KR20180032454A - 디오익 산류를 생산하는 캔디다 인판티콜라 균주 - Google Patents

디오익 산류를 생산하는 캔디다 인판티콜라 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캔디다 인판티콜라 균주에 관한 것으로서, 디오익 산류의 생산에 용되는 균주를 최적화하여 탄소원으로부터 디오익 산류의 전환율을 향상시킬 수 있다.

Description

디오익 산류를 생산하는 캔디다 인판티콜라 균주{CANDIDA INFANTICOLA SP. FOR PRODUCING DIOCIC ACIDS}
본 발명은 캔디다 인판티콜라 균주에 관한 것으로, 구체적으로는 탄소원으로부터 디오익 산류(Dioic acids)를 생산하는 균주에 관한 것이다.
디오익 산(dioic acids)은 화학산업에 있어서 매우 중요한 화학물질로서 엔지니어링 수지, 자동차 부품, 스포츠 용품, 카펫 및 칫솔 등에 이용되는 석유 유래 나일론뿐만 아니라, 다른 고분자 가소제, 접착제, 윤활유, 에폭시수지, 부식방지제, 코팅제, 가공 플라스틱, 향수 및 약제품 등 다양한 산업적 용도로 사용된다. 이들 디오익 산(dioic acids) 가운데 연간 약 15,000,000,000 파운드의 도데칸 디오익 산이 석유화학 원료로부터 합성되고 있으며, 이러한 석유화학 원료들은 주로 부족한 천연 원료로서 이들 원료의 사용은 전세계적으로 환경 파괴 및 환경 변화와 밀접한 연관이 있으며, 이러한 석유화학 원료들은 가격 변동에 민감하고 환경 오염에 대한 부담을 가중시킨다.
한편, 오메가-산화(ω-oxidation)를 통한 디오익 산(dioic acids) 전환 시 야생형 균주 배양을 채택하는 경우, 오메가-산화(ω-oxidation) 및 베타-산화(β-oxidation)가 모두 반응하기 때문에 최종 산물인 디오익 산 전환 수율이 낮고, 농도가 저하된다는 문제점이 발생할 수 있다.
따라서, 지속 가능하고 환경에 대한 부담을 줄이면서 디오익 산을 효과적으로 생산할 수 있는 최적의 균주 및 방법이 요구된다.
본 발명에서는 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 캔디다 인판티콜라 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 디오익 산류(dioic acid)를 생산하는 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP) 돌연변이 균주를 제공한다.
상기 균주는 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 베타-산화(β-oxidation)가 차단된 돌연변이 균주를 포함하는 것인 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP)일 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 돌연변이 균주가 EMS(ethyl methanesulfonate), UV 및 이들의 조합으로부터 선택된 방법으로 처리된 것일 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 균주는 베타-산화 경로가 차단되어 탄화수소 또는 지방산을 기질로 사용하여 디오익 산을 생산할 수 있는 것일 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 기질은 기질이 탄소수 6 내지 30의 알칸 또는 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 디오익 산류는 에탄디오익 산(ethanedioic acid), 프로판디오익 산(propanedioic acid), 부탄디오익 산(butanedioic acid), 펜탄디오익 산(pentanedioic acid), 헥산디오익 산(hexanedioic acid), 옥탄디오익 산(octanedioic acid), 노난디오익 산(nonanedioic acid), 데칸디오익 산(decanedioic acid), 언데칸디오익 산(undecanedioic acid), 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid), 헥사데칸디오익 산(hexadecanedioic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 폐수처리시설로부터 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)를 분리하는 단계;
PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼에 상기 야생형 균주를 혼탁시킨 혼탁액에 EMS(ethyl methanesulfonate) 처리하는 단계;
상기 DMS 처리된 균주를 YPD 고체배지에 배양하여 1차 돌연변이 균주를 수득하는 단계; 및
1차 돌연변이 균주 혼탁액을 YPD 고체배지에 도포하고 UV 조사 후 배양하여 2차 돌연변이 균주를 수득하는 단계를 포함하는 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP) 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 1) 글루코스를 포함하는 효모 추출 배지에 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호: KCTC13099BP)를 배양하는 1차 배양 단계;
2) 상기 단계 1)의 배지에 탄화수소를 포함하는 기질을 첨가하여 오메가-산화(ω-oxidation) 반응을 유도하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 반응액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질 및 글루코스를 첨가하며 배양하는 2차 배양 단계를 포함하는 것인 디오익 산류 생산방법을 제공할 수 있다.
기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP) 균주에 의하면, 야생형 균주에 비하여 디오익 산류(dioic acids)의 생산성을 향상시킬 수 있으므로 고농도의 디오익 산류의 생산성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 DS02 균주의 18s rRNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 DS02 균주에 대하여 시간에 따른 OD 값 및 DDDA 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 증기를 이용한 고체배지 제작에 대한 개략도이다.
도 4는 미생물에 대하여, 단일 탄소원 이용 유무에 따른 OD 값을 나타낸 그래프이다.
도 5는 지방산을 이용한 돌연변이 균주의 디오익 산류 전환 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 도데칸을 이용한 돌연변이 균주의 디오익 산류 전환 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 데칸을 이용한 돌연변이 균주의 디오익 산류 전환 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 구현예에 따른 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP) 균주 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 사용된 용어 '차단'이란 '저해'와 혼용될 수 있으며, 어떤 경로 또는 반응 등을 막는 것을 의미할 수 있다.
또한, '탄화수소'는 탄소와 수소만으로 이루어져 있는 유기 화합물을 지칭할 수 있다.
또한, '지방산'은 사슬 모양의 포화 또는 불포화 모노카복시산을 지칭할 수 있다.
또한, '오메가-산화(ω-oxidation)'는 지방산의 메틸기 말단이 산화되어 디카복시산으로 되는 반응을 의미할 수 있고, '베타-산화(β-oxidation)'는 카복시기에서 β 자리의 탄소원자가 산화되어 아세틸 CoA를 방출하면서 분해되는 반응을 의미할 수 있다.
일반적으로 지방산의 산화는 카복시기 말단부터 탄소 2개 단위로 절단되는 베타-산화(β-oxidation)가 주요 반응이며, 오메가-산화(ω-oxidation)는 탄소수 10 내지 12의 중간 사슬 지방산에 대한 보조 경로로 이해되고 있다.
본 발명에 따르면, 디오익 산류(dioic acids)를 생산하는 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP)를 제공할 수 있다. 상기 균주는 구체적으로, 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 베타-산화(β-oxidation) 경로를 차단시킨 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, 상기 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola) 야생형 균주는 예를 들어 석유화학 공장의 폐수로부터 분리할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 돌연변이 균주는 야생형 균주에 EMS(ethyl methanesulfonate), UV(ultra violet) 및 이들의 조합으로부터 선택된 방법을 처리하여 제조될 수 있다.
또한, 상기와 같은 균주로부터 생성되는 디오익 산류(dioic acids)는 탄소수 8 내지 14의 디오익 산을 포함할 수 있고, 예를 들어 에탄디오익 산(ethanedioic acid), 프로판디오익 산(propanedioic acid), 부탄디오익 산(butanedioic acid), 펜탄디오익 산(pentanedioic acid), 헥산디오익 산(hexanedioic acid), 옥탄디오익 산(octanedioic acid), 노난디오익 산(nonanedioic acid), 데칸디오익 산(decanedioic acid), 언데칸디오익 산(undecanedioic acid), 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid), 헥사데칸디오익 산(hexadecanedioic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으며, 구체적으로 디오익 산류로서 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid, DDDA)을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 폐수처리시설로부터 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)를 분리하는 단계; PBS(phosphate Buffered Saline) 버퍼에 상기 야생형 균주를 혼탁시킨 혼탁액에 EMS(ethyl methanesulfonate) 처리하는 단계; 상기 EMS 처리된 균주를 YPD 고체 배지에 배양하여 1차 돌연변이 균주를 수득하는 단계; 및 1차 돌연변이 균주 혼탁액을 YPD 고체 배지에 도포하고 UV 조사 후 배양하여 2차 돌연변이 균주를 수득하는 단계를 포함하는 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP) 제조방법을 제공한다. 균주에 EMS와 UV를 처리하는 단계는 순서와 횟수가 제한되지 않으며, EMS와 UV를 단독 또는 혼합으로 처리할 수 있다.
일구현예에 따르면, 1) 글루코스를 포함하는 효모 추출 배지에 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola) 돌연변이 균주(수탁번호: KCTC13099BP)를 배양하는 1차 배양 단계;
2) 상기 단계 1)의 배지에 탄화수소를 포함하는 기질을 첨가하여 오메가-산화(ω-oxidation) 반응을 유도하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 반응액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질 및 글루코스를 첨가하며 배양하는 2차 배양 단계를 포함하는 방법으로 디오익 산류를 생산할 수 있다.
예를 들어, 1) 1차 배양 단계는 균주 배양 단계로 초기 세포량(cell mass)을 얻기 위하여, 50g/L의 글루코스를 포함하는 효모 추출 배지(yeast extract)에 30℃, 1v/v/m 통기량, 용존 산소량(dissolved oxygen:DO) 35%의 교반 속도(DO 값에 따라 100~900rpm) 및 pH5로 24 내지 48시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 2) 오메가-산화(ω-oxidation)반응 유도 단계는 배양 중 pH7로 변경 후 알칸(탄화수소, 도데칸)과 최소한의 글루코즈 0.5 내지 3g/L/h를 투입하여 오메가 산화 관련 효소의 활성을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 3) 디오익 산류 전환 단계는 반응액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질 및 글루코스를 첨가하며 배양하는 2차 배양 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 기질은 탄소수 6 내지 30의 알칸 또는 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 도데칸(dodecane), 데칸(decane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 라우르산의 유도체는 C1-8 알킬라우레이트일 수 있다. 바람직하게는 메틸라우레이트(methyl laurate), 에틸라우레이트, 프로필라우레이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합일 수 있다.
일구현예에 따르면, 본 발명의 균주를 배양하여 디오익 산류를 생산하는 경우, 알칸 유래 물질을 첨가하여 오메가-산화(ω-oxidation)를 유도할 수 있다. 예를 들어, 1차 및 2차 배양으로 이루어지는 배양 단계에서 상기 알칸 유래 물질의 첨가 시기는 1차 배양과 2차 배양 사이일 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
제조예 1: 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola) 균주 스크리닝 및 탄소원 자화능 분석
캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)는 석유화학 공장(롯데케미칼 대산 공장)의 폐수 처리시설에서 폐수 샘플을 1L 멸균 수질 샘플 팩에 채취하여 준비하고, 채취한 시료는 아이스박스에 넣어 실험실로 이송하였다. 체취한 샘플의 일부를 고체 배지(agar plate)에 1차 평판도말(spreading)하고, 30℃ 항온 배양기에서 1주일간 배양하였다.
고체 배지의 조성은 YNB(yeast nitrogen base without amino acid) 6.7g/L, 도데칸(dodecane) 10g/L, 계면활성제 Gum Arabic 0.5%이다. 배양 후, 도데칸(dodecane; C12 알케인)이 포함된 배양액에서 생장성이 빠른 균주를 선별하기 위해, 고체 배지에 생성된 군락(colony)들을 채취하여, 도데칸(dodecane; C12 알케인)을 유일한 탄소원으로 포함하는 액체 배양 배지(YNB, yeast nitrogen base without amino acid) 20g/L, 도데칸(dodecane) 20g/L, 계면활성제 Tween 80 3mL/L)에서 경쟁 유도 연속식 집적 배양 배지에 접종하여 30℃, 1v/v/m 통기량, 400rpm 교반속도 및 pH5.0(controlled by 10N NaOH)의 조건의 경쟁 유도 연속식 집적 배양장치에서 배양하였다. 상기 경쟁 유도 연속식 집적 배양 시 초기 투입된 20g/L의 도데칸을 소진한 후, 추가로 40g/L의 도데칸이 포함된 추가 배지(YNB, yeast nitrogen base without amino acid) 20g/L, 도데칸(dodecane) 40g/L, 계면활성제 Tween 80 3mL/L)를 투입하여 희석률(dilution rate)을 0에서 0.4까지 상승시켜, 최종적으로 생장성이 가장 우수한 균주 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)를 분리하였다. 상기 실험에서 일부 미생물의 성장을 억제하기 위하여 항생제 카나마이신 25m g/L를 사용하였다.
분리한 야생형 캔디다 인판티콜라 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 탄소원 자화능(資化能)을 확인하기 위하여, API 20c AUX (Biomerieux 社)를 사용하여 분석하였다. API 20c AUX(Biomerieux 社)를 이용하여 분석한 실험 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
탄소원 캔디다 인판티콜라 DS02; KCTC 12820BP
(Candida infanticola DS02; KCTC 128200BP)
글루코오스(Glucose) +
글리세롤(Glycerol) -
2-케토-D-글루콘산
(2-keto-D-gluconate)		 -
L-아라비노오스(L-Arabinose) -
D-자일로스(D-Xylose) -
아도니톨(Adonitol) -
자일리톨(Xylitol) -
D-갈락토스(D-galactose) -
이노시톨(Inositol) -
D-솔비톨(D-Sorbitol) -
A-메틸-D-글루코시드
(A-Methyl-D-glucoside)		 -
N-아세틸-D-글루코사민
(N-Acetyl-D-glucosamine)		 -
D-세롤비오스(D-Cellobiose) -
D-젖당(D-Lactose) -
D-맥아당(D-Maltose) -
D-자당(D-Saccharose (Sucrose)) -
D-트레할로오스(D-Trehalose) -
D-멜레치토오스(D-Melezitose) -
D-라피노오스(D-Raffinose) -
제조예 2: 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola) 균주 동정
캔디다 인판티콜라(Candida infanticola) 균주를 동정하기 위하여, 18s rRNA 염기서열분석법으로 분석하였다. Yeast gDNA prep kit(PureHelixTM, NANOHELIX)를 이용하여 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 genomic DNA를 추출하고, 상기 추출한 genomic DNA를 주형으로 하기 표 2의 18s ITS ¼ 프라이머를 이용한 PCR 반응으로 증폭시킨 후, TA 벡터 클로닝 시킨 후, DNA 시퀀싱 반응을 통하여 18s rRNA 염기서열을 얻었으며, 상기 염기서열은 서열번호는 도 1에 나타내었다(서열번호 1).
상기 분리 균주의 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment search tool)을 사용하여 균주의 상동성을 조사하였다. 조사결과는 표 2에 나타내었으며, 캔디다 인판티콜라 CBS11940 와 높은 상동성을 가지는 근연종인 것을 확인할 수 있다.
분리 균주 서열의 길이 근연종 상동성
Candida infanticola DS02 441bp Candida infanticola strain CBS11940 (HQ695010) 99%
실시예 1: 야생형 캔디다 인판티콜라 균주의 디오익 산 전환 배양
캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)에 의한 도데칸의 도데칸 디오익 산(DDDA, dodecanedioic acid) 전환을 위한 초기 세포량(cell mass)을 얻기 위하여 50g/L의 글루코스를 포함하는 라우릴산 메틸(methyl laurate)기질을 사용한 효모 추출(yeast extract) 배지에 Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP를 30℃, 1v/v/m 통기량, 용존 산소량(dissolved oxygen: DO) 30%의 교반 속도(DO 값에 따라 100~900rpm) 및 pH5로 24 내지 48시간 동안 배양한 후, 1% 도데칸을 이용하여 pH7에서 12 내지 20시간 동안 오메가-산화(ω-oxidation) 유도를 진행한 후, 라우릴산 메틸 0.5 내지 1.0 ml/L/h 및 글루코스 2g/L/h 로 넣어주며 96시간 배양하여 pH7 내지 8에서 DDDA 전환을 진행하였다. 144 시간 배양결과 세포량은 O.D.(최대/최종) 184.0/159.8, 전환된 DDDA 농도는 10.6g/L로 베타-산화(β-oxidation)가 차단되지 않은 야생형 균주임에도 불구하고 높은 DDDA 전환을 보였으며, 하기 도 2에 나타내었다.
실시예 2: 야생형 캔디다 인판티콜라 균주에 대한 돌연변이 유도 및 스크리닝
야생형 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP) 균주의 경우 도데칸(dodecane)을 단일 탄소원으로 이용하여 생장이 가능하지만 베타-산화(β-oxidation) 경로가 차단된 돌연변이 균주의 경우 도데칸을 단일 탄소원으로 이용하여 실질적으로 생장하지 못한다. 상기 실질적으로 생장하지 못한다는 것은 성장하지 않거나, 미약하게 성장하는 것을 의미할 수 있다. 따라서 글루코스(glucose) 또는 도데칸(dodecane)을 단일 탄소원으로 포함하는 고체 배지에서의 균주 생장성을 비교하여 돌연변이 균주를 선별하였다.
선별된 돌연변이 균주에 돌연변이를 유도하기 위하여, EMS(ethyl methanesulfonate)와 UV를 사용하였다. PBS 버퍼(phosphate buffered saline)를 이용하여 OD(optical density 600nm) 0.01~0.1인 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP) 혼탁액을 준비하여 2% 농도의 돌연변이원(mutagen) EMS(ethyl methanesulfonate) 처리하여 1ml을 맞춘 후, 30℃, 150rpm에서 120분 반응시키고, 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 20% 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)로 2회 수세하여 EMS를 제거한다. 그리고 1ml PBS 버퍼에 균주를 혼탁시킨 후, 그 중 10ul를 YPD 고체배지에 도포하여 30℃, 3일 배양하여 10% 이내의 생존된 1차 변이균주를 얻었다.
EMS 돌연변이원을 처리한 균주에 PBS 버퍼(phosphate buffered saline)로 OD 0.01~0.1인 균주 혼탁액을 준비하여 YPD 고체배지에 10ul 도포 후 UV(ultraviolet 254 nm)를 120초 조사하고, 30℃, 3일 배양하여 약 10% 이내의 생존된 2차 변이균주를 얻었다. 돌연변이 유도 과정은 EMS 처리 후 UV 조사, UV 조사 후 EMS 처리 또는 EMS, UV 단독으로도 진행할 수 있으며, 그 순서 및 횟수는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
돌연변이 유도에 의하여 베타-산화(β-oxidation)가 차단된 돌연변이 균주를 선별하기 위하여, 글루코스(glucose) 또는 도데칸(dodecane)을 단일 탄소원으로 포함하는 고체 배지에서의 균주 생장성을 비교하였다. 사용된 고체 배지의 조성은 글루코스(glucose)를 단일 탄소원으로 사용한 고체 배지(YNB, yeast nitrogen base without amino acid) 6.7g/L, glucose 10g/L)와 도데칸(dodecane)을 단일 탄소원으로 사용한 고체배지 (YNB, yeast nitrogen base without amino acid) 6.7g/L, 도데칸(Dodecane) 10g/L)이다. 도데칸을 포함한 고체 배지의 경우 고체 배지의 색이 불투명한 흰색으로 생장한 콜로니 확인이 용이하지 않기 때문에, 도데칸 증기를 이용한 고체 배지를 제작하여 균주 성장성을 효율적으로 비교하였으며, 고체 배지는 도 3에 도시하였다.
고체 배지 내 멸균된 종이 재질의 필터를 넣고 필터에 정량의 도데칸을 도포하여 고체 배양 시 도데칸이 증기로 고체 배지 내에 퍼져 균주가 이용하는 방법으로 진행하였다. 후보 돌연변이 균주를 PBS 버퍼에 혼탁시켜 OD 0.01~0.1인 균주 혼탁액을 준비 후 위에서 설명한 두 고체 배지에 마이크로피펫을 이용하여 10ul 접종한 후 30℃, 3일 배양을 진행하여 글루코스 고체 배지에서는 잘 자라지만 베타-산화(β-oxidation)가 차단되어 도데칸 고체 배지에서는 자라지 못하는 균주를 선별하는 방법으로 1차 선별을 진행하였다.
1차 선별된 돌연변이 균주를 도데칸이 단일 탄소원으로 포함된 액체 배지에서의 균주 생장성을 통해 베타-산화(β-oxidation) 유전자 차단 균주를 2차 선별하였다. 본 실시에서는 총 6개의 선별된 균주의 액체 배양을 수행하였다. 액체 배양은 250ml의 삼각플라스크(erlenmeyer flask)에 70ml의 도데칸을 단일 탄소원으로 하는 배양액에 각 선별된 균주를 초기 배양 OD 1로 맞추어 접종하여 30℃, 150rpm으로 6일간 배양하였다. 사용된 액체 배지의 조성은 도데칸을 단일 탄소원으로 사용한 배지(YNB, yeast nitrogen base without amino acid) 20g/L, 도데칸(Dodecane) 20g/L)이다. 배양 결과는 도데칸을 탄소원으로 이용하지 못한 돌연변이 균주와 도데칸을 이용한 돌연변이 균주의 OD 측정값을 그래프로 각각 도 4에 나타내었다. 도데칸을 이용하지 못한 균주는 베타-산화(β-oxidation)가 차단된 균주로 판단하여 2차 선별을 완료하여, 베타-산화(β-oxidation)가 차단된 돌연변이 균주를 Candida infanticola LC-DA01로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호 KCTC13099BP, 2016년 09월 08일).
도 4에 나타난 바와 같이, 돌연변이 균주(기탁번호: KCTC13099BP)의 베타 산화 경로가 차단된 것을 1차적으로 확인할 수 있다.
실시예 3: 지방산 기질을 이용한 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주의 디오익 산 전환 배양
캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(수탁번호: KCTC13099BP)에 의한 라우릴산 메틸(methyl laurate)의 도데칸 디오익 산(DDDA, dodecanedioic acid) 전환을 위한 초기 세포량(cell mass)을 얻기 위하여 50g/L의 글루코스(glucose)를 포함하는 라우릴산 메틸(methyl laurate) 기질을 사용한 효모 추출(yeast extract) 배지에 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호 KCTC13099BP)를 30℃, 1v/v/m 통기량, 용존 산소량(dissolved oxygen: DO) 30%의 교반 속도(DO 값에 따라 100~900 rpm) 및 pH5 로 24 내지 48시간 동안 배양한다. 배양 중 12 내지 24시간에 50g/L의 글루코스를 모두 소모한 뒤 1 내지 4g/L/h로 글루코스를 투입하여 배양 종료까지 진행하였다.
초기 세포량을 얻은 후, 1% 도데칸을 이용하여 pH7에서 12 내지 20시간 동안 오메가-산화(ω-oxidation) 유도를 진행한 후, 라우릴산 메틸 0.5 내지 4.0ml/L/h 및 글루코스 1 내지 4g/L/h로 넣어주며 96 내지 144시간 배양하여 pH7 내지 8에서 DDDA 전환을 진행하였으며, 결과는 도 5 및 표 3에 나타내었다.
C. infantiola 야생형
DS02; KCTC 12820BP		 돌연변이
β-oxidation이 차단된 LC-DA01; KCTC13099BP
균체량 (O.D.)
(최대/최종)		 184.0/159.8 62.1/36.2
DDDA 농도
(g/L)		 10.6 140.9
DDDA 생산성
(g/L/h)		 0.07 1.67
DDDA 전환 수율
(DDDA/substrates)		 0.08 0.90
베타-산화(β-oxidation)가 차단된 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호 KCTC13099BP)의 경우 108시간 배양결과 O.D(optical density, 최대/최종)값은 62.1/36.2, DDDA 농도는 140.9 g/L (전환 수율 90%), DDDA 생산성 1.67g/L/h 로 베타-산화(β-oxidation)가 차단되지 않은 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 DDDA 농도 10.6g/L에 비해 13배 이상 월등히 높게 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 4: 탄화수소 기질을 이용한 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주의 디오익 산 전환 배양
캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(수탁번호: KCTC13099BP)에 의한 도데칸(dodecane)과 데칸 (decane)의 디오익 산(dioic acid) 전환을 위한 초기 세포량(cell mass)을 얻기 위하여 50g/L의 글루코스(glucose)를 포함하는 라우릴산 메틸(methyl laurate)기질을 사용한 효모 추출(yeast extract) 배지에 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호 KCTC13099BP)를 30℃, 1v/v/m 통기량, 용존 산소량(dissolved oxygen: DO) 30%의 교반 속도(DO 값에 따라 100~900rpm) 및 pH5 로 24 내지 48시간 동안 배양한다. 배양 중 12 내지 24시간에 50g/L의 글루코스를 모두 소모한 뒤 1 내지 4g/L/h로 글루코스를 투입하여 배양 종료까지 진행하였다.
초기 세포량을 얻은 후, 1% 도데칸을 이용하여 pH7에서 12 내지 20시간 동안 오메가-산화(ω-oxidation) 유도를 진행한 후, 도데칸(dodecane)과 데칸(decane) 기질을 0.5 내지 4.0ml/L/h 및 글루코스 1 내지 4g/L/h로 넣어주며 96 내지 144시간 배양하여 pH7 내지 8에서 DDDA 전환을 진행하였으며, 도데칸 기질 결과는 도 6, 데칸 기질 결과는 도 7 및 표 5에 나타내었다.
베타-산화(β-oxidation)가 차단된 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호 KCTC13099BP)의 도데칸 기질 발효 결과의 경우 96시간 배양결과 O.D(optical density, 최대/최종)값은 64.2/42.6, DDDA 농도는 122.5g/L(전환 수율 99%), DDDA 생산성 1.70g/L/h로 베타-산화(β-oxidation)가 차단되어 탄화수소를 기질로 하여 디오익 산 생산성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 베타-산화(β-oxidation)가 차단된 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호 KCTC13099BP)의 데칸 기질 발효 결과 경우 96시간 배양결과 O.D(optical density, 최대/최종)값은 66.9/40.0, 세바스 산(sebacic acid) 농도는 77.6 g/L(전환 수율 99%), 세바스 산(sebacic acid) 생산성 0.75g/L/h 로 베타-산화(β-oxidation)가 차단되어 탄화수소를 기질로 하여 디오익 산의 생산성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
C. infantiola LC-DA01 Dodecane 기질 이용 DDDA 생산 Decane 기질 이용 sebacic acid 생산
균체량 (O.D.)
(최대/최종)		 64.2/42.6 66.9/40.0
DDDA / sebacic acid 농도
(g/L)		 122.5 77.6
DDDA / sebacic acid 생산성
(g/L/h)		 1.70 0.81
DDDA 전환 수율
(DDDA/substrates)		 0.99 0.75
상기한 바와 같이, 본 발명은 균주의 베타-산화(β-oxidation) 경로가 차단됨으로써 디오익 산류의 전환률을 향상시킬 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 디오익 산류(dioic acid)를 생산하는 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호: KCTC13099BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주가 캔디다 인판티콜라 야생형 균주(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 베타-산화(β-oxidation)가 차단된 돌연변이 균주를 포함하는 것인 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola LC-DA01 KCTC13099BP) 돌연변이 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주가 베타 산화경로가 차단되어 탄화수소 또는 지방산을 기질로 사용하여 디오익 산을 생산할 수 있는 것인 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP).
  4. 제3항에 있어서,
    상기 기질이 탄소수 6 내지 30의 알칸 또는 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; KCTC13099BP).
  5. 제1항에 있어서,
    상기 디오익 산류는 에탄디오익 산(ethanedioic acid), 프로판디오익 산(propanedioic acid), 부탄디오익 산(butanedioic acid), 펜탄디오익 산(pentanedioic acid), 헥산디오익 산(hexanedioic acid), 옥탄디오익 산(octanedioic acid), 노난디오익 산(nonanedioic acid), 데칸디오익 산(decanedioic acid), 언데칸디오익 산(undecanedioic acid), 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid), 헥사데칸디오익 산(hexadecanedioic acid) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01 KCTC13099BP).
  6. 1) 글루코스를 포함하는 효모 추출 배지에 캔디다 인판티콜라 돌연변이 균주(Candida infanticola LC-DA01; 수탁번호: KCTC13099BP)를 배양하는 1차 배양 단계;
    2) 상기 단계 1)의 배지에 탄화수소를 포함하는 기질을 첨가하여 오메가-산화(ω-oxidation) 반응을 유도하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 반응액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질 및 글루코스를 첨가하며 배양하는 2차 배양 단계를 포함하는 것인 디오익 산류 생산방법.
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