KR101412446B1

KR101412446B1 - 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 화장료 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR101412446B1
Application number: KR1020120100582A
Authority: KR
Inventors: 정진아; 서동삼; 장정호
Original assignee: 세원셀론텍(주)
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2014-06-26
Also published as: KR20140033957A

Abstract

본 발명은 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 또는 항알러지용 조성물 및 녹차 캘러스 추출물 제조방법에 관한 것으로, 녹차의 종자로부터 캘러스를 유도 및 증식한 뒤, 공기부양식 생물반응기를 이용하여 대량배양생산하여 항염증 및 항알러지 활성을 최대화하고, 항염증 및 항알러지 활성을 갖는 녹차 캘러스 추출물을 제조하며, 인체 유래의 각질형성 세포와 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포를 이용하여 녹차 캘러스 추출물이 세포독성 감소 효과, IL-1a와 IL-6의 발현 억제, Total NO의 생성 억제, β-hexosaminidase A 생성 억제 등의 우수한 항염증 및 항알러지 효과를 가지는 물질로서 염증과 알러지 예방 및 완화용 조성물에 이용될 수 있으므로 다양한 형태의 피부 외용제 화장품 소재로서 사용될 수 있다.

Description

녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 화장료 조성물의 제조방법{Composition comprising extracts of green tea callus having anti-inflammatory or anti-allergy and preparing method of extracts of green tea callus}

본 발명은 녹차(Camellia sinensis) 종자(접합자배)로부터 유도된 체세포배(Somatic embryo)를 기원으로 하는 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

염증은 각종 유해한 손상에 대한 초기반응으로, 세포 상해를 유발하는 다양한 자극에 대해 생체 조직이 보이는 복합적인 반응이다(대한병리학회 대구경북지부학회, 간추린 병리학, 서울, 정문각. 1998:56-58). 일반적으로 염증은 경도의 조직 손상을 동반하지만 과도한 염증은 영구적인 조직 손상을 초래하기도 한다. 이러한 염증반응에 의한 조직 손상의 기전은 염증매개 사이토킨(cytokine)에 의해 나타나는 것으로 알려져 있다(Murry JF, Nadel JA. Textbook of Respiratory Medicine. 2^nd ed. W.B. Sauders Company. 1994:478-483, 박계영 외. 폐 상피 세포에서 NF-kB/IkB 경로에 의한 염증 매개 사이토카인의 발현. 결핵 및 호흡기 질환. 2000;49(3):332-342). 알러지는 염증성 질환의 한 종류로서, 지난 십 여 년 동안 알러지성 염증반응에 관계되는 세포와 매개물질에 대한 연구가 비약적으로 이루어졌다(Venge P. Monitoring the allergic imflammation. Allergy 2004;59:26-32).

이러한 알러지성 염증반응에 있어서도 여러 가지 사이토킨에 의해 다양한 조직 손상이 나타나게 된다. 생체 내의 사이토킨 반응은 복잡하게 복수의 사이토킨이 조합된 것으로 어떤 사이토킨은 촉진적으로 작용하고, 어떤 사이토킨은 억제적으로 작용한다. 하지만 알러지 질환에서는 그 균형이 무너져 알러지에 촉진적으로 작용하는 사이토킨이 우위가 되어 있다는 것이 알려져 있다(히라노토시오. 사이토카인 분자생물학. 서울, 도서출판 월드사이언스. 2002:1-3, 73-74, 117-118). 따라서 어떤 약물이 항알러지, 항염증 반응에 어떠한 영향을 미치는가를 규명하기 위해서 이러한 사이토킨의 발현에 미치는 영향을 관찰하는 것이 의미가 있을 것으로 사료된다(조형준 외. 상백피가 항알러지 및 항염증반응에 미치는 영향. 대한한방소아과학회지 2005;19(2):175-195).

염증 반응은 우리 몸에서의 항상성 유지를 위한 자극에 대한 생체의 방어 반응으로 리포폴리사카라이드(lipopolysaccride, LPS)와 같은 외부 자극원과 아라키돈산(arachidonic acid)과 같은 내부 자극원들을 매개로 한다(S.M. Han, K.G. Lee, J.H. Yeo, and H.Y. Kweon, Anti-inflammatory effect of the vanom from asian honeybees(Apis cerana L.) on inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor-ain Raw 264.7 cell line, Korean J. Apiculture, 2004:19, 89).

LPS는 그람 음성 박테리아의 세포 표면을 구성하는 내독소 물질로 병원성 세균과 진핵생물간의 상호작용에 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(E.S. Lee, H.K. Ju, T.C. Moon, E. Lee, Y. Jahng, S.H. Lee, J.K. Son, S.H. Baek, and H.W. Chang, Inhibition of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) production by propenone compound through blackade of nuclear factor (NF)-kappa B activation in cultured murine macrophages, Biol. Pharm. Bull., 2004;27:617). LPS의 또 다른 역할은 숙주로부터 방출되는 독소 물질이 세균으로 들어오는 것을 방어하여 자신의 생명을 지키게 되며, 세포 방어 시스템을 활성화시킴으로 면역 조절 물질, 염증 유발 물질을 자극하게 된다. 따라서 Raw 264.7 대식세포에 LPS를 처리하여 주게 되면 세포의 활성화가 이루어지면서 다양한 염증 반응 인자로 알려진 tumor necrosis factor-a(TNF-a), Interleukin-6(IL-6), Interleukin-1β(1L-1β)와 같은 염증 전구 사이토킨(pro-inflammatory cytokines)을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Y.C. Liang, Y.T. Huang, S.H. Tasi, and S.Y. Lin-Shiau, Suppression of inducible cyclooxygenase and inducible nitric oxide synthase by apigenin and related flavonoids in mouse macrophages, Carcinogenesis, 1999;20:1945).

유도형 NO synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의해 염증 반응을 미개하는 독소 물질인 일산화 질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘(prostaglandin E₂, PGE₂) 등의 염증 인자가 형성된다. iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성한다. 일반적인 NO 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 과도한 NO 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다(Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev. 1991;43:109-142).

녹차는 전 세계인이 즐겨 마시는 음료 중의 하나로, 중국, 한국, 일본, 인도 등의 아시아 지역에서 많이 소비되고 있으며, 화장품 및 식품 등에 꾸준히 사용되어 왔다. 특히 국내에서는 아모레퍼시픽 社에서 화장품 및 식품에 대한 기능성 연구가 많이 진행되었다(KR1020080010405, KR1020090089207). 녹차에는 카테킨(catechin), 플라보노이드(flavonoid), 데아닌(theanine), 가바(GABA), 카페인(caffeine), 타닌(tannin) 등과 같은 화장품원료로 우수한 효능을 가진 다양한 화합물과 각종 비타민(vitamin)이 함유되어 있어 항암, 항산화, 항균, 소취, 혈압강하, 면역기능 증강 등 다양한 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

최근 식물이 함유하고 있는 2차대사산물의 대량생산에 가장 효과적인 방법으로 생물반응기 배양이 많이 이루어지고 있다. 특히 뿌리를 약용 및 식품으로 이용하고 재배기간이 수년간 소요되는 식물의 경우에는 생물반응기 배양을 이용한 세포와 기관의 대량 배양을 통해 제한된 공간에서 적은 노동력으로 타켓으로 하는 유용물질을 단기간에 대량 생산할 수 있는 효과적인 방법으로 이용될 수 있다. 또한 기내에서 유도 후 배양되는 세포, 기관 등은 기내 배양환경의 조절로 생장속도와 특정 2차대사산물의 함량을 높일 수 있다는 장점이 있으며(Rao SR and Ravishankar GA (2002) Biotechnol. Adv. 20: 101-153), 이러한 조직배양기술을 이용하여 인삼 부정근을 이용한 ginsenoside의 대량 생산기술이 여러 연구자에 의하여 시도되었고, 일부는 성공적으로 산업화까지 진행되었다.

종래 선행기술문헌으로는 다음과 같은 것이 있다. 즉, 선행기술 1은, 특허등록 제0513616호(출원번호 제2003-0026015호)(명칭: 녹차 성분을 함유하는 피부 외용제 조성물)가 등록된바 있다. 또한 선행기술 2는, 공개특허 제2011-0031801호(출원번호 제2009-0089207호)(명칭: 녹차의 줄기세포를 함유하는 항산화 및 항노화용 화장료 조성물)가 출원된바 있다. 또한 선행기술 3은, 공개특허 제2010-0131598호(출원번호 제2009-0050271호)(명칭: 벼 캘러스 추출물을 함유하는 화장료 조성물)가 출원된바 있다. 또한 선행기술 4는, 공개특허 제2011-0095468호(출원번호 제2010-0014944)(명칭: 연 캘러스 추출물을 함유한 피부외용제 조성물 및 그 제조방법)가 출원된바 있다.

본 발명의 목적은 녹차(Camellia sinensis) 종자(접합자배)로부터 유도된 체세포배(Somatic embryo)를 기원으로 하는 녹차 캘러스를 유도 및 증식한 뒤, 항염증 및 항알러지 활성을 최대화하기 위해서 생물반응기를 이용해서 대량배양생산하여 항염증 또는 항알러지 활성을 갖는 추출물을 제조하고, 이 추출한 토마스 캘러스의 추출물이 세포독성 감소 효과, IL-1∝와 IL-6의 발현 억제, Total NO의 생성 억제, β-hexosaminidase A 생성 억제 등의 우수한 항염증 및 항알러지 효능를 가짐을 인체 유래의 각질형성세포와 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포를 이용하여 입증한 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 또는 항알러지용 조성물 및 녹차 캘러스 추출물 제조방법을 제공함에 있다.

상술한 본 발명의 목적은 녹차 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항알러지용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 목적은 (1) 녹차 종자를 멸균 세척하여 무기염류 농도를 1/2로 낮춘 pH 5.8인 1/2 MS(Murashige and Skoog, 1962) 고체배지에서 25℃ 암배양하여 신장시킨 접합자 배로부터 체세포 배를 형성한 후, 캘러스를 유도시키는 제1단계와; (2) 유도된 녹차 캘러스를 제1단계의 MS 배지로 옮겨 3주 간격으로 25±2℃의 암 조건에서 계대배양하여 안정화시키는 제2단계와; (3) 2,4-D 1 /L와 수크로오스 30 g/L가 첨가된 MS 배지에 유도된 녹차 캘러스를 접종한 후에 25±2℃의 암 조건에서 3주간 현탁배양하는 제3단계와; (4) 현탁배양된 녹차 캘러스를 공기부양식 생물반응기내에서 제3단계의 MS 배지를 이용하여 증식하는 제4단계; 및 (5) 증식된 녹차 캘러스를 2주 후에 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지 2L를 상기 생물반응기에 추가하여 25±2℃의 암 조건에서 대량배양생산하는 단계를 포함하는 녹차 캘러스의 대량배양생산방법에 의해 달성된다.

또한, 본 발명의 목적은 (1) 녹차 캘러스를 4주간 MS 배지에서 배양한 뒤, 상기 MS 배지가 혼합된 녹차 캘러스를 용기에 나누어 담아 냉동시키는 제1냉동단계와; (2) 제1냉동단계에 의해 냉동된 녹차 캘러스를 항온수조에서 녹을 때까지 일정시간 해동한 뒤, 호모기나이즈(Ika T-25)을 이용하여 8,000~15,000 rpm 조건에서 일정시간 녹차 캘러스를 상기 용기 내에서 함께 고속 분쇄 처리하는 제2분쇄단계와; (3) 제2분쇄단계에 의해 분쇄된 녹차 캘러스를 초고압 유화기(마이크로플루다이져)를 이용하여 분쇄하는 제3분쇄단계와; (4) 제3분쇄단계에 의해 분쇄된 녹차 캘러스를 여과지를 이용하여 감압여과 한 후, 여과판으로 감압여과시켜 추출제조하는 제4감압여과단계를 포함하는 녹차 캘러스 추출물의 제조방법에 의해 달성된다.

상술한 본 발명의 기술구성에 의해 녹차의 종자를 이용하여 유도, 증식된 녹차 캘러스를 대량배양생산할 수 있을 뿐만 아니라 이렇게 대량배양생산된 녹차 캘러스의 추출물이 세포독성 감소 효과, IL-1∝와 IL-6의 발현 억제, Total NO의 생성 억제, β-hexosaminidase A 생성 억제 등의 실험결과 항염증 및 항알러지 효능을 가짐에 따라 염증과 알러지 예방 및 완화용 조성물에 이용될 수 있으므로 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 헤어 토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 샴푸 및 헤어크림 등의 피부 외용제 형태의 화장품 소재로써 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 녹차 캘러스 추출물 농도에 따른 각질 형성 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 녹차 캘러스 추출물의 IL-1∝ 생성 억제 효과를 나타낸 그래프로,
A는 인체 유래의 각질형성세포를 대상으로 한 IL-1∝ 생성 억제 효과를 나타낸 것이고,
B는 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포를 대상으로 한 IL-1∝ 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 녹차 캘러스 추출물의 IL-6 생성 억제 효과를 나타낸 그래프로,
A는 인체 유래의 각질형성세포를 대상으로 한 IL-6 생성 억제 효과를 나타낸 것이고,
B는 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포를 대상으로 한 IL-6 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 녹차 캘러스 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프로,
A는 인체 유래의 각질형성세포를 대상으로 한 NO 생성 억제 효과를 나타낸 것이고,
B는 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포를 대상으로 한 NO 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 녹차 캘러스 추출물의 β-hexosaminidase A 생성 억제 효과를 나타낸 그래프로,
A는 인체 유래의 각질형성세포를 대상으로 한 β-hexosaminidase A 생성 억제 효과를 나타낸 것이고,
B는 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포주를 대상으로 한 β-hexosaminidase A 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.

선행기술 1은 녹차 성분을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 데아닌(theanine) 및 카테킨(catechin)을 단독 또는 혼합물의 형태로 함유하여 지방세포의 피하 지방 분해 효과, 셀룰라이트의 제거 효과가 우수한 지방분해 및 비만억제용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로 본 발명의 조성물의 효능과는 차이가 있다.

또한 선행기술 2는 녹차를 식물줄기세포배양기술(Plant stem cell culture technology)로 배양한 세포주(cell line), 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하여 활성 산소를 제거하는데 효과적인 항산화 및 항노화용 화장료 조성물에 관한 것으로 본 발명의 세포 배양 기술 방법, 조성물의 제조 방법 및 효능과는 차이가 있다.

이를 위해 본 발명의 조성물은 녹차 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유한 것을 제공한다.

또한 본 발명 녹차 캘러스 추출물은 녹차 캘러스와 MS 배지가 혼합된 것을 제공한다.

또한 본 발명 녹차 캘러스 추출물은 세포독성이 없는 것을 제공한다.

또한 본 발명 녹차 캘러스 추출물은 IL-1∝ 발현 억제 효과를 나타내는 것을 제공한다.

또한 본 발명 녹차 캘러스 추출물은 IL-6 발현 억제 효과를 나타내는 것을 제공한다.

또한 본 발명 녹차 캘러스 추출물은 Total NO의 생성 억제 효과를 나타내는 것을 제공한다.

또한 본 발명 녹차 캘러스 추출물은 β-hexosaminidase A의 생성 억제 효과를 나타내는 것을 제공한다.

또한 본 발명 녹차 배양 세포 추출물의 농도는 5~100 ㎍/mL인 것을 제공한다.

그리고 본 발명의 제조방법은,

(1) 녹차 종자를 멸균 세척하여 무기염류 농도를 1/2로 낮춘 pH 5.8인 1/2 MS(Murashige and Skoog, 1962) 고체배지에서 25℃ 암배양하여 신장시킨 접합자 배로부터 체세포 배를 형성한 후, 캘러스를 유도시키는 제1단계와; (2) 유도된 녹차 캘러스를 제1단계의 MS 배지로 옮겨 3주 간격으로 25±2℃의 암 조건에서 계대배양하여 안정화시키는 제2단계와; (3) 2,4-D와 수크로오스가 첨가된 MS 배지에 유도된 녹차 캘러스를 접종한 후에 25±2℃의 암 조건에서 3주간 현탁배양하는 제3단계와; (4) 현탁배양된 녹차 캘러스를 공기부양식 생물반응기내에서 제3단계의 MS 배지를 이용하여 증식하는 제4단계; 및 (5) 증식된 녹차 캘러스를 2주 후에 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지 2L를 상기 생물반응기에 추가하여 25±2℃의 암 조건에서 대량배양생산하는 단계;를 거쳐 녹차 캘러스 추출물을 제조하게 된다.

또한 본 발명은 상기 대량배양생산된 녹차 캘러스를 4주간 MS 배지에서 배양한 뒤, 상기 MS 배지가 혼합된 녹차 캘러스를 용기에 나누어 담아 냉동시키는 제1냉동단계와; (2) 제1냉동단계에 의해 냉동된 녹차 캘러스를 항온수조에서 녹차 캘러스가 녹을 때까지 일정시간 해동한 뒤, 호모기나이즈를 이용하여 8,000~15,000 rpm 조건에서 일정시간 녹차 캘러스를 상기 용기 내에서 함께 고속 분쇄 처리하는 제2분쇄단계와; (3) 제2분쇄단계에 의해 분쇄된 녹차 캘러스를 초고압 유화기(마이크로플루다이져)를 이용하여 분쇄하는 제3분쇄단계와; (4) 제3분쇄단계에 의해 분쇄된 녹차 캘러스를 여과지를 이용하여 감압여과 한 후, 여과판으로 감압여과시켜 추출제조하는 제4감압여과단계;를 거쳐 녹차 캘러스 추출물을 제조하게 된다.

이하, 본 발명의 구체적인 기술구성을 첨부한 도면을 이용하여 상세하게 기술하면 다음과 같다.

본 발명은 녹차 캘러스를 공기부양식 생물반응기를 이용하여 단시간에 대량배양생산할 수 있을 뿐만 아니라 이로부터 제조된 녹차 캘러스 추출물을 이용하여 항염 또는 항알러지 효능을 갖는 피부 개선능이 있는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위해 녹차의 종자를 MS 배지에 넣어 조직배양시켜 캘러스를 유도 및 증식한 뒤, 공기부양식 생물반응기를 이용하여 대량배양생산하여 항염증 및 항알러지 활성을 최대화하고, 항염증 및 항알러지 활성을 갖는 녹차 캘러스 추출물을 제조하고, 인체 유래의 각질형성 세포와 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포를 이용하여 녹차 캘러스 추출물이 세포독성 감소 효과, IL-1∝와 IL-6의 발현 억제, Total NO의 생성 억제, β-hexosaminidase A 생성 억제 등의 우수한 항염증 및 항알러지 효과를 가지는 물질임을 확인하였다.

실시예 1. 녹차 캘러스의 대량생산

1.1 녹차 캘러스의 유도

녹차 종자를 70 % 알콜로 1분간 표면살균 후, 0.4 % 락스로 20분간 가끔씩 흔들어주면서 살균하여 멸균수로 4회 세척하였으며, 표면 살균된 순채 종자의 발아를 위한 배양배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962)배지의 모든 무기염류 농도를 1/2로 낮추고 0.4 mg/L 티아민(thiamine)ㆍHCl, 100 mg/L 미오-이노시톨(myo-inositol), 30 g/L 슈크로즈(sucrose) 및 4 g/L 젤라이트(Gelrite) 가 첨가된 배지를 기본배지 (1/2 MS 배지)로 사용하였다. 모든 배지의 pH 는 고압살균전에 1N NaOH 용액을 사용하여 5.8로 조정하였으며, 멸균한 배지의 25 mL를 Petri dishes (90 x 17 mm)에 분주하였다.

녹차의 접합자배로부터 배발생 캘러스와 체세포배 형성 위해 표면 살균된 종자를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 2 mg/L가 첨가된 1/2 MS 배지에 치상하였다. 모든 배양은 25℃ 암배양 하였다. 6주 배양 후 치상된 접합자배로부터 백색의 구형 세포괴와 연황색의 캘러스가 형성되었으며 반복적으로 동일배지에 미성숙 체세포배를 현미경하에서 분리 및 적출한 뒤, 치상하여 배발생세포주를 유도 하였다.

1.2 배발생 세포주로부터 현탁배양계 확립

녹차 배발생 세포주로부터 현탁배양체계를 확립하기 위해, 초기의 연황색 캘러스를 사용하였다. 현탁배양의 개시를 위해 1 mg/L의 2,4-D가 첨가된 MS 배지에서 증식된 캘러스(약 1 g)을 멸균한 핀셋으로 조심스럽게 분해하여 동일조성의 액체배지 20 mL가 첨가된 250 mL Erlenmeyer flask로 옮겨준 다음, 25℃, 100 rpm으로 현탁배양을 개시하였다. 약 2주 배양 후, 동일 조성의 액체배지 20 mL를 첨가하여 2주 배양 하였다. 안정적인 증식을 확인한 이후, 현탁배양세포 1~5 mL를 동일조성의 액체배지 50 mL가 첨가된 250 mL Erlenmeyer flask로 옮겨 약 2~3주 간격으로 반복적으로 계대배양하여 선발하였다.

1.3 녹차 캘러스의 증식 및 수확

현탁배양으로 선발된 녹차 캘러스를 3L 공기부양식 생물반응기에서 2,4-D 1 mg/L, 수크로오스 30 g/L가 첨가된 MS 배지 250 mL에서 증식하였고, 2주 뒤에 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지 2L를 상기 3L 공기부양식 생물반응기에 추가로 공급하여 25±2의 암 조건에서 대량배양하여 2주 후에 수확하였다.

실시예 2. 녹차 캘러스 추출물의 제조

상기 3L 공기부양식 생물반응기에 4주간 대량배양생산한 MS 배지가 혼합된 녹차 캘러스를 1L 냉동 Stock 용기에 나누어 담아 냉동시켜 추출물 제조에 사용한다.

상기와 같이 수확하여 냉동시킨 녹차 캘러스를 45 항온수조에서 약 30분간 녹차 캘러스가 녹을 때까지 해동한 뒤, 호모기나이즈(Ika T-25)을 이용하여 8,000~15,000 rpm 조건에서 2~3분간 녹차 캘러스를 1L 냉동 Stock 용기 내에서 함께 고속 분쇄 처리하여 제조하였다. 분쇄된 녹차 캘러스를 초고압 유화기(마이크로플루다이져)를 통과하여 45, 1,000 bar에서 1회 분쇄하였다. 이렇게 분쇄된 녹차 캘러스를 No 2와 No 5C 여과지를 이용하여 1, 2차 감압여과 한 후, NA-12 여과판으로 감압여과시켜 녹차 캘러스 추출물을 제조하였다.

이렇게 제조된 녹차 캘러스 추출물의 미생물 오염을 막기 위하여 무균용기 멤브레인 필터(0.45㎛) 여과장치로 1회 여과한 후, 녹차 캘러스 추출물 160 mL를 동결건조하여 2.258 g을 얻었고, 이 녹차 캘러스 추출물을 1X PBS로 녹여 10 mg/mL의 stock을 만들어 DMEM 배지로 1/10씩 희석하여 세포에 처리하였다.

참고예 1. 실험용 인체 유래의 각질형성세포 배양

인체 유래의 각질형성세포주는 미국 표준 균주(American Type Culture Collection: ATCC)에서 구매하여 사용하였다.

각질형성세포는 10% FBS(GIBCO NY, USA), 1% penicillin- streptomycin(GIBCO NY, USA)을 첨가한 RPMI1640 배지에 부착 배양하였으며, 5% CO₂, 37 조건을 유지하였다.

참고예 2. 실험용 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포 배양

마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포주는 미국 표준 균주(American Type Culture Collection: ATCC)에서 구매하여 사용하였다.

Raw 264.7 대식세포는 10% FBS, 1% penicillin을 첨가한 DMEM 배지에 부착 배양하였으며, 5% CO₂, 37 조건을 유지하였다.

실험예 1. 참고예 1의 인체 유래의 각질형성세포에 대한 독성 평가

96-well plate에 well당 5×10³ μL의 참고예 1의 인체 유래의 각질형성세포가 들어있는 부유액 100 μL를 넣고, 24시간 배양하였다. 적절한 처리 농도와 각질형성세포 생존기간을 알기 위해 cell counting kit-8(CCK-8) solution(Dojindo, Japan)을 이용하여 세포독성 효과를 측정하였다.

부착된 각질형성세포에 실시예 2에 의해 제조된 녹차 캘러스 추출물을 0, 1, 10, 100 /mL, 1, 2, 4, 8, 16 mg/mL 총 9 point를 처리한 뒤, 48시간 배양하였다. 후에 CCK-8 solution 10 μL를 넣은 후, 1시간 배양하였다. Microplate reader(Sunrise, Tecan, Switzerland)를 사용하여 450에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 3회 반복하였다.

녹차 캘러스 추출물이 화장품 소재로 사용되었을 시, 안전한 소재임을 평가하기 위하여 각질형성세포의 생존력을 평가하였고, 그 측정결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, IC₅₀(Inhibitory Concentration 50)값이 약 2 mg/mL로 측정되었다.

녹차 캘러스 추출물 농도 100 /mL일 경우, 세포 생장율이 약 90% 이상으로 이 농도 내에서는 세포생장을 저해하지 않았다.

상기와 같은 세포 독성 시험 결과를 바탕으로 녹차 캘러스 추출물의 농도 구간을 5~100 /mL로 설정하여 이하의 실험예 2-5에서 항염 및 항알러지 효능 평가를 실시하였다.

참고예 3. 인체 유래의 각질형성세포 실험 배지(Media) 제조

96-well plate에 참고예 1의 세포를 seeding하고, 37, CO₂ 조건에서 24시간 배양 후에 참고예 1의 세포가 부착된 것을 확인한 뒤, 녹차 캘러스 추출물을 처리하였다. 30분뒤에 LPS 1 uL/ML(serum free media)를 넣고, 37에서 24시간 동안 전처리하여 인체 유래의 각질형성세포 실험 배지(Media)를 제조하였다.

참고예 4. 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포 실험 배지(Media) 제조

96-well plate에 참고예 2의 세포를 seeding하고, 37, CO₂ 조건에서 24시간 배양 후 참고예 2의 세포가 부착된 것을 확인한 뒤, 녹차 캘러스 추출물을 처리하였다. 30분뒤에 LPS 1 uL/ML(serum free media)를 넣고, 37에서 24시간 동안 전처리하여 마우스 유래의 Raw 264.7 대식세포 실험 배지(Media)를 제조하였다.

실험예 2. IL-1∝생성 억제 효과 실험

녹차 캘러스 추출물의 항염 효과 지표 중 하나인 IL-1∝의 발현 억제 효과를 측정하기 위해 참고예 1의 각질형성세포와 참고예 2의 Raw 264.7 대식세포를 대상으로 하는 실험을 수행하였다.

먼저 분석을 위해 참고예 3, 참고예 4의 실험 배지(Media)를 각각의 96-well plate에 200 uL 넣고, 상온에서 2시간 방치 후, 3회 세척하였다. 종결용액(Stop solusion)을 넣고, Microplate reader를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 3반복하였다.

상기 배지 내에 존재하는 IL-1∝의 양을 측정하였고, 그 측정결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, LPS 단독 처리시 IL-1∝ 생성량이 급격히 증가하였으며, 이에 녹차 캘러스 추출물 50 ㎍/mL를 처리하였을 시, 그래프 A의 각질형성세포 처리군에서는 LPS 단독 처리구 대비 100%에 가까운 IL-1a 생성 억제 효과를 보여 강력한 항염 효과가 있었다. 그래프 B의 Raw 264.7 대식세포 처리군에서는 LPS 단독 처리구 대비83% 수준에 가까운 뛰어난 항염 효과를 보였다.

실험예 3. IL-6 생성 억제 효과 실험

녹차 캘러스 추출물의 항염 효과 지표 중 하나인 IL-6의 발현 억제 효과를 측정하기 위해 참고예 1의 각질형성세포와 참고예 2의 Raw 264.7 대식세포를 대상으로 하는 실험을 수행하였다.

먼저 분석을 위해 참고예 3, 참고예 4의 실험 배지(Media)를 각각의 96-well plate에 100 uL 넣고, 상온에서 1시간 방치 후, 4회 세척하였다. 항체(antibody)를 넣고 1시간, conjugate를 넣고 30분 후, 다시 4회 세척하였다. 종결용액(Stop solusion)을 넣고, Microplate reader를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 3반복하였다.

상기 실험 배지 내에 존재하는 IL-6의 양을 측정하였다. 상기 측정 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 LPS 단독 처리시 IL-6 생성량이 급격히 증가하였으며, 녹차 캘러스 추출물 10 ㎍/mL를 처리하였을 때, 그래프 A의 각질형성세포와 그래프 B의 Raw 264.7 대식세포에서 LPS 단독 처리구 대비 각각 55%, 93%의 생성 억제 효과를 보였다. 특히 Raw 264.7 대식세포에서 뛰어난 항염효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 4. Total NO 생성 억제 효과 실험

녹차 캘러스 추출물의 항염 효과 지표 중 하나인 Total NO 생성 억제 효과를 측정하기 위해 참고예 1의 각질형성세포와 참고예 2의 Raw 264.7 대식세포를 대상으로 하는 실험을 수행하였다.

먼저 분석을 위해 참고예 3, 참고예 4의 실험 배지(Media)를 각각의 96-well plate에 100 uL 넣고, 37에서 1시간 동안 전처리한 뒤, 실시예 2에 의해 제조된 녹차 캘러스 추출물 100μL, 그리스 시약(Griess reagent) 50 μL를 처리하였다. 10분 뒤에 Microplate reader(Sunrise, Tecan, Switzerland)를 사용하여 525에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 3회 반복하였다.

상기 배지 내에 존재하는 NO의 생성량을 측정하였고, 그 측정 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이 LPS 단독 처리시 NO 생성량이 급격히 증가하였다. 추출물 100 ㎍/mL를 처리한 경우 그래프 A의 각질형성세포와 그래프 B의 Raw 264.7 대식세포에서 LPS 단독 처리구 대비 76~77%의 NO 생성 억제 효과를 보여 control과 유사한 양의 NO가 측정되어 뛰어난 항염효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 5. β-hexosaminidase A 분석

녹차 캘러스 추출물의 항알러지 효과 지표 중 하나인 β-hexosaminidase A 생성 억제 효과를 측정하기 위해 참고예 1의 각질형성세포와 참고예 2의 Raw 264.7 대식세포를 대상으로 하는 실험을 수행하였다.

먼저 분석을 위해 참고예 3, 참고예 4의 실험 배지(Media)를 각각의 96-well plate에 100 uL 넣고, 37에서 2시간 배양 후 종결용액(stop solution) 50 uL를 넣은 후 Microplate reader를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군은 3회 반복하였다.

상기 실험 배지 내에 존재하는 β-hexosaminidase A의 양을 측정하였고, 그 측정 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이 LPS 단독 처리시 β-hexosaminidase A 생성량이 급격히 증가하였고, 녹차 캘러스 추출물 50 ㎍/mL 처리하였을 때는 그래프 A의 각질형성세포보다는 그래프 B의 Raw 264.7 대식세포에서 결과가 우수하였다. Raw 264.7 대식세포에 녹차 캘러스 추출물 50 ㎍/mL를 처리하였을 때 71%의 생성 억제 효과를 보였다. 결과적으로 녹차 캘러스 추출물은 항원 자극에 의한 세포의 탈 과립 효과를 감소시킴으로써 항알러지 효과를 나타낸다고 볼 수 있다.

이러한 결과들을 종합하여 고찰해 볼 때, 녹차 캘러스 추출물의 농도는 5~100 ㎍/mL 일 때 세포 독성이 없으며, 50 ㎍/mL 농도에서 최대의 항염, 항알러지 효과가 있어 염증과 알러지 반응으로 유도되는 다양한 사이토키닌(cytokine)과 효소들의 발현을 억제하는 복합적인 항염 및 항알러지 작용기전이 있는 것으로 생각된다. 따라서 녹차 캘러스 추출물은 외부 자극에 의해서 발생할 수 있는 피부 손상을 효과적으로 보호하고, 염증을 완화할 수 있는 화장품 소재로써 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

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녹차 종자를 멸균 세척하여 무기염류 농도를 1/2로 낮춘 pH 5.8인 1/2 MS(Murashige and Skoog, 1962) 고체배지에서 25℃ 암배양하여 신장시킨 접합자 배로부터 체세포 배를 형성한 후, 캘러스를 유도시키는 제1단계와; 유도된 녹차 캘러스를 제1단계의 MS 배지로 옮겨 3주 간격으로 25±2℃의 암 조건에서 계대배양하여 안정화시키는 제2단계와; 이,사-디(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)와 수크로오스가 첨가된 MS 배지에 유도된 녹차 캘러스를 접종한 후에 25±2℃의 암 조건에서 3주간 현탁배양하는 제3단계와; 현탁배양된 녹차 캘러스를 공기부양식 생물반응기내에서 제3단계의 MS 배지를 이용하여 증식하는 제4단계; 및 증식된 녹차 캘러스를 2주 후에 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지 2L를 상기 생물반응기에 추가하여 25±2℃의 암 조건에서 대량배양생산하는 단계;를 포함하는 녹차 캘러스 추출물 제조방법에 있어서,
(1) 대량배양생산된 녹차 캘러스를 4주간 MS 배지에서 배양한 뒤, 상기 MS 배지가 혼합된 녹차 캘러스를 용기에 나누어 담아 냉동시키는 제1냉동단계와;
(2) 제1냉동단계에 의해 냉동된 녹차 캘러스를 항온수조에서 녹차 캘러스가 녹을 때까지 일정시간 해동한 뒤, 호모기나이즈를 이용하여 8,000~15,000 rpm 조건에서 일정시간 녹차 캘러스를 상기 용기 내에서 함께 고속 분쇄 처리하는 제2분쇄단계와;
(3) 제2분쇄단계에 의해 분쇄된 녹차 캘러스를 초고압 유화기(마이크로플루다이져)를 이용하여 분쇄하는 제3분쇄단계와;
(4) 제3분쇄단계에 의해 분쇄된 녹차 캘러스를 여과지를 이용하여 감압여과 한 후, 여과판으로 감압여과시켜 추출제조하는 제4감압여과단계;를 포함하는 녹차 캘러스 추출물을 함유하는 항염증 화장료 조성물의 제조방법.