KR102604529B1 - 줄기세포 배양 혼합물을 포함하는 피부개선용 화장료조성물 - Google Patents

줄기세포 배양 혼합물을 포함하는 피부개선용 화장료조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 배양 혼합물을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물로서, 구체적으로 인체유래 줄기세포배양물 및/또는 식물유래 줄기세포배양물에 히알루론산, 펩타이드, 천연 추출물을 혼합하여 항산화, 주름개선 및 항염 효과를 현저히 높인 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

줄기세포 배양 혼합물을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN IMPROVEMENT CONTAINING STEM CELL CULTURE}
본 발명은 줄기세포 배양 혼합물을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물로서, 구체적으로 인체유래 줄기세포배양물 및/또는 식물유래 줄기세포배양물에 히알루론산, 펩타이드, 천연 추출물을 혼합하여 항산화, 주름개선 및 항염 효과를 현저히 높인 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
과학이 발전함에 따른 인간의 수명 연장과 삶의 질의 향상으로 인해, 아름다움과 젊음을 유지하고자 하는 욕구를 충족하기 위한 화장품에 대한 관심은 날로 증가하고 있다. 이로 인해 기능성 화장품은 미용뿐만 아니라 노화예방, 질병치료 등의 기능도 포함된 다기능성 및 고기능성의 개념을 추구하고 있으며, 그에 따른 신소재 개발이 강하게 요구되고 있다.
그 중에서 줄기세포를 활용한 소재 개발이 활발히 이루어지고 있다. 줄기세포는 의약 목적뿐만 아니라 미용 목적으로 효과가 잘 알려져 있으며, 줄기세포 자체 보다는 배양액 추출물이 주로 활용되고 있다. 줄기세포는 크게 인체유래 줄기세포배양액, 식물유래 줄기세포배양액, 줄기세포 유래 소재 등이 있다. 인체유래 줄기세포배양액은 획득과 분리가 쉬운 지방 유래 줄기세포가 주로 활용되고 있으며, 지방유래 줄기세포를 배양하는 과정에서 배양액에 줄기세포가 자라면서 분비되는 다양한 성장인자와 사이토카인 등을 포함하고 있어 피부 재생에 효과적으로 보고되고 있다. 또한 식물유래 줄기세포는 캘러스(Callus)라고도 불리며 약리학적 특징이나 효능이 있는 식물들의 세포를 조직 배양하여 이용되고 있다. 식물조직배양은 식물체로부터 기관, 조직 및 세포를 적출 분리한 후 식물의 생장에 필요한 영양분이 포함된 배지에 의해 무균 배양하는 기술이 적용되고 있다.
그 외에도 유전자 재조합 기술을 이용한 성장인자를 생산하여 화장품 소재에 적용되기도 하며, 대표적으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 재조합 분비를 위한 EGF 유전자 구조를 확립하고, Bacillus subtilis에서 배지로 EGF 분비를 효과적으로 유도하여, 이전 시스템보다 수율성을 높인 기술이 개발되기도 하였다. 다만, 최근에는 화장품재료로 유전자변형, 박테리아 유래 성분들을 선호하지 않고, 인간을 포함한 동물 유래의 성분들은 법적으로 사용이 제한되고 있다.
이에, 화장품 산업에 사용되는 재료들은 점차 자연으로부터 유래된 천연 물질로 변화하고 있는 추세이다. 따라서 많은 화장품 연구 개발 그룹에서는 소비자 및 법률 요구 사항을 충족시키기 위해 원료의 개발 방법으로 생체유래, 세포배양과 같은 기술이 이용되고 있으며, 피부 안전성과 효능이 우수한 줄기세포 배양액을 이용한 고부가가치의 기능성 화장품 소재의 개발의 필요성은 지속되고 있다.
한국등록특허 제10-2539209호
본 발명의 목적은 줄기세포 배양액의 혼합물을 유효성분으로 하여 피부에 안전하면서, 피부개선 효과가 탁월한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 줄기세포 배양 혼합물 및 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 줄기세포 배양 혼합물은 동물유래 줄기세포배양물 및/또는 식물유래 줄기세포배양물을 모두 포함할 수 있으며, 피부개선에 효과가 있는 줄기세포배양물이라면 종류에 상관없이 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 줄기세포 배양 혼합물은 인체유래 줄기세포배양물 및/또는 식물 줄기세포배양물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 식물 줄기세포배양물은 사과 줄기세포배양물 및 복숭아 줄기세포배양물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 식물 추출물은 병풀 추출물 및 서양민들레 잎 발효 추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 추출물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “줄기세포(stem cell)”란, 탈분화 과정을 거치지 않아 유전적으로 보다 안정한 선천적인 미분화 세포를 의미한다. 그 중에서 식물 줄기세포(plant stem cell)는 식물 캘러스(Callus)라고도 불리우며, 탈분화 과정을 통하여 분화하지 않은 상태로 된 세포 또는 세포덩어리를 말한다. 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에서 분열이 왕성한 조직으로, 캘러스는 분열이 왕성하기 때문에 일반 식물체보다 항염,항산화, 항주름, 미백 등의 효과적인 생리활성물질을 고농도로 함유하고 있다.
본 발명에서 “인체유리 줄기세포”는 인간의 지방세포로부터 유래된 줄기세포(human adipose-derived stem cells)를 의미하며, 인체유래 줄기세포배양액은 해당 인체줄기세포를 수 일간 배양한 후 이를 제거한 성장배지를 의미한다. 또한 지방세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀 등을 추가로 추출할 수 있다.
본 발명에서, 사과(Pyrus Malu)는 장미과에 속하는 식물로 우리나라 기후에 알맞아 국내 생산량이 많은 과일 중 하나이다. 사과는 carotenoids, flavonoids, isoflavonoids, phenolic acids와 같은 phytochemical이 풍부한 것으로 알려져 있으며, 사과의 과육과 과피 추출물에서 주름개선, 미백 효능이 있다고 보고되었다. 또한 사과 세포배양재료를 이용한 기능성 화장품에서 Human stem cell의 증식 및 보호효과, 모낭세포의 노화 억제, 주름개선 효과 등이 있는 것으로 보고되면서 사과 추출물을 이용한 화장품이 상업적으로 판매되고 있다.
본 발명에서, 복숭아(Prunus persica L. Batsch)는 장미과에 속하는 온대 낙엽성 과수로 중국이 원산지로 알려져 있으며 전 세계적으로 소비되는 주요 과실 중 하나이다. 국내에서 복숭아는 감귤, 사과, 감 다음으로 생산량이 많은 과일로 6~9월에 집중적으로 소비되고 있다. Anthocyanin, carotenoid 등과 같은 다양한 기능 성분을 함유한 복숭아는 현재 여러 생리 활성 연구가 활발히 진행 중이며, 복숭아 ethyl acetate 분획물은 대표적인 합성 항산화제인 BHA보다 우수한 항산화력과 그로부터 기인한 항염 활성이 잘 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 줄기세포 배양 혼합물은 인체유래 줄기세포배양물 및 식물 줄기세포배양물의 혼합물일 수 있다. 구체적으로 인체유래 줄기세포배양물 및 식물 줄기세포배양물은 1 : 0.5 내지 1 : 1.5의 비율로 혼합한 것일 수 있다. 또한 식물 줄기세포배양물은 사과 유래 줄기세포배양물 또는 복숭아 유래 줄기세포배양물이거나, 또는 이를 모두 포함한 혼합 추출물일 수 있다.
상기 식물 줄기세포배양물은 리포좀으로 포접된 것일 수 있다. 상기 리포좀은 4℃ 이하의 온도에서 제조되므로, 봉입효율이 우수하며 열에 약한 줄기세포 배양액이 손상되는 것을 방지할 수 있다.
상기 피부개선용 화장료 조성물은 화장료 조성물 100중량부를 기준으로, 상기 줄기세포 배양 혼합물 0.01 내지 1.0 중량부, 히알루론산 0.01~1 중량부, 펩타이드 0.0001 내지 1 중량부, 나이아신아마이드 2.0~5.0 중량부, 글리세린 0.5~2 중량부 및 아데노신 0.01~0.1 중량부를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 줄기세포 배양 혼합물의 경우 0.001 내지 1.0 중량부를 함유할 수 있고, 상세하게는 0.001 내지 0.1 중량부, 더욱 상세하게는 0.01 내지 0.05 중량부를 함유할 수 있다. 0.001 중량부 미만이면 효과가 미미하고, 1.0 중량부 초과하면 세포독성을 나타내는 문제가 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 병풀 추출물 0.1~3중량부 및 서양민들레 잎 발효 추출물0.1~3 중량부로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 “병풀(Centella asiatica)”은 미나리과에 속하는 여러해살이 풀로서, 멜라닌을 억제하고 기미 및 색소침착 완화에 효과가 있다. 또한 자외선으로 붉어진 피부를 진정시키고, 피부의 유수분밸런스 개선의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 “서양민들레 잎(Taraxacum officinale)”은 유럽이 원산으로 100여 년 전 우리나라에 들어와 토착화된 귀화식물이다. 유럽에서는 잎을 샐러드로, 뿌리를 커피 대용으로 섭취 할 뿐만 아니라 비타민과 무기질 등 기능성 성분들을 다량 함유하고 있어 약으로 많이 이용되어 오고 있는 식물이다.
상기 병풀 또는 서양민들레 잎 추출물은 병풀 또는 서양민들레 잎의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액들의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 추출물은, 상기 병풀, 서양민들레 잎의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.
본 발명의 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물(정제수), C1 내지 C4의 무수 또는 저급 알코올, 상기 물과 저급 알코올의 혼합 용매, 아세톤, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상으로, 단독으로 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 원료에 포함된 유효성분은 용매의 극성에 따라 추출 비율이 상이해질 수 있다. 특히, 상기 용매는 상기 원료의 생리 활성 물질의 추출에 있어서 선택성이 뛰어난 알코올이 바람직할 수 있고, 바람직하게는 에탄올 추출에 의해 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있다.
특히 물과 에탄올은 극성이 상이하여, 각 극성에 따라 추출되는 유효성분이 차이가 날 수 있으므로 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있도록 상기 에탄올의 농도를 적절히 제어할 수 있다. 다만, 상기 에탄올은 농도가 50% 미만이면 피부 개선 효과를 나타내는 유효 성분이 충분하게 추출되지 않을 수 있고, 농도가 80% 초과이면 적정한 수율이 구현되지 않을 수 있으므로, 상기 에탄올의 농도를 상기 범위 내에서 적절히 조정할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 서양민들레 잎 추출물의 추출 용매는 에탄올일 수 있으며, 더욱 구체적으로 70% 에탄올일 수 있다.
본 발명에서 “발효”는 발효 균주 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미한다. 발효 균주를 통한 발효과정을 거친 원료는 발효 전보다 최소 2배에서 최대 수십배의 효과가 증대되는 것으로 알려져 있다. 특히 발효를 거친 대사물질은 피부에 좋은 각종 아미노산, 유기산을 포함한 항산화 물질을 함유하여 피부를 개선시켜주는 효과가 있다.
구체적으로, 상기 서양민들레 잎 추출물은 락토바실러스 균주를 이용하여 15℃ 이상 25℃ 이하의 저온에서 발효시킨 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 화장료 조성물은 항산화, 피부 주름개선 또는 피부 항염 용도일 수 있다.
본 발명에서 “항산화”란, 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질과 산화억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체물질과 쉽게 반응할 수 있으며, 생체 내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 암 등을 초래하게 되고, 노화의 직접적인 원인이 되기도 한다. 이러한 활성 산소종을 제거하거나 감소시킴으로써 항산화 효과를 얻어 노화를 방지하고 건강을 유지할 수 있게 된다.
본 발명의 일 실시예에서 항산화 활성을 평가한 결과, 복숭아 줄기세포 배양물만 첨가한 비교예에서는 항산화 활성이 14%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 반면, 인체유래 줄기세포배양물 및 식물 줄기세포배양물을 포함하는 줄기세포 배양 혼합물을 첨가함으로써 양성대조군인 Trolox와 유사 수준까지 DPPH 라디칼 소거능이 향상됨을 확인하였다(도 1).
본 발명에서 “주름 개선”이란, 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유가 콜라겐과 함께 존재하며, 상기 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지 또는 향상되는 형상을 의미한다. 또한 상기 주름 개선은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름이 완화되는 현상을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 콜라겐을 통해 피부 노화 및 주름생성 방지 효과를 확인한 결과, 식물 줄기세포 배양 혼합물을 첨가한 화장료 조성물에서 콜라겐 생합성량이 증가하며, 특히 천연 식물 추출물을 첨가함에 따라 양성대조군과 유사한 수준의 활성을 보이며 콜라겐 생합성을 촉진할 수 있는 효과가 탁월한 것을 확인하였다(도 2).
본 발명에서 “항염”은 염증 개선 효과를 의미한다. 상기 “염증”은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전으로, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민, 세로토닌, 브라디키닌, 프로스타글란딘, HETE(hydroxyeicosatetraenoic acid), 류코트리엔과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증이 유발될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 세포 염증인자인 NO, COX-2에 대한 저해 활성을 측정한 결과, 복숭아 줄기세포배양물을 처리할 때에는 대조군과 차이가 거의 나타나지 않았으나, 줄기세포 배양 혼합물에서는 눈에 띄개 NO 생성이 감소함을 확인하였다(표 3).
또한 본 발명의 일 실시예에서 COX-2의 발현량이 본 발명의 화장료 조성물의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였는 바, 염증 유발 인자 관련하여 높은 저해 활성을 가지는 것을 확인하였다(표 4).
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 리퀴드, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 바디워시, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 폼 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.
상기 조성물은 피부에 직접 도포하거나 살포하는 등의 경피 투여 방법으로 사용될 수 있으며, 본 발명 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 사용량은 연령, 병변의 정도 등의 개인 차이나 제형에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 1일 1회 내지 수회 적?韜?을 피부에 도포하여 1 주일 내지 수개월 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 줄기세포 배양 혼합물을 통해 피부 개선 효과를 높일 수 있어, 다양한 용도의 기능성 화장품에 활용될 수 있다.
또한 병풀 추출물 및 서양민들레 잎 발효 추출물을 첨가함으로써 기존 식물 줄기세포 배양 혼합물의 주름개선, 항염 효과를 크게 증진시킬 수 있는 바, 노화방지 용도로 탁월한 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 실시예 및 비교예의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 평가를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 및 비교예의 50ug/mL 농도에서 콜라겐 생합성량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. 인체유래 줄기세포 배양액의 시료 준비
인체 지방조직으로부터 줄기세포의 단리는 통상적인 방법으로 수행하였다. 분리된 지방 흡입물은 세척하여 지방 조직만을 얻은 후 콜라게나아제를 처리한 다음 원심분리하여 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 이렇게 얻은 세포 펠렛 형태의 스트로마성 혈관 분획을 세척한 다음 세포 여과기를 통과시켜 세포 이외의 조직을 제거한 후 플라스크에 하루 동안 배양하였다. 이후 비접착성 세포들을 제거하였다. 플라스크에는 부착 단백질을 코팅하였고, 무혈청 배지를 사용하여 줄기세포를 배양하였다. 상기 단리된 부착형 줄기세포들을 3일 간격으로 배지를 교환해주면서 플라스크 내 세포가 70 ~ 80% 가득찰 때까지 유지한 후 계대 배양을 하였다. 초기 배양의 일반적인 조건은 온도 37℃, 5% CO2로 하였다. 세포가 플라스크 바닥의 70 ~ 80%를 채우면 증식 배지를 제거하고 트립신을 처리하여 세포를 플라스크에서 떼어 내었다. 계대 배양을 위해서 부착 단백질이 코팅된 새로운 플라스크에 10,000개/㎠의 세포를 분주하였다. 계대 후 배양 조건은 온도 37℃5% CO2, 5~10% O2로 하였다. 무혈청 배지 내 세포 성장에 필요한 영양분은 공급하고 3~4일 후 배양액의 50~75%를 새로운 배지로 교환하였다.
준비예 2. 식물 줄기세포 배양물의 시료 준비
2-1. 식물 재료 및 캘러스 유도
사과 및 복숭아 캘러스 유도에는 각각 갈라(Malus domestica), 찌요마루(Prunus persica L. Batsch) 품종을 이용하였다. 사과 및 복숭아 캘러스 종자를 각각 70% 에탄올에 1분 동안 침지한 후 멸균수로 세척하였다. 1% 차아염소산나트륨으로 20분간 소독한 후 멸균수로 3회 세척한 후 Filter paper에서 건조하였다. Agar 8g/L, sucrose 30g/L가 첨가된 MS배지(Murashige and Skoog, 1962)와 WPM(Lloyd and McCown, 1980) 배지에 종자를 각각 파종하였다.
배양기의 온도를 25℃로 유지하고 암실 배양하여 종자로부터 발아를 유도하였다. 발아된 종자의 자엽 및 줄기를 절단하여 IAA 2mg/L, sucrose 30g/L agar 8g/L 및 쿼세틴 100mg/L가 첨가된 MS 배지(pH 5.8)와 WPM 배지(pH 5.8)에 치상하였다. 25℃에서 4주 경과한 후, 배지에 치상된 자엽 및 줄기의 절편에서 캘러스가 유도되었다. 다시 4주 경과 후, 사과, 복숭아 각각으로부터 유도된 캘러스 또는 그 배양물을 채취하였다.
2-2. 캘러스 추출물의 리포좀화
본 발명에서 리포좀은 레시틴과 수상성분으로 구성된다. 상온에서 레시틴을 상기 실시예 2-1의 캘러스가 포함된 수상에 분산시킨 뒤, 초임계 이산화탄소를 이용하여 4℃ 이하의 온도에서 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼(수상/저온공정 이산화탄소)을 형성시켜 반응을 중지하고, 초임계 이산화탄소를 감압 기화시키면 초임계 이산화탄소 상이 제거되면서 줄기세포의 배양액이 포접된 리포좀 현탁액을 수득하였다.
준비예 3. 식물 추출물의 준비
3-1. 병풀 추출물 및 서양민들레 잎 추출물의 제조
병풀 및 서양민들레 잎을 수세한 후, 상온에서 완전히 건조시키고 분쇄하여 분쇄물을 각각 100 g씩 수득하였다. 병풀 및 서양민들레 잎의 분쇄물을 각 100 g에 대해 10배 부피의 에탄올 수용액(50% 질량농도)를 용매로 하여 50℃의 온도에서 12시간 동안 침적 추출하였다. 각각의 추출물은 필터에 의해 여과되었으며, 잔여 원료에 대해 동일한 방법으로 3회씩 반복 추출하여 수득된 추출물을 수득하였다.
3-2. 서양민들레 잎 발효추출물의 제조
서양민들레 잎 추출물의 발효를 위해 상기 2-1에서 준비한 서양민들레 잎 추출물을 준비하였다. 발효를 위한 종균은 멸균된 유산균 배양배지(Lactobacillus MRS Broth, 디프코, 미합중국)에서 배양된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 사용하였으며, 배양이 완료된 후 1x109 cfu/ml 농도로 서양민들레 잎 추출물에 접종하였다. 이때, 발효 균주는 락토바실러스 람노서스 공시균주인 KCTC5033을 이용하였다. 발효는 발효조를 이용하여 1~3일간, 25~35°C로 유지하며 진행하였다. 발효가 완료된 서양민들레 잎 발효물은 원심분리하여 균체를 제거하고 0.2 μm 여과지를 이용하여 최종 여과하였다. 추출 여과된 서양민들레 잎 추출물은 동결건조하여 사용하였다.
실시예 및 비교예
성분
[함량(중량부)]
실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 비교예 2 비교예 3
인체유래 줄기세포배양물 0.02 0.02 0.02 - 0.02 0.02
복숭아 줄기세포배양물 0.02 0.02 - 0.02 - 0.02
복숭아 캘러스엑소좀 - - 0.02 - - -
히알루론산 0.16 0.16 0.165 0.16 0.16 0.16
펩타이드 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
나이아신아마이드 2.15 2.15 2.15 2.15 2.15 2.15
글리세린 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
아데노신 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
병풀 추출물 0.5 0.5 0.5 - - -
서양민들레 잎 발효 추출물 - 0.5 - - - -
실험예 1. 세포 독성 평가(EZ-cytox assay)
실시예 1 내지 3의 피부 안정성을 확인하기 위해, EZ-사이톡스 분석(EZ-cytox assay)법을 이용하여 세포 독성 평가를 수행하였다. EZ-사이톡스 분석(EZ-cytox assay)은 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogenase)와 반응하여 주황색의 수용성 formazan을 생성하는 원리를 이용하여 세포생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.
구체적으로, 피부각질형성세포에서의 독성을 확인하기 위하여 HaCaT 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5 X 104 cells/mL로 96 웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트리더 (microplate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.
세포 생존율(대조군 %)
농도(ug/ml) 0 12.5 25 50 100
실시예 1 100 114 122 126 122
실시예 2 100 112 120 124 124
실시예 3 100 115 122 127 126
그 결과, 실시예 1 내지 3의 화장료 조성물은 농도에 상관 없이 우수한 세포 생존율을 나타냈으며, 피부각질형성세포에 대한 독성이 거의 없어 안정성이 높음을 확인하였다
실험예 2. 항산화 활성 분석
피부는 자외선 노출 시 자유 라디칼(free radical)인 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성되어 탄력감소, 주름살 및 기미; 주근깨와 같은 피부 노화를 야기시키는 것으로 알려져 있다. 이들 반응은 대부분 라디칼 반응으로 자동산화반응을 거쳐 진행되는데, α-tocopherol, L-ascorbic acid와 같은 항산화제에 의해 라디칼이 소거되면서 반응이 종결된다. 그 중 안정화된 구조의 라디칼인 2,2-diphenyl-1-picrylhydrezyl(DPPH) 반응은 항산화 활성을 측정하는데 보편적으로 사용되는 방법으로, 실시예 1 내지 3의 항산화 활성도 DPPH 라디칼 소거능을 이용하여 측정하였다.
상기 실시예 1 내지 3의 항산화 할성은 DPPH 라디칼 소거활성을 Fugita의 방법을 응용하여 측정하였다. 실시예 1 내지 3의 시료를 100% DMSO에 녹인 후 10, 50, 100, 500 ug/mL를 가하여 10초간 진탕한 후 상온에서 30분간 방치한 다음 540 nm에서 ELISA plate Reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 Trolox를 이용하였고, DPPH 라디칼 소거율은 아래와 같은 계산식으로 산출하여 백분율(%)로 나타내었다.
[식 1]
DPPH radical 소거활성(%) = {1 - (시료첨가군의 흡광도)/(무 첨가군의 흡광도)} X 100
그 결과, 양성 대조군인 Trolox는 10ug/mL의 농도에서 약 85%의 소거능을 인 반면, 비교예 1의 복숭아 줄기세포배양물을 포함한 경우 항산화 활성이 500ug/mL에서 각각 14%로 매우 낮은 수치로 나타났다. 실시예 1 내지 3의 조성물에서 각각 65%, 80%, 88%의 소거능을 부여하면서, 항산화 활성이 양성대조군과 유사한 수준으로 높은 것을 확인하였는 바, 식물 줄기세포 배양 혼합물 및 식물 추출물의 조합에 따라 DPPH 라디칼 소거활성이 크게 향상됨을 알 수 있었다(도 1).
실험예 3. 주름개선 활성 분석
외부로부터 자극에 대해 피부를 보호, 유지하는 콜라겐은 피부의 장력과 강도를 부여하기 때문에, 콜라겐의 감소는 피부노화 및 주름생성과 관계되어 있다.
상기 실시예 1 내지 3의 주름개선 활성을 확인하기 위해 인간유래 섬유아세포(Human fibroblast cells)의 콜라겐 생합성량을 측정하였다. 섬유아세포(아주대 피부과로부터 분양)를 10% fetal brovine serum (FBS)과 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 37℃, 5%, CO2 조건으로 배양하고 계대 후 4-15세대 세포를 실험에 사용하였다. 세포를 96 well plate에 1 X 104 개/well 씩 분주하여 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 24시간 동안 배양한 후, 100% DMSO에 녹인 시료를 FBS가 포함되지 않은 새로운 DMEM에 1, 10, 50ug/mL 농도 별로 첨가하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 배지 중에 유리된 콜라겐의 양은 배양액을 procollagen Type I C peptide ELA kit (Takara bio, Japan)를 이용하여 측정하였다. 표준검량선은 콜라겐 측정키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450 nm에서 ELISA plate Reader로 흡광도를 측정하여 작성하고, 이를 이용하여 콜라겐 생성량을 산정하였다.
그 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군의 콜라겐 생합성량을 100%로 보았을 때 실시예 1 내지 3은 대조군에 비해 50ug/mL 농도에서 콜라겐 생합성량이 각각 17%, 20%, 24% 증가하는 것으로 확인되었다. 이는 양성대조군인 TGF-β를 10ng/mL 농도를 처리했을 때와 비슷한 수준의 활성으로, 실시예 1 내지 3의 조성물은 50ng/mL 농도 수준에서 콜라겐 생합성을 촉진하는 주름개선 활성이 있는 것을 알 수 있다(도 2).
실험예 4. 항염 활성 분석
상기 실시예 1 내지 3의 항염 활성은 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포의 염증인자인 NO, COX-2에 대한 저해 활성을 측정하였다.
4-1. NO 생성 저해 측정
마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포를 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였고, 12 well plate에 5 × 104 개/well씩 분주한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 FBS가 포함되지 않은 새로운 DMEM로 바꾸어주고, 100% DMSO에 녹인 시료를 1, 10, 100 μg/mL 농도별로 전처리하여 1시간 동안 전배양시켰다. 전배양 후 lipopolysaccharide (LPS)를 20ng/mL의 농도로 처리하고, 14시간 동안 배양 후 배양상등액을 회수하여 NO 생성량을 측정하였다. NO 생성량은 아질산 및 아질산이온의 검출·정량에 사용되는 시약인 Griess (1% sulfanilamide, 0.1% NED [N-(1-naphthyl)-ethylenediamide dihydrochloride], 8.5% phosphoric acid)를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포배양 상등액과 Griess 시약을 1:1 비율로 반응한 후 540 nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 NO 생성정도를 산출하였다.
시료 NO production (%)
LPS(-) Con. 16.66
LPS(+) + 100.00
비교예 1 100ug/mL 101.05
비교예 2 85.28
실시예 1 73.21
실시예 2 69.02
실시예 3 62.66
그 결과 LPS에 의해 NO 생성이 활성화된 RAW 264.7 세포에 복숭아 줄기세포배양물만 처리한 비교예 1에서는 LPS만 처리하였을 때와 큰 차이를 나타내지 않았으나, 실시예 1 내지 3에서 뚜렷하게 감소하는 경향이 나타났다. 특히 병풀 추출물 및 서양민들레 잎 발효 추출물을 첨가할 때 감소 효과가 큰 바, NO 생성에 대한 저해 활성이 우수함을 입증하였다.
4-2. Cyclooxgenase-2 (COX-2) 저해 측정
마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포를 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였고, 12 well plate에 5 × 104 개/well 씩 분주한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 transfection reagent을 이용하여 COX-2 reporter vector를 transfection 시켰다. 24시간 배양 후 FBS가 포함되지 않은 새로운 DMEM로 바꾸어준 후, 100% DMSO에 녹인 시료를 1, 10, 100 ug/mL 농도별로 전처리하여 1시간 동안 전배양시켰다. 전배양 후 LPS를 200 ng/mL의 농도로 각각의 시험군에 처리하여 14시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 수확하여 얻어진 팔레트(pellet)을 50~100 uL의 reporter lysis buffer을 이용하여 얼음 안에서 1시간 용해하였다. 1시간 후 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻어진 상층액을 luciferase substrate solution과 1 : 1 (v/v)로 첨가한 다음 luminometer를 이용하여 405nm 에서 흡광도를 측정하였다.
시료 LPS(200ng/mL) NO production (%)
0 1 10 100
대조군 - 1
비교예 1 100ug/mL 5.5 5.1 4.7 4.2
비교예 2 5.5 5.2 4.9 4.5
실시예 1 5.5 5 4 2.9
실시예 2 5.5 5 4.3 3.3
실시예 3 5.5 5 3.7 2.6
그 결과, LPS에 의해 COX-2발현은 실시예 및 비교예의 처리농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 100 ug/mL의 농도에서는 COX-2 발현양이 50% 이상 감소하는 것으로 나타나 높은 저해활성이 있는 것으로 나타났다.
제형예 1. 유연화장수
상기 실시예 1을 함유하는 유연화장수 제형을 하기 표 5에 나타낸 조성으로 통상의 제조방법에 따라 제조하였다.
성분 함량(중량%)
베타인 3.0
낫토검 3.0
셀룰로오스검 0.005
에탄올 10.0
폴리옥시에틸렌경화피마자유 0.2
초산토코페롤 2.0
실시예 1 5.0
방부제 미량
색소 미량
미량
정제수 잔량
제형예 2. 영양화장수
상기 실시예 1을 함유하는 영양화장수 제형을 하기 표 6에 나타낸 조성으로 통상의 제조방법에 따라 제조하였다.
성분 함량(중량%)
세틸에틸렌헥사노에이트 4.0
세토스테아릴알콜 1.0
친유형모노스테아릴산스테아레이트 1.0
스쿠알란 0.5
실시예 1 5.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
글리세린 5.0
트리에탄올아민 0.5
카르복시비닐폴리머 0.2
방부제 미량
색소 미량
미량
정제수 잔량
제형예 3. 크림
상기 실시예 1을 함유하는 크림 제형을 하기 표 7에 나타낸 조성으로 통상의 제조방법에 따라 제조하였다.
성분 함량(중량%)
글리세릴스테아레이트 3.0
폴리솔베이트 60 1.0
세토스테아레이트 2.5
밀납 1.0
스쿠알란 2.0
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
세틸에틸헥사노에이트 0.5
유동파라핀 5.0
유효성분혼합물 5.0
글리세린 3.0
프로필렌글리콜 3.0
실시예 1 5.0
방부제 미량
색소 미량
미량
정제수 잔량
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단 일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 줄기세포 배양 혼합물 및 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 있어서,
    상기 줄기세포 배양 혼합물은 인체유래 줄기세포배양물 및 식물 줄기세포배양물을 포함하며,
    상기 식물 줄기세포배양물은 복숭아 줄기세포배양물이 리포좀으로 포접된 것이고,
    상기 화장료 조성물 100중량부를 기준으로, 상기 줄기세포 배양 혼합물 0.001 내지 1.0 중량부, 히알루론산 0.01~1 중량부, 펩타이드 0.0001 내지 1 중량부, 나이아신아마이드 2.0~5.0 중량부, 글리세린 0.5~2 중량부 및 아데노신 0.01~0.1 중량부, 병풀 추출물 0.1~3 중량부 및 서양민들레 잎 발효 추출물 0.1~3 중량부를 포함하는 것인,
    피부개선용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서
    상기 화장료 조성물은 항산화, 피부 주름개선 또는 피부 항염 용도인 것인, 피부개선용 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 리퀴드, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 바디워시, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 폼 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이 중 어느 하나의 제형인, 피부개선용 화장료 조성물.
KR1020230085078A 2023-06-30 2023-06-30 줄기세포 배양 혼합물을 포함하는 피부개선용 화장료조성물 KR102604529B1 (ko)

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KR1020230085078A KR102604529B1 (ko) 2023-06-30 2023-06-30 줄기세포 배양 혼합물을 포함하는 피부개선용 화장료조성물

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Citations (6)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120058865A (ko) * 2010-11-30 2012-06-08 (주)아모레퍼시픽 사과줄기세포 추출물을 함유하는 지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진용 조성물
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KR102539209B1 (ko) 2022-11-22 2023-06-02 (주)엔비바이오컴퍼니 알바수련꽃 추출물, 레몬머틀잎 추출물 및 사과 추출물을 포함하는 미백, 항산화, 항염, 피부 자극완화 및 보습용 화장료 조성물

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