KR20210060797A - 시호 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항염증용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물은 세포독성이 없고, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P.acnes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S.aureus) 등 여드름 원인균에 대한 항균 효과가 우수하며, 사이토카인 생성을 제어하는 NF-kB 단백, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 일산화질소(NO) 발생을 억제할 수 있으므로, 피부 염증 완화 및 치료효과가 있어 여드름 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

시호 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항염증용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR ANTI-MICROBIAL OR ANTI-INFLAMMATORY COMPRISING BUPLEURUM FALCATUM COMPLEX EXTRACTS}

본 발명은 시호 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부에서의 염증 반응(inflammatory response)은 물리적 자극이나 화학 물질, 세균 등에 의해 피부손상이 유발될 때 이를 방어하기 위한 작용으로서 시작되며, 다양한 면역세포와 염증 유도 사이토카인이 관여한다. TNF-α(tumor mecrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8) 등이 대표적인 염증 유도 사이토카인이다. 또한 활성화된 대식세포(macrophage)는 염증 유도 사이토카인 뿐만 아니라 일산화질소(nitric oxide: NO)나 프로스타글란딘(prostaglandin) E2(PGE2)를 과도하게 생성하여 염증 과정을 더욱 활성화시킨다.

염증성 피부 장애가 초래할 수 있는 질환 중 하나인 여드름(acne vulgaris)은 주로 사춘기에 일어나는 호르몬의 변화에 의한 피지선 내의 염증성 피부 질환이다. 여드름의 원인으로는 안드로겐에 의해 활성화된 과다한 피지 생성과 피지선의 확대, 모피지선내의 표피 각질 형성세포들의 증식, 모낭 각질세포들의 불완전한 탈락과 이에 의한 모피지선의 막힘, 그리고 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P.acnes)라 불리우는 박테리아에 의한 염증 등이 잘 알려져 있다.

한편, 지금까지 알려진 치료제로는 여러가지 형태의 레티놀산이 있는데, 이는 피부의 피지 생성을 억제하며 피지선의 확대를 막아준다. 또한, P.acnes의 번식을 억제하는 항생제 요법도 여드름의 효과적인 치료법으로 알려져 있다. 그러나, 레티놀산이나 항생제의 경우 피부에 자극적이기 때문에 염증을 오히려 악화시킬 수 있고, 박테리아 내성 등 부작용을 가지기 때문에 사용에 제한이 있다.

본 발명은, 시호, 황금, 후박 및 오미자가 특정 중량부 비로 포함되는 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항염증 효과를 갖는 화장료 조성물, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 명세서에서는, 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 명세서에서는 상기 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물은 물, 에탄올 및 메탄올 중 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 용매추출물인, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 명세서에서는 상기 복합추출물은 상기 용매추출물을 아세톤, 헥산, 에탄올 및 물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종의 분획용매로 분획하여 얻은 분획추출물인, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 명세서에서는, 상기 복합추출물은, 시호 추출물 40 내지 50 중량부, 황금 추출물 10 내지 20 중량부, 후박 추출물 25 내지 35 중량부 및 오미자 추출물 5 내지 15 중량부를 포함하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 명세서에서는 상기 항균 또는 항염증용 화장료 조성물을 유효성분으로 함유하는, 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물은 세포독성이 없고, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P.acnes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S.aureus) 등 여드름 원인균에 대한 항균 효과가 우수하며, 사이토카인 생성을 제어하는 NF-kB 단백, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 일산화질소(NO) 발생을 억제할 수 있으므로, 피부 염증 완화 및 치료효과가 있어 여드름 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물의 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물의 항염 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물의 DPPH scarvensing activity를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물의 항균 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물에 대해서 보다 상세하게 설명하기로 한다. 한편, 본 발명의 명세서 및 청구범위 전반에서 사용되는 용어인 "항염증"은 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 발명 억제 또는 지연을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 항염증용 화장료 조성물은 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

시호(柴胡)는 미나리과(Apiaceae/Umbelliferae)에 속하며, 우리나라 각처의 산이나 들에 나는 다년초로, 개화기는 8~9월이고 결실기가 9~10월이다. 시호는 북시호(北柴胡), 산채(山菜), 시초(柴草), 시호(柴胡), 여초(茹草), 자초(滋草), 자호((刺虎), 지훈, 참시호, 큰일시호, 협엽시호(狹葉柴胡), 북시호(北柴 胡, 동속근연식물), 왕시호(동속근연식물), 섬시호(동속근연식물), 개시호(동속근연식물), 대엽시호(大葉柴胡) (동속근연식물), 참시호(동속근연식물), 협엽시호(狹葉柴胡, 동속근연식물) 등의 여러 가지 이름으로 부른다. 시호 약재는 단일 또는 갈라진 뿌리로 윗부분은 굵으며 지름 5-15㎜이고, 아랫부분은 가늘고 길이 10-15㎝이며 근두부에는 줄기의 기부가 남아 있고, 바깥면은 엷은 갈색-갈색이며 깊은 주름이 있고 꺾어지기 쉬우며 꺾은 면은 약간 섬유성이다. 시호는 사이코사포닌(Saikosaponin), 스테롤화합물, 플라보노이드, 쿠마린과 그 외에 정유성분 등을 함유하고 있으며, 시호에서 추출한 사이코사포닌 D는 간손상에 대한 억제 효과를 나타내고, 뇨단백 배설억제, 혈중 콜레 스테롤 감소 효과 및 항암효과가 확인되었다. 사이코사포닌 A(Saikosaponin A)는 기니피그 실험에서 천식을 억제하고 히스타민에 의한 기관지 수축을 억제하는 등 알레르기성 천식에 대한 치료 효과가 있으며, 그 밖에도 시호는 만성 위궤양에 효과가 있음이 밝혀졌고, 혈관 내에서 콜레스테롤의 농도를 감소시키고, 혈소판에 의한 혈액 응집도 억제하여 고지혈증에 탁월한 효과가 있다고 알려져 있다.

황금(黃芩)은 꿀풀과에 속하는 여러해살이 초본식물인 황금(Scutellaria baicalensis GEORGE)의 뿌리로 만든 약재이다. 황금(Scutellaria baicalensis GEORGE)은 산지의 풀밭에서 자라며, 높이가 20 내지 60㎝이다. 여러 대가 나와 포기로 자라고 털이 있으며 가지가 갈라진다. 잎은 마주나고 바소꼴이며 가장자리가 밋밋하다. 열매는 9월에 결실하며 둥근 모양으로 꽃받침 안에 들어 있다. 원뿌리는 원뿔형이고 살이 황색이다. 한방에서 뿌리를 해열·이뇨·지사·이담 및 소염제로 이용한다. 황금의 주요 성분 중 하나인 바이칼린(Baicalin)은 항당뇨 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

후박(厚朴)은 목련과(Magnoliaceae)에 속하는 낙엽교목으로서, 그 기원이 중국인 당후박(Magnolia officinalis)과 일본인 화후박(Magnolia obovata Thunberg)으로 구분되며, 한방적으로 조습소담(燥濕消痰), 하기제만(下氣除萬)의 효능을 지니고 있어 습체상중(濕滯像中), 완비토사(脘肥吐瀉), 식적 기체(食積氣滯), 복창변비(腹脹便秘), 담음천해(痰飮喘咳)를 치료한다. 후박의 성분으로는 알파, 베타, 감마-오이데스몰(α, β, γ-eudesmol) 등의 정유, 마그놀올(magnolol), 호노키올(honokiol), 테트라하이드로마그놀올(tetrahydromagnolol), 마그노큐라린(magnocurarine), 마그노플로린 (magnoflorine), 오보바톨(obovatol), 오보바탈데하이드(obovataldehyde), 사포닌 등이 함유되어 있다.

오미자(五味子)는 오미자과의 낙엽 덩굴식물로서, 종류에는 오미자(북오미자)·남오미자·흑오미자 등이 있으며, 주로 태백산 일대에 많이 자라고 남오미자는 남부 섬지방, 흑오미자는 제주도에서 자란다. 시잔드린(Schizandrin)·고미신·시트럴·사과산·시트르산 등의 성분이 들어 있어 심장을 강하게 하고 혈압을 내리며 면역력을 높여 주어 피로 회복, 자양 강장제로 쓰며, 폐의 기능을 강하게 하고 진해, 거담 작용이 있어서 기 침이나 갈증 등을 치료하는 도움을 주는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 시호, 황금, 후박 및 오미자 각 성분을 특정 중량부로 포함하는 복합추출물이 세포독성이 없으면서도, 여드름의 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P.acnes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S.aureus) 등에 대한 항균 효과가 우수하며, 사이토카인 생성을 제어하는 NF-kB 단백, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 일산화질소(NO) 발생을 억제할 수 있으므로, 피부 염증 완화 및 치료효과가 있어 여드름 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다는 점을 실험을 통해 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따른 복합추출물은 물, 에탄올, 및 메탄올 중 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 용매추출물일 수 있으며, 상기 추출 방법으로는 당해 기술분야에 통상적으로 알려진 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법 및 압착법 중 선택되는 1종 이상의 추출 방법을 선택하여 수행하는 것일 수 있다.

일례로 상기 복합추출물은 시호를 에탄올 50% 용액에 2시간 동안 추출한 추출물, 황금을 100% 증류수에 2시간 동안 추출한 추출물, 후박을 에탄올 50% 용액에 2시간 동안 추출한 추출물, 오미자를 에탄올 50% 용액에 2시간 동안 추출한 추출물을 혼합한 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 복합추출물은 상기 용매추출물을 부탄올, 아세톤, 헥산, 에탄올 및 물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 분획용매로 분획하여 얻은 분획추출물일 수 있다.

일례로, 상기 복합추출물은 상술한 방법으로 얻은 시호 추출물을 에탄올 50% 용액 및 부탄올(BuOH)을 1 : 1의 중량부 비로 혼합한 분획용매에서 0.5 시간 동안 분획하여 얻은 시호 분획추출물, 상술한 방법으로 얻은 황금 추출물을 100% 증류수 및 아세톤(Aceton)을 1 : 1의 중량부 비로 혼합한 분획용매에서 0.5 시간 동안 분획하여 얻은 황금 분획추출물, 상술한 방법으로 얻은 후박 추출물을 에탄올 50% 용액 및 헥산(Hexane)을 1 : 1의 중량부 비로 혼합한 분획용매에서 0.5 시간 동안 분획하여 얻은 후박 분획추출물 및 상술한 방법으로 얻은 오미자 추출물을 혼합한 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따른 상기 복합추출물은 시호 추출물 40 내지 50 중량부, 황금 추출물 10 내지 20 중량부, 후박 추출물 25 내지 35 중량부 및 오미자 추출물 5 내지 15 중량부를 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 상세하게는 시호 추출물 45 중량부, 황금 추출물 15 중량부, 후박 추출물 30 중량부 및 오미자 추출물 10 중량부를 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 복합추출물 내에 시호, 황금, 후박 및 오미자가 상술한 중량부 비로 포함되는 경우, 세포독성이 없고, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P.acnes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S.aureus) 등 여드름 원인균에 대해 우수한 항균 효과를 나타내며, 사이토카인 생성을 제어하는 NF-kB 단백, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 일산화질소(NO) 발생을 효과적으로 억제할 수 있어, 피부 염증 완화 및 치료 효과를 기대할 수 있고, 이에 따라 여드름 예방 또는 개선 용도로 사용하기에 적합하다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따른 항균 또는 항염증용 화장료 조성물을 유효성분으로 함유하는, 화장료 조성물은 여드름 예방 또는 개선 효능이 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 것 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 본 기술 분야에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 젤 등과 같이 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등 다양한 형태로 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

일례로, 상기 화장료 조성물은 피부 외용제의 제형일 수 있으며, 상기 피부 외용제의 제형을 가지는 경우 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 마사지크림, 영양크림, 팩, 클렌저, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 것일 수 있고, 또한 로션, 연고, 겔, 크림 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 가지는 것일 수 있다.

또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기 필수 성분 이외에 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전 분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이상으로 설명한 본 발명의 일실시예에 따른, 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물은 세포독성이 없고, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P.acnes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S.aureus) 등 여드름 원인균에 대한 항균 효과가 우수하며, 사이토카인 생성을 제어하는 NF-kB 단백, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 일산화질소(NO) 발생을 억제할 수 있으므로, 피부 염증 완화 및 치료효과가 있어 여드름 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 시호 추출물(및 분획물)의 제조

먼저, 시호 원물을 준비하고 분쇄한 다음, 시호 분쇄물 대비 5 배의 50% 에탄올 용액으로 60℃ 온도 조건 하에서 2시간 동안 추출하였으며, 상기 추출 과정을 통해 얻은 추출물 : 부탄올(BuOH)을 1 : 1 중량부 비로 혼합하여 0.5 시간 동안 교반함으로써, 시호 분획물을 수득하였다.

추출시간	ethanol 함량
	0%	50%	60%	80%
1h	0.7%	1.2%	1.3%	1.3%
2h	0.8%	1.6%	1.5%	1.5%
3h	0.8%	1.5%	1.4%	1.4%
4h	0.7%	1.4%	1.5%	1.4%

<에탄올 함량 및 추출시간 별 Saikosaponin A 함량(%)>

분획시간	용매조건
	BuOH	Chloroform	Aceton	Hexane
0.3h	4.2%	1.7%	2.1%	2.3%
0.5h	4.5%	1.8%	2.0%	2.5%
1h	4.3%	1.9%	1.9%	2.4%

<용매별 분획 및 시간 별 Saikosaponin A 함량(%)>

제조예 2: 황금 추출물(및 분획물)의 제조

먼저, 황금 원물을 준비하고 분쇄한 다음, 황금 분쇄물 대비 5 배의 증류수로 80℃ 온도 조건 하에서 2시간 동안 추출하였으며, 상기 추출 과정을 통해 얻은 추출물 : 아세톤(Acetone)을 1 : 1 중량부 비로 혼합하여 0.5 시간 동안 교반함으로써, 황금 분획물을 수득하였다.

추출시간	ethanol 함량
	0%	50%	60%	80%
1h	13.1%	11.3%	10.3%	10.6%
2h	18.2%	13.2%	10..5%	10.3%
3h	18.0%	13.3%	9.4%	10.5%
4h	17.3%	13.6%	9.5%	10.2%

<Ethanol 함량 및 추출시간 별 Baicalin 함량(%)>

분획시간	용매조건
	BuOH	Chloroform	Aceton	Hexane
0.3h	53.2%	57.3%	63.3%	63.1%
0.5h	54.2%	58.1%	64.2%	63.2%
1h	56.2%	57.6%	63.1%	61.3%

<용매별 분획 및 시간 별 Baicalin 함량(%)>

제조예 3: 후박 추출물(및 분획물)의 제조

먼저, 후박 원물을 준비하고 분쇄한 다음, 후박 분쇄물 대비 5 배의 50% 에탄올 용액으로 60℃ 온도 조건 하에서 2시간 동안 추출하였으며, 상기 추출 과정을 통해 얻은 추출물 : 헥산(Hexane)을 1 : 1 중량부 비로 혼합하여 0.5 시간 동안 교반함으로써, 후박 분획물을 수득하였다.

추출시간	ethanol 함량
	0%	50%	60%	80%
1h	12.0%	12.3%	11.2%	9.1%
2h	12.2%	13.4%	11.0%	9.2%
3h	12.1%	13.2%	11..3%	9.5%
4h	12.2%	13.1%	11.3%	9.3%

<에탄올 함량 및 추출시간 별 Magnolol + Honokiol 함량(%)>

분획시간	용매조건
	BuOH	Chloroform	Aceton	Hexane
0.3h	15.2%	20.1%	16.3%	49.3%
0.5h	17.3%	19.2%	16.5%	51.2%
1h	18.1%	20.3%	16.2%	51.0%

<용매 분획 및 시간 별 Magnolol + Honokiol 함량(%)>

제조예 4: 오미자 추출물(및 분획물)의 제조

먼저, 오미자 원물을 준비하고 분쇄한 다음, 오미자 분쇄물 대비 5 배의 50% 에탄올 용액으로 60℃ 온도 조건 하에서 2시간 동안 추출하였다.

추출시간	ethanol 함량
	0%	50%	60%	80%
1h	12.7%	12.9%	11.6%	12.1%
2h	13.1%	14.4%	12.0%	10.2%
3h	13.1%	14.2%	13.0 %	10.5%
4h	13.5%	14.1%	13.3%	10.3%

< Ethanol 함량 및 추출시간 별 Schizandrin 함량(%)>

실시예

본 발명의 일실시예에 따른 복합추출물의 효능 및 독성 평가를 시행하기 위해 상술한 제조예 1 내지 4에 따른 방법으로 제조된 추출물을 아래 표 8의 중량부 비로 혼합하여 시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물을 제조하였다.

Lot no.	배합비율 (%)
	시호 추출물	황금 추출물	후박 추출물	오미자 추출물
MP-190329-1	25	25	45	5
MP-190329-2	25	40	25	10
MP-190329-3	25	45	25	5
MP-190329-4	30	30	30	10
MP-190329-5	40	40	15	5
MP-190329-6	30	20	40	10
MP-190329-7	45	15	30	10
MP-190329-8	50	20	15	15
MP-190329-9	60	10	10	20
MP-190329-10	65	15	15	5

<시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물>

[실험 1: 세포 독성 시험]

배양

L929 세포는 한국세포주은행에서 구입하여, 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco, U.S.A.)을 포함한 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, Gibco, U.S.A.)이 들어있는 75 cm² 플라스크 (Nunc, Denmark)에 넣고, 5%의 CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.

MTT assay

도 1은 상기 실시예에 따른 복합추출물의 세포 독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 진행한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 대수증식기의 세포에 0.25% Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 배양플라스크 바닥으로부터 세포를 분리한 후, 50 mL 튜브에 넣고, 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 10% FBS를 포함한 EMEM 배지에 현탁시켰다.

혈구계수판을 이용하여 세포수를 계수하여 0.5~1Х105 cells/mL세포현탁액을 만든 후, 96 well 플레이트 (100 μL/well)에 분주하여 5%의 CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 1일간 배양하였다. 전배양 종료 후, 배양액을 제거하고 각 용량당 3 well씩 음성대조군, 시험물질군 및 양성대조군을 구분하였다.

음성대조물질, 시험물질 및 양성대조물질을 배지에 10%가 되도록 첨가한 후 각 well에 100 μL씩 처리하였다. 5%의 CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24 및 48시간 배양하였다. 배양 종료 후, 세포독성에 의한 세포의 형태 등의 변화를 현미경으로 관찰하였다.

모든 well에 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, 5 mg/mL D-PBS)를 20 μL씩 첨가하여 4시간 더 배양한 후에 배양액을 버리고 건조시켰다. 여기에 DMSO를 100 μL씩 첨가하여 침전물을 용해시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식률은 흡광도를 측정하여 평가하였다. 시험물질 처리에 의한 세포독성의 정도를 음성대조군과 비교하여 평가하였다.

[실험 2: 항염증 효과 측정을 위한 항염 마커 시험]

도 2는 상기 실시예에 따른 복합추출물의 항염증 효과를 측정하기 위하여 아래와 같이 NO 생산량 및 Real-time polymerase chain reaction(PCR)을 이용한 염증관련 마커 측정 시험을 진행한 결과를 나타낸 것이다.

배양

Mouse macrophage cell line인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였으며, DMEM 배지에 10% inactivated fetal bovine serum 및 1% antibiotics-antimycotics를 첨가한 배지를 배양액으로 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 실험과정의 모든 세포는 80 - 90% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대배양 하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.

NO 생산량 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응(Promega, Madison, USA)을 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell을 배지를 이용하여 1.0 Х 106 cells/ml로 조절한 후 6 well plate에 접종하고 5% CO₂ incubator에서 20시간 전 배양하였다. 세포에 1 μg/ml의 LPS와 추출물을 처리하여 24시간 재 배양하였다. 배양액의 상층액(50 μl)을 얻은 후, 동량의 sulfanilamide 시약과 10분 반응 후에 동량의 NED solution을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, microplate reader (Spectramax M2)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 무처치군과 비교하여 %로 산출하였다.

Real-time polymerase chain reaction(PCR)을 이용한 염증관련 마커 측정

상층액을 채취한 후, 각 well을 PBS로 세척한 다음 다음 Trizol (Life technologies, Carlsbad, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 1 μg의 RNA로 Oligo-(dT)15 (Promega)와 avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (Promega)를 이용 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 real-time PCR방법으로 증폭하였다(표 9). 이 때 housekeeping 유전자인 GAPDH를 internal control로 사용하였다.

Gene name	Accession No.	Mouse Primer
		Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
COX2	NM_011198	GAACCTGCAGTTTGCTGTGG	ACTCTGTTGTGCTCCCGAAG
IL-6	NM_031168.1	TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC	AGTCTCCTCTCCGGACTTGT
iNOS	NM_010927.3	CTATGGCCGCTTTGATGTGC	TTGGGATGCTCCATGGTCAC
NF-kB	NM_008689	cactgctcaggtccactgtc	ctgtcactatcccggagttca
TNFα	NM_013693	TACCTTGTTGCCTCCTCTT	GTCACCAAATCAGCGTTATTAAG
GAPDH	NM_008084	cgtgccgcctggagaaacc	tggaagagtgggagttgctgttg

<Sequences of the primers used in the current study>

[실험 3: DPPH 라디칼 소거능 측정 시험]

도 3은 상기 실시예에 따른 복합추출물의 DPPH 라디칼 소거능 효과를 측정하기 위하여 아래와 같은 방법으로 DPPH 라디칼 소거능 측정 시험을 진행한 결과를 나타낸 것이다.

DPPH는 2-diphenyl-picryl hydrazyl으로 수용액상태에서 보라색이지만, 전자 (electron)나 radical에 의해 scavenging되면 담황색으로 변하게 된다. 이때 감소하는 자색의 수치를 UV/VIS-spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 측정하였다.

측정방법으로는 96 well에 추출물을 100 μg/mL 및 60 μM DPPH를 각각 100 μL씩 첨가한 후, 실온에서 30분을 방치한 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH radical 저해율 (Radical inhibiton, %)

= [(Absorbance of control-Absorbance of sample)/Absorbance of control] x 100

[실험 3: 항균 시험]

도 4는 상기 실시예에 따른 복합추출물의 항균 효과를 측정하기 위하여 아래와 같은 방법으로 항균 시험을 진행한 결과를 나타낸 것이다.

P. acnes를 접종한 배지에 8 ㎜의 paper disc를 올린 후 추출물을 3 ㎎ /disc가 되도록 흡수시켜 충분히 건조시켰다. P. acnes는 혐기성 균으로 anaerobic jar에서 gaspack system을 사용하였고 밀봉 상태로 37℃의 incubator에서 72시간 동안 배양하였으며, 배양 후 disc의 직경을 포함한 clear zone을 측정하였다.

S. aureus 및 E. coli 를 접종한 배지에 8 ㎜의 paper disc를 올린 후 추출물을 3 ㎎/disc가 되도록 흡수시켜 충분히 건조시킨 후 37℃의 incubator에서 72시간 동안 배양하였으며, 배양 후 disc의 직경을 포함한 clear zone을 측정하였다.

실시예에 따라, 실험 1 내지 4를 통해 측정한 복합추출물의 효능에 대한 결과는 다음의 표 10과 같다.

Lot No.	평가항목
	항산화 평가	항균평가		항염평가
	DPPH inhibition (%)	P.acnes clear zone (mm)	S.aureus clear zone (mm)	NF-kB /GAPDH	TNF-α /GAPDH	IL-6 /GAPDH	NO Con.
MP-190329-1	82.1	26.7	24.4	2.0	3.5	3.0	1.7
MP-190329-2	85.7	23.7	26.3	2.1	3.6	2.4	1.6
MP-190329-3	87.0	25.6	27.7	2.0	2.7	2.5	1.9
MP-190329-4	90.5	28.6	29.4	1.7	2.8	1.8	2.0
MP-190329-5	88.3	27.9	30.6	1.8	2.8	1.9	1.9
MP-190329-6	91.2	30.5	29.7	1.6	2.7	2.0	2.0
MP-190329-7	92.3	34.2	32.3	1.5	2.6	1.6	1.5
MP-190329-8	90.7	29.6	30.4	1.9	2.8	1.9	1.9
MP-190329-9	89.5	30.1	29.9	1.9	2.9	2.2	1.8
MP-190329-10	88.6	27.6	29.2	1.9	2.7	2.8	1.6

<배합 비율 별 효능 평가 스크리닝 결과>

위의 표 10의 결과를 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물은 세포독성이 없고, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P.acnes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S.aureus) 등 여드름 원인균에 대한 항균 효과가 우수하며, 사이토카인 생성을 제어하는 NF-kB 단백, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 일산화질소(NO) 발생을 억제할 수 있으므로, 피부 염증 완화 및 치료효과가 있어 여드름 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.

특히, 위 실험 결과를 참조하면 MP-190329-7(시호 추출물: 황금 추출물: 후박 추출물: 오미자 추출물 = 45 : 15 : 30 : 10 중량부 비일 때) 평가 항목 별로 가장 우수한 효능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

[제형예 1] 시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 여드름 개선용 에센스

성분	함량 (단위: 중량%)
제조예에 따른 복합추출물	1.0 ~ 5.0
글리세린	10.0
베타인	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
이.디.티.에이-2NA	0.02
벤조페논-9	0.04
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐 히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데칸올	0.3
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

상기 표 11의 조성으로 본 발명에 따른 시호, 황금, 후박 및 오미자 복합추출물을 함유하는 여드름 개선용 에센스를 통상의 방법에 따라 제조할 수 있었다.

앞에서, 본 발명의 특정한 실시예가 설명되고 도시되었지만 본 발명은 기재된 실시예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형할 수 있음은 이 기술의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 일이다. 따라서, 그러한 수정예 또는 변형예들은 본 발명의 기술적 사상이나 관점으로부터 개별적으로 이해되어서는 안되며, 변형된 실시예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 하여야 할 것이다.

Claims (5)

1. 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 시호, 황금, 후박 및 오미자의 복합추출물은
   물, 에탄올 및 메탄올 중 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 용매추출물인, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 복합추출물은 상기 용매추출물을 부탄올, 아세톤, 헥산, 에탄올 및 물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 분획용매로 분획하여 얻은 분획추출물인, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 복합추출물은 시호 추출물 40 내지 50 중량부, 황금 추출물 10 내지 20 중량부, 후박 추출물 25 내지 35 중량부 및 오미자 추출물 5 내지 15 중량부를 포함하는, 항균 또는 항염증용 화장료 조성물.
5. 제 1 항의 항균 또는 항염증용 화장료 조성물을 유효성분으로 함유하는, 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.

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