KR20180078434A - 쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 - Google Patents

쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은, LPS를 500 ng/ml 처리한 RAW 264.7 세포(2×105 cell/well)를 기준으로 할 때 쑥부쟁이 물 추출물 또는 쑥부쟁이 70% 에탄올 추출물을 25~200 ug/ml로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 항염증 기능성은 세포 독성이 없고, NO 및 PGE2의 생성을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하는 효능에 근거한다.

Description

쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물{A COMPOSITION COMPRISING YOMENA ASTER EXTRACT FOR PREVENTING, IMPROVING OR TREATING INFLAMMATION}
본 발명은 쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은, LPS를 500 ng/ml 처리한 RAW 264.7 세포(2×105 cell/well)를 기준으로 할 때 쑥부쟁이 물 추출물 또는 쑥부쟁이 70% 에탄올 추출물을 25~200 ug/ml로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 항염증 기능성은 세포 독성이 없고, NO 및 PGE2의 생성을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하는 효능에 근거한다.
쑥부쟁이(Aster yomena (Kitam.) Honda)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 다년생 초본으로 권영초, 왜쑥부쟁이, 가새쑥부쟁이라고도 하며 습기가 약간 있는 산과 들에서 자란다.
쑥부쟁이는 꽃이 없는 어린 상태에서 줄기에 붙어 있는 잎만 관찰하면 쑥 종류(Artemisisa spp.)와 흡사하지만, 완전히 다른 종류다. 쑥부쟁이는 높이가 30~100cm 정도이고, 잎의 길이는 5~6cm, 폭은 2.5~3.5cm인 타원형이며, 잎자루가 길고 잎 끝에 큰 톱니와 털이 있고 처음 올라온 잎은 꽃이 필 때 말라 죽는다. 쑥부쟁이의 꽃은 가지 끝과 원줄기 끝에 여러 송이가 달리며, 열매는 9~10월경에 달리고 종자 끝에 붉은빛이 도는 갓털이 달리며 길이는 2.5~3mm 정도이다.
쑥부쟁이는 원예 및 조경용으로 쓰이지만, 쑥부쟁이의 잎과 어린순은 식용으로도 쓰인다. 쑥부쟁이 잎은 비타민 A 및 C가 풍부하고 식이섬유 등이 다량 함유되어 있어 소화를 잘되게 하며 혈압을 내리고, 기침과 천식에 좋아 즙을 내어 마시며 벌레 물린 곳에 사용하며 한방에서는 해열제와 이뇨제로 쓰인다. 또한, 꽃이 피었을 때 쑥부쟁이 잎과 줄기를 말려 감초를 넣고 달인 물을 하루 3회 공복에 마시면 어깨 결림에서 오는 심한 통증 및 복통을 가라앉힐 수 있다.
본 발명자들은 쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 안출하였는바, 이하 선행특허문헌을 살펴본다.
대한민국 공개특허공보 제10-2016-0010884(2016.01.28. 공개)호를 보면, 항염증 활성이 우수한 섬쑥부쟁이 분획물에 대해서 기재되어 있다. 개략적으로 살펴보면, 섬쑥부쟁이(Aster glehni)로부터 분리한 항염증 활성을 갖는 화합물을 주요 기술적 특징으로 하고 있다. 본 발명과 대비하여 보면, 본 발명은 쑥부쟁이(Aster yomena (Kitam.) Honda)에 관한 것이고, 상기 특허문헌은 울릉도에서만 자생하는 다년생 풀(속칭 : 부지깽이 나물)로서 속은 같으나 종이 다르다. 또한, 본 발명은 쑥부쟁이의 열수 또는 에탄올 추출물을 이용한 약리효과에 근거하고 있는데 비해, 상기 특허문헌은 6'-O-카페오일로세오사이드 (6'-O-caffeoylroseoside; 화합물 1), 6'-O-카페오일디히드로시린진 (6'-O-caffeoyldihydrosyringin; 화합물 2) 및 글레노사이드 (glehnoside; 화합물 3)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물의 약리효과에 근거를 두고 있는바, 본 발명에 따른 쑥부쟁이 추출물에서는 별도 화합물을 분리 정제를 할 필요가 없기 때문에 생산 비용 측면에서 효과가 현저하다. 또한, 본 발명은 잎 전체를 이용하여 추출된 전체 성분의 기능성에 근거하고 있지만, 상기 특허문헌은 특정 물질의 기능성에 근거하고 있으므로 양자의 약리 효과가 상이하다고 하겠다.
대한민국 공개특허공보 제10-2016-0010884호 (2016.01.28. 공개)
본 발명의 목적은 쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은, 쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 약학적 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
구체적으로는, 상기 쑥부쟁이 추출물은 열수 추출물 또는 70 중량% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 쑥부쟁이 추출물은 LPS(Lipopolysaccharides)를 500 ng/ml 처리한 RAW 264.7 세포(2×105 cell/well)를 기준으로 할 때 25~200 ug/ml인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 항염증 기능성은 세포 독성이 없고, NO 및 PGE2의 생성을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하는 효능에 근거한다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 LPS에 의한 NO의 생성을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 LPS에 의한 PGE2의 생성을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 LPS에 의한 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
도 1은 RAW 264.7 세포에서 쑥부쟁이 물 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 쑥부쟁이 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.
도 3은 쑥부쟁이 물 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 쑥부쟁이 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 쑥부쟁이 물 추출물의 농도별로 PGE2 생성량을 비교한 결과이다.
도 6은 쑥부쟁이 에탄올 추출물의 농도별로 PGE2 생성량을 비교한 결과이다.
도 7a 내지 7c는 쑥부쟁이 물 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량, IL-6 생성량 및 IL-1β 생성량을 각각 나타낸 결과이다.
도 8a 내지 8c는 쑥부쟁이 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량, IL-6 생성량 및 IL-1β 생성량을 각각 나타낸 결과이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1. 쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물
쑥부쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제조한다.
쑥부쟁이의 잎, 줄기 및/또는 뿌리를 물, 에탄올 또는 메탄올 또는 기타 유기용매를 이용하여 추출 또는 분획추출한 후에 분리 동정한다. 추출용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및 잔류성분 처리 방식 등을 달리하여 처리한다.
바람직하게, 쑥부쟁이의 잎을 열수 또는 70 중량% 에탄올을 이용하여 추출한 추출물을 이용한다.
본 발명에 따른 조성물은, LPS를 500 ng/ml 처리한 RAW 264.7 세포(2×105 cell/well)를 기준으로 할 때 쑥부쟁이 물 추출물 또는 쑥부쟁이 70% 에탄올 추출물을 25~200 ug/ml로 포함하도록 한다.
쑥부쟁이 추출물 이외의 약제학적으로 허용된 첨가제나 식품학적으로 허용된 첨가제를 이용하여 사용목적에 맞게 조성물을 제조한다.
참고예 1. 실험 준비
1-1. 실험 재료
쑥부쟁이 물 추출물 (Water extract) 및 쑥부쟁이 70중량% 에탄올 추출물 (EtOH extract)을 이용한다.
실험에 사용한 쑥부쟁이는 주관기관인 구례 쑥부쟁이 영농조합법인에서 재배하고 있는 것을 이용하였다. 쑥부쟁이 잎을 채취하여 세척한 후 그늘에서 건조하여 분쇄한 후 혼합물의 10배 용량의 증류수을 첨가하여 105℃ 3시간 동안 3회 열수추출한 후 여과하여 불순물을 제거하였다. 또한 혼합물의 10배 용량의 70% 에탄올을 첨가하여 3시간 동안 3회 추출하여 여과하여 불순물을 제거하였다.
열수 추출 시료 및 에탄올 추출 시료는 Freeze dry(PVTFD20R, 일신랩(주), 대한민국)를 사용하여 동결건조(Ilshin, Korea) 시킨 후 실험 시료로 사용하였다.
1-2. 세포주 및 세포배양
Raw 264.37 세포주는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10% fetal Bovine serum (FBS)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)을 사용하여, CO2 배양기 (MCO-17A1, Sanyo, Osaka, Japan)에서 온도 37℃ 조건에서 배양하였다.
1-3. 세포 독성 평가 (MTS 분석)
물 추출물, 70% 에탄올 추출물의 RAW 264.7에 대한 세포 독성효과를 측정하기 위해 MTS assay를 실시하였다. 96 well plate에 2 × 105 cells/㎖로 분주하여 24시간 동안 배양하였고 10% FBS DMEM 조건에서 시료를 농도별로 처리해 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각각 10 ㎕의 MTS 용액을 첨가한 후 37℃에서 4시간 동안 배양한 다음 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Mnnedrf, Switzerland)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-4. Nitiric oxide (NO) 농도 측정
LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 물 추출물, 70% 에탄올 추출물의 NO 생성 억제를 측정하기 위해 시료를 여러 농도로 처리하고 LPS (500 ng/㎖)를 24시간 동안 처리 하였다. 그 후 griess reagent system을 이용하여 NO를 측정하였으며, 96 well plate에 세포 배양 상등액과 griess reagent를 1 : 1로 혼합하여 넣고 10분 동안 반응시킨 후 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Mnnedrf, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-5. Prostaglandin E2 ( PGE2 ) 측정
물 추출물, 70% 에탄올 추출물의 PGE2 분비 억제능을 측정하기 위해 ELISA kit를 이용하여 분석하였다. RAW 264.7 세포를 96 well plate에 2 × 105 cells/㎖로 분주하여 배양하였고, 10% FBS DMEM 조건에서 시료를 농도별로 전처리하고 2시간 후에 LPS (500 ng/㎖)를 각각 처리한 다음 RAW 264.7 세포를 24시간 배양하였다. 그 후 세포배양 상층액을 취하여 ELISA kit 사용자 매뉴얼에 기재된 방법대로 정량하여 분석하였다.
1- 6.Cytokines ( TNF -α, IL- , IL-6) 측정
염증성 사이토카인 생성에 미치는 추출물의 효과를 확인하기 위해 LPS (500 ng/㎖)로 RAW 264.7 세포를 자극하기 전, 물 추출물 또는 70% 에탄올 추출물을 30분 동안 전처리 하였다. LPS로 24시간동안 자극한 뒤 사이토카인 측정을 위해 세포상층액을 이용하여 ELISA kit의 매뉴얼대로 실험을 수행하였다.
1-7. 통계처리
본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 나타내었으며, 통계처리는 SPSS(18.0, Statistical Package for Social Science Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 일원변량분석(One way ANOVA)을 실시한 후 세포실험은 Student's t-test로 동물실험은 Duncan's multiple range test로 유의성을 p<0.05 수준에서 검증하였다.
실험예 1. 물 추출물의 RAW 264.7 세포주에서의 세포생존율에 미치는 영향
도 1은 RAW 264.7 세포에서 쑥부쟁이 물추출물을 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.(RAW 264.7 cells were incubated for 24 hrs in the presence or absence of water extract indicated dose. Cell viability was evaluated by MTS assay as described in materials and methods. statistical significance: * p < 0.05, ** p < 0.01 when compared to the control. Significant differences between treated groups were determined using the Student's t-test. Data represent the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiments.)
도 1을 살펴보면, MTS 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과 쑥부쟁이 물 추출물 25~200 ug /ml 농도에서 세포독성이 없음을 알 수 있다.
실험예 2. 에탄올 추출물의 RAW 264.7 세포주에서의 세포생존율에 미치는 영향
도 2는 RAW 264.7 세포에서 쑥부쟁이 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.(RAW 264.7 cells were incubated for 24 hrs in the presence or absence of Etoh extract indicated dose. Cell viability was evaluated by MTS assay as described in materials and methods. statistical significance: * p < 0.05, ** p < 0.01 when compared to the control. Significant differences between treated groups were determined using the Student's t-test. Data represent the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiment.)
도 2를 살펴보면, MTS 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과 쑥부쟁이 에탄올 추출물 25~200 ug /ml 농도에서 세포독성이 없음을 알 수 있다.
실험예 3. 물 추출물의 NO 생성 억제 효과
도 3은 쑥부쟁이 물 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.( RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of Water extract for 30 minutes before being incubated with LPS (500 ng/ml) for 24 hours. Statistical significance: * p < 0.05, ** p < 0.01 when compared to the control group; #p < 0.05, ##p < 0.01 when compared to the LPS alone treated group. Significant differences between treated groups were determined using the Student's t-test. Values shown are the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiments. CON : control, LPS : LPS treated.)
도 3을 살펴보면, 물 추출물을 30분간 전처리한 후에 LPS 500 ng /ml로 24시간 배양한 결과, 농도의존적으로 NO 생성량을 억제함을 알 수 있다.
실험예 4. 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과
도 4는 쑥부쟁이 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.(RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of Etoh extract for 30 minutes before being incubated with LPS (500 ng/ml) for 24 hours. Statistical significance: * p < 0.05, ** p < 0.01 when compared to the control group; #p < 0.05, ##p < 0.01 when compared to the LPS alone treated group. Significant differences between treated groups were determined using the Student's t-test. Values shown are the mean ± S.D. of triplicate determinations from three separate experiments. CON : control, LPS : LPS treated.)
도 4를 살펴보면, 에탄올 추출물을 30분간 전처리한 후에 LPS 500 ng /ml로 24시간 배양한 결과, 농도의존적으로 NO 생성량을 억제함을 알 수 있다.
실험예 5. 물 추출물의 PGE2 생성 억제 효과
도 5는 물 추출물의 PGE2 생성 억제 효과를 나타낸 도면이다.(RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of Water extract for 30 minutes before being incubated with LPS (500 ng/ml) for 24 hours. The culture supernatant was collected, and the levels of PGE2 was analyzed using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The values are expressed as the means ± S.D. abcdeMeans not. sharing a common letter are significantly different between groups based on one-way ANOVA with Duncan's multiple-range post hoc test (DMRT) at p < 0.05.)
도 5를 살펴보면, 물 추출물을 30분간 전처리한 후에 LPS 500 ng /ml로 24시간 배양한 결과, 농도의존적으로 PGE2 생성량을 억제함을 알 수 있다.
실험예 6. 에탄올 추출물의 PGE2 생성 억제 효과
도 6은 에탄올 추출물의 PGE2 생성 억제 효과를 나타낸 도면이다.(RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of Etoh extract for 30 minutes before being incubated with LPS (500 ng/ml) for 24 hours. The culture supernatant was collected, and the levels of PGE2 was analyzed using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The values are expressed as the means ± S.D. abcdMeans not. sharing a common letter are significantly different between groups based on one-way ANOVA with Duncan's multiple-range post hoc test (DMRT) at p < 0.05.)
도 6을 살펴보면, 에탄올 추출물을 30분간 전처리한 후에 LPS 500 ng /ml로 24시간 배양한 결과, 농도의존적으로 PGE2 생성량을 억제함을 알 수 있다.
실험예 7. 물 추출물의 염증성 사이토카인 생성 억제 효과
도 7a 내지 7c는 쑥부쟁이 물 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량, IL-6 생성량 및 IL-1β 생성량을 각각 나타낸 결과이다.(RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of Water extract for 30 minutes before being incubated with LPS (500 ng/ml) for 24 hours. The culture supernatant was collected, and the levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β were analyzed using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The values are expressed as the means ± S.D. abcdeMeans not. sharing a common letter are significantly different between groups based on one-way ANOVA with Duncan's multiple-range post hoc test (DMRT) at p < 0.05.)
도 7a 내지 7c를 살펴보면, 물 추출물을 30분간 전처리한 후에 LPS 500 ng /ml로 24시간 배양한 결과, 농도의존적으로 염증성 사이토카인의 생성을 억제함을 알 수 있다.
실험예 8. 에탄올 추출물의 염증성 사이토카인 생성 억제 효과
도 8a 내지 8c는 쑥부쟁이 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량, IL-6 생성량 및 IL-1β 생성량을 각각 나타낸 결과이다.(RAW 264.7 cells were pretreated with the indicated concentration of Etoh extract for 30 minutes before being incubated with LPS (500 ng/ml) for 24 hours. The culture supernatant was collected, and the levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β were analyzed using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The values are expressed as the means ± S.D. abcdefMeans not. sharing a common letter are significantly different between groups based on one-way ANOVA with Duncan's multiple-range post hoc test (DMRT) at p < 0.05.)
도 8a 내지 8c를 살펴보면, 에탄올 추출물을 30분간 전처리한 후에 LPS 500 ng /ml로 24시간 배양한 결과, 농도의존적으로 염증성 사이토카인의 생성을 억제함을 알 수 있다.

Claims (5)

  1. 쑥부쟁이(Aster yomena (Kitam.) Honda) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 쑥부쟁이 추출물은 열수 또는 70중량%에탄올로 추출한 것을 특징으로 하는 항염증 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 쑥부쟁이 추출물은,
    LPS를 500 ng/ml 처리한 RAW 264.7 세포(2×105 cell/well)를 기준으로 할 때,
    25~200 ug/ml인 것을 특징으로 하는 항염증 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 쑥부쟁이 추출물은,
    세포 독성이 없고, NO 및 PGE2의 생성을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 저해하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 항염증 약학적 조성물.
  5. 쑥부쟁이(Aster yomena (Kitam.) Honda) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200072619A (ko) * 2018-12-12 2020-06-23 대한민국(농촌진흥청장) 생리활성 기능성이 증진된 쑥부쟁이 유산균 발효물

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