KR20170117215A - 세포 이식 방법 및 장치 - Google Patents

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크레이그 하실로
저스틴 리우시너
다니엘 니콜라스 하워드
시몬 쇼헤트
필립 마이클 톨레이키스
델피나 마리아 마주카 시로엔
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세르노바 코포레이션
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Abstract

숙주체 내로 세포를 이식하는 장치 및 방법에 대해서 설명한다. 세포는 혈관 및 연결 조직을 성장시킬 수 있는 다공성 스캐폴드, 다공성 스캐폴드 내에 배치하도록 구성된 플러그 또는 플러그 시스템 및 다공성 스캐폴드의 근위 개구부를 닫도록 구성된 밀폐부를 포함한다. 장치는 다공성 스캐폴드 내부로 세포를 전달하기 위한 세포 전달 장치를 더 포함할 수 있다. 세포 이식 방법은 두 단계 공정을 포함한다을 포함한다. 장치는 숙주체 내에서 인큐베이션되어, 다공성 스캐폴드 내에 위치된 플러그 주위로 혈관이 발달된 콜라겐 기질이 형성된다. 그 후, 플러그는 다공성 스캐폴드로부터 철회시키고, 세포는 다공성 스캐폴드 내에 만들어진 혈관이 발달된 공간 속으로 전달된다.

Description

세포 이식 방법 및 장치 {METHODS AND DEVICES FOR CELLULAR TRANSPLANTATION}
본 출원은 2009년 8월 28일에 출원된 미국 가출원 NO. 61/238,011의 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 여기에 참조로써 포함되었다.
본 발명은 세포 치료 분야와, 더 구체적으로는, 숙주체에 세포 이식하기 위한 방법 및 장치와 관련된다.
최근 세포 치료에 관한 분야의 발명은 중대하고 충족되지 않은 의료상 요구가 있는 질병 영역에 세포 이식의 이용에 관한 새로운 가능성을 보여준다. 현재, 생리적인 기능의 조절을 위하여 필요한 생체분자를 생산하는 세포의 손실 또는 손상에 의해 발생하는 당뇨병 또는 파킨슨 병과 같은 많은 후천성 및 선천성 질병 상태에 대해 충분히 효과적인 약물 치료법이 없다. 세포 치료는 손상된 생리적인 기능을 개선하도록 손실 또는 손상된 세포를 공여 세포 또는 줄기 세포로 대체하는 가능성을 가진다. 예를 들어, 랑게르한스섬의 이식은 인슐린 의존성 당뇨병 환자의 탄수화물 조절기능 복원의 수단을 제공할 것이다. 유사하게, 도파민성 뉴런 또는 신경 줄기 세포의 이식은 파킨슨병의 세포-기반 치료의 가능성으로 알려졌다.
세포 치료의 적용에 있어 주요한 제한 요소는 숙주 조직으로 세포를 이식하여 면역 반응의 야기 또는 숙주에 다른 유해한 부작용의 발생 없이 이식된 세포가 계속하여 기능을 하도록 보장하는 데 있어서의 어려움이다. 치료용 세포를, 예를 들면 혈관계 내로 또는 기관이나 조직의 이식에 의해 직접 숙주체 내로 투여하는 시도가 행해졌다. 그러나, 직접적인 세포 이식에서, 환자는 평생 면역억제 치료를 해야 하고, 면역억제 약물은 숙주와 이식된 세포에 독성을 야기할 수 있다. 또한, 세포의 혈액에의 직접적인 노출은 응고 연속 단계를 개시하는 즉각적인 혈액-매개 염증 반응(IBMIR)을 야기할 수 있고, 이식된 세포의 상당 부분을 파괴할 수 있다. 또한, 세포는 미세혈관에 박혀져 혈관의 폐색 및 혈전증을 초래할 수 있고, 이는 이식된 세포의 기능 상실과 일부 조직의 손상을 야기할 수 있다.
또다른 치료적 접근은 숙주 내에 거주하는 세포를 위한 생물학적으로 적합한 환경을 제공하는 장치를 이용한 세포 전달이다. 이 접근의 주요한 도전과제는 세포에게 영양분을 공급하고, 세포의 장기 생존을 위한 장치 내에서의 최적의 환경을 유지하기 위한 장치 속으로의 혈관의 접합성이 나쁘다는 것이다. 즉각적인 혈관을 발달시키는 환경이 없는 경우, 이식된 세포는 충분한 산소를 얻지 못하거나 쉽게 노폐물을 배출할 수 없고, 국소 빈혈 또는 저산소증 효과에 의해 급속히 죽거나 손상될 수 있다. 또한, 일부 혈관이 초기에 자라는 상황이더라도, 혈관은 지속될 수 없을 것이다. 또한, 신체의 정상적인 염증 반응은 또한 세포의 사망 또는 손상을 야기할 수 있다. 이 접근이 마주치는 다른 어려움들 중 일부는 과도한 상처 및/또는 장치 벽의 파괴, 생물학적 환경과 장치 물질의 불화합성, 장치 및 이식 환경의 이미지화의 어려움, 세포의 생물학적 기능에 영향을 미치는 장치의 부적절한 크기, 지속되는 치료 효과를 위한 적절한 수의 세포의 적재의 불가능 및 교체 필요시 장치 제거의 어려움을 포함한다. 또한, 장치 구조는 신체 외부 윤곽에 맞추어지지 않을 수 있고, 이는 심미적 관점에서, 환자에게 장치가 받아들여지지 못하게 만드는 장치의 비정상적인 돌출을 야기할 수 있다.
그러므로, 여전히 치료용 세포의 성공적인 이식을 위한 효과적인 기술을 찾을 필요는 남아있다. 본 발명은 기존의 장치-기반의 세포 치료 방법에 관련된 많은 문제를 완화하면서, 장기간 동안 생체 내에서 세포의 전달 및 유지를 위한 장치 및 방법을 제공한다.
본 발명의 일 관점에서, 숙주체에 세포를 이식하는 장치가 제공된다. 장치는 근위 단부와 원위 단부를 가지는 적어도 하나의 챔버를 포함하는 다공성 스캐폴드와 적어도 하나의 챔버 내에 위치되도록 구성된 적어도 하나의 제거가능한 플러그를 포함한다. 다공성 스캐폴드는 적어도 하나의 챔버 내로 혈관 및 연결 조직의 성장을 용이하게 하는 크기의 구멍을 가지는 메쉬를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 폴리프로필렌 메쉬를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시 양태는 숙주체로 세포를 이식하는 장치로, 여기서 장치는 근위 단부와 원위 단부를 가지는 하나 이상의 챔버를 포함하는 다공성 스캐폴드와 근위 단부와 원위 단부 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 포함한다. 다공성 스캐폴드는 하나 이상의 챔버내로 혈관 및 연결 조직의 성장을 용이하게 하는 크기의 구멍을 포함한다. 장치는 또한 하나 이상의 챔버 내에 위치되도록 구성된 외부 플러그 및 외부 플러그 내에 위치되도록 구성된 내부 플러그를 포함하는 하나 이상의 이-플러그 시스템을 포함한다. 또한, 장치는 챔버 내에서 플러그 시스템을 밀폐하고 챔버의 근위 단부와 원위 단부 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 밀폐하도록 구성된 적어도 하나의 밀폐부를 포함한다.
본 발명의 또다른 관점에서, 숙주체로 세포를 이식하는 방법을 제공한다. 그 방법은 숙주체에서 세포를 유지하기 위한 장치 이식 단계를 포함하는데, 여기서 장치는 근위 단부와 원위 단부를 가지는 하나 이상의 챔버를 포함하는 다공성 스캐폴드를 포함한다. 다공성 스캐폴드는 적어도 하나의 챔버 내에 혈관과 연결 조직의 성장이 용이하도록 하는 크기의 구멍을 가진 메쉬를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 폴리프로필렌 메쉬를 포함한다. 장치는 적어도 하나의 챔버 내에 위치되도록 구성된 적어도 하나의 플러그를 더 포함하고, 적어도 하나의 챔버는 근위 단부와 원위 단부 한쪽 또는 양쪽에 개구부를 포함한다. 방법은 장치 이식 후에 챔버의 근위 단부와 원위 단부의 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 밀폐하는 단계를 포함한다. 방법은 추가로 다공성 스캐폴드가 혈관 및 연결 조직에 침투할 때까지, 숙주체에 장치를 유지시키는 단계와 수술용 절개를 통해 장치에 접근하는 단계, 챔버의 근위 단부 및 원위 단부의 한쪽 또는 양쪽을 다시 여는 단계, 혈관이 발달된 콜라겐 기질로 캡슐화된 다공성 스캐폴드 내에 공간을 만들기 위하여 챔버로부터 플러그를 추출하는 단계, 혈관이 발달한 공간으로 세포 제제를 전달하는 단계 및 챔버의 근위 단부 및 원위 단부의 한쪽 또는 양쪽 개구부를 다시 밀폐하는 단계를 포함한다.
또다른 대체적 실시 양태에서, 숙주체에 세포를 이식하는 방법은 숙주체 내에서의 세포의 유지를 위하여 이식가능한 장치를 제공하는데, 여기서 이식가능한 장치는 다공성 스캐폴드 내로 혈관 및 연결 조직의 성장을 용이하게 하는 크기의 구멍을 가지는 다공성 스캐폴드와 다공성 스캐폴드 내에 위치되도록 구성된 적어도 하나의 이-플러그 시스템를 포함한다. 이식가능한 장치의 다공성 스캐폴드는 챔버의 근위 단부 및 원위 단부 한쪽 또는 양쪽에 개구부를 가지는 적어도 하나의 챔버를 포함한다. 장치는 적어도 하나의 챔버의 근위 또는 원위 단부의 한쪽 또는 양쪽 개구부를 밀폐할 수 있는 밀폐부를 포함한다. 이식가능한 장치의 적어도 하나의 플러그 시스템은 적어도 하나의 챔버 내에 위치되도록 구성된 외부 플러그와 외부 플러그 내에 위치되도록 구성된 내부 플러그를 포함한다. 방법은 숙주체 내에 장치를 이식하는 단계, 장치에 혈관 및 연결 조직이 침투할 때까지 숙주체 내에서 장치를 유지시키는 단계 및 세포 제제가 적재된 적어도 하나의 세포 주입 튜브를 포함하는 세포 전달 장치의 제공 단계를 포함하는데, 여기서 세포 주입 튜브는 적어도 하나의 플러그 시스템의 외부 플러그 내에 위치되도록 구성되어 있다. 또한, 방법은 수술적 절개를 통하여 이식된 장치로 접근하는 단계 및 장치의 근위 단부 및 원위 단부 한쪽 또는 양쪽의 밀폐부를 여는 단계, 플러그 시스템으로부터 내부 플러그를 철수시키는 단계, 외부 플러그 내로 세포 주입 튜브를 삽입하는 단계, 적어도 하나의 챔버로부터 외부 플러그를 철수시키고 동시에 세포 제제를 챔버에 주입하는 단계 및 밀폐부를 다시 닫는 단계를 포함한다. 앞의 대략적인 설명과 다음의 상세한 설명은 예시적이고, 단지 설명하기 위한 것이며, 청구된 바와 같이, 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
본 발명의 또다른 관점은 하나 이상의 챔버, 바람직하게는 2 내지 12개의 챔버를 포함하는 다공성 스캐폴드 내로 혈관 및 연결 조직의 성장을 용이하게 하는 구멍 크기를 가지는 다공성 스캐폴드를 포함하는 세포 이식 장치를 제공하는데, 여기서 다공성 스캐폴드는 스캐폴드의 구멍을 일시적으로 채우도록 설계된 생체적합성, 생분해성 물질로 코팅되어있다. 일부 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 폴리프로필렌 메쉬를 포함한다. 적합한 생체적합성, 생분해성 물질은 예를 들어, 콜라겐, 피브로넥틴, 세포외 기질 단백질 및 막 세포골격 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상, 바람직하게는 2 내지 12개의 챔버를 포함하는 다공성 스캐폴드 내로 혈관 및 연결 조직의 성장을 용이하게 하는 구멍 크기를 가지는 다공성 스캐폴드를 포함하는 이식 장치의 이식 단계를 포함하는 숙주체로 세포 이식하는 방법을 제공하는데, 여기서 다공성 스캐폴드는 스캐폴드의 구멍을 일시적으로 채우는 생체적합성, 생분해성 물질로 코팅되고, 또 여기서 적어도 하나의 챔버는 이식하기 위한 세포로 채워지고, 챔버는 밀폐된다.
설명과 함께 본 설명의 일부로 포함되고, 구성되는 첨부한 도면은 본 발명의 방법 및 실시 양태를 나타낸다.
도 1a 내지 1e는 본 발명에 따른 단일-챔버 세포 이식 장치의 여러 실시 양태를 나타낸다;
도 1f는 본 발명에 따른 다수-챔버 세포 이식 장치의 실시 양태를 나타낸다;
도 2a 내지 2d는 본 발명에 따른 세포 이식 장치를 형성하는 데 사용할 수 있는 여러 가지 메쉬의 구성을 나타낸다;
도 3a는 본 발명의 실시 양태에 따른 세포 이식 장치를 나타낸다;
도 3b는 도 1a의 세포 이식 장치의 구성 요소를 나타낸다;
도 4는 본 발명의 실시 양태에 따른 세포 이식 장치의 다공성 스캐폴드를 나타낸다;
도 5a는 본 발명의 실시 양태에 따른 세포 이식 장치의 밀폐부를 나타낸다;
도 5b는 도 3a에 표시된 밀폐부의 단면도이다;
도 6a는 본 발명의 실시 양태에 따른 세포 이식 장치의 두 부분 플러그 시스템의 다수개의 외부 플러그를 나타낸다;
도 6b는 도 5a에 표시된 외부 플러그의 단면도이다;
도 6c는 숙주체에 이식되기 전의 플러그 시스템 및 단일 다공성 스캐폴드 조립체의 단면도이다;
도 6d는 숙주체 내 인큐베이션 후의 도 4c에 예시된 조립체의 단면도이다;
도 6e는 플러그 시스템의 제거 후에 숙주체 내에 이식된 다공성 스캐폴드의 단면도이다;
도 7은 본 발명의 실시 양태에 따른 세포 이식 장치의 두 부분 플러그 시스템의 다수개의 내부 플러그를 나타낸다;
도 8은 본 발명의 실시 양태에 따른 세포 이식 장치의 혈관이 발달된 챔버 내에 세포를 밀폐하기 위한 밀폐부를 나타낸다;
도 9a는 본 발명의 실시 양태에 따른 세포 이식 장치에 세포를 전달하기 위한 장치를 나타낸다;
도 9b는 도 8a에 표시된 전달 장치의 세포 주입 기구를 나타낸다;
도 9c는 도 8a 내지 8b에 나타낸 전달 장치의 세포 주입 기구의 추가적인 단계를 나타낸다;
도 10는 본 발명에 따른 세포 이식 방법의 단계를 보여주는 흐름도이다;
도 11a 내지 11d는 본 발명에 따른 세포 주입 공정의 일부 단계의 도식적인 개관을 나타낸다;
도 12a는 실시예 1에서 서술한 바와 같이, 복강 내 이식 후 세포 이식 장치의 혈당 측정에 관한 선형 그래프를 나타낸다;
도 12b는 실시예 1에서 서술한 바와 같이, 피하 이식 후 세포 이식 장치의 혈당 측정에 관한 선형 그래프를 나타낸다;
도 12c는 실시예 1에서 서술한 바와 같이, 췌도 세포를 이식한 루이스 쥐의 이식 후 40일차, 이식 후 80일차, 장치 제거후(이식 후 110일차) IVGTT 반응도의 선형 그래프를 나타낸다;
도 12d는 실시예 1에서 서술한 바와 같이, 췌도 세포가 이식된 루이스 쥐의 포도당 투여에 대응한 인슐린 수준의 선형 그래프를 나타낸다;
도 13a는 실시예 2에서 서술한 바와 같이, 이식된 장치의 챔버 내에 있는 인슐린의 조직 염색을 나타낸다;
도 13b는 실시예 2에서 서술한 바와 같이, 이식된 장치의 챔버 내의 혈관 신생(미소혈관계)의 조직 염색을 나타낸다;
도 14는 실시예 3에서 서술한 바와 같이, 본 발명의 실시 양태에 따른 네 그룹의 세포 이식 장치에서 계산된 평균적인 콜라겐 두께 및 총 혈관/cm2 표이다;
도 15a는 실시예 3에서 서술한 바와 같이, 이식 후 2, 4, 8 주차에 세포 이식 장치로 조직의 침투를 나타낸다;
도 15b는 실시예 3에서 서술한 바와 같이, 세포 이식 전에 이식된 장치의 여러 공간에서의 혈관 형성을 나타낸다;
도 16은 실시예 4에서 서술한 바와 같이, 성숙한 췌도와 미성숙한 췌도에 의해 생산된 인슐린 수준의 막대 그래프를 나타낸다;
도 17a는 실시예 4에 서술한 바와 같이, 이식된 장치의 챔버 내에 있는 인슐린과 미세혈관의 조직 염색을 나타낸다;
도 17b는 실시예 4에서 서술한 바와 같이, 세포 이식 후에 이식된 장치의 챔버 내에 있는 미세혈관의 조직 염색을 나타낸다;
도 18은 실시예 4에서 서술한 바와 같이, 췌도 자가 이식 후 혈당 수준의 선 그래프를 나타낸다;
도 19a는 실시예 4에서 서술한 바와 같이, 췌도 세포가 이식된 요크셔-랜드레이스 돼지의 포도당 투여에 대응한 혈당 수준의 절대값의 선 그래프를 나타낸다;
도 19b는 실시예 4에서 서술한 바와 같이, 췌도 세포가 이식된 요크셔-랜드레이스 돼지에서 포도당 투여에 대응한 혈당 수준에 대한 곡선 아래 면적(AUC)의 막대 그래프를 나타낸다;
도 19c는 실시예 4에서 서술한 바와 같이, 췌도 세포를 이식한 요크셔-랜드레이스 돼지의 포도당 투여에 대응한 C-펩타이드 수준의 배수의 선 그래프를 나타낸다.
이제, 본 발명의 실시 양태를 상세하게 살펴볼 것이며, 그의 예가 첨부된 도면에 도시된다. 가능한 경우, 같거나 유사한 부분을 언급하기 위하여 도면 전체에서 같은 도면 부호를 사용할 것이다. 본 발명 전체에서, 세포 주입과 세포 이식 용어는 상호교환적으로 사용된다.
생체 내(in vivo)에 치료용 세포를 포함하는 세포 이식 장치를 제공한다. 하나의 예시적인 실시 양태에서, 세포 이식 장치는 스캐폴드의 근위 단부과 원위 단부의 한쪽 또는 양쪽에 개구부를 가지고 챔버를 그 안에 포함하는 적어도 하나의 다공성 스캐폴드 및 챔버 내에 수용되도록 구성된 적어도 하나의 플러그를 포함한다. 챔버의 한쪽 또는 양쪽 개구부는 챔버로부터 플러그의 삽입 및 철회 가능하도록 크기를 조절한다. 하나의 실시 양태에서, 적어도 하나의 다공성 스캐폴드는 형태가 튜브형이고, 적어도 하나의 플러그는 실린더형이고 적어도 하나의 다공성 스캐폴드의 내경을 따라 펼쳐져 있다. 일부 실시 양태에서는, 다공성 스캐폴드가 근위 단부에만 열려있다. 그러한 하나의 실시 양태에서, 튜브형 다공성 스캐폴드의 원위 단부은 둥글거나 바닥이 평평한 표면을 포함한다. 또다른 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드의 원위 단부의 연부는 점점 가늘어지고, 원위 단부를 붙이기 위해 서로 접촉하게 된다.
또 다른 예시적인 실시 양태에서, 세포 이식 장치는 근위 단부와 원위 단부를 가지는 하나 이상의 챔버를 포함하는 다공성 스캐폴드를 포함한다. 하나 이상의 챔버는 근위 단부에 개구부를 포함한다. 그 장치는 또한 하나 이상의 챔버 내에 위치되도록 구성된 외부 플러그 및 외부 플러그 내에 위치하도록 구성된 내부 플러그를 포함하는 하나 이상의 플러그 시스템을 포함한다. 게다가, 장치는 챔버 내의 플러그 시스템을 닫고, 챔버의 근위 단부의 개구부를 밀폐하도록 구성된 적어도 하나의 밀폐 부분을 포함한다.
다공성 스캐폴드는 체내에서 단지 가벼운 염증성 반응을 일으키도록 하는 신체적합성 물질로 형성된다. 가벼운 염증성 요소는 혈관 신생을 자극하고, 장치 내의 혈관 콜라겐 기질의 결합을 촉진하지만, 장치 주위에 상당한 염증을 야기하지는 않는다. 이러한 생체적합성 물질의 예는 폴리프로필렌이 있다. 예시적인 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 장치 제조가 가능하도록 충분한 강도를 가진 직조된 폴리프로필렌 메쉬를 포함한다. 또한 그 폴리프로필렌 메쉬는 미세혈관이 장치에 들어갈 수 있고, 견고하고 건강한 혈관을 유지할 수 있도록 선택되는데, 이는 장치 내에 주입된 치료용 세포의 생존 및 정상적인 기능을 위해 중요하다.
장치 내로 혈관이 발달한 조직의 규제 성장을 조장하여, 다공성 스캐폴드는 흉터 조직으로의 캡슐화를 방지한다. 내향성 조직은 또한 그 이식물을 안정화시키고, 원 위치로(in situ) 장치의 의도하지 않은 이동을 방지한다. 게다가, 일부 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 조직 결합과 혈관 신생을 촉진하기 위한 생물학적 또는 비생물학적 제제, 예를 들어, 성장 인자로 코팅된다. 장치는 고분자 약물 제제 또는 장치를 코팅하는 데 적용되는 다른 공지의 기술로 딥-코팅될 수 있다. 조직 결합과 혈관 신생을 촉진하는 생물학적 또는 비생물학적 제제의 예는 VEGF(혈관 내피 성장 인자), PDGF(혈소판 유래 성장 인자), FGF-1(섬유아세포 성장 인자), NRP-1(뉴로플린-1), Ang-1, Ang2 (안지오포이에틴 1,2), TGF-β, 엔도글린, MCP-1, ανβ3, ανβ5, CD-31, VE-카데린, 에프린, 플라스미노겐 활성제, 안지오게닌, Del-1, aFGF(산성 섬유아세포 성장 인자), vFGF(염기성 섬유아세포 성장 인자), 폴리스타틴, G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자), HGF(간세포 성장 인자), Il-8(인터루킨-8), 렙틴, 미드카인, 태반 성장 인자, PD-ECGF(혈소판 유래 내피 성장 인자), PTN(플레이오트로핀), 프로그래뉼린, 프로리퍼린, TGF-α 및 TNF-α를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드의 외부 표면은 조직 진입을 활성화하도록 거칠게 만든다. 어떤 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 다양한 약물-방출 고분자 코팅을 포함한다. 어떤 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 약물을 사용하지 않고, 생분해성 또는 비생분해성 고분자로 코팅될 수 있다. 그 스캐폴드는 부분적 또는 전체적으로 고분자로 코팅될 수 있다. 코팅 및/또는 약물 방출을 위해 사용할 수 있는 대표적인 고분자는 메타크릴레이트 고분자, 폴리에틸렌-이민과 덱스트란 술페이트, 폴리(비닐실록산)에코폴리미어폴리에틸렌이민 및 포스포릴콜린, 폴리(에틸메타크릴레이트), 폴리우레탄, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락트-글리콜산), 히드록시아페타이트, 폴리(락트산), 폴리히드록시발레레이트와 공중합체, 폴리히드록시부티레이트와 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리디악사논, 폴리안하이드라이드, 폴리시아노크릴레이트, 폴리(아미노산), 폴리(오소에스테르), 폴리에스테르, 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로오스 고분자, 키토산 및 알기네이트 또는 그들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 스캐폴드를 코팅하기 위해 사용될 수 있는 추가의 예는 콜라겐, 피브로넥틴, 세포외 기질 단백질, 빈쿨린, 한천 및 아가로스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 고분자 혼합물을 사용할 수 있음을 이해하여야 한다.
약물 방출에 대하여, 일부 실례가 되는 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 감염을 최소화하기 위하여 항생제 코팅을 포함한다. 대표적인 항생제는 암피실린, 테트라시클린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 반코마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 클린다마이신, 트리메토프림-술파메톡사졸, 리네졸리드, 테이코플라닌, 에리트로마이신, 시프로플록삭신, 리팜핀, 페니실린, 아목시실린, 술폰아미드, 날리딕스산, 노플로삭신, 시프로플록사신, 오플록사신, 스파플록사신, 로메플록사신, 플레록사신, 페플록사신, 아미플록사신, 5-플루오로우라실, 클로람페니콜, 폴리믹신, 미토미신, 클로로퀸, 노보바이오신, 니트로이마다졸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 살균제를 포함한다. 대표적인 살균제는 벤잘코늄 클로라이드, 클로로헥시딘 글루코네이트, 소르브산과 그의 염, 티메로살, 클로로부탄올, 페네틸 알코올 및 p-히드록시벤조에이트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 다른 실시 양태에서, 세포 이식 장치의 부분은 섬유질 조직 캡슐화를 억제하기 위하여 항섬유성 약물로 코팅된다. 대표적인 항섬유화제는 파클리탁셀, 에베롤리무스, 타크롤리무스, 라파미신, 할로푸기논 히드로브로마이드, 콤브레타스타틴과 그의 유사체와 유도체(예를 들어, 콤브레타스타틴 A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, B-1, B-2, B-3, B-4, D-1, D-2 및 콤브레타스타틴 A-4 포스페이트(옥시진)), 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈크리스틴 술페이트, 빈데신 및 비노렐빈, 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 에토포시드 또는 테니포시드 안트라미신, 미톡산트론, 메노가릴, 노갈라미신, 아클라시노미신 A, 올리보미신 A, 크로모미신 A3 및 플리카미신, 메토트렉세이트, 에다트렉세이트, 트리메트렉세이트, 랄티트렉세드, 피리트렉심, 데놉테린, 토뮤덱스, 프테로프테린, 및 그들의 유도체와 유사체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시 양태에서, 세포 이식 장치는 폴리메틸 메타크릴레이트 또는 골 시멘트 또는 시아노아크릴레이트의 다른 형태 역시 포함할 수도 있다.
일부 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 예를 들어, MRI, fMRI, CT 스캔, X-선, 초음파, PET 스캔 등을 사용하여 이식 장치를 이미지화하는 물질로 형성된다. 그러한 일 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 면역학적으로 적합하고, 혈관신생 조직의 이미지화가 가능한 고분자 메쉬(예를 들어, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리우레탄, 폴리에스테르, 실크 메쉬 등)를 포함한다. 또다른 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 물질들의 조합을 포함한다. 그러한 일 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 교직된 폴리프로필렌 및 실크 스트랜드를 포함한다.
스캐폴드 물질의 구멍 크기는 다공성 스캐폴드의 챔버내에서 조직 결합 및 혈관 신생이 용이하게 하도록 선택된다. 일부 실시 양태에서, 구멍 크기는 약 50 nm 내지 약 5 nm의 범위일 수 있다. 예시적인 일 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드는 구멍의 직경이 0.53 nm인 직조된 폴리프로필렌 메쉬를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 구멍 크기는 면역 세포 또는 면역제가 이식된 장치를 침투하는 것을 차단하도록 선택된다. 일부 다른 실시 양태에서, 구멍 크기는 면역세포 또는 면역제가 장치를 침투하는 것을 차단하는 것이 반드시 필요하지는 않다. 이것은 예를 들어, 장치가 공동-이식 세포에 면역 보호를 제공할 수 있는 면역 방지 세포(예를 들어, 세르토리 세포, 간엽 줄기 세포 등)를 포함하는 세포의 조합을 이식하는 데 사용된 경우일 것이다. 이것은 또한, 예를 들어 동계 세포 또는 이식을 받은 환자로부터 유래된 세포를 이식하는 데 사용된 경우일 것이다.
세포 이식 장치의 플러그 또는 플러그 시스템은 다공성 스캐폴드 내의 챔버에 꼭 맞게 구성된다. 플러그 또는 플러그 시스템은 생물학적 조직이 플러그나 플러그 시스템 안으로 성장하는 것을 억제하는 비다공성 물질(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌 등)을 포함할 수 있다. 플러그 또는 플러그 시스템은 중공 또는 충실 구조일 수 있다. 그러나, 중공 플러그를 사용한다면, 장치가 숙주 조직 내로 이식된 경우, 콜라겐 또는 다른 생물학적 물질의 플러그 내강으로의 침투를 막기 위해 주의를 해야만 한다. 플러그 시스템은 아래에서 더 자세하게 논의한다.
일부 실시 양태에서, 플러그 또는 플러그 시스템의 근위 단부는 밀폐부와 연결되어 있다. 이러한 실시 양태에서, 그 밀폐부는 플러그 또는 플러그 시스템이 다공성 스캐폴드의 챔버내로 완전히 삽입되었을 때 챔버의 근위 개구부를 닫도록 구성되어 있다. 그 밀폐부는 다공성 스캐폴드 내의 제자리에 플러그 또는 플러그 시스템을 고정하도록 조직되어 있다. 다른 실시 양태에서, 밀폐부는 플러그 또는 플러그 시스템으로부터 떨어져 있다. 또다른 실시 양태에서, 밀폐부는 다공성 스캐폴드에 연결되어 있다. 또한 일부 예시적인 실시 양태에서, 챔버의 근위 단부는 별개의 밀폐부를 사용하지 않고, 수술용 봉합사 및/또는 혈관 클립을 이용하여 밀폐한다.
숙주체에 이식한 때, 장치의 다공성 스캐폴드는 혈관과 연결 조직의 성장을 촉진하기 때문에, 스캐폴드 내에 수용된 플러그 또는 플러그 시스템은 혈관이 형성된 조직의 기질 내에 캡슐화된다. 다공성 스캐폴드로부터 플러그 또는 플러그 시스템을 제거할 때, 숙주체 내에서 세포 제제를 수용하는데 사용할 수 있는 혈관 신생화 챔버는 장치 내에 만들어진다.
다공성 스캐폴드 및 플러그 또는 플러그 시스템의 크기는 생체 내에서(in vivo) 세포의 유지 및 혈관 신생 챔버 내에서 세포의 장기 생존을 보장하기 위한 최적의 표면적 대 부피의 비를 제공하도록 선택된다. 유사하게, 이식 장치 내의 챔버의 수는 이식될 세포의 부피 및/또는 수를 기반으로 결정된다. 일부 실시 양태에서, 각 개별적인 챔버의 최적의 표면적 대 부피의 비를 유지하면서 챔버 수의 증가 또는 감소로 세포 이식 장치의 총 부피가 조절된다. 다른 실시 양태에서, 챔버의 길이를 조절하여, 총 부피를 변화시킨다. 그렇지 않으면, 여러 실시 양태에서, 세포 이식 장치는 고정된 수의 챔버를 포함하지만, 장치의 전체 부피 필요요건에 따라 선택된 수의 챔버들만이 세포의 주입을 받는다. 일부 실시 양태에서, 챔버의 길이는 물론 챔버의 수를 조절하여 필요로 하는 총 부피를 변화시킨다.
개시된 세포 이식 장치는 복강 또는 다른 적합한 위치를 포함하는 숙주체의 피하 또는 복강 내 중 어느 하나로 이식될 수 있다. 그렇지 않으면, 개시된 세포 이식 장치는 복강 또는 다른 적합한 위치 내를 포함하는 숙주체의 복강 내에 부분적으로 이식될 수 있고, 피하 환경으로 확장될 수 있다. 한 실시 양태에서, 세포는 피하 환경으로 확장된 장치의 부분에 적재될 수 있는 반면, 장치의 나머지 부분은 복강 내 환경에 있다. 또 다른 실시 양태에서, 세포 이식 장치는 이식 세포로부터 치료적 효과를 끌어내기 위해 필요에 따라, 뇌, 척수 코드 영역 또는 다른 장기 속에 이식될 수도 있다. 대부분의 실시예에서, 숙주는 인간이지만, 다른 포유류 또는 비포유류 동물일 수도 있다. 세포 이식 과정은 장치 이식 단계에 이어 세포 주입(세포 이식)단계를 포함하는 두 단계 공정이다. 세포 주입 단계는 이식된 장치가 그동안 혈관이 발달된 콜라겐 기질에 침투되는 생체 내(in vivo) 인큐베이션 기간 후에 시행된다. 한 실시 양태에서, 인큐베이션 기간은 다공성 스캐폴드의 혈관신생과 콜라겐 침투에 적절한 시간으로 인정되는, 약 삼십일이다. 필요하거나 바라는 혈관 신생 및 조직(세포를 포함한 콜라겐) 형성 정도에 의존하여 인큐베이션 기간는 늘리거나 줄일 수 있다. 예를 들어, 이식 장치는 장치의 물질, 규모 또는 예를 들어 항생제 코팅과 같은 코팅, 성장 인자 등에 따라 다른 속도로 혈관을 발달시킬 수 있다. 이식 장치는 또한 다른 숙주에서 다른 속도로 혈관을 발달시키거나 같은 숙주 안에서 다른 체조직에 위치할 수 있다. 당업자는 적합한 인큐베이션 기간를 결정할 수 있다. 예를 들어, 이미지화 연구는 충분한 혈관 및/또는 연결 조직이 인큐베이션 기간 동안 다공성 스캐폴드의 벽 주변 또는 사이에 부착되는 것을 확실히 하기 위하여 세포 전달에 앞서 행해질 수 있다. 세포 주입 단계를 위해, 이식 위치에 수술용 절개를 통해 접근하고, 플러그 또는 플러그 시스템은 스캐폴드 내에서 콜라겐과 혈관이 정렬된 주머니를 형성하기 위하여 다공성 스캐폴드로부터 제거된다. 그 후 세포 제제는 혈관이 발달된 주머니로 전달되고, 다공성 스캐폴드는 다시 밀폐된다. 또 다른 실시 양태에서, 세포 이식 공정은 장치를 배치하고, 동시에 세포를 이식하는 한 단계 공정이다. 이 환경에서, 세포는 장치의 구멍으로부터 새어나오지 않도록, 기질 내에 배치될 수 있거나 또는 그렇지 않으면 장치는 콜라겐과 혈관형성 발달 공정 중에 장치로부터 세포가 새는 것을 방지하기 위해 분해성 고분자로 코팅될 수 있다.
어떤 실시 양태에서, 이식되기 위한 세포는 여기서 설명한 이식 장치 중 어느 하나의 챔버 내에 적재되기에 앞서 생체적합성 점착성 용액 또는 생분해성 고분자 제제와 결합할 수 있다. 이 생분해성 고분자는 숙주체에 의해 장치에 완전히 혈관이 발달되기 전까지 세포를 보호할 것이다. 이 제제는 숙주 내에 장치가 배치되기 전 또는 후에 장치에서 콜라겐 기질과 혈관 구조가 형성되기 전에 챔버 내에 위치할 수 있다. 그러나 생체적합성 점착성 용액 또는 생분해성 고분자 제제와 결합한 세포는 숙주체 내로 장치의 이식 전에 세포와 함께 적재되도록 제작된 장치에서 특히 유용하다. 세포와 결합하는 생분해성 제제로써 사용될 수 있는 대표적인 고분자의 예는 폴리에틸렌-이민과 덱스트란 술페이트, 폴리(비닐실록산)에코폴리미어폴리-에틸렌이민, 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락트-글리콜산), 폴리(락트산), 폴리히드록시발레레이트와 공중합체, 폴리히드록시부티레이트와 공중합체, 폴리디악사논, 폴리안하이드라이드, 폴리(아미노산), 폴리(오소에스테르), 폴리에스테르, 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로오스 고분자, 키토산, 알기네이트, 피브로넥틴, 세포외 기질 단백질, 빈쿨린, 한천, 아가로스, 히알루론산, 마트리겔 및 그들의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
세포는 장치 내에 위치할 수 있다는 것을 주의하여야 한다; 그러나, 세포는 또한 캡슐화될 수 있다. 다음은 실시예이지만, 한정하는 것은 아니다. 고분자 세포 캡슐화 시스템의 예는 알기네이트 캡슐화, 폴리사카라이드 하이드로겔, 키토산, 칼슘 또는 바륨 알기네이트, 알티네이트와 폴리리신의 적층된 기질, 각 세포 또는 세포 다발을 캡슐화하기 위한 광중합성 폴리(에틸렌 글리콜) 고분자, 히드록시에틸 메타크릴레이트 메틸 메타크릴레이트를 포함하는 폴리아크릴레이트, 실리콘 캡슐, 실리콘 나노캡슐 및 폴리멤브레인(아크릴로니트릴-코-비닐 클로라이드)을 포함한다.
도 1a 내지 1e는 세포 이식 장치(1)의 여러 가지 예시적인 실시 양태를 나타낸다. 장치(1)는 숙주체에 세포를 함유하기 위한 다공성 챔버(2)를 형성하는 고분자 메쉬(예를 들어, 폴리프로필렌 메쉬, PTFE 메쉬 또는 임의의 기타 적합한 물질)을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 장치(1)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상의 다공성 챔버(2)를 포함할 수 있다. 다수의 챔버의 유용성은 당업자가 결정할 수 있는 지식과 기술 내에서 세포 제제의 부피에 따라 챔버의 어떤 숫자 또는 조합의 이용을 가능하게 한다.
도 1a에서 나타낸 바와 같이, 장치(1)는 근위 단부(3), 원위 단부(4) 및 다공성 챔버(2)에 수용된 플러그(5)를 포함한다. 한 실시 양태에서, 다공성 챔버(2)는 형태가 튜브형이고, 플러그(5)는 원통형으로, 다공성 챔버(2)의 내강을 따라 확장된다. 다른 예시적인 실시 양태에서, 다공성 챔버(2)는 근위 단부(3)에 개구부를 포함한다. 근위 단부(3)의 개구부는 다공성 챔버(2)로부터 플러그(5)의 삽입 및 철회가 가능한 크기이다. 그러한 실시 양태 중 하나에서, 근위 단부(3)의 개구부는 장치 인큐베이션 동안 및 장치로의 세포 주입 후에 수술용 봉합사 및/또는 혈관 클램프를 이용하여 밀폐시킨다. 당업자로서 이해하는 것과 같이, 기타 수술용 봉합 요소, 예를 들어, 미세혈관 클립, 클램프 등을 근위 단부(3)의 개구부를 밀폐하는 데 사용할 수 있다. 또다른 실시 양태에서는, 도 1b에서 나타낸 바와 같이, 장치(1)는 근위 단부(3)에 비다공성 덮개(6)를 포함한다. 그러한 실시 양태 중 하나에서, 덮개(6)는 실리콘으로 만들어진다. 덮개(6)는 장치 인큐베이션 동안 및 장치로의 세포 주입 후에 수술용 봉합사, 클램프 또는 기타 적합한 봉합 기구를 이용하여 밀폐될 수 있다. 예시적인 실시 양태에서, 장치(1)의 원위 단부(4)는 둥글거나 바닥이 평평한 표면을 포함한다. 어떤 실시 양태에서, 장치(1)는 원위 단부(4)에 장치 인큐베이션 동안 및 세포 주입 후에 수술용 봉합사, 클램프 또는 기타 수술용 봉합 요소를 이용하여 밀폐할 수 있는 개구부를 포함한다.　 또 다른 예시적인 실시 양태에서, 도 1c에서 보는 바와 같이, 원위 단부(4)는 장치의 원위 단부에서 조직의 성장을 방지하고, 세포 주입 전에 장치로부터 플러그(5)의 철회를 용이하게 하는 비다공성 부분(7)을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 도 1d에서 도시한 바와 같이, 플러그(5)의 근위 단부는 밀폐부(8)에 연결된다.　 일부 실시 양태에서, 플러그(5)가 챔버(5) 내로 삽입될 때, 밀폐부(8)는 근위 단부(3)의 개구부를 닫도록 구성된다.　 밀폐부(8)는 다공성 챔버 내부에 플러그(5)를 제자리에 고정하도록 조직된다.　 또다른 실시 양태에서, 도 1e에서 보는 바와 같이, 플러그(5)는 다공성 챔버(2)보다 길고, 장치의 근위 단부(3) 및 원위 단부(4) 양쪽의 밀폐부로 기능한다.　 플러그(5) 주위의 다공성 챔버(2)의 연부는 수술용 봉합사 및/또는 수술용 접착제를 이용하여 밀폐된다.　 세포 주입 전 플러그(5)의 제거 후에, 근위 단부(3) 및 원위 단부(4)의 개구부는 당업자가 이해되는 바와 같이, 수술용 봉합사, 혈관 클램프 또는 기타 적합한 봉합 기구를 이용하여 밀폐시킬 수 있다.
일부 예시적인 실시 양태에서, 장치(1)는 서로 축방향으로 연결된 다수의 다공성 챔버(2)를 포함한다.　 그런 실시 양태 중 하나에서, 다수의 다공성 챔버(2)는 예를 들어, 다공성 물질의 상부와 하부 표면을 장치의 세로축에 대체로 평행한 선을 따라 초음파 용접시켜 형성된다.　 도 1f는 다공성 챔버(2)가 여덟 개인 세포 이식 장치를 나타낸다.　 각 챔버(2)는 장치 인큐베이션 단계 동안 플러그(5)를 수용한다.　 플러그(5)는 챔버 내로 세포의 주입 전에 챔버(2)로부터 제거된다.　 하나의 실시 양태에서, 장치(1)는 전체 길이가 50 mm, 너비가 45 mm인 여덟 개의 다공성 챔버를 포함한다.　 각 다공성 챔버(2)는 내부 직경이 3.5 mm 이하이고, 길이가 약 40 mm이며 직경이 2.5 mm인 플러그(5)를 수용한다.　 일부 실시 양태에서, 플러그(5)는 비다공성, 생체적합성 물질, 예를 들면 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)로 형성된다.
본 발명의 세포 이식 장치의 예시적인 실시 양태는 의료용 폴리프로필렌 메쉬, 예를 들어 미국 코네티컷주 브룩필드 SURGICALMESHTM의 폴리프로필렌으로 짠 메쉬(PPKM)로 형성된다.　 실례가 되는 실시 양태에서, 메쉬는 직경이 0.1 mm 내지 0.3 mm의 범위인 단사와, 0.3 mm 내지 1 mm, 0.4 mm 내지 0.85 mm 및 0.5 mm 내지 0.6 mm의 범위의 메쉬 구멍 크기로 형성된다.　 도 2a 내지 2d는 세포 이식 장치 형성에 사용될 수 있는 여러 가지 예시적인 메쉬 구성을 나타낸다.　 도 2a는 구멍 크기가 0.5 mm이고, 단사의 두께가 0.3 mm인 폴리프로필렌 메쉬(PPKM601)를 나타내고; 도 2b는 구멍 크기가 0.53 mm이고, 단사의 두께가 0.18 mm인 폴리프로필렌 메쉬(PPKM602)를 나타내고; 도 2c는 구멍 크기가 0.53 mm이고, 단사 두께가 0.13 mm인 폴리프로필렌 메쉬(PPKM404)를 나타내고; 도 2d는 구멍 크기가 0.85 mm이고, 단사 두께가 0.2 mm인 폴리프로필렌 메쉬(PPKM604)를 나타낸다.
도 3a는 세포 이식 장치(10)의 또다른 예시적인 실시 양태를 나타낸다.　 도 3b는 세포 이식 장치(10)의 구성 요소를 나타낸다.　 장치(10)는 다공성 스캐폴드(12), 일차 밀폐부(14), 외부 플러그(16)와 내부 플러그(18)를 포함하는 적어도 하나의 플러그 시스템 및 이차 밀폐부(20)를 포함한다.
도 4에서 보는 바와 같이, 세포 이식 장치(10)의 다공성 스캐폴드(12)는 숙주체에 세포를 함유하기 위한 하나 이상의 다공성 챔버(22)를 형성하는 고분자 메쉬(예를 들어, 폴리프로필렌 메쉬, PTFE 메쉬, 또는 임의의 기타 적합한 물질)를 포함할 수 있다.　 일부 실시 양태에서, 다공성 스캐폴드(12)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상의 다공성 챔버(22)를 포함할 수 있다.　 다수 챔버의 유용성은 당업자의 기술 및 지식 내에서, 세포 제제에 요구되는 부피에 따라 챔버의 어떤 수 또는 조합의 이용을 가능하게 한다.
다공성 챔버(22)는 예를 들어, 장치의 길이 방향축에 실질적으로 평행한 선을 따라 다공성 스캐폴드(12)의 상부와 하부 표면을 연결하여 만들어질 수 있다.　 다수의 다공성 챔버(22)는 같거나 또는 다른 단면 크기와 표면적을 가질 수 있다.　 하나의 실시 양태에서, 다수의 다공성 챔버(22)는 스캐폴드의 근위 단부(24)에서 원위 단부(26)까지 고분자 메쉬를 초음파 용접함으로써 형성된다.　 다공성 스캐폴드(12)의 상부와 하부 표면은 하나 이상의 다공성 챔버(22) 전체에 걸쳐 연속적이고, 단지 다공성 스캐폴드(12)의 길이방향 축에 실질적으로 평행하게 이어진 초음속 용접선(28)에 의해서만 중단된다.　 다공성 스캐폴드(12)의 상부 및 하부 표면은 각 용접선에 살짝 들어갈 수 있는데, 이는 혈관 발달에 추가적인 표면적을 제공하고, 숙주 내에서 장치(10)에 물리적 안정성을 제공한다.　 일 실시 양태에서, 원위 단부(26)의 연부는 점점 가늘어지고, 원위 단부(26)를 밀폐하기 위해 서로에 초음파 용접시킨다.
도 3b를 참조하면, 일차 밀폐부(14)는 장치 인큐베이션 동안 및 세포 주입 후, 하나 이상의 다공성 챔버(22)를 밀폐하도록 구성된다.　 일차 밀폐부(14)는 비활성, 생체적합성 고분자 필름 또는 임의의 기타 적합한 물질을 포함한다.　 일 실시 양태에서, 도 5a 및 5b에서 나타낸 바와 같이, 일차 밀폐부(14)는 측면 연부 및 가늘어진 근위 단부(31)에 초음파 용접된다.　 일차 밀폐부(14)의 원위 단부(32)는 다공성 스캐폴드(12)의 근위 단부(24)에 부착된다.　 일 실시 양태에서, 원위 단부(32)는 다공성 스캐폴드(12)의 근위 단부(24)에 초음파 용접된다.
여러 실시 양태에서, 일차 밀폐부(14)는 인큐베이션 기간 동안 다공성 챔버(22) 내에서 적어도 하나의 외부 플러그(16)를 유지하도록 보조하는 재밀폐할 수 있는 잠금장치(34)를 포함한다.　 잠금장치(34)는 또한 세포 주입 공정 동안 세포 제제가 새어나가는 것을 방지한다.　 어떤 적합한 재밀폐 가능한 잠금 기구를 잠금장치(34)로 사용할 수 있다.　 일 실시 양태에서, 잠금장치(34)는 맞물림 홈과 리지(ridge) 특징부를 포함하는데, 이는 함께 눌렀을 때 단단한 밀폐부를 형성하고, 근위 단부(31)에서 밀폐부(14)의 상부면과 하부면을 잡아당기는 경우 열린다.　 장치 인큐베이션 기간 후에, 외부 플러그(16)로의 접근은 일차 밀폐부(14)의 근위 단부(31)를 잘라내고, 재밀폐 가능한 잠금장치(34)를 여는 것으로 달성된다.　 다공성 스캐폴드(12) 안으로 세포 제제가 운반된 후에, 잠금장치(34)는 다시 닫히고, 근위 단부(31)는 예를 들어 수술용 봉합사, 스테이플러 또는 생체접착제, 또는 밀폐제를 이용하여 다시 밀폐시킨다.
플러그 시스템의 수는 세포 이식 장치(10) 내의 다공성 챔버(22)의 수와 일치할 수 있다.　 외부 플러그(16)는 장치 인큐베이션 기간 동안 다공성 챔버(22)의 내부에 수용된다.　 일부 실시 양태에서, 외부 플러그(16)의 길이는 각 다공성 챔버(22)의 길이와 거의 같다.　 도 6a에서 도시한 바와 같이, 일 실시 양태에서, 다수의 외부 플러그(16)는 공동 스파인(42)을 이용하여 근위 단부(40)에 연결되어 있다.　 공동 스파인(42)은 다공성 챔버(22)로부터 외부 플러그(16)의 제거를 용이하게 하는 하나 이상의 홈(43)을 포함할 수 있다.　 예를 들어, 홈(43)은 겸자를 사용하여 공동 스파인(42)을 잡도록 할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 외부 플러그(16)는 내부 플러그(18)를 수용하는 중공 중심체(45)를 가진다.　 도 6b에서 나타낸 바와 같이, 일 실시 양태에서, 중공 중심부(45)에는 플러그의 내부 표면의 길이를 따라 하나 이상의 내부 돌기(47)가 있다.　 내부 돌기(47)는 외부 플러그(16)와 내부 플러그(18) 사이에 세포 제제의 운반 중에 갇힌 공기 방울이 탈출하게 하는 공기 영역을 제공하는데, 이는 아래에서 더 상세하게 설명한다.　 공기 영역은 또한 내부 플러그(18)를 제거하는 동안 진공 형성을 방지하고, 그에 의해 다공성 챔버의 내부 및 주위에서 새롭게 형성되어 혈관이 발달된 콜라겐 기질의 완전성이 유지된다.　 그러므로, 어떤 면에서, 외부 플러그(16)와 내부 플러그(18)를 포함하는 플러그 시스템은 세포 이식 장치(10)로 세포의 전달을 용이하게 할 수 있고, 또한 온전한 콜라겐 기질 내에서 세포의 생존 가능성을 증가시킬 수 있다.　
일부 실시 양태에서, 외부 플러그(16)의 근위 단부(40)와 원위 단부(41)는 내부 플러그(18)의 효과적인 밀폐를 보장하기 위하여, 예를 들어, 내부 홈 또는 좁아지는 표면과 같은 밀폐 기구를 포함한다.　 도 7에서 보는 바와 같이, 내부 플러그(18)의 근위 단부(50)와 원위 단부(51)는 인큐베이션 기간 동안 중공 중심체(45)로 콜라겐 기질의 침투를 방지하기 위하여 상호보완적인 밀폐 기구(53)를 포함할 수 있다.　 예를 들어, 일 실시 양태에서, 밀폐 기구(53)는 내부 플러그(18)의 근위 및 원위 단부의 주변부 주위로 연장된 홈을 포함하고, 외부 플러그(16)는 그것의 원위 및 근위 단부의 주변부 주위의 리지를 포함한다.　 이러한 실시 양태에서, 내부 플러그(18)가 외부 플러그(16)의 중공 중심(45) 안으로 삽입될 때, 외부 플러그(16)의 리지와 내부 플러그(18)의 홈은 서로 맞물리게 되어, 내부 및 외부 플러그의 완벽한 밀폐부를 형성하고, 중공 중심(45) 내부로 어떠한 생물학적 물질의 침투도 막는다.　 또한, 그러한 실시 양태에서, 외부 플러그(16)가 일 이상의 내부 돌기(47)를 포함하는 경우, 외부 플러그(16)의 근위 및 원위 단부의 리지의 높이는 내부 돌기(47)의 높이보다 클 수 있다.
도 6c 및 6d는 본 발명의 일 실시 양태에 따른 다공성 챔버(22) 및 플러그(16, 18) 조립체의 단면도를 나타낸다.　 도 6c는 숙주체 내로 이식하기 전 조립체의 단면도이고, 도 6d는 숙주체 내에서 인큐베이션 후 조립체의 단면도이다.　 다공성 챔버(22)의 내부 직경과 외부 플러그(16)의 외부 직경은 조직 형성을 위한 외부 플러그(16)의 주변부 주위의 공간(46)을 유지할 수 있도록 선택된다.　 예를 들어, 도시된 일 실시 양태에서, 다공성 챔버(22)의 내부 직경은 4.5 mm보다 크지 않고, 플러그(16)의 외부 직경은 3.5 mm보다 크지 않다.　 또다른 실시 양태에서, 다공성 챔버(22)의 내부 직경은 3.5 mm보다 크지 않고, 플러그(16)의 외부 직경은 2.5 mm보다 크지 않다.　 이러한 실시 양태는 혈관이 발달한 콜라겐 기질의 형성을 위한 외부 플러그(16) 주위의 공간으로, 예를 들어, 약 0.5 mm를 제공한다.　 외부 플러그(16) 주위의 공간은 또한 다공성 챔버의 외부 및 내부로 외부 플러그의 삽입 및 철회를 위한 충분한 공간을 제공한다.
세포 이식 장치(10)가 숙주체에 이식될 때, 혈관과 연결 조직은 다공성 챔버(22)를 통해 공간(46)으로 침투하고, 외부 플러그(16) 주위로 혈관이 발달한 조직 기질(48)을 형성한다.　 플러그(16)는 조직 기질(48)이 다공성 챔버(22)의 내강으로 더 침투하는 것을 방지한다.　 내부 플러그(18) 및 외부 플러그(16)가 다공성 챔버(22)로부터 철회될 때, 다공성 챔버(22) 내부에 숙주체 내의 세포를 보관하는 데 사용될 수 있는 주머니(49)가 만들어진다.　 도 6e에서 나타낸 바와 같이, 주머니(49)는 혈관이 발달된 조직 기질(48)로 감싸진다.
내부 플러그(18)의 수는 외부 플러그(16)의 수에 일치할 수 있다.　 내부 플러그(18)는 장치 인큐베이션 기간동안 외부 플러그(16)의 중공 중심(45) 내에 수용된다.　 일 실시 양태에서, 다수의 내부 플러그(18)는 공동 스파인(52)을 이용하여 근위 단부(50)에 연결된다.　 일부 실시 양태에서, 공동 스파인(52)은 외부 플러그(16)로부터 추출되는 동안 내부 플러그(18)의 조작을 보조하는 클립 구조(54)를 포함한다.　
도 8에서 나타낸 바와 같이, 이차 밀폐부(20)는 세포 이식 장치(10) 내로 세포 제제의 전달 후에 일차 밀폐부(14)가 다시 닫힐 때, 다공성 챔버에 있는 세포질 제제를 수용하는 데 사용된다.　 이차 밀폐부(20)는 세포 제제가 다공성 챔버(22) 내부로 완전히 전달되고, 외부 플러그(16)가 장치(10)로부터 철회된 후에 다공성 스캐폴드(12)의 근위 단부(24)에 위치한다.　 일부 실시 양태에서, 이차 밀폐부(20)는 핀셋을 이용하여 장치(10) 내부로 삽입하기에 용이하도록 홈(60)을 포함한다.
본 발명의 또다른 관점에서, 세포 이식 장치로의 세포 전달을 위한 장치 및 방법을 개시하였고, 세포 이식 장치(10)를 참조로 하여 설명할 것이다.　 도 9a는 세포 전달 장치(70)의 여러 가지 구성 요소를 나타낸다.　 세포 전달 장치(70)는 적어도 하나의 세포 주입 튜브(71)와 클립 구조(73)를 가진 연결용 캡(72) 및 연결용 스페이서(74)를 포함한다.
세포 주입 튜브(71)는 고분자 튜브(예를 들어, 폴리에틸렌 튜브) 또는 세포 주입 단계 동안 장치(10)의 다공성 챔버(22) 내로 세포 제제를 전달하기에 적합한 임의의 다른 물질을 포함할 수 있다.　 전달 시스템의 세포 주입 튜브의 수는 다공성 챔버(22)의 수와 일치할 수 있다.
연결용 스페이서(74)는 세포 주입 튜브(71)의 원위 단부에 위치하고, 세포 전달 공정 동안 외부 플러그(16)의 근위 단부(40)와 결합하거나, 접속한다.　 도 9a에서 나타낸 바와 같이, 연결용 스페이서(74)는 세포 주입 튜브(71)가 그를 통해 삽입되는 일 이상의 관통 구멍을 포함한다.　 관통 구멍은 세포 주입 튜브(71)와 함께 광 간섭 맞춤(light interference fit)을 제공하도록 구성된다.　 세포 주입 공정 동안 세포 주입 튜브(71)가 제자리에 유지되도록 핏팅이 채택된다.　 또한, 어떤 실시 양태에서, 연결용 스페이서(74)는 아래에 더 설명하는 바와 같이, 세포 전달 공정 동안, 내부 돌기(47)에 의해 만들어진 외부 플러그(16)의 공기 공간으로부터 공기를 배출시키기 위한 통기구(76)를 포함한다.　 일 실시 양태에서, 외부 플러그(16)는 근위 단부(40)에 중심체(78)를 포함한다.　 그러한 실시 양태에서, 연결용 스페이서(74)는 세포 이식 장치(10)의 전달 장치(70)를 보호하도록, 세포 주입 공정 동안에 중심체(78)로 삽입된다.
세포 주입 튜브(71)의 근위 단부는 연결용 캡(72)을 포함한다.　 튜브가 외부 플러그(16)로 삽입됨으로써, 연결용 캡(72)은 연결용 스페이서(74)를 향해서 말단으로 다가간다.　 도 9c에서 나타낸 바와 같이, 튜브(71)가 외부 플러그(16)로 완전히 삽입되었을 때, 연결용 캡(72)은 연결용 스페이서(74) 및/또는 중심체(78) 위에 끼우고, 클립 장치(73)는 공동 스파인(42)을 따라 외부 플러그(16)/또는 중심체(78)와 연결된다.　 이것은 세포 제제가 다공성 챔버(22) 내부로 주입될 때 연결용 캡(72), 연결용 스페이서(74) 및 외부 플러그(16)가 일체로 철회될 수 있게 한다.
본 발명의 또다른 관점에서, 세포질 이식 방법을 개시하였고, 세포 이식 장치(10) 및 세포 전달 장치(70)를 참조하여 설명할 것이다.　 세포 이식 방법은 본 발명 장치의 실시 양태로 제한되지 않고, 어떠한 세포 이식 장치 및 세포 전달 장치에 사용될 수 있다.
도 10은 예시적인 세포 이식 공정의 단계를 나타낸 흐름도이다.　 세포 이식 공정은 일반적으로 장치 이식 단계와 후에 세포 인큐베이션 단계를 포함하는 두 단계 공정이다.　 장치(10)는 콜라겐과 혈관이 다공성 스캐폴드(12)로 침투하기에 충분한 시간을 제공하기 위하여 세포 전달 전에 숙주체에 이식된다.　 일부 실시 양태에서, 이식 전에 에틸렌 옥사이드를 이용하여 장치(10)를 살균시킨다.　 장치(10)는 에틸렌 옥사이드 기반의 살균 공정용 멸균 표시 스트립과 함께 자체 밀폐 패키지 또는 기타 살균가능한 패키지로 포장될 수 있다.　 일부 다른 실시 양태에서, 감마 방사선 또는 건열 고압살균법이 이식 전에 장치를 살균하기 위해 사용할 수 있다.　 건열 고압살균은 열변형 온도가 낮은 일부 고분자 물질(예를 들어, 폴리프로필렌)을 틀어지게 만들기 때문에, 사용되는 살균 방법의 종류는 스캐폴드 물질에 의존한다.　 6 M-Rad의 살균선량에서, 감마 방사선은 세포 이식 장치를 성공적으로 살균할 수 있으나; 감마 방사선은 폴리프로필렌으로 만들어진 장치의 저장 수명을 감소시킬 수 있다.
장치(10)는 피하 또는 복막 내로 이식될 수 있다.　 예를 들어, 숙주체 내에 장치의 피하 이식을 위해, 피부와 표피를 관통하여 절개한 후, 연결 조직과 지방질을 조심스럽게 뭉툭하게 절개하여 절개선으로부터 미골부로 피하 주머니를 만든다(810 단계).　 적합한 공간을 만들고 나면(장치의 대략적인 크기), 장치(10)는 피하 주머니로 이식되고, 절개는 봉합된다(820 단계).　 그렇지 않으면, 장치(10)는 복부의 절개를 통해 복막의 빈 부분에 이식될 수 있다.　 장치 이식 단계(810 및 820 단계) 후에 혈관이 발달된 콜라겐 기질이 그동안 다공성 스캐폴드(12) 내 및 주위에 부착되는 장치 인큐베이션 기간(830 단계)이 이어진다.
인큐베이션 기간 후에, 장치(10)는 이차 수술용 절개를 통해 접근할 수 있다.　 예를 들어, 일차 밀폐부(12)의 근위 단부(31)는 장치(10)를 열기 위해 제자리에서(in situ) 잘라질 수 있다(840 단계).　 내부 플러그(18)는 그 후 외부 플러그(16)로부터 추출되고, 폐기된다(850 단계).　 내부 플러그 제거 공정 동안에, 내부 돌기(47)에 의해 공기 움직임이 용이하게 되고, 이는 장치 내 및 주위에 새롭게 형성된 혈관의 파괴를 발생시킬 수 있는 장치 내의 진공 형성을 방지한다.　 내부 플러그(18)의 제거는 내부 플러그(18)의 근위 단부(50) 및 원위 단부(51)를 외부 플러그(16)의 근위 단부(40) 및 원위 단부(41)로부터 분리시킨다.　 그 후, 세포질 제제는 세포 전달 장치(70)를 이용하여 장치(10) 내부로 전달된다.
도 11a 내지 11d는 예시적인 세포 주입 공정의 일부 단계의 도식적인 개요를 나타내고, 도 10에 나타낸 흐름도를 참조하여 설명할 것이다.　 도 11a에 나타낸바 같이, 장치(10)에 세포를 투여하기 위해서, 전달 장치(70)의 세포 주입 튜브(71)는 세포질 제제(79)를 적재하고, 튜브를 외부 플러그(16)의 중공 중심(45) 내로 삽입한다(860 단계).　 연결용 스페이서(74)는 외부 플러그(16)의 근위 단부(41) 및/또는 중심체(78)와 결합한다.　 튜브(71)가 외부 플러그 안쪽으로 다가감으로인해, 공기는 외부 플러그(16)의 내부 돌기(47) 및 연결용 스페이서(74)의 배기구(76)를 통하여 방출된다.　 튜브(71)가 외부 플러그(16) 내부로 줄곧 다가갈 때, 연결용 캡(72)은 연결용 스페이서(74)와 접속한다.　 그 후, 연결용 캡(72)의 클립(73)은 외부 플러그(16)의 중심체(78)와 연결된다(870 단계).　 이 경우, 그 후 외부 플러그(16), 연결용 캡(72) 및 연결용 스페이서(74)가 일체로 다공성 챔버(22)로부터 약간 철회되어, 다공성 챔버(22)의 원위 단부에 공간을 만든다(875 단계).　 일부 실시 양태에서, 외부 플러그(16)는 전달 장치(70)와 외부 플러그(16)의 연결 전에, 다공성 챔버(22)로부터 약간 철회될 수 있다.　 다시 말하면, 875 단계는 870 단계 전에 행해질 수 있다.　 가벼운 압력을 세포 주입 튜브(71)와 연결된 주사기에 가하여, 세포를 다공성 챔버(22)에 전달한다(880 단계).　 세포질 제제가 전달되도록 압력을 가하는 동안, 튜브(71)가 다공성 챔버(22)에 남아있도록 주의하여야 한다.
일 실시 양태에서, 도 11b에서 도시한 바와 같이, 세포 주입을 시작하기 전에, 외부 플러그(16)를 약 5 mm 철회시킨다.　 압력(P)이 세포 주입 튜브(71)와 연결된 주사기에 가해지는 동안, 세포 제제(79)는 다공성 챔버(22) 내로 주입된다.　 도 11c 및 11d에서 도시한 바와 같이, 세포 제제가 다공성 챔버(22) 내로 전달되는 동안, 외부 플러그(16)와 세포 주입 튜브(71)는 장치로부터 빼내어진다(885 단계).　 장치가 세포질 제제(79)로 완전히 채워진 때, 세포 주입은 멈춰지고, 세포 주입 튜브(71)는 장치(10)로부터 완전히 철회된다(890 단계).　 그 후, 다공성 챔버(22)를 세포질 제제를 위한 남은 공간에 대해 평가하고, 남은 세포 제제를 다공성 챔버의 단부에 조심스럽게 추가할 수 있다.　 세포 제제는 다공성 챔버(22)의 근위 단부(40)에 이차 밀폐부(20)를 배치함으로써, 다공성 챔버(22) 내에 수용되고, 그 후 일차 밀폐부(12)의 재밀폐가능한 잠금장치(34)를 닫고, 수술용 봉합사 또는 스테이플러 또는 다른 적합한 밀폐 기구로 일차 밀폐부(12)의 근위 단부(31)를 고정한다(895 단계).　 마지막으로, 수술용 절개 부위는 수술용 봉합사, 스테이플러 또는 조직 접착제를 이용하여 봉하고, 그에 의해 세포 이식 공정이 완료된다.
본 발명의 세포 이식 장치와 방법은 병태의 치료를 위한 치료용 생물학적 물질을 숙주로 제공하기 위하여 어떠한 치료용 세포, 세포의 조합물의 숙주체 내로의 이식에 사용할 수 있다.　 세포는 줄기 세포, 제대혈 세포 및 배아 줄기 세포를 포함하는 동종이계, 이종 또는 동계의 공여 세포, 환자에게서 유래된 세포일 수 있다.　 줄기 세포는 적합한 치료용 세포로 분열될 수 있다.　 그 세포는 장치 내에 배치될 때 미성숙하거나, 부분적으로 분열되었거나, 또는 완전히 분열되었고 성숙한 세포일 수 있다.　 세포는 또한 유전적으로 조작된 세포 또는 세포주일 수 있다.　 하나의 관점에서, 본 발명과 일치하는 실시 양태는 숙주체의 혈당 조절을 위한 수단을 제공하는 랑게르한스섬 세포의 이식에 사용될 수 있다.　 다른 관점에서, 세르토리 세포가 숙주체 내의 랑게르한스섬 세포에 면역학적 보호를 제공하는 경우, 세포 이식 장치의 한 실시 양태는 랑게르한스섬과 세르토리 세포의 동시 이식을 위해 사용된다.　 숙주체 내에서, 세르토리 세포에 의한 면역 보호는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,725,854에서 이미 밝혀졌고, 그 전체가 여기에 참조로써 포함되었다. 이에 따라, 본 발명은 또한 여기 개시된 세포 이식 장치의 실시 양태를 이용하여 필요로 하는 환자에게 치료 양의 세포 이식에 의한 다양한 질병 치료 방법을 고려한다.　
이식된 치료용 세포 또는 세포 조합물의 밀도는 숙주의 무게와 세포의 치료 효과를 기반으로 결정된다.　 앞서 언급한 바와 같이, 세포 이식 장치의 크기와 사용되는 다공성 챔버의 수(다중 챔버 장치에서)는 필요로 하는 세포의 수, 장치 인큐베이션 기간 동안 얻을 수 있는 혈관 발달 정도 및 이식 장치의 안팎에서의 영양분과 세포질 생성물의 분산 특성을 기반으로 결정된다.　
실시예
다음의 실시예는 다양한 실시 양태를 더 잘 설명하기 위하여 제공되나, 어떠한 방법으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.　 이 실시예에서 사용되는 세포 이식 장치는 폴리프로필렌 메쉬로 형성되었고, 장치의 각 다공성 챔버에 단일의 PTFE 플러그를 포함한다.
1. 췌도 세포를 함유하는 세포 이식 장치는 루이스 쥐를 정상혈당으로 회복시킬 수 있다.
세포 이식 장치는 정상혈당을 회복하기 위한 루이스 쥐에 동종동계의 췌도 세포를 이식하는 데 사용하였다. 이식된 세포의 혈당반응을 쥐의 간문맥으로 직접 투여한 췌도 세포의 혈당반응과 비교하였다. 루이스 쥐는 그룹당 9마리로 3종류의 연구 그룹으로 나뉘어졌다. 첫 번째와 두 번째 연구 그룹에서, 장치는 각각 복강내와 피하의 공간에 투입되었다. 세 번째 그룹에서, 췌도 세포는 간문맥 내로 직접 투입되었다.
이식된 장치를 루이스 쥐에서 한 달 이상 인큐베이션하여 혈관이 성장되게 하였다. 그 후, 쥐에 스트렙토조토신을 주입함으로써 당뇨병을 화학적으로 유도하였다. 세 번의 성공적인 혈당 측정이 적어도 18.0 mL라면, 그 쥐를 당뇨병으로 생각하였다. 그 후, 단리된 루이스 쥐의 췌도 세포(10,000 IEQ/Kg 무게)를 이식된 장치 내로 또는 당뇨병 쥐의 간문맥 내로 직접 주입하였다. 인슐린 펠릿은 췌도 이식 후 14일차에 제거된다(도 11a 및 도 11b의 그래프 위의 닫힌 사각형으로 표시됨). 쥐의 혈당 수치는 100일간 관찰되었다. 이식 후 100일차, 장치는 이식된 췌도가 당뇨병 전환의 원인이 되는지 확인하기 위하여 제거되었다.
도 12a와 12b는 각각 복강내(그물막의 챔버) 및 피하의 세포 이식 장치를 받은 쥐의 포도당 표준화 결과를 보여준다. 직선으로 표시된 바와 같이, 성공적인 세포 이식은 혈당 수준의 표준화(8.0 mM 미만의 혈당 측정)를 야기시켰다. 정상 혈당을 얻지 못한 이식은 점선으로 표시되었다. 결과는 췌도 세포를 받은 당뇨쥐의 통계적으로 유의한 수에서 정상 혈당 수준이 유지되는 것을 나타낸다. 이식 후 백일째 이식 장치의 제거 후에, 이전에 정상 혈당 수준이 증명되었던 쥐가 고혈당 수준으로 돌아갔는데, 이는 장치가 장치 제거 전에 정상혈당을 얻을 수 있는 완전한 기능성 이식물을 포함한다는 것을 의미한다. 혈당 농도가 비당뇨 수준에 도달한 비율은 연구 그룹 사이에서 통계적으로 상이하였다(p<0.0001, t-test).
도 12c는 췌도 세포가 이식된 루이스 쥐의 IVGTT(정맥내 내당력 시험)를 보여준다. IVGTT는 이식 후, 40일차와 80일차에 실시하였다. 복강 내 및 피하에 이식 한 쥐의 포도당 반응은 간문맥내 췌도 세포를 받은 쥐의 포도당 반응과 비교하였다. IVGTT는 각 연구 그룹에서 세 마리 쥐에게 실시하였다. 이식 후 40일 및 80일째, 췌도 세포가 이식된 쥐의 혈당 수준은 도 12c에서 보는 바와 같이, 포도당 투여를 받고 50분 내에 8.0 mM 이하로 떨어졌다. 세포 이식 장치는 100일째 제거하였다. 110일째 포도당 한 회분을 투여하였을 때, 혈당 수준은 떨어지지 않았는데, 이는 이식된 장치의 제거 전에, 이식된 췌도 세포가 당뇨쥐의 정상혈당 달성의 원인이라는 것을 의미한다.
도 12d는 췌도 세포가 이식된 루이스 쥐의 인슐린 반응성을 보여준다. 인슐린 수준은 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 검사하였다. 측정은 삼중으로 실시하였다. 결과는 포도당 투여의 혈액 인슐린 수준에서 커다란 차이를 나타낸다(p<0.005, t-test). 도 12d에서 보는 바와 같이, 이식된 장치를 받은 쥐의 인슐린 수준은 간문맥내 췌도 세포를 받은 쥐의 인슐린 수준과 밀접한 관련성이 있었다.
2. 세포 이식 장치의 다공성 챔버 내에서의 혈관 생성 및 인슐린의 조직학적 검출
100일차에 이식된 장치를 제거한 후, 인슐린에 대항하는 특정한 일차 항체를 이용하여 장치 내의 인슐린을 검출하였다. 도 13a는 피하에 이식된 장치의 다공성 챔버 내의 인슐린 염색 결과를 보여준다. 챔버 내의 인슐린의 검출은 장치 내에 수용된 췌도 세포가 이식 후 100일차에 살아있고, 기능을 한다는 것을 나타낸다.
이식된 장치의 조직학적 평가는 또한 장치 내부 또는 주위에 부착된 콜라겐 기질 내의 혈관 조직의 형성을 확인하기 위해 실시하였다. 도 13b에서 도시한 바와 같이, 내피 세포와 관련된 인자 Ⅷ의 면역조직 화학 염색은 연결 조직 내에 깊게 내장된 잘 형성된 혈관 구조를 나타내었다(어두운 구조는 내피를 나타내고; 세포핵은 화살표로 나타내었다). 조직학적 평가는 또한 세포 이식 장치의 중심 쪽으로 혈관이 형성된 조직의 침투를 보여주었다.
3. 세포 이식 장치 내 혈관형성 및 콜라겐 부착 평가
이식 단계의 적절한 길이(장치의 이식과 췌도의 이식 사이의 시간)를 결정하기 위하여, 세포 이식 장치를 팔 주된 요크셔-랜드레이스 돼지의 피하에 2, 4, 8 주차에 이식시켰다. 각 기간의 이식 후에, 장치는 혈관형성 및 콜라겐 부착의 수준을 결정하기 위하여 외식되고, 분석된다.
a) 혈관 형성 및 콜라겐 부착의 총 평가
혈관과 조직 형성의 총 분석을 위해 외식된 장치의 배쪽과 등쪽 표면 모두 사진을 찍었다. 사진을 1 cm × 1 cm 그리드로 덮어, 미세혈관 및 조직(세포와 콜라겐) 형성을 정량화하였다. 그리드 내의 각 1 cm2 상자는 혈관 형성을 위해 수치가 매겨졌고, 총 혈관/cm2로 외식된 장치의 전체 표면을 계산하였다. 장치의 중앙 및 측면 둘레의 평균 두께를 측정하여, 콜라겐 부착 양을 평가하였다. 도 14는 다른 다공성 물질(메쉬)를 사용하여 형성된 네 개의 장치로부터 계산된 평균 콜라겐 두께 및 총 혈관/cm2 표를 나타낸다. 이식 후 2주차에 네 개의 메쉬 종류 모두에서 충분한 미세혈관과 조직 형성이 관찰된다. 결과는 또한 미세혈관 형성과 콜라겐 부착을 위해 필요한 시간은 장치 물질(메쉬의 다공도, 표면 거칠기 등)에 의존하여 변할 수 있다는 것을 보여준다.
b) 혈관 형성 및 콜라겐 증착의 조직학적 평가
혈관 형성은 본 빌레브란트 인자(도 15b) 및 헤마톡실린과 에오신(H&E) 착색제(도 15a)로 내피 세포를 염색하여 결정된다. 도 15a는 이식 후 2, 4, 8주차에 장치 내의 조직 결합을 보여준다. 도 15b는 세포 이식 전, 장치의 다양한 가장자리에서의 혈관 형성을 나타낸다. 장치 안으로 조직의 결합에 대한 평가는 장치가 췌도 이식 전 모든 측정된 시점에서 콜라겐 및 미세혈관과 결합하는 것을 보여준다.
4. 돼지 자가이식 췌도를 받은 세포 이식 장치의 평가
팔 주된 요크셔-랜드레이스 돼지는 4주와 8주차에 세포 이식 장치를 이식받는다. 동물 당뇨병을 만들기 위해, 90 %의 췌장절제술을 실시한 후, 수술 하루 후에 스트렙토조토신 150 mg/Kg을 정맥 내로 투여했다. 췌도는 췌장절제술을 실시하기 전에, 췌장으로부터 단리되었다. 당뇨병의 확인 및 회복을 위한 충분한 시간을 주기 위하여 이식조직의 단리와 췌장절제술을 실시한 지 5일 후, 미성숙한 췌도의 이식조직은 동물 내로 이식하였다.
미숙한 췌도 세포의 인슐린 생산 용량은 이식 전에 검사하였다. 도 16에서 보는 바와 같이, 미성숙한 췌도는 성숙한 췌도에게 평균적으로 기대되는 인슐린의 약 10%를 생산하였다. 이 사실은 약 3-5K IEQ/Kg의 낮은 췌도 이식 수(간문맥내 이식에 일반적으로 사용되는 인슐린 생산 췌도의 5-10%)와 함께, 세포 이식 장치의 엄격한 검사를 제공한다. 오늘날, 임상적인 췌도 이식 치료에서, β 세포 무리의 적절한 양의 주입은 인슐린 의존성 당뇨병의 치료에 장애물로 제기되었다. 인슐린 독립성은 췌도 세포의 충분한 양, 수용체의 몸무게 Kg 당 약 10,000 IEQ을 전달할 때 일상적으로 얻어진다. 이 양의 췌도 세포를 얻기 위해, 현재 이식 의정서는 한 수용체당 하나를 초과하는 공여 췌장을 요구하여 이미 제한된 공여 공급량의 부담을 발생시킨다. 따라서, 혈당의 조절이 간문맥내 이식에 현재 사용되는 췌도의 단지 5-10%를 사용하여 얻을 수 있다면, 췌도 이식 치료를 받을 수 있는 당뇨병 환자의 수는 눈에 띄게 늘어날 것이다.
외식 장치의 조직학적 분석은 이식된 췌도의 장기적인 생존 및 기능의 시험하기 위해 행해졌다. 췌도 이식 조직의 기능은 또한 격주로 혈당 시험, 격월로 정맥내 내당력 시험(IVGTT)을 통해 관찰하였다.
a) 췌도 이식 장기 기능의 조직학적 분석
9주차에 장치의 외식 후에, 인슐린을 인슐린에 대항하는 특정 일차 항체를 사용하여 장치에서 검출하였다. 도 17a는 외식 장치의 다공성 챔버 내의 인슐린 염색 결과를 보여준다. 챔버 내의 인슐린의 검출은, 이식 후 9주차에, 장치 내에 수용된 췌도 세포가 살아있고, 기능을 한다는 것을 보여주었다. 외식 절개의 면역조직화학적 염색은 튼튼한 미세혈관에 둘러싸인 건강하고, 잘 구성된 췌도를 나타내었다(도 17b; 미세혈관은 화살표로 표시하였다).
b) 혈당 측정
이식 후에, 매주 공복 및 비공복 혈당 수준을 췌도 이식조직 기능을 관찰하기 위해 측정하였다. 이 측정은 혈당 수준의 장기 조절에 있어서의 세포 이식 장치의 전체 효능을 결정하는데 도움이 된다. 공복 혈당 판독은 이식 조직 기능의 조절된 기준을 제공한다. 간단하게, 혈액의 방울(수 마이크로리터)을 수용체 동물의 정맥으로부터 모으고, 혈당 수준은 프리스타일 라이트 혈당측정기(Freestyle Lite glucometer) 또는 다른 포도당 측정 장치를 이용하여 결정된다.
도 18에서 나타낸 바와 같이, 이식된 췌도는 장치 외식 72일까지 장기적인 포도당 조절을 보여주었다. "혈당 대조" 그룹(n=4)의 동물은 인슐린에 독립적이고, 혈당 수준은 세포 이식 장치 내의 췌도 단독으로 조절되었다. 이 그룹의 동물은 췌도 이식 후에 장기 인슐린 독립성을 보였다. 그러나 일부 동물은 장치 내 췌도의 이식 후에도 여전히 고혈당증이었다(매일 혈당 수준을 측정)(n=6). 이것은 이식 전 췌도의 부족한 물질 대사의 양과 낮은 췌도 이식 투여량(IEQ/Kg)과 관련이 있었다. 이식 전의 췌도의 질은 장기적인 췌도 기능과 상당한 연관성이 있었다.
c) 내당력 시험
내당력 시험은 이식 전과 후의 IVGTT 결과의 비교를 통해 췌도 이식조직의 기능을 평가하는 점에서 중요하다. 세포 이식 장치의 효능을 검사하기 위하여, 췌장절개술(기준선) 전, 장치로 췌도 이식 후 및 장치의 외식 후의 여러 시점에서 IVGTT가 실시되었다. IVGTT는 덱스트로스의 투입량을 주입하고, 내인성 인슐린이 기준선까지 포도당 수준을 불러오는데 걸리는 시간을 측정함으로써 실시되었다. 혈당 수준을 측정하는 것뿐만 아니라, 인슐린이 β 세포에 의해 생산될 때 부산물로 만들어지는 C-펩타이드의 수준을 측정하기 위해 여러 시기에 혈액을 샘플링하였다. IVGTT의 결과는 혈당 수준의 절대값(도 19a), 혈당 수준의 곡선 아래 면적(AUC)(도 19b) 및 C-펩타이드 수준의 배수 변화(도 19c)를 이용하여 설명되었다.
도 19a 및 19b에서 도시한 바와 같이, 포도당 수준은 장치를 외식한 후에 눈에 띄게 증가하는데(p<0.001, Anova), 이는 장치의 제거가 췌도가 없는 당뇨병 동물과 유사하게 인슐린 기능의 제거를 야기한다는 것을 나타낸다. 최저 포도당 수준은 췌장 절개술을 하지 않은 동물에게서 검출된 반면, 췌도 자가이식 수용체는 덱스트로스 주입 후에 포도당 수준의 뚜렷한 감소를 보였고, 이는 미성숙한 췌도가 이식 후에 생존할 수 있고, 기능을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
IVGTT로부터 나온 혈청 샘플을 합성 돼지 C-펩타이드에 특이적으로 대항하게 만들어진 항체를 이용하는 린코의 돼지 C-펩타이드 방사면역측정법 키트(Linco's Porcine C-Peptide Radioimmunoassay kit)를 이용하여 분석하였다. 혈청 샘플은 덱스트로스를 주입한 후 0, 5, 15, 30, 60 및 120분에 돼지의 C-펩타이드가 존재하는지에 대해 분석되었다. 네 개의 연구 그룹-췌장절개술을 하지 않은 돼지(기준선), 췌도 자가이식 수용체(췌도 이식 후), 장치가 제거된 자가이식 수용체(장치 제거 후) 및 당뇨병 대조용 돼지-이 시험되었다. 서로 다른 연구 그룹 중에서, C-펩타이드 수준의 배수 변화가 조사될 때, 기준선 및 췌도 이식 후 수용체는 거의 비슷한 결과를 보여주었으나, 췌도 이식 후 수용체의 C-펩타이드 수준은 기준선 그룹에 대해 30분에서와 대조적으로 60분에서 증가하였다(도 19c). 또한, 장치 제거 후의 그룹과 당뇨병 대조용 그룹의 C-펩타이드의 배수 변화는 유사하였는데, 이는 이식된 췌도가 장치 제거 전에 C-펩타이드 방출의 원인이 되었다는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 실시 양태는 명세서의 고려 및 여기서 개시된 발명의 실행을 통해 당업자에게 분명할 것이다. 이것은 명세서와 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되고, 발명의 진정한 범위와 사상은 다음의 청구항에 의해 나타내어 지는 것임을 의미한다.

Claims (43)

  1. (a) (i) 0.05 mm 내지 5 mm 크기의 구멍을 갖는 폴리프로필렌 메쉬; 및
    (ⅱ) 근위 단부와 원위 단부를 갖고, 폴리프로필렌 메쉬에 의해 경계가 구분되는 적어도 하나의 챔버
    를 포함하는 다공성 스캐폴드; 및
    (b) 조직 결합 및 혈관 신생을 촉진하는 비-생분해성 물질
    을 포함하고,
    상기 폴리프로필렌 메쉬 내의 구멍은 적어도 하나의 챔버 내로 혈관 및 연결 조직의 성장을 가능하게 하는, 숙주체에 세포를 이식하는 장치.
  2. 제1항에 있어서, 챔버 내에 세포 제제를 더 포함하는 장치.
  3. 제2항에 있어서, 세포 제제가 랑게르한스섬 세포, 세르토리 세포, 도파민성 뉴런, 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 제대혈 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 및 분화된 줄기 세포 중 하나 이상을 포함하는 장치.
  4. 제2항에 있어서, 세포 제제가 랑게르한스섬 세포를 포함하는 장치.
  5. 제2항에 있어서, 세포 제제가 줄기 세포 또는 분화된 줄기 세포를 포함하는 장치.
  6. 제2항에 있어서, 세포 제제가 신경 줄기 세포, 도파민성 뉴런, 또는 간엽 줄기 세포를 포함하는 장치.
  7. 제2항에 있어서, 세포 제제가 랑게르한스섬 세포, 세르토리 세포, 도파민성 뉴런, 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 제대혈 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 분화된 줄기 세포로부터 선택되는 2 이상의 세포 종류의 조합물을 포함하는 장치.
  8. 제7항에 있어서, 세포 제제가 랑게르한스섬 세포 및 세르토리 세포를 포함하는 장치.
  9. 제2항에 있어서, 세포 제제가 동종이계의 세포, 이종의 또는 동계의 공여세포, 환자에게서 유래된 세포, 또는 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 장치.
  10. 제2항에 있어서, 세포 제제가 캡슐화되는 장치.
  11. 제10항에 있어서, 세포 제제가 알기네이트, 폴리사카라이드 하이드로겔, 키토산, 칼슘 또는 바륨 알기네이트, 알기네이트와 폴리리신의 적층된 기질, 광중합성 폴리(에틸렌 글리콜) 고분자, 폴리아크릴레이트, 히드록시에틸 메타크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 실리콘 캡슐, 실리콘 나노캡슐, 폴리멤브레인, 아크릴로니트릴-코-비닐 클로라이드, 또는 이들의 조합 내에 캡슐화되는 장치.
  12. 제2항에 있어서, 세포 제제가 생분해성 고분자를 더 포함하는 장치.
  13. 제12항에 있어서, 생분해성 고분자가 폴리에틸렌-이민과 덱스트란 술페이트, 폴리(비닐실록산)에코폴리미어폴리에틸렌이민, 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락트-글리콜산), 폴리(락트산), 폴리히드록시발레레이트와 공중합체, 폴리히드록시부티레이트와 공중합체, 폴리디악사논, 폴리안하이드라이드, 폴리(아미노산), 폴리(오소에스테르), 폴리에스테르, 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로오스 고분자, 키토산, 알기네이트, 피브로넥틴, 세포외 기질 단백질, 빈쿨린, 한천, 아가로스, 히알루론산, 마트리겔, 또는 이들의 조합을 포함하는 장치.
  14. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 챔버 내에 위치하도록 구성된 적어도 하나의 제거가능한 플러그를 더 포함하는 장치.
  15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 플러그가 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하는 장치.
  16. 제1항에 있어서, 스캐폴드의 근위 단부와 원위 단부의 한쪽 또는 양쪽의 개구부, 및 근위 단부와 원위 단부의 한쪽 또는 양쪽의 개구부를 닫기 위한 적어도 하나의 밀폐부를 더 포함하는 장치.
  17. 제1항에 있어서, 다공성 스캐폴드가 측면으로 연결되는 다수의 챔버를 포함하는 장치.
  18. 제17항에 있어서, 측면으로 연결되는 3개의 챔버, 4개의 챔버, 5개의 챔버, 6개의 챔버, 7개의 챔버, 8개의 챔버, 9개의 챔버, 10개의 챔버, 11개의 챔버, 또는 12개의 챔버를 포함하는 장치.
  19. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 밀폐부가 다공성 스캐폴드에 초음파 용접된 고분자 막인 장치.
  20. 제1항에 있어서, 다공성 스캐폴드의 적어도 일부의 구멍을 채우는 생체적합성 및 생분해성 물질을 더 포함하는 장치.
  21. 제1항에 있어서, 다공성 스캐폴드의 적어도 일부가 조직 결합과 혈관 신생을 촉진하는 하나 이상의 생물학적 또는 비생물학적 제제로 코팅되는 장치.
  22. 제21항에 있어서, 제제는 성장 인자, 항섬유성 제제, 고분자, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 콜라겐, 피브로넥틴, 폴리에틸렌-이민과 덱스트란 술페이트, 폴리비닐 실록산과 폴리에틸렌이민, 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락트-코-글리콜산), 폴리(락트산), 폴리히드록시발레레이트와 공중합체, 폴리히드록시부티레이트와 공중합체, 폴리디악사논, 폴리안하이드라이드, 폴리(아미노산), 폴리(오소에스테르), 젤라틴, 셀룰로오스 고분자, 키토산, 알기네이트, 빈쿨린, 한천, 아가로스, 히알루론산, 마트리겔, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 장치.
  23. 제22항에 있어서, 제제가 VEGF를 포함하는 장치.
  24. 제22항에 있어서, 고분자가 약물 용출 고분자인 장치.
  25. 제20항에 있어서, 생체적합성 및 생분해성 물질이 콜라겐, 피브로넥틴, 세포외 기질 단백질, 및 막 세포골격 단백질 중 적어도 하나를 포함하는 장치.
  26. 제1항에 있어서, 다공성 스캐폴드의 적어도 일부가 적어도 하나의 챔버 내로의 조직 결합을 촉진하도록 거칠게 되어 있는 장치.
  27. 제14항에 있어서, 다공성 스캐폴드가 혈관 및 연결 조직을 포함하는 신생화 콜라겐 기질 내에 플러그를 캡슐화하도록 구성되고, 플러그를 챔버로부터 철수시켜 혈관 신생화 콜라겐 기질 내 캡슐화된 챔버 내에 공간을 생성할 수 있는, 장치.
  28. 제1항에 있어서, 챔버 내에 위치하도록 구성되며 장치의 챔버로 세포를 전달하도록 구성되는 적어도 하나의 세포 주입 튜브를 포함하는 세포 전달 장치를 더 포함하는 장치.
  29. 제14항에 있어서, 제거가능한 플러그가 적어도 하나의 챔버 내에 위치하도록 구성되는 외부 플러그와 외부 플러그 내에 위치하도록 구성되는 내부 플러그를 갖는 이-플러그(two-plug) 시스템을 포함하는 장치.
  30. 제29항에 있어서, 외부 플러그의 안쪽 벽이 외부 플러그의 길이 방향을 따라 적어도 하나의 돌출부를 포함하는 장치.
  31. 제29항에 있어서, 외부 플러그 및 내부 플러그가 보완적 밀폐 기구를 포함하는 장치.
  32. 제29항에 있어서, 외부 플러그 내에 위치하도록 구성되며 장치의 챔버로 세포를 전달하도록 구성되는 적어도 하나의 세포 주입 튜브를 포함하는 세포 전달 장치를 더 포함하는 장치.
  33. 제32항에 있어서, 세포 전달 장치가 세포 주입 튜브가 외부 플러그 내로 삽입되는 경우 외부 플러그와 연결되도록 구성되는 연결부를 더 포함하고, 외부 플러그로의 연결부 부착이 세포 전달 장치와 외부 플러그를 일체로서 장치로부터 후퇴시키도록 하는, 장치.
  34. 제33항에 있어서, 상기 연결부는 외부 플러그와 연결하기 위한 클립을 포함하는, 장치.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 장치를 포함하는 세포 이식용 장치로서,
    상기 장치는
    a. 숙주체 내에 장치를 이식하고;
    b. 이식된 장치에 혈관 및 연결 조직이 침투할 때까지 숙주체 내에 이식된 장치를 유지하고;
    c. 이식된 장치에 접근하여 이식된 장치의 적어도 하나의 밀폐부를 개방하고;
    d. 장치의 챔버 내로 세포 주입 튜브를 삽입하고;
    e. 세포 주입 튜브를 통해 제공되는 세포 제제를 챔버에 주입하고; 및
    f. 적어도 하나의 밀폐부를 다시 닫도록 구성되는, 장치.
  36. 제35항에 있어서, 세포 제제가 랑게르한스섬 세포, 세르토리 세포, 도파민성 뉴런, 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 제대혈 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 및 분화된 줄기 세포 중 하나 이상을 포함하는 장치.
  37. 제36항에 있어서, 세포 제제가 캡슐화되는 장치.
  38. 제14항, 제15항, 제27항 및 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항의 장치를 포함하는 세포 이식용 장치로서,
    상기 장치는
    a. 숙주체 내에 장치를 이식하고;
    b. 이식된 장치에 혈관 및 연결 조직이 침투할 때까지 숙주체 내에 이식된 장치를 유지하고;
    c. 이식된 장치에 접근하여 이식된 장치의 적어도 하나의 밀폐부를 개방하고;
    d. 이식된 장치로부터 플러그를 철수하고;
    e. 장치의 챔버 내로 세포 주입 튜브를 삽입하고;
    f. 세포 주입 튜브를 통해 제공되는 세포 제제를 챔버에 주입하고; 및
    g. 적어도 하나의 밀폐부를 다시 닫도록 구성되는, 장치.
  39. 제38항에 있어서, 세포 제제가 랑게르한스섬 세포, 세르토리 세포, 도파민성 뉴런, 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 제대혈 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 및 분화된 줄기 세포 중 하나 이상을 포함하는 장치.
  40. 제39항에 있어서, 세포 제제가 캡슐화되는 장치.
  41. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항의 장치를 포함하는 세포 이식용 장치로서,
    상기 장치는
    a. 숙주체 내에 장치를 이식하고;
    b. 이식된 장치에 혈관 및 연결 조직이 침투할 때까지 숙주체 내에 이식된 장치를 유지하고;
    c. 이식된 장치에 접근하여 이식된 장치의 적어도 하나의 밀폐부를 개방하고;
    d. 이-플러그 시스템으로부터 내부 플러그를 철수하고;
    e. 외부 플러그 내로 세포 주입 튜브를 삽입하고;
    f. 세포 주입 튜브를 통해 제공되는 세포 제제를 챔버에 주입하고 적어도 하나의 챔버로부터 외부 플러그를 철수하고; 및
    g. 적어도 하나의 밀폐부를 다시 닫도록 구성되는, 장치.
  42. 제41항에 있어서, 세포 제제가 랑게르한스섬 세포, 세르토리 세포, 도파민성 뉴런, 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 제대혈 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 및 분화된 줄기 세포 중 하나 이상을 포함하는 장치.
  43. 제42항에 있어서, 세포 제제가 캡슐화되는 장치.
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