KR20170122671A - 미백개선과 주름개선 효과를 갖는 배 캘러스와 유자 캘러스 소재 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물 그리고 카보머를 유효성분으로 함유하는 항노화 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 배 또는 유자 세포 배양물 또는 그 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능, 탄력 개선, 항산화 능을 가지고 있어, 기능성 화장품 소재로써 활용가치가 높다.

Description

미백개선과 주름개선 효과를 갖는 배 캘러스와 유자 캘러스 소재 {Callus extracts from Citrus junos Siebold ex Tanaka and Pyrus pyrifolia Nakai with Whitening and Anti-wrinkle effect}

본 발명은 미백개선과 주름개선 효과를 갖는 배 캘러스와 유자 캘러스 소재및 카보머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물 그리고 카보머를 유효성분으로 함유하는 기능성 피부 외용제 소재에 관한 것이다.

화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학, 약학 등의 기초과학과 응용기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로써 피부에 대한 안전성, 효능, 사용 편의성등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능 뿐 아니라, 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다. 특히 화장품 산업은 급속한 산업화가 진행되고 있고, 고령화 현상이 심화됨에 따라, 환경 및 건강에 대한 중요성이 부각되어 웰빙 문화가 현대 사회의 메가트렌드로 자리잡았다. 이러한 고도산업의 발달에 따라 환경변화에 기인한 각종 피부 질환이 증가하고 있으며, 바이오벤처 및 화장품, 생명공학 업계에서는 천연소재의 고기능성을 활용한 미백 및 항노화 연구가 활발히 진행되고 있다.

이처럼 최첨단 생명공학 기술의 발전 및 국가경제가 성장함에 따라 화장품 산업에서도 첨단 기술이 도입되었으며, 준치료제 개념의 코스메슈티컬(화장품을 뜻하는 코스메틱과 치료제를 뜻하는 파마슈티컬의 신조 합성어) 개발이 화장품 산업의 메가트렌드로 부각되고 있다.

특히 최근 기능성이 높은 바이오소재들이 접목되어 생물학적인 유효성이 높은 제품들을 개발하고자 하는 시도들이 화장품 업계와 바이오기업들을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 기존 화장품 소재들은 식물이나 한방 추출물의 민간요법 또는 동의보감에 의한 정보를 바탕으로 한 전통적인 방식의 추출물이 화장품에 쓰였다. 반면 현재는 생물학적인 기반으로 유효성이 확인된 추출물이나 추출법이 적용되어 피부에 대한 기능성이 탁월하고 효과 및 안전성이 우수한 기능성 화장품 소재에 대한 니즈가 증가되고 있는 추세이다.

한편, 식물캘러스 (식물줄기세포)는 식물의 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리를 의미하는 것으로, 식물이 상처가 있을 때 생성되는 분열조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물은 크게 세포 분열을 하는 분열조직과 그렇지 않는 영구 조직으로 구성되어 있으며, 이중 처음 분열 조직의 세포를 영양 배지에 넣고 키우면 캘러스가 형성된다. 이후 부정배가 형성되면서 식물체로 분화된다. 캘러스는 식물의 각 조직으로 분회되므로 "식물의 줄기세포"라고 정의된다. 친환경 녹색성장과 매우 밀접한 관계를 가지는 식물조직 배양기술은 1990년대 이후 국내 농촌진흥청및 대학가에서 주로 병저항성, 특정 이차대사산물 축적을 목적으로 많이 활용되고 있다. 최근 식물줄기세포(캘러스) 소재는 바이오벤처기업 중심으로 활발히 이뤄지고 있다.

이러한 상황 속에서, 배 또는 유자에 대하여 화장료 조성물로 개발코자 하는 시도는 있어왔으나, (특허문헌 1 및 2) 배 또는 유자의 캘러스 추출물 및 카보머를 피부생리활성 기능을 가진 항노화 소재로서 개발한 사례는 전무하다.

특허문헌 1: 대한민국공개특허 제2015-0139688호 특허문헌 2: 대한민국공개특허 제2015-0081201호

본 발명자들은 기능성 화장품 천연 소재 개발을 위해 노력하던 중, 배 또는 유자 식물의 식물조직배양기술을 통한 식물 캘러스를 유도하였고, 이들의 상등액 추출물 또는 열수 추출물 그리고 카보머가 피부 세포의 성장 및 증식을 활성화시키고, 미백, 주름개선효능을 비롯한 항노화, 및 항산화 효능 등이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물 및/또는 카보머를 유효성분으로 함유하는 미백 또는 항노화 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항노화 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 카보머를 추가로 더 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 주름 방지 또는 개선용, 미백용, 또는 탄력개선용, 항산화인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 배 또는 유자 식물의 캘러스를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 유도된 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 제조하는 단계; 를 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물과 카보머를 혼합하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물 및 카보머를 유효성분으로 함유한 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 또는 미백 피부 외용제 소재로써, 항노화 또는 미백 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 카보머를 추가적으로 더 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 배(Pyrus pyrifolia Nakai)는 배나무속(Pyrus)은 장미과의 한 속이고, 배나무속 과일을 "배"라고 부른다. 배나무의 기원지는 중국 서부, 혹은 남서부로 추정된다.

본 발명에서, 유자(Citrus junos Siebold ex Tanaka)는 감귤과 식물로 빛깔은 밝은 노란색이고 껍질이 울퉁불퉁하다. 향기가 좋으며, 딱딱한 모과와 달리 과육이 부드러운 편이다.

본 발명에서, 카보머는 화장품에서 가장 보편적으로 사용되고 있는 점증제, 상안정화제로 구조는 산성 고분자화합물로 주로 아크릴산이 중합된 물질이다. 카보머의 장점은 폭넓은 pH 범위에 매우 투명하게 점증이 가능하고, 피부에 대한 자극이 거의 없으며, 미생물에 의한 오염 또한 적다는 것이다. 또 아주 쉽게 겔화가 이루어지고 폭 넓은 점도 범위로 자유로이 점도조절도 가능하다. 이러한 카보머는 에센스부터 크림 제형, 마스크팩, 헤어, 손세정제까지 화장품, 생활용품에서 가장 널리 쓰이는 점증제이다. 다만 물에 대한 용해도나 분체의 날림성, 합성과정에서 발암 물질로 알려진 벤젠을 용매로 사용하는 경우가 있어 단점으로 작용하지만 최근에는 이런 단점을 보완한 제품군들도 다양하게 출시되어 있다.

또한, 본 발명에서 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 1 또는 0.01 내지 10 중량% 또는 부피%로 함유할 수 있고, 이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 0.01mg/ml, 0.05mg/mg, 0.1mg/ml, 0.5mg/ml, 1mg/ml 등으로 실험한 결과를 포함하고 있으나, 이들을 포함하여 더 높거나 낮은 함량에서도 우수한 미백, 피부 재생, 주름개선, 탄력개선, 항산화 기능 등을 가짐은 당업자에게 자명하다.

또한, 본 발명에서 카보머는 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 2 중량% 또는 부피%로 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배 또는 유자 캘러스 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~ 48시간동안, 80~ 100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 캘러스 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 1-10일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다.

특히, 본 발명에 있어서는 캘러스 배양물을 파쇄를 통해 냉장 상태(약 4℃)에서 교반시킨 후 원심분리하여 상등액을 얻은, "캘러스(배양물) 상등액 추출물" 그리고,

캘러스 배양물을 파쇄한 후 물의 중탕 가열을 통해 열수 추출하는 "캘러스(배양물) 열수 추출물"을 얻었는데, 본 발명에 따른 추출물의 구체적인 형태는 이들을 포함한 다양한 형태일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 항노화란, 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 모공 수축, 축소, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능, 피부 재생 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 미백, 항노화에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부 외용제 조성물로써 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성, melanogenesis 저해에 따른 미백 효능, 피부재생, 탄력 개선, 항산화 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

이러한 관점에서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 미백용, 주름 개선, 방지용, 탄력개선, 피부 재생, 항산화 조성물을 포함한다.

한편, 식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 배 또는 유자 식물로부터 캘러스 유도하는 단계; 및 (b) 상기 유도된 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 피부외용제 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계 이후에 추가로, (c) 상기 추출물과 카보머를 혼합하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 배 또는 유자 캘러스 배양물 또는 그 추출물 및 카보머를 함유한 피부 외용제 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 배 또는 유자 캘러스를 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 캘러스를 배양시에는, 첫번째로,캘러스를 유도하기 위한 배지에는 2,4-디클로로페녹시-아세트산과 6-벤질아미노퓨린이 약 0.5 내지 5mg/L 포함될 수 있으며, 배양시에 암주기와 12시간 내지 18시간 광주기 유도할 수 있다.

상기 유도된 캘러스를 고체상 배지에서는 피클로람을 약 1 내지 5mg/L로 포함하여 배양할 수 있다. 또한, 고체배지상의 배양 이후에 액체 배지 배양 단계로 배양할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 배 또는 유자 캘러스 배양물 그대로를 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 배 또는 유자 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시키나,

(a)단계에서 얻어진 배 또는 유자 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하거나,

또는 (a) 단계에서 얻어진 배 또는 유자 캘러스 배양물을 파쇄한 다음, 정제수 또는 PBS에 교반하고, 원심분리하여 얻은 상등액 추출물을 얻거나,

또는 (a) 단계에서 얻어진 배 또는 유자 캘러스 배양물을 파쇄한 다음, 정제수 또는 PBS에 교반하고, 물중탕으로 가열을 통해 얻어진 열수 추출물을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

상기 (b)단계까지의 수행을 통하여 적절한 형태의 피부외용제 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 카보머와 혼합할 경우는,

상기 (c) 단계로써, 상기 (b) 단계에서 얻어진 추출물과 카보머를 혼합하여 적절한 형태의 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물, 카보머 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물 및 카보머를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물 및 카보머를 함유하는 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 배 또는 유자 캘러스를 함유하는 조성물 그리고 카보머를 혼합한 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하여 피부 주름개선, 피부 탄력개선, 미백, 항산화 효능을 가지고 있어, 기능성 피부 외용제의 소재로써 적용가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 유자 및 배 식물 조직을 이용한 캘러스의 유도 과정을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 유자 또는 배 캘러스 상등액과 추출액의 준비 과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 유자 캘러스 상등액 추출물과 유자 캘러스 열수 추출물이 인간 섬유아세포 성장에 미치는 영향을 확인한 결과이다. (A: 유자 캘러스 상등액 추출물, B: 유자 캘러스 열수 추출물)
도 4는 배 캘러스 상등액 추출물과 배 캘러스 열수 추출물이 인간 섬유아세포 성장에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (A: 배 캘러스 상등액 추출물, B: 배 캘러스 열수 추출물)
도 5는 유자 캘러스 상등액 추출물과 유자 캘러스 열수 추출물이 인간 각질형성세포 성장에 미치는 영향을 확인한 결과이다. (A: 유자 캘러스 상등액 추출물, B: 유자 캘러스 열수 추출물)
도 6은 배 캘러스 상등액 추출물과 배 캘러스 열수 추출물이 인간 각질형성세포 성장에 미치는 영향을 확인한 결과이다 (A: 배 캘러스 상등액 추출물, B: 배 캘러스 열수 추출물)
도 7은 유자 캘러스 열수 추출물과 배 캘러스 열수 추출물의 티로시나아제 효소 저해 활성을 확인한 결과이다.(A: 유자 캘러스 열수 추출물, B: 배 캘러스 열수 추출물)
도 8은 유자 캘러스 열수 추출물과 배 캘러스 열수 추출물의 L-DOPA 산화 저해 활성을 나타낸 결과이다. (A: 유자 캘러스 열수 추출물, B: 배 캘러스 열수 추출물)
도 9는 유자 캘러스 상등액 추출물 및 유자 캘러스 열수 추출물의 멜라닌 생합성 억제 활성을 나타낸 결과이다. (A: 유자 캘러스 상등액 추출물, B: 유자 캘러스 열수 추출물)
도 10은 배 캘러스 상등액 추출물 및 배 캘러스 열수 추출물의 멜라닌 생합성 억제 활성을 나타낸 결과이다. (A: 배 캘러스 상등액 추출물, B: 배 캘러스 열수 추출물)
도 11은 유자 캘러스 상등액 추출물 및 유자 캘러스 열수 추출물의 항산화 효과를 확인한 결과이다. (Ascorbic acid: 아스코르브산, Citrus Callus Solution: 유자 캘러스 상등액 추출물, Citrus Callus Extract: 유자 캘러스 열수 추출물)
도 12은 배 캘러스 상등액 추출물 및 배 캘러스 열수 추출물의 항산화 효과를 확인한 결과이다. (Ascorbic acid: 아스코르브산, Pear Callus Solution: 배 캘러스 상등액 추출물, Pear Callus Extract: 배 캘러스 열수 추출물)
도 13은 유자 캘러스 상등액 추출물 및 유자 캘러스 열수 추출물의 엘라스타아제 저해 활성을 확인한 결과이다. (Ursolic acid: 우르솔릭산, Citrus Callus Solution: 유자 캘러스 상등액 추출물, Citrus Callus Extract: 유자 캘러스 열수 추출물)
도 14는 배 캘러스 상등액 추출물 및 배 캘러스 열수 추출물의 엘라스타아제 저해 활성을 확인한 결과이다. (Ursolic acid: 우르솔릭산, Pear Callus Solution: 배 캘러스 상등액 추출물, Pear Callus Extract: 배 캘러스 열수 추출물)
도 15는 유자 캘러스 상등액 추출물 및 유자 캘러스 열수 추출물의 콜라겐 생성 촉진 활성을 확인한 결과이다. (Citrus Callus Solution: 유자 캘러스 상등액 추출물, Citrus Callus Extract: 유자 캘러스 열수 추출물)
도 16은 배 캘러스 상등액 추출물 및 배 캘러스 열수 추출물의 콜라겐 생성 촉진 활성을 확인한 결과이다. (Pear Callus Solution: 배 캘러스 상등액 추출물, Pear Callus Extract: 배 캘러스 열수 추출물)
도 17은 유자 캘러스 상등액 추출물 및 유자 캘러스 열수 추출물의 피부세포 증식 활성을 확인한 결과이다. (Citrus Callus Solution: 유자 캘러스 상등액 추출물, Citrus Callus Extract: 유자 캘러스 열수 추출물)
도 18은 배 캘러스 상등액 추출물 및 배 캘러스 열수 추출물의 피부세포 증식 활성을 확인한 결과이다. (Pear Callus Solution: 배 캘러스 상등액 추출물, Pear Callus Extract: 배 캘러스 열수 추출물)
도 19는 배 캘러스 추출물, 유자 캘러스 추출물과 카보머의 혼합처리가 프롤린 하이드록실라아제(prolyl hydroxylase)의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 20은 배 캘러스 추출물, 유자 캘러스 추출물과 카보머의 혼합처리가 라이실 하이드록실라아제(lysyl hydroxylase)의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 21은 배 캘러스 추출물, 유자 캘러스 추출물과 카보머의 혼합처리가 콜라겐 합성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 이하의 실시예에서는 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물에 관한 효능을 확인하였으나, 추출물이 아닌 배양물 자체에 대해서도 이러한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

1. 본 발명에 따른 배 및 유자의 식물캘러스 유도 및 배양

(1) 식물재료 준비

유자 캘러스 유도를 위한 식물체는 이삭농원에서 구입한 유자 묘목의 잎과 열매의 과즙, 씨를 사용하였다. 배 캘러스 유도를 위한 식물체는 좋은영농조합에서 받은 씨앗을 발아시켜 사용하였다. 70% EtOH (Merck, cat.603-002-00-5) 용액을 이용해 1분 30초간 살균처리 한 후, 2% sodium hypochloride (Duksan, cat. 7681-52-9) 용액에서 30분간 교반 하였다. 그 다음 클린벤치 내에서 멸균 된 증류수로 4회 반복 세척하였다. 멸균 처리한 후 식물 조직 샘플들을 이용하여 아래와 같이 유자 및 캘러스를 유도하였다.

(2) 유자 및 배 캘러스 유도

유자 및 배의 잎, 과즙, 씨를 각각 일정한 크기로 잘라 상처 낸 후, 캘러스 유도 배지에 치상하였다. 유자 및 배 캘러스의 유도를 위하여 기본 MS 배지 (Murashige and Skoog, Duchefa Cat. M0222.0050)에 각각 2,4-dichlorophenoxy-acetic Acid (2,4-D, Duchefa Cat. D0911.0100)와 6-Benzylaminopurine (BA, Duchefa Cat. B0904.0001) 1 mg/L가 들어있는 배지들을 사용하였으며, 암주기와 16시간 광주기로 유도하였다 (도 1).

(3) 유자 및 배 캘러스 성장 조건 탐색

유도된 유자 및 배 캘러스를 고체상 배지에서 성장시키기 위해 기본 MS 배지에 식물 캘러스 성장에 주로 사용되는 Picloram (Duchefa, Cat. P0914.0005) 2 mg/L 농도로 넣은 배지를 사용하였다.

(4) 유자 및 배 캘러스 액체 배양

고체 배지에서 성장된 유자 및 배 캘러스의 배양 scale-up을 위하여 고체 배지 상 배양의 단계를 액체 배지 배양 단계로 전환하였다. 이를 위해 고체 배지 상에서 확인된 최적화된 배양조건을 활용하여 Picloram 2 mg/L를 추가한 MS 기본배지 100ml을 500ml 삼각 플라스크에 넣어 잘 배양된 고체 배양 배지 (plate) 3개 양의 유자 캘러스를 접종하고 25℃, 100rpm에서 배양하였다 (도 2).

2. 유자와 배 캘러스 추출 시료 준비

상기 1에서 얻어진 유자 캘러스 및 배 캘러스 배양물을 가지고,

첫 번째로, 캘러스를 파쇄를 통해 냉장 상태에서 추출하는 추출물("캘러스 상등액 추출물"), 두 번째로, 캘러스를 파쇄한 후 물의 중탕 가열을 통해 열수 추출하는 추출물("캘러스 열수 추출물")로 나누어 각각 얻었다.

좀 더 자세하게는, 막자사발에 유자 캘러스를 넣어 액체질소를 부어주며 곱게 갈았다. 유자 혹은 배 캘러스 0.2 g당 PBS 1 ml을 넣어 주고 잘 섞이게 4℃ 에서 1시간이상 교반시킨 후, 위에서 언급한 2가지로 구별하여 샘플들을 준비하였다.

첫째, 유자 혹은 배 캘러스 상등액 추출물의 준비는 교반된 샘플을 바로 8000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액 취해 0.8 um syringe filter를 사용하여 여과하여 시료를 준비하였다 ("캘러스 상등액 추출물").

둘째, 유자 혹은 배 캘러스 열수 추출물의 준비는 교반된 샘플을 물중탕(90~95 ℃ )으로 2시간 가열한 후 8000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액 취해 0.8 um syringe filter를 사용하여 여과하여 시료를 준비하였다 ("캘러스 열수 추출물").

실험예 1: 본 발명에 따른 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 피부 안전성 시험

인간 피부구성세포인 섬유아세포(fibroblast)에 세포주 CCD-986sk에 대하여 안전성 혹은 세포 독성 존재 여부를 검사하기 위해 MTT 시험법을 사용하여 평가하였다. 자세하게는 섬유아세포인 CCD-986sk를 24 well plate에 5×10⁴ cells/well씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 ~50%만큼 배양되면, 상기의 방법으로 준비된 유자 혹은 배 캘러스 상등액 추출물 및 열수 추출물들을 동결건조하고, 분말화된 시료들을 0.01 mg/ml ~ 1 mg/ml 농도로 처리하여 48시간을 추가로 배양하였다. 추가 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/mL)을 50 μL 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 μL의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200 μL 처리하여 교반한 후, 100 μL 씩을 96 well로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상대적인 평가를 하기 위하여 세포에 대한 독성 혹은 증식을 촉진하는 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

그 결과, 유자 캘러스의 상등액 (냉온추출물) 및 추출물 (열수수출물)은 아래 표에 나타난 바와 같이, 인간 섬유아세포 성장에 독성이 없고, 증식촉진효과가 있었다. (도 3, 및 표 1과 표 2).

유자캘러스상등액추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	111.1812	124.4364	117.2227	115.78	105.2299

유자캘러스열수추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	104.7162	113.0131	103.0568	104.8035	99.21397

실험결과, 상기의 방법으로 준비된 배 캘러스 상등액과 배 캘러스 추출액은 인간 섬유아세포 세포인 CCD-986sk에 매우 안전하였으며 세포 독성이 관찰되지 않았다. 특히 무처리 대조군에 비해 처리군들 모두에서 -6.2 ~ 35.0% 전후의 세포 증식 촉진효과가 관찰되었다 (도 4, 및 표 3과 표 4).

배캘러스상등액추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	133.156	135.0177	115.2482	106.117	93.88298

배캘러스열수추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	128.2342	128.2342	122.474	112.3702	104.7214

실험예 2: 본 발명에 따른 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 in vitro 각질형성세포에 대한 안전성 평가

인간 피부구성세포인 각질형성세포 (keratinocyte) 세포주 HaCaT에 대하여 안전성 혹은 세포 독성 존재 여부를 검사하기 위해 MTT 시험법을 사용하여 평가하였다. 자세하게는 인간 각질형성 세포주 HaCaT 세포를 24 well plate에 5×10³ cells/well 씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 ~50%만큼 배양되면, 상기의 방법으로 준비된 유자 혹은 배 캘러스 상등액 추출물 및 열수 추출물의 동결 건조 분말들을 배양 배지에 0.01 mg/ml에서 1mg/ml의 농도로 처리하고 48시간을 추가로 배양하였다. 추가 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/mL)을 50 μL 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 μL 의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200μL 처리하여 교반한 후, 100μL 씩을 96 well로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상대적인 평가를 하기 위하여 세포에 대한 독성 혹은 증식을 촉진하는 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 1]

세포안전성(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)x100

실험결과, 상기의 방법으로 준비된 유자 캘러스 상등액과 유자 캘러스 추출액은 인간 각질형성세포 세포주인 HaCaT에 매우 안전하였으며 세포 독성이 관찰되지 않았다. 특히 무처리 대조군에 비해 처리군들 모두에서 -4.5 ~ 38.6% 전후의 세포 증식 촉진효과가 관찰되었다 (도 5, 표 5 및 표 6).

유자캘러스상등액추출물 (mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	134.2618	128.7337	113.6062	130.8764	95.99314

유자캘러스열수추출물 (mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	138.6101	124.7113	110.4136	105.8577	95.50703

실험결과, 상기의 방법으로 준비된 배 캘러스 상등액과 배 캘러스 추출액은 인간 각질형성세포 세포주인 HaCaT에 매우 안전하였으며 세포 독성이 관찰되지 않았다. 특히 무처리 대조군에 비해 처리군들 모두에서 0 ~ 35% 전후의 세포 증식 촉진효과가 관찰되었다 (도 6, 표 7 및 표 8).

배캘러스상등액추출물 (mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	172.78	197.7365	158.5026	145.5891	139.321

배캘러스열수추출물 (mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05	0.01
결과값	100	161.1568	157.3007	133.012	113.9901	103.9737

실험예 3: 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 미백 활성 평가 1 ( Tyrosinase 활성 저해)

Tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 수행하는 rate-limiting enzyme이다. 피부의 색소를 생성하는 세포인 색소생성세포 (melanocyte)의 색소형성기관 (melanosome)에서 tyrosine을 산화시켜 dopa를 만들고, 다시 dopa를 산화시켜 dopachrome을 만드는 dopa oxidase로 작용한다. 좀 더 정확히 표현하면, tyrosinase (EC 1.14.18.1)는 인간 피부 색소인 멜라닌 합성에서 가장 중요한 역할을 수행하며 인간 염색체 11q14-21에 위치하는 TYR 혹은 c-locus에 의해서 발현된다. 이 tyrosinase는 멜라닌 합성 단계에서 3가지 구별되는 반응을 촉매 하는데, 1) monophenol (L-tyrosine)의 hydroxylation, 2) catechol (L-DOPA)의 dehydrogenation, 3) DHI의 dehydrogenation 등이다. 따라서 다양한 미백 기능성 원료의 tyrosinase 활성 억제는 미백 활성의 중요한 척도가 될 수 있다.

상기의 방법으로 준비된 유자 혹은 배 캘러스 상등액 및 추출액의 미백 활성을 확인하기 위하여, 버섯 유래 tyrosinase와 3,4-dihyrroxyphenylalanine(L-DOPA)를 효소 기질로 사용하여 멜라닌 합성 효소의 저해 정도와 멜라닌 생성 과정의 중요 단계인 L-DOPA의 산화를 저해하는지를 실험하였다.

① in vitro tyrosinase 활성 억제 시험 방법

좀 더 자세하게는 동결 건조된 유자 혹은 배 캘러스 추출액을 sodium phosphate buffer(0.1 M, pH 6.8)로 희석하여 전체 반응액의 최종농도가 0.5 mg/ml에서 10 mg/ml의 농도가 되도록 준비하였다. 2 mL tube에 sodium phosphate buffer 290 μL, 준비된 시료 100 μL, 10 mM 기질 100 μL을 첨가한 후 37℃에서 5분 동안 pre-incubation하였다. 이 후, 2,500 unit/mL tyrosinase 용액을 각각 10 μL 첨가한 후 10분 간 37℃에서 반응시켰다. 반응 종료 후 475 nm에서 흡광도 측정하였으며, 양성 대조군으로는 arbutin 및 vitamin C를 0.5 mg/ml ~ 10 mg/ml 농도로 사용하였다. 공시료액으로는 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH7.0)을 넣는다.

tyrosinase 활성 저해율 (%) = 100 - [(b-b')/(a-a') X 100]

a: 공시료액의 반응 후의 흡광도

b: 시료액의 반응 후의 흡광도

a', b': tyrosinase 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

실험 결과, 무처리 대조군 대비 유자 캘러스 열수 추출물의 경우 5 mg/ml 처리군에서 23.1%와 10 mg/ml 처리군에서 36.2% 등 유의적인 tyrosinase 효소 활성 억제를 확인할 수 있었다 (표 9, 도 7).

유자 캘러스 열수 추출물 (mg/ml)	control	10	5	1
결과값	0	36.190	23.095	-2.381

배 캘러스 열수 추출물의 경우 10mg/ml 처리군에서 유의적인 tyrosinase 효소 활성을 확인할 수 있었다 (표 10, 도 7).

배캘러스 열수 추출물 (mg/ml)	control	10	5	1
결과값	0	10.952	-2.381	-8.095

② in vitro L- DOPA 산화 저해 시험 방법

본 시험 방법은 멜라닌 합성과정의 속도결정단계를 촉매하는 타이로시나제의 DOPA 산화반응에 대한 활성 저해를 측정하여 미백성분의 효과를 평가하는 것이다. 좀 더 자세하게는 동결 건조된 유자 혹은 배 캘러스 열수 추출물을 sodium phosphate buffer(0.1 M, pH 6.8)로 희석하여 전체 반응액의 최종농도가 0.5 mg/ml에서 10 mg/ml의 농도가 되도록 준비하였다. 시험방법으로는 시험관에 sodium phosphate buffer(0.1 M, pH 7.0) 850ul와 적정 농도로 희석된 캘러스 시료 50ul 그리고 머쉬룸 타이로시나제액 50ul를 순서대로 넣고 37℃에서 6분동안 반응시킨다. 이 용액에 0.06mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine, Sigma D9628-25G)액 50ul를 넣은 다음 37℃에서 1분 동안 반응시킨다. 반응이 종료된 후 ELISA reader를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정한다. 공시료액으로는 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH7.0)을 넣는다.

[수학식]

DOPA산화활성저해율(%) = 100-{(각시료액의반응흡광도/공시료액의반응흡광도)×100}

그 결과, 무처리 대조군 대비 유자 캘러스 열수 추출물의 처리에서는 매우 강한 L-DOPA oxidation 저해활성을 관찰할 수 있었으며, 0.5 mg/ml 처리 시 9.2%, 2.5 mg/ml 처리 시 18.3%, 5 mg/ml 처리 시 25.2% 전후의 강한 저해 활성을 확인하였다 (표 11, 도 8)

유자 캘러스 열수 추출물 (mg/ml)	control	5	2.5	0.5
결과값	0	25.157	18.339	9.169

또한, 무처리 대조군 대비 배 캘러스 열수 추출물의 처리에서는 약하지만 유의적인 L-DOPA oxidation 저해활성을 관찰할 수 있었으며, 5mg/ml 처리 시 13.5%, 2.5mg/ml 처리 시 3.8%의 저해 활성을 확인하였다 (표 12, 도 8).

배캘러스 열수추출물 (mg/ml)	control	5	2.5	0.5
결과값	0	13.558	3.840	2.665

실험예 4: 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 미백 활성 평가 2 ( B16F10 세포 내 멜라닌 생성억제)

상기의 방법으로 개발된 유자 및 배 캘러스 상등액 및 추출액의 미백활성을 확인하기 위하여 멜라닌을 형성하는 피부구성세포인 B16F10 (rat melanoma) cell에 처리하고, 세포가 배양 중 생성하는 멜라닌의 생합성 양을 비교 평가하였다. 좀더 자세히는 96 well plate에 2 × 10⁴ cells/well로 B16F10 세포를 분주하고, 동결 건조된 캘러스 상등액과 추출물을 이용하여 배양액 내 0.05 mg/ml 농도에서 1 mg/ml 농도로 처리하였다. 시료가 적절한 농도로 처리된 후 멜라닌 생합성의 저해를 유도하기 위하여 72시간 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 각 well의 상층액을 흡인한 후 PBS로 세척하고 각 well에 1N NaOH 150 μL 첨가하였다. 65℃에서 45분간 방치하여 세포 내에 형성된 멜라닌을 완전히 녹였으며, 그 후 각 well의 상층액 100 μL씩 취해 405 nm에서 흡광도 측정하였다. 멜라닌 생성량은 무처리군을 음성대조군으로 상대적인 감소량을 백분율로 나타내어 미백 활성을 평가하였다.

[수학식]

멜라닌합성저해율(%) = 100-{(각시료액의반응흡광도/음성대조군의반응흡광도)×100}

실험 결과, 무처리 대조군 대비 유자 캘러스 상등액 추출물의 처리에서는 실험된 농도 내에서 50% 이상의 멜라닌 생합성 저해 효과를 보여 미백 효과를 확인할 수 있었다. 유자 캘러스의 경우 강한 미백 효과는 유자 캘러스 상등액 추출물과 유자 캘러스 열수 추출물에서 모두 관찰되었다 (표 13 및 표 14, 도 9).

유자 캘러스 상등액추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05
결과값	0	51.25581	52.46512	60	53.11628

유자 캘러스 열수 추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05
결과값	0	55.87967	50.31905	59.34366	55.33273

실험 결과, 무처리 대조군 대비 배 캘러스 상등액 추출물의 처리에서는 실험된 농도 내에서 37.7%에서 51.4%까지의 멜라닌 생합성 저해 효과를 관찰할 수 있었다. 또한 배 캘러스 열수 추출물의 처리에서는 7.1%에서 농도 의존적으로 증가하여 1 mg/ml 농도의 처리 시 약 44.6% 멜라닌 저해 효과를 확인할 수 있었다 (표 15 및 표 16, 도 10).

배 캘러스 상등액 추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05
결과값	0	41.68297	46.57534	51.36986	37.67123

배 캘러스 열수 추출물(mg/ml)	control	1	0.5	0.1	0.05
결과값	0	44.60363	38.01337	13.56256	7.067813

실험예 5: 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 항산화 활성 평가 ( DPPH 라디칼 소거 효과)

상기의 방법으로 개발된 유자 및 배 식물캘러스 상등액 및 추출액의 항산화 효과 실험은 DPPH (2,2-diphehyl-pictyl-hydrazyl)를 이용하여 시료의 자유 라디칼 소거 효과로 측정하였다. 양성 대조군으로 ascorbic acid를 3차 증류수에 용해시켜 50~1,000 μM 농도의 용액을 제조하였으며 유자 및 배 식물캘러스 상등액 및 추출액은 각각 인산염완충액 (pH 7.4)으로 희석하여 10~0.1 mg/mL 농도로 제조하였다. 각 시료 용액 100 μL에 0.2 mM DPPH 메탄올 용액을 100 μL씩 첨가한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. 이후 각 시료 용액 100 μL에 100 μL의 메탄올을 첨가한 용액을 blank로 하고 DPPH 메탄올 용액을 음성 대조군으로 하여 520 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래 식으로 DPPH 저해율 (항산화율)을 계산하였다.

[수학식]

DPPH 저해율 (%) = 100 - [(시료의 흡광도 - 각 시료 blank의 흡광도)/음성 대조군의 흡광도× 100]

실험 결과 유자 식물캘러스 상등액 추출물의 경우 최대 22.4 내지 4.99%의 항산화율을 보인 반면 유자 식물캘러스 열수 추출물은 양성 대조군인 125 μM ascorbic acid에 상응하는 최대 항산화율 (68.5 내지 9.49%)을 나타냈다 (표 17, 도 11).

Ascorbic acid		유자 식물캘러스 상등액 추출물		유자 식물캘러스 열수 추출물
처리농도 (μM)	Free radical scavenging activity (%)	처리농도 (mg/mL)	Free radical scavenging activity (%)	처리농도 (mg/mL)	Free radical scavenging activity (%)
500	98.5±2.64	10	22.4±4.99	10	68.5±9.49
250	80.1±1.93	5	0.00±0.00	5	21.2±1.41
125	62.3±1.77	2	0.00±0.00	2	10.1±4.16
50	17.7±4.37	1	0.00±0.00	1	5.13±3.67
25	0.00±0.00	0.1	0.00±0.00	0.1	0.00±0.00

배 식물캘러스 상등액 추출물의 경우 최대 46.8 내지 6.68%의 항산화율을 보였으며 배 식물캘러스 열수 추출물은 양성 대조군인 500 μM ascorbic acid에 상응하는 최대 항산화율 (78.7 내지 4.76%)을 나타냈다 (표 18, 도 12).

Ascorbic acid		배 식물캘러스 상등액 추출물		배 식물캘러스 열수 추출물
처리농도 (μM)	Free radical scavenging activity (%)	처리농도 (mg/mL)	Free radical scavenging activity (%)	처리농도 (mg/mL)	Free radical scavenging activity (%)
1000	95.1±1.40	10	46.8±6.68	10	78.7±4.76
500	82.1±1.13	5	2.14±3.04	5	78.6±1.86
250	67.5±6.05	2	0.00±0.00	2	34.8±14.2
100	52.2±6.05	1	0.92±1.83	1	46.3±4.66
50	24.9±9.25	0.1	2.82±3.28	0.1	35.9±19.3

실험예 6: 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 엘라스타아제 저해 활성 ( elastase inhibition assay)

상기의 방법으로 개발된 유자 및 배 캘러스 상등액 및 추출액의 엘라스타아제 저해 활성은 EnzChek elastase assay kit으로 평가하였다. DQ^TMelastin (soluble bovine neck ligament elastin labeled with fluorescence dye)을 기질로 사용하였으며 N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketone을 저해제로 사용하였다. 96 well opti-plate의 각 well에 50 μL의 ursolic acid (0.0001~0.1 mM) 혹은 50 μL의 유자 및 배 캘러스 상등액 혹은 추출액을 넣은 후 각 well에 50 μL의 DQ elastin working solution (100 μg/mL) 및 100 μL의 porcine pancreatic elastase (0.2 U/mL)를 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 반응시킨 후 fluorescence multiplate reader에서 각 well의 형광 강도를 측정하였다. (excitation: 485 nm, emission: 530 nm) 각 시료의 엘라스타아제 저해 활성은 아래 식으로 계산하였다.

[수학식]

엘라스타아제 저해율 (%) = (Ac - As) × 100/(Ac - An)

여기서, Ac는 측정 시료를 넣지 않은 well의 형광 강도, As는 측정 시료를 넣은 well의 형광 강도, An은 측정 시료 및 효소를 넣지 않은 blank well의 형광 강도를 의미한다.

실험 결과 유자 식물캘러스 상등액 추출물의 경우 최대 15.1 내지 0.28%의 엘라스타아제 저해 활성을 보였으며 유자 식물캘러스 열수 추출물은 양성 대조군인 0.001 mM의 ursolic acid에 상응하는 최대 저해 활성 (20.3 내지 1.17%)을 나타냈다 (표 19, 도 13).

Ursolic acid		유자 식물캘러스 상등액 추출물		유자 식물캘러스 열수 추출물
처리농도 (mM)	Elastase inhibition (%)	처리농도 (mg/mL)	Elastase inhibition (%)	처리농도 (mg/mL)	Elastase inhibition (%)
0.1	67.0±1.16	10	9.81±0.36	10	15.1±1.01
0.01	44.8±1.59	5	9.51±2.49	5	14.7±0.53
0.0025	30.1±4.43	2	12.2±0.70	2	10.1±1.33
0.001	19.0±1.29	1	11.1±0.87	1	20.3±1.17
0.0001	10.9±0.54	0.1	15.1±0.28	0.1	11.4±0.28

배 식물캘러스의 경우 역시 그 상등액 추출물 및 열수 추출물의 엘라스타아제 저해 활성은 처리 농도에 대한 의존성이 없었으며 배 식물캘러스 상등액 추출물은 최대 47.6 내지 1.35%의 저해 활성을 보였으며 배 식물캘러스 열수 추출물은 양성 대조군인 0.001 mM ursolic acid에 상응하는 최대 저해 활성 (45.9 내지 1.18%)을 나타냈다 (표 20, 도 14).

Ursolic acid		배 식물캘러스 상등액 추출물		배 식물캘러스 열수 추출물
처리농도 (mM)	Elastase inhibition (%)	처리농도 (mg/mL)	Elastase inhibition (%)	처리농도 (mg/mL)	Elastase inhibition (%)
0.1	96.3±0.55	10	39.6±3.06	10	37.9±1.60
0.01	81.7±2.40	5	42.8±0.97	5	39.9±2.28
0.0025	60.8±1.23	2	43.1±1.67	2	42.0±1.10
0.001	49.9±1.10	1	42.0±0.61	1	44.3±1.70
0.0001	39.3±2.46	0.1	47.6±1.35	0.1	45.9±1.18

실험예 7: 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 콜라겐 생성 촉진 활성

상기의 방법으로 얻어진 유자 및 배 식물캘러스 상등액 추출물 및 열수 추출물의 콜라겐 생성 촉진 활성은 다음과 같이 평가하였다. 인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk)를 96 well plate에 1 × 10⁴ cell/well씩 분주하고 10% FBS가 포함된 DMEM 배양액에서 24시간 배양한 후 serum free 배지로 단계적으로 희석한 유자 및 배 식물캘러스 상등액 및 추출액 혹은 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자 (recombinant human transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 각 well에 100 μL씩 가하고 24시간 동안 CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 세포 배양액을 취해 Procollagen type I C-peptide EIA kit (Takara, Japan)을 이용하여 콜라겐 생합성 양을 측정하였다. 먼저, anti-POD conjugate solution을 100 μL씩 각 well에 첨가하고 시료 혹은 표준액을 20 μL씩 넣은 후 교반한 다음 37℃에서 3시간 반응시켰다. 이후 내용물을 제거하고 인산염완충액 (pH 7.4) 400 μL로 4회 세척하였다. 세척 후 각 well 당 기질 용액을 100 μL씩 넣고 20~30℃에서 15분간 반응시킨 뒤 ELISA stop solution을 100 μL씩 첨가하여 발색을 중지시킨 후 교반하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준농도곡선을 이용하여 콜라겐 생합성 양을 산정하였다.

실험 결과 유자 및 배 식물캘러스 상등액 혹은 추출물 처리 시 무처치 음성 대조군 대비 콜라겐 생합성이 유의적으로 증가하였으며 양성 대조군인 rhTGF-β의 경우 100 ng/mL의 처리 농도에서 무처치 음성 대조군 대비 콜라겐 생합성이 163% 증가하였다 (표 21, 도 15).

rhTGF-β		유자 식물캘러스 상등액 추출물		유자 식물캘러스 열수 추출물
처리농도 (ng/mL)	Procollagen type I C-peptide (ng/mL)	처리농도 (mg/mL)	Procollagen type I C-peptide (ng/mL)	처리농도 (mg/mL)	Procollagen type I C-peptide (ng/mL)
0	379.7±66.83	5	489.6±40.44	5	507.2±38.40
10	571.0±71.52	2	744.6±88.49	2	620.9±72.01
100	617.5±97.41	1	658.3±73.08	1	668.1±22.40
500	561.6±98.9
1,000	504.2±71.7

반면 유자 식물캘러스 추출액 (1 mg/mL)은 무처치 음성 대조군 대비 콜라겐 생합성이 176% 증가하였으며 배 식물캘러스 추출액 (5 mg/mL)은 무처치 음성 대조군 대비 콜라겐 생합성이 204% 증가하였다 (표 22, 도 16).

rhTGF-β		배 식물캘러스 상등액 추출물		배 식물캘러스 열수 추출물
처리농도 (ng/mL)	Procollagen type I C-peptide (ng/mL)	처리농도 (mg/mL)	Procollagen type I C-peptide (ng/mL)	처리농도 (mg/mL)	Procollagen type I C-peptide (ng/mL)
0	379.7±66.83	5	785.0±27.40	5	776.5±54.00
10	571.0±71.52	2	763.4±33.69	2	681.7±99.70
100	617.5±97.41	1	807.1±46.61	1	560.4±72.78
500	561.6±98.9
1,000	504.2±71.7

실험예 8: 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 피부세포 증식 활성

상기의 방법으로 개발된 유자 및 배 식물캘러스 상등액 및 추출액의 피부세포 증식 활성을 다음과 같이 평가하였다. 인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk)를 96 well plate에 5 × 10³ cell/well씩 분주하여 10% FBS/DMEM 배지로 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 0.05% FBS가 포함된 DMEM 배양액에서 다시 24시간 배양하였다. 이후 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배양액으로 단계적으로 희석한 유자 및 배 식물캘러스 상등액 및 추출액과 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자 (recombinant human transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 각 well에 100 μL씩 가한 후 다시 24시간 동안 CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 5 mg/mL 농도의 WST-1 (Roche Diagnostics) 용액을 각 well에 10 μL씩 처리한 후 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 뒤 450 nm에서 흡광도 측정하고 무처치 음성 대조군 대비 피부세포의 증식 정도를 평가하였다.

실험 결과 유자 및 배 식물캘러스 상등액 추출물은 5 mg/mL 이하의 농도에서 무처치 음성 대조군 대비 인간섬유아세포의 증식이 유의적으로 증가하였으며 양성 대조군인 rhTGF-β의 경우 1,000 ng/mL 농도로 처리 시 무처치 음성 대조군 대비 피부세포 증식이 135% 증가하였다. 반면 유자 식물캘러스 열수추출물 (5 mg/mL) 처치 시 무처치 음성 대조군 대비 피부세포 증식이 154% 증가하였으며 배 식물캘러스 열수 추출물 (5 mg/mL) 처치 시 무처치 음성 대조군 대비 피부세포 증식이 126% 증가하였다 (표 23 및 24, 도 17 및 18).

rhTGF-β		유자 식물캘러스 상등액 추출물		유자 식물캘러스 열수추출물
처리농도 (ng/mL)	Relative cell proliferation (%)	처리농도 (mg/mL)	Relative cell proliferation (%)	처리농도 (mg/mL)	Relative cell proliferation (%)
0	100.0±5.426	10	26.16±1.664	10	27.44±0.952
10	115.2±2.146	5	50.35±3.907	5	153.9±8.878
50	132.5±12.81	2	95.71±4.217	2	130.2±12.93
100	131.0±12.59	1	99.00±4.944	1	133.3±16.58
500	127.9±13.58	0.1	102.8±8.434	0.1	114.2±8.894
1,000	134.8±13.53	0.01	103.1±9.888	0.01	115.7±12.56

rhTGF-β		배 식물캘러스 상등액 추출물		배 식물캘러스 열수추출물
처리농도 (ng/mL)	Relative cell proliferation (%)	처리농도 (mg/mL)	Relative cell proliferation (%)	처리농도 (mg/mL)	Relative cell proliferation (%)
0	100.0±5.426	5	104.1±5.122	5	126.4±9.000
10	115.2±2.146	2	110.5±4.119	2	114.5±0.796
50	132.5±12.81	1	118.5±5.040	1	115.2±3.535
100	131.0±12.59	0.1	112.2±8.019	0.1	96.02±5.596
500	127.9±13.58	0.01	134.1±13.69	0.01	106.0±2.882
1,000	134.8±13.53

실험예 9: 배 또는 유자 캘러스 배양 추출물의 피부재생 활성

상기의 방법으로 개발된 유자 및 배 캘러스 상등액 및 추출액의 피부 재생 활성을 다음과 같이 평가하였다. 인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk)를 96 well plate에 3.5 × 10⁴ cell/well씩 분주하고 10% FBS/DMEM 배지에서 72시간 배양하여 인간섬유아세포 monolayer를 형성시킨 후 배양액을 제거하고 wound maker를 이용하여 각 well에 cell-free zone (scratch wound)를 형성시켰다. 이후 각 well을 인산염완충액 (pH 7.4) 100 μL로 4회 세척하고 serum free DMEM 배양액으로 단계적으로 희석한 유자 및 배 캘러스 상등액 추출물 및 열수 추출물 혹은 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자 (recombinant human transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 각 well에 100 μL씩 가한 후 CO₂ incubator에서 Incucyte Zoom microscope (Essen Bioscience)로 4시간 간격으로 72시간 동안 scratch wound의 회복(재생)율을 측정하였다.

실험 결과 유자 및 배 식물캘러스 상등액 추출물 처리 시 무처치 음성 대조군 대비 피부세포의 재생 활성이 유의적으로 증가하였으며 양성 대조군인 rhTGF-β의 경우 1,000 ng/mL 농도로 처리 시 무처치 음성 대조군 대비 피부재생 활성이 155% 증가하였다. 반면 유자 식물캘러스 열수 추출물 (0.01 mg/mL) 처치 시 무처치 음성 대조군 대비 피부재생 활성이 155% 증가하였으며 배 식물캘러스 열수 추출물 (0.01 mg/mL) 처치 시 무처치 음성 대조군 대비 피부재생 활성이 126% 향상되었다.

rhTGF-β (ng/mL)	Relative wound recovery (%)	식물캘러스 (mg/mL)	Relative wound recovery (%)
0 ng/mL	36.0 ± 0.99	유자 식물캘러스 상등액 추출물 (0.01 mg/mL)	43.6 ± 3.32
10 ng/mL	44.8 ± 1.06	유자 식물캘러스 열수 추출물 (0.01 mg/mL)	55.7 ± 1.41
50 ng/mL	43.6 ± 3.04	배 식물캘러스 상등액 추출물 (0.01 mg/mL)	45.3 ± 0.50
100 ng/mL	49.3 ± 1.11	배 식물캘러스 열수 추출물 (0.01 mg/mL)	45.3 ± 0.91
500 ng/mL	54.6 ± 3.68
1,000 ng/mL	55.7 ± 6.93

실험예 10: 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 주름 개선 효능 시험

인체 피부를 구성하는 섬유아세포 (fibroblast)가 생산하는 세포간 물질 중 피부의 탄력을 유지하는 핵심 성분인 콜라겐 (collagen)은 세포 내 합성에 proline 아미노산의 유도체인 hydorxyproline과 lysin 아미노산의 유도체인 hydroxyllysin이 필수 요소로 요구된다. 이 두 아미노산 유도체들은 proline hydroxlase와 lysyl hydroxylase 효소들에 의해 효소 전환되는데, 섬유아세포의 세포 배양시 배 캘러스 추출물, 유자 캘러스 추출물, 그리고 카보머 혼합 처리가 세포내 두 효소의 발현에 어떤 영향을 미치는 지 RT-PCR로 조사하였다.

1.1 CCD-986sk 피부 섬유아세포 배양

CCD-986sk 피부 섬유아세포 (Human dermal fibroblast cell)는 Polystyrene 세포 배양접시에 부착시키고 10% FBS (Gibco, USA)를 첨가한 DMEM (Gibco, USA)을 사용하여 배양하였다. 배양시 습도는 95%, 온도는 37℃를 유지 하면서 5% CO2를 계속 공급하였다.

1.2 Reverse transcriptase PCR을 이용한 효소의 mRNA 발현 측정

각 농도의 배 캘러스 추출물, 유자 캘러스 추출물, 카보머((주)해피콜 (한국), Polygel CS)를 단독 혹은 혼합으로 2일 또는 3일간 처리한 세포에서 Trizol reagent를 이용하여 RNA를 분리하고 파장 260 nm에서 정량하였다. Total RNA 10 μL (0.5μg/μL)를 65℃에서 10분간 가열하고 4℃에서 10분 동안 방치한 후 1 μL oligo (dT)15 primer (0.5 μg/μL), 1μL M-MLV RT (10 unit/μL; promega, USA), 1 μL RNase inhibitor (20~40 unit/μL; promega, USA), 10μL 5X RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 5 μL 2.5 mmol/L dNTP mixture, 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 증류수를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 가열하여 cDNA를 합성하였다. Prolyl hydroxylase와 Lysyl hydroxylase의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA 로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), Prolyl hydroxylase와 Lysyl hydroxylase의 primer sequence는 Table 1과 같다. Prolyl hydroxylase의 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 0.1% DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아) 에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 72℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분동안 30cycle로 진행하였다. Lysyl hydroxylase는 denaturation 94℃ 30초, annealing 52℃에서 45초, extention 72℃ 30초간 총 40cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 2% agarose gel에서 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 imaging densitometer [Labworks ver.4.6. (image acquisition and analysis software), UVP, CA]를 사용하여 측정하였다.

RT-PCR을 위한 primer 서열

Gene		Primer sequence
GAPDH	Sense	5’-TTG TCA AGC TCA TTT CCT GGT ATG-3’
	Anti-sense	5’-GCC ATG TAG GCC ATG AGG TC-3
Prolyl hydroxylase	Sense	5’-CCA CAG CAG AGG AAT TAC AG-3’
	Anti-sense	3’-ACA CTA GCT CCA ACT TCA GG-5’
Lysyl hydroxylase	Sense	5’-GGA ACC TGG CCT ATG ACA CCC T-3’
	Anti-sense	5’-TGC CAT GCT GTG CCA GGA ACT-3’

실험 결과, 프롤린 하이드록실라제(prolyl hydroxlase) 발현의 경우 배 캘러스 추출물과 유자 캘러스 추출물을 세포 배양액을 기준으로 카보머 단독으로 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.25%, 1.5% 처리한 경우 무처리군에 비해 증가와 감소가 반복되어 유의적인 증가효과를 나타내지는 못하였다. 역시 라이실 하이드록실라제(lysyl hydroxylase) 발현의 경우도 카보머 단독으로 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.25%, 1.5% 처리한 경우 무처리군에 비해 증가와 감소가 반복되어 큰 변화를 유발하지 못하였다. (도 19 및 도 20) 그러나, 배 캘러스 추출물 및/또는 유자 캘러스 추출물과 함께 0.5% 농도의 카보머를 혼합 처리하는 경우 proline hydroxlase와 lysyl hydroxylase 발현들이 무처리구 대조군 혹은 카보머 단독 처리군에 비해 유의적으로 증가됨을 확인할 수 있었다.

이러한 실험 결과를 통해 배 캘러스 추출물과 유자 캘러스 추출물은 시험된 농도 범위에서 단독 처리의 경우, 콜라겐을 합성하는데 중요한 두 효소의 세포내 유전자 발현에 큰 영향을 미치지 않았으나 0.5%의 카보머와 혼합 처리하는 경우, 유의적인 발현양의 증가가 확인되었다. 실험 결과 카보머를 단독으로 처리하는 경우는 시험에 사용된 0.1%에서 1.5%까지 무처리군에 비해 유의적인 차이가 없었지만, proline hydroxylase 발현양은 배 캘러스 추출물 1.0%와 카보머 0.5%를 혼합 처리한 경우 무처리군에 비해 약 159%와 유자 캘러스 추출물 1.0%와 카보머 0.5%를 혼합 처리한 경우는 약 179% 증가한 결과를 보였으며, 이러한 카보머의 효과는 카보머, 배 캘러스 추출물과 유자 캘러스 추출물을 0.5%씩 혼합 처리한 경우에도 168%로 크게 증가하였다.

1.대조군	2.카보머 0.1%	3.카보머 0.5%	4.카보머 1.0%	5.카보머 1.25%	6.카보머 1.25%	7.배 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5%	8.유자 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5%	9.배 캘러스 추출물 0.5% + 유자 캘러스 추출물 0.5% + 카보머 0.5%
평균: 100	106	94	97	105	89	159	179	168
표준편차:35	16	45	31	9	21	43	33	35

Lysyl hyroxylase의 발현양에 미치는 영향도 proline hydroylase의 발현양에 대한 효과와 유사하였다. 실험 결과 카보머만을 단독으로 처리하는 경우는 시험에 사용된 0.1%에서 0.5%까지 무처리군에 비해 유의적인 차이가 없었지만, lysyl hydroxylase 발현양은 배 캘러스 추출물 1.0%와 카보머 0.5%를 혼합 처리한 경우 무처리군에 비해 약 189%와 유자 캘러스 추출물 1.0%와 카보머 0.5%를 혼합 처리한 경우는 약 178% 증가한 결과를 보였으며, 이러한 카보머의 효과는 카보머, 배 캘러스 추출물과 유자 캘러스 추출물을 0.5%씩 혼합 처리한 경우에도 180%로 크게 증가하였다.

1.대조군	2.카보머 0.1%	3.카보머 0.5%	4.카보머 1.0%	5.카보머 1.25%	6.카보머 1.25%	7.배 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5%	8.유자 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5%	9.배 캘러스 추출물 0.5% + 유자 캘러스 추출물 0.5% + 카보머 0.5%
평균: 100	88	106	104	121	108	189	178	180
표준편차:21	56	37	46	53	14	41	58	43

1.3 콜라겐 생성 촉진 활성 확인 시험

상기의 방법으로 개발된 유자 및 배 식물캘러스 상등액 및 추출액의 콜라겐 생성 촉진 활성은 다음과 같이 평가하였다. 인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk)를 96 well plate에 1 × 10⁴ cell/well씩 분주하고 10% FBS가 포함된 DMEM 배양액에서 24시간 배양한 후 serum free 배지로 단계적으로 희석한 유자 및 배 식물캘러스 상등액 및 추출액 혹은 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자 (recombinant human transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 각 well에 100 μL씩 가하고 24시간 동안 CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 세포 배양액을 취해 Procollagen type I C-peptide EIA kit (Takara, Japan)을 이용하여 콜라겐 생합성 양을 측정하였다. 먼저, anti-POD conjugate solution을 100 μL씩 각 well에 첨가하고 시료 혹은 표준액을 20 μL씩 넣은 후 교반한 다음 37^oC에서 3시간 반응시켰다. 이후 내용물을 제거하고 인산염완충액 (pH 7.4) 400 μL로 4회 세척하였다. 세척 후 각 well 당 기질 용액을 100 μL씩 넣고 20~30^oC에서 15분간 반응시킨 뒤 ELISA stop solution을 100 μL씩 첨가하여 발색을 중지시킨 후 교반하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준농도곡선을 이용하여 콜라겐 생합성 양을 산정하였다.

그 결과, 세포 내에서 prolyl hydroxylase와 lysyl hydroxylase의 발현의 증가가 실제 fibroblast의 collagen 함량의 증가로 연결되는 지를 확인하기 위하여 total collagen synthsis의 양을 무처리군 (Negative control, 음성대조군), 카보머 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.25%, 1.5% 처리군, 배 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5% 혼합 처리군, 유자 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5% 혼합 처리군, 그리고 배 캘러스 추출물 0.5% + 유자 캘러스 추출물 0.5% + 카보머 0.5% 혼합 처리군으로 비교하였다. 그 결과, 카보머 단독 처리군에서는 각각 106, 100, 104, 121, 108% 등으로 유의적인 증가효과를 보지 못하였고, 카보머를 혼합한 처리군들에서 각각 189%, 178%, 180%로 우수한 콜라겐 생산 증가 효능을 확인할 수 있었다 (도 21).

1.대조군	2.카보머 0.1%	3.카보머 0.5%	4.카보머 1.0%	5.카보머 1.25%	6.카보머 1.25%	7.배 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5%	8.유자 캘러스 추출물 1.0% + 카보머 0.5%	9.배 캘러스 추출물 0.5% + 유자 캘러스 추출물 0.5% + 카보머 0.5%
평균: 100	106	100	104	121	108	189	178	180
표준편차:21	56	37	15	19	14	41	58	43

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 배 또는 유자(Magnoliales) 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 카보머를 유효성분으로 더 함유하는 피부 외용제 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 주름 방지 또는 개선용인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 탄력 증진용인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 재생용인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 항산화능을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. (a) 배 또는 유자 성체 식물로부터 캘러스를 유도하는 단계; 및
   (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배 또는 유자 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음,
   원심분리하여 상등액을 얻거나, 냉수 추출하거나, 열수 추출하거나 또는 에탄올 추출하여 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계를 포함하는
   제1항에 따른 피부 외용제 조성물의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 (b) 단계에 있어서,
   상기 추출하여 추출물을 얻은 후 카보머와 혼합하여 피부 외용제 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 피부 외용제 조성물을 제조하는 방법.
   
   

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