 연꽃씨추출물 | |
| 연꽃잎추출물 | |
| 귤껍질추출물 | |
| 금은화추출물 | |
| 은행잎추출물 | |
| 국화꽃추출물 | |
| 매화추출물 | |
| 백합꽃/잎/줄기추출물 | |
| 하이드로제네이티드올리브오일 | 1.2 |
| 올리브오일 | |
| 올리브오일불검화물 | |
| 진세노사이드 | 0.1 |
| 콜로이달백금 | |
| 하이드롤라이즈드콜라겐 | 0.5 |
| 목련나무껍질추출물 | 0.5 |
| 하이알루로닉애씨드 | 0.1 |
| 바이오사카라이드검-1 | 0.5 |
| 흑효모발효추출물 | 0.5 |
| 마카다미아씨오일 | 0.2 |
| 호호바씨오일 | 0.2 |
| 세테아릴글루코사이드 | 1.5 |
| 세테아릴알코올 | |
| 베타-글루칸 | 0.5 |
| 동백오일 | 0.2 |
| 토코페롤 | 0.1 |
| 카보머 | 0.2 |
| 알란토인 | 0.1 |
| 알지닌 | 0.2 |
| 라벤더오일 | 0.1 |
| 유향유 | 0.05 |
| 오렌지껍질오일 | 0.03 |
| 만다린껍질오일 | 0.025 |
| 아데노신 | 0.04 |
| 합계 | 100 |
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 항산화 효과, 콜라겐 생성 촉진 및 분해 억제로 인한 주름개선 효과 및 세포 재생 효과를 통해 피부의 노화를 막아 피부를 건강하고 젊게 유지할 수 있게 해주어 기능성 식품, 화장료 및 의약품 제조에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
Claims (5)
- 아세틸 헥사펩타이드-8, 헥사펩타이드-12, 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF), 인슐린 유사성장인자 (IGF-1) 및 귤속(citrus) 과피 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생, 주름 개선 또는 항산화용 조성물.
- 제1항에 있어서, 전체 조성물 대비 상기 아세틸 헥사펩타이드-8는 0.005 내지 0.1%(w/v), 상기 헥사펩타이드-12는 0.005 내지 0.1%(w/v), 상기 에시딕 섬유아세포 성장인자(aFGF)는 0.00001 내지 0.001%(w/v), 상기 인슐린 유사성장인자 (IGF-1)는 0.00001 내지 0.001%(w/v) 및 상기 귤속(citrus) 과피 발효 추출물은 1 내지 10%(v/v)로 포함된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 귤속 과피 발효 추출물은 하기 방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물:
(a) 레몬, 오렌지, 감귤, 한라봉, 만다린, 라임 및 유자로 이루어진 군에서선택된 2 이상의 과피를 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 추출물에 락토바실러스 악시도필러스(Lactoba cillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillu plantarum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 이루어진 군에서 선택된 2종의 락토바실러스속 미생물을 접종하여 발효시키는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)의 활성저해, 활성산소 소거능, 세포 내 콜라겐 생성 촉진 및 표피세포의 증식을 촉진하는 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물, 또는 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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