KR20170128738A

KR20170128738A - 단일염기다형성을 이용한 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물, 및 이를 이용한 꾸지뽕 계통 및 교잡종 판별 방법

Info

Publication number: KR20170128738A
Application number: KR1020160059052A
Authority: KR
Inventors: 이신우; 김윤희; 신용욱; 이수진; 김광연
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2017-11-23
Also published as: KR101855984B1

Abstract

본 발명은 단일염기다형성을 이용한 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물, 및 이를 이용한 을 꾸지뽕 계통 및 교잡종 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 한국 및 중국 꾸지뽕(Cudrania tricuspidata Bureau) 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있고 더 나아가 교잡종 여부, 교배 조합 및 한약재에 혼재되어 있는 계통의 혼합 비율도 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.

Description

단일염기다형성을 이용한 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물, 및 이를 이용한 꾸지뽕 계통 및 교잡종 판별 방법{composition comprising SNP markers for a differentiation of Cudrania tricuspidata Bureau lines, and method for a differentiation of Cudrania tricuspidata Bureau lines and hybrid using the same}

본 발명은 단일염기다형성을 이용한 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물, 및 이를 이용한 꾸지뽕 계통 및 교잡종 판별 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 한국 및 중국 꾸지뽕(Cudrania tricuspidata Bureau) 계통을 판별할 수 있는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 기반으로 하는 엽록체 또는 핵 내 유전자 단편 증폭용 PCR 및 HRM 커브(high resolution melting curve) 분석용 마커 조성물, 및 이를 이용한 꾸지뽕 계통 및 교잡종을 판별할 수 있는 꾸지뽕 계통 및 교잡종 판별 방법에 관한 것이다.

우리나라의 남부지역 일대의 야산에서 자생하고 있는 꾸지뽕 나무 (Cudrania tricuspidata Bureau)는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하는 낙엽활엽 소교목으로 자웅이주이며 줄기에는 1.0~3.5㎝의 가시가 있고 근피는 황색을 띠면서 천근성이며 10월경 붉은 열매가 맺히는 특징이 있다. 꾸지뽕 나무는 식용(잎, 열매), 약용(줄기), 토목공사재, 누에의 사료(잎) 등으로 이용된다. 또한, 꾸지뽕 나무의 잎을 누에에 먹이면 실을 뽑아 거문고나 가야금 등의 줄을 만드는데 보통의 실을 쓰는 것보다 훨씬 좋고 소리가 맑고 청아하여 멀리까지 퍼져나간다고 알려져 있다(최한기 농촌진흥청 (2006) 고농서국역총서 10호 농정회요 II, 347). 이외에도 꾸지뽕 나무는 조경용, 섬유용(잎), 상황버섯 종균 접목 등의 용도로 활용된다.

또한, 꾸지뽕 나무는 병충해에 강하여 농림업 분야에서 좋은 소득작목이다. 현재 꾸지뽕 나무의 줄기와 뿌리는 민간에서 암 치료용으로 많이 사용되고 있음에 불구하고 줄기와 뿌리는 식품원료로서의 사용이 제한되고 있어서 열매와 잎만이 식용으로 사용 가능하다. 꾸지뽕 나무의 잎은 열수 추출하거나 건조 후 분말로 만들어 제빵의 부원료 등으로, 꾸지뽕 나무의 열매는 식용으로 잼을 만들거나 술을 담그는데 이용되고 있다.

꾸지뽕 나무의 잎은 녹차잎과 뽕잎에 비하여 단백질, 식이섬유, 비타민 B1, 비타민 B2, 칼슘, 칼륨, GABA(γ-amino byturic acid), 루틴(rutin) 등의 함량이 높다. 따라서 녹차대용으로서의 엽차, 추출물로 다수 개발되고 있다. 하지만 꾸지뽕 나무는 가시가 많아 농가에서 잎, 열매를 채취하는데 노동력과 시간이 많이 소모되므로 가시가 없는 개량종 보급이 진행중에 있으나 개량종과 재래종 간의 약효에 대한 검증이 이루어지지 않아 보급의 걸림돌로 작용하고 있는 것이 현실이다.

꾸지뽕 나무에 관한 연구는 항암 활성 물질의 탐색 등으로 간암 세포인 HepG3에 세포독성을 보이는 물질들이 동정 되었고, Zou 등(2005, Chem Biodivers. 2 (1) : 131-138)은 꾸지뽕 근피로부터 소화기계 암 세포주에 저해활성을 보이는 이소프레닐화 크산톤(isoprenylated xanthone) 또는 이소프레닐화 플라바논(isoprenylated flavanones)계에 속하는 물질들을 분리하였다. 또한 Wang 등(2005, Planta Med. 71 (3) : 273-274)은 이소프레닐화 크산톤(isoprenylated xanthone)인 쿠드라푸루티크산톤 A (cudrafrutixanthone A) 화합물을 꾸지뽕 뿌리에서 분리하여 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주의 활성을 저해하는 항진균 작용도 확인하였다고 보고하였다. An 등(2006, Biol Pharm Bull 29: 838-840)은 간암에 효능이 있음을 보고하였고, Tian 등(2005,Arch Pharm Res. 28(1): 44-48)도 HepG2 cell에 타크린(Tacrine)으로 유도한 간 독성을 저해하는 결과를 보고하였다. 이외에도 꾸지뽕 나무는 혈압강하작용(Kang 등, 2002, Life Sci 70:2599-2609), 항우울 작용, 파킨슨병 예방 (Han 등, 2005, Arch Pharm Res.28(12):1324-1327), 고지혈증과 동맥경화 억제(Park 등, 2006, Bioorg Med Chem Lett 16: 5580-5583)의 효능이 있음이 보고되었다.

꾸지뽕이 속하여 있는 뽕나무과(Molaceae)는 세계적으로 73속 1,000여종이 분포하고 있다고 알려져 있으며, 국내에는 5속 10여종이 서식하고 있는 것으로 보고된 바 있다(Lee 등, 1985, Shingo plantbtaxonomy, Hyangmunsa;1986, Dendrology, Hyangmunsa). 또한, 꾸지뽕 나무는 인도, 중국, 호주에 각각 3종과 일본에 2종이 자생하고 있는 것으로 보고되었다(上原敬仁, 1959, 樹木大圖設, 有明書房, 東京).

최근 나고야의정서의 발효 등의 국제추세에 따라 자국의 유전자원의 발굴, 보존 등이 강화됨에 따라 중국과 한국 꾸지뽕 계통을 판별할 수 있는 기준 설정에 관한 연구의 필요성이 대두 되었다. 특히 기존에 수행되었던 형태학적인 연구 결과(Kwon 등, 2014, Korean J Plant Research 27(4):337-343)를 기초로 하여 세포학적, 생화학적, 또는 분자생물학적 판별 기술의 개발이 더욱더 필요한 실정이다. 최근 Sung 등이 한국잠사학회(2001,Korean J. Seric. Sci. 43(1):1-8)에 발표한 바에 따르면 ITS 지역의 염기서열을 비교분석한 결과 꾸지뽕 나무는 다른 뽕나무속 식물과 쉽게 구분이 가능한 다양한 SNP를 확인하였다고 하였다. 그러나 지역별로 수집한 꾸지뽕 나무 계통간 또는 암수나무 사이에는 염기서열의 큰 차이가 없었다고 하였다. 이어서 Oh 등(2012, J. Agri & Life Sci, 43(2):32-36)은 국내에 분포하고 있는 꾸지뽕 나무를 8개 그룹으로 그 계통을 분류하여 암ㆍ수나무를 구분하여 ITS 영역의 염기서열을 비교분석한 결과 99.4에서 99.8%이상의 유의성을 보였으며, 지역별로 암ㆍ수 계통 간에 단일염기다형성을 확인할 수 있었다고 하였다. 그러나 이후 추가적인 연구결과가 보고된 것이 없어 최근에는 보다 진전된 분자생물학적 기술을 적용한 판별 마커의 개발이 절실한 실정이다.

본 발명의 발명자들은 국내에서 수집하여 증식 및 보관 중에 있는 중국 또는 국내 꾸지뽕 계통을 구분하기 위하여, 엽록체에 존재하는 TrnL과 TrnF 유전자의 일부와 유전자간 DNA(intergenic DNA)를 포함하는 단편과 matK 유전자 단편을 PCR로 증폭한 후 염기서열을 분석하여 기존에 등록된 진뱅크(GenBanK)로부터 유전자의 염기서열을 비교하여 SNP를 보이는 부위를 포함하는 프라이머를 제작하여 각각의 기원을 조사하여 판별할 수 있는 마커를 개발하고, 상기 마커를 기반으로 하는 엽록체 또는 핵 내 유전자 단편 증폭용 PCR 및 HRM 커브(high resolution melting curve) 분석용 마커 조성물, 및 이를 이용한 꾸지뽕 계통 및 교잡종을 판별할 수 있는 꾸지뽕 계통 및 교잡종 판별 방법을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 SNP 마커를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 꾸지뽕 계통 판별용 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 의한 SNP 마커를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 꾸지뽕 교잡종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확하게 꾸지뽕 계통을 판별할 수 있는 꾸지뽕 계통 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확하게 꾸지뽕 교잡종을 판별할 수 있는 꾸지뽕 교잡종 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 18 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 20 및 21의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나 이상의 프라이머쌍; 및 서열번호 18 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 20 및 21의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 교잡종 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 22 및 23의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 24 및 25의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 26 및 27의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 꾸지뽕 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, (a) 꾸지뽕 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (c) 서열번호 18 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 20 및 21의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (d) 단계 (b)의 PCR 산물 및 단계 (c)의 PCR 산물을 확인하고 비교하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 교잡종 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 꾸지뽕 계통 판별용 SNP 마커를 활용하여 한국 토종 및 중국 계통의 기원을 정확하고 신속하게 판별할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, ARMS-PCR 및 HRM 커브 패턴 분석용 프라이머쌍을 제공하여 꾸지뽕 계통 판별의 신속성 및 정확성을 더욱 개선할 수 있다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 핵내에 존재하는 ITS Ⅰ과 Ⅱ에 존재하는 SNP 마커를 이용하여 PCR용 프라이머쌍을 제공하며, 상기 프라이머쌍과 엽록체에 존재하는 trnL-trnF 및 matK 유전자 단편에서 개발한 판별 마커를 상호 이용하면 두 계통간의 상호 교배에 의해 생산된 교잡종 여부 및 교잡종의 교배 조합의 부본 및 모본을 판별할 수 있다.

따라서 본 발명에 의하면, 한약재에 다양한 형태로 혼용 또는 혼재되어 있는 꾸지뽕 계통의 혼합 비율도 용이하게 확인할 수 있다.

도 1은 한국 및 중국 계통 꾸지뽕의 trnL- trnF 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 한국 및 중국 계통 꾸지뽕의 matK 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 trnL-trnF 유전자 단편에서 ARMS-PCR 용 프라이머 위치를 포함하여 디자인한 모식도를 나타낸 도면이다.
도 4는 trnL-trnF 유전자 단편의 단일염기다형성을 이용하여 제작한 프라이머를 이용한 ARMS-PCR 결과를 나타낸 도면으로, 시료번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8은 중국계통, 시료번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16은 한국계통이다.
도 5는 ARMS-PCR(trnL-trnF 마커) 기술을 이용한 국내에서 수집된 꾸지뽕 계통들의 기원을 판별한 결과를 나타낸 도면으로, 시료번호는 표 1에 기술한 수집된 지역을 각각 표시한 것이다.
도 6은 한국 및 중국 계통에 대한 핵 내에 내재하는 ITS 단편의 염기서열 비교 분석 결과로서, 계통 판별용 마커 개발을 위한 프라이머는 화살표로 표시되어 있으며 각각 두 개의 단일염기다형성을 나타내는 부위를 3′-말단에 위치하게 디자인하였다.
도 7은 핵 내에 내재하는 ITS 유전자 단편의 단일염기다형성을 이용하여 제작한 프라이머로 국내에서 수집된 꾸지뽕 유전자원의 기원을 판별한 결과를 나타낸 도면으로, 시료번호는 표 1에 기술한 수집된 지역을 각각 표시한 것이다.
도 8은 한국 및 중국 계통간의 교잡종으로 추정되는 계통(수집번호 2016-10, 표 1 참조)에 대한 엽록체 판별 마커(trnL-trnF)와 핵 내에 내재하는 ITS 판별 마커를 이용한 PCR 결과를 나타낸 도면으로서, Lane 1, 2, 3은 잎, Lane 4, 5, 6은 줄기에서 분리한 DNA를 사용한 것으로 2016-10번 시료에 대하여 3 반복 실험을 수행한 결과이다.
도 9는 trnL-trnF, matK, ITS 유전자의 HRM-커브 분석용 프라이머 조합에 대한 PCR 결과를 나타낸 도면으로서, 각각의 유전자에 대한 예상한 크기의 단일밴드가 증폭됨을 확인한 결과이다.
도 10은 엽록체 유전자(trnL-trnF, matK)와 핵 내 유전자 (ITS) 단편을 이용한 HRM 커브 패턴에 따른 중국 및 한국 꾸지뽕 계통의 판별 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 SNP 마커는 서열번호 2의 62번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커 및 서열번호 2의 395번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커 중 적어도 하나이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 염기서열은 서열번호 2의 805번째 부위에서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열이 반복된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유전자는 trnL-trnF 유전자에서 유래된 것이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 SNP 마커는 서열번호 5의 32번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 55번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 153번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 5의 378번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 409번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 416번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 599번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 및 서열번호 5의 692번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유전자는 matK 유전자에서 유래된 것이다.

본 발명에서는 상기 SNP를 확인한 후 그 SNP에 이웃하고 있는 2, 또는 3번째의 염기를 변경하여 미스매치 프라이머(mismatch primer)를 제작하여 PCR 반응과정에서 특이성을 증대시킨 ARMS-PCR(amplification refractory mutation system-PCR)기술을 적용하여 판별력의 정확도를 더욱 높였다(Han 등, Mol Biol Rep (2016) 43:323332).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 키트는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함한다.

본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 DNA 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마이크로어레이 키트일 수 있다.

본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 SNP 마커는 서열번호 15의 38번째 뉴클레오타이드가 A인 SNP 마커, 서열번호 15의 40번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 서열번호 15의 167번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP, 서열번호 15의 363번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP, 서열번호 15의 379번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP, 서열번호 15의 385번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP, 서열번호 15의 458번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP, 및 서열번호 15의 462번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 유전자는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래된 것이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 꾸지뽕 교배 조합 판별이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 고해상도 융해 분석(High resolution melting analysis)을 위한 것이다.

본 발명에서는 HRM 커브 분석기술을 이용하여 단지 하나의 단일염기다형성을 포함하는 두 계통을 정확하고 신속하게 판별할 수 있게 하였다(Han 등, Mol Biol Rep (2016) 43:323332).

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 꾸지뽕 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 본 발명의 따른 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하여 서열번호 2의 62번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커 및 서열번호 2의 395번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 한국산 꾸지뽕 계통으로 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 18 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 20 및 21의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하여 서열번호 15의 38번째 뉴클레오타이드가 A인 SNP 마커, 서열번호 15의 40번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 서열번호 15의 167번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 15의 363번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 15의 379번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 서열번호 15의 385번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 15의 458번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 및 서열번호 15의 462번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 한국산 꾸지뽕 계통으로 판별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, (a) 꾸지뽕 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 제8항 기재의 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; (c) 제13항 기재의 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (d) 단계 (b)의 PCR 산물 및 단계 (c)의 PCR 산물을 확인하고 비교하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 교잡종 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 꾸지뽕 시료가 단계 (b)의 PCR 산물을 확인한 결과 한국산 꾸지뽕으로 판별되고 단계 (c)의 PCR 산물을 확인한 결과 중국산 꾸지뽕으로 판별된 경우, 꾸지뽕 시료를 한국계통을 모본으로 하는 교잡종으로 판별할 수 있다.

본 발명에서는 엽록체와 핵 내에 내재하는 유전자 단편의 단일염기다형성을 이용한 ARMS-PCR 기술을 적용하여 중국과 한국 토종 계통의 판별과 함께 이들의 혼재율, 상호교배에 의한 교잡종의 여부 등도 판별이 가능하다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명은 보다 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

시료

하기 실험에서 사용한 구지뽕 계통은 경남 산청군 생비량면의 농가(김광연)에서 중국 혹은 한국 계통의 기원이 확실하게 알려진 계통을 확보하였으며, 이 외에 경남 진주시 대곡면, 경남 의령군 대의면, 경남 진주시 미천면 대암, 경남 밀양 등의 꾸지뽕 재배 농가 혹은 전남 해남군 송지면 송호리 산 45번지의 땅끝마을 등에서 분양받거나 직접 채취한 시료들을 대상으로 조사하였다 (표 1 참조).

표 1은 수집 및 보관중인 꾸지뽕 계통 현황에 관한 것이다.

<실시예 1>

계통별 게놈 DNA 분리

수집된 계통별로 일정량의 뿌리, 종자, 잎 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 얻은 분말을 이용하여 GeneAll사의 Exgene^TM Plant SV 킷트를 이용하여 회사에서 제공한 실험방법에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리과정에서의 분해 정도를 확인한 후 Micro-spectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 234nm, 260nm, 280nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A₂₆₀/A₂₈₀ 값이 1.8-2.2 범위 그리고 A₂₃₄/A₂₆₀ 값이 0.5-0.8 범위 내 포함 여부를 조사하여 RNA 및 단백질 등의 오염정도를 확인하여 순수한 DNA를 확인하였다.

<실시예 2>

엽록체 유전자( trnL-trnF 와 matK )의 증폭 및 염기서열 분석

엽록체 유전자 내의 단일염기다형성을 확인하고자 trnL-trnF 유전자 단편과 matK 유전자 단편의 증폭을 위하여 표 2에 요약한 바와 같이 기존에 알려진 유전자의 염기서열정보를 사용하여 각각의 프라이머를 제작하였다. 즉 trnL-trnF 유전자단편은 GenBank에서 Accession number (JN006418.1), 그리고 matK 유전자 단편은 (JF317421.1)의 염기서열들로부터 각각의 프라이머를 제작하였다.

표 2는 엽록체 게놈의 SNP 개발을 위하여 사용한 프라이머의 정보에 관한 것이다.

유전자의 증폭은 iNtRON 회사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하여 중합반응과정에서 야기 될 수 있는 돌연변이를 최소화하였다. 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA 50 ng과 프라이머를 각각 10 pmole을 혼합 한 후 94℃에서 5분간 DNA를 변성 시킨 후 94℃에서 30초, 60℃에서 10초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 72℃에서 5분간 연장반응을 시킨 후 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA 밴드는 2.0% agarose gel을 이용하여 전기 영동하여 그 결과를 확인하였다. 증폭된 각 유전자 단편의 클로닝 과정에서 돌연변이가 일어날 수도 있으므로 클로닝을 하지 않고 증폭된 DNA단편을 Expin^TM PCR SV (GeneAll, Seoul, South Korea)Kit를 사용하여 순수정제한 후 직접 염기서열분석을 의뢰하였다. 또한, 최종적으로 확인된 단일염기다형성(SNP)은 최소 5 반복 이상 수행하여 검정하였다.

<실시예 3>

엽록체 유전자 단편( trnL-trnF 와 matK ) 내에 존재하는 단일염기다형성의 확인

국내 토종으로 알려진 한국산과 중국에서 도입된 종으로 알려진 꾸지뽕 계통들을 대상으로 trnL - trnF 와 matK 유전자 단편을 증폭하여 염기서열 분석을 수행하여 그 결과를 비교하여 본 바, 예상한 바와 같이 아주 유사한 것으로 조사되어 trnL-trnF 유전자 단편(서열번호 1 및 2)의 경우에는 단지 2개(도 1 참조), matK 유전자 단편(서열번호 4 및 5)의 경우에는 10개 (도 2 참조)의 위치에서 염기서열의 치환(substitution)이 일어나 서로 다른 단일 염기단일염기다형성 패턴을 확인할 수 있었다. 특이하게도 한국산의 경우에는 trnL - trnF 유전자 단편의 약 805bp 부위에서 12 bp(TTTTTAATTGAC)가 반복되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

<실시예 4>

엽록체 유전자 단편( trnL-trnF )에 대한 ARMS-PCR용 프라이머를 이용한 한국 및 중국 꾸지뽕 계통의 판별용 마커 개발

일반적으로 단일염기다형성을 이용하여 제작한 미스매치 프라이머(mismatch primer)를 사용하여 특정 계통을 판별하기 위한 시도를 많이 하고 있으나, 하나 혹은 두 개의 미스매치(mismatch) 서열에 대한 프라이머가 제대로 작동을 하지 않고 원하는 결과를 얻지 못하는 경우가 많다. 따라서 우선 trnL-trnF 유전자의 단일염기다형성을 나타내는 염기를 3′-말단에 위치하게 하고, 5′-말단 쪽으로 첫 번째 또는 두 번째의 염기를 인위적으로 변형시킨 프라이머를 사용하여 특이성을 향상시킬 수 있는 ARMS-PCR 기술을 도입하고자 하였다.

도 3은 trnL-trnF 유전자의 SNP를 기준으로 5′-말단 쪽으로 2번째의 염기를 각각 다른 염기로 치환하여 ARMS-PCR용 primer를 제작한 결과를 도식화한 것이다. 이들에 대한 각각의 프라이머에 대한 염기서열 정보는 표 3에 요약하였으며 염기가 다른 미스매치(mismatch) 부분을 빨간색으로 표시하였다. 즉, 양 방향 프라이머에 대하여 모두 ARMS-PCR용 프라이머를 제작하여 각각의 프라이머를 이용하여 온도별 조건을 확립하기 위한 PCR 반응을 수행한 결과 도 4에서 요약한 바와 같이 trnL-trnF 유전자의 경우 한국산과 중국산 특이 프라이머 모두 55℃에서 양호한 결과를 얻었다.

표 3은 trnL-trnF 유전자의 단일염기다형성을 중심으로 제작한 ARMS-PCR용 프라이머 정보에 관한 것이다.

이러한 결과를 바탕으로 지역별로 수집한 꾸지뽕 계통에 대한 기원을 판별하는 실험을 수행하고자 표1에서 기술한 자원들에 대하여 게놈 DNA를 분리한 후 상기한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 도 5에 요약하였다. Forward와 reverse 방향 프라이머 모두에 인위적으로 염기를 변형시켜 제작한 ARMS-PCR용 프라이머를 사용하여 경남 산청군 생비량면의 김광연씨 농가에서 수집한 중국 또는 한국 계통의 기원이 확실하게 알려진 계통을 대조구(수집번호, 41, 42)로 하여 ARMS 프라이머의 작동 여부를 확인한 후(도 4 참조), 경남 진주시 대곡면(자원 수집번호, 36, 36-1), 경남 의령군 대의면(37), 경남 산청군 생비량면(38), 경남 진주시 미천면 대암(39), 그리고 전남 해남군 송지면 송호리 산 45(30, 31)에서 수집된 대상으로 분석한 결과 모두 한국산으로 판명되었다(도 5).

<실시예 5>

한국 및 중국 꾸지뽕 계통의 교잡종 판별에 이용될 수 있는 핵내 DNA 판별마커 개발

한국 및 중국 꾸지뽕 계통은 종이 같은 것으로 상호 교잡이 가능할 것으로 판단되며 특히 최근에 중국에서 도입된 중국종이 대량으로 재배되면서 국내 전역에서 한국산 계통과 사로 교잡이 되어 유통되고 있을 것으로 추정된다.

이러한 교잡종은 상기한 엽록체 내에 존재하는 판별 마커로는 구분이 불가능 할 수도 있다. 따라서 엽록체에 존재하는 유전자는 모계유전을 하고 핵에 존재하는 유전자는 교배에 의하여 유전을 하기 때문에 핵 내에 존재하는 리보좀 DNA(ribosomal DNA)를 암호 하는 유전자의 전사단위 내에 존재하는 ITS(intergenic transcribed spacer) 지역의 유전자 단편에 나타나는 단일염기다형성을 확인한 다음 그것을 근거로 하여 각각을 구분할 수 있는 판별 마커를 개발하여 교잡종도 판별할 수 있도록 하였다.

ITS 유전자 단편의 염기서열을 확보하고자 먼저 꾸지뽕의 리보솜 DNA(ribosoaml DNA)의 전사단위 내에 존재하는 18S rRNA와 28S rRNA를 암호 하는 유전자를 GenBank에서 검색하여 기존에 알려진 염기서열 정보로부터 프라이머(표 4 참조)를 제작하여 중국과 한국 꾸지뽕 계통(시료번호 41, 42, 표 1 참조)으로부터 분리한 게놈 DNA를 이용하여 PCR로 증폭하여 얻은 단편을 직접 염기서열 분석(서열번호 4 및 5)하여 상호 비교한 결과 아주 역시 예상한 바와 같이 아주 유사하여 단지 8개 정도의 염기만이 치환이 일어난 것으로 조사되었다(도 6). 주어진 염기서열을 기준으로 두 개의 단일염기다형성을 포함하는 양방향 프라이머쌍을 제작하여 이들 두 계통을 판별하고자 하였으며 (표 4 참조) 프라이머의 위치는 도 6에서 화살표로 표시하였다. 양방향 프라이머 모두 두 개의 SNP를 포함하고 있기 때문에 인위적으로 변이를 유기시키는 ARMS-PCR 기술은 적용하지 않았다.

표 4는 한국 및 중국 꾸지뽕 계통간 교잡종을 판별하기 위한 핵 내 ITS DNA의 SNP를 포함하는 프라이머의 정보에 관한 것이다.

상기한 프라이머를 이용하여 trnL-trnF 유전자 마커로 모두 한국산으로 확인된 지역별로 수집된 꾸지뽕 자원에 대하여 PCR을 수행한 결과 역시 모든 자원에서 한국산으로 밝혀졌다(도 7 참조). 이 결과는 모계 유전을 하는 엽록체에 존재하는 trnL-trnF 유전자의 염기서열로부터 제작한 중국 및 한국 특이 프라이머를 사용하여 확실하게 구분이 가능하였던 계통에 대하여 핵 내에 존재하는 ITS 유전자 단편의 단일염기다형성을 기초로 제작한 프라이머로도 동일한 결과를 얻었으므로 이들 유전자원은 모두 그 기원이 한국인 것이 확실하다고 할 수 있다.

또한, 한국과 중국 꾸지뽕은 동일한 학명을 사용하고 있으므로 같은 종이나 국가별로 그 계통이 서로 다른 것으로 이들 두 계통은 상호 교잡이 가능하다. 따라서 상호교잡이 일어난 경우에는 엽록체 유전자 마커로는 구분이 불가능하기 때문에 핵 내에 존재하는 ITS 유전자를 이용할 수 있도록 별도로 판별 프라이머를 작성하였다. ITS 판별 프라이머를 사용하여 경남 밀양의 재배 농가로부터 수집한 한 계통(수집 번호 2016-10, 표 1 참조)에 대하여 분석을 한 결과, trnL-trnF 유전자 마커로는 모두 한국산으로 판명되었으나 ITS 마커로는 한국뿐만 아니라 중국 특이 프라이머를 사용한 경우에도 동일한 크기의 PCR 산물이 생성된 것으로 조사되었다(도 8 참조). 이러한 결과는 아마도 한국계통을 모본으로 하여 중국계통의 꽃가루가 수분 되어 수정이 일어나 그 결과로 나타난 교잡종이라 할 수 있을 것이다. 이와 유사한 연구결과로 Zeng 등(2015, PLoS One, 13(8):e0135411), 뽕나무과(Moraceae), 뽕나무속(Morus)의 ITS 유전자 염기서열의 비교분석 결과 8개 그룹으로 종을 구분할 수 있다고 제시하였으며, 특히 종간 교잡종도 확인할 수 있었다고 하였다. 또한, Burgess 등(2007, New Phytologist 177:276-284)도 역시 같은 뽕나무속에 속하는 붉은 색의 열매를 맺는 mulberry (Morus ruba)가 외국에서 도입된 도입종인 흰색 mulberry(Morus alba)와 종간 교잡종을 육안으로 쉽게 판별이 가능할 정도로 그 빈도가 높다고 하였다.

향후 2016-10번 교잡종(표 1 참조)과는 반대로 중국계통이 모본이 되고 한국 계통의 꽃가루가 수분이 된 교배조합을 찾아 보다 많은 분자생물학적 마커를 사용한 추가연구가 필수적으로 수행되어야 할 것으로 사료되며 형태학적인 차이와 아울러 지표성분과 약리 효과 등에 관한 연구가 병행될 경우 학문적으로 유용할 뿐만 아니라 이들의 유통과정에서 쉽게 판별이 가능할 것으로 보인다.

<실시예 6>

고해상도 융해(High resolution melting, HRM)) curve 패턴의 분석을 통한 한국과 중국 꾸지뽕 계통의 기원 판별 기술 개발

엽록체의 게놈에 존재하는 trnL-trnF 및 matK 유전자와 핵 내에 존재하는 ITS 유전자 단편의 염기서열을 비교한 결과 밝혀진 단일염기다형성 패턴을 근거로 하여 HRM curve 분석용 프라이머를 디자인하였다. 이들 염기서열의 단일염기다형성을 하나 혹은 그 이상을 포함하도록 하여 중앙에 위치하도록 하여 크기가 약 200bp 정도 되는 PCR 산물을 생성하도록 프라이머를 디자인하였으며 그 염기서열 정보를 표 5에 요약하였다.

표 5는 HRM curve 패턴을 이용한 중국 및 한국 계통의 기원 판별용 프라이머의 염기서열 정보에 관한 것이다.

표 5에서 기술한 3종류의 유전자 내에 내재하는 단일염기다형성을 포함하도록 디자인한 프라이머 조합들을 이용하여 먼저 이들 프라이머가 목표 유전자 단편이 정확하게 증폭되는지의 여부를 조사하기 위하여 실시예 2에서 기술한 방법대로 각각의 프라이머 조합을 이용하여 중국 및 한국 계통에 대한 PCR 반응을 수행하여 2.0% agarose gel 상에서 전기영동하여 확인한 결과 도 9의 그림과 같이 예상한 위치에서 각 유전자에 대하여 단일밴드의 DNA 단편이 증폭됨을 확인할 수 있었다.

또한, 이들 밴드들을 아가로스 겔로부터 순수 정제하여 염기서열분석을 한 결과 각각의 종에서 확인된 trnL-trnF 또는 matK 유전자 그리고 ITS 유전자 단편의 염기서열과 100% 일치하는 것을 확인하였으며, 다른 밴드들은 증폭되지 않음을 확인하였다.

각각의 유전자에 대한 HRM curve 패턴을 분석하기 위하여 중국 및 한국 계통 꾸지뽕 나무에서 분리한 게놈 DNA를 각각 10 ng씩 넣고, 표 6에서 기술한 프라이머를 각각 5 pmol씩 넣고 10 ul의 SsoFast™ EvaGreen^®Supermix BIO-RAD, 172-5200 premixture를 넣고 전체 반응액을 20 ul로 맞춘 후 Mx3005P QPCR Systems(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을 사용하여 HRM curve 분석을 수행하였다. 조건은 먼저 98℃에서 2분간 효소를 활성화 시킨 후 98℃에서 5초간 DNA를 변성을 시킨 후 58℃에서 20초간 유지하면서 annealing과 함께 상보 가닥의 연장이 진행되도록 하여 이를 30회 반복 수행하고 종료된 후에는 65℃까지 온도를 내린 후 95℃까지 증가시키면서 입력된 프로그램에 의하여 melting curve 패턴을 분석하여 그 결과를 도 10에 제시하였다. matK와 trnL-trnF 그리고 ITS 유전자 단편에 대하여 중국 및 한국 꾸지뽕 계통의 서로 다른 HRM curve 패턴을 보여 계통들의 판별이 가능한 것으로 조사되었다. 특히 12bp의 반복서열을 포함하는 trnL-trnF 유전자의 경우 두 계통에 대하여 보다 확실하게 차이가 나는 패턴을 보여 향후 유통시장 등에서의 실용화에 적용될 수 있을 것으로 사료되었다.

상기와 같이, 본 발명은 국내에서 수집하여 증식 및 보관 중에 있는 중국 또는 국내 꾸지뽕 계통을 구분하기 위하여 엽록체에 존재하는 TrnL과 TrnF유전자의 일부와 유전자간 DNA(intergenic DNA)를 포함하는 단편과 matK 유전자 단편을 PCR로 증폭한 후 염기서열을 분석하여 기존에 등록된 진뱅크(GenBanK)로부터 유전자의 염기서열을 비교하여 SNP를 보이는 부위를 포함하는 프라이머를 제작하여 각각의 기원을 조사하여 판별할 수 있는 마커를 개발하였다. 이와 함께 PCR반응의 특이성을 증대시키기 위하여 기존의 단일염기다형성을 나타내는 염기를 3′-말단에 위치하도록 하고 그와 이웃하는 3번째의 염기를 인위적으로 변경시켜 제작한 mismatch primer 즉 ARMS-PCR용 마커를 개발하였다. 또한 HRM 기술을 적용하여 이들 계통들을 판별하기 위하여 SNP가 중앙에 위치하도록 디자인 한 프라이머를 개발하였으며 이들 프라이머를 사용하여 HRM curve 패턴을 비교분석한 결과 이들을 판별하기에 적합한 조건을 확립하였다. 나아가서 최근에 꾸지뽕의 유통과정 또는 가공과정에서 두 계통간의 혼재 여부 즉 혼ㆍ오용 문제를 해결하기 위하여 정성은 물론 혼합비율까지 측정이 가능한 기술을 개발하였다. 또한, 최근 중국에서 대량으로 도입되어 재배되고 있는 현실을 감안하여 이들 계통이 동일종인 한국 토종 계통과의 상호교배에 의하여 생성된 교잡종을 확인하기 위하여 이와는 별도로 핵내에 존재하는 ribosomal DNA의 전사단위체를 증폭하여 SNP를 확인한 후 internal transcribed sequence (ITS)I과 ITSⅡ지역에서 각각의 계통을 구분할 수 있는 판별 마커를 개발하여 이들 계통을 구분함 과 동시에 전술한 엽록체 판별 마커와 조합하여 종간 교잡종의 부본 및 모본을 판별할 수 있는 기술을 확립하였다.

<110> GYEONGNAM NATIONAL UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> composition comprising SNP markers for a differentiation of Cudrania tricuspidata Bureau lines, and method for a differentiation of Cudrania tricuspidata Bureau lines and hybrid using the same <130> NPF29923 <160> 27 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 993 <212> DNA <213> Cudrania tricuspidata Bureau <400> 1 nnncgtagac gctacggact taattgaatt gagccttggt atggaaacct accaagtgac 60 aactttcaaa ctcagagaaa ccctggaatt aaaaatgggc aatcntgagc caaatccggt 120 tttctgaaaa caaacaaggg ttcagaaggc aataataaaa agggataggt gcagagactc 180 aatggaagct gttctaacaa atggagttgg ctgcggtgcg ttagtaaagg aatcactcca 240 gaaagaatga agaataaacg tatatatgta tacgtactga aatactatct tcaaatgatt 300 aatgacaacc caaatccgta tttcttttca ttttcatgaa aaatgaaaga attgttgtga 360 atcaattata aggtgaaaaa agaatcaaat atttattgat caaatcattt actccatcaa 420 aatctgatag atcttttgaa gaattgatta atcggacgag aataaagata gagtcctatt 480 ctacatgtca atattggcaa caatgaaatt tatagtaaga ggaaaatccg 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ttgaacgcaa gttgcgcccg aagccatccg gtcgagggca cgtctgcctg 420 ggcgtcacac actgttgccc ccctaatccc ttgtcactcg ttgtgtagtg catgtggact 480 aaaaggggcg tatattggcc tcccgtgcga tatggacttc atggttggcc caaactcaag 540 tcccttgtca cgtgcattgt ggcaaaaggt ggttgtcgat cagtcggtgc cccgtcactt 600 gatgccggac acgtaaaggg actcccagcg accccaatgc atcgatagtg taggtgcttt 660 gaaagcgacc ccaggtcagg cggggctacc cgctgagtta agcatatcaa taagncgaan 720 nna 723 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <400> 16 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <400> 17 gccgttacta ggggaatcct tg 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <400> 18 gccaagtgcg tgccgctcag c 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <400> 19 cgacaaccac cttttgccac a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <400> 20 gccaagtgcg tgccgctctg t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <400> 21 cgacaaccac cttttgtcac g 21 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <400> 22 gaagatcttt gagaaaggaa tccc 24 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <400> 23 tgccaggaac cagatttgaa ct 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <400> 24 gtgtggtctc aaccaggaag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <400> 25 gccaacgatc caatcagagg 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <400> 26 tcccgtgaac catcgagtc 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <400> 27 gcacgtgaca agggacttg 19

Claims

서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SNP 마커는 서열번호 2의 62번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커 및 서열번호 2의 395번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커 중 적어도 하나인 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염기서열은 서열번호 2의 805번째 부위에서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열이 반복되는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자는 trnL-trnF 유전자에서 유래된 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
제5항에 있어서,
상기 SNP 마커는 서열번호 5의 32번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 55번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 153번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 5의 378번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 409번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 416번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 서열번호 5의 599번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 및 서열번호 5의 692번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나인 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 유전자는 matK 유전자에서 유래된 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제8항 기재의 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트.
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하고, 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
제10항에 있어서,
상기 SNP 마커는 서열번호 15의 38번째 뉴클레오타이드가 A인 SNP 마커, 서열번호 15의 40번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 서열번호 15의 167번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP, 서열번호 15의 363번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP, 서열번호 15의 379번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP, 서열번호 15의 385번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP, 서열번호 15의 458번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP, 및 서열번호 15의 462번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나인 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 유전자는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래된 꾸지뽕 계통 판별용 마커 조성물.
서열번호 18 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 20 및 21의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제13항 기재의 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트.
서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나 이상의 프라이머쌍; 및
서열번호 18 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 20 및 21의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 교잡종 판별용 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 꾸지뽕 교배 조합 판별이 가능한 꾸지뽕 교잡종 판별용 조성물.
서열번호 22 및 23의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 24 및 25의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 26 및 27의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍 중 적어도 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제17항에 있어서,
상기 조성물은 고해상도 융해 분석(High resolution melting analysis)을 위한 것인 꾸지뽕 계통 판별용 조성물.
제17항 기재의 조성물을 포함하는 꾸지뽕 계통 판별용 키트.
꾸지뽕 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
제8항 기재의 프라이머쌍, 제13항 기재의 프라이머쌍 또는 제17항 기재의 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 계통 판별 방법.
제20항에 있어서,
제8항 기재의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하여 서열번호 2의 62번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커 및 서열번호 2의 395번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 한국산 꾸지뽕 계통으로 판별하는 꾸지뽕 계통 판별 방법.
제20항에 있어서,
제13항 기재의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하여 서열번호 15의 38번째 뉴클레오타이드가 A인 SNP 마커, 서열번호 15의 40번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 서열번호 15의 167번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 15의 363번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 15의 379번째 뉴클레오타이드가 C인 SNP 마커, 서열번호 15의 385번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커, 서열번호 15의 458번째 뉴클레오타이드가 T인 SNP 마커, 및 서열번호 15의 462번째 뉴클레오타이드가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 한국산 꾸지뽕 계통으로 판별하는 꾸지뽕 계통 판별 방법.
(a) 꾸지뽕 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 제8항 기재의 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
(c) 제13항 기재의 프라이머쌍을 이용하여 상기 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
(d) 단계 (b)의 PCR 산물 및 단계 (c)의 PCR 산물을 확인하고 비교하는 단계를 포함하는 꾸지뽕 교잡종 판별 방법.
제23항에 있어서,
꾸지뽕 시료가 단계 (b)의 PCR 산물을 확인한 결과 한국산 꾸지뽕으로 판별되고 단계 (c)의 PCR 산물을 확인한 결과 중국산 꾸지뽕으로 판별된 경우, 꾸지뽕 시료를 한국계통을 모본으로 하는 교잡종으로 판별하는 꾸지뽕 교잡종 판별 방법.