KR20180104571A - 피부보호를 위한 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents
피부보호를 위한 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
피부보호를 위한 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 유효량의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 포함하며, 이때 상기 추출물은 카멜리아 시넨시스 잎의 캘러스 극성용매 추출물이다. 상기 조성물은 광손상에 대해 피부 치료, 피부 재건, 피부상태 개선, 피부노화의 지연, 피부 콜라겐 함량 유지 보조, 피부 병변 방지 및/또는 상처 치유 향상에 특히 사용된다.
Description
본 출원은 2017년 3월 13일자로 미국 특허청에 제출된 미국 가출원 제62/470,564호의 우선권을 주장하며, 이들의 개시 내용은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
본 발명은 피부를 보호하는데 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis) 캘러스 추출물의 사용, 특히 피부를 보호에 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis) 잎의 캘러스의 추출물을 사용하는 것에 관한 것이다. 피부 보호 용도에는 광 손상에 대한 피부 간호(nursing), 피부 수선(repairing), 피부 상태 개선, 피부 노화 지연, 피부 콜라겐 함량 유지 도움, 피부 병변 예방 및/또는 상처 치유 촉진 등이 포함된다.
주로 세포외 기질과 결합 조직에 분포하는 콜라겐은 동물 몸의 일차 구조 단백질이며 세포 조직의 구조를 지지하고 조직의 단단함(toughness)을 유지할 수 있다. 피부 진피(dermis)의 90%는 콜라겐으로 구성되어 있다. 콜라겐은 피부에 단단함, 탄력 및 수분을 준다. 노화, 자외선(UV) 및 자유 라디칼(free radicals)의 생성은 모두 콜라겐들 간의 구조를 파괴할 수 있으며, 콜라겐의 분해 및 손실을 유발하여 피부처짐 및 주름과 같은 피부 노화를 촉진시킬 수 있다는 것이 알려져 있다.
글리코실화(Glycosylation,당화)는 글루코오스가 단백질에 부착되어 AGE(advanced glycation end products)가 생성되는 화학 반응이다. 피부 세포에 축적된 AGE는 단백질의 변성 및 탄력 손실에 의해 피부 주름 및 피부 노화를 유발할 뿐만 아니라, DNA 손상을 유발하고 피부 세포에서의 DNA 기능에 영향을 미치며 심지어 피부 병변을 일으킬 수 있다.
자외선(UV) 또한 피부 노화와 피부 병변을 일으키는 주요 요인 중 하나이다. 햇빛 속 자외선의 90% 이상이 UVA인 것으로 알려져 있고, UVA는 피부에 매우 강한 침투력을 가지며 피부의 진피를 침투하여 피부 손상을 일으킬 수 있다. UVA 방사선에 잦은 노출은 매트릭스 분해 효소의 과다 활성화, 콜라겐 및 엘라스틴의 손실, 세포 노화의 촉진 및 노화 현상 (예: 피부 케라틴의 두꺼워짐, 건조 및 피부 박리, 미세 선 및 어두운 점 생성, 피부 처짐 및 피부 탄력 저하)을 유발한다. 또한, UVA는 세포의 DNA를 파괴하고 DNA 손상을 일으킬 수 있다. 지나치게 손상된 DNA가 축적되면 세포 노화를 유발할 뿐만 아니라 세포성 변형(cellular variation)을 유발하여 피부 병변 및 심지어 피부암을 유발할 수 있다.
따라서, 자연적이고 안전한 물질을 사용하여 상기 문제점을 해결하기 위한 접근법이 본 기술 분야에서 매우 바람직하다. 본 발명자들은 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis) 캘러스 추출물이 자외선에 의한 세포 손상을 줄이고, 피부의 콜라겐 소실을 억제하며, 피부의 콜라겐 분비를 촉진시키고, 피부 세포에서의 단백질의 당화(glycosylation)를 억제하는 효과가 있고, 광 손상에 대해 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선, 피부 노화 지연, 피부 콜라겐 함량 유지 도움, 피부 병변 예방 및/또는 상처 치유 촉진에 사용될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 목적은 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis) 잎의 캘러스의 극성 용매 추출물인 조성물의 제조에 있어서의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 용도를 제공하는 것이며, 상기 조성물은 피부 보호에 사용된다. 바람직하게는, 상기 극성 용매는 물, C1-C4 알콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 제공되는 조성물은 케어(care) 제품 조성물, 식품 조성물 또는 약학 조성물이다.
본 발명의 다른 목적은 피부를 보호하기 위해 사용되는 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 케어 제품 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물이고 유효량의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 포함하며, 상기 추출물은 카멜리아 시넨시스 잎의 캘러스의 극성 용매 추출물이다. 바람직하게는, 상기 극성 용매는 물, C1-C4 알콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따라 제공되는 케어 제품 조성물은 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선 및 피부 노화 지연 중 적어도 하나에 사용된다. 바람직하게는, 상기 케어 제품 조성물은 에센스이며, 상기 에센스에서 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도는 0.01 내지 10 wt%이다. 바람직하게는, 상기 케어 제품 조성물은 로션이고, 상기 로션 중 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도는 0.01 내지 5 wt%이다.
본 발명에 따라 제공되는 식품 조성물은 피부에서 콜라겐 함량을 유지하는 데 도움이 된다. 바람직하게는, 상기 식품 조성물은 미용 음료이고, 상기 미용 음료 중 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도는 1 내지 1000ppm이다.
본 발명에 따라 제공되는 약학적 조성물은 광 손상, 피부 병변 예방 및 상처 치유 촉진 중 적어도 하나에 사용된다. 약학적 조성물은 경피 투여, 경구 투여 또는 피하 주사의 형태로 제공된다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 피부를 보호하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 방법은 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선, 피부 노화 지연, 피부 콜라겐 함량 유지, 광 손상, 피부 병변 예방 및 상처 치유 촉진 중 적어도 하나를 위한 것이다.
본 발명을 위해 구현된 상세한 기술 및 바람직한 실시예는 청구 범위에 기재된 발명의 특징을 당업자가 잘 이해할 수 있도록 첨부된 도면을 수반하는 다음의 단락에서 설명된다.
본 특허출원에는 적어도 하나의 도면이 색으로 표시되어 있다. 도면의 컬러 도면(들)의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불시 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 동일한 항산화 효과를 부여하기 위한 비타민 C의 농도와 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 농도의 관계를 도시하며, 이때, 가로축은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 농도를 나타내고, 세로축은 비타민 C의 농도를 나타낸다;
도 2는 대조군과 비교하여 각 다른 그룹의 세포 생존율을 도시하는데, 이 때 상기 대조군 중 인간 피부 섬유 아세포는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 함유하지 않은 배지에서 배양하고 UVB를 조사하지 않았고, "UVB" 그룹은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 함유하지 않은 배지에서 배양하되 UVB를 조사하였고, "UVB + 추출물 (0.375)" 그룹, "UVB + 추출물 (0.75)" 그룹, "UVB + 추출물 (1.5)" 그룹 , "UVB + 추출물 (3)" 그룹 및 "UVB + 추출물(6)" 그룹은 UVB를 조사하고, 독립적으로 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 외부 첨가한 MEM 배지에서 최종 농도 0.375, 0.75, 1.5, 3 및 6 mg/ml가 되도록 각각 배양하였다;
도 3은 대조군과 비교하여, 각 다른 그룹의 세포에서 미토콘드리아 발현을 나타내며, 이 때 대조군의 인간 피부 섬유 아세포는 카멜리아 시넨시스 켈러스 추출물이 없는 배지에서 배양하고 UVA를 조사하지 않았고, "UVA" 그룹은 카멜리아 시넨시스 켈러스 추출물이 없는 배지에서 배양하고 UVA를 조사하였으며, "UVA + 추출물" 그룹은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 외부 첨가된 MEM 배지에서 최종 농도 5mg/ml가 되도록 배양하고, UVA를 조사하였다;
도 4는 상이한 농도의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물에 의해 처리된 후의 반응 용액 중 AGEs (당화 말단 산물, advanced glycation end products)의 생산 수준을 나타낸다;
도 5는 대조군과 비교하여, "추출물(Extract)"그룹에서 인간 피부 섬유 아세포에 의해 분비된 콜라겐의 수준을 나타내며, 이때, 대조군의 인간 피부 섬유 아세포는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양되었고, "추출물" 그룹에서는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 외부적으로 첨가한 MEM 배지에서 최종 농도가 10 mg/ml가 되도록 배양하였다;
도 6은 대조군과 비교하여, 각 다른 그룹의 인간 피부 섬유아세포에서 MMP2 및 TIMP1 유전자의 발현 수준을 나타내며, 이때, 대조군의 인간 피부 섬유아세포는 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양하고, "추출물(0.125)" 그룹 및 "추출물(0.25)" 그룹에서 인간 피부 섬유아세포는 독립적으로 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 외부적으로 첨가한 MEM 배지에서 각각 최종 농도 0.125 및 0.25 mg/ml가 되도록 배양하였다.
도 1은 동일한 항산화 효과를 부여하기 위한 비타민 C의 농도와 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 농도의 관계를 도시하며, 이때, 가로축은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 농도를 나타내고, 세로축은 비타민 C의 농도를 나타낸다;
도 2는 대조군과 비교하여 각 다른 그룹의 세포 생존율을 도시하는데, 이 때 상기 대조군 중 인간 피부 섬유 아세포는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 함유하지 않은 배지에서 배양하고 UVB를 조사하지 않았고, "UVB" 그룹은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 함유하지 않은 배지에서 배양하되 UVB를 조사하였고, "UVB + 추출물 (0.375)" 그룹, "UVB + 추출물 (0.75)" 그룹, "UVB + 추출물 (1.5)" 그룹 , "UVB + 추출물 (3)" 그룹 및 "UVB + 추출물(6)" 그룹은 UVB를 조사하고, 독립적으로 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 외부 첨가한 MEM 배지에서 최종 농도 0.375, 0.75, 1.5, 3 및 6 mg/ml가 되도록 각각 배양하였다;
도 3은 대조군과 비교하여, 각 다른 그룹의 세포에서 미토콘드리아 발현을 나타내며, 이 때 대조군의 인간 피부 섬유 아세포는 카멜리아 시넨시스 켈러스 추출물이 없는 배지에서 배양하고 UVA를 조사하지 않았고, "UVA" 그룹은 카멜리아 시넨시스 켈러스 추출물이 없는 배지에서 배양하고 UVA를 조사하였으며, "UVA + 추출물" 그룹은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 외부 첨가된 MEM 배지에서 최종 농도 5mg/ml가 되도록 배양하고, UVA를 조사하였다;
도 4는 상이한 농도의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물에 의해 처리된 후의 반응 용액 중 AGEs (당화 말단 산물, advanced glycation end products)의 생산 수준을 나타낸다;
도 5는 대조군과 비교하여, "추출물(Extract)"그룹에서 인간 피부 섬유 아세포에 의해 분비된 콜라겐의 수준을 나타내며, 이때, 대조군의 인간 피부 섬유 아세포는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양되었고, "추출물" 그룹에서는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 캘러스 추출물을 외부적으로 첨가한 MEM 배지에서 최종 농도가 10 mg/ml가 되도록 배양하였다;
도 6은 대조군과 비교하여, 각 다른 그룹의 인간 피부 섬유아세포에서 MMP2 및 TIMP1 유전자의 발현 수준을 나타내며, 이때, 대조군의 인간 피부 섬유아세포는 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양하고, "추출물(0.125)" 그룹 및 "추출물(0.25)" 그룹에서 인간 피부 섬유아세포는 독립적으로 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 외부적으로 첨가한 MEM 배지에서 각각 최종 농도 0.125 및 0.25 mg/ml가 되도록 배양하였다.
이하, 본 발명의 실시 형태의 일부를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서, 본 발명은 다양한 실시예들로 구체화될 수 있으며, 명세서에 설명된 실시예들에 한정되지 않아야 한다. 또한, 본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 명세서 (특히 청구항에서)에 인용된 표현은 단수 형태 및 복수 형태 모두를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 인용된 "개체"라는 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함하는 포유 동물을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 본 명세서에 인용된 용어 "카멜리아 시넨시스 캘러스 (Camellia sinensis callus)"는 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis) 잎의 캘러스를 언급한다.
본 발명자들은 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis) 식물의 손상된 잎에서 생성된 캘러스의 특징이 포유류의 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cells)와 유사하며, 카멜리아 시넨시스 캘러스의 추출물은 UV 손상을 막고 단백질의 당화(글리코실화)를 억제하고, 콜라겐의 분비를 촉진하고, 콜라겐의 분해 및 손실을 지연하는데 효과적이라는 것을 발견했다.
따라서, 본 발명은 피부 보호에 있어서 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 용도에 관한 것으로, 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선, 피부 노화 지연, 피부에서 콜라겐 함량 유지 도움, 광 손상 대비, 피부 병변 예방 및/또는 상처 치유 촉진하기 위하여, 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것, 조성물의 제조에 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 사용, 유효량의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 함유하는 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 특히, 카멜리아 시넨시스 캘러스는 카멜리아 시넨시스 잎의 캘러스이다.
본 발명에 따라 채택된 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물은 카멜리아 시넨시스 잎의 캘러스를 극성 용매로 추출함으로써 제공될 수 있으며, 여기서 극성 용매는 물, 알콜(예를 들어,C1-C4 알콜), 또는 그 조합일 수 있다. 또한, 추출 용매 중에 물질이 고르게 분산 될 수 있는 한 추출 용매의 양은 제한되지 않는다. 예를 들어, 추출 단계에서, 추출 용매 및 카멜리아 시넨시스 캘러스는 100 : 1 내지 300 : 1의 범위의 부피비 (추출 용매 : 카멜리아 시넨시스 캘러스)로 사용될 수 있다. 선택적으로, 상기 추출은 추출 효율을 향상시키기 위해 초음파 처리와 함께 수행될 수 있다. 바람직하게는, 추출 전에 건조 조작을 수행할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 카멜리아 시넨시스 캘러스는 추출 전에 동결 건조시켰다. 예를 들어, 동결 건조된 카멜리아 시넨시스 캘러스를 100 : 1 (물 : 동결 건조된 카멜리아 시넨시스 캘러스)의 중량비로 물과 혼합하여 혼합물을 제공할 수 있고, 그 혼합물을 70℃에서 45분 동안 초음파 교반을 수행하여 추출물을 수득하였다.
본 발명에 따라 채택된 카멜리아 시넨시스 캘러스는 다음 단계에 의해 제공 될 수 있다 :
I. 2% 하이포아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 용액으로 카멜리아 시넨시스 식물을 세척한 다음 멸균수로 세척하고, 선택적으로 상기 세척 단계를 반복 할 수 있음;
II. 세척한 카멜리아 시넨시스 식물의 잎을 잘라 표면에 상처를 만들어 캘러스 생성을 유도함 (1 ~ 3 개월); 및
III. 단계 II에서 얻은 캘러스를 1/2MS 배지 (1/2 x Murashige and Skoog Basal Medium)에서 온도 25℃, 습도 50 ~ 60% (1 ~ 1.5 개월)에서 배양함.
본 발명에 따라 채택된 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물은 카멜리아 시넨시스 캘러스의 추출로부터 직접 얻어지는 액체 추출물의 원래(original) 형태일 수 있거나, 또는 상기 액체 추출물의 사용을 용이하게 하기 위하여 액체 추출물 상에서 여과, 살균, 농축 및 희석과 같은 하나 이상의 임의의 단계를 수행함으로써 수득된 생성물일 수 있다. 예를 들어, 액체 추출물을 농축 건조, 분무 건조 또는 동결 건조와 같은 조작에 적용하여 운반 또는 저장하기에 편리한 분말 제품이 제공될 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는 조성물은 케어 제품 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있으며, 이 때, 상기 케어 제품 조성물은 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선, 및 피부 노화 지연 중 적어도 하나에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 케어 제품 조성물은 특별한 제한없이 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 케어 제품 조성물은 에멀젼, 크림, 겔 (하이드로 겔과 같은) 또는 용액(에센스, 로션과 같은)일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 제공되는 케어 제품 조성물을 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선 및/또는 피부 노화 지연을 위해 피부 표면에 투여하는 경우, 제품 내의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 농도는 제품의 타입에 의존하여 다양화될 수 있다. 예를 들어, 상기 케어 제품 조성물이 에센스인 경우, 에센스 내의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서의)의 농도는 0.01 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 중량%이다. 상기 케어 제품 조성물이 로션인 경우, 로션 내의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도는 0.01 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.1 중량%이다.
본 발명에 따라 제공되는 식품 조성물은 피부 내의 콜라겐 함량을 유지하는 데 도움을 주며, 특별한 제한없이 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 식품 조성물은 건강 음료 및 미용 음료와 같이 삼키거나 마시기에 적합한 형태로 제조될 수 있지만, 이로써 제한되지는 않는다. 식품 조성물이 미용 음료인 경우, 상기 미용 음료 내의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도는 1 내지 1000 ppm, 바람직하게는 500 ppm이다.
선택적으로, 본 발명에 따라 제공되는 케어 제품 조성물, 식품 조성물 또는 약학 조성물은 적절한 양의 첨가제를 추가로 포함할 수 있는데, 예를 들어, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 기호성 및 시각적 인지를 향상시키기 위한 향료, 토너 또는 착색제와 같은 적절한 양의 첨가제, 및/또는 케어 제품 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 안정성 및 저장성을 개선시키기 위한 완충제, 보존제, 방부제, 항균제, 또는 항진균제를 포함할 수 있다.
원하는 목적에 따라, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 특별한 제한 없이 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 (예를 들어, 경피 또는 피하) 경로에 의해 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있지만, 이로써 제한되지는 않는다. 형태 및 목적에 따라, 적절한 담체가 선택되어 약학 조성물을 제공하는데 사용될 수 있고, 이 때, 상기 담체는 부형제, 희석제, 보조제, 안정화제, 흡수 억제제, 붕해제(disintegrating agent), 가용화제(hydrotropic agents), 유화제, 항산화제, 접착제, 결합제, 점착 부여제(tackifiers), 분산제, 현탁제, 윤활제, 흡습제 등을 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 투약 형태(dosage form)로서, 약학적 조성물은 활성 성분 (즉, 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물)의 원하는 효과에 악영향을 미치지 않을 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 또는 그의 유사체, 셀룰로즈, 전분, 슈가 벤토나이트 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 약학적 조성물은 정제 (예를 들어, 드라제), 환제, 캡슐, 과립제, 펄비스(pulvis), 유동추출제(fluidextract), 용액, 시럽, 현탁액 또는 팅크(tincture) 등과 같은 경구 투여용 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다.
경피 투여용 제형으로는, 패치, 에멀젼, 크림, 겔 (예를 들어, 하이드로겔), 페이스트 (예를 들어, 분산 페이스트, 연고), 스프레이, 또는 외부 사용을 위한 용액(예를 들어, 현탁액)과 같은 형태로 제공될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
피하 투여에 적합한 주사제 또는 드립(drip)의 형태에 있어서, 약학적 조성물은 등장성 용액, 염-완충 식염수 (예 : 인산염-완충 식염수 또는 시트르산-완충 식염수), 가용화제, 유화제, 5% 슈가 용액 및 기타 담체와 같은 하나 이상의 성분(들)을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 상기 약학적 조성물은 예비-주입 고체(pre-injection solid)로서 제조될 수 있다. 상기 예비-주입 고체는 다른 용액 또는 현탁액에 가용성인 형태 또는 유화 가능한 형태로 제공될 수 있다. 예비-주입 고체를 필요로 하는 대상에게 투여하기 전에 다른 용액 또는 현탁액에 용해 시키거나 또는 유제화함으로써 목적하는 주사제가 제공된다.
대상의 필요, 연령, 체중, 건강 상태 및 목적에 따라, 본 발명에 따라 제공되는 상기 조성물은 예를 들어 하루에 한 번, 하루에 여러 번, 하루에 몇 번, 며칠마다 한번 등과 같은 다양한 투여 빈도로 복용될 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 포함하는 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 피부 보호 방법을 제공한다. 적용 유형, 적용 경로, 적용 형태, 적용 빈도 및 조성의 관련 응용 분야에서의 사용은 모두 위의 설명과 일치한다.
이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 기재될 것이다.
실시예
실시예
1 : 카멜리아 시넨시스
캘러스
추출물의 제조
카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 식물은 Guoguang Flower Market(Taichung, Taiwan)에서 구입하여 카멜리아 시넨시스 캘러스를 제공하기 위해 다음과 같은 조작을 수행하였다:
I. 2% 하이포아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 용액으로 카멜리아 시넨시스 식물을 세척한 다음 멸균수로 세척하고, 선택적으로 상기 세척 단계를 반복 할 수 있음;
II. 세척한 카멜리아 시넨시스 식물의 잎을 잘라 표면에 상처를 만들어 캘러스 생성을 유도함 (1 ~ 3 개월); 및
III. 단계 II에서 얻은 캘러스를 1/2MS 배지 (SIGMA 사에서 구입 한 1/2 x Murashige and Skoog Basal Medium, 제품 번호 : M5524)에서 온도 25℃, 습도 50 ~ 60% (1 ~ 1.5 개월)에서 배양함.
단계 III 에서 얻은 카멜리아 시넨시스 캘러스는 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물을 준비하기 위해 다음과 같은 조작을 수행하였다:
(1) 카멜리아 시넨시스 캘러스를 12시간 동안 -22℃에서 동결 건조시킨 다음, 건조시킨 카멜리아 시넨시스 캘러스를 분쇄하여 카멜리아 시넨시스 캘러스 분말을 제공함;
(2) 상기 단계 (1)에서 얻은 카멜리아 시넨시스 캘러스 분말을 물 : 카멜리아 시넨시스 캘러스 분말 = 100 : 1의 중량비로 물과 혼합하여 혼합물을 제조한 다음 70℃에서 45분간 초음파 교반함;
(3) 단계 (2)의 생성물을 여과막으로 여과하여 여액을 제공함;
(4) 단계 (3)에서 얻은 여액을 95℃로 가열하고 95℃에서 20분간 유지하여 살균함;
(5) 단계 (4)의 생성물 (즉, 다음 실시예에서 사용하기 위해 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물의 1차 액체)을 냉각시킨 후, 다음 실험에서 사용하기 위해 포장하여 냉장 보관함; 그리고
(6) 단계 (5)의 1 차 액체를 동결 건조시켜 건조 물질 (즉, 본 발명에 따라 채택된 Camellia sinensis 캘러스 추출물)을 제공함.
실시예
2 :
Camellia
sinensis
캘러스
추출물의 항산화 효과
실시예 1의 (6) 단계에서 얻은 Camellia sinensis 캘러스 추출물 건조 물질을 7 개의 그룹으로 나누어서 역삼투수 (reverse osmosis(RO) water)와 독립적으로 혼합하여 Camellia sinensis 캘러스 추출물의 농도가 각각 0.83, 1.00, 1.25, 1.67, 2.50, 4.00 및 5.00 mg/ml인 7가지 용액을 제조하였다. 그 후, 각 Camellia sinensis 캘러스 추출물 용액에 하기의 처리를 각각 수행하였다 :
I. 2.5ml의 Camellia sinensis 캘러스 추출물 용액 또는 표준 2.5ml와 0.2M 인산 완충 식염수 (pH = 6.6) 및 1% PFC(potassium ferricyanide) 2.5ml를 혼합하여 혼합 용액을 제공하고, 상기 혼합 용액을 50℃에서 20분동안 유지함;
II. 단계 I의 생성물을 냉각시키고, 삼염화 초산 (TCA, trichloroacetic acid) 2.5ml와 골고루 혼합하여 혼합물을 얻은 다음, 3000g에서 10분간 원심 분리하고 상청액을 수집함; 그리고
III. 상기 단계 II에서 얻은 상청액 3 ml 증류수 3 ml및 0.1% 염화 제2철 1.2 ml 균일하게 혼합하여 혼합 용액을 제조한 후, 실온에서 상기 혼합 용액을 10 분간 유지하여 다음의 흡광도 측정에 사용을 위한 용액을 제공함.
비타민 C (SIGMA 사에서 구입)를 7 그룹으로 나누어 물과 독립적으로 혼합하여 비타민 C의 농도가 각각 0, 20, 40, 60, 80, 100 및 120 ㎍/ml인 7가지 용액을 제조하였다. Camellia sinensis 캘러스 추출물 용액을 비타민 C 용액으로 대체한 것을 제외하고, 7가지 비타민 C 용액 각각을 상기 단계 I 내지 III에서 기술된 바와 같이 처리하였다.
다음에, 단계 III에서 얻어진 각 용액의 흡광도값을 분광광도계로 파장 700 nm에서 측정하였다. 흡광도값이 높을수록 강한 환원능(reducing ability)(즉, 우수한 항산화능)을 나타낸다. 그 후, Camellia sinensis 캘러스 추출물 용액의 흡광도 값을 이용하여, 해당 Camellia sinensis 캘러스 추출 용액과 동일한 흡광도값을 갖는 비타민 C의 농도를 계산하였다. 그 결과는 도1에 도시하였다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, 1 mg/ml Camellia sinensis 캘러스 추출물 용액의 항산화능(antioxidant capability)은 30 ㎍/ml 비타민 C 용액의 항산화능과 동일하다. 이러한 결과는 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 항산화에 탁월하다는 것을 나타낸다.
실시예
3 :
Camellia
sinensis
캘러스
추출물이 광 손상에 미치는 영향
(3-1)
MTT
분석
인간 피부 섬유 아세포 (CCD-966SK, ATCC로부터 구입)를 24시간 동안 MEM 배지 (Minimum Essential Medium; Gibco로부터 구입, 제품 번호 : 61100-061)에서 배양하였다. 그 후, 인간 피부 섬유 아세포를 7 개의 그룹으로 나누어 각각 독립적으로 다음과 같은 처리를 실시하였다:
1. 대조군 : 세포를 MEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다 (즉, 세포를 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양).
2. "UVB"그룹 : 세포를 MEM 배지에서 24 시간 동안 배양한 후 (즉, Camellia sinensis 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양), UVB (15 J/cm2)를 1 시간 동안 조사 하였다 .
3. "UVB + 추출물 (0.375)" 그룹, "UVB + 추출물 (0.75)" 그룹, "UVB + 추출물 (1.5)" 그룹, "UVB + 추출물 (3)" 그룹 및 "UVB + 추출물 (6)" 그룹 : 실시예 1의 단계 (6)에서 얻은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 건조물질 (최종 농도가 각각 0.375, 0.75, 1.5, 3 및 6 mg/ml)이 외부 첨가된 MEM 배지에서 24시간 동안 각 그룹의 세포를 배양한 후, UVB (15 J/cm2)를 1 시간 동안 조사하였다.
그 후 각 그룹의 세포 생존율을 MTT assay로 측정하였다. 그 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, "UVB" 그룹의 세포 생존율은 현저히 낮았다. 그러나, Camellia sinensis 캘러스 추출물 ("UVB + 추출물 (0.375)" 그룹, "UVB + 추출물 (0.75)" 그룹, "UVB + 추출물 (1.5)" 그룹, "UVB + 추출물 (3)" 그룹 및 "UVB + 추출물 (6)" 그룹)은 "UVB"그룹보다 유의하게 높았으며, Camellia sinensis 캘러스 추출물의 농도는 세포 생존율에 비례하였다.
(3-2) 형광 염색(
Fluorescent
staining
)
인간 피부 섬유아세포 (CCD-966SK, ATCC로부터 구입)를 MEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 인간 피부 섬유아세포를 3 개의 그룹으로 나누어 각각 독립적으로 하기의 처리를 수행하였다 :
1. 대조군 : 세포를 MEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다 (즉, 세포를 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양).
2. "UVA" 그룹 : 세포를 MEM 배지에서 24시간 동안 배양한 후 (즉, 세포를Camellia sinensis 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양), UVA (15 J/cm2)를 100 분간 조사하였다.
3. "UVA + 추출물" 그룹 : 실시 예 1의 단계 (6)에서 얻은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 건조물질 최종 농도 5mg/ml로 24시간 동안 외부 첨가한 MEM 배지에서 세포를 배양하고, UVA (15 J/cm2)를 100 분간 조사하였다.
그 후, 각 그룹의 세포를 Rhodamine 123 (즉, 미토콘드리아 특이적 염색제, Thermo사로부터 구입) 및 Hoechest 33342 (즉, 세포 핵-특이적 염색제; Thermo 사로부터 구입)로 형광 염색하고, 형광 현미경으로 각 그룹의 세포에서 핵 (청색 형광으로 나타냄)과 미토콘드리아 (적색 형광으로 나타냄)를 관찰하였다. 그 결과는 도 3에 도시하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, "UVA" 그룹의 세포에서 미토콘드리아의 수는 현저히 적었다. 그러나, "UVA + 추출물" 그룹 세포의 세포 내 미토콘드리아의 수는 대조군과 거의 같았다.
(3-1)과 (3-2)의 결과는 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 UVA 및 UVB- 유도된 세포 손상을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 인간의 피부 섬유아세포에서 미토콘드리아를 보호하고 자외선-유도된 손상을 수선하는데 도움이 될 수 있음을 나타낸다. (3-1)과 (3-2)의 상기 결과는 또한 실험 농도의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 정상 인간의 피부 섬유 아세포에 독성을 나타내지 않음을 나타낸다.
실시예
4 :
Camellia
sinensis
캘러스
추출물이 단백질
당화(글리코실화)를
억제하는 효과
본 발명에 따라 제공된 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 단백질 글리코 실화를 억제할 수 있는지를 확인하기 위해, 다음의 실험에 의해 진행된 글리코실화 산물 (AGEs, advanced glycation end products)의 생산 수준을 조사하였다.
실험군:
I. 용매로서 200mM 인산 나트륨 완충액 (pH = 7.4)을 사용하여 60mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 (아지드 나트륨 0.06% 함유) 및 1.5M 프럭토스 용액을 각각 제조함
II. 실시예 1의 단계 (5)에서 얻은 Camellia sinensis 캘러스 추출물의 1 차 액체를 진공 농축하여 각각 Camellia sinensis 캘러스 추출물의 10배 및 100 배 농축액을 제공함;
III. 실시예 1의 (5) 단계에서 얻은 Camellia sinensis 캘러스 추출물의 1 차 액체 0.25ml와 단계 (II)에서 얻은 Camellia sinensis 캘러스 추출물의 10 배 농축액과 단계 (II)에서 얻은 Camellia sinensis 캘러스의 100 배 농축액을, 단계 (I)에 의해 제공된 0.25 ml BSA 용액 (0.06 % 아지드 나트륨 함유) 및 단계 (I)에 의해 제공된 0.25 ml 프럭토스 용액을 고르게 혼합하고, 그 후 상기 3가지 혼합된 용액을 50℃에서 24시간 동안 유지시켜 3 개의 반응 용액 (이하 "1차 액체" 그룹, "10배 농축 액체" 그룹 및 "100배 농축 액체" 그룹)을 제공함;
IV. 단계 (III)에서 수득된 각 그룹의 반응 용액의 형광값 (각 그룹의 반응 용액 0.1 ml을 사용함)을 360 nm의 여기 광파장 및 460 nm의 방출 광파장에서 형광 분광기를 사용하여 측정 하였다(즉, 각 실험군의 0시간 형광값); 그리고
V. 단계 (III)에서 얻은 각 그룹의 반응 용액을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이팅한 다음 (각 그룹의 반응 용액 0.45ml 사용), 각 그룹의 인큐베이팅된 용액의 형광값 (각 그룹의 인큐베이팅된 용액 0.1ml 사용)을 형광 분광기를 사용하여 360 nm의 여기 광파장 및 460 nm의 방출 광파장에서 측정함(즉, 각 실험군의 24시간 형광값)
대조군:
(i)
용매로서 200 mM 인산 나트륨 완충액 (pH = 7.4)을 사용하여 3 mM 아미노구아니딘 (AG) 용액을 준비함.
(ii)
단계 (i)에 의해 제공된 0.25 ml의 AG 용액과 단계 (i)에 의해 제공된 0.25 ml BSA 용액 (0.06 % 아지드 나트륨 함유) 및 단계 (i)에 의해 제공된 프럭토스 용액 0.25 ml를 고르게 혼합한 후, 50℃에서 24 시간 동안 상기 혼합된 용액을 유지하여 반응 용액을 제공함(이하, "대조군"이라 함);
(iii) 형광 분광계에 의해, 단계 (ii)에서 얻어진 반응 용액의 형광값 (0.1 ml의 반응용액을 사용함)을 여기 광파장 360 nm 및 방출 광파장 460 nm에서 측정함(즉, 대조군의 0시간 형광값); 및
(iv) 단계 (ii)에서 얻은 반응 용액을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 (0.45 ml의 반응 용액을 사용함), 형광 분광계로 360 nm의 여기 광 파장 및 460 nm의 방출 광 파장에서 인큐베이트한 용액(0.1 ml 배양액 사용)의 형광값을 측정하였다. (즉, 대조군의 24시간 형광값).
그 후, 각 실험군의 AGEs의 상대적 생산량(%)을 다음 식에 의해 산출하였다. 상기 결과는 도 4에 도시하였다.
AGE 상대적 생산량 (%) =
(실험군의 24-시간 형광 - 실험군의 0-시간 형광 / 대조군의 24-시간 형광 - 대조군의 0-시간 형광) x 100%
도 4에 도시된 바와 같이, Camellia sinensis 캘러스 추출물은 AGE 생성을 효과적으로 억제할 수 있고, Camellia sinensis 캘러스 추출물의 농축액은 많은 유의적인 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 단백질 당화(글리코실화)를 저해하는데 효과적이므로 인간의 피부 섬유 아세포에서 단백질의 당화를 억제하여 피부 노화를 지연시키고 피부 병변을 예방하는 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.
실시예
5:
카멜라
시넨시스
캘러스
추출물이 피부에서 콜라겐 함량을 유지하는 데 도움을 주는 효과
(5-1) 콜라겐의 분비 촉진
카멜라 시넨시스 캘러스 추출물이 콜라겐 분비 촉진에 미치는 영향을 확인하기 위해, 인간 피부 섬유아세포 (CCD-966SK, ATCC에서 구입)를 MEM 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 두 그룹으로 나누어 각각 독립적으로 다음 처리를 수행하였다:
1. 대조군 : 세포를 MEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다 (즉, 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 없는 배지에서 배양).
2. "추출물" 그룹 : 실시예 1의 단계 (6)에서 얻은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 건조물질을 최종 농도 10mg/ml가 되도록 48시간 동안 외부 첨가한 MEM 배지에서 세포를 배양하였다.
그 후, 상기 2그룹의 배양 배지 중 콜라겐 함량을 SircolTM Soluble Collagen Assay kit (Biocolor에서 구입함) 및 ELISA reader (BioTek에서 구입함)로 검사하였다. 이어서, 얻어진 상기 데이터를 Student's t-test에 의해 분석하고, 대조군의 콜라겐 함량을 기초로 하여(즉, 대조군의 콜라겐 함량을 100%로 하여), "추출물"그룹의 콜라겐 상대적 함량을 계산하였다. 그 결과는 도 5에 도시하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여, "추출물" 그룹의 콜라겐 함량은 28.29% 까지 증가하였다. 상기 결과는 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 콜라겐을 분비하기 위해 세포를 효과적으로 촉진시킬 수 있어, 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선, 피부 노화 지연 및/또는 상처 치유 촉진에 효과적임을 나타낸다.
(5-2) 콜라겐의 손실 지연
MMP2 유전자의 발현 수준의 감소 및/또는 TIMP1 유전자의 발현 수준의 증가는 콜라겐 분해가 억제됨을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따라 제공된 Camellia sinensis 캘러스 추출물이 피부에서 콜라겐의 분해 및 손실을 지연시킬 수 있는지를 확인하기 위해 인간 피부 섬유아세포 (ATCC에서 구입한 CCD-966SK)를 MEM 배지에서 24시간 동안 배양한 다음, 이를 3 개의 그룹으로 나누어 독립적으로 하기 처리를 실시하였다:
1. 대조군 : 세포를 MEM 배지에서 6시간 동안 배양하였다 (즉, 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 함유되지 않은 배지에서 배양).
2. "추출물 (0.125)" 그룹 : 실시예 1의 단계 (6)에서 얻은 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 건조물질을 최종 농도 0.125mg/ml가 되도록 6시간 동안 외부 첨가한 MEM 배지에서 세포를 배양하였다.
3. "추출물 (0.25)" 그룹 : 실시예 1의 단계 (6)에서 얻은 시넨시스 캘러스 추출물 건조물질을 최종 농도 0.25mg/ml가 되도록 6시간 동안 외부 첨가한 MEM 배지에서 세포를 배양하였다.
그 후, 각 그룹의 세포를 모아 qRT-PCR을 행하여 각 그룹의 세포에서 MMP2 및 TIMP1 유전자의 발현량을 측정하였다. 이어서, 얻어진 데이터를 Student's t-test에 의해 분석하고, 상기 대조군의 결과를 근거로 하여 (대조군의 발현 수준을 1배로 설정) 각 다른 그룹의 상대적 유전자 발현량을 산출하였다. 그 결과는 도 6에 도시하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, Camellia sinensis 캘러스 추출물 ("추출물 (0.125)" 그룹 및 "추출물 (0.25)" 그룹을 포함함)에 의해 처리된 그룹의 MMP2 유전자의 발현 수준은 유의하게 감소 하였고, 그리고, TIMP1 유전자의 발현 수준이 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물이 콜라겐 분해를 효과적으로 억제하여 콜라겐의 분해 및/또는 손실을 지연시켜 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선, 피부 노화 지연 및/또는 상처 치유 촉진 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
상기 실시예에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따라 제공되는 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물은 실제로 피부 세포에서 단백질의 당화를 억제하고, 피부 세포를 촉진하여 콜라겐을 분비하고, 콜라겐의 분해를 억제하고, 콜라겐의 손실을 지연시키고, UV 광조사에서 피부 세포의 생존율을 증가시킬 수 있고, 그러므로, 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선, 피부 노화 지연, 피부 콜라겐 함량 유지 도움, 광 손상 대비, 피부 병변 예방 및/또는 상처 치유 촉진과 같은 피부 보호에 효과적이다.
Claims (10)
- 유효량의 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis ) 캘러스 추출물을 함유하는 피부 보호 조성물로서, 추출물은 카멜리아 시넨시스 잎의 캘러스의 극성 용매 추출물인 피부 보호 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 극성 용매는 물, C1-C4 알콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 보호 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 케어 제품 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물인 피부 보호 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 피부 간호, 피부 수선, 피부 상태 개선 및 피부 노화 지연 중 적어도 하나를 위한 케어 제품 조성물인 피부 보호 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 케어 제품 조성물은 에센스이고, 에센스 내의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도가 0.01 내지 10 중량% 인 피부 보호 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 케어 제품 조성물은 로션이고, 로션 내의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도가 0.01 내지 5 중량 % 인 피부 보호 조성물
- 제 3 항에 있어서, 조성물은 콜라겐 함량을 유지하는 것을 돕는 식품 조성물인 피부 보호 조성물.
- 제7 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 미용 음료이고, 미용 음료 내의 카멜리아 시넨시스 캘러스 추출물 (건조 물질로서)의 농도가 1 내지 1000ppm 인 피부 보호 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 광 손상, 피부 손상 방지 및 상처 치유 촉진 중 적어도 하나를 위한 약학적 조성물인 피부 보호 조성물.
- 제 9 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경피 투여, 경구 투여 또는 피하 주사의 형태로 제공되는 피부 보호 조성물.
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