KR20170066454A - 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 조성물, 백신 및 방법이 기재되어 있다. 하나 이상의 바이러스성 발현 벡터와 단리된 항원성 폴리펩티드의 이종 백신 조합은 하나 또는 복수의 HIV 군에 의한 감염에 대해 강한 방어 면역을 유도하였다.

Description

인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물{Methods and Compositions for Inducing Protective Immunity Against Human Immunodeficiency Virus Infection}
관련 출원에 대한 참고 사항
이 출원은 2014년 9월 26일에 출원된 미국 가특허출원 제62/056,059에 대해 35 U.S.C. § 119 (e)에 의거 우선권을 받을 권리가 있으며, 그 개시 내용이 본 명세서에 참고로 인용된다.
연방 정부 후원 연구 또는 개발에 관한 설명
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여된 허가 번호 AI078526 및 AI096040로 정부의 지원으로 기획되었다. 정부는 본 발명에 대해 확실한 권리를 갖는다.
전자적으로 제출 된 서열에 대한 참고 사항
이 출원은 생성일자가 2015년 9월 15일이고, 크기가 47 kB인 파일 이름이 "688097-53WO 서열 목록"인 ASCII 형식의 서열로 EFS-웹을 통해서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고 있다. 서열은 EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 본 명세서에 그 전체가 참고로 인용된다.
본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염에 대한 방어 면역성(protective immunity)을 유도하는 조성물, 백신 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 바이러스 발현 벡터와 HIV의 하나 이상의 클레이드(clades)에 의한 감염에 대한 방어 면역성을 유도하기 위한 절연 항원 폴리펩티드의 이종 결합 백신에 관한 것이다.
인간 면역 결핍 바이러스(HIV)는 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치며, HIV의 예방은 널리 항 레트로 바이러스 치료의 시대에 매우 높은 우선 순위로 남아 있다. 미국에서, 질병 통제 센터 (CDC)는 모든 HIV 양성 미국 거주자의 약 1/5이 그들의 상태를 인지하지 못하는 것으로 추정하고, 이 작은 비율은 매년 새로운 감염의 절반을 전염시킬 책임이 있다 [2]. 전세계적으로 신속한 진단과 치료의 격차는 훨씬 더 크다.　　2010 년 말에, 약 34,000,000명은 전 세계적으로 HIV와 함께 살고 있었으며, 2001 년 대비 17 % 증가하였다. 새로운 HIV 감염의 대부분은 사하라 사막 이남의 아프리카에서 계속 발생하지만, CDC는 미국에서 2,008 ~ 2,011 사이에 HIV 감염의 연간 발생률은 매년 40,000 번 이상의 새로운 감염, 약 15 ~ 16/100,000에서 안정을 유지한 것으로 추정되었다. 따라서, 장내 CD4 풀(pool)[3]의 파괴와 높은 전염 위험성[4] 모두를 포함해서 진단하기 전에 HIV 감염을 예방하거나 초기 영향을 둔화시키는 안전하고 유력한 HIV 백신을 찾는 것이 긴급한 세계 보건의 우선 순위이다.
완전히 효과적인 백신은 다른 그룹에서 HIV-1 변종을 중화할 수 있는 강력한 세포 반응과 광범위한 중화 항체 모두를 유도할 수 있을 것으로 예상된다.
또한, 최근의 임상 연구에서는 비-중화 Env-특이성 항체는 특이성 서브타입의 항체 기능과 연결된 일부 방어 능력을 가질 수 있다는 것을 보여주고 있다 [9]. 광범위한 중화 항체는 바이러스성 엔벨로프(viral envelope)의 고도로 보존된 영역에 대해 유도된다.　최근까지, 대부분의 항 HIV 백신은 가용성 형태로 존재하는 gp160, gp41 또는 gp120과 같은 정제된 HIV항원 단백질을 사용하였다.　　대부분의 Env 단백질계 단량체는 면역원(immunogens)은 결합 항체를 유도하는 단량체 엔벨로프 분자이지만, 강력한 중화 항체는 유도하지 않는다. 이것은 부분적으로 중화 항체가 바이러스성의 엔벨로프 단백질의 천연, 삼량체 구조에서 3급 및 4 급 에피토프(epitope)를 인식한다는 사실에 기인한다. 또한, 대부분의 Env-계 면역원은 세포 매개 반응을 유도하지 않는다. HIV-1 Env의 안정화된 삼량체가 생체 내에서 HIV-1에 대해 중화 항혈청을 광범위하게 유도한다는 것이 보고되었다. 예를 들면, US 2012/0045472 참조.
약독화 생백신(Live attenuated vaccines)은 SIV 감염을 예방하기 위한 약독화 생말라리아 면역결핍 바이러스 (SIV) 기반의 백신과 같은 특이성 바이러스 질환에 대해 인간 및 비인간 영장류(NHP)에서 매우 효능이 있는 것으로 입증되었다. 불행히도 살아있는 약독화 HIV와 관련된 안전 위험 때문에 이러한 전략은 HIV 인간 백신에 적용할 수 없다.
강력한 세포 반응 및 광범위한 중화 항체 모두를 유도하기 위해, 약독화된 생바이러스 백신의 대안으로서 생체 내에서 HIV 항원 단백질 유전자를 발현하는데 재조합 벡터가 사용되어 왔다. 복제 능력이 없는 재조합 바이러스 벡터의 사용은 백신 및 다른 형태의 유전자 치료법에 대해 연구되어 왔다. 특히, 복제 능력이 없는 재조합 아데노바이러스 벡터, 특히 아데노바이러스 혈청형 2 및 5 (Ad2 및 Ad5)는 백신 접종을 포함해서 유전자 전달 분야에 대해 광범위하게 연구되어 왔다. 이러한 복제 능력이 없는 Ad5 벡터계 백신은 다양한 동물 모델에서 방어 면역 반응을 이끌어 내었지만 HIV 및 기타 병원균에 대한 재조합 Ad5 벡터계 백신의 유용성은 인간 집단에서 발생하는 Ad5 특이성 중화 항체(NAbs)의 높은 혈청 수준에 의해 제한될 수 있다 [17]. 예를 들어 전 세계적으로 4,381 명의 대상자의 혈청 역학 연구에서 Ad5 NAb 역가는 사하라 사막 이남 아프리카에서 거의 보편적이며, 고 역가이며 Ad5 NAb 역가가 >200 를 보이는 대다수에서 관찰되었다 [14].
재조합 Ad5 벡터계 백신에 기초한 백신을 사용하여 복수의 HIV-1 백신 유효성 시험이 수행되었다. 이 연구에는 HVTN 502/STEP (Merck Ad5), HVTN 503/Phambili (Merck Ad5) 및 HVTN 505 (NIH VRC DNA/Ad5) HIV-1 백신 유효성 시험이 포함되어 있다. 그러나 비 복제 Ad5 및 DNA/Ad5 백신을 사용하는 세 가지 HIV-1 백신 유효성 연구 모두 HIV-1 감염에 대한 효능을 나타내지 않았다. 또한, Merck Ad5 백신 접종 대상 환자에서 플라세보와 비교해서 STEP 연구에서 HIV-1 감염이 증가하는 추세가 관찰되었다. 에이즈 백신에 대한 아데노바이러스 서브타입 5와 같은 복제 능력이 없는 벡터에 대한 현재까지의 경험은 실망스럽고, 여러 가지 효능 시험에서 이점을 나타내지 못했다 [5-8].
Ad5 벡터, 특히 STEP 연구 [8, 10]의 안전성에 관한 관심은 바이러스성 백신 벡터와 같은 대체 혈청형으로부터 생물학적으로 실질적으로 상이한 Ad 벡터의 탐색을 유도하였다 [11-13]. Ad5에 대한 대안적인 아데노바이러스 혈청형의 한 예는 아데노바이러스 혈청형 26 (Ad26)이다. Ad26은 사람에게서 비교적 흔하지 않은 바이러스이며, 다른 종에서는 복제할 수 없다. 다른 개체군에서의 아데노바이러스에 대한 복수의 조사에서 거의 분리되지 않은 것으로 밝혀졌으며 심지어 고립되었을 때도 증상과 거의 연관되지 않았다. 실험적인 예방 접종은 마찬가지로 심각한 감염에 대한 증거를 거의 보여주지 못했다. 문헌 [14], [27] - [43] 참조. 따라서, Ad26이 건강한 성인에서 임상 증상을 유도한다는 관찰 연구에서의 증거는 없으며, Ad26 챌린지 연구의 실험 데이터는 또한 장내 Ad26 감염이 증상을 나타내지 않는다고 제안했다 [44]. 복제가 결핍된 아데노바이러스 벡터 rAd26은 Ad5 E1 보체 세포주에서 고 역가로 성장할 수 있으며[11], 이 벡터는 프라임-부스트 백신 전략(prime-boost vaccine strategies)에서 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다 [11,21]. 또 다른 대안은 아데노바이러스 혈청형 35에서 유래된 복제가 결핍된 아데노바이러스 벡터인 rAd35이다. rAd35 벡터는 임상용 백신 생산에 적합한 세포주에서 고 역가로 성장하며, 주사용과 안정한 흡입 용 분말로 제형화되었다[62].
이러한 대안적인 아데노바이러스 벡터는 인간 수지상 세포의 효율적인 형질도입을 나타내며 [63,22], 따라서 높은 레벨의 항원 전달 및 제시를 매개하는 능력을 갖는다.
최소한 수용체의 사용, 생체 친화성, 수지상 세포와의 상호 작용, 선천성 면역 프로필, 적응 면역 표현형, 붉은 털 원숭이의 SIV에 대한 방어 효능의 측면에서, Ad26는 Ad5와 생물학적으로 매우 다른 것으로 입증되었다 [11, 12, 15, 19-22]. 또한, 사람에서의 복제되지 않은 Ad26 벡터의 안전성 및 면역원성(immunogenicity)이 입증되었다 (ClinicalTrials. GovNCT01215149). 또한, Ad5와 Ad26 사이의 유익한 생물학적 차이의 많은 부분, 예를 들어 인간의 혈청 평형도가 낮고, 중화 항체가가 낮다는 것도 Ad5 Ad26 사이에 존재한다.
백신 바이러스의 복제-결핍 균주인 변형된 백시니아 앙카라(Vaccinia Ankara(MVA)) 바이러스는 또한 HIV 항원 단백질의 재조합 발현을 위한 바이러스 벡터로서 사용되어 왔다. 예를 들어, US 20110159036, US 8197825 등을 참조. MVA는 포크비리다에 (Poxviridae)의 계열에서 올소폭시바이러스 (Orthopoxvirus) 속의 일원인 백시니아 바이러스와 관련이 있다. 폭시바이러스 세포질 내 (intracelltoplasmic) 발현 때문에 CD8 T 세포 반응의 좋은 유도 인자로 알려져 있다. 그러나, 이들은 일반적으로 CD4 MHC 클래스 II 제한 T 세포를 생성하는데 열악하다고 여겨진다. 예를 들어 [64] 참조.
복제 - 무능 바이러스 벡터의 하나의 가능한 단점은 바이러스 벡터로부터 숙주에 전달되는 표적 유전자의 발현이 벡터의 투여 후에 감소할 수 있다는 것이다. 숙주에서 복제되거나 증식할 수 없기 때문에, 바이러스 벡터는 유전자 발현을 증가시키는데 사용될 수 있는 새로운 복제물을 생성할 수 없으며, 따라서 바이러스 벡터의 재 투여가 필요하다. 동일한 아데노바이러스 혈청형이 숙주에 재 투여되는 경우, 숙주는 그 특정 아데노바이러스 혈청형에 대한 중화 항체를 생성시켜서 혈청형 항-아데노바이러스 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 혈청형 특유의 항-아데노바이러스 반응은 바이러스 벡터의 효과적인 재 투여를 방지하여 백신 또는 유전자 전달 비히클로서 덜 효과적이게 한다.
따라서, HIV 감염에 대한 방어 면역성을 유도하는데 사용될 수 있는 개선된 백신에 대한 필요성이 본 기술 분야에서 존재한다. 이러한 백신은 바람직하게는 투여가 간단하고, 장기간 작용하며, 부작용이 적다. 더 나아가 세계 여러 지역에서 가장 빈번하게 발생하는 HIV 전파 유형의 광범위한 다양성에 대해 효과적일 것이다.
본 발명은 HIV 항원을 암호화하는 복제 무능 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터와 단리된 HIV 항원 단백질의 조합이 HIV의 하나 이상의 그룹에 대한 증가된 방호 면역을 유도한다는 발견에 부분적으로 기초한 것이다.
따라서, 본 발명의 하나의 일반적인 측면은 이를 필요로하는 대상자에서 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조합물에 관한 것으로,
(i) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 1 조성물;
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원성 폴리펩티드와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 2 조성물; 및
(iii) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 항원 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 발현 벡터,
여기서, 제 1 및 제 2 조성물 중 하나는 면역화를 프라이밍(priming)하기 위한 것이고, 다른 조성물은 면역화를 부스팅(boosting)하기 위한 것이며, 면역원적으로 유효한 양의 추가의 발현 벡터는 면역화를 프라이밍하거나 부스팅하기 위해서 제 2 조성물에 존재하거나 또는 제 2 조성물과 함께 투여될 제 3 조성물에 존재한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 백신 조합물의 단리된 항원성 폴리펩티드는 HIV 엔벨로프 당 단백질 및 바람직하게는 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 단리된 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터 및 백신 조합물의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26, rAd35, rAd48, rAd5HVR48 벡터 또는 MVA 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 백신 조합물의 제 3 조성물에 존재한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 하나 이상의 추가 발현 벡터에 의해 코딩되는 하나 이상의 항원성 폴리펩티드는 하나 이상의 HIV 모자이크(mosaic) 항원, 보다 바람직하게는 하나 이상의 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원을 포함하며, 보다 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터 및 하나 이상의 추가의 발현 벡터 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 백신 조합물은 각각 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 rAd26 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 1 조성물을 포함한다. SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함하는 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원성 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 2 조성물; 및 SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 및 SEQ ID NO : 4의 아미노산 서열을 갖는 4 개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 MVA 벡터를 포함하는 제 3 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일반적인 측면은 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염에 대한 방어 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 본 발명의 구현예에 따른 백신 조합물에 관한 것으로, 상기 제 1 조성물은 면역 반응을 프라이밍하는데 사용하고, 제 2 조성물과 하나 이상의 추가 발현 벡터의 면역원적으로 유효한 양의 면역 반응을 부스팅하는데 사용된다.
본 발명의 또 다른 일반적인 측면은 본 발명의 구현예에 따른 백신 조합물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일반적인 측면은 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상자에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로,
(i) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 1 조성물을 대상자에게 투여하는 단계;
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원성 폴리펩티드와 약학학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 2 조성물을 대상자에게 투여하는 단계; 및
(iii) 면역워적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 발현 벡터를 대상자에게 투여하는 단계,
여기서, (i) 및 (ii) 단계는 면역화를 프라이밍하기 위한 단계 및 면역화를 부스팅하기 위한 단계 중 어느 하나를 순서대로 수행하며, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터가 제 2 조성물에 존재하거나 면역화를 프라이밍 또는 부스팅하기 위하여 제 2 조성물과 함께 투여된 제 3 조성물에 존재한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 제 1 조성물은 면역화를 부스팅하기 위한 것이며, 제 2 조성물과 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 면역화를 프라이밍하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가의 발현 벡터는 제 3 조성물에 존재한다.
본 발명의 추가의 일반적인 측면은 이를 필요로 하는 대상자에게 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은
(i) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 프라이머(primer) 백신을 대상자에게 투여하는 단계; 및
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원성 폴리펩티드, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 부스터(booster) 백신을 대상자에게 투여하는 단계;
여기서, 단리된 항원성 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가의 발현 벡터가 동일한 조성물 또는 별도의 조성물에 존재하고; 프라이머 백신이 투여된 후에 부스터 백신이 투여되는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 프라이머 백신 및 부스터 백신 중 하나 또는 둘 모두는 면역 반응을 추가로 유도하기 위해 1 회 또는 복수 회 재 투여되고, 프라이머 백신은 부스터 백신이 초기 투여되기 전에 1회 투여 후 재 투여된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단리된 항원성 단백질은 HIV 엔벨로프 당 단백질, 보다 바람직하게는 안정화된 HIV gp140 삼량체 단백질 또는 안정화된 모자이크 gp140 삼량체 단백질과 같은 안정화된 HIV 엔벨로프 당 단백질이고, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 하나 이상의 추가 발현 벡터는 하나 이상의 HIV 모자이크 항원, 보다 바람직하게는 하나 이상의 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원을 코딩하며, 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원을 코딩한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터 또는 추가 발현 벡터는 rAd26, rAd35, rAd48, rAd5HVR48 벡터 또는 MVA 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터이다. 보다 바람직하게는, 면역화를 프라이밍하기 위해 사용되는 하나 이상의 벡터는 면역화를 부스팅하기 위해 사용된 것과 다른 유형의 바이러스로부터 유래된다. 예를 들어, rAd26 또는 rAd35 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터가 면역화를 프라이밍하기 위해 사용되는 경우, 면역화를 부스팅하기 위한 단리된 HIV 항원성 단백질과 함께 MVA 벡터가 사용된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 MVA 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터는 MVA 벡터이고 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 또한 rAd26 벡터이다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에서, 면역화를 프라이밍하기 위해 사용되는 조성물은 각각 SEQ ID NOs: 1, 3 및 4의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항원성 단백질을 코딩하는 rAd26 벡터와; 면역화를 부스팅하기 위해 사용되는 하나 이상의 조성물은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질과 SEQ ID NOs: 1-4의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 항원 단백질을 코딩하는 MVA 벡터를 포함한다. 가장 바람직하게, MVA 벡터는 제 3 조성물에 존재한다.
전술한 요약 및 이하의 본 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 도시된 정확한 구현예에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도면에서:
도 1a 및 1b는 프라이머 백신의 초기 투여후 28주째 및 56주째에 서로 다른 백신 조합물로 백신을 접종한 히말라야 원숭이 (Macaca mulatta) (NHPs)에서 채취한 혈청 샘플에 대한 클레이드(clade) C gp140 엔벨로프(Env) 단백질과 모자이크 엔벨로프(Env) 단백질 효소 연쇄 면역 흡착 분석(ELISA)의 결과를 나타낸 것이고; log10- 형질 전환된 EC90 ELISA 역가가 표시되어 있으며, 기호는 시험된 개개의 동물의 역가를 나타낸 것이고; 수평선은 그룹의 기하 평균 역가를 표시한 것이며 점선은 검출 하한선을 나타낸 것이고; 도 1a: 28주째의 클레이드 C gp140 Env 및 모자이크 Env ELISA 역가; 도 1b는 56주에서의 클레이드 C gp140 Env 및 모자이크 Env ELISA 역가이다.
도 2는 비오틴이 부착된 클레이드 C Env 및 모자이크 Env 항원을 사용하여 비워진 NHP로부터 28 주째에 수득된 혈청 샘플로부터 정제된 면역 글로블린 G (IgG) 항체에 대한 항체 의존성 세포 식균 (ADCP) 분석 결과를 나타낸 것이고; 개개 동물의 식균 점수 반응이 표시되어 있으며; 기호는 검사된 개개 동물의 점수 값을 나타내고, 회색 컬럼은 그룹 기하 평균 역가를 나타낸 것이다.
도 3은 제1열 Env HIV-1 슈도 바이러스에 대해 TZM-b1 세포에서 백신 접종된 NHPs로부터 56 주째에 수득된 혈청 샘플에서의 중화 항체 (nAb) 분석의 결과를 나타낸 것이고; 실험된 제1열 Env HIV-1 슈도 바이러스는 MW965.26 (클레이드 C), SF162.LS (클레이드 B), MN-3 (클레이드 A), DJ263.8 (클레이드 A) 및 BaL.26 (클레이드 B)를 포함하고; 기호는 수평선으로 나타낸 그룹 기하 평균 역가를 갖는 개개의 동물로부터의 log10- 형질 변환된 ID50 (중간 감염 선량) 역가를 나타낸 것이다.
도 4는 글로벌 잠재적 T-세포 에피토프 (PTE) 펩티드 풀을 사용하여 백신접종된 NHPs로부터 54 주째에 수득된 샘플에 대한 IFN-γ 효소 연계 면역 스팟 (ELISPOT) 분석 결과를 나타낸 것이며; 이 결과는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 106 마리당 평균 스폿 형성 단위 (SFU)로 나타내며, 기호는 개개 동물에 대한 값을 나타내고; 수평선은 그룹 기하 평균값을 나타내고, 점선은 검출의 하위 임계 값을 나타낸다.
다양한 출판물, 논문 및 특허들이 발명의 배경 및 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 기술되어 있다. 이들 참조 문헌 각각은 그 전체가 참고 문헌으로 여기에 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등의 논의는 본 발명의 배경을 제공하기 위한 것이다. 그러한 논의는 이러한 사안 중 일부 또는 전부가 공개되거나 청구된 발명과 관련하여 선행 기술의 일부를 구성한다고 인정되지는 않는다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않은 경우, 여기에 사용된 특정 용어는 명세서에 명시된 의미를 갖는다. 여기에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 출판물은 본 명세서에 완전히 기재된 것처럼 참고 문헌으로 포함된다.
본 명세서 및 첨부 된 청구의 범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥 상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것을 알아야 한다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소에서 선행하는 "적어도" 라는 용어는 그 시리즈의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인식할 수 있거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 이하의 청구 범위에서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)" 라는 단어 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 정수 또는 단계의 그룹은 제외하지만 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹은 제외되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "포함하는" 또는 "포함하는" 또는 때로는 용어 "갖는"과 함께 사용될 때 대체될 수 있다.
본 명세서에서 "~로 이루어진다(consisting of)"를 사용할 때 청구항 구성요소에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에 사용될 때, "필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"는 청구항의 기본 및 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 양상 또는 실시 예의 맥락에서 사용될 때마다, "포함하는(comprising)", "포함하는(containing)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"의 전술한 용어 중 어느 것을 본 발명의 양태 또는 실시 형테의 내용에 사용할 경우 개시의 범위를 변경하기 위하여 "구성되는(consisting of)" 또는 "포함하는(consisting essentially of)"의 용어로 대체할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 복수의 요소들 간의 연결 용어 "및/또는"은 개별 옵션 및 결합된 옵션 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소가 없는 첫 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소의 적용될 수 있음을 나타낸다. 이들 옵션들 중 임의의 하나는 의미 내에 포함되는 것으로 이해되고, 따라서 본 명세서에서 사용된 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시킨다. 하나 이상의 옵션에 대한 동시 적용 가능성은 또한 그 의미 내에 해당되므로 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시킨다.
본 명세서에서 사용된 "대상자"는 본 발명의 구현예에 따른 방법에 의해 치료되거나 치료될 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "포유 동물"은 임의의 포유 동물을 포함한다. 포유류의 예로는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그(guinea pigs), 원숭이 또는 유인원과 같은 인간 이외의 영장류 (NHP), 인간 등이 포함되나, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "방어 면역성(protective immunity)" 또는 "방어 면역 반응(protective immune response)"은 백신 접종 대상자가 백신 접종이 수행 된 것에 대해 병원성 물질에 의한 감염을 조절할 수 있음을 의미한다. 일반적으로 "방어 면역 반응"을 보인 피험자는 경증에서 중증도의 임상 증상만 보이거나 증상이 전혀 나타나지 않는다. 대개 특정 제제에 대한 "방어 면역 반응" 또는 "방어 면역성"을 갖는 대상자는 상기 제제에 의한 감염의 결과로 사망하지 않는다.
"아데노바이러스 캡시드 단백질"은 특정 아데노바이러스의 혈청형 및/또는 방향성을 결정하는데 관여하는 아데노바이러스 (예를 들어, Ad26, Ad35, rAd48, rAd5HVR48 벡터)의 캡시드상의 단백질을 지칭한다. 아데노바이러스 캡시드 단백질은 전형적으로 섬유, 펜톤(penton) 및/또는 헥슨(hexon) 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "Ad26 캡시드 단백질" 또는 "Ad35 캡시드 단백질"과 같은 특정 아데노바이러스에 대한 "캡시드 단백질"은 예를 들어 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질의 적어도 일부를 포함하는 키메라(chimeric) 캡시드 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 캡시드 단백질은 Ad26 또는 Ad35의 전체 캡시드 단백질이다. 특정 구현예에서, 헥슨, 펜톤 및 섬유는 Ad26 또는 Ad35이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "동시 전달(co-delivery)" 또는 "함께 투여되는(administered together with)"은 바이러스성 발현 벡터 및 단리된 항원 성 폴리펩티드와 같은 두 성분의 동시 투여를 말한다. "동시 투여(simultaneous administration)"는 적어도 같은 날에 두 구성 요소를 동시에 투여할 수 있다. 2 가지 성분이 함께 투여되는 경우, 이들은 24, 20, 16, 12, 8 또는 4 시간 또는 1 시간 이내에 짧은 시간주기 내에 별도의 조성물로 순차적으로 투여될 수 있거나, 동시에 한 가지 조성물로 투여될 수 있다.
"보강제(adjuvant)" 및 "면역 자극제(immune stimulant)"라는 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 면역계의 자극을 유도하는 하나 이상의 물질로 정의된다. 이와 관련하여, 본 발명의 아데노바이러스 벡터, MVA 벡터 및/또는 항원성 HIV 항원성 폴리펩티드와 같은 본 발명의 발현 벡터 및 항원 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 면역 보강제가 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "감염(infection)"은 질병 유도제에 의한 숙주의 침입을 지칭한다. 질병 유도제는 숙주를 침입하여 숙주 내에서 복제 또는 증식할 수 있을 때 "감염성"이 있는 것으로 간주된다. 감염제의 예는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 및 특정 종의 아데노바이러스, 프리온, 박테리아, 균류, 원생 동물 등의 바이러스를 포함한다.
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 레트로 바이러스 (Retroviridae) 계열의 일부인 렌티비리나 (Lentivirinae) 속의 구성원이다. 두 종의 HIV에 감염된 사람: HIV-1과 HIV-2. HIV-1은 HIV 바이러스의 가장 흔한 균주이며, HIV-2 보다 병원성이 높다. 본 명세서에 사용된 용어 "인간 면역 결핍 바이러스" 및 "HIV"는 HIV-1 및 HIV-2를 의미하지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정의 예시적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 엔벨로프 단백질은 인식되는 렌티바이러스의 5 가지 혈청 그룹 중 임의의 것을 지칭하는데, 즉 영장류 (예: HIV-1, HIV-2, 유사 면역 결핍 바이러스 (SIV)); 양 및 염소 (예: 비사 (visna) 바이러스, 수염성 관절염 뇌염 바이러스); 말 (예; 말 감염성 빈혈 바이러스); 고양이 (예: 고양이 면역 결핍 바이러스 (FIV)); 및 소 (예: 소 면역 결핍 바이러스 (BIV)) (바이러스 설명의 분류학에 관한 국제 위원회 참조).
HIV는 유전적 확산 정도가 높은 복수의 클레이드로 분류된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "HIV 클레이드" 또는 "HIV 서브타입"은 유전적 유사성의 정도에 따라 분류된 관련된 인간 면역 결핍 바이러스를 지칭한다. 현재 HIV-1 균주에는 M, N 및 O의 세 가지 그룹이 있다. 그룹 M (주요 계통)은 A부터 J까지 적어도 10 개의 클레이드로 구성된다. 그룹 O (외부 계통)는 유사한 수의 클레이드로 구성될 수 있다. 그룹 N은 그룹 M 또는 O로 분류되지 않은 새로운 HIV-1 단리물이다. 특정의 예시적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 광범위하게 중화하는 항체가 인식될 것이고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 또는 그 이상의 클레이드 및/또는 2 개 이상의 HIV 그룹에 대해 면역 반응을 일으킬 것이다.
본 발명에서, 이종의 프라임-부스트 조합물, 특히, 하나 이상의 HIV 항원성 단백질을 코딩하는 rAd26과 같은 발현 벡터로 프라이밍 한 후, HIV 엔벨로프 당 단백질과 같은 단리된 HIV 항원성 단백질로 부스팅하되, 바람직하게는 하나 이상의 HIV 항원성 단백질을 코딩하는 rAd26 또는 MVA를 추가로 부스팅하는 것은 하나 이상의 서브타입(subtype)의 HIV에 대한 방어 면역 반응을 발생시키는데 놀라웁게 효과적이다.
HIV 항원성 단백질
본 명세서에서 사용된 용어 "HIV의 항원성 폴리펩티드", "HIV 항원 폴리펩티드", "HIV 항원성 단백질", "HIV 면역성 폴리펩티드" 또는 "HIV 면역원"의 용어는 이를 필요로 하는 대상자에서 HIV에 대한 면역 반응, 예를 들어 체액성 및/또는 세포 매개성 반응을 유도 할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 항원성 폴리펩티드는 면역 반응을 유도하거나 이를 필요로 하는 대상자에서 HIV에 대한 면역, 예를 들어 방어 면역화를 유도할 수 있는 HIV의 단백질, 그의 단편 또는 그의 에피토프, 또는 다중 HIV 단백질 또는 그의 일부의 조합일 수 있다.
바람직하게는, 항원성 폴리펩티드는 바이러스성 질환 또는 감염에 대한 면역 반응을 유도, 및/또는 바이러스성 질환 또는 감염에 대해 대상자(예, 백신 접종)에게 면역력 생성과 같은 방어 면역 반응을 숙주 내에서 일으킬 수 있으며, 바이러스성 질환 또는 감염에 대해 대상자를 보호하게 된다. 예를 들어, 항원성 폴리펩티드는 HIV 또는 SIV 엔벨로프 gp160 단백질, HIV 또는 SIV 매트릭스/캡시드 단백질 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 생성물과 같은 시미안 면역 결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus; SIV) 또는 HIV로부터의 단백질 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항원성 폴리펩티드는 HIV-1 또는 HIV-2 항원 또는 그의 단편일 수 있다. HIV 항원의 예는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 구조 단백질 및 필수 효소를 코드화(encode)하는 gag, pol 및 env 유전자 생성물을 포함한다. Gag, pol 및 env 유전자 생성물은 다단백질(polyprotein)로 합성되어 복수 개의 다른 단백질 생성물로 추가 처리된다. gag 유전자의 1차 단백질 생성물은 바이러스 구조 단백질 gag 다단백질로서, MA, CA, SP1, NC, SP2 및 P6 단백질 생성물로 추가 처리된다. pol 유전자는 바이러스성 효소 (Pol, 폴리메라아제(polymerase))를 코드화하고, 1 차 단백질 생성물은 RT, RNase H, IN 및 PR 단백질 생성물로 추가 처리된다. env 유전자는 구조 단백질, 특히 비리온 엔벨로프의 당 단백질을 코드화한다. env 유전자의 1차 단백질 생성물은 gp160이며, gp120과 gp41로 추가 처리된다. HIV 항원의 다른 예는 유전자 조절 단백질 Tat 및 Rev; 액세서리 단백질 Nef, Vpr, Vif 및 Vpu; 캡시드 단백질, 뉴클레오 캡시드 단백질 및 p24 바이러스성 단백질을 포함한다. 본 발명에 따른 이종의 핵산 서열은 임의의 HIV 항원을 코드화할 수 있고, 바람직하게는 gag, env 및/또는 pol 유전자 생성물 또는 그의 일부를 코드화할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 항원성 폴리펩티드는 HIV Gag, Env 또는 Pol 항원, 또는 Pol 항원, 또는 임의의 일부 또는 이들의 조합, 보다 바람직하게는 HIV-1 Gag, Env 또는 Pol 항원 또는 임의의 일부 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 벡터에 의해 코드화하는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드는 모자이크 HIV 항원이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "모자이크 항원"은 천연 서열의 단편으로부터 조립 된 재조합 단백질을 지칭한다. "모자이크 항원"은 유전 알고리즘을 사용하여 컴퓨터를 통해 생성 및 최적화 될 수 있다. 모자이크 항원은 천연 항원과 유사하지만 면역 반응의 폭과 적용 범위를 향상시키는 자연 서열에서 발견되는 잠재적인 T 세포 항원 결정기의 범위가 최대가 되도록 최적화된다.
본 발명에 따른 모자이크 HIV 항원은 모자이크 Gag-Pol-Env 항원인 것이 바람직하고, 모자이크 HIV-1 Gag-Pol-Env 항원인 것이 더욱 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 "모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원"은 구체적으로 HIV의 Gag, Pol 및 Env 다단백질 서열 중 하나 이상으로부터 유래된 다중 에피토프를 포함하는 모자이크 항원을 말한다. 본 발명에 따른 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원의 에피토프 서열은 천연 HIV 항원의 서열과 유사하지만, 순환하는 HIV 서열에서 발견되는 에피토프의 적용 범위를 개선하기 위해 보다 넓은 범위의 T 세포 에피토프를 제공하도록 최적화된다.
예를 들어, 잠재적인 T- 세포 에피토프의 최대 적용 범위를 제공하기 위해, 모자이크 Gag, Pol 및 Env 항원은 하나 이상의 HIV 클레이드의 최적 범위를 제공하도록 설계된다. 9개의 인접한 아미노산 (9-mer)의 단편의 in silico 재조합 서열 데이터베이스는 실제 단백질과 유사하며, 백신 후보 물질과 글로벌 데이터베이스 간의 9-mer 서열 일치 수를 최대화한다. 모자이크 Gag, Pol 및 Env 항원은 천연 항원과 유사한 도메인 구조를 가지며, 완전히 인공적인 접합이 없는 자연스러운 서열을 구성한다. Pol 항원은 촉매 활성을 제거하기 위해 돌연변이를 함유할 수 있다. 단합체(monomeric) Env gp140 모자이크 항원은 절단 및 융합 활성을 제거하기 위해 포인트 돌연변이를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원은 gag 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프를 갖는 모자이크 HIV Gag 항원이며; pol 유전자 생성물의 서열로부터 유래된 에피토프를 갖는 모자이크 HIV Pol 항원; 또는 env 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프를 갖는 모자이크 HIV Env 항원을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원은 gag, pol 및/또는 env 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프의 조합을 포함한다. 예시적이고 비제한적인 예로는 env 및 pol 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프를 갖는 모자이크 Env-Pol 항원; env 및 gag 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프를 갖는 모자이크 Env-Gag 항원; gag 및 pol 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프를 갖는 모자이크 Gag-Pol 항원; 및 gag 및 env 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프를 갖는 모자이크 Gag-Env 항원을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원은 하나 이상의 클레이드로부터의 gag, pol 및 env 유전자 생성물의 서열로부터 유도된 에피토프의 조합물을 포함한다.
모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원의 예는 예를 들어, US20120076812, Barouch et al., Nat Med 2010, 16 : 319-323 [54]; Barouch et al., Cell 155 : 1-9, 2013 [65] (이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 인용됨)에 기재되어있다.
바람직하게는, 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원은 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 측면에서, 모자이크 HIV 항원은 당 업계에 공지 된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, US20120076812, Fischer et al, Nat Med, 2007. 13 (1): p. 100-6 [53]; Barouch et al., Nat Med 2010, 16: 319-323 [54] (이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 인용됨)에 기재되어 있다.
엔벨로프 당 단백질
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "엔벨로프 당 단백질", "env 당 단백질" 및 "Env"의 각각은 이에 한정하는 것은 아니지만, HIV 비리온의 엔벨로프 표면 및 HIV 감염 세포의 원형질막의 표면 상에서 발현되는 당 단백질 또는 면역 반응을 유도할 수 있거나 또는 이를 필요로 하는 대상자에서 HIV에 대한 면역력을 생성할 수 있는 그의 단편을 지칭한다.
env 유전자는 gp160을 코드화하고, 이는 gp120과 gp41로 단백질 분해적으로 절단된다. 보다 구체적으로, gp160은 (gp160)3로 삼량체화 된 후 두 개의 비공유 결합 단편 gp120 및 gp41로 절단을 겪게 된다. 바이러스 엔트리(viral entry)는 그 뒤에 gp120/gp41 헤테로다이머(heterodimer)의 삼량체에 의해 조정된다. Gp120은 수용체 결합 단편이며, T-헬퍼 세포와 같은 수용체를 갖는 표적 세포에서 CD4 수용체에 결합한다. gp120에 비공유 결합된 Gp41은 융합 단편이며, HIV가 세포로 들어가는 두 번째 단계를 제공한다. Gp41은 원래 바이러스 엔벨로프 내에 묻혀 있지만, gp120이 CD4 수용체에 결합하면, gp120은 그 구조를 변화시켜 gp41이 노출되어 숙주 세포와의 융합을 도울 수 있다. Gp140은 삼량체 gp160의 절단되지 않은 세포외 도메인, 즉, (gp160)3이며, 절단된 바이러스성 스파이크(viral spike)의 천연 상태에 대한 대용물로서 사용되어 왔다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, env 당 단백질 (예: gp160, gp140, gp120 또는 gp41), 바람직하게는 안정화된 삼량체 gp140 단백질을 발현 벡터 단독으로 유도된 면역을 강화시키기 위해 면역화를 프라이밍하거나 부스팅하기 위해 투여할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "안정화된 삼량체 gp140 단백질" 및 "안정화된 삼량체 gp140"은 삼량체 구조의 안정성을 증가시키는 폴리펩티드 서열을 포함하는 gp140 폴리펩티드의 삼량체를 지칭한다. gp140 폴리펩티드는 gp140의 삼량체를 안정화시키는 삼량체화 도메인을 포함할 수 있거나 변형될 수 있다. 삼량체화 도메인의 예로는 T4-피브리딘(fibritin) "폴돈(foldon)" 삼량체화 도메인; GCN4로부터 유래된 코일형 삼량화 도메인 [66]; 삼량체 태그로서 E. coli 아스파 테이트 트랜스카르바모일라제(aspartate transcarbamoylase)의 촉매 서브 유닛(catalytic subunit) [67]을 포함한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 안정화된 삼량체 gp140 단백질은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 안정화된 삼량체 gp140 단백질은 부스팅 면역화로서 또는 바이러스성 발현 벡터와 함께 부스팅 면역화의 구성 요소로서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 안정화된 삼량체 gp140 단백질은 클레이드 C 또는 클레이드 A gp140 단백질이고, 보다 바람직하게는 클레이드 C gp140 단백질이다. 클레이드 C 삼량체 gp140 단백질은 기니피그(guinea pigs)에서 다른 클레이드 및 중화 감도가 다른 HIV-1 변종 세트에 대해 강력한 중화 항체 반응을 유도할 수 있다 [68, 60].
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, "엔벨로프 당 단백질"은 하나 이상의 HIV 클레이드의 하나 이상의 Env 다단백질 서열로부터 유도된 다중 에피토프를 포함하는 모자이크 엔벨로프 단백질이다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 "gp140 단백질"은 하나 이상의 HIV 클레이드의 하나 이상의 gp140 단백질 서열로부터 유도된 다중 에피토프를 포함하는 "모자이크 gp140 단백질"일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 모자이크 gp140 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 모자이크 gp140의 안정화된 삼량체이다.
단리된 gp140 단백질은 아데노바이러스 발현 벡터 또는 MVA 발현 벡터와 함께 전달될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, gp140 단백질 및 Ad26 또는 MVA는 2개의 별개의 제제로서 별도로 또는 단일 제형으로 함께 투여된다. 동시 투여 또는 동시 전달은 동시에, 한 시간 이내에 또는 같은 날에 발생할 수 있다. 또한, gp140 단백질은 보강제로 투여될 수 있다. 적합한 보강제는 예를 들어 인산 알루미늄 또는 사포닌(saponin)계 보강제일 수 있다.
항원성 폴리펩티드는 본 발명의 관점에서 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산 및 단리될 수 있다. 예를 들어, 항원 폴리펩티드는 숙주 세포, 바람직하게는 항원 폴리펩티드의 생산을 위해 최적화된 재조합 숙주 세포로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 재조합 유전자는 절단 및 융합 활성을 제거하기 위한 돌연변이를 포함하는 gp140 단백질, 바람직하게는 대상자(예를 들면, 사람)의 면역화 때(예를 들면, 본 발명의 조성물, 예를 들어 본 발명의 백신에 혼입될 때) 발생된 항 바이러스성 면역 반응(예를 들어 세포성 또는 체액성 면역반응)의 폭, 강도, 깊이 또는 수명이 증가된 최적화된 gp140 단백질을 발현하는데 사용된다. 최적화된 gp140 단백질은 또한 절단 부위 돌연변이, 인자 Xa 부위 및/또는 폴돈 삼량체화 도메인을 포함할 수 있다. 리더(leader)/시그널(signal) 서열은 최대 단백질 발현을 위해 최적화된 gp140 단백질의 N-말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 리더/신호 서열은 일반적으로 소포체의 내강으로 이송되는 동안 초기 폴리펩티드로부터 항상 절단된다. 관심있는 숙주 세포에 적합한 임의의 리더/시그널 서열을 사용할 수 있다. 예시적인 리더/시그널 서열은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단리된 항원성 폴리펩티드는 Nkolola et al 2010, J.Virology 84 (7): 3270-3279 [68]; Kovacs et al., PNAS 2012, 109 (30): 12111-6 [60], WO 2010/042942 및 WO 2014/107744 (이들 모두는 그 전체가 참고 문헌으로 포함됨) 에 기재된 것과 같은 안정화된 삼량체 gp140이다.
아데노바이러스
본 발명에 따른 아데노바이러스는 아데노바이러스의 계열에 속하며, 바람직하게는 Mastadenovirus 속에 속한다. 그것은 인간 아데노바이러스일 수도 있고, 이에 한정하는 것은 아니지만, 소 아데노바이러스 (예: 소 아데노바이러스 3, BAdV3), 개 아데노바이러스 (예: CAdV2), 돼지 아데노바이러스 (예: PAdV3 또는 5) 또는 시미안(simian) 아데노바이러스 (원숭이 아데노바이러스와 침팬치 아데노바이러스 또는 고릴라 아데노바이러스와 같은 유인원 아데노바이러스를 포함)를 비롯한 다른 종을 감염시키는 아데노바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 (HAdV 또는 AdHu) 또는 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스 (ChAd, AdCh 또는 SAdV)와 같은 시미안 아데노바이러스이다. 본 발명에서, 인간 아데노바이러스는 종의 표시없이 Ad로 지칭되는 것을 의미한다. 예를 들어, 약어 표시 "Ad5"는 인간 아데노바이러스 혈청형 5 인 HAdV5와 동일한 것을 의미한다. 또한, "rAd" 표시는 재조합 아데노바이러스를 의미하는데, 예를 들어 "rAd26"은 재조합 인간 아데노바이러스 26을 말한다.
가장 진보된 연구는 인간 아데노바이러스를 사용하여 수행되었으며, 인간 아데노바이러스가 본 발명의 특정 형태에 바람직하다. 특정의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스를 기본으로 한다. 바람직한 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49, 50, 52 등을 기본으로 한다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 아데노바이러스는 혈청형 26 또는 35 중 하나의 인간 아데노바이러스이다. 이들 혈청형의 이점은 인간 개체군에서 낮은 혈청 유병률 및/또는 낮은 선재 중화 항체 역가이다. rAd26 벡터의 제조는 예를 들어 WO 2007/104792 및 Abbink et al., (2007) Virol 81 (9): 4654-63 [11]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. Ad26의 예시적인 게놈 서열은 WO 2007/104792의 GenBank Accession EF 153474 및 SEQ ID NO: 1에서 발견된다. rAd35 벡터의 제조는 예를 들어 미국 특허 제 7,270,811 호, WO 00/70071 및 Vogels et al. (2003) J Virol 77 (15): 8263-71 [12]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. Ad35의 예시적인 게놈 서열은 GenBank Accession AC_000019와 WO 00/70071의 도 6에서 발견된다.
시미안 아데노바이러스는 또한 일반적으로 인간 개체군에서 낮은 혈청 유병률 및/또는 낮은 선재 중화 항체 역가를 가지고 있고, 침팬지 아데노바이러스 벡터를 사용하는 상당량의 연구 보고가 있어 왔다 (예: US6083716; WO2005/071093; WO2010/086189; WO2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13 [13]; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55, [69], Kobinger et al, 2006, Virology 346; 394-401[70]; Tatsis et al, 2007, Molecular Therapy 15: 608-17 [71]; 또한, Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62 [72]; 및 Lasaro와 Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39 [73]에 의한 검토 참조). 따라서, 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 시미안 아데노바이러스 예를 들면, 침팬지 아데노바이러스를 기본으로 한다. 특정 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 시미안 아데노바이러스 유형 1, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 또는 SA7P을 기본으로 한다.
바람직하게는, 아데노바이러스 벡터는 rAd26, rAd35, rAd48, rAd5HVR48 등과 같은 복제 결핍 재조합 바이러스 벡터이다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 2 개의 희귀 혈청형인 Ad26 및 Ad35로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 전형적인 구현예에서, 벡터는 rAd26 또는 rAd35 바이러스이다.
따라서, 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있는 벡터는 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질 (예: 섬유, 펜톤 또는 헥손 단백질)을 포함한다. 이 기술분야의 당업자는 전체 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질이 본 발명의 벡터에서 사용될 필요는 없다는 것을 인식할 것이다. 따라서, Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질의 적어도 일부를 포함하는 키메라 캡시드 단백질이 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에 따른 벡터는 하나 이상의 캡시드 단백질이 Ad26 또는 Ad35로부터 유래된다면, 섬유, 펜톤 및 헥손 단백질이 각각 상이한 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함 할 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 섬유, 펜톤 및 헥손 단백질은 각각 Ad26으로부터 유래되거나 또는 Ad35로부터 유래된다.
당업자는 복수의 혈청형으로부터 유래된 요소가 단일 재조합 아데노바이러스 벡터에서 조합될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 상이한 혈청형으로부터의 원하는 특성을 조합한 키메라 아데노바이러스가 생성될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 아데노바이러스는 온도 안정성, 어셈블리, 앵커링(anchoring), 생산 수율, 방향 전환 또는 개선된 감염, 표적 세포에서의 DNA의 안정성 등과 같은 특성을 갖는 Ad26 및 Ad35 혈청형의 선재 면역의 부재를 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 유용한 재조합 아데노바이러스 벡터는 주로 또는 전적으로 Ad35 또는 Ad26으로부터 유래된다 (즉, 벡터는 rAd35 또는 rAd26이다). 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 예를 들어 게놈의 E1 영역에 결실을 함유하기 때문에 복제가 결핍된다. Ad26 또는 Ad35로부터 유래된 본 발명의 아데노바이러스에 있어서, 아데노바이러스의 E4-orf6 코딩 서열을 Ad5와 같은 인간 서브그룹 C의 아데노바이러스의 E4-orf6와 교환하는 것이 일반적이다. 이것은 예를 들어 293 세포, PER.C6 세포 등과 같은 Ad5의 E1 유전자를 발현하는 잘 알려진 보체 세포주에서 그러한 아데노바이러스의 증식을 허용한다 (예를 들어, Havenga, et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43[61]; WO 03/104467 참조). 그러나, 이러한 아데노바이러스는 Ad5의 E1 유전자를 발현하지 않는 비-보체 세포에서 복제할 수 없다.
특정 구현예에서, 아데노바이러스는 하나 이상의 HIV 항원 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 클론된 E1 영역에서의 결실 및 Ad5의 E4-orf6 영역을 갖는 혈청형 35의 인간 아데노바이러스이다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 클론된 E1 영역에서의 결실 및 Ad5의 E4 orf6 영역을 갖는 혈청형 26의 인간 아데노바이러스이다. Ad35 아데노바이러스의 경우, 아데노바이러스에 E1B 55K 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 3 '말단을 보유하는 것이 일반적이다. 예를 들어 pIX 오픈 리딩 프레임의 166 bp 직접 상류 또는 pIX 개시 코돈(start codon)의 243 bp 단편 직접 상류와 같이 이를 포함하는 단편이 pIX 유전자의 프로모터가 부분적으로 이 영역에 존재하기 때문에 아데노바이러스의 안정성을 증가시키므로 Bsu36I 제한 사이트에 의해 5 '말단에 표기된다 (예를 들어 [61], supra; WO 2004/001032 참조).
재조합 아데노바이러스 벡터의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. rAd26 벡터의 제조는, 예를 들어 WO 2007/104792 및 Abbink et al., (2007) Virol 81 (9) : 4654-63 [11]에 기재되어있다. Ad26의 예시적인 게놈 서열은 WO 2007/104792의 GenBank Accession EF 153474 및 SEQ ID NO: 1에서 발견된다. rAd35 벡터의 제조는 예를 들어 미국 특허 제 7,270,811호 및 Vogels et al., (2003) J Virol 77 (15): 8263-71 [12]에 기재되어 있다. Ad35의 예시적인 게놈 서열은 GenBank Accession AC_000019에서 발견된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명에 유용한 벡터는 WO2012/082918에 기술된 벡터를 포함하며, 이의 개시는 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
일반적으로, 본 발명에서 유용한 벡터는 전체 재조합 아데노바이러스 게놈 (예를 들어, 플라스미드, 코스미드 또는 배큘로 바이러스 벡터)을 포함하는 핵산을 사용하여 생산된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 코드화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 RNA의 형태이거나 또는 클론에 의해 수득되거나 합성적으로 생성된 DNA 형태 일 수 있다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다.
본 발명에서 유용한 아데노바이러스 벡터는 일반적으로 복제가 불완전하다. 이러한 구현예에서, 바이러스는 E1 영역과 같이 바이러스의 복제에 중요한 영역의 결실 또는 불활성화에 의해 복제가 불완전하게 된다. 상기 영역은, 예를 들어 상기 영역 내의 항원 폴리펩티드(보통 프로모터에 연결됨)를 코딩하는 유전자와 같은 관심 유전자를 삽입함으로써 실질적으로 결실되거나 불활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 벡터는 E2, E3 또는 E4 영역과 같이 다른 영역에서의 결실 또는 이들 영역 중 하나 이상의 영역 내의 프로모터에 연결된 이종의 유전자 삽입을 포함할 수 있다. E2- 및/또는 E4-돌연변이 아데노바이러스의 경우, 일반적으로 E2- 및/또는 E4-보체 세포주를 사용하여 재조합 아데노바이러스를 생성시킨다. E3가 복제에 필요하지 않기 때문에, 아데노바이러스의 E3 영역의 돌연변이는 세포주에 의해 보완될 필요가 없다.
패키징(packaging) 세포주는 일반적으로 본 발명에서 사용하기에 충분한 양의 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 사용된다. 패키징 세포는 복제 결핍 벡터에서 결실되거나 불활성화 된 유전자를 포함하는 세포로서, 바이러스가 세포 내에서 복제되는 것이 가능하다. 적합한 패키징 세포주는 예를 들어, PER.C6, 911, 293 및 E1 A549를 포함한다.
상기한 바와 같이, 다양한 HIV 항원성 폴리펩티드가 벡터에서 발현될 수 있다. 필요한 경우, HIV 항원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 이종의 유전자는 처리된 숙주 (예: 인간)에서의 적절한 발현을 보장하기 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈-최적화는 당해 기술분야에 널리 적용되는 기술이다. 일반적으로, 이종의 유전자는 아데노바이러스 게놈의 E1 및/또는 E3 영역에 클론된다.
이종의 HIV 유전자는 아데노바이러스 유래의 프로모터 (예를 들어, 메이저 레이터 프로모터(Major Late Promoter))의 조절하에 있을 수 있거나 또는 이종의 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 적합한 이종의 프로모터의 예로는 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus: CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma virus: RSV) 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 프로모터는 발현 카세트 내의 관심 이종의 유전자의 상류에 위치한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 유용한 아데노바이러스 벡터는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 본 명세서에서 논의된 항원성 폴리펩티드를 포함해서, 당업자에게 공지된 다양한 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 Abbink, J Virol, 2007. 81 (9) : p. 4654-63 [11]에 기재되어 있으며, 참고로 여기에 포함되어 있다.
MVA 벡터
본 발명에 유용한 MVA 벡터는 변형된 백시니아 앙카라 바이러스(Vaccinia Ankara virus)로부터 유래된 감쇠된 바이러스를 이용하며, 이는 인간 세포주에서 생식적으로 복제할 수 있는 능력의 상실을 특징으로 한다. MVA 벡터는 이에 한정하는 것은 아니지만, 본 명세서에서 논의된 항원성 폴리펩티드를 포함해서, 당업자에게 공지된 HIV 항원성 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현할 수 있다.
MVA는 터키, 앙카라의 백신 연구소에서 수년 동안 유지되고 인간의 예방 접종의 기초를 위해 사용되었던 피부 백시니아계 균주인 앙카라 [Chorioallantois vaccinia virus Ankara virus, CVA; 참고로 Mayr et al. (1975), infection 3, 6-14[74]에 의해서 검토됨]의 닭 배아 섬유 아세포 상에 570개 이상의 연속적인 계대에 의해 생성되었다. 그러나, 종종 백신 접종 후, 백신 바이러스와 관련된 합병증으로 인해 더 약독하고 더 안전한 천연두 백신을 만들려는 몇 가지 시도가 있었다.
1960년에서 1974년 사이에 Anton Mayr 교수는 CEF 세포에서 570개 이상의 연속된 계대에 의해 CVA를 감쇠시키는데 성공했다 [74]. 다양한 동물 모델에서 생성된 MVA가 무해하다고 나타났다 [75]. 사전 천연두 백신으로서 MVA의 초기 개발의 일환으로, 우울증으로 인한 부작용 위험이 있는 대상자에 Lister Elstree [77, 78]와 함께 MVA-517을 사용한 임상 시험이 있었다. 1976년에, MVA-571 종자에서 유래된 MVA (571 번째 계대에 해당)는 2 단계 비경구 천연두 백신 프로그램에서 프라이머 백신으로 독일에서 등록되었다. 결과적으로 MVA-572는 백시니아(vaccinia)와 관련된 합병증의 위험이 높은 집단 중 많은 수의 대상자가 있었음에도 불구하고 약 12만 명의 백인 (1 ~ 3 세 사이의 어린이가 대부분)에서 심각한 부작용이 보고되지 않았다 [76]. MVA-572는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 ECACC V94012707로 기탁되었다.
MVA를 약독시키는데 사용된 계대의 결과로서, CEF 세포에서 수행된 계대 횟수에 의존하는 복수의 상이한 균주 또는 단리물이 있다. 예를 들어, MVA-572는 천연두 박멸 프로그램 중에 독일에서 사전 백신으로 소량 사용되었으며, MVA-575는 수의학 백신으로 광범위하게 사용되었다. MVA는 물론 MVA-BN은 선구 CVA 바이러스에 비해 게놈의 약 15% (6개 지역에서 31kb)가 결핍되어 있다. 결실은 유형 A 봉입체에 대한 유전자뿐만 아니라 복수의 독성 및 숙주 범위 유전자에 영향을 미친다. MVA-575는 2000년 12월 7일 ECACC에서 수탁 번호 V00120707로 기탁되었다. 약독한 CVA-바이러스 MVA(Modified Vaccinia Virus Ankara)는 1차 닭 배아 섬유 아세포에서 CVA의 순차적인 번식(570 계대 이상)에 의해 얻어졌다.
Mayr et al.가 1970 년대에 MVA가 사람과 포유 동물에서 매우 약독하고 무독성임을 입증하였지만, 특정 연구자들은 잔류 복제가 이들 세포에서 일어날 수 있기 때문에 MVA가 포유 동물과 인간 세포주에서 완전히 약화하지 않는다고 보고했다 [79, 80; 미국 특허 제 5,185,146호; 81]. 이 간행물에서 보고된 결과는 MVA의 여러 가지 알려진 균주에서 얻은 것으로 추측된다. 왜냐하면 사용된 바이러스의 특성, 특히 다양한 세포주에서의 성장 거동이 본질적으로 다르기 때문이다. 이러한 잔류 복제는 인간에서의 사용과 관련된 안전 문제를 포함하여 다양한 이유로 바람직하지 않다.
백신 또는 약제와 같은 보다 안전한 생성물의 개발을 위해 개선된 안전성 프로파일을 갖는 MVA의 균주는 예를 들어 바바리안 노르딕(Bavarian Nordic) 사에 의해 개발되었다. MVA는 바바리안 노르딕 사에 의해 추가로 계대되었으며 MVA-BNA로 지정되었다. MVA-BN의 대표 샘플은 수탁번호 No. V00083008로 ECACC(European Collection of Cell Cultures)에 2000년 8월 30일에 기탁되었다. MVA-BN은 WO 02/42480 (US 2003/0206926) 및 WO 03/048184 (US 2006/0159699)에 추가로 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
MVA의 "유도체" 또는 "변종체"는 본 명세서에 기술된 바와 같이 MVA와 본질적으로 동일한 복제 특성을 나타내지만 그들 게놈의 하나 이상의 부분에서 차이를 나타내는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, MVA-BN과 MVA-BN의 유도체 또는 변종체는 면역 억제가 심한 쥐에서 조차 인간과 생쥐의 생체 내에서 생식 적으로 복제하지 못한다. 보다 구체적으로, MVA-BN 또는 MVA-BN의 유도체 또는 변종체는 바람직하게는 닭 배아 섬유 아세포 (CEF)에서의 생식 복제 능력을 가지지 만 인간 케라티노사이트(keratinocyte) 세포주인 HaCat [82]에서의 생식 복제 능력은 없고, 인간 골육종(human bone osteosarcoma) 세포주 143B (ECACC 기탁 번호 91112502), 인간 배아 신장 세포주 293 (ECACC 기탁 번호 85120602) 및 인간 자궁 경부암 세포주 HeLa (ATCC 기탁 번호 CCL-2)를 포함한다. 또한, MVA-BN의 유도체 또는 변종체는 Hela 세포 및 HaCaT 세포주에서 MVA-575보다 2 배 이상, 보다 바람직하게는 3 배 적은 바이러스 증폭률을 갖는다. MVA 변종체의 이러한 특성에 대한 시험 및 분석은 WO 02/42480 (US 2003/0206926) 및 WO 03/048184 (US 2006/0159699)에 기재되어 있다.
"생식 복제가 불능" 또는 "생식 복제 능력 없음"이란 용어는 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 원하는 특성을 갖는 MVA를 얻는 방법을 교시하는 WO 02/42480에 기재되어 있다. 이 용어는 WO 02/42480 또는 미국 특허 제 6,761,893호에 기재된 분석을 사용하여 감염 후 4 일째 바이러스 증식률이 1 미만인 바이러스에 적용되며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
"생식적으로 복제하지 못한다"는 용어는 감염 후 4 일째에 바이러스 증폭률이 1 미만인 바이러스를 의미한다. WO 02/42480 또는 미국 특허 제 6,761,893호에 기재된 분석법은, 바이러스 증식 비율의 결정에 적용할 수 있다.
바이러스의 증식 또는 복제는 일반적으로 처음에 세포를 감염시키는데 사용된 양(입력)에 대한 감염된 세포로부터 생산된 바이러스의 비율(출력)로 표현되며, “증식률"이라고 칭한다. 증식률 "1"은 감염된 세포로부터 생성된 바이러스의 양이 세포를 감염시키는데 처음 사용된 양과 동일한 증식 상태를 의미한다. 이는 감염된 세포가 바이러스 감염 및 복제에 허용된다는 것을 의미한다. 대조적으로, 1 미만의 증식률, 즉 입력 레벨과 비교하여 출력의 감소는 생식 복제의 결핍 및 그로인한 바이러스의 약독을 나타낸다.
MVA-기반 백신의 장점은 그들의 안전 프로필 뿐만 아니라 대규모 백신 생산을 위한 유용성을 포함한다. 또한, 효능 외에도 산업 규모 제조의 실현 가능성이 유익할 수 있다. 또한 MVA-기반 백신은 복수의 이종의 항원을 제공할 수 있으며, 동시에 체액성 및 세포성 면역을 유도할 수 있다.
본 발명에서 유용한 MVA 벡터는 당해 기술분야에서 공지된 방법, 예컨대 WO/2002/042480, WO/2002/24224, US 20110159036, US 8197825 등에 기술된 방법을 사용하여 제조 할 수 있으며, 여기에 참고로 포함되어 있다.
또 다른 측면에서, 복제 결핍 MVA 바이러스 균주는, 예컨대 균주 MVA-572 및 MVA-575, 또는 임의의 다른 유사하게 약독화된 MVA 균주가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 또한, 결실된 융모요막 백시아나 바이러스 앙카라(chorioallantois vaccinia virus Ankara: dCVA)와 같은 변종체 MVA가 적합할 수 있다. dCVA는 MVA 게놈의 del I, del II, del III, del IV, del V 및 del VI 결실 부위를 포함한다. 이 부위는 복수의 이종의 서열 삽입에 특히 유용하다. dCVA는 인간 세포주 (인간 293, 143B 및 MRC-5 세포주와 같음)에서 생식적으로 복제 (10 보다 큰 증식률로)할 수 있으며, 바이러스-기반 백신접종 전략에 유용한 추가 돌연변이에 의한 최적화가 가능할 수 있다 (WO 2011/092029 참조).
본 발명의 바람직한 구현예에서, MVA 벡터(들)은 HIV 모자이크 항원과 같은 하나 이상의 항원 HIV 단백질을 코드화하는 핵산을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, MVA 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화하고, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 가지는 4 개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화한다.
HIV 항원 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 MVA의 하나 이상의 유전자간 영역 (IGR)에 삽입될 수 있다. 특정 구현예에서, IGR은 IGR 07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 및 IGR 148/149에서 선택된다. 특정 구현예에서, 재조합 MVA의 5, 4, 3 또는 2개 미만의 IGR은 모자이크 항원 및/또는 추가 HIV 항원성 폴리펩티드와 같은 HIV의 항원성 결정기를 코드화하는 이종의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이종의 뉴클레오티드 서열은 부가적으로 또는 대안적으로 하나 이상의 자연 발생 결실 부위, 특히 MVA 게놈의 주요 결실 부위 I, II, III, IV, V 또는 VI 내로 삽입될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 MVA의 천연 발생 결실 부위 중 5, 4, 3 또는 2개 미만은 HIV 엔벨로프 당 단백질 및/또는 추가 HIV 단백질의 항원성 결정기를 코드화하는 이종의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
HIV 단백질의 항원성 결정기를 코드화하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MVA의 삽입 부위의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상일 수 있다. 특정 구현예에서, 이종의 뉴클레오타이드 서열은 4, 3, 2개 또는 그 이하의 삽입 부위에 삽입된다. 바람직하게는, 2개의 삽입 부위가 사용된다. 특정 구현예에서, 3개의 삽입 부위가 사용된다. 바람직하게는, 재조합 MVA는 2 또는 3개의 삽입 부위에 삽입된 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 제공된 재조합 MVA 바이러스는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 생성될 수 있다. 재조합 폭스 바이러스(poxviruses)를 수득하거나 외래 코딩 서열을 폭스 바이러스 게놈에 삽입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, DNA, DNA 및 RNA 단리, 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis), RT-PCR 및 PCR 증식 기술의 클로닝과 같은 표준 분자 생물학 기술에 대한 방법은 Molecular Cloning, A laboratory Manual (2차 편집) [83], 및 바이러스의 취급 및 조작 기술은 Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)] . 마찬가지로, MVA의 취급, 조작 및 유전 공학 기술 및 노하우는 Molecular Virology: A Practical Approach [A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)(예를 들어, Chapetr 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors 참조)] 및 Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998)(예를 들어, Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector 참조)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 개시된 다양한 재조합 MVAs를 생성하기 위해, 다른 방법이 적용될 수 있다. 바이러스에 삽입될 DNA 서열은 MVA의 DNA 부분에 상동성을 갖는 DNA가 삽입된 E coli 플라스미드 구조에 위치할 수 있다. 별도로, 삽입될 DNA 서열은 프로모터에 연결될 수 있다. 프로모터-유전자 결합은 비 필수 로커스(non-essential locus)를 포함하는 MVA DNA 영역에 인접한 DNA 서열과 상동성을 갖는 DNA에 의해 양쪽 말단에 측면이 위치하도록 플라스미드 구조 내에 위치할 수 있다. 생성된 플라스미드 구조는 E. coli 박테리아 내에서 번식에 의해 증식되고 단리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 포함하는 단리된 플라스미드는 배양물이 MVA에 감염되는 동시에 닭 배아 섬유 아세포 (CEF)와 같은 세포 배양물 내로 형질 감염될 수 있다. 플라스미드에서 상동성 MVA DNA와 바이러스 게놈 간의 재조합은 외래 DNA 서열의 존재에 의해 변형된 MVA를 생성 할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 적절한 세포 배양액, 예를 들어 CEF 세포와 같은 세포는 폭스 바이러스로 감염될 수 있다. 감염된 세포는 그 다음에 외래 또는 이종의 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제1 플라스미드 벡터로, 바람직하게는 폭스 바이러스 발현 조절 요소의 전사 조절하에서 세포로 감염될 수 있다. 상기에서 설명된 바와 같이, 플라스미드 벡터는 또한 외래성 서열의 삽입을 폭스 바이러스 게놈의 선택된 부분으로 유도할 수 있는 서열을 포함한다. 선택적으로, 플라스미드 벡터는 또한 폭스 바이러스 프로모터에 작동 가능하게 연결된 마커(marker) 및/또는 선별 유전자를 포함하는 카세트를 함유한다. 적합한 마커 또는 선택 유전자는 예를 들어 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제(galactosidase), 네오마이신-포스포리보실 트랜스퍼라제(neomycin-phosphoribosyltransferase) 또는 다른 마커를 코드화하는 유전자이다. 선택 또는 마커 카세트의 사용은 생성된 재조합 폭스 바이러스의 식별 및 단리를 단순화한다. 그러나, 재조합 폭스 바이러스는 또한 PCR 기술에 의해 동정될 수 있다. 이어서, 추가의 세포를 상기에 기재한 바와 같이 수득된 재조합 폭스 바이러스로 감염시키고, 제2 외래 또는 이종의 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제2 벡터로 전달감염시킬 수 있다. 이 유전자가 폭스 바이러스 게놈의 다른 삽입 부위에 도입될 수 있는 경우, 제2 벡터는 폭스 바이러스의 게놈에 제2 외래 유전자 또는 유전자들의 통합을 지시하는 폭스 바이러스-상동의 서열이 다르다. 상동의 재조합이 발생된 후에, 2개 이상의 외래 또는 이종의 유전자를 포함하는 재조합 바이러스가 단리될 수 있다. 재조합 바이러스에 추가 외래 유전자를 도입하기 위해, 감염 및 전달감염의 단계는 감염을 위한 이전 단계에서 단리된 재조합 바이러스를 사용하고 또 다른 외래 유전자 또는 전달감염을 위한 유전자를 포함하는 추가 벡터를 사용함으로써 반복될 수 있다.
대안적으로, 전술한 바와 같은 감염 및 전달감염의 단계는 상호 교환 가능하다. 즉, 적합한 세포는 외래 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 먼저 전달감염될 수 있고, 이후에 폭스 바이러스에 감염될 수 있다. 추가의 대안으로서, 각각의 외래 유전자를 다른 바이러스에 도입하고, 수득된 모든 재조합 바이러스와 함께 세포를 공-감염시키고, 모든 외래 유전자를 포함하는 재조합을 위한 스크린하는 것이 가능하다. 제3의 대안은 in vitro에서 DNA 게놈 및 외래 서열의 연결 및 헬퍼 바이러스를 사용하여 재조합 백시니아 바이러스 DNA 게놈의 재구성이다. 제4 대안은 박테리아 인공 염색체 (BAC)로서 클론된 백시니아 바이러스 게놈과 백시니아 바이러스 게놈에서 원하는 통합 부위에 인접한 서열에 상동인 DNA 서열이 측면에 위치하는 선형 외래 서열 간의 E.coli 또는 다른 박테리아 종에서의 상동성 재조합이다.
이종의 HIV 유전자, 예를 들어 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화하는 핵산은 하나 이상의 폭스 바이러스 프로모터의 조절하에 (즉, 작동 가능하게 연결될 수 있음) 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 폭스 바이러스 프로모터는 Pr7.5 프로모터, 하이브리드 초기/후기 프로모터, 또는 PrS 프로모터, PrS5E 프로모터, 합성 또는 천연의 초기 또는 후기 프로모터, 또는 우두 바이러스 바이러스 ATI 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, MVA 벡터는 Barouch et al., Nat Med 2010, 16:319-323 [54]; Barouch et al., Cell 155 : 1-9, 2013 [65]에 기재된 것과 같이 다가 모자이크 Env/Gag/Pol 항원을 발현하며, 이들 모두는 그 전체가 본 명세서 참고로 인용된다. 본 발명의 구현예에 따르면, 이에 한정하는 것은 아니지만, MVA 벡터는, 이에 한정하는 것은 아니지만, HIV 모자이크형 Gag-Pol-Env 항원과 같은 HIV 모자이크형 항원을 포함해서 본 명세서에 기재된 임의의 항원성 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
면역원성 조성물
본 명세서에서 사용된 "면역원적으로 유효한 양" 또는 "면역학적으로 유효한 양"은 이를 필요로하는 대상자에서 원하는 면역 효과 또는 면역 반응을 유도하기에 충분한 양의 조성물을 의미한다. 하나의 구현예에서, 면역원적으로 유효한 양은 이를 필요로하는 대상자에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 또 다른 구현예에서, 면역원적으로 유효한 양은 이를 필요로하는 대상자에서 면역을 생성시키기에 충분한 양, 예를 들어 바이러스 감염과 같은 질병에 대한 방어 효과를 제공하기에 충분한 양을 의미한다. 면역원적으로 유효한 양은 대상자의 신체 상태, 연령, 체중, 건강 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 면역 반응 유도 또는 방어 면역 제공 여부에 관계없이 특정 적용; 투여된 특정 재조합 벡터; 투여된 재조합 벡터에 의해 코딩되는 면역원; 투여된 특정 항원 폴리펩티드; 면역력이 요구되는 특정 질병, 예를 들어, 바이러스 감염이 있다. 면역원적으로 유효한 양은 본 개시 내용을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
일반적 지침으로서, 재조합 바이러스 벡터와 관련하여 사용될 때 면역 원적으로 유효한 양은 약 108 바이러스 입자 내지 약 1012 바이러스 입자, 예를 들어 108, 109, 1010, 1011 또는 1012 바이러스 입자의 범위일 수 있다. 면역원적으로 유효한 양은 단일 조성물로, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 조성물 (예 : 정제, 캡슐제 또는 주사제)과 같은 다중 조성물로 투여될 수 있다. 여기서, 다중 캡슐 또는 주사제의 투여는 집합적으로 대상자에게 면역원적으로 유효한 양을 제공한다. 일반적으로, 단리된 항원성 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 면역원적으로 유효한 양은 예를 들어, 약 0.3 내지 약 3000 마이크로 그램 (μg)의 범위, 예를 들어, 1-1000 μg, 예를 들어, 10-500 μg, 예를 들어, 약 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 ㎍일 수 있다. 또한, 소위 프라임-부스트 요법 (prime-boost regimen)에서 면역원적으로 유효한 양을 대상자에게 투여하고 이어서 동일한 대상자에게 면역원적으로 유효량의 다른 투여 량을 투여하는 것도 가능하다. 프라임-부스트 요법의 일반적인 개념은 백신 분야의 기술자에게 잘 알려져 있습니다. 필요에 따라 더 많은 부스터 투여를 선택적으로 요법에 추가할 수 있다.
면역원성 조성물은 본 발명에서 사용하기 위한 면역원적으로 유효한 양의 정제된 또는 부분적으로 정제된 아데노바이러스 또는 MVA 벡터를 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 백신 ("면역원성 조성물"이라고도 함)으로 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 면역 반응을 향상시키는 보강제를 포함할 수 있다. 제제 중에 각 성분의 최적 비율은 본 개시 내용을 고려하여 당업자가 공지된 기술에 의해 결정할 수 있다.
면역원성 조성물의 제조 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물 또는 식물유, 광유 또는 합성유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스(dextrose) 또는 다른 당류 용액(saccharide solution) 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 HIV-1 항원을 포함할 수 있거나, 프라이밍 또는 부스팅 면역이 다른 항원을 포함할 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터와 조합하여 사용되는 다른 항원은 본 발명에 중요하지 않으며, 예를 들어, HIV-1 항원 및 이를 발현하는 핵산일 수 있다.
본 발명에서 유용한 면역원성 조성물은 보강제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 공-투여에 적합한 보강제는 QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, 알루미늄염 (예를 들어, AdjuPhos), Adjuplex 및 MF59를 포함하는 사람들에게 잠재적으로 안전하고 잘 참고견딜 수 있으며, 효과적인 것이어야 한다.
투여될 수 있는 다른 보조제는 렉틴(lectins), 성장 인자(growth factors), 알파-인터페론, 감마 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF), 과립구 콜로니 자극 인자 (gCSF), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자 (gMCSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12 또는 그의 코딩 핵산과 같은 사이토카인(cytokines) 또는 림포카인(lymphokines)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정 화제 또는 당업자에게 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야하며, 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어, 근육 내, 피하, 경구, 정맥 내, 피부, 점막 내 (예컨대, 창자), 비강 내 또는 복강 내 경로에 의존할 수 있다.
동물 또는 인간 유기체에서의 투여시 항-HIV 면역 반응을 유도하거나 자극하는 능력은 당업계의 표준인 다양한 검정법을 사용하여 in vitro 또는 in vivo 로 평가할 수 있다. 면역 반응의 개시 및 활성화를 평가하기 위해 이용 가능한 기술에 대한 일반적인 설명을 위해, 예를 들어 Coligan et al. (1992 및 1994, Current Protocols in Immunology, J Wiley & Sons Inc, 국립 보건원)를 참조할 수 있다. 세포성 면역의 측정은 CD4 + 및 CD8 + T 세포로부터 유래된 것들을 포함하는 활성화된 이펙터 세포(effector cells)에 의해 분비된 사이토킨 프로파일의 측정(예를 들어, ELISPOT에 의한 IL-10 또는 IFN 감마 - 생성 세포의 정량화)에 의해, 면역 이펙터 세포의 활성 상태의 결정(예를 들어, 고전적 [3H] 티미딘 흡수에 의한 T 세포 증식 분석)에 의해, 예민한 대상자에서 항원-특이적 T 림프구에 대한 분석 (예를 들어, 세포 독성 분석에서 펩티드 특이적 용해 등)에 의해, 수행될 수 있다.
세포 및/또는 체액 반응을 자극하는 능력은 항체 결합 및/또는 결합 경쟁에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press 참조). 예를 들어, 면역원을 제공하는 조성물의 투여에 반응하여 생성된 항체의 역가는 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 면역 반응은 항체 분석을 중화함으로써 측정될 수 있는데, 여기서 바이러스의 중화는 특정 항체에 의한 바이러스의 반응/억제/중화를 통한 감염성의 상실로 정의된다. 면역 반응은 항체 의존성 세포 식균 작용 (ADCP)으로 측정할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 대상자에게 투여시, 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 재조합 MVA 벡터와 같은 발현 벡터는 면역원성 폴리펩티드를 발현한다. 본 명세서에 기재된 임의의 항원성 폴리펩티드는 발현 벡터에 의해 코드화될 수 있고, 본 발명의 방법으로 대상자에게 투여될 수 있다. 발현된 면역원성 폴리펩티드는 대상자의 면역계에 제공되어 면역 반응을 일으키거나 질병이나 감염을 치료 또는 예방하기 위한 면역 반응을 유도하는데 필요한 반응을 유도한다. 예를 들어, 반응은 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 항체를 생산할 수 있다.
바람직하게는, 대상체에 투여시, 발현 벡터는 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원을 발현한다. 본 발명에 따른 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원을 대상자의 면역계에 제시하면, 모자이크 HIV 항원의 서열 구성에 따라 HIV gag, pol 및/또는 env 유전자 산물에 특이적인 항체의 생산을 유도할 수 있다.
백신 조합물
본 발명의 일반적인 측면은 이를 필요로하는 대상자에서 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조합물에 관한 것으로,
(i) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제1 조성물;
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원 폴리펩티드와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제2 조성물; 및
(iii) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 항원 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 발현 벡터,
여기서, 제1 및 제2 조성물 중 하나는 면역화를 프라이밍하기 위한 것이고, 다른 조성물은 면역화를 부스팅하기 위한 것이며, 면역원적으로 유효한 양의 추가의 발현 벡터는 프라이밍하거나 부스팅하기 위해서 제2 조성물에 존재하거나 또는 제2 조성물과 함께 투여될 제3 조성물에 존재한다.
바람직한 구현예에서, 단리된 항원성 폴리펩티드는 HIV 엔벨로프 당 단백질을 포함한다. 엔벨로프 당 단백질의 예는 이에 한정하는 것은 아니지만, HIV의 임의의 클레이드로부터의 gp160, gp140, gp120 또는 gp41을 포함하는 상기에 기재한 HIV 엔벨로프 당 단백질 중 임의의 것을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 항원 폴리펩티드는 HIV gp140의 안정화된 삼량체, 특히 HIV gp140의 클레이드 C 안정화된 삼량체, 예컨대 SEQ ID NO: 5를 포함하는 HIV 엔벨로프 단백질의 안정화된 삼량체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, HIV 엔벨로프 당 단백질은 모자이크 HIV 엔벨로프 당 단백질, 예를 들어 SEQ UD NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 모자이크 HIV gp140 단백질과 같은 모자이크 HIV 엔벨로프 당 단백질이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 발현 벡터 또는 추가 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 MVA 벡터이다. 바람직하게는, 다른 기원의 벡터가 면역화를 프라이밍 및 부스팅하는데 사용된다. 예를 들어, 프라이밍 면역화를 위해서 아데노바이러스 벡터를 사용하는 경우, MVA 벡터를 부스팅 면역화를 위해서 사용한다. 마찬가지로, 프라이밍 면역화를 위해서 MVA 벡터를 사용하는 경우, 부스팅 면역화를 위해서 아데노바이러스 벡터를 사용한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 아데노바이러스 벡터, 더욱 바람직하게는 rAd26 벡터가 프라이밍 면역화에 사용되고, 하나 이상의 MVA 벡터가 HIV 엔벨로프 단백질과 같은 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드와 함께 부스팅 면역화를 위해서 사용된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 하나 이상의 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는 rAd26 벡터가 프라이밍 면역화를 위해 사용되고, 하나 이상의 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는 rAd26 벡터가 HIV 엔벨로프 단백질, 바람직하게 안정화된 삼량체 gp140 단백질과 같은 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드와 함께 면역화에 사용된다. 부스팅 면역화를 위해서 사용된 아데노바이러스 벡터는 면역화를 프라이밍하기 위해 사용된 아데노바이러스 벡터에 의해 크드화된 것과 동일한 항원 단백질을 코드화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드 및 하나 이상의 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는 rAd26 벡터가 프라이밍 면역화를 위해서 사용되고, 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드 및 하나 이상의 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는 rAd26 벡터가 부스팅 면역화를 위해서 사용된다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기에서 논의된 HIV 항원성 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현 벡터(들) 및 추가의 발현 벡터(들)로 코드화할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항원성 폴리펩티드는 HIV 모자이크 항원, 보다 바람직하게는 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원이다. 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원의 예는 이에 한정되는 것은 아니지만, SEQ ID NOs: 1 내지 4의 아미노산 서열을 포함하는 모자이크 항원을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 제1 조성물은 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원과 같은 하나 이상의 모자이크 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터를 포함하고; 제2 조성물은 HIV gp140의 안정화된 삼량체 또는 모자이크 HIV 엔벨로프 단백질과 같은 단리된 HIV 엔벨로프 단백질; 추가적인 발현 벡터는 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원과 같은 하나 이상의 모자이크 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 SEQ ID NOs: 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 rAd26 벡터를 포함하고; 제2 조성물은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항원성 폴리펩티드를 포함하며; 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 MVA 벡터이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 제1 조성물은 각각 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 모자이크 HIV 단백질을 코딩하는 rAd26 벡터를 포함하고; 제2 조성물은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 HIV gp140의 단리된 안정화된 삼량체를 포함하고; MVA 벡터는 제3 조성물에 존재하며, SEQ ID NOs: 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 4 개의 모자이크 HIV 항원 단백질을 코드화한다.
본 발명의 구현예에 따르면, 제1 조성물은 하나의 발현 벡터 또는 하나 이상의 발현 벡터를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 조성물은 아데노바이러스 벡터와 같은 하나의 발현 벡터, 보다 바람직하게는 rAd26 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 조성물은 1, 2, 3 또는 4개 등의 발현 벡터와 같은 하나 이상의 발현 벡터, 바람직하게는 rAd26 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 하나 이상의 발현 벡터는 동일하거나 다른 HIV 항원성 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 발현 벡터 각각은 하나의 HIV 항원성 폴리펩티드 서열, 또는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드 서열을 발현할 수 있다. 예시적이고 비제한적인 예로서, 제1 조성물은 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 및 보다 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 HIV 항원 폴리펩티드를 각각 발현하는 3 개의 rAd26 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 하나의 발현 벡터 또는 2, 3, 4개 또는 그 이상의 발현 벡터와 같은 하나 이상의 발현 벡터일 수 있다. 하나 이상의 추가 발현 벡터는 동일하거나 다른 항원 폴리펩티드를 발현 할 수 있다. 하나 이상의 추가 발현 벡터 각각은 하나의 항원성 폴리펩티드 서열 또는 다중 항원성 폴리펩티드 서열을 발현할 수 있다. 예시적이고 비 제한적인 예로서, 두 개의 추가 발현 벡터, 바람직하게는 MVA 벡터가, SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 모자이크 HIV Gag-Pol-Env 항원 서열과 같은 다른 모자이크 HIV 항원 서열을 코딩하는 각각의 MVA 벡터와 함께 사용된다. 바람직하게, 본 발명의 이러한 구현예에서, 하나의 MVA 벡터는 SEQ ID NOs: 1과 3을 포함하는 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화하고, 다른 MVA 벡터는 SEQ ID NOs: 2와 4를 포함하는 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화한다.
본 발명의 구현예에 따른 백신 조합물은 HIV의 하나 또는 복수의 클레이드에 대한 면역 반응을 유도하는데 효과적이다.
HIV 감염에 대한 방어 면역을 유도하는 방법
본 발명은 단리된 항원성 폴리펩티드와 조합하여 하나 이상의 발현 벡터를 사용하여 이를 필요로하는 대상자에서 하나 이상의 HIV 클레이드에 대한 면역 반응을 프라이밍 및 부스팅하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 일반적인 형태에 따르면, 이를 필요로하는 대상자에서 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은
(i) 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코팅하는 면역원적으로 유요한 양의 하나 이상의 발현 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제1 조성물을 대상자에게 투여하는 단계;
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원성 폴리펩티드와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 2 조성물을 대상자에게 투여하는 단계;
(iii) 하나 이상의 추가 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유요한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터를 대상자에게 투여하는 단계를 포함하되,
여기서, 단계(i) 및 (ii) 는 면역화를 프라이밍하기 위한 단계 및 면역화를 부스팅하기 위한 단계 중 어느 하나를 순서대로 수행하고, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터가 제2 조성물에 존재하거나 또는 면역화를 프라이밍 또는 부스팅하기 위한 제2 조성물과 함께 투여된 제 3 조성물에 존재한다.
본 발명의 구현예에 따른 임의의 백신 조합물을 본 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 명세서에 기술된 방법을 참조하여 사용되는 경우 "면역 반응을 유도하는"은 예방적인 목적을 위해 HIV 감염과 같은 감염에 대해 대상자에 방어적 면역 제공 및/또는 백신 접종하는 것과 마찬가지로, 치료를 목적으로 HIV 감염과 같은 감염에 대해 이를 필요로 하는 대상자에서 원하는 면역 반응 또는 효율성을 일으키는 것을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 방어 면역을 위한 것과 같은 예방 목적을 위한 것이다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 단리된 항원 폴리펩티드, 발현 벡터, 추가 발현 벡터, 발현 벡터에 의해 코드화된 항원성 폴리펩티드 등의 구현예는 상기 및 하기의 실시예에서 상세히 논의된다.
개시된 방법의 하나의 구현예에서, 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 아데노바이러스 벡터가 면역 반응을 프라임하는데 사용된다. 하나 이상의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 면역화를 프라이밍하기 위하여 하나 이상의 아데노바이러스 벡터와 함께 사용될 수 있다. 프라이밍 면역화는 복수 회 투여될 수 있는데, 예를 들어 0 시간에 초기 프라이밍 투여하고, 초기 프라이밍 투여 후, 약 10-14 주에 또 다른 프라이밍 투여를 한다. 하나 이상의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 하나 이상의 추가 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 아데노바이러스 또는 MVA 벡터와 함께 면역 반응을 증가시키는데 사용된다. 부스팅 면역화는 또한 예를 들어, 초기 프라이밍 투여 후, 약 22-26 주에 처음으로 복수 회 투여될 수 있고, 초기 프라이밍 투여 후 약 46-50 주에 또 다른 추가 투여를 한다. 면역화에 의해 유도 된 면역 반응을 모니터링한다.
개시된 방법의 구현예는 또한 보다 짧은 프라임-부스트 요법을 고려하며, 이는 최종 부스팅 면역화가 초기 프라이밍 투여 후 약 22 내지 26 주에 투여되는 것을 의미한다. 프라이밍 면역화는 0 주째에 투여될 수 있다. 부스팅 면역화는 예를 들어, 초기 프라이밍 투여 후 약 7-9 주 또는 11-13 주에 처음으로 복수 회 투여 될 수 있고, 이어서 초기 프라이밍 투여 후 약 22-26주에 다른 부스팅 투여를 한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 프라이밍 면역화를 위한 하나 이상의 아데노바이러스 벡터와 함께 투여된다.
당해 기술 분야의 숙련자는 프라이밍 및 부스팅 투여하기 위한 요법을 투여 후 측정된 면역 반응에 기초하여 조정할 수 있음을 쉽게 알 수 있다. 예를 들어, 부스팅 조성물은 프라이밍 조성물의 투여 후 수 주 또는 수 개월, 예를 들어 프라이밍 조성물의 투여 후 약 2-3 주, 또는 4 주, 또는 8 주, 또는 16 주, 또는 20 주, 또는 24 주, 또는 28 주, 또는 30 주, 또는 32 주, 또는 1 내지 2년 동안 일반적으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 아데노바이러스 벡터는 rAd26 벡터를 포함한다. 하나의 예시적인 구현예에서, rAd26 벡터는 면역 반응을 프라임하는데 사용되며, 단리된 항원 폴리펩티드와 함께 MVA 벡터가 면역 반응을 부스트하는데 사용되거나 그 반대도 마찬가지이다.
기재한 방법의 하나 이상의 구현예에서, 복수의 rAd26 벡터가 면역 반응을 프라임하는데 사용되고, 복수의 단리된 항원 단백질을 임의적으로 복수의 MVA 벡터와 함께 면역 반응을 부스트하는데 사용되거나 그 반대로 마찬가지다.
본 명세서에서의 방법에 따른 바람직한 구현예에서, 복수의 rAd26 벡터를 프라이밍 면역화하는데 사용하고, 이어서 복수의 MVA 벡터 및 단리된 항원성 폴리펩티드로 부스팅 면역화시킨다. 바람직하게, 부스팅 면역화는 마지막 프라이밍 후 10 내지 36 주, 보다 바람직하게는 프라이밍 후 12 내지 24 주에 투여된다.
각각의 프라이밍 및 부스팅 조성물 (그러나, 많은 부스팅 조성물이 사용됨) 내의 항원은 동일할 필요는 없지만, 항원 결정기를 공유하거나 실질적으로 서로 유사해야 한다.
발현 벡터 및/또는 항원성 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 투여는 전형적으로 근육 내 또는 피하이다. 그러나 정맥 내, 피부, 피부 내 또는 비강 투여와 같은 다른 투여 방식도 또한 고려될 수 있다. 면역원성 조성물의 근육 내 투여는 발현 벡터의 현탁액을 주사하기 위한 바늘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 아데노바이러스 및/또는 MVA 벡터, 및/또는 항원성 폴리펩티드를 포함한다. 대안은 조성물을 투여하기 위한 바늘없는 주사 장치 (예를 들어, BiojectorTM를 사용함) 또는 백신을 함유하는 동결 건조된 분말을 투여하는 것이다.
정맥 내, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위에서의 주사를 위해, 상기 벡터는 발열원이 없으며, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 수용 가능한 수용액의 형태로 존재할 것이다. 마찬가지로, 단리된 항원성 폴리펩티드는 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 수용 가능한 용액의 형태로 존재할 것이다. 당업자는 예를 들어 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이티드 링거 주사(Lactated Ringer's Injection)와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 지연 방출 제형이 또한 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 구현예에 따른 백신 조성물의 투여는 감염 또는 증후 발병 전에 HIV 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 예방적인 목적을 가질 것이다. 본 발명에 따라 치료 또는 예방될 수 있는 질병 및 장애는 면역 반응이 방어적 또는 치료적 역할을 할 수 있는 것들을 포함한다. 다른 구현예에서, 발현 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 및/또는 MVA 벡터 및/또는 항원성 폴리펩티드는 노출 후 예방을 위해 투여될 수 있다.
발현 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 및/또는 MVA 벡터 및 항원성 폴리펩티드를 함유하는 면역원성 조성물은 대상자에게 투여되어 대상자에서 항-HIV 면역 반응을 일으킨다. 검출 가능한 면역 반응을 유도하기에 충분한 조성물의 양은 "면역원적으로 유효한 양"으로 정의된다. 하기의 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 면역원성 조성물은 체액성뿐만 아니라 세포-매개 면역 반응을 유도한다. 본 발명의 전형적인 구현예에서, 면역 반응은 방어 면역 반응이다.
투여되는 실제 양 및 투여의 속도 및 시간-과정은 치료되는 대상의 성질 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료 요법, 예를 들어, 복용량 결정 등은 일반 의사와 다른 의사 또는 수의과의 맥락에서 수의사의 책임하에 있으며, 일반적으로 치료할 장애, 개별 환자의 상태, 전달 장소, 투여 방법 및 의사들에게 알려진 다른 요인에 따라 달라질 수 있다. 위에서 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980에서 찾아 볼 수 있다.
아데노바이러스 및 MVA 벡터의 생산 및 이러한 입자의 조성물로의 선택적 제형에 따라, 벡터는 개인, 특히 인간 또는 다른 영장류에게 투여될 수 있다. 투여는 인간 또는 다른 포유류, 예를 들어 마우스(mouse), 래트(rat), 햄스터(hamster), 기니아 피그(guinea pig), 토끼, 양, 염소, 돼지, 말, 소, 당나귀, 원숭이, 개 또는 고양이일 수 있다. 비인간 포유 동물으로의 전달은 치료 목적일 필요는 없지만, 예를 들어 gp140 단백질 또는 아데노바이러스 또는 MVA 벡터에 의해 발현되는 항원에 대한 면역 반응의 메커니즘을 조사하는 것과 같은 실험적 환경에서 사용될 수 있다.
하나의 예시적인 요법에서, 아데노바이러스 또는 MVA 벡터는 약 104 내지 1012 바이러스 입자/ml의 농도를 함유하는 식염수 용액 약 100㎕ 내지 약 10㎖의 범위로 투여 (예를 들어, 근육 내로) 된다. 일반적으로, 아데노바이러스 또는 MVA 벡터는 1 회 투여시 인간 대상자에게 약 109 내지 약 1012 바이러스 입자 (vp), 보다 일반적으로 약 1010 내지 약 1012 vp의 양으로 투여된다. 위에서 설명한 바와 같이 부스트에 의해서 초기 백신 접종을 한다. 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 예를 들어 약 0.001 내지 30 mg/kg 체중의 범위로 투여될 수 있다. 당업자는 이에 한정하는 것은 아니지만 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상자의 일반적인 건강 및/또는 연령 및 존재하는 기타 질환을 포함해서, 특정 인자가 대상자를 효과적으로 치료하는데 필요한 용량에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다.
조성물은 필요에 따라 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여량의 형태로 함유할 수 있는 키트, 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser)로 존재할 수 있다. 키트는 예를 들어, 블리스터 팩(blister pack)과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 키트, 팩 또는 디스펜서는 투여를 위한 관리 지침이 첨부 될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료되는 상태, 및 치료에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인에 따라 동시에 또는 순차적으로, 단독 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.
구현예
구현예 1은 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상자에서 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물로서,
(i) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제1 조성물;
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원성 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제2 조성물; 및
(iii) 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 발현 벡터,
여기서, 제1 및 제2 조성물 중 하나는 면역화를 프라이밍하기 위한 것이고, 다른 조성물은 면역화를 부스팅하기 위한 것이며, 추가 발현 벡터의 면역원적으로 유효한 양은 면역화를 프라이밍 또는 부스팅을 위해 제2 조성물 또는 제2 조성물과 함께 투여될 제3 조성물에 존재한다.
구현예 2는 구현예 1에 따른 백신 조합물로서, 단리된 항원성 폴리펩티드가 HIV 엔벨로프 당 단백질을 포함한다.
구현예 3은 구현예 2에 따른 백신 조합물로서, 단리된 항원성 폴리펩티드가 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함한다.
구현예 4는 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 백신 조합물로서, 하나 이상의 발현 벡터 및 하나 이상의 추가 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 MVA 벡터이다.
구현예 5는 구현예 4에 따른 백신 조합물로서, 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 MVA 벡터이며; 하나 이상의 발현 벡터는 MVA 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26 벡터이며; 또는 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 또한 rAd26 벡터이다.
구현예 6은 구현예 1-5 중 어느 하나에 따른 백신 조합물로서, 하나 이상의 발현 벡터 및 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID Nos: 1-4로 이우러진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화한다.
구현예 7은 구현예 6에 따른 백신 조합물로서, 하나 이상의 발현 벡터가 SEQ ID NO: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터이고; 단리된 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고; 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터이다.
구현예 8은 구현예 7에 따른 백신 조합물로서, 제1 조성물은 프라이밍 면역화를 위한 것이며, 제2 조성물 및 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 부스팅 면역화를 위한 것이다.
구현예 9는 구현예 8에 따른 백신 조합물로서, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터가 제3 조성물에 존재한다.
구현예 10은 실시예 9에 따른 백신 조합물로서, 제1 조성물은 각각 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 3 가지 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터를 포함하고; 단리된 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함하고; 제3 조성물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 4 개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터를 포함한다.
구현예 11은 구현예 1-10 중 어느 하나에 따른 백신 조합물로서, 대상자에 대한 백신 조합물의 투여는 HIV의 다중 클레이드에 대한 면역 반응을 유도한다.
구현예 12는 구현예 1-11 중 어느 하나에 따른 백신 조합물로서, HIV 감염에 대한 방어 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 것으로, 상기 제1 조성물은 면역 반응을 개시하기 위해 사용되며, 제2 조성물 및 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 면역 반응을 부스팅하는데 사용된다.
구현예 13은 구현예 1-12 중 어느 하나의 백신 조합물을 포함하는 키트이다.
구현예 14는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상자에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
(i) 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제1 조성물을 대상자에게 투여하는 단계;
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 항원성 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제2 조성물을 환자에게 투여하는 단계; 및
(iii) 하나 이상의 추가 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터를 대상자에게 투여하는 단계,
여기서, 단계(i) 및 (ii)는 면역화를 프라이밍하기 위한 단계 중 하나와 면역화를 부스팅하기 위한 것 중 어느 하나를 순서대로 수행되며, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터가 제2 조성물에 존재하거나 또는 면역화의 프라이밍 또는 부스팅을 위해 제2 조성물과 함께 투여된 제 3 조성물에 존재한다.
구현예 15는 구현예 14에 따른 방법으로서, 단리된 항원성 폴리펩티드가 HIV 엔벨로프 당 단백질을 포함한다.
구현예 16은 구현예 15에 따른 방법으로서, 단리된 항원성 폴리펩티드는 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함한다.
구현예 17은 구현예 14 내지 16 중에서 어느 하나에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터 및 하나 이상의 추가 발현 벡터가 아데노바이러스 벡터 또는 MVA 벡터 이다.
구현예 18은 구현예 17에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 MVA 벡터이며; 하나 이상의 발현 벡터는 MVA 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26 벡터이고; 또는 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고 하나 이상의 추가 발현 벡터는 또한 rAd26 벡터이다.
구현예 19는 구현예 14-18 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터 및 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화한다.
구현예 20은 구현예 19에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터이고; 단리된 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고; 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터이다.
구현예 21은 구현예 20에 따른 방법으로서, 제1 조성물은 면역화를 프라이밍하기 위한 것이고, 제2 조성물 및 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 면역화를 부스팅하기 위한 것이다.
구현예 22는 구현예 21에 따른 방법으로서, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터가 제3 조성물에 존재한다.
구현예 23은 구현예 22에 따른 방법으로서, 제1 조성물은 각각 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 3가지 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터를 포함하고; 단리된 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함하고; 제3 조성물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 4개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터를 포함한다.
구현예 24는 구현예 14-23 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 대상자에게 백신 조합물의 투여가 HIV의 복수의 클레이드에 대한 면역 반응을 유도한다.
구현예 25는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상자에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
(i) 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 프라이머 백신(primer vaccine)을 대상자에게 투여하는 단계; 및
(ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 부스터 백신(booster vaccine)을 대상자에게 투여하는 단계,
여기서, 단리된 항원성 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가 발현 벡터가 동일한 조성물 또는 별도의 조성물로 존재하고;
여기서, 부스터 백신은 프라이머 백신이 투여된 후에 투여된다.
구현예 26은 구현예 25 또는 26에 따른 방법으로서, 부스터 백신이 프라이머 백신이 최초 투여된 후 약 22 내지 26 주째에 1회 투여된다.
구현예 27은 구현예 25 또는 26에 따른 방법으로서, 추가로 프라이머 백신이 최초 투여된 후, 부스터 백신이 1회 투여되기 전에, 대상자에게 프라이머 백신을 재투여하는 것을 포함한다.
구현예 28은 구현예 27에 따른 방법으로서, 프라이머 백신이 최초 투여된 후 약 10-14 주째에 프라이머 백신을 재 투여한다.
구현예 29는 구현예 25-28 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 부스터 백신을 대상자에게 재 투여하는 것을 추가로 포함한다.
구현예 30은 구현예 29에 따른 방법으로서, 부스터 백신은 부스터 백신의 이전 투여 후 약 22 내지 26 주째에 재 투여된다.
구현예 31은 구현예 25-30 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고 하나 이상의 추가 발현 벡터는 MVA 벡터이고; 하나 이상의 발현 벡터는 MVA 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26 벡터이며; 또는 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고 하나 이상의 추가 발현 벡터는 또한 rAd26 벡터이다.
구현예 32는 구현예 25-30 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터이고, 여기서 단리된 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고; 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터 또는 MVA 벡터이다.
구현예 33은 구현예 32에 따른 방법으로서, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26 벡터이다.
구현예 34는 구현예 32에 따른 방법으로서, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 MVA 벡터이다.
구현예 35는 구현예 25에 따른 방법으로서, 부스터 백신은 프라이머 백신이 최초 투여 된 후 약 8 내지 12 주째에 1회 투여되고, 프라이머 백신이 최초 투여된 후 약 24 주째에 재 투여된다.
구현예 36은 구현예 35에 따른 방법으로서, 프라이머 백신은 면역원적으로 유효한 양의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 동일한 조성물 또는 별도의 조성물로 존재한다.
구현예 37은 구현예 34-35 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터는 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드 서열을 코딩하는 rAd26 벡터이며, 여기서 단리된 항원성 폴리펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HIV 엔벨로프 당 단백질이고; 하나 이상의 추가 발현 벡터는 바람직하게 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드 서열을 코딩하는 rAd26 또는 MVA 벡터이다.
구현예 38은 구현예 37에 따른 방법으로서, 하나 이상의 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1, 3 및 4의 HIV 항원성 폴리펩티드 서열을 코딩하는 rAd26 벡터이고; 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1, 3 및 4의 HIV 항원성 폴리펩티드 서열을 코딩하는 rAd26 벡터이다.
구현예 39는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상자에서 면역 반응을 유도하는 방법으로,
(i) SEQ ID NOs: 1, 3 및 4의 HIV 항원성 폴리펩티를 코딩하는 하나 이상의 rAd26 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 프라이머 백신을 대상자에게 투여하는 단계; 및
(ii) SEQ ID NO: 5와 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 면역원적으로 유효한 양의의 단리된 HIV 엔벨로프 당 단백질과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 부스터 백신을 대상자에게 투여하는 단계; 및
여기서, 부스터 백신은 프라이머 백신이 투여된 후에 투여된다.
구현예 40은 구현예 39에 따른 방법으로서, 부스터 백신은 보강제, 바람직하게는 알루미늄 염, 보다 바람직하게는 인산 알루미늄을 포함한다.
구현예 41은 구현예 39 또는 40에 따른 방법으로서, 부스터 백신에서 단리된 HIV 엔벨로프 당 단백질은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 42는 구현예 39-41 중 어느 하나에 따른 방법으로서, SEQ ID NOs: 1, 3 및 4의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 rAd26 발현 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제2 프라이머 백신은 단계 (i) 이후 및 단계 (ii) 전에 대상자에게 투여된다.
구현예 43은 구현예 39-42 중 어느 하나에 따른 방법으로서, SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6, 바람직하게 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역원적으로 유효한 양의 분리된 HIV 엔벨로프 당 단백질과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 추가의 부스터 백신을 단계 (ii) 후에 대상자에게 투여된다.
구현예 44는 구현예 39 내지 43 중 어느 하나에 따른 방법으로서, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 HIV 엔벨로프 당 단백질의 면역원적으로 유효한 양이 250 ㎍ 이다.
구현예 45는 구현예 39-44 중 어느 하나에 따른 방법으로서, SEQ ID NOs: 1, 3 및 4의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 rAd26 발현 벡터는 3개의 rAd26 벡터로 이루어지되 그의 제1 벡터는 SEQ ID NO: 1의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화하고, 제2 벡터는 SEQ ID NO: 3의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화하며, 제3 벡터는 SEQ ID NO: 4의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화하며, 여기서, 3 개의 rAd26 발현 벡터는 5 x1010 vp의 총 용량으로 투여된다.
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 특성을 추가로 설명하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해 결정된다는 것을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1: 비인간 영장류에서의 HIV 백신 요법
동물 연구는 계속되는 진보된 발전을 위한 다가의 HIV-1 백신 요법을 확인하기 위해 수행되었다. 이 연구는 2 회의 프라이머 면역화 (0 주 및 12 주째)와 1 회의 부스터 면역화 (24 주째)를 사용하는 백신 접종 일정을 시험 및 확장하였다. 특히 이 연구는 이종 백신의 조합물에서 아데노바이러스 또는 MVA 벡터와 엔벨로프 당 단백질의 조합을 사용하는 경우의 영향을 시험하였다. 체액성 및 세포성 면역학적인 반응을 백신 접종된 비인간 영장류 ( "NHP"라고도 함)에서 시험하였다.
백신 접종 및 실험 설계
히말라야 원숭이 (Macaca mulatta) (NHPs)는 그룹 당 12 마리의 동물(그룹 II-V) 외에 각각 12 마리의 동물을 갖는 2 개의 대조군 (그룹 I 및 VI)을 갖는 4개의 다른 백신 플랫폼을 사용하여 백신 접종하였다. 제1 대조군 (그룹 I)은 임의의 단리된 HIV 항원성 단백질 없이 HIV-1 모자이크 Env1 (SEQ ID NO: 1), 모자이크 GagPol1 (SEQ ID NO: 3) 및 모자이크 GagPol2 (SEQ ID NO: 4) 유전자를 발현하는 Ad26 벡터의 프라이머 및 부스터 백신을 투여받았다. Ad26 벡터는 각각 "Ad26.mos1Env, Ad26.mos1Gag-Pol 및 Ad26.mos2Gag-Pol"로 명명되었고, 총칭으로 "Ad26mos"로 한다. 제2 대조군 (그룹 VI)은 플라세보( "샘" ) 프라이머 및 부스터 백신만 투여받았다.
그룹 Ⅵ을 제외한 모든 그룹은 0주 및 12주째에 Ad26mos를 갖는 2개의 프라이머 백신을 투여받은 다음에 24주째에 1차 부스터 백신을 투여하였다. 이후 부스터 백신을 52 주째에 투여했다.
특히, 그룹 II는 Ad26mos의 2개의 프라이머 백신을 받았고, 이어서 인산 알루미늄 보강제 (이하 "gp140 약물 제품" 또는 "gp140DP"이라 칭함)가 투여된 250μg 클레이드 C Env gp140 삼량체 단백질 (SEQ ID NO: 5)을 갖는 2개의 부스터 백신을 투여하였다. 그룹 III은 Ad26mos의 두개의 프라이머 백신을 받았고, 이어서 Ad26mos와 gp140DP가 동시에 접종된 2개의 부스터 백신을 받았다. 그룹 IV는 Ad26mos의 2개의 프라이머 백신을 받았고, 이어서 모자이크 Env1 유전자 (SEQ ID NO: 1) 및 모자이크 GagPol1 유전자 (SEQ ID NO: 3)를 발현하는 하나의 MVA 벡터, 상기 벡터와 별개의 위치에 유전자를 갖는, 모자이크 Env2 유전자 (SEQ ID NO: 2) 및 모자이크 GagPol2 유전자 (SEQ ID NO: 4)를 발현하는 다른 MVA 벡터를 포함하는 2개의 상이한 MVA 벡터를 함유하는 조성물을 갖는 2개의 부스터 백신을 받았다. MVA 벡터는 "MVA.mos1Env/Gag-Pol" 및 "MVA.mos2Env/Gag-Pol"으로 명명되고, 총칭하여 "MVAmos"로 한다. 그룹 V는 Ad26mos의 2개의 프라이머 백신 을 받았고, 이어서 MVAmos와 gp140 DP가 함께 접종된 2개의 부스터 백신을 받았다. NHPs에서 시험된 백신 요법은 하기 표 1에 요약되어 있다.
Figure pct00001
1Ad26mos= Ad26.mos1Gag-Pol + Ad26.mos1Env + Ad26.mos2Gag-Pol (총 5x1010 vp)
2MVAmos = MVA.mos1Env/Gag-Pol + MVA.mos2Env/Gag-Pol (총 1x108 pfu)
3 gp140 DP = 즉석 혼합에 의해 제조된 보강제 (250μg 단백질 + 0.425 mg 인산 알루미늄)가 투여된 정제된 클레이드 C Env gp140 삼량체 단백질.
ELISA 결합 항체 분석, 항체 의존성 세포 탐식증 (ADCP) 분석 및 ELISPOT 분석을 포함하는 다음의 초기 코어 분석 실험을 프라이머 백신의 초기 투여후 28주 및/또는 54/56주째에 표 1에 기재된 요법에 따라 처리된 NHPs로부터 취한 샘플에 대해 수행하였다. 72주째에 시미안/인간 면역 결핍 바이러스 (SHIV) 감염 실험이 수행되었다.
ELISA 결합 항체(Ab) 분석
HIV-1 특이적 체액 반응은 변형된 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)에 의해 28주 및 56주째에 결정되었다. 96-웰의 저면이 평면인 플레이트 (Nunc)의 한 컬럼에 있는 웰을 1 x 둘베코 인산 완충 식염수 (Dulbecco Phosphate Buffered Saline:DPBS) (Gibco / Life Technologies) 10 mL에 희석시킨 10μg의 클레이드 C (C97ZA.012) gp140 코팅 단백질 (SEQ ID NO: 5) 또는 10μg의 모자이크 1 단백질 (SEQ ID NO: 6)을 웰 당 100 μL로 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 이전 연구로부터 잘 알려진 양성 혈청 샘플을 양성 대조군으로 사용하고, 사전 백신 접종 혈청 샘플은 음성 대조군으로 사용하였다.
플레이트 웰을 200 μL의 ELISA Wash (1000 mL PBS (1x) 및 0.5 mL Tween 20 (Sigma))로 1 회 세척하였다. 웰을 250 μL의 블로킹 용액 (PBS(Pierce) 내의 Blocker Casein)으로 차단하고, 3-4 시간 동안 실온에서 배양하였다. 배양 후, 블로킹 용액을 버렸다. 그런 다음 150 μL의 블로킹 용액과 6 μL의 샘플 혈청을 각 플레이트의 첫 번째 컬럼에 첨가하고, 100 μL의 블로킹 용액을 다른 모든 웰에 첨가하였다. 그 후 플레이트를 가로 질러서 100 μL의 블로킹 용액에 50 μL의 시리얼(serial) 희석액을 넣고, 마지막 컬럼에서 50 μL를 버리고, 각 웰에 100 μL의 샘플을 넣었다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 웰의 내용물을 버리고 웰을 200 μL의 ELISA Wash로 3 회 세척하였다.
그 다음에 블로킹 용액에 1 : 2000 2차 항체 퍼옥시다아제-어피니퓨어 염소 항-인간 IgG (Peroxidase-AffiniPure Goat ant-human IgG) (Jackson ImmunoResearch Labs) 100 μL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 실온에서 1 시간 동안 배양하고, ELISA Wash로 3 번 세척한 후, 웰을 세루블루 티엠비 마이크로웰 용액(SeruBlue TMB Microwell Solution) (KPL Laboratories) 100 μL로 성장시키고, 100 μL의 TMB 스톱 용액(Stop Solution) (KPL Research Products)으로 0.5 분 후에 성장을 정지시켰다.
플레이트를 ELISA 플레이트 리더에서 450 nm 및 550 nm (Molecular Devices-Versamax 및 Softmax Pro 4.7.1 소프트웨어)에서 판독하였다. ELISA EC90 역가는 SoftMaxPro에 의해 생성된 4-파라미터 곡선 적합성으로부터 변수가 유도된 다음 식 (1)을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00002
식 중, H는 기울기를 나타내고, F는 퍼센트 응답을 나타낸다.
데이터의 통계 분석은 공동 순위를 위한 던 (Dunn) 방법을 사용한 대조군과의 비모수(nonparametric) 비교에 의해 수행되었고, 가장 높은 기하 평균 역가를 갖는 군을 대조군으로 각각 정의하였다.
클레이드 C gp140 (C97) 및 모자이크 (Mos1) ELISA 분석 실험으로부터의 결과를 도 1a (28 주) 및 도 1b (56 주)에 요약하였다. 클레이드 C gp140 Env와 모자이크 1 Env 항원은 편향없이 양호한 상관 관계를 보였다 (데이터는 표시되지 않음).
항체 의존 세포 식균 작용 (ADCP) 분석
기능성 비-중화 항체 반응은 처리된 NHPs로부터 28 주째에 수득된 혈청 샘플로부터 정제된 면역 글로불린 G (IgG) 항체를 사용하여 측정하였다. IgG는 멜론 겔 컬럼(Melon Gel columns) (Thermo Scientific)을 사용하여 정제하였고, 나노드롭 분광 광도계 (Nanodrop spectrophotometer) (Thermo Scientific)를 사용하여 정량하였다. ADCP 분석은 Ackerman et al. (2011) (A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. J. Immunol. Methods 366, 8-19)에 기술되어 있으며, 여기에 그 전체가 참고로 인용되어 있다.
보다 구체적으로, 클레이드 C (C97) Env (SEQ ID NO: 5) 및 모자이크 M (mos1) (SEQ ID NO: 6) Env 바이오티닐화된 항원을 1㎛ 황록색 형광성 뉴트라비딘 비드 (neutravidin beads) (Invitrogen)으로 밤새도록 배양하였다. 그 다음에 비드를 세척하고 인산 완충 식염수 - 소 혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin) (PBS-BSA)에서 최종 희석 1 : 100으로 재현탁했다. 혈청 샘플 및 9 x 105 항원 - 표지 비드로부터 정제된 항체를 저면이 둥근 96-웰 플레이트에서 혼합하고, 플레이트를 2 시간 동안 배양하였다. 급성 골수성 백혈병 (THP-1 세포, 2x104 세포) 으로부터 유래된 인간 단구 세포를 200 μL의 최종 부피로 각 웰에 첨가하고 플레이트를 밤새 배양하였다.
다음 날, 배양액의 절반을 제거하고, 플레이트를 HTS 플레이트 리더가 장착 된 BD LSR II 플로우 사이토미터(Flow Cytometer)에서 분석하기 전에 100 μL의 4 % 파라포름알데히드로 대체하였다. 분석을 위해, 샘플을 생세포에 게이트하고, THP-1 세포 식균작용 비드의 비율이 결정되었다. 식세포 점수는 다음과 같이 계산하였다: (비드 양성 백분율)에 (비드 양성의 평균 형광 강도)를 곱함.
28 주째의 ADCP 분석에서 얻어진 결과를 도 1에 요약하였다. 도 2는 개개의 동물의 식세포 점수 반응을 나타낸 것이다. 데이터의 통계 분석은 던(Dunn) 방법을 사용하여 모든 쌍에 대한 비모수 비교를 통해 수행하였다.
클레이드 C gp140 Env 및 모자이크 M Env 항원은 전술한 ELISA 분석 및 하기에 기술된 중화 항체 (nAb) 분석으로부터의 결과와 일치하는 바이어스가 없는 양호한 상관 관계를 나타내었다.
중화 항체 (nAb) 분석
티어(tier) 1 HIV-1 Env 슈도 바이러스(pseudoviruses)에 대한 중화 항체 (nAb) 반응을 TZM.b1 세포에서 루시퍼라제-기재 바이러스(luciferase-based virus) 중화 분석을 사용하여 측정하였다. 특히, 티어 1 패널에서의 바이러스는 MW965.26 (클레이드 C), SF162.LS (클레이드 B), MN-3 (클레이드 A), DJ263.8 (클레이드 A) 및 BaL.26 (클레이드 B)를 포함한다.
간단히, 96-웰 저면이 편평한 플레이트를 56 주째에 NHPs로부터 얻은 혈청 샘플로 코팅하고, 10 % 둘베코의 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM) 100μL 중에서 혈청 샘플의 3 배 희석액을 제조하였다. 그런 다음 200 TCID50의 바이러스 (조직 배양 감염량, 또는 접종된 세포 배양물의 50 %에서 병리학적 변화를 일으키는 병원성 물질의 양)를 각 웰에 50μL의 부피로 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 11μg/mL의 최종 농도에서 DEAE- 덱스트란 (Sigma)을 함유하는 100μL의 10 % DMEM의 부피로 TZM.bl 세포를 1x104 세포/ 웰에 첨가하였다.
IC50은 세포 대조군의 상대 발광 단위 (바이러스가 존재하지 않는 TZM.bl 세포)를 뺀 후, 희석되지 않은 바이러스 대조군에 비해 상대 발광 단위가 50 % 감소된 혈청 희석액으로서 계산하였다.
56 주째에 NHPs로부터 수득된 샘플에서 MW965.26 (클레이드 C), SF162.LS (클레이드 B), MN-3 (클레이드 A), DJ263.8 (클레이드 A), 및 BaL.26 (클레이드 B) 에 대한 HIV-1 티어 1 TZM-bl 중화 분석 결과는 도 3에 나타내었다. 기호는 수평선으로 표시된 그룹 기하 평균 역가로 시험한 개개의 동물의 log10-변환된 ID50 역가를 나타낸 것이다. nAb 분석의 결과는 ELISA 분석의 결과와 일치한다.
ELISPOT 분석
HIV-1- 특이적 세포성 면역 반응을 Liu et al., 2009, Nature 457: 87-91에 종전에 기재되어 있던 바와 같이, IFN-γ ELISPOT에 의해서 분석하였으며, 그 전체를 여기에 참고로 인용하였다. ELISPOT 분석은 세계적으로 잠재적인 인간 T 세포 에피토프를 커버하는 HIV-1 잠재적 T 세포 에피토프 (PTE) 펩티드의 풀을 활용하였다. 이전의 연구에서, 세포 면역 폭의 분석은 본질적으로 우리가 이전에 Barouch et al., 2010, Nat. Med. 16:319-323 [54]에서 보고한 바와 같이, 개별 펩티드를 사용하는 에피토프 맵핑에 의해 각 항원을 커버하는 10-16개의 펩티드 서브풀을 이용하였으며, 이것은 그 전체가 여기에 참고로 인용되었다. 에피토프-특이적 CD8 + 및 CD4 + T 림프구 반응은 세포 고갈 연구에 의해 결정되었다.
간략히, 치료된 NHPs의 면역원성을 PTE 펩티드 풀을 사용하여 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 54 주째에 수득된 샘플에서 평가하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 PTE 펩티드 풀로 자극하고, 배양 후, 세포를 세척, 표식 및 성장시켜 스폿 형성 세포(spot forming cells)를 시각화 하였다. 106 PBMC 당 평균 스폿-형성 단위 (SFU)로서 표현된 ELISPOT 분석의 결과를 도 1에 나타내었다.
연구 결론
상기에 기재한 동물 연구의 결과 및 도 -4에 요약된 바와 같이, 프라임- 부스트 조합물에서 단리된 항원성 폴리펩티드를 갖는 rAd 벡터 및/또는 MVA 벡터의 조합은 영장류에서 광범위한 HIV-특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으키는데 유용하다. 특히, 영장류에서 광범위한 HIV-특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 높이는데 있어서 하나 이상의 부스팅 면역 접종에서 gp140 단백질 통합의 유용성이 입증되었다. 더욱이, 시험된 모든 백신 요법은 모든 면역화된 동물에서 면역원성이 있는 것으로 나타났다 (그룹 II-V).
특히, 하나 이상의 HIV-1 항원을 발현하는 1 종 이상의 rAd26 벡터 (0 주 및 12 주) 투여 후 rAd26 벡터 또는 MVA 벡터 및 단리된 클레이드 Cgp140 단백질로 24 주 및 52 주째에 부스팅 면역화함으로써 ELISA 및 ADCP 분석 (도 1a, 1b 및 2 참조, 특히 그룹 III ( "Ad26/Ad26 + Env"로 표시함) 및 그룹 V ( "Ad26/MVA + Env"로 표시함)의 결과에 의해 나타난 바와 같이, HIV-1에 대한 체액성 반응의 효율적인 부스팅의 결과를 가져왔다. 또한, 하나 이상의 rAD26 벡터의 투여 후, 클레이드 Cgp140 단백질과 함께 또는 없는 MVA 벡터를 24 주 및 52 주째에 부스팅 면역화함으로써 ELISPOT 분석에 의해 측정된 바와 같은 세포 면역 반응을 현저히 증가시킬 수 있었다 (도 4 참조, 구체적으로 그룹 IV ( "Ad26/MVA"로 표시) 및 그룹 V ( "Ad26/MVA + Env"로 표시함)).
실시 예 2. 사람에서의 HIV 백신 요법의 연구
건강한 HIV-감염되지 않은 성인 남녀에 대한 다기관, 무작위, 병렬군, 플라세보-대조, 더블-블라인드 임상 연구를 다음과 같이 수행하였다: 고용량, 저용량 또는 HIV 예방을 위해 클레이드 C gp140 단백질 플러스 보강제 없이 동종 Ad26 모자이크 벡터 백신 요법 또는 MVA 모자이크 이종 벡터 백신 요법의 안전성/내약성 및 면역원성 평가. 이 연구는 진행 중이다.
전반적인 이론적 근거
7 개의 프라임-부스트 백신 요법의 안전성/내약성 및 면역원성을 평가하기 위한 연구가 수행된다. 대상자는 4 회의 연구 백신 접종을 받는다: Ad26mos 또는 플라세보는 0 주 및 12 주째에 투여하고; 당 단백질 140 약물 제품(저용량 또는 고용량)과 함께 또는 없이 Ad26mos 또는 MVAmos 또는 단지 플라세보만 24 및 48 주째에 투여한다.
사용된 연구 백신은 다음과 같이 Ad26mos, MVAmos 및 gp140 DP이다 (실시 예 1 참조) :
(i) Ad26mos는 동일한 유리병에 공급된 다음의 3개의 백신 제품으로 구성되며, 2 : 1 : 1 비율로 투여된다: 각각 HIV-1 모자이크 Env1 (SEQ ID NO: 1), 모자이크 GagPol1 (SEQ ID NO: 3) 및 모자이크 GagPol2 (SEQ ID NO: 4) 유전자를 발현하는 Ad26.Mos1Env, Ad26.Mos1Gag-Pol 및 Ad26.Mos2Gag-Pol.
(ii) MVAmos는 별도의 유리병에 공급된 다음의 2개의 백신 제품으로 구성되며, 1 : 1 비율로 투여된다: 모자이크1 (SEQ ID NOs: 1 과 3을 가지는 HIV-1 Gag, Pol, 및 Env 단백질) 및 MVA-모자이크 2 (SEQ ID NOs: 2 와 4를 가지는 모자이크 2 HIV-1 Gag, Pol, 및 Env 단백질을 발현하는 MVA 바이러스); 및
(iii) gp140 약물 제품은 gp140을 생산하도록 구성된 형질 전환된 PER.C6® 세포주에 의해 생성된 HIV-1 클레이드 C 당 단백질 140 (SEQ ID NO: 5를 갖는 재조합 삼량체 gp140)을 포함한다. 이 연구에서, gp140 약물 제품은 보강제로서 인산 알루미늄이 복용되고, 투여된 gp140 약물 제품은 간단히 "gp140 DP"라고 칭한다.
목적들
본 연구의 1차 목적은 (1) Ad26mos, MVAmos 및/또는 gp140 DP 성분을 함유하는 다양한 프라임-부스트 요법의 안전성/내약성 평가; 및 (2) 상이한 백신 요법 간의 HIV Env 결합 항체 반응의 비교를 포함한다.
본 연구의 2차 목적은 다른 항체 결합, 항체 효과 기능 및 항체 특성 및 세포 반응을 평가하는 것을 포함한다.
본 연구의 탐구 목적은 (1) 대상자의 부분집합에서 점막 분비물에 다른 백신 요법에 대한 면역 반응을 탐구하는 것; (2) 다른 백신 요법 간에 유전자 발현 패턴을 탐구하는 것; 그리고 (3) Ad26 벡터에 대한 중화 항체를 탐구하는 것을 포함한다.
백신 접종 및 실험 설계
이 연구는 48 주간의 백신 접종 기간을 포함하며, 이 기간 동안 대상자들은 기준선 (0 주), 12 주 및 24 주째에 백신 접종을 하고, 48 주째에는 부스터 접종을 하고, 최종 방문에는 48 주간의 추적 관찰 기간을 갖는다. 백신 접종은 표 2에 나타낸 바와 같이 투여하고, 혈액 샘플은 면역 반응을 평가하기 위한 특별히 클리닉 방문시에 취한다.
28 주간의 데이터 분석에 기초하여 장래의 연구를 위해 후속적으로 선택된 요법으로 무작위로 된 대상자에 대해 장기간 추적 관찰 기간 (96 주 후, 약 2 년)이 계속될 것이다. 28 주 데이터가 결정적이지 않은 경우, 52 주 데이터가 요법 선택시 고려된다. 명확한 결정을 내릴 수 없는 경우, 연장된 추적 관찰 기간에는 면역 반응의 내구성을 평가할 목적으로 여러 그룹의 대상자가 포함될 수 있다. 연구의 마지막은 마지막 대상자의 최종 방문이다.
Figure pct00003
* adj는 AdjuPhos® (멸균된 인산알루미늄 습윤 겔 현탁액; gp140의 보상제로서 사용됨, 알루미늄 함량은 0.425 mg/0.5 mL 용량, 50 μg (저용량) 및 250 μg (고용량)은 gp140 단백질의 총 단백질 함량을 나타낸다.
복용량 및 투여
대상자는 0주, 12주 및 24 주 중 하루, 49주에 부스터를 무작위로 4번 연구 백신 투여량을 받으며, 삼각형의 모양으로 근육 주사로 투여된다. 주사 방문시에 한번만 (즉, 0 주 및 12 주), 삼각형 모양으로 주사를 사용할 수 있다. 한번의 방문 (즉, 24 및 48 주)에는 2 번의 연구 백신 주사가 주어질 경우, 각 주사시에 다른 삼각형 모양이 사용된다 (의학적 표시에서 허용되는 예외는 제외함). 투여된 복용량을 포함하는 연구 백신은 다음과 같다:
(i) Ad26mos (Ad26.Mos1Env + Ad26.Mos1Gag-Pol + Ad26.Mos2Gag-Pol) :
총 투여 량은 0.5 mL 주사 당 5 x 1010 바이러스 입자(vp)
(ii) MVAmos (MVA-Mosaic1 + MVA-Mosaic2) :
총 투여 량은 0.5 mL 주사 당 108 플라크-형성 단위 (pfu)
(iii) gp140 DP:
저용량 : 총 단백질 50μg을 함유한 gp140 DP에 0.5mL 주사 당 약국에서 인산 알루미늄 보강제 (알루미늄 0.425mg)를 혼합한 것
고용량 : gp140 DP와 250 μg 총 단백질에 약 0.5 ml 주사 당 약국에서 인산 알루미늄 보강제 (알루미늄 0.425 mg) 혼합한 것
(iv) 플라세보 :
0.9 % 식염수, 0.5 mL 주사
면역 원성 평가
이에 한정하는 것은 아니지만, Env- 특이적 혈청 결합 항체 분석, nAb 분석 및 항체-의존성 식균 작용 (ADCP) 분석뿐만 아니라 에피토프 맵핑을 포함하는 체액 면역 반응을 평가하기 위하여 분석을 수행한다 (표 3 참조).
Figure pct00004
ELISPOT에 한정되는 것은 아니지만, 세포 내 사이토카인 염색법 및 다중 파라미터 유동 세포 계측법을 포함하는 세포 면역 반응을 평가하기 위한 분석을 수행한다 (표 4 참조).
Figure pct00005
실시 예 3. 사람에서의 HIV 백신 요법의 추가 연구
건강한 HIV 감염되지 않은 대상자에 모자이크 HIV 항원 및 단리된 클레이드 C gp140 삼량체 단백질을 발현하는 rAd26 벡터로 다른 백신 일정의 안전성/내약성 및 면역원성을 평가하기 위해 인간에 대한 추가 임상 연구를 수행한다. 특히, 실시예 2에 기재한 연구와 비교해서 보다 짧은 투여량과 보다 적은 투약 요법이 시험된다. 백신 일정을 최적화하면 전체 일정을 준수할 수 있고, 및/또는 사용이 쉽고, 관리가 용이해진다.
예방 접종 및 실험 설계
18-50 세의 건강한 HIV-감염되지 않은 성인 남성 및 여성에 단일 센터, 무작위, 평행군, 플라세보-조절, 이중-블라인드 상 1 임상 연구를 수행한다. 36 명의 인간 대상자의 표적이 연구에 참여한다. 대상자는 3개의 그룹 (그룹 1 ~ 3)으로 나누어서 각 그룹에 무작위로 12 명의 대상자를 배정한다. 각 그룹의 대상자들은 추가로 무작위로 2개의 하위 그룹로 하고; 하위 그룹 A (10 명)와 하위 그룹 B (2 명)로 한다. 하위 그룹 A의 대상자는 연구 백신을 받고, 하위 그룹 B의 대상자는 플라세보를 받는다. 대상자들은 기준선 Ad26 혈청 양성 여부에 상관없이 연구에 이름이 오른다.
상기 연구는 48 주의 최대 백신 접종 기간 및 72 주까지 백신 접종 후 추적 기간을 포함한다. 대상자는 다음 표 5의 일정에 따라 시험 백신 또는 플라세보를 투여받는다. 이 연구에 사용된 백신 조성물에 대한 설명은 실시예 2를 참조하면 된다.
Figure pct00006
그룹 1은 본 연구의 데이터를 실시예 2의 연구에 브리징(bridging)할 수 있게 하는 "베이스-케이스(base-case)" 요법을 나타낸다. 그룹 1에서 대상자는 0 주, 12 주, 24 주 및 48 주에 4 회 백신 접종을 실시하고, 이것은 실시예 2에서 연구의 그룹 1에서 대상자와 동일한 투여 일정이다 (실시예 2의 표 2 참조). 그룹 2와 그룹 3은 24 주에 걸쳐 3회 백신 접종을 받는다 (그룹 2 : 0, 12 및 24 주, 그룹 3 : 0, 8 및 24 주). 특정 병원 방문시 혈액 샘플을 채취하여 면역 반응을 평가한다.
보다 구체적으로, 그룹 2는 "베이스-케이스"와 달리 48 주째에 후기 부스트를 위해 대상자가 클리닉으로 돌아갈 필요성을 제거함으로써 더 짧고 더 편리한 요법을 탐구한다.
그룹 3은 rAd26 벡터가 완전한 요법과 동일한 질적으로 유사한 반응을 일으키는 능력을 시험하는 반면, 2회 백신 접종때 gp140DP의 추가 투여 때문에 24 시간 이후의 "베이스-케이스" 요법보다 우수한 면역원성 수준을 달성한다.
모든 대상자가 28 주째 방문을 완료하거나 더 일찍 중단하면 중간 분석 (블라인드)이 수행된다. 1 차 분석 (비블라인드)은 모든 대상자가 52 주째 방문을 완료하거나 더 일찍 중단하면 수행된다. 최종 분석은 모든 대상자가 72 주째에 최종 학습 방문을 마친 후에 수행된다.
실시 예 4. 인간의 HIV 백신 요법에 대한 추가 연구
건강한 HIV-감염되지 않은 대상자에서 MVA 벡터와 클레이드 C gp140 삼량체 단백질로 다른 백신 일정의 안전성/내약성 및 면역원성을 평가하기 위해 인체에서의 추가 임상 연구가 수행되며, 여기서, 보다 적은 투여 요법 및 보다 적은 투여량을 갖는 요법이 실시예 1에서의 연구와 비교하여 시험된다. 대상자는 다음 표 6의 일정에 따라 연구 백신 또는 플라세보를 투여받는다. 연구에 사용된 백신 조성물은 실시예 2에 기술된 바와 같다. 실시예 3에서의 연구를 위해 상기 기재한 바와 같이 연구 참가자를 무작위로 추출한다.
Figure pct00007
제 1 그룹 (그룹 1)은 다시 실시예 2의 연구에 대한 본 연구의 데이터와 브리징이 가능한 "베이스-케이스" 요법을 나타낸다. 대상자는 0, 12, 24 및 48 주째에 4 회 백신 접종을 투여하며, 이것은 실시예 2의 연구의 그룹 4에서 대상자와 동일한 투여 일정이다 (실시예 2의 표 2 참조). 다른 그룹 (그룹 2 및 그룹 3)은 보다 짧은 요법을 받고 0 주, 8 주 또는 12 주 및 24 주째에 백신 접종을 실시한다. 이 연구의 프라이밍은 Ad26 벡터를 사용하고, 부스팅은 MVA 벡터를 사용한다. 이 요법의 가능한 이점은 그룹 1 (총 48 주)의 요법과 비교하여 더 짧은 기간 (총 24 주)과 더불어 보다 큰 편리함을 포함한다. 특정 병원 방문시 혈액 샘플을 채취하여 면역 반응을 평가한다.
본 명세서에 기재된 실시예들 및 구현예들은 단지 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 광범위한 개념을 벗어남이 없이 전술한 구현예들에 변경이 만들어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시예들에 한정되지 않으며, 첨부된 청구 범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위 내의 변경들을 포함하도록 의도되었다.
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Crucell Holland B.V. <120> Methods and Compositions for Inducing Protective Immunity Against Human Immunodeficiency Virus Infection <130> 688097-53WO (CRU5171WOPCT/0246 WO 00 ORD) <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 685 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mos1.Env mosaic antigen sequence <400> 1 Met Arg Val Thr Gly Ile Arg Lys Asn Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp 1 5 10 15 Gly Thr Met Leu Leu Gly Ile Leu Met Ile Cys Ser Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr 35 40 45 Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val 50 55 60 His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro 65 70 75 80 Gln Glu Val Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys 85 90 95 Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp 100 105 110 Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu 115 120 125 Asn Cys Thr Asp Asp Val Arg Asn Val Thr Asn Asn Ala Thr Asn Thr 130 135 140 Asn Ser 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Pro Asp Ile Val Leu Leu Lys Glu Asn Arg Asn Asn Ser 145 150 155 160 Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Leu Ile Asn Cys Asn Ala Ser Thr Ile Thr 165 170 175 Gln Ala Cys Pro Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys 180 185 190 Ala Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Ser 195 200 205 Gly Lys Gly Pro Cys Asn Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly 210 215 220 Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala 225 230 235 240 Glu Lys Glu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn Leu Thr Asp Asn Val Lys 245 250 255 Thr Ile Ile Val His Leu Asn Lys Ser Val Glu Ile Val Cys Thr Arg 260 265 270 Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Met Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr 275 280 285 Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala Tyr Cys 290 295 300 Asn Ile Ser Gly Ser Lys Trp Asn Glu Thr Leu Lys Arg Val Lys Glu 305 310 315 320 Lys Leu Gln Glu Asn Tyr Asn Asn Asn Lys Thr Ile Lys Phe Ala Pro 325 330 335 Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Ile Thr Thr His Ser Phe Asn Cys Arg 340 345 350 Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Thr Arg Leu Phe Asn Asn Asn Ala 355 360 365 Thr Glu Asp Glu Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile 370 375 380 Asn Met Trp Gln Gly Val Gly Arg Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ala 385 390 395 400 Gly Asn Ile Thr Cys Lys Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Val Arg 405 410 415 Asp Gly Gly Glu Asp Asn Lys Thr Glu Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly 420 425 430 Gly Asn Met Lys Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val 435 440 445 Ile Glu Leu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Gly Ala Lys Glu Arg 450 455 460 Val Val Glu Arg Glu Glu Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu 465 470 475 480 Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Leu Thr 485 490 495 Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Ser Ile Val Gln Gln Gln 500 505 510 Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu 515 520 525 Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu 530 535 540 Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly 545 550 555 560 Lys Leu Ile Cys Thr Thr Asn Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn 565 570 575 Lys Ser Gln Thr Asp Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp 580 585 590 Arg Glu Ile Ser Asn Tyr Thr Asp Thr Ile Tyr Arg Leu Leu Glu Asp 595 600 605 Ser Gln Thr Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp 610 615 620 Ser Trp Lys Asn Leu Trp Ser Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp 625 630 635 640 Tyr Ile Lys Ser Arg Ile Glu Gly Arg Gly Ser Gly Gly Tyr Ile Pro 645 650 655 Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp 660 665 670 Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 675 <210> 6 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mosaic gp140 chimeric protein <400> 6 Ala Gly Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys 1 5 10 15 Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp 20 25 30 Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp 35 40 45 Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn 50 55 60 Met Trp Lys Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser 65 70 75 80 Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys 85 90 95 Val Thr Leu Asn Cys Thr Asp Asp Val Arg Asn Val Thr Asn Asn Ala 100 105 110 Thr Asn Thr Asn Ser Ser Trp Gly Glu Pro Met Glu Lys Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ile Arg Asn Lys Val Gln 130 135 140 Lys Gln Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Val Pro Ile Asp Asn 145 150 155 160 Asp Ser Asn Asn Thr Asn Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val 165 170 175 Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His 180 185 190 Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asp Lys Lys 195 200 205 Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr 210 215 220 His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser 225 230 235 240 Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Glu Asn Phe Thr Asn Asn 245 250 255 Ala Lys Thr Ile Met Val Gln Leu Asn Val Ser Val Glu Ile Asn Cys 260 265 270 Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly 275 280 285 Arg Ala Phe Tyr Thr Ala Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala 290 295 300 His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Asn Trp Asn Asn Thr Leu Arg Gln Ile 305 310 315 320 Val Glu Lys Leu Gly Lys Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Val Phe 325 330 335 Asn His Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Met His Ser Phe Asn 340 345 350 Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Lys Leu Phe Asn Ser 355 360 365 Thr Trp Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Asn Asn Thr Lys Arg Ser Asn 370 375 380 Asp Thr Glu Glu His Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile 385 390 395 400 Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Arg 405 410 415 Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg 420 425 430 Asp Gly Gly Asn Asp Thr Ser Gly Thr Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly 435 440 445 Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val 450 455 460 Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Glu Arg 465 470 475 480 Val Val Gln Arg Glu Glu Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu 485 490 495 Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr 500 505 510 Leu Thr Val Gln Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln 515 520 525 Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu 530 535 540 Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu 545 550 555 560 Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly 565 570 575 Lys Leu Ile Cys Thr Thr Thr Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn 580 585 590 Lys Ser Leu Asp Lys Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu 595 600 605 Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Thr Leu Ile Glu Glu 610 615 620 Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp 625 630 635 640 Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp 645 650 655 Tyr Ile Lys Ser Arg Ile Glu Gly Arg Gly Ser Gly Gly Tyr Ile Pro 660 665 670 Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp 675 680 685 Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 690 695 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary leader sequence for gp140 stabilized trimeric protein production <400> 7 Met Arg Val Arg Gly Ile Gln Arg Asn Cys Gln His Leu Trp Arg Trp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Ile Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala 20 25

Claims (15)

  1. 대상자에서 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조합물로서,
    (i) 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 발현 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 1 조성물;
    (ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 2 조성물; 및
    (iii) 하나 이상의 추가 HIV 항원 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터,
    여기서, 제 1 및 제 2 조성물 중 하나는 면역화를 프라이밍하기 위한 것이고, 다른 조성물은 면역화를 부스팅하기 위한 것이며, 면역원적으로 유효한 양의 추가의 발현 벡터는 면역화를 프라이밍하거나 부스팅하기 위해서 제 2 조성물에 존재하거나 또는 제 2 조성물과 함께 투여될 제 3 조성물에 존재하는 백신 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 HIV 엔벨로프 당 단백질, 바람직하게는 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함하고, 여기서, 하나 이상의 발현 벡터와 하나 이상의 추가 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 MVA 벡터인 백신 조합물.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 MVA 벡터이거나, 하나 이상의 발현 벡터는 MVA 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 바람직하게는 하나 이상의 발현 벡터와 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코드화하고, 바람직하게는 하나 이상의 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터이고; 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고; 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터인 백신 조합물.
  4. 제3항에 있어서, 제1 조성물은 프라이밍 면역화를 위한 것이고, 제2 조성물과 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 부스팅 면역화를 위한 백신 조합물.
  5. 제4항에 있어서, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 제3 조성물에 존재하는 백신 조합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1조성물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 3 개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 rAd26 벡터를 포함하고; 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 HIV gp140의 안정화된 삼량체를 포함하며; 제3 조성물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 4 개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터를 포함하는 백신 조합물.
  7. HIV 감염에 대한 방어 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 백신 조합물로서, 제 1 조성물은 면역 반응을 프라이밍하기 위해 사용하고, 제 2 조성물과 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 면역 반응을 부스팅하기 위해 사용되는 백신 조합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항의 백신 조합물을 포함하는 키트.
  9. 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상자에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 이 방법은,
    (i) 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 발현 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 1 조성물을 대상자에게 투여하는 단계;
    (ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제 2 조성물을 대상자에게 투여하는 단계; 및
    (iii) 하나 이상의 추가 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터를 대상자에게 투여하는 단계를 포함하되
    여기서, 단계(i) 및 (ii)은 면역화를 프라이밍하기 위한 단계 및 면역화를 부스팅하기 위한 단계 중 어느 하나를 순서대로 수행하고, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터가 제 2 조성물에 존재하거나 면역화를 프라이밍 또는 부스팅하기 위한 제 2 조성물과 함께 투여된 제 3 조성물에 존재하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 HIV 엔벨로프 당 단백질, 바람직하게는 HIV gp140의 안정화된 삼량체, 및 하나 이상의 발현 벡터와 하나 이상의 추가 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 MVA 벡터인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 발현 벡터는 rAd26 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 MVA 벡터이거나 하나 이상의 발현 벡터는 MVA 벡터이고, 하나 이상의 추가 발현 벡터는 rAd26 벡터이며, 바람직하게는 하나 이상의 발현 벡터와 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하고, 바람직하게는 하나 이상의 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코팅하는 rAd26 벡터이고; 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고; 하나 이상의 추가 발현 벡터는 SEQ ID NOs: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 MVA 벡터인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제1 조성물은 프라이밍 면역화를 위한 것이고, 제2조성물과 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 부스팅 면역화를 위한 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터는 제3 조성물에 존재하는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 조성물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 3개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코팅하는 rAd26 벡터이고; 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 HIV gp140의 안정화된 삼량체; 및 제3 조성물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 4개의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코팅하는 MVA 벡터를 포함하는 방법.
  15. 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상자에게 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 이 방법은
    (i) 하나 이상의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 프라이머 백신을 대상자에게 투여하는 단계; 및
    (ii) 면역원적으로 유효한 양의 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드, 하나 이상의 추가의 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 면역원적으로 유효한 양의 하나 이상의 추가 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 부스터 백신을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하되
    여기서, 단리된 HIV항원성 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가의 발현 벡터는 동일한 조성물 또는 별도의 조성물에 존재하고; 프라이머 백신이 투여된 후에 부스터 백신이 투여되는 방법.
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