KR20170055619A - 레스베라트롤 생합성 발아현미를 함유하는 피부노화 및 피부주름 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 레스베라트롤 생합성 발아현미를 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 상기 본 발명은 콜라겐 분해에 관여하는 효소인 MMP-1의 활성 억제 및 콜라겐 합성에 관여하는 효소인 type I procollagen의 활성을 증가시키는 효과를 가지는 레스베라트롤 생합성 발아현미를 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 레스베라트롤 생합성 발아현미를 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부노화 및 피부주름 개선 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 피부 미백용 화장료 조성물을 포함한 다양한 제품에 유용하게 사용될 수 있다
Description
본 발명은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것이다. 상기 본 발명은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선, 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
세포외 기질의 주요 구성 성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하며, 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나선 구조를 가지고 있다. 특히 뼈와 피부(진피)에 그 포함량이 높으며, 대부분의 다른 체 구조물에서는 섬유상 봉입체로 존재한다. 콜라겐의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.
종래에는 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐합성 촉진물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래 알려진 콜라겐합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP8-208424), 클로렐라추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다. 그러나 상기 물질은 피부 적용시 자극과 발적 등 안전성 문제로 사용량에 제한이 있거나 그 효과가 미미하여 실질적으로 주름개선 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있다. 따라서 종래 주름개선용 조성물보다 생체에 안전하고 주름개선 효과가 높은 새로운 주름개선 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
기능성 성분을 다량 함유한 식물의 하나의 예로 벼는 벼과 벼속에 속하는 1년생초로 전세계에 널리 분포한다. 쌀의 성분은 탄수화물 70 내지 85%, 단백질 6.5 내지 8.0%, 지방 1.0 내지 2.0% 정도이고 전세계 인구의 절반 정도가 주식으로 사용하고 있다. 벼는 인간이 섭취하는 열량의 약 21를 차지하며 120여 개국에서 재배되는 매우 중요한 농작물이다. 현미의 경우 겨층과 호분층에 단백질, 지질, 섬유질 및 회분 등이 많이 분포하고 있으며 무기질이나 비타민 함량이 2 내지 3배로 높아서 영양적으로 매우 좋다고 알려져 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물의 피부노화 및 피부주름개선에 대한 영향을 알아보기 위해서 연구를 수행한 결과, 본 발명에 따른 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물이 콜라겐 분해에 관여하는 MMP-1의 활성을 억제하고, 콜라겐 합성에 관여하는 type I procollagen의 활성을 증가시킴으로써, 자외선 (UVB)에 의해 유도된 광노화를 억제하여 피부노화 및 피부주름 개선을 위한 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선, 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "레스베라트롤"이란, 식물이 곰팡이나 해충 같은 안좋은 환경에 처했을 때 만들어지는 강한 항산화성을 가지는 폴리페놀계 물질로서, 포도껍질, 포도씨, 땅콩 등에 과량 함유되어 있는 것이 알려져 있다. 레스베라트롤이 인간에게 미치는 영향에 대하여 많은 연구가 진행되어 왔으며, 이제까지 항암, 항바이러스, 신경보호, 항노화, 항염, 수명연장 등의 효과가 알려져 있다. 레스베라트롤은 시스 형태(cis)와 트랜스(trans)형태가 있는데 트랜스 레스베라트롤만이 효과가 있는 것으로 추측되고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "벼"란, 세계 인구의 반 이상의 주식량 자원으로, 특히 아시아에서 식용 작물로써 재배되는 식물이다. 벼속 식물 가운데에서도 곡물로 재배되는 것을 의미하며, 벼속에는 20 내지 30 종의 야생종이 있지만, 이중 재배종은 Oryza sativa와 Oryza glabemina 두종뿐인 것으로 알려져있다. 본 발명에서 벼는 천연형 벼 또는 형질전환된 벼 일 수 있으며, 구체적으로는 우리나라에서 개발되어 보급된 보급종인 동진벼 또는 동진벼의 형질전환 벼일 수 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0894148호 또는 대한민국 공개특허 제10-2014-0088492에서 개발한 레스베라트롤을 함유하는 벼 종자일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "벼 종자"란, 미도정, 반도정(현미), 전도정(백미) 여부를 불문하고 모든 상태를 포함한다. 다만, 발아현미를 제조하기 위해서는 바람직하게는 현미 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "레스베라트롤 생합성 발아현미"란, 레스베라트롤을 생합성하는 벼의 종자를 현미상태로 도정한 후, 이를 발아시킨 형태를 의미한다. 천연형 벼 또는 형질전환 벼의 종자를 포함하나, 레스베라트롤을 포함하고 발아현미 상태인 벼의 종자인 이상, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 레스베라트롤 생합성 발아현미는 a) 레스베라트롤을 생합성하는 벼의 종자를 물에 침지하는 단계; 및 b) 상기 물에 침지된 벼 종자를 명조건과 암조건을 반복처리하여 발아시키는 단계를 포함하는 발아현미 제조 방법을 통하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환"이란, DNA 염기서열 상의 삽입, 결실 또는 대체 등의 변이를 통해 특정 형질이 발생하거나 사라지거나 조절되는 모든 행위를 의미하며, 특히 본 발명에서는 외주로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환 벼"는 형질전환으로 제조된 천연형 벼에 비하여 DNA 염기서열 상의 변이가 발생한 벼를 의미하며, 유전자 제조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 삽입, 변형 또는 활성의 변이가 유발되어 생성된 유전자 재조합체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "동진벼"란, 내병 양질 다수성 신품종 육성을 목표로 1975년 국내에서 금남풍과 질병 저항성이 강한 낙동벼 및 사도미노리를 삼원교배하여 만든 품종이다. 1981년 국내에서 장려품종으로 결정되어 동진벼로 명명되고 보급되었다.
본 발명에서, 상기 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 구체적으로는 메탄올, 에탄올 또는 부탄올로 추출한 것을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는 추출처리에 의해 얻어지는 추출물, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다. 예를 들어, 상기 용매는 80% 메탄올일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명에서 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 i) 레스베라트롤 생합성 발아현미를 마쇄하는 단계; 및 ii) 상기 마쇄된 발아현미 가루를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매에 첨가하여 추출하는 단계를 포함하여 제조되는 것일 수 있으며, 상기 ii) 단계는 2회 이상 반복된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물을 제조하기 위하여 레스베라트롤 생합성 발아현미를 마쇄기를 이용하여 마쇄하고, 마쇄된 발아현미 가루를 100g으로 정량하여 80% 메탄올 1L에 첨가하여 30분간 추출하였다. 추출 후, 상등액은 필터페이터를 이용하여 거르고, 다시 한번 80% 메탄올 1L를 첨가하여 30분간 초음파 추출하였다. 상등액을 다시 필터피이퍼를 이용하여 거르고, 거른 추출액을 모아 감압농축기로 농축하였다. 농축물을 동결건조하여 발아현미 추출물 시료를 수득하였다. 대조군으로 동진 벼의 발아현미를 상기와 동일한 방법으로 제조하고 동일한 방법으로 추출물 시료를 제조하였다.
본 발명에서 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 상기 생합성 발아현미 추출물이 ㄱ) 레스베라트롤 생합성 벼 종자를 물에 침지하는 단계; ㄴ) 상기 물에 침지된 벼 종자를 명조건과 암조건을 반복처리하여 발아시키는 단계; ㄷ) 상기 발아된 벼 종자를 마쇄하는 단계; 및 ㄹ) 상기 마쇄된 발아현미 가루를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매에 첨가하여 추출하는 단계를 포함하여 제조된 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"이란, 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량, 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작한 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이의 조합 등이 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 레스베라트롤 생합성 발아현미를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 사용하였다. 본 발명에서 상기 분획물을 얻는데 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매: 헥산 (Hexane), 에틸아세테이트 (Ethyl acetate), 클로로포름 (Chloroform), 디클로로메탄 (Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 구체적으로는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
일 예로, 상기 분획물은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 분획하여 제조한 것일 수 있다. 다른 일 예로, 상기 분획물은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물을 물, 헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올로 분획하여 제조한 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명의 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 및 피부주름 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 레스베라트롤, 레스베라트롤 생합성 발아현미 등은 상기에서 설명하는 바와 동일하다.
본 발명의 약학적 조성물은 하기 i), ii) 및 iii) 중 하나 이상의 특징을 갖는 조성물;
i) MMP-1의 활성 억제,
ii) type I procollagen의 활성 증가,
iii) 콜라겐 층의 두께를 증가시키는 것일 수 있으며, 자외선 (UVB)조사에 따른 피부노화 및 피부주름을 개선 또는 치료하는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 유효성분은 레스베라트롤 생합성 발아현미에 유효성분을 활성화하기 위한 가공이 가해진 상태, 추출물, 분획물 등의 상기 쌀로부터 추출되는 모든 형태의 물질을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 피부노화 및 피부주름을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "치료" 또는 "개선"이란, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 피부노화 및 피부주름 상태가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 켑슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체는 락토스, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들어, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프포필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 자외선B (UVB, ultraviolet-B)는 피부에 가장 많은 영향을 주며 주로 표피까지 침투하여 피부세포에 영향을 주는 광선으로 이에 의해, 콜라겐이 감소한다. 이것은 자외선에 의한 광손상에 의해 몸이 보이는 반응이라고 보고 있다.
본 발명에 있어서, 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 콜라겐 분해에 관여하는 MMP-1의 활성을 억제하고, 콜라겐 합성에 관여하는 type I prcollagen의 활성을 증가시켜, 자외선에 의해 유도된 피부노화 및 피부주름을 개선하는 우수한 효과가 있다.
본 발명에서 용어, "피부노화"란, 피부에 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.
본 발명에서 "피부노화 예방 또는 개선"이란, 상기 노화 증상을 억제 또는 저해하거나, 이미 나타난 노화 증상을 완화시키는 것을 말한다.
본 발명에서 용어, "피부주름"이란, 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.
본 발명에서 "피부주름 예방 또는 개선"이란, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
피부 섬유아세포의 주된 기능으로 세포외기질 합성과 증식을 통한 손상된 피부 조직 재생 등을 들 수 있는데, 광노화와 같은 외인성 노화 요인 또는 유리 산소에 의한 손상 누적, 텔로미어 단절로 인한 세포 노화 등에 따른 내인성 노화 요인들은 진피층 내에 있는 피부 섬유아세포의 생리 활성 기능을 저하시키게 된다. 피부 세포외 기질 중 95% 이상을 차지하고, 세포의 부착분자(adhesion molecule) 및 세포 골격(cytoskeleton) 등과의 상호 작용과 신호 교류를 통해 섬유아세포의 생리 활성에 매우 주요한 부분을 담당하는 제I형 콜라겐의 합성이 저하될 경우, 피부 조직 내 콜라겐 양이 감소되고, 이에 따라 표면 장력이 감소되어 피부 탄력이 저하되고 피부 주름이 형성될 뿐만 아니라, 세포의 증식 및 재생 기능을 포함하는 생리 활성 기능이 감소하는 악순환의 원인이 된다. 따라서, 피부 섬유아세포의 콜라겐은 피부 재생, 피부 탄력, 피부 주름 형성 및 피부 손상 시 조직의 수복 또는 재생과 직접적인 관련이 있다고 볼 수 있다.
즉, 피부 섬유아세포의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 합성이 촉진되면, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과를 얻을 수 있다.
따라서 본 발명의 상기 레스베라트롤 생합성 발아현미를 포함하는 조성물은 콜라겐 분해를 억제하고 콜라겐 합성을 촉진하므로 피부탄력 증가, 피부재생, 피부주름 개선, 상처치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과를 가질 수 있다. 구체적으로는 피부주름 또는 피부노화 예방; 또는 개선의 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 자외선 조사로 유도된 광노화 세포에서 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물의 처리로, 콜라겐 분해에 관여하는 MMP-1의 단백질 발현량이 감소하고, 콜라겐 합성에 관여하는 type I procollagne의 단백질 발현량이 증가함을 확인하였으며(도 3), 자외선 조사한 인공피부에서는 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물의 처리로, 콜라겐 층의 분해가 방지되는 것을 확인하였다(도 4). 또한, 레스베라트롤 생합성 발아현미를 3개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층의 두께가 327.8±13.4um를 나타내어 동진 발아현미를 3 개월간 급여한 마우스군의 콜라겐 층인 203.3±7.5um 및 레스베라트롤을 3개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층인 204.4±10.2um와 비교하여, 1.6배 이상 콜라겐 층의 두께가 증가하였고, 게다가, 6개월간 레스베라트롤 생합성 발아현미를 장기급여한 마우스의 콜라겐 층의 두께는 444.4±34.1um을 나타내어 동진 발아현미를 6개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층인 227.8±13.4um 및 레스베라트롤을 6개월간 장기급여한 마우스의 콜라겐 층인 222.4±11.1um와 비교하여 1.9배 이상 콜라겐 층의 두께가 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 종합하면, 본 발명의 레스베라트롤 생합성 발아현미는 콜라겐 층을 증가시킬 뿐만 아니라, 자외선 등의 광원에 의한 콜라겐 분해를 억제하여 피부노화 및 피부주름을 방지하는 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 피부노화 및 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 레스베라트롤, 레스베라트롤 생합성 발아현미 등은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향로 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다. 본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우도 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨데 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물에는 피부노화 및 피부주름 개선 기능을 갖는 물질을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명의 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 레스베라트롤, 레스베라트롤 생합성 발아현미 등은 상기 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 피부노화 및 피부주름 예방 및 개선용 식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.
본 발명이 피부노화 및 피부주름 예방 및 개선용 음료 조성물은 필수 성분으로서 상기 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물을 함유하는 것외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)을 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 레스베라트롤, 레스베라트롤 생합성 발아현미 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어, "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다. 또한, 상기 의약외품 조성물은 피부 외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있으며, 상기 개인위생용품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크-업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔, 세정 겔 등이 될 수 있다.
본 발명에 따른 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물을 포함하는 조성물은 콜라겐 분해에 관여하는 효소인 MMP-1의 활성을 억제하고, 콜라겐 합성에 관여하는 효소인 type I procollagen의 활성은 증가시켜, 피부노화 및 피부주름 예방 및 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 피부주름 개선용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 각각 10 ug/mL와 100 ug/L 처리하여 144 mJ/cm2의 자외선 (UVB)을 조사한 정상 인간 섬유아세포 (Normal human dermal fibroblast, NHDF)세포군과 자외선을 조사하지 않은 세포군에서의 세포생존률을 확인한 결과를 나타내는 도면이다(NC; 자외선 미조사군, Ctl; 자외선 조사군, NR; 자외선 조사-동진 발아현미 처리군, RR; 자외선 조사-레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, R; 자외선 조사-시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 1b는 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 각각 10 ug/mL와 100 ug/L 처리하여 144 mJ/cm2의 자외선 (UVB)을 조사한 NHDF 세포군과 자외선을 조사하지 않은 세포군에서의 세포형태를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 2a는 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 처리한 자외선 조사-NHDF 세포에서의 Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 분비량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 2b는 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 처리한 자외선 조사-NHDF 세포에서의 type I procollagen의 분비량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 3은 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 처리한 자외선 조사-NHDF 세포에서의 MMP-1 및 type I procollagen의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타내는 도면이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 4는 인공피부에 동진 발아현미 및 레스베라트롤 생합성 발아현미를 처리한 후, 자외선 조사한 결과를 나타내는 사진이다(UVB-; 시료를 투여하지 않은 자외선 미조사군, UVB+; 시료를 투여하지 않은 자외선 조사군, UVB+ with NR; 동진 발아현미 처리 후의 자외선 조사군, UVB+ with RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리 후의 자외선 조사군, HE; 헤마톡실린-에오진 (hematoxylin-eosin, H&E)염색법, MT; 메이슨 트리크롬 (masson's trichrome)염색법).
도 5는 인공피부에 동진 발아현미 및 레스베라트롤 생합성 발아현미를 처리한 후, MMP-1 및 type I procollagen의 단백질 발현량을 면역염색으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다(UVB-; 시료를 투여하지 않은 자외선 미조사군, UVB+; 시료를 투여하지 않은 자외선 조사군, UVB+ with NR; 동진 발아현미 처리 후의 자외선 조사군, UVB+ with RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리 후의 UVB 조사군, HE; 헤마톡실린-에오진 (hematoxylin-eosin, H&E)염색법, MT; 메이슨 트리크롬 (masson's trichrome)염색법).
도 6은 레스베라트롤 생합성 발아현미를 3개월 및 6개월간 장기급여한 마우스 피부조직 콜라겐 층의 분석을 나타내는 사진이다(Ctrl; 시료를 투여하지 않은 대조군(옥수수사료), DJ; 동진 발아현미 투여군, R; 레스베라트롤 투여군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 투여군).
도 7은 레스베라트롤 생합성 발아현미 장기급여 마우스의 조직 분석을 나타내는 사진이다(Ctrl; 시료를 투여하지 않은 대조군(옥수수사료), DJ; 동진 발아현미 투여군, R; 레스베라트롤 투여군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 투여군).
도 1b는 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 각각 10 ug/mL와 100 ug/L 처리하여 144 mJ/cm2의 자외선 (UVB)을 조사한 NHDF 세포군과 자외선을 조사하지 않은 세포군에서의 세포형태를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 2a는 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 처리한 자외선 조사-NHDF 세포에서의 Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 분비량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 2b는 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 처리한 자외선 조사-NHDF 세포에서의 type I procollagen의 분비량을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 3은 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤을 처리한 자외선 조사-NHDF 세포에서의 MMP-1 및 type I procollagen의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타내는 도면이다(NR; 동진 발아현미 처리군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군, Resv; 시판의 레스베라트롤 시약 처리군).
도 4는 인공피부에 동진 발아현미 및 레스베라트롤 생합성 발아현미를 처리한 후, 자외선 조사한 결과를 나타내는 사진이다(UVB-; 시료를 투여하지 않은 자외선 미조사군, UVB+; 시료를 투여하지 않은 자외선 조사군, UVB+ with NR; 동진 발아현미 처리 후의 자외선 조사군, UVB+ with RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리 후의 자외선 조사군, HE; 헤마톡실린-에오진 (hematoxylin-eosin, H&E)염색법, MT; 메이슨 트리크롬 (masson's trichrome)염색법).
도 5는 인공피부에 동진 발아현미 및 레스베라트롤 생합성 발아현미를 처리한 후, MMP-1 및 type I procollagen의 단백질 발현량을 면역염색으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다(UVB-; 시료를 투여하지 않은 자외선 미조사군, UVB+; 시료를 투여하지 않은 자외선 조사군, UVB+ with NR; 동진 발아현미 처리 후의 자외선 조사군, UVB+ with RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리 후의 UVB 조사군, HE; 헤마톡실린-에오진 (hematoxylin-eosin, H&E)염색법, MT; 메이슨 트리크롬 (masson's trichrome)염색법).
도 6은 레스베라트롤 생합성 발아현미를 3개월 및 6개월간 장기급여한 마우스 피부조직 콜라겐 층의 분석을 나타내는 사진이다(Ctrl; 시료를 투여하지 않은 대조군(옥수수사료), DJ; 동진 발아현미 투여군, R; 레스베라트롤 투여군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 투여군).
도 7은 레스베라트롤 생합성 발아현미 장기급여 마우스의 조직 분석을 나타내는 사진이다(Ctrl; 시료를 투여하지 않은 대조군(옥수수사료), DJ; 동진 발아현미 투여군, R; 레스베라트롤 투여군, RR; 레스베라트롤 생합성 발아현미 투여군).
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.
실시예
1:
레스베라트롤
생합성하는
발아현미
및 추출물 제조방법
실시예
1-1:
레스베라트롤
생합성
발아현미의
제조
본 발명의 레스베라트롤 생합성 벼 종자는 대한민국 공개특허 제10-2011-0136093호의 방법을 통해 발아하여 본 발명의 발아현미를 제조하였다.
구체적으로는, 페트리 디쉬에 필터페이퍼를 놓고 물이 충분하게 스며들게 한 후 레스베라트롤 생합성 벼 종자를 파종하여 조직 배양실에서 21 내지 27 , 14 내지 18시간 명배양, 6 내지 10시간 암배양 조건으로 반복처리하여 1 내지 7일간 발아시켰다. 발아 종자가 썩지 않도록 물을 매일 교체하였다.
실시예
1-2:
레스베라트롤
생합성
발아현미의
추출물 제조
본 발명의 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 상기 실시예 1-1의 레스베라트롤 생합성 발아현미를 마쇄기를 이용하여 마쇄하고, 마쇄된 발아현미 가루를 100g으로 정량하여 80% 메탄올 1L에 첨가하여 30분간 추출하였다. 추출 후 상등액은 필터페이퍼를 이용하여 거르고, 다시 한번 80% 메탄올 1L를 첨가하여 30분간 초음파 추출하였다. 상등액을 다시 필터페이퍼를 이용하여 거르고, 거른 추출액을 모아 감압농축기로 농축하였다. 농축물을 동결건조하여 발아현미 추출물 시료를 수득하였다. 본 발명에서 사용한 레스베라트롤 생합성 발아현미의 양은 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물의 양을 나타내며, 그 중의 레스베라트롤 함량은 HPLC의 분석결과, 0.246 ug/mg을 나타낸다(Taek Hwan Lee, Biomol Ther 22(5), 431-437 (2014), Resveratrol-Enriched Rice Down-Regulates Melanin Synthesis in UVB-Induced Guinea Pigs Epidermal Skin Tissue).
한편, 이의 대조군으로, 형질전환 대상 벼종인 동진 벼의 종자를 상기와 동일한 방법으로 발아하여, 대조군 발아현미를 제조하고, 상기 추출물 시료 제조방법과 동일한 방법을 통하여 대조군 추출물 시료인 동진발아현미 추출물을 제조하였다.
실시예
2: 자외선 (
UVB
)조사로 유도된
NHDF
세포의 독성평가
실시예
2-1: 세포배양
정상 인간 섬유아세포 (normal human dermal fibroblast, NHDF)는 건강한 수컷 도너 (Healthy young male donor, MCTT Core, Inc., Seoul, Korea)의 피부조직검사(skin biopsy)로부터 수득하여 100 nm 조직배양 디쉬에 접종하고 10% 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서, 37℃ 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 세포는 6계대와 10계대 사이의 세포를 사용하였고, 세포밀집도가 80%에 도달하면 60 mm 배양디쉬에 1.2 × 105 cell/well로 씨딩하였다.
실시예
2-2: 자외선 (
UVB
)조사 및 시료처리
상기 60 mm 배양디쉬에 씨딩한 NHDF 세포가 80%의 세포밀도에 도달하면 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 2번 세척한 다음, 자외선 조사 장치(Bio-Link BLX-312; Vilber Lourmat GmbH, France)를 이용하여 144 mJ/cm2의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사한 후, 세포를 PBS로 3번 세척하고 혈청을 포함하지 않는 배지로 교환한 다음, 즉시 동진발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 및 레스베라트롤을 각각 10 ug/mL와 100 ug/mL농도로 처리하였다.
실시예
2-3: 세포독성 평가
상기 동진발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 및 레스베라트롤의 세포독성 평가를 위해, MTT 분석을 통해 세포생존율을 분석하고 현미경을 통해 새포형태를 관찰하였다(도 1a, 도 1b). MTT 분석을 위해, 세포를 72시간 배양한 후, 1 mg/mL의 MTT시약 100 uL를 처리하고 ELISA 리더(Molecular Devices E09090; San Francisco, CA, USA)를 이용하여 OD 570 nm의 흡광도를 측정하였다. 상기 도 1 및 도 2a에서 나타내는 바와 같이, 자외선 조사한 NHDF 세포에 동진발아현미 및 레스베라트롤 생합성 발아현미를 각각 10 ug/mL와 100 ug/mL농도로 처리하였을 경우, 세포독성을 나타내지 않았고, 세포형태도 변하지 않았다. 레스베라트롤 단독처리의 경우, 10 ug/mL농도처리에서는 세포독성을 나타내지 않았으나, 100 ug/mL농도처리에서는 세포독성을 나타내었고, 새포형태도 변화하였다.
실시예
3: 피부노화 및 피부주름 관련 효소의 분비량 분석
실시예
3-1:
MMP
-1의 분비량 분석
피부주름과 관련하여, 콜라겐 분해에 관여하는 효소인 MMP-1과 콜라겐 합성에 관여하는 type I procollagen이 알려져 있다. 상기 동진발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤의 MMP-1과 type I procollagen에 대한 조절능력을 평가하기 위해, NHDF 세포를 72시간 배양한 후, 각 웰로부터 세포배양액(conditioned medium)을 회수하고 ELISA kits (Human Total MMP-1 kit; R&D Systems, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA; Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)을 이용하여 MMP-1과 type I procollagen의 분비량을 분석하였다. 상기 실험은 동일한 방법으로 3번 반복실험하였다(도 2a, 도 2b). 상기 도 2a와 도 2b에서 나타내는 바와 같이, 우선 NHDF 세포에 자외선을 조사할 경우, 자외선을 조사하지 않은 세포에 비해 526% MMP-1의 분비량이 증가함을 확인하였다. 이에, 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤 처리군에서, MMP-1의 분비량이 감소되는 것을 확인하였고, 동진 발아현미 처리군에 비해 레스베라트롤 발아현미 처리군에서 농도의존적으로 MMP-1의 분비량을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 상기 레스베라트롤 생합성 발아현미 10 ug/mL에 함유되어 있는 레스베라트롤의 함량은 0.246 ug/mL이므로(Biomol Ther 22(5), 431-437 (2014), Taek Hwan Lee.et.al.), 레스베라트롤 단독 처리와 비교하였을 경우, 레스베라트롤 생합성 발아현미는 레스베라트롤 처리군의 약 1/40에 해당하는 양으로 MMP-1의 분비량을 현저하게 감소시키는 뛰어난 효과를 가짐을 확인하였다(도 2a).
실시예
3-2: type I
procollagen의
분비량 분석
type I procollagen의 분비조절에 있어서는, 우선, 자외선 조사로 type I procollagen의 분비량이 감소되는 것을 확인하였다. 이에, 동진발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤 처리군에서, type I procollagen의 분비량을 농도의존적으로 증가시킴을 확인하였다. 또한, 레스베라트롤 처리군에 비해 레스베라트롤 생합성 발아현미의 레스베라트롤 함량이 1/40에 해당하는 0.245 ug/mL임에도 불구하고 type I procollagen의 분비량을 증가시키는 효과가 보다 뛰어남을 확인하였다(도 2b).
이와 같은 결과로, 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 자외선 조사로 인한 광노화 유도 세포에서 MMP-1의 분비량을 현저하게 감소시키고, type I procollagen의 분비량은 증가시키는 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예
4: 피부노화 및 피부주름관련 효소 단백질의 발현량 분석
자외선을 조사한 NHDF 세포에서 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤 처리에 의한 MMP-1 및 type I procollagen의 단백질 발현량을 분석하기 위해, 웨스턴 블롯법을 이용하여 MMP-1 및 type I procollagen의 단백질 발현량을 조사하였다. 상기 도 3에서 나타내는 바와 같이, 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤 처리군에서 MMP-1의 단백질 발현량이 감소되는 것을 확인하였고, 레스베라트롤 생합성 발아현미 중의 레스베라트롤 함량이 0.246 ug/mL임에도 불구하고 레스베라트롤 처리군에 비해 MMP-1 단백질 발현량을 억제시키는 효과가 뛰어남을 확인하였다. type I procollagen의 단백질 발현량의 경우, 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군에서 type I procollagen의 단백질 발현량을 증가시키는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과로, 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 자외선 조사로 인한 광노화 유도 세포에서 MMP-1의 단백질 발현량을 효과적으로 억제시키고 type I procollagen의 단백질 발현량은 증가시키는 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하였다(도 3).
실시예
5: 인공피부를 이용한 주름개선 효과 확인
실시예
5-1:
광노화
유도 인공피부 모델의 확립
케라틴세포 (keratinocyte)와 섬유아세포 (fibroblast)로 구성되는 인공피부 (Human reconstructed skin, KeraskinTM FT)를 주식회사 엠씨티티 (Modern Cell & Tissue Technologies Inc)로부터 구입하였다. 상기 인공세포를 이용하여 자외선으로 유도된 광노화에 대한, 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤의 효과를 측정하기 위해, 10% 프로필렌글리콜 (propylene glycol)을 포함하는 PBS에 용해되어 있는 1%(w/v)의 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤 20 uL를 인공피부에 처리하고, 24시간 후에 100 mJ/cm2의 자외선 (UVB)을 조사하였다. 24시간 후, 10% 포르말린으로 고정시키고 헤마톡실린-에오진 (hematoxylin-eosin, H&E)염색 및 메이슨 트리크롬 (masson's trichrome)염색법을 이용하여 면역조직화학염색을 수행하였다. 상기 시료의 항원회복 (antigen retrieval)을 위해 0.1% 프로테아제를 포함하는 PBS에서 인큐베이션한 다음, 3% H2O2를 포함하는 PBS에서 10 내지 15분간 인큐베이션하였다. 그 다음, 2% 정상 말 혈청 (normal horse serum)을 포함하는 PBS에서 1시간 인큐베이션 한 후, 상기 시료를 MMP-1 (Abcam, Cambridge, MA, USA)및 type I procollagen (Santa Cruz Biotechnology Inc.,CA)의 1차 항체와 인큐베이션하여 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤에 대한 광노화 유도 인공피부모델을 완성하였다.
실시예
5-2:
광노화
유도 인공피부에서의
콜라겐층에 대한 효과측정
자외선으로 유도된 광노화 인공피부에 대한 동진 발아현미, 레스베라트롤 생합성 발아현미 및 레스베라트롤의 효능을 평가하기 위해, 상기 실시예 5-1에서 제작한 인공피부 모델을 헤마톡실린-에오진 염색법 및 메이슨 트리크롬 염색법을 이용하여 조직학적 분석을 수행하였다(도 4).
헤마톡실린-에오진 (HE)염색결과로부터 인공세포의 조직형태를 관찰하였다. 도 4에서 나타내는 바와 같이, 시료를 투여하지 않은 자외선 (UVB)조사군의 경우, 인공피부 상피층의 붕괴가 관찰되었다. 동진 발아현미 처리군에서도 상피층에서 약간의 붕괴가 관찰되었으나, 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군에서는 상피층의 붕괴는 관찰되지 않았다. 또한, 메이슨 트리크롬(MT) 염색결과로부터 콜라겐층의 형태를 관찰하였다. 시료를 투여하지 않은 자외선 (UVB)조사군의 경우, 콜라겐이 분해되어 콜라겐 층의 두께가 얇아짐을 확인하였다. 동진 발아현미 처리군에서는 콜라겐의 분해가 관찰되었으나, 레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군에서는 콜라겐 층의 양과 밀도가 동진 발아현미 처리군에 비해 증가되었음을 확인하였다(도 4).
이와 같은 결과로부터, 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 자외선 조사로 인한 인공세포 상피층의 붕괴로부터 상피층 세포를 보호하고, 콜라겐의 분해를 막아 피부노화 및 피부주름을 방지하는 것을 확인하였다.
실시예
5-3: 인공피부에서의 피부주름 관련 효소 단백질 발현량 분석
광노화 유도 인공피부의 면역조직염색을 통해, MMP-1 및 type I procollagen의 단백질 발현량을 검토하였다(도 5). 상기 도 5에서 나타내는 바와 같이, type I procollagen의 발현량에 있어서, 시료를 첨가하지 않은 대조군에 자외선을 조사할 경우(UVB+), type I procollagen의 발현량이 감소함을 알 수 있다. 자외선 조사-동진 발아현미 처리군에 비해, 자외선 조사-레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군에서 type I procollagen의 단백질 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, MMP-1의 발현량에 있어서, 시료를 첨가하지 않은 대조군에 자외선을 조사할 경우(UVB+), MMP-1의 발현량이 증가함을 알 수 있다(갈색). 자외선 조사-동진 발아현미 처리군에 비해, 자외선 조사-레스베라트롤 생합성 발아현미 처리군에서 MMP-1의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과로부터, 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은 type I procollagen의 단백질 발현량은 증가시키고, MMP-1의 단백질 발현량은 감소시키는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예
6:
레스베라트롤
생합성
발아현미
장기급여 마우스의 피부
콜라겐 층
분석
레스베라트롤 생합성 발아현미를 마우스에 장기급여하여 마우스 피부조직 콜라겐 층에 미치는 영향을 검토하였다. 본 발명에서 비교 대조군으로서?@사용한 레스베라트롤의 함량은 0.98ug/g이며, 레스베라트롤 생합성 발아현미에 함유된 레스베라트롤의 함량도 동일한 양을 포함한다. 시료를 마우스에 3개월 및 6개월간 급여한 다음, 메이슨 트리크롬 염색법을 통해 염색한 피부조직을 관찰하고, Apero ScanScope FL (Leica Biosystems, Nussloch, 독일)장비를 사용하여 피부조직을 분석하였다(도 6). 또한, 피부조직의 콜라겐층의 두께는 Image-J system (NIH, Maryland, 미국)프로그램을 이용하여 정량분석 하였다(표 1 및 도 7).
그 결과, 표 1 및 도 7에서 나타내는 바와 같이, 레스베라트롤 생합성 발아현미를 3개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층의 두께가 327.8±13.4um를 나타내어 동진 발아현미를 3개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층인 203.3±7.5um 및 레스베라트롤 3개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층인 204.4±10.2um에 비해, 1.6배 이상 콜라겐 층의 두께가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 레스베라트롤 생합성 발아현미를 6개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층의 두께가 444.4±34.1um를 나타내어 동진 발아현미를 6개월간 급여한 마우스군의 콜라겐 층인 227.8±13.4um 및 레스베라트롤 6개월간 급여한 마우스의 콜라겐 층인 222.4±11.1um에 비해, 1.9배 이상 콜라겐 층의 두께가 증가하였고, 시료를 첨가하지 않은 대조군의 콜라겐 층인 150.0±7.5um에 비해 무려 2.9배 이상 콜라겐 층이 증가하는 뛰어난 효과를 확인할 수 있었다.
이러한 결과로부터, 레스베라트롤 생합성 발아현미는 마우스의 콜라겐 층을 증가시킴으로써 피부노화 및 피부주름을 억제하는 뛰어난 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (11)
- 레스베라트롤 생합성 발아현미, 그의 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 피부노화 및 피부주름 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 하기 i), ii) 및 iii) 의 특징을 갖는 조성물;
i) MMP-1의 활성 억제,
ii) type I procollagen의 활성 증가, 및
iii) 콜라겐 층의 두께 증가. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 레스베라트롤 생합성 발아현미는
i) 레스베라트롤 생합성 벼 종자를 물에 침지하는 단계; 및
ii) 상기 물에 침지된 벼 종자를 명조건과 암조건을 반복처리하여 발아시키는 단계를 포함하는 발아현미 제조방법을 통하여 제조된 것인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은
i) 레스베라트롤 생합성 발아현미를 마쇄하는 단계; 및
ii) 상기 마쇄된 발아현미 가루를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매에 첨가하여 추출하는 단계를 포함하여 제조된 것인, 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 ii) 단계는 2회 이상 반복된 것인, 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 용매는 80% 메탄올인 것인, 조성물. - 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 및 피부주름 개선 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물은,
i) 레스베라트롤 생합성 벼 종자를 물에 침지하는 단계;
ii) 상기 물에 침지된 벼 종자를 명조건과 암조건을 반복처리하여 발아시키는 단계;
iii) 상기 발아된 벼 종자를 마쇄하는 단계; 및
iv) 상기 마쇄된 발아현미 가루를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매에 첨가하여 추출하는 단계를 포함하여 제조된 것인, 조성물. - 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선용 화장료 조성물.
- 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선용 식품 조성물.
- 레스베라트롤 생합성 발아현미 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 및 피부주름 개선용 의약외품 조성물.
Priority Applications (1)
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| KR1020150158412A KR101742029B1 (ko) | 2015-11-11 | 2015-11-11 | 레스베라트롤 생합성 발아현미를 함유하는 피부노화 및 피부주름 개선용 조성물 |
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