KR20170075769A - 혼합층 이온 교환 흡착제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체를 함유한 용액으로부터 숙주 세포 단백질(HCP), 항체 단편과 저분자량 물질을 분리하기에 적합한 새로운 종의 이온 교환 흡착제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 대상 생체분자와 불순물을 분리하여 생물학적 시료를 정제하기 위한 방법으로서 시료를 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용을 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유로 이루어진 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항체를 함유한 용액으로부터 숙주 세포 단백질(HCP), 항체 단편과 저분자량 물질을 분리하기에 적합한 새로운 종의 이온 교환 흡착제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 대상 생체분자와 불순물을 분리하여 생물학적 시료를 정제하기 위한 방법으로서 시료를 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용을 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유로 이루어진 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
단클론 항체의 정제
단클론 항체(mAb)는 약학 용도로 사용되므로 예외적으로 높은 순도가 요구된다[A. Jungbauer, G. Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010].
일반적으로 현재 시중에 나와 있는 대부분의 치료용 단클론 항체(mAb)를 제조하기 위해 포유류 세포 배양물이 사용되고 있다. 이들 약물 항체의 생산은 전형적으로 항체를 세포외액으로 분비하는 중극 햄스터 난소(CHO) 세포의 현탁액을 함유한 생물 반응기에서 개시된다. 다음, 얻어진 항체는 정화, 여과 및 정제를 포함한 일련의 공정을 거쳐 세포, 세포 잔해, 숙주 세포 단백질(HCP), 지질, DNA, 바이러스, 박테리아, 항체 응집물 등을 제거한다. 이러한 일련의 공정을 흔히 하류 공정(downstream process, DSP)이라고 한다.
가장 보편적으로 사용되는 DSP는 1 또는 2개의 결합-용리 크로마토그래피 정제 단계와 후속 1 또는 2개의 유수식 폴리싱(flow-through polishing) 단계를 포함한다(도 1, 표준 mAb 정제도). 전형적인 하류 정화 공정은 다공성 비드 기반의 크로마토그래피 매질이 채워져 있는 충전 칼럼 또는 멤브레인 기반의 장치를 사용한다. 이들 단위 조작은 연속적으로 직렬로 사용되며 각각 유수식 폴리싱 또는 결합/용리(bind/elute) 포획 모드로 특정 불순물을 제거하는 것을 목표로 한다.
폴리싱 매질의 기본 목적 중 하나는 HCP의 농도를 (mAb 농도와 관련하여) < 10 ppm까지 감소시키는 것이다. 다양한 치료용 생체분자를 상업적 규모로 정제하는 것은 현재 비드 기반의 크로마토그래피 수지를 사용하여 이루어지고 있다. 이러한 유수식 폴리싱 단계에서 바이오 의약품 제조사는 가장 일반적으로 단순한 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 매질을 이용하고 있다. 상기 AEX 매질은 산성 HCP, DNA, 내독소와 바이러스 제거를 위해 사용한다. 그러나 염기성 HCP, 생성물 응집체와 단편과 같은 양이온을 띤 불순물을 제거하는 데에는 그다지 효과가 없는 경우가 많다.
단클론 항체는 치료제와 진단제로서 계속하여 중요성을 더하고 있다. 후보 mAB들에 대한 하이브리도마 라이브러리를 선별하는 공정은 시간 소모적이면서 집중적인 인력을 필요로 한다. 적합한 mAB를 발현하는 하이브리도마 세포주가 수립되면, 추가 특성 분석을 위해서 충분한 mAB를 생산하기 위한 정제방법이 개발되어야 한다.
전통적인 정제방법은 이온 교환 크로마토그래피뿐만 아니라 Protein A 또는 Protein G 친화성 크로마토그래피를 이용하는 것을 포함한다. 정제된 항체를 투석을 이용하여 생리적 완충액으로 탈염 및 교환한다. 전체 공정은 전형적으로 완료까지 수 일이 필요하며 여러 mAB들을 병행하여 평가해야 하는 경우에는 특히 힘든 일일 수 있다.
이에 따라 최근에는 더 큰 용량과 친화력을 나타내어 더 광범위한 불순물을 제거할 수 있는 다양한 새로운 폴리싱 흡착제들이 개발되었다. 이들 흡착제는 모두의 소위 "혼합 모드"의 리간드, 음이온(AEX)(예. US 7,714,112)과 양이온 교환(CEX) 물질(예. US 7,385,040) 모두를 포함한다. 그러나 수지에 비해 이들 복잡한 리간드의 비용이 더 높아 1회 사용을 위해 또는 일회용 공정에서 사용되지 않고 있다.
일반적으로, 높은 공극률과 큰 표면적이 증명된 비드 기반의 흡착제를 적용하면 생산 규모(예. 10,000 리터)의 생체분자의 배치 공정(batch processing)을 위해 충분한 흡착능을 가진 물질을 제공한다. 특허문헌에는 혼합층 고정상에서 상기 기술 용도로 사용되는 이러한 비드 기반의 매질의 많은 예가 공지되어 있다.
JP 01-10178(Asahi Chem. Ind. CO LTD., JP 2660261B2로도 공개됨)에는 단일 장치 내에서 양이온, 음이온과 미세 입자 제거용으로 AEX와 CEX 다공성 중공 섬유 멤브레인의 조합을 포함하는 다기능 모듈이 개시되어 있다.
Bio-Rad Laboratories, Inc.는 단일 칼럼 내 제2형의 크로마토그래피 매질 위에 친화성 크로마토그래피 매질층을 포함하여 대상 친화성 결합 단백질을 용출하는 중에 상부 친화성 크로마토그래피 매질로부터 침출되는 임의의 친화성 리간드를 포집하는 다매질(multi-media) 친화성 칼럼(US 8,053,565 B)을 개발하였다.
Promega Corp.(US 6,270,970)는 불순 혼합물로부터 핵산을 단리하기 위한 혼합층 고체상을 개발하였다. 포함된 2개의 상 각각은 서로 다른 용액 조건에서 표적 핵산을 결합하고 방출시키는 능력을 갖고 있다.
Millipore Corp.와 Ebara Corp.가 출원한 또 다른 특허출원(WO 2005/011849 A)에는 이온 교환 수단이 대면 관계로 위치되어 있는 음이온 교환 섬유의 직물과 양이온 교환 섬유의 직물의 조립체를 포함하고 있는 전기 탈이온 모듈이 개시되어 있다.
혼합층 크로마토그래피는 단일 장치에서 서로 결합되어 있는 2종 이상의 서로 다른 흡착제 매질을 사용한다. 이를 통해 다양한 서로 다른 적용 상호작용을 단일 장치 내에서 단백질 용액을 분석 및 정제하기 위해 이용할 수 있다. Rassi와 Horvath는 AEX 수지와 CEX 수지로 구성된 혼합층 칼럼이 직렬 연결된 2개의 개별 칼럼과 유사하게 단백질 분리를 제공함을 입증하였다(el Rassi, Z.; Harvath, C; "Tandem columns and mixed-bed columns in high-performance liquid chromatography of proteins"; J. Chrom. 1986, 359, 255-264). 이들은 상기 시스템을 사용하여 수지를 단 하나만 사용했을 때 동시에 용출되는 여러 개의 서로 다른 단백질의 혼합물을 분석할 수 있었다.
혼합층 크로마토그래피는 다양한 다량의 단백질과 미량의 단백질로 구성되어 있기 때문에 분석하기가 특히 어려운 단백질체의 분석을 포함하여 서로 다른 여러 분야에 적용되어 왔다(Boschetti, E.; Righetti, P. G.; "Mixed-bed chromatography as a way to resolve peculiar fractionation situations", J. Chomatogr. B 2011, 897, 827-835.)
크로마토그래피 수지와 같은 분리 물질은 전형적으로 유동 불균일성을 최소화하면서 효율적인 칼럼 충전을 가능하게 하는 구형 구조를 나타낸다. 비드 사이의 간극 공간은 크로마토그래피 칼럼을 통한 대류 이동을 위한 유로를 제공한다. 이는 크로마토그래피 칼럼이 압력 강하를 최소화하면서 높은 선속도로 층 깊게 작동되도록 할 수 있다. 이들 인자를 조합하면 크로마토그래피 수지는 생체분자의 대규모 정제에 필요한 요구 효율, 높은 투과율과 충분한 결합능을 나타낼 수 있다.
비드 기반의 크로마토그래피에서는 흡착을 위해 이용할 수 있는 표면적의 대부분은 비드의 내부에 있다. 결과적으로, 분리 공정은 물질 이동의 속도가 일반적으로 공극 확산에 의해 제어되기 때문에 본질적으로 느리다. 이러한 확산 저항을 최소화하는 동시에 동적 결합능을 극대화하기 위해서 소직경의 비드를 사용할 수 있다. 그러나 소직경의 비드를 사용하면 그 대가로 칼럼 압력 강하가 커지게 된다. 결국, 분취용 크로마토그래피 분리의 최적화는 많은 경우에 효율/동적 용량(작은 비드가 유리)과 칼럼 압력 강하(큰 비드가 유리) 간 절충을 수반한다.
크로마토그래피 매질은 일반적으로 비용이 매우 높고(> $ 1000/L) 대규모 생산 칼럼의 경우에 상당량이 필요하다. 그 결과, 바이오 의약품 제조사들은 크로마토그래피 수지를 수백 회 재활용하고 있다. 이들 재생 사이클 각각은 상당량의 매질을 소비하고 각 단계는 세척, 살균 및 칼럼 충전 작업 각각의 유효성 확인과 관련된 추가 비용을 발생시킨다.
위에서 제시한 바와 같이, 여러 기술이 특허문헌에 기재되어 있고, 관능화 섬유상의 매질 및/또는 복합체를 기반으로 바이오 의약품 분리용으로 시판되고 있다. 대부분은 적정한 결합능을 얻기 위해 필요한 표면적을 제공하는 다공성 겔을 섬유 기지에 혼입하는 것을 필요로 한다. 그러나 이러한 구성에서는 겔 위치와 물질의 균일성이 좋지 않아 일반적으로 효율이 저하된다(얕은 파과(breakthrough) 및 빠른 용출). 또한 적당한 압력 하중에서 겔 압축에 의해 흔히 가중되는 문제인 내유동성이 짧은 층 깊이의 경우에도 높을 수 있다.
또 다른 방안은 대개 다공성이고 고유의 흡착 기능을 갖고 있는 미립자를 섬유 기지 내 혼입하는 것으로; 미립자의 예로는 활성탄과 실리카겔이 있다.
현재의 하류 공정(DSP)은 복잡하고 고비용이다. 이것이 산업계가 이들 공정을 압축하고 단순화하면서 비용을 절감시키는 신기술 개발에 관심이 있는 이유이다. 따라서 사용 후 칼럼을 세척하고 저장하는데 필요한 시간과 완충액을 제거함으로써 제조비용을 줄이는 저가의 일회용 흡착제 매질을 개발하는 것이 목적이다. 또한 더욱 광범위한 불순물을 표적으로 하여 흡착제 매질의 성능을 증가시키는 것이 목적이다.
또한, 흡착제 매질을 특별히 조절하여 소정의 투입물에 존재하는 불순물들의 특정 혼합물을 표적으로 할 수 있도록 리간드 화합물의 맞춤형 조성을 갖는 것이 바람직하다. 이를 수지와 멤브레인 기반의 흡착제 매질로 달성하려는 시도가 진행 중이다.
또한 층 투과율과 달성 가능한 유속을 희생시키지 않고 생체분자 크로마토그래피용으로 펜던트(pendant) 흡착 작용기를 가진 고표면적 섬유의 조합을 제공하는 것이 바람직하다.
이외에도, 종래의 과정에 의해 유도체화되어 이온 교환 물질로서 또는 소수성 분리 물질로서 모두 사용할 수 있는, 저가로 제조 가능하고 화학적으로 정의된 담체 물질을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다.
종래 기술의 단점은 크로마토그래피용, 특히 이온 교환 크로마토그래피용 흡착 매질 및 특히 이 매질을 사용하여 생물학적 시료를 정제하기 위한 적절한 방법과 관련된 본 명세서에 개시된 구현예들에 의해 해결된다.
대상 생체분자와 불순물을 분리함으로써 생물학적 시료를 정제하기 위한 본 명세서에 개시되어 있는 방법은 시료를 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용을 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유로 이루어진 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계와 세척하여 미결합 종을 제거하거나 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계를 포함한다.
구체적으로 대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 본 발명에 따른 방법은 일반적으로
a) 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료를 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계,
c) 상기 제1 섬유 매질을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계,
d) 상기 제1 섬유 매질을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계,
e) 상기 대상 생체분자를 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
f) 상기 제2 섬유 매질을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계, 및
g) 상기 제2 섬유 매질을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계를 포함하되, 단 단계 b)와 e)에서는 서로 다르게 관능화된 섬유 매질들을 사용한다.
단계 b)에서는 사용 시료를 음이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 접촉시키고, 단계 e)에서는 소수성 상호작용을 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용한다. 그러나 이 공정은 단계 b)에서 상기 시료를 양이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 접촉시키고 단계 e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용하는 변형된 형태로 수행할 수도 있다. 이 공정의 또 다른 구현예에 있어서, 단계 b)에서는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용하고 단계 e)에서는 상기 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 그러나 사용 생물학적 시료의 속성에 따라 단계 b)에서는 음이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용하고 단계 e)에서는 상기 제2 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 크로마토그래피이거나 그 반대일 수도 있다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 공정 단계는 다음과 같다:
a) 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료를 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질의 혼합물과 접촉시키는 단계,
c) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계, 및
d) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계.
이때 상기 제1 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 크로마토그래피이고 상기 제2 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피이거나 그 반대이다.
본 발명의 방법의 또 다른 변형예는
a) 시료를 제공하고,
b) 상기 시료를 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질의 혼합물과 접촉시키고,
c) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 미결합 종을 제거하고,
d) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 것이다.
상기 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
본 발명은 또한 섬유의 충전층을 포함하는 하우징으로서; 상기 충전층이 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 층과 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 층을 가진 하우징에 관한 것이다. 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 본 발명에 따른 하우징의 특정 구현예에 있어서, 상기 하우징은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 층과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 층을 가진 섬유의 충전층을 포함한다. 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 하우징은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질의 혼합물을 가진 섬유의 충전층을 포함한다. 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 본 발명의 방법은 또한 시료를 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제1 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 접촉시키고 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제2 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질과 접촉시킴으로써 실시될 수 있다. 상기 제1 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 섬유인 것이 바람직하다. 상기 방법의 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 섬유이다. 본 방법에서 크로마토그래피 매질은 상기 제1 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하도록 선택된다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현예에 있어서, 크로마토그래피 매질은 상기 제1 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하도록 선택된다. 그러나 상기 방법은 정제에 유리한 것으로 확인되면 상기 제1 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하도록 변형시킬 수도 있다.
또한 대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 본 발명의 방법은 시료를 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제1 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제2 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질과 접촉시킴으로써 실시할 수도 있다. 본 발명에 따른 방법의 상기 구현예에 있어서, 바람직하게는 상기 제1 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질은 소수성 상호작용 크로마토그래피 섬유이다. 다른 한편으로, 상기 대상 생체분자의 필요에 따라 상기 제1 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질은 소수성 상호작용 크로마토그래피 섬유이다. 상기 제1 작용기뿐만 아니라 상기 제2 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하는 경우에 양호한 정제 결과가 얻어진다. 필요하고 유리하다면, 상기 제1 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하도록 크로마토그래피 매질을 선택할 수 있다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제1 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하도록 크로마토그래피 매질을 선택할 수 있다. 또한 본 발명의 방법의 특정 구현예에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질과 상기 제2 크로마토그래피 매질은 다양하게 관능화된 섬유의 혼합물로 배치하거나 상기 제1 크로마토그래피 매질과 상기 제2 크로마토그래피 매질은 층상으로 배치된다. 층상 크로마토그래피 매질의 적절한 구현예들을 아래에서 보다 상세하게 서술하기로 한다.
본 발명의 상세한 설명
개시되어 있는 크로마토그래피 매질은 표면적이 큰 성형 또는 다공성 섬유로부터 유도된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 성형 섬유는 소섬유화(fibrillated) 또는 융기형(ridged) 구조를 나타낸다. 특정 구현예에 따른 고표면적 섬유의 예로는 Allasso Industries, Inc.(Raleigh, NC)가 시판하고 있는 "윙형(winged)" 섬유가 있다. 윙형이거나 매우 다공성일 수 있는 적합한 섬유는 그램당 약 1 내지 14 평방미터의 표면적을 나타낸다.
본 명세서에는 또한 양이온 교환 또는 음이온 교환 작용기를 제공하는 표면 펜던트 작용기를 예를 들어 고표면적 섬유에 첨가하는 방법으로 유도체화되는 섬유상 물질이 개시되어 있다. 상기 펜던트기는 단클론 항체(mAb)와 같은 생체분자의 이온 교환 크로마토그래피 정제를 위해 유용하다.
본 명세서에 개시되어 있는 크로마토그래피 교환 물질은 표면적이 적어도 1-14 m2/g 범위로 높고 또한 표면에 작용기, 즉 적어도 음이온 교환기, 양이온 교환기 또는 소수성 상호작용 작용기를 가진 기를 포함하는 부직 고분자 섬유를 포함하되, 상기 작용기들은 혼합되거나 그대로 동일한 섬유의 표면에 부착될 수 있고 서로 다르게 관능화된 섬유들은 서로 조합 또는 혼합될 수 있다. 수행된 관능화에 따라 본 발명의 물질은 이온 교환 물질로서 음이온 교환 또는 양이온 교환 흡착제이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 관능화된 크로마토그래피 교환 물질은 이온기에 의해 이미 관능화되어 있는 동일한 섬유의 표면 또는 별도의 섬유의 표면에 소수성 상호작용 작용기를 포함할 수 있다.
이는 본 발명의 크로마토그래피 교환 물질이 서로 다른 작용기를 가진 섬유를 포함하거나 서로 다른 작용기를 가진 섬유의 혼합물을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 물질들은 배합되어 크로마토그래피 매질 내 서로 다른 작용기가 균등하게 분포된 혼합물을 제공한다. 상기 크로마토그래피 매질의 조성은 특정 용도의 서로 다른 2개 유형의 섬유의 상대량을 변경하여 조절할 수 있다. 예를 들어, 50% 음이온 교환 섬유(AEX 섬유)와 50% 양이온 교환 섬유(CEX 섬유)로 구성된 특정 용도의 크로마토그래피 매질을 생성할 수 있다. 또 다른 예에서, 서로 다른 용도의 특정 분리 요구에 대처하기 위해서 25% AEX 섬유 및 75% CEX 섬유로 구성된 크로마토그래피 매질을 생성할 수 있다.
이와 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 물질은 서로 다른 층이 동일한 섬유로 제조되거나 각 층이 서로 다른 작용기를 가질 수 있는 층상 구조를 갖는다. 이에 따라, 서로 다른 작용기를 가진 층들이 적층될 수 있다. 이들 층은 특별한 순서로, 경우에 따라 여러 번 적층되거나 동일한 작용기를 가진 층들이 여러 번 직접 연속적으로 반복되어 원하는 층 두께를 만든다.
상기 크로마토그래피 교환 물질을 형성하는 섬유는 8 내지 32개의 심부 채널을 가진 경량의 윙형 섬유 또는 다공성이 큰 섬유를 기재로 하는 1-14 m2/g 범위의 큰 표면적을 가진 섬유이다. 상기 윙형 섬유는 공압출에 의해 제조하여 균일하고 직선형 에지를 가진 윙 사이에 8 내지 32개의 심부 채널을 특징으로 하는 코어를 형성할 수 있다. 크로마토그래피 교환 물질로서 다공성이 큰 섬유를 사용할 수도 있다. 일반적으로, 0.5 mm 내지 5 cm 범위의 길이를 가진 섬유가 본 발명의 크로마토그래피 교환 물질용으로 사용된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 크로마토그래피 교환 물질은 0.5 mm 내지 2.5 cm 범위의 길이를 갖는 섬유로 구성된다. 0.5 mm 내지 2 mm 범위의 길이를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 교환 물질이 특별히 바람직하다.
상기 크로마토그래피 교환 물질이 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 메틸 메타크릴레이트, (히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리(프로필렌글리콜)모노메타크릴레이트, (페닐)메타크릴레이트, (n-부틸)메타크릴레이트, (n-헥실)메타크릴레이트, 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)와 폴리아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머로 제조한 섬유를 포함하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에 개시되어 있는 크로마토그래피 교환 물질에 의해 체액의 분리와 정제 공정에 있어서 특성이 크게 개선된 신규한 장치를 제조할 수 있다. 따라서 이에 따른 장치도 본 발명의 대상이다. 실험에 의해 상기 섬유가 폴리아미드, 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 폴리프로필렌(PP)으로 제조된, 특히 섬유가 아크릴계 모노머로 유도체화되어 있는 크로마토그래피 교환 물질을 포함하는 장치가 특히 적합하다는 것이 밝혀졌다. 상기 아크릴계 모노머는 2-히드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 아크릴아미드, 아크릴산, 아크릴로니트릴, 메틸 메타크릴레이트와 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 아크릴계 모노머는 유도체화를 위해 그 자체로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 섬유가 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 또는 2-히드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA)와 글리시딜 메타크릴레이트(GMA)의 조합으로 유도체화되어 있는 적절한 장치가 특별히 바람직하다. 본 발명에 따르면, 이들 장치는 바람직하게는 경우에 따라 작용기를 포함하는 화합물 또는 리간드와의 반응에 의해 변형된 이러한 유도체화된 섬유를 사용하여 제조한다. 상기 작용기는 아미노, 카르복실, 히드록실, 에폭시, 술포프로필, 술폰산과 술프하이드릴기로부터 선택된다.
상기 신규 장치는 매우 저렴한 섬유와 공정을 이용하여 제조할 수 있기 때문에 일회용 장치로 제조할 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 생물학적 시료로부터 표적 물질을 분리하기 위한 방법으로서,
a) 표적 물질을 함유한 시료를 제공하는 단계;
b) 상기 시료를 본 명세서에 개시되어 있는 크로마토그래피 교환 물질과 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 표적 물질을 고표면적 섬유에 결합되도록 하여 시료로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법이다.
후속 단계(d)에서는 단계(c)의 시료를 회수하거나 단계(d)에서 단계(c)의 시료를 회수하고, 다음 단계(e)에서는 부직 섬유상 물질에 결합된 표적 물질을 부직 물질을 통해 표적 물질과 섬유 간 결합을 방해하는 용리액으로 용출함으로써 섬유로부터 표적 물질을 분리한다. 본 방법의 특정 구현예에 있어서, 상기 부직 물질을 시트로 압축시키거나 칼럼에 충전 및 압축시킨다.
본 방법은 표적 물질이 단백질, 펩티드, 지질, DNA 분자, RNA 분자, 유기 분자, 무기 분자, 세포, 바이러스, 박테리아, 독소 또는 프리온인 분리 공정에 특히 적합하다.
상술한 바와 같이, 상기 크로마토그래피 매질은 성형 섬유로부터 유도될 수 있다. 특정 구현예에 있어서 상기 성형 섬유는 소섬유화 또는 융기형 구조를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이들 융기형 구조는 일반 섬유와 비교시 섬유의 표면적을 크게 증가시킬 수 있다. 이에 따라 섬유 직경을 감소시키지 않으면서 고표면적이 얻어지는데, 이로 인해 전형적으로 층 투과율이 크게 감소하고 이에 따라 유속 감소가 나타난다.
특정 구현예에 따른 고표면적 섬유의 예로는 Allasso Industries, Inc.(Raleigh, NC, Allasso Winged FiberTM)가 시판하고 있는 "윙형" 섬유가 있다. 이들 섬유는 나일론으로 제조된 것으로 매우 가볍고 그램당 1 내지 14 평방미터 범위에서 동일한 총 표면적을 갖고 있다. 이들 섬유는 특수 설계한 스핀팩(spinpack)을 통해 공압출되는 성형 코어 폴리머와 희생 폴리머를 포함하고 있다. 상기 코어는 균일한 직선형 에지를 가진 윙 사이에 8 내지 32개의 심부 채널을 특징으로 한다. 쉬이스(sheath) 폴리머는 섬유 형성 중에 채널을 채우고 최종 생성물을 마무리하는 중에 용해된다.
앞서 이미 언급한 바와 같이, 다공성이 큰 섬유 또한 본 발명에 적용 가능하다.
최근에 단클론 항체(mAb)와 같은 생체분자의 크로마토그래피 정제는 이온성 및 소수성 상호작용을 모두 포함하는 상기 섬유상 재료의 혼합 작용기를 활용하면 단순화된 조건에서 진행될 수 있지만 결과는 향상될 수 있음이 밝혀졌다.
이에 따라, 예를 들어 CEX, AEX 또는 소수성 상호작용 작용기를 제공하는 표면 펜던트 작용기를 고표면적 섬유에 첨가하는 방법이 개발되고 있다.
적절하게 관능화된 고표면적 섬유를 제조하기 위해서 나일론으로 제조된 Allasso Winged Fibers를 적용할 수 있을 뿐 아니라 그램당 적어도 1 내지 14 평방미터 범위의 높은 표면적을 나타내는 다른 섬유들도 사용할 수 있다. 예를 들어 다공성이 큰 섬유 또한 적용할 수 있다. 이러한 섬유는 S. Megelski et al. Macromolecules 2002, 35, 8456-8466에 개시되어 있고 폴리스티렌, 폴리카보네이트 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)로부터 방사된다. 그러나 이를 위해 폴리에스테르, 폴리프로필렌(PP), 메틸 메타크릴레이트, 히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리(프로필렌 글리콜)모노메타크릴레이트, (페닐)메타크릴레이트, (n-부틸)메타크릴레이트, (n-헥실)메타크릴레이트, 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 폴리아미드의 적절한 섬유도 사용할 수 있다. 바람직한 일군의 섬유는 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)로 제조된다.
이들 개질된 고표면적 섬유를 사용함으로써, 펜던트 AEX 및 CEX 리간드를 가진 섬유 기반의 크로마토그래피 매질을 사용하는 또 다른 정제 모드를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 AEX 섬유와 CEX 섬유 매질 모두를 배합하여 단일 장치에 충전한다. 이 방식은 작업 단순성과 이러한 방안에 의한 프로세스 템플릿(process template) 압축 가능성 면에서 유리하다.
또 다른 구현예에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피용 섬유 매질을 구성하는데 유리한 특성들이 밝혀졌다. 이러한 유형의 섬유 매질은 단 하나의 크로마토그래피 칼럼이 제공되고 서로 다른 2가지 유형의 섬유 크로마토그래피 매질이 상기 크로마토그래피 칼럼 내 개별 층으로 배치되어 있는 소위 "탠덤(tandem) 크로마토그래피"용으로 유용하다.
이 특별한 배치는 제1 층에 배치되어 있는 CEX 섬유 매질을 사용하는 결합/용리 정제 및 이후 용출과 동일한 크로마토그래피 칼럼 또는 다른 적합한 장치 내 제2 층에 배치되어 있는 상술한 HIC 섬유 매질을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 후속 정제에 의해 단클론 항체 공급 흐름을 정제하는 용도로 적합하다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 유형의 섬유 기반의 이온 교환 물질의 혼합층을 조합하면 서로 다른 예기치 않은 장점을 갖는 것으로 밝혀졌다. 특히, 다양한 이온 교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 리간드 작용기를 가진 섬유 매질은 층상 구조로 쉽게 배치할 수 있는 반면에, 비드 기반의 시스템에 의해서는 상기 방식을 쉽게 달성할 수 없다.
혼합층 크로마토그래피는 재조합 세포로부터 유래된 치료용 단백질의 정제용으로 특히 유력한 방법인데, 이들 공급원이 매우 다양한 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물을 함유하고 있기 때문이다. 이들 단백질 불순물은 단일 유형의 크로마토그래피 매질만을 사용할 때 저농도에서 제거하기 특히 어렵다. 하나의 방안은 서로 다른 여러 흡착제를 일련의 칼럼에 배치하는 것이다. 그러나 이는 하류 공정의 불용 체적(dead volume)과 복잡성을 현저히 증가시킬 것이다. 서로 다른 흡착제 매질을 단일 장치 내에서 조합하면 서로 다른 불순물을 단일 단계로 제거할 수 있다.
예기치 않게도 AEX 관능화 섬유 매질과 CEX 관능화 섬유 매질로 구성된 혼합층 크로마토그래피 장치는 항체 용출액으로부터 잔류 HCP의 유수식 제거에 매우 효율적이다. 상기 혼합 섬유층은 양전하와 음전하를 띤 HCP를 제거할 수 있다. 관능화 섬유의 상대적으로 낮은 비용으로 인해 이들을 1회 사용하는 일회용으로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 표면 개질된 크로마토그래피 매질을 하우징, 단일 크로마토그래피 칼럼 또는 다른 적합한 크로마토그래피 장치 내에서 분리형 밴드로 적층하면 분리 및 정제 결과가 개선된다. 상기 "적층"은 먼저 매질을 칼럼에 가하고 더 높은 밀도로 압축하여 매질의 하층을 형성함으로써 이루어진다. 이어서, 제2 층을 칼럼에 가하고 매질을 더 높은 밀도로 압축하여 상층을 형성할 수 있다. 마지막으로, 적층된 매질을 크로마토그래피 칼럼 또는 다른 적절한 크로마토그래피 장치 상에 상부 유동 분배 헤더를 설치함으로써 가장 높은 제3의 밀도로 압축할 수 있다. 서로 다른 리간드, CEX 리간드(예를 들어 실시예 3에 개시되어 있는)와 소수성 상호작용 크로마토그래피 리간드(예를 들어 실시예 6에 개시되어 있는)를 가진 2가지 유형의 섬유 기반 크로마토그래피 매질을 포함하는 층상 칼럼을 포함하는 단일 칼럼을 제공할 수 있는데, 이는 2개의 분리 직교(orthogonal) 모드를 제공한다. 도 2에는 제2 층의 HIC 섬유 매질의 상부에 위치해 있는 제1 층의 CEX 섬유 매질을 제공하는 "탠덤 크로마토그래피"용 층상 매질 칼럼이 개시되어 있다. 이 방식은 예를 들어 먼저 포스트-단백질 A 용출 풀(pool)(mAb 공급물)을 층상 칼럼 상부에 가함으로써 단클론 항체 공정 흐름의 정제에서 이용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, mAb 공급물은 전도도가 낮고(전형적으로 3 mS/cm) 적절한 완충 시스템으로 조정한 후에 pH 5를 갖는다(도 2). 이 mAb 공급물을 칼럼에 로딩하면 먼저 CEX 섬유 매질층과 만나 mAb가 이온 교환 상호작용에 의해 섬유 매질에 결합한다. 상기 섬유 매질을 적절한 완충액으로 세척하여 미결합 HCP, DNA 또는 다른 불순물들을 제거한다. 세척 후, 높은 전도도(30-1000 mS/cm, pH 5)의 용리 완충액을 칼럼에 가하여 CEX 층으로부터 mAb를 용출시킨다. 용출된 mAb가 HIC 섬유 매질이 차지하고 있는 칼럼의 구역으로 이동하고 mAb는 소수성 상호작용에 의해(CEX 매질층으로부터 용출을 위해 사용한 완충액의 높은 이온 강도로 인한) HIC 매질에 결합한다. 상기 섬유 매질은 이온 강도가 높은 적절한 완충액으로 재세척하여 칼럼의 HIC 섬유 매질 부분으로부터 모든 미결합 HCP 또는 다른 불순물들을 제거한다. 마지막으로, 낮은 이온 강도(3 mS/cm, pH 5)의 용리 완충액을 칼럼에 가하여 HIC 층으로부터 mAb를 용출시킨다. 이 단계 이후 단리된 mAb 생성물은 전도도가 낮으며 후속 AEX 기반의 폴리싱 작업을 위해 pH를 단지 약간 조정할 필요가 있다.
도 2는 하기 단계를 포함하는 탠덤 크로마토그래피(CEX 매질 및 HIC)에 의한 mAb 정제의 일례로서 상술한 분리 공정의 개략적인 흐름도이다:
i. 포스트-단백질 A mAb 로딩(전도도 3 mS, pH 5)
ii. 생성물 mAb를 상부 CEX 매질층으로부터 용출하지만 하부 HIC 매질층에 결합시키는 고염(high salt) mAb 용출(전도도 30-1000 mS, pH 5)
iii. 낮은 이온 강도의 용리액으로 용출시켜 생성물 mAb를 하부 HIC 매질층으로부터 용출시키는 저염 mAb 용출(전도도 3 mS, pH 5).
다음, 용출된 mAb을 용액 전도성 감소를 위해 희석할 필요 없이 후속 AEX 폴리싱 작업을 준비한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에 기재되어 있는 해결방안은 일회용 포맷을 포함하고 낮은 재료비로 실시할 수 있는 저가의 mAB 분리 공정을 제공한다. 이 외에도, 액체의 양을 계속하여 감소시키고 pH값과 전도도를 조정하면서 서로 다른 칼럼과 여과 장치에서 실시하여야 했던 서로 다른 공정 단계를 결합 부위로 기질의 대류 이동이 일어나는 단일 칼럼에서 실시하는 하나의 과정으로 압축된다.
고표면적 섬유의 표면 관능화는 2단계 공정에 의해 이루어질 수도 있다. 적합한 관능화 방법은 WO 2012/015908 A에 개시된 바와 같은 그래프팅 중합이다. 이러한 관능화는 펜던트 알릴기를 섬유 표면, 예를 들어 폴리아미드인 NyIon6으로 제조된 윙형 섬유의 표면에 부착시키는 것으로 시작된다. 이때 상기 섬유를 50℃에서 12시간 동안 수산화나트륨 수용액이 존재하는 상태에서 알릴 글리시딜 에테르로 처리한다. 상기 섬유 표면의 관능화의 제1 단계는 위에서 언급한 특허출원에 개시된 대로 실시하거나 에피클로로히드린 또는 (메트)아크릴 글리시딜 에스테르와 같은 서로 다른 적합한 모노머에 의해 변화된 조건에서 실시할 수 있다. 다음, 펜던트 알릴기는 펜던트 아크릴 아마이드 폴리머 작용기에 대한 부착점으로서 섬유 표면상의 고정 부위 역할을 한다. 아크릴아미드 모노머의 용액 중합을 위한 조건이 제공되고 섬유 표면상의 펜던트 알릴기는 용액 중에서 성장하는 폴리머 사슬에 부착된다. 이에 따라, 이어서 알릴 관능화 섬유를 2-아크릴이미도-2-메틸-1-프로판 술폰산, N,N-디메틸아크릴이미드와 암모늄 퍼술페이트의 수용액으로 약 4시간 동안 약 80℃에서 처리할 수 있다. 상기 온도로 가열시 퍼술페이트 분해는 아크릴 모노머의 자유 라디칼 중합을 개시한다. 이 반응에서는 술폰산기를 포함하는 양이온 교환 물질이 얻어진다. 이들 조건에서, 섬유 표면상의 펜던트 알릴기는 펜던트 아크릴계 폴리머 작용기에 대한 부착점 역할을 할 수 있고 아크릴계 폴리머는 섬유 표면에 공유 결합된다.
고표면적 섬유의 표면 개질을 위해 세륨 이온 산화환원 그래프팅 중합을 이용할 수도 있다. 이들 조건에서 산은 HNO3일 수 있고 Ce(VI) 이온은 (암모늄 세륨(IV) 니트레이트)와 같은 염에 의해 제공된다. 이 경우, 반응 시간은 훨씬 더 짧고 온도는 낮아진다.
일반적으로 세륨 이온 산화환원 그래프팅 반응은 Mino and Kaizerman [Mino, G, Kaizerman, S. J. Polymer Science 31, 242-243 (1958)과 J, Polymer Science 38, 393-401 (1959)]에 따라 진행되는데, 이는 질산 수용액에서 수행된다. 이 반응은 수용액에 용해성인 모노머로 실시할 수 있다. 수용성 모노머를 사용할 수 있다면, 디옥산 또는 테트라히드로푸란과 같은 적절한 가용화제에 의해 용해도가 개선될 수 있다.
후속 반응 단계에서는 예를 들면 폴리(글리시딜 메타크릴레이트)로 변형된 표면 관능화 섬유는 상기 관능화 섬유를 메탄올 중 50 wt% 트리메틸아민 용액(수성)과 단순 혼합하여 음이온 교환 물질로 전환시킬 수 있다.
적절하게 조정한 그래프팅 반응과 적절한 반응물의 사용에 의해, 가교되지 않고 다양한 작용기를 보유한 폴리머 사슬을 사용 섬유의 표면에 공유 결합시킬 수 있다.
용어 "작용기"는 활성, 가수분해성, 수화성, 수소 결합을 형성시키는 이온 형성성(이온화성) 전하 보유(양이온 또는 음이온)기와 같은 포괄적인 용어이다. 이러한 작용기에 대한 예에는 -OH 및/또는 -CO- 및/또는 -NH2 및/또는 -SO3 - 및/또는 -SO4 - 및/또는 -PO4 - 및/또는 -SO2Cl 및/또는 -NH4 + 및/또는 -CONH 및/또는 -CHO 및/또는 -COOH 및/또는 -COO- 및/또는 SH가 있다.
이에 따라 음이온 교환 크로마토그래피용으로 적합한 작용기의 예를 들면 4급 히드록시프로필디에틸아미노에틸-, 4급 트리메틸아미노에틸-, 또는 디에틸아미노에틸기와 같은 4급 암모늄기가 있다. 작용기의 이온 해리도에 따라 음이온 교환기를 강염기, 중염기 또는 약염기 음이온 교환 물질로 분류할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 사용 섬유를 산성기를 가진 양이온 교환 물질로서 관능화한다. 양이온 교환 크로마토그래피용으로 적합한 작용기는 예를 들면 술포메틸-, 술포프로필- 또는 카르복시메틸기이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피용으로 적합한 기는 예를 들면 단백질과 약한 상호작용을 제공하는 에테르와 메틸 리간드와 같은 알킬 및 아릴 리간드 또는 부틸 또는 옥틸 리간드, 페닐 또는 보다 강력한 상호작용을 보이는 그 외 다른 아릴 리간드이다.
적어도 하나의 수소원자를 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 부틸렌 연결부(bridge) 또는 적절한 알콕시 또는 아릴을 통해 간접적으로 작용기로 치환할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 상기 작용기는 적합한 그래프트 폴리머에 의해 사용 섬유의 표면에 결합될 수 있다. 일반적으로, 그래프트 중합은 적합한 개시제가 존재하는 상태에서 공지의 방법에 따라 실시되는데, 상기 개시제는 세륨(IV) 이온(질산암모늄: (NH4)2Ce(NO3)6), 세륨(IV) 술페이트, 세륨 암모늄 술페이트, 철(II)-과산화수소(Fe2+-H2O2: 펜톤(Fenton) 시약), 코발트(III) 아세틸아세토네이트 착염, Co(II)-칼륨 모노퍼술페이트, 나트륨 술피트-암모늄 퍼술페이트와 같은 산화환원 개시제이거나 아조비스이소부티로니트릴(C8H12N4: AIBN), 칼륨 퍼술페이트(K2S2O8: KPS), 암모늄 퍼술페이트((NH4)2S2O8: APS)와 벤조일 퍼옥사이드(C14H10O4: BPO)와 같은 자유 라디칼 발생제일 수 있다.
예를 들어, 그래프트 중합은 적합한 세륨(IV) 염의 아크릴산과 메타크릴산과 같은 산성 모노머를 사용하여 진행할 수 있다. 이러한 모노머 산을 메틸메타크릴레이트, 메틸아크릴레이트와 아크릴로니트릴과 같은 중성 모노머와 상대적으로 낮은 비율로라도 조합하는 경우에는 섬유 상에서 그래프팅이 매우 쉽게 일어날 수 있다. 얻어진 그래프트 공중합체는 약산성, 고용량의 양이온 교환 물질이다.
사용 섬유 및 유도체화를 위해 사용한 모노머의 화학적 속성에 따라 서로 다른 반응과 메커니즘이 일어날 수 있고 적절한 표면 개질을 위한 가능한 방안은 다음과 같다:
- 원자 전달 라디칼 중합(ATRP)
- UV 개시 자유 라디칼 중합
- 열 개시 자유 라디칼 중합
- 음이온 중합
- 양이온 중합
- 감마 개시 자유 라디칼 중합
- 전이 금속 촉매 중합
- 가역적 첨가 분절 연쇄 이동 중합(RAFT)
그래프트 중합을 실시하기에 적합한 다양한 모노머가 있다. 생성 물질의 원하는 성질에 따라 서로 다른 모노머를 사용할 수 있다.
그래프트 촉수(tentacle)에 양전하를 도입하기 위하여 다음과 같은 군으로부터 모노머를 선택할 수 있다:
2-(아크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드,
3-(아크릴로일아미노-프로필)트리메틸암모늄 클로라이드,
2-(디에틸아미노에틸)아크릴아미드,
2-(디에틸아미노에틸)메타크릴아미드,
2-(디메틸아미노에틸)아크릴-아미드,
2-(디메틸아미노에틸)메타크릴아미드,
3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드,
3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드,
3-(디에틸아미노프로필)아크릴아미드,
3-(디에틸아미노프로필)메타크릴아미드,
2-(메트-아크릴로일아미노에틸)트리메틸암모늄 클로라이드,
3-(아크릴로일아미노-프로필)트리메틸암모늄 클로라이드,
N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 히드로클로라이드,
[3-(메타크릴로일아미노)프로필]디메틸(3-술포프로필)암모늄 히드록사이드 내염(inner salt),
2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트,
2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트,
2-아미노에틸 메타크릴레이트 히드로클로라이드,
2-(디이소프로필아미노)에틸 메타크릴레이트 및
2-(tert-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트.
다음과 같은 군으로부터 선택되는 모노머를 사용함으로써 촉수에서 음전하를 발생시킬 수 있다:
2-아크릴아미도-2-메틸프로판-술폰산,
2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰산 나트륨염 용액,
2-아크릴아미도에탄술폰산,
카르복시메틸아크릴아미드,
카르복시에틸아크릴아미드,
카르복시프로필아크릴아미드,
카르복시-메틸메타크릴아미드,
카르복시에틸메타크릴아미드,
카르복시프로필-메타크릴아미드,
아크릴산,
메타크릴산 및
3-술포프로필 메타크릴레이트 칼륨염.
한편, 다음과 같은 군으로부터 선택되는 모노머를 사용하여 소수성 기를 생성된 촉수에 도입한다:
N-벤질-2-메틸아크릴아미드,
N-이소프로필메타크릴아미드,
N,N-디메틸메타크릴아미드,
N,N-디에틸메타크릴아미드,
메틸 메타크릴레이트,
에틸 메타크릴레이트,
히드록시에틸 메타크릴레이트,
프로필 메타크릴레이트,
n-부틸 메타크릴레이트,
이소부틸 메타크릴레이트,
sec-부틸 메타크릴레이트,
tert-부틸 메타크릴레이트,
헥실 메타크릴레이트,
라우릴 메타크릴레이트,
이소보닐 메타크릴레이트,
벤질 메타크릴레이트,
1-나프틸 메타크릴레이트,
2-나프틸 메타크릴레이트,
2-에틸헥실 메타크릴레이트,
시클로헥실 메타크릴레이트,
3,3,5-트리메틸시클로헥실 메타크릴레이트,
페로세닐메틸 메타크릴레이트 및
페닐 메타크릴레이트.
당업자라면 이와 관련하여 모노머로서 제공될 수 있고 생성된 폴리머 사슬에 적절한 양전하 또는 음전하를 도입하기에 적합한 본 명세서에 열거된 것들 이외에 더 많은 적합한 화합물들을 알고 있다.
본 발명에 따른 분리 물질을 제조하기에 적합한 섬유는 임의의 길이와 직경을 가질 수 있고 바람직하게는 컷(cut) 또는 스테이플(staple) 섬유 또는 부직포이다. 이들은 일체형 구조로서 서로 결합할 필요는 없지만 개별 분리체로서 효과적으로 제공될 수 있다. 이들은 실과 같이 연속적인 길이 형태 또는 부정형 길이의 모노필라멘트일 수 있거나 또는 이들은 예를 들면 섬유상 재료(예. 스테이플 섬유)를 절단함으로써 더 짧은 개별 섬유로 형성되거나 또는 연속적인 길이의 섬유를 개별 조각으로 절단하고 결정 성장법 등에 의해 형성되는 부직포 또는 직포로서 형성될 수있다. 바람직하게 상기 섬유는 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 열가소성 우레탄, 폴리스티렌, 코-폴리에스테르 또는 액정 폴리머와 같은 열가소성 폴리머로 제조된다.
본 명세서에 기재된 목적을 위해 바람직하게 사용되고 밀집체를 형성하지 않는 섬유는 섬유 단면적의 가장 넓은 치수보다 훨씬 더 큰 길이를 갖는다. 바람직하게는 이들 섬유는 수 밀리미터 내지 수 센티미터 범위의 길이를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 사용 섬유는 0.5 mm 내지 5 cm 범위의 길이를 가지며, 0.5 mm 내지 2.5 cm 범위의 길이를 갖는 적당한 섬유가 더욱 적합하다. 약 0.5 mm 내지 2 mm 범위의 길이를 갖는 섬유가 특히 적합하다.
특정 구현예에 있어서 상기 섬유는 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 단면 길이와 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 단면 폭을 갖는다. 하나의 적합한 섬유는 약 20 ㎛의 단면 길이와 약 10 ㎛의 단면 폭을 갖는다. 바람직하게 상기 섬유는 약 10-20 ㎛의 단면 길이를 갖는다.
특정 구현예에 있어서, 상기 섬유 단면은 일반적으로 본체 영역이 실질적인 종축을 한정하고 상기 본체 영역으로부터 복수 개의 돌출부가 반경 방향 외측으로 연장되어 있는 윙형이다. 상기 돌출부는 섬유의 길이를 따라 연장되어 있는 동일 선상 채널들의 어레이를 형성하는데, 전형적으로 이러한 채널은 섬유당 2-30개이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 돌출부의 길이는 본체 영역의 길이보다 짧다. 특정 구현예에 있어서, 상기 섬유 단면은 일반적으로 중간 영역이 섬유의 중심을 지나는 종축을 포함하고 복수 개의 돌출부가 상기 중간 영역으로부터 연장되어 있는 윙형이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 복수 개의 돌출부는 일반적으로 중간 영역으로부터 반경 방향으로 연장되어 있다. 이러한 구성의 결과로서, 상기 돌출부에 의해 복수 개의 채널이 한정된다. 돌출부 간 적절한 채널 폭은 약 200 내지 약 1000 나노미터의 범위이다. 그 개시 내용이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허공개 2008/0105612에는 적합한 섬유가 개시되어 있다.
적어도 1 m2/g 내지 약 14 m2/g 범위 또는 그 이상의 표면적을 가진 섬유가 적합하다. 또한 바람직하게는 적어도 20 m2/g의 표면적, 보다 바람직하게는 적어도 25 m2/g의 표면적, 더욱 바람직하게는 30 m2/g의 표면적을 가진 섬유가 적합하다. 이는 다공성이 큰 섬유뿐 아니라 윙형 섬유에도 적용된다. 이에 따라 상기 범위의 표면적을 가진 섬유가 바람직하게 사용되지만, 훨씬 더 큰 표면적을 가진 섬유도 본 발명에 따른 분리 재료를 제조하기 위해 적용될 수 있다.
적합한 섬유로 그 개시 내용이 본 명세서에 참고로 인용되는 미국 가출원 62/044,630에 기재되어 있는 것과 같은 다공성 섬유를 포함한다.
다공성 섬유는 높은 표면적을 가질 수 있지만, 공극은 그래프트 중합에 의해 관능화가 이루어지는 크기를 갖는 것이 필요하나 추후 분리 공정에서 유효성과 접근 가능성은 제한되지 않는다. 또한 이들 다공성 섬유는 안정성이 필요한 분야에서 중요하므로 이들은 압축된 크로마토그래피 칼럼에서 사용하기에 적합하다.
특정 구현예에 있어서, 상기 섬유는 적절한 포트와 치수를 가진 장치 또는 용기에 압축하여 쉽게 충전시킬 수 있어 제품은 사용할 준비가 되어 있기 때문에 사용자가 충전할 필요가 없다. 상기 섬유는 부직포 산업에서 보편적인 스펀본드(spunbond)(연속 필라멘트) 또는 습식(wet-laid)(컷 섬유) 공정에 의해 만들어진 부직포 시트 원료와 같은 전-성형(pre-form) 층 구성으로 사용할 수도 있다. 적절한 전성형 섬유 구성으로는 시트, 매트, 웹, 모노리스(monolith) 등이 있다.
상기 성형 섬유 매질은 그의 형태구조적 속성에 의해 다공성 크로마토그래피 비드에 비해 소정의 장점을 제공한다. 전형적으로 비드 기반의 크로마토그래피에서는 분리 공정의 율속 단계는 피흡착물(용질)이 다공성 비드 깊이 침투하는 것으로서 확산에 의해 제어되며; 단백질과 같은 거대 분자인 경우에 이러한 확산 이동은 상대적으로 느릴 수 있다. 본 명세서에 개시되어 있는 고표면적 섬유의 경우에 결합 부위는 주로 섬유의 외부에 노출되므로 유동 흐름에 있는 피흡착 분자가 쉽게 접근된다. 이러한 방안에 의해 제공되는 빠른 이동으로 인해 짧은 체류 시간(높은 유속)이 가능하게 되어 모의 이동층 시스템 등과 같은 수단에 의한 매질의 신속한 사이클링을 가능하게 한다. 처리 속도는 생물학적 물질의 생산에 있어 중요한 파라미터이기 때문에, 본 명세서에 기재되어 있는 섬유 기반의 크로마토그래피 매질은 기존의 비드 기반의 매질에 비해 특별한 공정상의 이점이 있다.
1-5 cm의 층 높이에서 약 0.1-0.4 g/ml, 바람직하게는 약 0.32 g/ml의 적정한 칼럼 충전 밀도는 크로마토그래피 평가에서 허용 가능한 성능을 위한 충분한 유동 균일성을 제공할 것이다. 본 명세서에 개시되어 있는 구현예들의 표면 관능화 섬유 매질은 충전 층 구성에서 높은 투과율을 보인다.
본 명세서에 기재되어 있는 새로운 표면 관능화 섬유 매질의 특별한 장점은 범용성이다. 사용 섬유와 이들의 유도체화에 따라 예를 들면 단백질, 특히 단백질 A, 펩티드, 지질, DNA 분자, RNA 분자, 유기 분자, 무기 분자, 세포, 바이러스, 박테리아, 독소 또는 프리온과 같은 다양한 표적 분자의 분리와 정제가 가능하다. 특히 체액에 적용되는 분리 공정에서 본 명세서에 기재되어 있는 물질의 특성이 특히 유리하고 효과적임을 알 수 있다.
약어:
AEX
음이온 교환 크로마토그래피 매질
aq.
수성
ArlS-ArlR
스타필로코커스 아우레우스에서 독성 유전자 발현의 조절 인자인 2성분계
CEX
양이온 교환 크로마토그래피 매질
CHO
중국 햄스터 난소
CV
칼럼 체적
DI
탈이온수
DNA
데옥시리보핵산
DSP
하류 공정
Fab
단편 항원-결합(Fab 단편)은 항원에 결합하는 항체의 영역임.
Fe 영역
항체의 분류에 따라 2 또는 3개의 불변 도메인을 구성하는 2개의 중쇄로 구성되는 (단편, 결정성) 영역
GMA
글리시딜 메타크릴레이트
HCP
숙주 세포 단백질
HIC
소수성 상호작용 크로마토그래피
IgG
분류 G의 항체(면역글로불린)인 면역 글로불린 G(IgG) 또는 감마 글로불린,
LRV
"로그 제거값". 상기 용어는 정화 단계의 공급물 내 불순물의 질량 대 생성물 풀 내 불순물의 질량비의 로그(밑수 10)를 의미함.
mAb
단클론 항체
Q-관능화
4급 암모늄(Q)에 의한 표면 관능화
도 1: 결합-용리 크로마토그래피 정제 단계와 후속의 유수식 폴리싱 단계를 포함하는 DSP를 이용하는 표준 mAb 정제도.
도 2: 하기 단계를 포함하는 탠덤 크로마토그래피(CEX 매질 및 HIC)에 의한 mAb 정제를 가진 분리 공정의 개략적인 흐름도.
i. 포스트-단백질 A mAb 로딩(전도도 3 mS, pH 5)
ii. 생성물 mAb를 상부 CEX 매질층으로부터 용출하지만 하부 HIC 매질층에 결합시키는 고염 mAb 용출(전도도 30-1000 mS, pH 5)
iii. 낮은 이온 강도의 용리액으로 용출시켜 생성물 mAb를 하부 HIC 매질층으로부터 용출시키는 저염 mAb 용출(전도도 3 mS, pH 5).
도 3: 유수식 정화 후 실시예 5에 기재된 매질(AEX 섬유, CEX 섬유 및 AEX와 CEX 매질의 배합물)을 사용하여 mAb04 Protein A 공급물로부터 HCP 제거율을 나타내는 막대그래프.
도 4: 0.4 M 세륨(IV) 암모늄 니트레이트가 존재하는 상태에서 선택된 반응성 메타크릴계 모노머((히드록시에틸)메타크릴레이트, 폴리(프로필렌글리콜)-모노메타크릴레이트, (페닐)메타크릴레이트, (n-부틸)메타크릴레이트, (n-헥실)메타크릴레이트))에 의한 윙형 나일론 섬유 매질의 개질 표면.
도 2: 하기 단계를 포함하는 탠덤 크로마토그래피(CEX 매질 및 HIC)에 의한 mAb 정제를 가진 분리 공정의 개략적인 흐름도.
i. 포스트-단백질 A mAb 로딩(전도도 3 mS, pH 5)
ii. 생성물 mAb를 상부 CEX 매질층으로부터 용출하지만 하부 HIC 매질층에 결합시키는 고염 mAb 용출(전도도 30-1000 mS, pH 5)
iii. 낮은 이온 강도의 용리액으로 용출시켜 생성물 mAb를 하부 HIC 매질층으로부터 용출시키는 저염 mAb 용출(전도도 3 mS, pH 5).
도 3: 유수식 정화 후 실시예 5에 기재된 매질(AEX 섬유, CEX 섬유 및 AEX와 CEX 매질의 배합물)을 사용하여 mAb04 Protein A 공급물로부터 HCP 제거율을 나타내는 막대그래프.
도 4: 0.4 M 세륨(IV) 암모늄 니트레이트가 존재하는 상태에서 선택된 반응성 메타크릴계 모노머((히드록시에틸)메타크릴레이트, 폴리(프로필렌글리콜)-모노메타크릴레이트, (페닐)메타크릴레이트, (n-부틸)메타크릴레이트, (n-헥실)메타크릴레이트))에 의한 윙형 나일론 섬유 매질의 개질 표면.
표:
표 1: 층 깊이와 칼럼 체적, 압력과 유속, 투과율과 속도를 고려하여 AEX 섬유, CEX 섬유 또는 AEX와 CEX 섬유의 혼합물로 충전시킨 칼럼의 특성.
표 2: 특성, 유수, 섬유에 mAb 로딩, mAb 회수, HCP 농도와 HCP의 LRV를 고려하여 AEX 섬유 매질, CEX 섬유 매질과 배합 AEX/CEX 섬유 매질 칼럼을 이용한 mAb에 대한 유수식 정제 데이터.
본 기재내용에 의해 당업자라면 본 발명을 포괄적으로 적용할 수 있다. 따라서 추가 설명이 없어도 당업자는 가장 넓은 범위에서 상술한 내용을 활용할 수 있을 것이라고 예상된다.
명확하지 않은 것이 있으면, 인용 간행물과 특허문헌을 참고해야 함은 물론이다. 따라서 이들 문헌은 본 발명의 개시 내용의 일부로서 간주된다.
본 발명을 더 잘 이해하고 설명하기 위해서, 본 발명의 보호범위 내에서 실시예를 아래에 제시한다. 이들 실시예는 또한 가능한 변형예를 설명하기 위해 제공된다. 그러나 기재되어 있는 본 발명의 원리의 보편적인 타당성으로 인해 본원의 보호범위를 실시예로만 축소하는 것은 적합하지 않다.
또한 제시된 실시예와 나머지 기재내용 모두에서 조성물 내 존재하는 성분량은 항상 조성물 총량 대비 최대 100 중량% 또는 몰% 이하까지만 첨가되고 제시된 퍼센트 범위로부터 더 높은 값이 나타날 수 있더라도 이를 초과할 수 없음은 당업자에게 자명하다. 달리 명시하지 않는 한, % 데이터는 예를 들면 혼합물 중에서 소정의 부피비로 사용되는 용매를 제조하기 위한 용리액과 같은 경우에 부피 데이터로 나타낸 비를 제외하고는 중량% 또는 몰%이다.
청구범위뿐 아니라 실시예와 상세한 설명에 제시되어 있는 온도는 항상 ℃ 단위이다.
실시예
실시예
1
미변성 나일론 섬유의 그래프트 중합
10 g의 Allasso 나일론 섬유와 물(466 ml)을 500 ml 병에 첨가한다. 14 ml의 1M HNO3(14.4 mmol)을 반응 혼합물에 첨가한 후, 1 M HNO3(0.480 mmol) 중 1.2 ml의 0.4 M 암모늄 세륨(IV) 니트레이트 용액을 첨가한다. 이 반응 혼합물을 15분 동안 교반한다. 3.39 g의 글리시딜 메타크릴레이트(GMA, 24 mmol)를 첨가한다. 이후, 교반한 반응 혼합물을 1시간 동안 35℃로 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후, 얻어진 고체를 DI수(3×300 ml)로 세척하고 습윤 물질을 다음 단계에서 즉시 사용한다.
실시예
2
에폭시 관능화 섬유의 Q-관능화(AEX 섬유 매질)
실시예 1의 습윤 GMA 관능화 섬유를 물(500 ml)과 메탄올(500 ml) 중 50 wt% 트리메틸아민(수성)의 용액과 함께 2 L 병에 첨가한다. 이 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한다. 다음, 얻어진 섬유 고체를 0.5 M 황산 중 0.2 M 아스코르브산(3×400 ml), DI수(3×400 ml), 1M 수산화나트륨 용액(3×400 ml), DI수(3×400 ml)와 에탄올(1×400 ml)로 순차적으로 세척한다. 이어서, 상기 물질을 오븐에 넣어 40℃에서 48시간 동안 건조시킨다. 수율: 11.74 g의 백색 섬유상 고체
실시예
3
미변형 나일론 섬유(CEX 섬유 매질)의 그래프트 중합
10 g의 Allasso 나일론 섬유와 물(460 ml)을 1000 ml 병에 첨가한다. 29.8 ml의 1M HNO3 용액(30 mmol)을 반응 혼합물에 첨가한 후, 1 M HNO3(3.00 mmol) 중 0.4 M 암모늄 세륨(IV) 니트레이트 용액 7.46 ml을 첨가한다. 이 반응 혼합물을 15분 동안 교반한다. 다음, 61 g의 3-술포프로필메타크릴레이트 칼륨염(3-SPMA, 250 mmol)을 첨가하고, 얻어진 교반 반응 혼합물을 18시간 동안 35℃로 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후, 각 병의 섬유 고체를 DI수(3×300 ml), 0.5 M 황산 중 0.2 M 아스코르브산(3×300 ml), DI수(3×300 ml), 1M 수산화나트륨 용액(3×300 ml), DI수(3×300 ml)와 에탄올(1×300 ml)로 세척한다. 다음, 제조된 물질을 오븐에 넣어 40℃에서 건조한다.
수율: 11.38g의 백색 섬유상 고체
실시예
4
배합 이온 교환 매질 칼럼 충전
pH 8의 25 mM Tris 중 상기 섬유 매질(표 1 참조)의 슬러리 0.35 g을 6.6 mm ID Omnifit 칼럼에 첨가한다. 상기 섬유 매질을 3.0 cm의 층 깊이로 압축한다(칼럼 체적 1.03 ml, 섬유 충전 밀도 0.35 g/ml). pH 8의 25 mM Tris 완충액을 2.0 ml/분의 유속으로 칼럼을 통해 흐르게 하고 전기 압력 변환기에 의해 칼럼 압력 강하를 측정하여 섬유 층 투과율을 평가한다. 섬유 층 투과율 값 또한 표 1에 제공되어 있다.
| 칼럼 유형 | 매질 유형, 양[g] | 층 깊이[cm] CV[ml] |
압력[PS], 유속[ml/분] |
투과율[mDarcy] 속도[cm/h] |
| AEX 칼럼 | AEX 섬유, 실시예 2, 0.35g | 3.0 cm 1.03 ml |
23.5 PSI 2.0 ml/분 |
185 mDa, 350 cm/h |
| CEX 칼럼 | CEX 섬유, 실시예 3, 0.35g | 3.0 cm 1.03 ml |
20.0 PSI 2.5 ml/분 |
269 mDa, 440 cm/h |
| AEX와 CEX 배합 칼럼 | AEX 섬유, 실시예 2, 0.18g CEX 섬유, 실시예 3, 0.18g |
3.0 cm 1.03 ml |
28.0 PSI 1.9 ml/분 |
144 mDa, 330 cm/h |
실시예
5
AEX 섬유, CEX 섬유 및 AEX와 CEX 매질의 배합물에 의한 mAb04 Protein A 용출액으로터 HCP 제거율 비교
mAb04의 세포 배양물을 깨끗하게 한 다음, Protein A 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 7.2 mg/ml의 농도로 포집하였다. 다음, mAb04 Protein A 용출액의 pH를 보관을 위해 Tris 염기로 pH 5로 조정한 다음, Stericup-GP 0.22 ㎛ Millipore ExpressPLUS 멤브레인(1L, 카탈로그 번호: SCGPU02RE, Millipore Corp, Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과하였다. 이 용액의 pH를 사용 직전에 Tris 염기를 사용하여 pH 7.0로 조정하였다. 다음, 얻어진 용액을 Stericup-GP 0.22 mm Millipore Express PLUS 멤브레인(1 L, 카탈로그 번호 SCGPU02RE, Millipore Corp. Billerica, MA, 01821, USA)을 통해 여과하였다.
실시예 4에 기재된 바와 같이 관능화 섬유를 함유한 3개의 칼럼을 준비하였다. 첫 번째 1 ml 칼럼은 실시예 2의 4급 암모늄 리간드(lot ID # JA7654-163B)로 관능화한 AEX 섬유로 구성하였다. 두 번째 1 ml 칼럼은 실시예 3의 술포네이트 리간드(lot ID # JA7654-131)로 관능화한 CEX 섬유로 구성하였다. 세 번째 1 ml 칼럼은 실시예 2의 4급 암모늄 리간드(JA7654-163B)로 관능화한 AEX 섬유와 실시예 3의 술포네이트 리간드(JA7654-131)로 관능화한 CEX 섬유의 배합물로 구성한바, 이에 대해서는 실시예 4를 참조할 것. 상기 3개의 칼럼을 완충액(pH 7의 25 mM Tris)으로 평형시킨다.
120 ml의 Protein A 용출액 풀을 각 칼럼에 0.33 ml/분의 유속으로 통과시켜 각각의 섬유 충전 칼럼에서 3분의 체류 시간을 제공한다. 각 칼럼으로부터 3개의 40 ml 분획을 포집한다. 칼럼을 통과한 80 ml와 120ml 이후의 용출액 풀 조성을 나타내는 풀 시료를 분석용으로 제공한다. 이 용액들을 숙주 세포 단백질(HCP)과 IgG 농도에 대해 분석한다. 미국, 노스캐롤라이나주 사우스포트 소재 Cygnus Technologies의 카탈로그 번호 F550의 시판용 ELISA 키트를 키트 제작사의 지침에 따라 사용하여 HCP 분석을 수행한다. Poros? A Protein A 분석 칼럼이 장착된 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 IgG 농도를 측정한다. 결과를 표 3과 도 3에 요약하였다.
실험 결과를 통해 AEX와 CEX 섬유를 함유한 혼합층 칼럼을 조합하면 로그 제거값(LRV)이 대략 1.6 LRV인 더 큰 HCP 제거율이 얻어졌음을 알 수 있다. 이는 AEX 섬유만을 함유한 칼럼에서 관찰된 HCP의 약 0.9 LRV와 CEX 섬유만을 함유한 칼럼에서 관찰된 HCP의 약 0.6 LRV를 넘는 것이다. 상기 2개의 섬유의 배합물을 사용한 칼럼에 의해 HCP의 양이 더 많이 제거된 것은 상기 배합물이 HCP를 흡착할 수 있는 상이한 특성의 서로 다른 2개의 리간드를 갖고 있기 때문인 것으로 보인다. 상기 AEX 관능화 섬유는 그의 표면상에 음전하를 띤 영역을 가진 불순물에 결합할 수 있는데, 이는 등전점이 낮은 단백질에 전형적인 것이다. 상기 CEX 관능화 섬유는 그의 표면상에 양전하를 띤 영역을 갖는 불순물에 결합할 수 있는데, 이는 등전점이 높은 단백질에 전형적인 것이다.
| 유수식 트레인(train) | 섬유에 mAb 로딩[kg/l] | mAb[g/l] | mAb 회수 | HCP[ng/ml] | HCP[ppm] | HCP의 LRV |
| 미처리 | - | 7.20 | - | 1876 | 261 | - |
| AEX 섬유 | 0.54 | 7.15 | 99% | 223 | 31 | 0.92 |
| AEX 섬유 | 0.82 | 7.16 | 99% | 242 | 34 | 0.89 |
| CEX 섬유 | 0.54 | 6.67 | 93% | 476 | 71 | 0.57 |
| CEX 섬유 | 0.82 | 6.82 | 95% | 494 | 72 | 0.56 |
| AEX 섬유와 CEX 섬유의 배합물 | 0.54 | 6.97 | 97% | 38 | 5 | 1.68 |
| AEX 섬유와 CEX 섬유의 배합물 | 0.82 | 7.03 | 98% | 47 | 7 | 1.59 |
도 3: 실시예 5에 기재되어 있는 매질을 사용하여 유수식 정제 후 mAb04 Protein A 공급물로부터 HCP 제거율.
실시예
6
소수성 상호작용 크로마토그래피 리간드를 가진 섬유 매질
상기 본문에 기재되어 있는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질은 실시예 1과 3에 기재되어 있는 섬유 표면 개질 과정과 메타크릴레이트 모노머 또는
메틸 메타크릴레이트,
히드록시에틸메타크릴레이트,
폴리(프로필렌글리콜)모노메타크릴레이트,
(페닐)메타크릴레이트,
(n-부틸)메타크릴레이트,
(n-헥실)메타크릴레이트를 포함하는 군으로부터 선택되는 다른 중합성 작용기를 사용하여 제조할 수 있다:
실시예 1과 3에 기재되어 있는 세륨 이온 산화환원 중합 과정을 이용하여 Allasso 나일론 섬유 매질의 표면을 본 실시예에 개시되어 있는 반응성 메타크릴계 모노머로 직접 개질할 수 있다(도 4 참조). 그래프팅 중합과 적절한 세척 과정(또한 실시예 1과 3에 기재되어 있음) 후, 섬유 매질은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 적합한 소수성 리간드 작용기를 보인다. 이후, 상기 매질을 크로마토그래피 칼럼 또는 상기 본문에 기재되어 있는 탠덤 크로마토그래피용 다른 장치에 로딩할 준비를 한다.
도 4: 본 발명의 섬유 매질에 적합한 HIC 리간드의 선택 및 Allasso 나일론 섬유 매질의 표면에 부착하기 위한 공정
i: 실시예 1과 3에서 이용한 표면 개질 과정을 따라 35℃에서 18시간 동안 (하이드록시에틸)메타크릴레이트, 폴리(프로필렌글리콜)모노메타크릴레이트, (페닐)메타크릴레이트, (n-부틸)메타크릴레이트, (n-헥실)메타크릴레이트를 포함하는 군으로부터 선택되는 메타크릴레이트 모노머, Allasso 나일론 섬유, 0.4 M 세륨(IV) 암모늄 니트레이트, 질산, 물을 사용하는 Allasso 섬유 매질 표면 개질
실시예
7
소수성 상호작용 크로마토그래피용 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트) 리간드로 개질한 섬유 매질
히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA, 1.69 g, 13 mmol)과 물(232.5 ml)을 500 ml 병에 첨가한다. 다음, 이 용액에 5.00 g의 Allasso 나일론 섬유(Winged fiber™)를 첨가한다. 이 반응 혼합물에 1M HNO3 용액(7.21 ml, 7.2 mmol)을 첨가한 후 1M HNO3(0.601 ml, 0.240 mmol) 중 암모늄 세륨(IV) 니트레이트의 0.4 M 용액을 첨가한다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 35℃로 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후, 얻어진 고체를 0.5 M 황산 중 0.2 M 아스코르브산의 용액(3×100 ml), DI수(3×100 ml), 1M 수산화나트륨 용액(3×100 ml), DI수(3×100 ml)과 에탄올(1×100 ml)로 세척한다. 상기 물질을 오븐에 넣어 40℃에서 12시간 동안 건조시킨다. 수율: 백색 섬유상 고체로서 5.58 g.
Claims (34)
- 대상 생체분자와 불순물을 분리하여 생물학적 시료를 정제하기 위한 방법으로서,
시료를 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용을 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유로 이루어진 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계와
세척하여 미결합 종을 제거하거나 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 방법으로서:
a) 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료를 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계,
c) 상기 제1 섬유 매질을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계,
d) 상기 제1 섬유 매질을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계,
e) 상기 대상 생체분자를 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
f) 상기 제2 섬유 매질을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계, 및
g) 상기 제2 섬유 매질을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계를 포함하되, 단 단계 b)와 e)에서는 서로 다르게 관능화된 섬유 매질들을 사용하는 방법. - 제2항에 있어서, 단계 b)에서 상기 시료를 음이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 접촉시키고 단계 e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용하는 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 b)에서 상기 시료를 양이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 접촉시키고, 단계 e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용하는 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 b)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용하고, 단계 e)에서 상기 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 b)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기를 가진 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질을 사용하고, 단계 e)에서 상기 이온 교환 크로마토그래피가 양이온 교환 크로마토그래피인 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 b)에서 상기 제1 크로마토그래피 매질이 음이온 교환 크로마토그래피이고, 단계 e)에서 상기 제2 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 크로마토그래피인 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 b)에서 상기 제1 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 크로마토그래피이고, 단계 e)에서 상기 제2 크로마토그래피 매질이 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
- 대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 방법으로서,
a) 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료를 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질의 혼합물과 접촉시키는 단계,
c) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계, 및
d) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계를 포함하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질이 음이온 교환 크로마토그래피이고 상기 제2 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 크로마토그래피이거나 그 반대인 방법.
- 대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 방법으로서:
a) 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료를 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질의 혼합물과 접촉시키는 단계,
c) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계, 및
d) 상기 크로마토그래피 매질의 혼합물을 세척하여 상기 대상 생체분자를 추출하는 단계를 포함하는 방법. - 제11항에 있어서, 상기 제2 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
- 섬유의 충전층을 포함하는 하우징으로서; 상기 충전층이 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 층과 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 층을 가진 하우징.
- 제13항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피인 하우징.
- 섬유의 충전층을 포함하는 하우징으로서; 상기 충전층이 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 층과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 층을 가진 하우징.
- 제15항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피인 하우징.
- 섬유의 충전층을 포함하는 하우징으로서; 상기 충전층이 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질의 혼합물을 가진 하우징.
- 제17항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피인 하우징.
- 대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 방법으로서, 시료를 제공하고, 상기 시료를 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제1 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제2 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질이 음이온 교환 섬유인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질이 음이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 섬유인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하는 방법.
- 대상 생체분자와 불순물을 포함하는 시료를 정제하기 위한 방법으로서:
시료를 제공하고, 상기 시료를 이온 교환 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제1 섬유를 포함하는 제1 크로마토그래피 매질과 소수성 상호작용 크로마토그래피를 가능하게 하는 작용기가 표면에 부여된 제2 섬유를 포함하는 제2 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법. - 제25항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질이 양이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질이 소수성 상호작용 크로마토그래피 섬유인 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질이 음이온 교환 섬유이고 상기 제2 크로마토그래피 매질이 소수성 상호작용 크로마토그래피 섬유인 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 제1 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 제1 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 제1 작용기가 유수식 모드로 정제를 가능하게 하고 상기 제2 작용기가 결합/용리 모드로 정제를 가능하게 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질과 상기 제2 크로마토그래피 매질을 혼합물로 배치하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질과 상기 제2 크로마토그래피 매질을 층상으로 배치하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질과 상기 제2 크로마토그래피 매질을 혼합물로 배치하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 매질과 상기 제2 크로마토그래피 매질을 층상으로 배치하는 방법.
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