KR20180008358A - 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 천연 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 천연 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선 등을 추출한 조성물을 이용한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 천연 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선, 백출, 건강, 대추, 감초를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황기 100 중량부에 방기 70~100중량부, 천오두 70~100중량부, 우슬 50~80중량부, 위령선 50~80중량부, 백출 50~80중량부, 건강 50~80중량부, 대추 50~80중량부, 감초 10~40 중량부를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 천연 조성물{the natural composite with the functon of rheumatoid athritis protection and treatment}

본 발명은 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 천연 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선 등을 추출한 조성물을 이용한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 천연 조성물에 관한 것이다.

관절염이란 관절에 어떤 원인에 의해서든 염증성 변화가 생긴 것을 총괄해서 지칭하는 병명이며, 뼈와 뼈 마디를 연결하여 매끈하게 움직이게 하는 물렁뼈가 소실되는 것을 말한다. 관절염의 종류로는 100가지가 넘으나 가장 흔한 관절염의 유형으로 퇴행성 관절염과 류마티스성 관절염이 있다.

퇴행성 관절염은 젊은 시절 관절을 많이 사용하거나 상처를 입어 이미 시작되었을 수도 있지만 증상은 주로 노인들에게서 보여지는 유형이다. 주로 몸무게가 실리는 무릎, 엉덩이, 척추 관절에서 발생되지만, 그 외에도 외상이나, 골절, 과도한 운동 등으로 인해 모든 관절 부위에 발생될 수 있다. 퇴행성 관절염의 경우 뼈 끝을 감싸고 있는 연골이 닳은 것이며 많은 경우에 퇴행성 관절염이 있는 관절에 골극(극돌기)이라 불리는 뼈가 발달되고 관절의 염증은 통증과 부종을 일으키며 그 관절을 계속 사용하게 되면 통증이 발생되며 휴식을 통해 통증이 약간 감소될 수는 있다.

류마티스성 관절염은 장기 질환으로 관절을 포함하여 인체 각 부분에 영향을 주는 질병이며 관절 부분이 부으면서 주위 조직까지 침범하며, 특정 화학 물질을 분비하여 관절 표면을 공격하여 파괴시켜 버린다. 주로 손과 발의 관절에서 발생되지만 간혹 엉덩이, 무릎, 팔꿈치 등의 관절에서도 발생되기도 한다. 사용하지 않는 관절임에도 불구하고 부종, 통증, 뻣뻣한 증상이 발생되기도 하며 류마티스성 관절염은 모든 연령층에서 발생되지만 전체 환자의 70%이상은 30세 이상이며 많은 관절들에서 동시에 발생될 수도 있다.

관절염의 치료방법으로 약물요법은 아스피린, 이부프로펜, 나프록센 등의 약들을 통하여 효과적으로 통증과 염증을 감소시켜 준다. 만약 환자가 궤양, 천식, 신장 질환, 간 질환이 있는 경우에는 경구용 약물이 안전하지 못할 수 있으므로 이럴 경우에는 관절 부위에 코르티손을 직접 주사하여 증상을 완화시킨다. 그러나, 같은 관절 부위에 계속적으로 주사하는 것은 오히려 관절에 손상을 주거나 예상치 못한 부작용이 생길 수 있다.

따라서, 부작용이 없으면서도 환자의 입장에서 봤을 때 연골재생, 염증, 통증효과가 뚜렷하며 치료가 명확한 새로운 관절염 예방 및 개선 기능성 식품과 의약품의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이와 관련한 선행기술로 등록특허 10-1012415(관절염 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법)는 "1~2중량부 닭발, 1~2중량부 구척, 1~2중량부 속단, 1~2중량부 우슬 및 1~2중량부 차전자 혼합재료의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하고, 상기 구척은 소주에 담갔다 증기로 찌는 과정을 2~5회 반복하고 말려서 사용하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물"을 제공한 바 있다.

상기한 종래기술 및 선행기술은 여전히 간 및 신장에 독성이 있으며 관절염 치료에 미흡하였는바 본 발명은 이를 해결하고자 한다.

또한 본 발명은 간 및 신장에 독성이 없으면서도 항산화 효능, 항염증 효능이 있고 관절염의 예방과 치료에 매우 효과적인 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기한 목적 및 요구를 해결하기 위하여,

황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선, 백출, 건강, 대추, 감초를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 황기 100 중량부에 방기 70~100중량부, 천오두 70~100중량부, 우슬 50~80중량부, 위령선 50~80중량부, 백출 50~80중량부, 건강 50~80중량부, 대추 50~80중량부, 감초 10~40 중량부를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물은 간 및 신장에 독성이 있으며 관절염 예방과 치료에 현저한 효과가 나타난다.

또한 본 발명에 따른 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물은 항산화 효능, 항염증 효능이 있을 뿐만 아니라 관절염의 예방과 치료에 매우 효과적이다.

또한 본 발명에 따른 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물은 관절염의 연골조직손상의 치료에 현저히 높은 효과가 나타난다.

도 1은 본 발명의 조성물을 투입한 실험 쥐의 RA(류마티스 관절염) 개선 정도를 나타내주는 사진.
도 2는 본 발명의 조성물을 투입한 실험 쥐의 RA(류마티스 관절염) 개선 정도를 나타내주는 그래프.
도 3은 본 발명의 조성물을 투입한 실험 쥐의 후족부를 micro-CT로 촬영하여 3D로 변환한 결과 사진.
도 4는 본 발명의 조성물을 투입한 실험 쥐의 골밀도 측정 그래프.
도 5는 본 발명의 조성물을 투입한 실험 쥐의 염증정도 측정 그래프.

이하 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선, 백출, 건강, 대추, 감초를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 구척, 차전자, 홍화씨, 골담초를 더 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.

따라서 본 발명은 바람직하게는 황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선, 백출, 건강, 대추, 감초, 구척, 차전자, 홍화씨, 골담초를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기한 황기는 아래와 같은 통상의 황기를 말려서 사용한다.

황기는 턱잎은 바소꼴로써 끝이 길게 뾰족하다. 잎겨드랑이에서 총상(總狀)으로 대가 긴 꽃이삭이 나오며 5∼10개의 꽃이 달린다. 7∼8월에 황백색 꽃이 피며 길이 약 2cm이고 작은 꽃자루는 길이 약 3mm이다. 꽃받침은 길이 약 5mm이고 흑갈색 털이 있으며 5개로 갈라진다. 수술은 10개이고 열매는 11월에 결실하며 협과이다. 꼬투리는 긴 타원형으로 양 끝이 뾰족하고 길이 2∼3cm이며 5∼7개의 종자가 들어 있다.

한국·일본·만주·중국 북동부·시베리아 동부 등지에 분포한다. 일반적으로 약초로서 재배하며 한방에서는 가을에 채취하여 노두(蘆頭)와 잔뿌리를 제거하고 햇빛에 말린 것을 한약재의 황기라 하며, 강장·지한(止汗)·이뇨(利尿)·소종(消腫) 등의 효능이 있어 신체허약·피로권태·기혈허탈(氣血虛脫)·탈항(脫肛)·자궁탈·내장하수·식은땀·말초신경 장애 등에 처방한다.

본 발명의 방기(防己)는 통상적으로 사용하는 방기를 사용한다.

방기의 효능은 풍습성 사지관절 동통과 수족경련, 중풍, 구안와사, 부종, 각기병, 복수가 찰 때 사용한다.

약리작용으로 진통작용, 소염작용, 해열작용, 횡문근 이완작용, 기관지 평활근이완작용, 항균, 항종양작용이 보고되었다.

방기과의 방기(Sinomenium acutum (Thunb.) Rehder& E.H.Wilson)의 덩굴성줄기 및 뿌리줄기를 사용해 만든 약재(한국, 일본). 중국은 지역마다 여러 가지 방기를 사용하지만 공식적으로는 방기(Sinomenium acutum (Thunb.) Rehder& E.H.Wilson)를 청풍등(靑?藤)이라 하여 약용하며, 동속의 모청등(Sinomenium acutum var. cinereum Rehder& E.H.Wilson:毛靑藤)을 함께 사용하고 있다

본 발명의 천오두(川烏頭)는 통상적으로 사용하는 천오두를 사용한다.

천오두의 딴 이름은 천오(川烏) · 근(菫) · 해독(奚毒)이다. 바구지과 식물인 부자 Aconitum carmichaeli Debx.의 모근(母根)을 말린 것이다. 부자는 각지에서 심는다. 가을에 덩이뿌리를 캐 모근만 골라 물에 씻어 햇볕에 말린다. 맛은 맵고 성질은 따뜻하며 독이 있다. 비경(脾經) · 심경(心經) · 신경(腎經)에 작용한다. 풍한습사(風寒濕邪)를 없애고 경맥을 따뜻하게 하며 통증을 멎게 한다. 약리 실험에서 강심(强心) 작용, 소염 작용 등이 밝혀졌다. 비증(?證), 팔다리가 오그라드는 데, 반신 불수, 명치와 배가 차면서 아픈 데, 부스럼 등에 쓴다. 급성 류머티스성 다발성 관절염에도 쓴다. 하루 2~6g(부자처럼 법제한 것)을 탕제 · 산제 · 환제 형태로 만들어 먹는다. 외용약으로 쓸 때는 가루 내서 기초(약)제에 개어 바른다. 임신부나 열증(熱證)에는 쓰지 않는다

본 발명의 우슬은 비름과에 속하는 여러해살이 초본식물을 의미한다.

그 뿌리의 형상이 소의 무릎과 비슷하다고 하여 우슬이라고 부르며, 약재로 쓴다.

식물 줄기에 있는 마디의 형상이 소의 무릎과 유사하다고 하여 쇠무릎이라 호칭되기도 한다. 우슬은 쇠무릎의 뿌리에 해당하는 약재이다.

유효성분으로는 사포닌과 다량의 칼슘을 함유하고 있으며, 동물실험에서는 진통작용을 나타내었다.

또 자궁의 수축을 증강시키며 약한 이뇨작용이 있고, 혈관을 확장시켜 일시적인 혈압강하작용을 나타내기도 한다. 약성은 평범하고 맛은 시고 쓰다. 효능은 부인의 생리를 정상으로 유도하고 이뇨와 배변을 용이하게 한다.

형태가 무릎을 닮은 것과 같이 무릎의 질환(관절염·류머티스성관절염·타박으로 인한 염증)을 치료하는 데 현저한 효과가 인정되고 있다. 또 허리와 다리가 무겁고 통증을 느끼며 때로 근육경련이 있을 때에 많이 활용된다.

신장의 결격으로 소변을 잘 못보면서 통증이 있고 피가 섞인 소변을 볼 때에도 쓴다. 고혈압에 두통·어지러움·안화(眼花) 등의 증상이 있을 때에 혈압을 하강시키면서 뇌혈관의 경련을 이완시켜 주기도 한다.

민간에서는 어린 싹을 나물로 먹고 뿌리는 신경통에 쓰기도 한다. 금기로는 설사·자궁출혈·임신부에게 쓰지 않는다. 한방에서 많이 쓰이고 있으며, 대표적인 처방은 관절염에 쓰이는 우슬탕(牛膝湯)과 혈압에 복용하는 평간강압탕(平肝降壓湯)이 있다.

본 발명의 위령선은 미나리아재비과의 으아리(Clematis mandshurica Maximowicz) 또는 기타 동속 근연식물의 뿌리로 만든 약재(한국)를 의미한다.

중국에서는 으아리(Clematis mandshurica Maximowicz), 위령선(Clematis chinensis Osbeck.:威靈仙), 산료(Clematis hexapetala Pall.:山蓼), 소목통(Clematis armandii Franch.:小木通)의 뿌리를 쓴다. 일본은 으아리, 위령선, 산료의 뿌리를 사용한다.

위령선은 풍습을 제거하고 관절굴신불리, 사지마비, 요통, 사지동통, 근육마비, 타박상을 치료한다. 오장의 기능 항진, 경락이 막혀 생기는 통증에 사용한다.

약리작용은 혈압강하, 평활근 흥분, 이뇨작용, 혈당하강작용, 진통, 항균작용이 보고되었다.

생김새는 뿌리줄기가 고르지 않은 덩어리 모양으로 윗 끝에 때로는 목질의 짧은 줄기가 붙어 있으며 긴 잔뿌리가 많다. 뿌리줄기 바깥면은 황갈색이며 섬유성이고 뿌리 바깥면은 갈색이나 흑갈색이며 세로 주름이 있고 꺾어지기 쉬우며 목부와 피부가 떨어지기 쉽다.

다른 이름으로 노호수(老虎鬚), 능소(能消), 영선(靈仙), 위령선(??仙), 철각위령선(鐵脚威靈仙), 로선(露仙), 철선연(鐵線連), 소목통(小木通) 등이 있다.

본 발명의 백출(白朮)은 삽주의 뿌리를 건조시킨 약재를 의미한다.

창출의 껍질을 벗긴 것을 백출이라 하며,잎이 엉겅퀴 잎과 비슷하여 포계, 마계라고도 한다. 삽주는 국화과에 속하는 여러 해살이 식물로 키가 50㎝가량 자라며, 우리나라, 만주, 일본 등지에 분포한다.

백출의 약효성분으로는 아트락틸롤(atractylol)·아트락틸론(atractylonen) 등이 함유되어 있는데, 동물실험에서는 소화효소의 분비촉진과 지속적인 이뇨효과 및 진정작용을 나타내었다. 약성은 온화하고 맛은 약간 쓰며 달다.

효능은 건위·소화 작용이 있어서 만성소화불량·장염·설사 등과 식욕증진에도 탁월하다. 특히 병후에 식욕이 없고 전신이 쇠약하며 땀을 많이 흘리는 사람에게 유효하다. 만성관절류머티즘에는 위령선(威靈仙)·방기(防己) 등을 배합하여 많이 활용되고 있다.

또 이뇨작용도 있어서 신장염으로 부종이 있는 데나 임신부의 부종에도 많이 쓰인다. 미약하지만 혈당을 강하시키는 효과가 있고, 간장의 기능을 활성화시키는 효과도 있다.

한방에서는 많이 쓰이는 약의 하나로 별로 금기해야 할 질환은 없으나 급성세균성장염에는 사용하지 않는다. 민간에서는 소화불량에 가루로 만들어 장복한다. 대표적인 처방으로는 위장질환에 통용되는 평위산(平胃散)이 있다.

본 발명의 건강(乾薑)은 한국, 중국, 일본에서는 생강(Zingiber officinale Roscoe)의 말린 뿌리줄기를 사용한다. 일본에서는 건생강(乾生姜)이라고 부르며 한국에서는 건강가루도 약용한다.

가슴과 배부위가 냉기가 돌며 은은하게 통증이 있고 배가 차고 소화가 안되며 구토, 설사를 하는 증상에 효과가 있다. 또한 맥이 약하고 팔다리가 차고 저리며 찬바람에 해수가 생기고, 호흡이 가빠질 때, 아랫배가 차고 이질 설사가 생길 때 사용한다.

약리효과는 위액분비촉진, 장관 연동작용 활성화, 소화촉진, 구토를 가라앉히며 심장을 흥분시켜 혈압을 상승하게 하고 혈액순환을 촉진한다. 항염, 진통작용, 억균작용이 있다.

고르지 않게 갈라진 뿌리줄기와 그 파편으로 이루어지며 다소 눌려서 편편하게 되었거나 구부러진 난형, 긴 난형으로 양쪽에 싹눈이 혹같이 부풀어 오른 것도 있다. 겉껍질은 회색빛이 도는 황색이며 바깥면은 회백색이 돌며 흰가루가 붙어 있다. 꺾인 면에는 분비물이 어두운 갈색의 작은 점으로 흩어져 있으며 현미경으로 보면 정유성분의 황색의 물질이 가득 들어있다.

건강은 백강(白薑), 균강(均薑)이라고도 한다. 까맣게 태운 것을 건강탄(乾薑炭)이라하여 지혈에 사용한다.

본 발명의 대추는 통상적인 대추 열매를 사용한다.

색이 붉다 하여 홍조(紅棗)라고도 하는데, 홍조는 찬 이슬을 맞고 건조한 것이라야 양질의 대추가 된다. 과육에는 주로 당분이 들어 있으며 점액질·능금산·주석산 등도 들어 있다. 씨에는 베툴린·베투릭산·지방 등이 들어 있어 한방에서는 이뇨강장·건위진정·건위자양의 약재로 널리 쓰인다. 또한, 식용으로 널리 쓰여 관혼상제 때의 음식마련에는 필수적인 과실이다. 제상이나 잔칫상에 과실을 그대로 놓거나 조란·대추초 등의 과정류로 만들어놓으며, 떡이나 음식의 고명으로도 많이 이용된다.

본 발명의 감초는 통상적으로 사용하는 감초를 의미한다.

뿌리는 적갈색으로 땅속 깊이 들어가고 줄기는 모가 지며 1m 정도 곧게 자란다. 또한 흰털이 밀생하여 회백색으로 보이며 선점(腺點)이 흩어져 있다. 잎은 어긋나고 홀수깃꼴겹잎이다. 작은잎은 7∼17개씩이고 달걀 모양이며 끝이 뾰족하다. 작은잎의 길이는 2∼5cm, 나비 l∼3cm로 양면에 흰털과 선점이 있으며 톱니는 없다.

꽃은 7∼8월에 피는데 길이 1.4∼2.5cm로 보라색이며, 총상꽃차례로 잎겨드랑이에 달린다. 꼬투리는 선처럼 가늘고 긴 모양으로 활처럼 굽으며 신장형의 종자가 6∼8개씩 들어 있다. 뿌리는 단맛이 나서 감미료, 한약재로 사용한다.

시베리아산(G. glabra var. glandulifera), 에스파냐산(G. glabra) 등이 있다. 비슷한 종으로 개감초(G. pallidiflora)가 있다. 이는 단맛이 적고 감초와 달리 약용으로 쓰이지 않으며, 털이 적고 열매가 타원형이며 끝이 뾰족하다. 중국 동북부와 시베리아, 몽골 등지에 분포한다

본 발명은 황기 100 중량부에 방기 70~100중량부, 천오두 70~100중량부, 우슬 50~80중량부, 위령선 50~80중량부, 백출 50~80중량부, 건강 50~80중량부, 대추 50~80중량부, 감초 10~40 중량부를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.

본 발병은 상기한 조성물에 보조 조성물을 더 혼합하여 류마티스 관절염 예방 및 치료에 더욱 효과를 나타낼 수 있다.

상기 보조 조성물은 상기한 조성물에 황기 100중량부를 기준으로 구척 10~30중량부, 차전자 10~30중량부, 홍화씨 5~20중량부, 골담초 5~20중량부를 더 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 제공한다.

상기한 보조 조성물은 류마티스 관절염 예방 및 치료에 있어 항산화 및 항염증에 더욱 높은 효능을 나타낸다.

본 발명은 상기한 재료를 혼합한 원재료(100중량부)를 정제수(100~5,000 중량부)와 혼합하여 가열한 것을 추출하는 방법으로 조성물을 수득할 수 있다.

본 발명의 상기한 재료를 혼합한 원재료 100 중량부를 70~90% 주정(알코올) 1000~2000ml를 넣고 2~5시간 동안 환류 추출한 것을 여과하여 얻은 액을 Rotary Vacuum evaporator로 감압 농축하여 농축액을 수득한다.

상기 수득한 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 분말을 수득한 후 초저온 냉장고(-80도씨)에서 보관하여 실험에 따라 필요한 농도로 증류수로 희석하여 조성물을 수득한다.

또한 본 발명은 상기한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 포함한 약제학적 조성물을 제공한다.

상기의 약제학적 조성물은 관절염의 예방과 치료를 위한 약을 의미하며, 여기에 본 발명의 천연 조성물이 포함된 것을 의미한다.

본 발명에 따른 상기한 조성물은 류마티스 관절염 예방 및 치료에 현저한 효능이 있다.

<실시예>

1. (주) 옴니허브에서 상기한 황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선, 백출, 건강, 대추, 감초를 구입하여 이를 정선한 후, 황기 14g, 방기 12g, 천오두 12g, 우슬 12g, 위령선 9g, 백출 9g, 건강 9g, 대추 9g, 감초 9g를 혼합하여 준비한다.

2. 또한 황기 14g, 방기 9.8g, 천오두 9.8g, 우슬 9.8g, 위령선 7g, 백출 7g, 건강 7g, 대추 7g, 감초 1.4g를 혼합하여 준비한다.

3. 또한 황기 14g, 방기 14g, 천오두 14g, 우슬 14g, 위령선 11.2g, 백출 11.2g, 건강 11.2g, 대추 11.2g, 감초 5.6g를 혼합하여 준비한다.

4. 또한 황기 14g, 방기 14g, 천오두 14g, 우슬 14g, 위령선 11.2g, 백출 11.2g, 건강 11.2g, 대추 11.2g, 감초 5.6g, 구척 3g, 차전자 3g, 홍화씨 2g, 골담초 2g을 혼합하여 준비한다.

상기 준비된 원재료에 80% 주정 (C2H5OH) 1200 ㎖을 넣고 3시간 동안 환류추출 후 여과액을 얻어 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 분말 4.6~6g을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온 냉동고 (-80℃)에서 보관하면서 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석한 천연조성물(이를 "BHT"라고 함)을 사용하였으며 아래와 같은 실험 결과를 얻었다.

<실험결과>

실험동물인 수컷 5주령의 DBA/1 생쥐 (16∼22 g)는 ㈜중앙실험동물 (Seoul, Korea)에서 공급 받아 실험 당일까지 고형사료 (㈜퓨리나)와 물을 충분히 공급하고 온도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 15%, 12시간-12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 대전대 동물실험윤리 위원회의 승인 (동물사용 윤리위원회 승인번호DJUARB 2014-014)을 받아 동물윤리준칙에 의거하여 실험하였다.

1. 간 기능 검사

(1) 혈청 내에서 AST, ALT 활성도를 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 서울의과학연구소 (Seoul, Korea)에 분석 의뢰 하였다. AST, ALT 활성도는 JSCC UV method의 원리를 이용하여 생화학 자동분석기로 측정하였다.

(2) 결과

1) Aspartate aminotransferase ( AST ) 함량

간 기능 측정의 지표 성분인 AST를 측정한 결과, 정상군은 125.4±6.4 U/L, 대조군은 146.7±5.8 U/L, 양성 대조군은 165.6±7.1 U/L, BHT 투여군은 133.8±6.3 U/L로 나타나, 정상군과 비교하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다

2)Alanine aminotransferase (ALT) 함량

간 기능 측정의 지표 성분인 ALT를 측정한 결과, 정상군은 46.7±3.3 U/L, 대조군은 43.3±5.3 U/L, 양성 대조군은 63.3±2.1 U/L, BHT 투여군은 47.2±6.7 U/L로 나타나, 정상군에 비하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다

2. 신 기능 검사

(1) 혈청 내에서 creatinine, BUN 활성도를 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 서울의과학연구소 (Seoul, Korea)에 분석 의뢰 하였다. Creatinine의 함량은 Creatinine Jaffe Method 의 원리, BUN의 함량은 Kinetic UV assay for urea/urea nitrogen의 원리를 이용하여 생화학 자동분석기로 측정하였다

(2) ① Creatinine ( Cr ) 함량

신 기능 측정의 지표 성분인 creatinine을 측정한 결과, 정상군은 1.6±0.3 (㎎/㎗), 대조군은 1.2±0.6 (㎎/㎗), 양성 대조군은 1.6±0.3 (㎎/㎗), BHT 투여군은 1.4±0.7 (㎎/㎗)로 나타나, 정상군에 비하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다.

② Blood urea nitrogen (BUN) 함량

신 기능 측정의 지표 성분인 BUN을 측정한 결과, 정상군은 50.0±2.1 ㎎/㎗, 대조군은 46.7±3.8 ㎎/㎗, 양성 대조군은 43.3±4.2 ㎎/㎗, BHT 투여군은 43.3±3.9 ㎎/㎗로 나타나, 정상군에 비하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다

3. 세포독성 측정

(1) RAW 264.7 세포는 96 well plate에 2×10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 실험을 하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, BHT를 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.

(2) RAW 264.7 세포에서 세포 독성을 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 BHT 추출물의 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 111.0±2.7%, 108.9±5.5%, 95.5±1.3%의 세포 생존율을 나타내어 안전한 것으로 나타났

4. 항산화 효능 측정

(1) 항산화 효능은 총 phenol 함량 측정, 총 flavonoid 함량 측정, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능 측정, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radical 소거능 측정, 세포내 ROS (Reactive oxygen species) 생성 측정 등을 대조군과 비교한 결과를 보여준다.

(2) ① 총 페놀함량 측정은 BHT 추출물에 존재하는 총 phenol 함량을 gallic acid를 표준물질로 하여 측정한 결과,phenol 함량이 215.0±4.4 ㎎/g으로 나타났다.

② BHT 추출물에 존재하는 총 flavonoid 함량을 quercetin을 표준물질로 하여 측정한 결과, flavonoid 함량이 22.3±1.4 ㎎/g으로 나타났다.

이와 같은 결과는 대조군에 비하여 매우 유의 있는 결과를 보여준다.

③ 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능 측정

BHT 추출물의 DPPH 소거율을 측정한 결과, 1 ㎍/㎖ 농도에서 10.8±0.6%, 10 ㎍/㎖ 농도에서 12.6±0.9%, 100 ㎍/㎖ 농도에서 21.7±0.6%, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 66.3±2.5% 로 나타나 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가함을 보였다

④ 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radical 소거능 측정

BHT 추출물의 ABTS 소거율을 측정한 결과, 1 ㎍/㎖ 농도에서 9.7±1.2%, 10 ㎍/㎖ 농도에서 10.1±2.2%, 100 ㎍/㎖ 농도에서 20.9±1.4%, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 70.1±4.0% 로 나타나 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가함을 보였다.

⑤ 세포내 ROS (Reactive oxygen species) 생성 측정

BHT 추출물의 ROS 생성 저해 활성을 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 정상군은 19.3±7.1%, BHT 추출물은 1 ㎍/㎖ 농도에서 92.2±2.5%, 10 ㎍/㎖ 농도에서 90.0±3.0%, 100 ㎍/㎖ 농도에서 87.0±3.1%로 나타나, 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소를 나타내었다.

5. 항염증 효능 측정

(1) 향염증 효능은 RAW 264.7 세포에 BHT 추출물을 실험하여 Nitric oxide (NO)의 생성량에 미치는 영향, 사이토카인 및 케모카인 생성량 측정으로 항염증 효능을 측정하였다.

또한 세포 내에서 염증성 사이토카인을 12 well plate에 RAW 264.7 세포를 2×10⁵ cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고, BHT 추출물을 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고, LPS 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 원심분리 후 상청액으로 IL-1β, IL-6, TNF-α는 Luminex를 이용하여 측정하였으며, IL-17, IL-21, MCP-1, GM-CSF는 ELISA Reader기를 이용하여 측정하였다.

(2) ① Nitric oxide (NO)의 생성량에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 BHT 추출물의 NO 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100.0±3.7%로 나타냈을 때 정상군은 38.2±1.4%, BHT 추출물은 1 ㎍/㎖ 농도에서 97.5±4.4%, 10 ㎍/㎖ 농도에서 93.3±5.0%, 100 ㎍/㎖ 농도에서 89.7±4.0%로 나타나, 대조군에 비하여 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소를 나타내었다

② 사이토카인 및 케모카인 생성량 측정

1) IL-1β 생성량에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 BHT 추출물의 IL-1β 생성량을 측정한 결과, 대조군이 28.6±1.7 pg/㎖, 정상군이 6.1±2.3 pg/㎖, BHT 추출물은 1 ㎍/㎖ 농도에서 28.3±2.1 pg/㎖, 10 ㎍/㎖ 농도에서 26.6±2.7 pg/㎖, 100 ㎍/㎖ 농도에서 20.7±3.3 pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 100 ㎍/㎖의 농도에서 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소를 나타내었다

2) IL-6 생성량에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 BHT 추출물의 IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군이 1419.7±182.5 pg/㎖, 정상군이 342.6±168.9 pg/㎖, BHT 추출물은 1 ㎍/㎖ 농도에서 1355.7±156.4 pg/㎖, 10 ㎍/㎖ 농도에서 1233.1±188.6 pg/㎖, 100 ㎍/㎖ 농도에서 1200.9±103.8 pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 모든 농도에서 감소를 나타내었다

3) TNF-α 생성량에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 BHT 추출물의 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군이 10096.9±330.8 pg/㎖, 정상군이 3412.6±66.7 pg/㎖, BHT 추출물은 1 ㎍/㎖ 농도에서 9477.1±210.8 pg/㎖, 10 ㎍/㎖ 농도에서 9504.9±332.2 pg/㎖, 100 ㎍/㎖ 농도에서 8544.3±345.4 pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 100 ㎍/㎖의 농도에서 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소를 나타내었다

6. 류마티스 관절염에 대한 효과

5주령의 DBA/1 생쥐를 2주간 안정기를 거친 뒤 7주령이 된 생쥐에 2 ㎎/㎖ 농도의 Bovine 제2형 콜라겐 용액을 동일한 농도의 complete Freund’s adjuvant (CFA)와 1：1의 비율로 혼합하며, 혼합액 0.1 ㎖ (제2형 콜라겐 100μg)을 꼬리의 기저부에서 1.5∼3 cm 아래쪽의 피내를 통해 천천히 주입하여 1차 유발을 하였다. 1차 유발 후 2주 후에 1차 시기와 동일하게 CFA 대신 incomplete Freund’s adjuvant (IFA)과 혼합하여 한쪽 발바닥에 주사하여 유발하였다. 실험은 정상군과 증류수를 투여하는 대조군, indomethacin (이하, Indo로 표기) 투여하는 양성대조군 및 BHT를 투여하는 실험군 등 총 4개의 그룹으로 나누어 매일 1회, 오후 2시에 200 ㎕ (200 ㎎/㎏)씩 경구 투여하였다. 실험이 진행되는 동안 자유 식이를 하였다. BHT 및 Indo 투여량은 1회 분량을 성인 체중 60 kg에 1회 섭취량으로 하고, 1회 섭취량으로부터 얻은 시료를 마우스 체중 30 g으로 기준하여 산출하였다.

(1) Rheumatoid arthritis index score (AI) 측정

1) RA 지수 (Rheumatoid Arthritis index score) 확인을 위하여 2차 주사 이후에 DBA/1 생쥐의 각 4개의 발 (paw)에서 각 발마다 0∼4점 (총 0∼16점)의 임상점수, 발목 두께의 변화, 발생률 등을 측정하였다. 측정은 9주차부터 13주차까지 매주 마다 기록하였으며 기준은 아래의 [표 1]과 같다.

Standard of Rheumatoid Arthritis Index Score
Rheumatoid Arthritis index	Inflammation-induceddegree
0	no arthritis
1	small degree of arthritis
2	light swelling
3	medium swelling
4	severe swellin

2) 결과

양성 대조군과 BHT 투여군을 실험이 실시되는 5주동안 육안적으로 관찰한 결과, Fig. 40은 9주, 11주, 13주의 RA 개선 정도를 나타내주는 사진으로, 대조군에서 발 (paw)과 발목 및 마디 등에 부종이 지속되는 반면, 양성 대조군과 BHT 투여군은 점차 감소되어 13주차에 대조군에 비하여 큰 감소를 나타내었다(Fig. 40). 이와 같은 결과는 AI에 반영되어 나타났다. AI 지수는 RA를 유발한 후 9주차부터 13주차까지 매주 사진촬영을 한 후에 RA 심화 정도를 관능적 방법에 의하여 측정한 결과로, 대조군은 9주차에서 12.2±0.3, 10주차에서 14.3±0.4, 11주차에서 13.5±0.3, 12주차에서 11.9±0.4, 13주차에서 11.4±0.3의 결과가 나타났으며, 양성 대조군은 9주차에서 12.1±0.1, 10주차에서 11.0±0.4, 11주차에서 8.7±0.3, 12주차에서 7.9±0.5, 13주차에서 5.9±0.4의 결과를 나타났으며, BHT 투여군은 9주차에서 12.0±0.3, 10주차에서 12.7±0.3, 11주차에서 11.0±0.7, 12주차에서 9.8±0.6, 13주차에서 8.5±0.8으로 대조군에 비하여 모두 유의성 있는 (*** : p<0.001) 감소를 나타내었다.(도 1 및 도 2참조)

(2) 관절에 미치는 영향 결과

1) 관절 상태에 미치는 영향

실험 종료 후 후족부를 micro-CT로 촬영하여 3D로 변환한 결과, 대조군에서는 중족지 관절과 근위지 관절의 변형과 마디사이의 파괴가 심하게 일어났음을 확인할 수 있었으며(도 3-A, B 사각형), BHT 투여군에서는 양성 대조군과 더불어 중족지 관절과 근위지 관절의 변형과 마디사이의 파괴가 상대적으로 적게 나타났음을 확인할 수 있었다.(도 3 참조)

2) 골밀도에 미치는 영향

실험 종료 후 후족부를 3D μCT로 분석하여 BV (bone volume)에 대한 ratio를 산출하여 골밀도를 측정한 결과, 정상군은 0.36±0.03 (U^3), 대조군은 0.21±0.05 (U^3), 양성 대조군은 0.37±0.10 (U^3), BHT 투여군은 0.38±0.06 (U^3)로 나타나, 대조군에 비하여 골 밀도 수치가 높게 나타내었다(도 4 참조)

3) 관절 염증에 미치는 영향

실험 종료 후 후족부를 3D micro-CT로 분석하여 BS (bone surface)와 BV (bone volume)에 대한 ratio를 산출하여 관절의 염증정도를 측정한 결과, 정상군은 17.10±0.5 (1/U), 대조군은 26.9±4.7 (1/U), 양성 대조군은 17.0±1.7 (1/U), BHT 투여군은 18.0±0.7 (1/U)로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 5 참조).

본 발명은 상기한 조성으로 이루어진 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 천연 조성물을 제공한다.

본 발명은 생약, 약초를 이용하여 관절염을 치료하는 기능성 식품, 약제 등을 생산, 가공, 유통, 판매, 연구하는 산업에 매우 유용하다.

Claims (2)

1. 황기, 방기, 천오두, 우슬, 위령선, 백출, 건강, 대추, 감초를 혼합하여 추출한 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물.
   
2. 제1항의 류마티스 관절염 예방 및 치료에 효능이 있는 조성물을 포함하는 약제학적 조성물.
   
   

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