KR20170052526A - 다발성 경화증에 대한 병용 치료 - Google Patents

다발성 경화증에 대한 병용 치료 Download PDF

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Abstract

본 출원은 알파-4 인테그린 및 MCAM에 대한 조합 차단이 어느 한 분자만에 대한 것보다 유효하다는 증거를 제공한다. 그 결과, 본 발명은 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제가 둘 다 다발성 경화증 또는 다른 자가면역 질환을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 투여되는 병용 치료 방법을 제공한다.

Description

다발성 경화증에 대한 병용 치료{COMBINATION TREATMENT FOR MULTIPLE SCLEROSIS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 미국 가출원 번호 61/952,835 (2014년 3월 13일 출원), 및 미국 가출원 번호 62/023,577 (2014년 7월 11일 금요일 출원)를 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 편입되어 있다.
서열 목록, 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록에 대한 참조
서열목록 ("다발성 경화증에 대한 병용 치료"에 대하여, 파일 455719SEQLIST.txt에 기록됨, 2015년 3월 4일 제작됨)은 153 킬로바이트이다. 이러한 파일에 함유된 정보는 참조로서 본원에 편입된다.
다발성 경화증 (MS)은 중추신경계 (뇌, 척수, 및 시신경)에 대한 면역계 공격을 수반하는 질환이다. 상기 질환은 하나 이상의 환경적인 인자의 조합에 의하여, 유전적으로 민감한 개체에서 유발되는 것으로 고려된다. 중추신경계 상에서의 면역 공격의 부분으로서, 신경 섬유 그 자체뿐만 아니라, 수초 (중추신경계 내에서의 신경 섬유를 둘러싸고 보호하는 지방 물질)도 손상된다. 손상된 수초는 반흔 조직 (경화증)을 형성하고, 이는 상기 질환을 정의하는 것이다. 수초(myelin sheath) 또는 신경 섬유가 손상 또는 파괴될 경우, 뇌 및 척수에, 또는 이로부터 이동하는 신경 자극은 왜곡되거나 방해되며, 이는 다양한 증상을 생성한다.
다발성 경화증에 대한 치료는 없지만, 현재 증상, 발병 빈도, 및/또는 질환 진행에 대하여 약 10개의 FDA-승인된 약물이 존재한다. 이들 약물은 하기를 포함한다: 오바지오 (테리플루노마이드), 아보넥스 (인터페론 베타-1a), 베타세론 (인터페론 베타-1b), 코팍손 (갈라티라머 아세테이트), 엑타비아 (인터페론 베타-1b), 길레니아 (핑골리모드), 노반트론 (미톡산트론), 레비프 (인터페론 베타-1a), 텍피데라 (디메틸 푸마레이트), 및 타이사브리 (나탈리주맙). 나탈리주맙은 이용가능한 약물 중 보다 효과적인 약물 중 하나이다. 나탈리주맙이 염증 및 이의 영향, 예컨대 재발 및 병변 부하를 유의미하게 감소시킨다고 하더라도, 진행에 있어서의 이의 영향은 보다 덜 현저하다 (Polman et al., N. Engl. J. Med .354:899-910 (2006)). 대다수의 대상체가 나탈리주맙 치료에 대해 양호하게 반응함에도 불구하고, 진행성 다초점 백색질뇌증 (PML)이 드문 경우로 발생하였다 (Bloomgren et al., N. Engl. J. Med. 366(20):1870-1880 (2012); Schwab et al., Neurology 78(7):458-467 (2012); Schwab et al., Mult. Scler. 18(3):335-344 (2012)).
발명의 요약
본 발명은, 자가면역 질환의 치료 또는 예방 실시 방법으로서, 알파-4 인테그린 길항제를 또한 수여받는 다발성 경화증을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 MCAM 길항제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 MCAM 길항제 및 알파-4 인테그린 길항제는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 유효한 방식으로 제공되는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 자가면역 질환의 치료 또는 예방 실시 방법으로서, MCAM-길항제를 또한 수여받는 다발성 경화증을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 알파-4 인테그린 길항제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 유효한 방식으로 제공되는 방법을 제공한다.
일부 방법에서, 자가면역 질환은 다발성 경화증이다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제는 VCAM-1에 결합하는 알파-4 인테그린에 길항된다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제는 알파-4 인테그린에 특이적으로 결합한다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제는 단클론성 항체이다. 일부 방법에서, 단클론성 항체는 나탈리주맙이다. 일부 방법에서, MCAM-길항제는 라미닌-알파-4에 결합하는 MCAM에 길항된다. 일부 방법에서, MCAM 길항제는 MCAM에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다. 일부 방법에서, MCAM 길항제는 라미닌-알파-4에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다. 일부 방법에서, MCAM 항체는 1749 또는 2120, 또는 이들의 키메라, 베니어(veneered), 또는 인간화 버전이다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제가 나탈리주맙이고, MCAM 길항제가 1749 또는 2120, 또는 이들의 키메라, 베니어(veneered), 또는 인간화 버전이다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 둘 다 대상체의 혈청 중에서 동시에 검출가능하도록 동시에 제공된다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 동시 주입에 의해 제공된다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 순차적으로 제공된다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제가 먼저 제공되고, 대상체에서 알파-4 인테그린 길항제에 대해 내성이 발생한 뒤 MCAM 길항제가 제공된다. 일부 방법에서, MCAM 길항제가 먼저 제공되고, 대상체에서 MCAM 길항제에 대해 내성이 발생한 뒤 상기 알파-4 인테그린 길항제가 제공된다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제를 이용한 치료 과정이 먼저 투여되고, 대상체가 치료 과정의 개시 시 재발 완화 다발성 경화증을 갖거나 그 위험이 있으며, 대상체가 상기 MCAM 길항제를 이용한 치료 과정 개시 시 이차 진행 다발성 경화증으로 진행된다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 매주 내지 매분기의 간격으로 각각 제공된다. 일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 매4주 간격으로 각각 제공된다. 일부 방법에서, 각 항체의 투여량은 50-500 mg/대상체이다. 일부 방법에서, 각 항체의 투여량은 100-200 mg/대상체이다. 일부 방법에서, 각 항체의 투여량은 50-150 mg/대상체이다.
일부 방법에서, MCAM 항체가 서열 번호: 93 또는 100의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 86 또는 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104 또는 105의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및/또는 서열 번호: 101 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명은 T-세포 침윤이 관여되는 자가면역 질환의 치료 또는 예방 실시 방법을 추가로 제공하고, 염증성 질환을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 알파-4 길항제 및 MCAM 길항제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 유효한 방식으로 제공된다. 일부 방법에서, 상기 자가면역 질환이 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 사르코이드증, 또는 건선 관절염이다. 일부 방법에서, MCAM 길항제 및 알파-4 인테그린 길항제가 순차적으로 투여되며, 알파-4 인테그린 길항제가 먼저 투여된다. 일부 방법에서, MCAM 길항제 및 알파-4-길항제는 동시투여된다.
일부 방법에서, MCAM 길항제는 서열 번호: 93 또는 100의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 86 또는 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104 또는 105의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및/또는 서열 번호: 101 또는 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론성 항체이다.
도 1 (a-c)는: 나탈리주맙을 이용한 장기 치료 하의 뇌척수액 중 변화가 MS 대상체에서 중추 면역 반응의 정상화를 반영함을 보여준다.
도 2 (a-c)는: 장기 나탈리주맙 요법 하의 말초 및 중추 T-세포 구획에서의 CD49d 발현을 나타낸다.
도 3 (a & b)는: 나탈리주맙 치료가 PSGL-1의 상향조절을 유도함을 나타낸다.
도 4 (a-k)는: CD4+ T 세포 상에서 CD49d 및 PSGL-1의 분자 분포
도 5 (a & b)는: 다발성 경화증 대상체 및 대조군 조직에서 가능한 진입 경로 상의 VCAM-1 및 P-셀렉틴의 발현을 나타낸다.
도 6 (a-g)는: CD49d 및 PSGL-1의 리간드(즉, VCAM-1/P-셀렉틴)에 대한 CD4+ T 세포의 롤링 및 부착에 대한 나탈리주맙 처리의 영향을 나타낸다.
도 7 (a-g)는: TH17 세포가 내피에 대한 단단한 부착을 위해 MCAM을 이용할 수 있음을 나타낸다.
도 8 (a-i)는: 활성 MS 병소에서 MCAM+ 림프구를 나타낸다.
도 9: MS 내의 또는 장기 나탈리주맙 요법 하에서의 중추- 및 효과기 기억 T 세포의 혈액-CSF 이주의 도식적 개요
서열의 간단한 설명
서열 번호: 1은 항체 클론 17의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 2는 항체 클론 17의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 3은 항체 클론 17의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 4는 항체 클론 17의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 5는 항체 클론 17의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 6은 항체 클론 17의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 7은 항체 클론 17의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 8은 항체 클론 17의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 9는 항체 1174.1.3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 10은 항체 1174.1.3의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 11은 항체 1174.1.3의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 12는 항체 1174.1.3의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 13은 항체 1174.1.3의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 14는 항체 1174.1.3의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 15는 항체 1174.1.3의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 16은 항체 1174.1.3의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 17은 항체 1414.1.2의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 18은 항체 1414.1.2의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 19은 항체 1414.1.2의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 20은 항체 1414.1.2의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 21은 항체 1414.1.2의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 22는 항체 1414.1.2의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 23은 항체 1414.1.2의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 24는 항체 1414.1.2의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 25는 항체 1415.1.1의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 26은 항체 1415.1.1의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 27은 항체 1415.1.1의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 28은 항체 1415.1.1의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 29은 항체 1415.1.1의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 30은 항체 1415.1.1의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 31은 항체 1415.1.1의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 32는 항체 1415.1.1의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 33은 항체 1749.1.3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 34는 항체 1749.1.3의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 35는 항체 1749.1.3의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 36은 항체 1749.1.3의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 37은 항체 1749.1.3의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 38은 항체 1749.1.3의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 39는 항체 1749.1.3의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 40은 항체 1749.1.3의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 41은 항체 2120.4.19 버전 1의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 42는 항체 2120.4.19 버전 2의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 43은 항체 2120.4.19 버전 3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 44는 항체 2120.4.19의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 45는 항체 2120.4.19의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 46은 항체 2120.4.19의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 47은 항체 2120.4.19의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 48은 항체 2120.4.19의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 49는 항체 2120.4.19의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 50은 항체 2120.4.19의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 51은 항체 2107.4.10 버전 1의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 52는 항체 2107.4.10 버전 2의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 53은 항체 2107.4.10의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 54는 항체 2107.4.10의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 55는 항체 2107.4.10의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 56은 항체 2107.4.10의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 57은 항체 2107.4.10의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 58은 항체 2107.4.10의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 59는 항체 2107.4.10의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 60은 항체 1749.1.3의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 61은 인간화 항체 1749 버전 1 (VH1)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 62는 인간화 항체 1749 버전 2 (VH2)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 63은 항체 1749.1.3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 64는 인간화 항체 1749 버전 1 (VL1)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 65는 인간화 항체 1749 버전 2 (VL2)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 66은 항체 2107.4.10.18의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 67은 인간화 항체 2107 버전 1 (VH1)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 68은 인간화 항체 2107 버전 2 (VH2)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 69는 인간화 항체 2107 버전 3 (VH3)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 70은 인간화 항체 2107 버전 4A (VH4A)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 71은 인간화 항체 2107 버전 5A (VH5A)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 72는 인간화 항체 2107 버전 6 (VH6)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 73은 항체 2107.4.10.18의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 74는 인간화 항체 2107 버전 1 (VL1)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 75는 인간화 항체 2107 버전 2 (VL2)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 76은 인간화 항체 2107 버전 3 (VL3)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 77은 항체 2120.4.19.6의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 78은 인간화 항체 2120 버전 1 (VH1)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 79는 인간화 항체 2120 버전 2 (VH2)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 80은 인간화 항체 2120 버전 3 (VH3)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 81은 인간화 항체 2120 버전 4 (VH4)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 82는 인간화 항체 2120 버전 5 (VH5)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 83은 항체 2120.4.19.6의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 84는 인간화 항체 2120 버전 1 (VL1)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 85는 인간화 항체 2120 버전 2 (VL2)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 86은 인간화 항체 2120 버전 3 (VL3)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 87은 인간화 항체 2120 버전 3 (VH3)의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 88은 인간화 항체 2120 버전 4 (VH4)의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 89은 인간화 항체 2120 버전 5 (VH5)의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 90은 인간화 항체 2107 버전 1 (VH1)의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 91은 인간화 항체 2107 버전 4 (VH4)의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 92는 인간화 항체 2120 버전 1-5 (VH1-VH5)의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 93은 인간화 항체 1749 버전 3 (VH3)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 94는 인간화 항체 1749 버전 3 (VL3)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 95는 항체 2120.4.19.Q1E의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
서열 번호: 96은 인간화 항체 2120 버전 1 Q1E (VH1.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
서열 번호: 97은 인간화 항체 2120 버전 2 Q1E (VH2.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
서열 번호: 98은 인간화 항체 2120 버전 3 Q1E (VH3.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
서열 번호: 99는 인간화 항체 2120 버전 4 Q1E (VH4.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
서열 번호: 100은 인간화 항체 2120 버전 5 Q1E (VH5.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이며, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
서열 번호: 101은, N-말단에 아르기닌을 갖는, 인간화된 1749 또는 2120 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 102는, N-말단에 아르기닌이 없는, 인간화된 1749 또는 2120 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 103은, 인간화된 1749 또는 2120 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 104는, BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 105는, BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 106은 인간화 항체 2120 버전 3 (VL3 + 경쇄 불변 영역)의 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 107은 인간화 항체 2120 버전 5 (VH5 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 108은 인간화 항체 2120 버전 5 (VH5 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 109은 인간화 항체 2120 버전 5 Q1E (VH5.Q1E + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 110은 인간화 항체 2120 버전 5 Q1E (VH5.Q1E + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 111은 인간화 항체 1749 버전 3 (VL3 + 경쇄 불변 영역)의 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 112는 인간화 항체 1749 버전 3 (VH3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 113은 인간화 항체 1749 버전 3 (VH3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 114는 인간화된 19C12 중쇄 가변 영역 버전 1 (H1)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 115는 인간화된 19C12 중쇄 가변 영역 버전 2 (H2)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 116은 인간화된 19C12 중쇄 가변 영역 버전 3 (H3)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 117은 인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 1 (L1)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 118은 인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 2 (L2)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 119는 인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 3 (L3)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 120은 인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 4 (L4)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 121은 인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 5 (L5)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 122는 인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 6 (L6)의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 123은 19C12 인간화 항체 (H1 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 124는 19C12 인간화 항체 (H1 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 125는 19C12 인간화 항체 (H2 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 126은 19C12 인간화 항체 (H2 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 127은 19C12 인간화 항체 (H3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 128은 19C12 인간화 항체 (H3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 129는 19C12 인간화 항체 (L1 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 130은 19C12 인간화 항체 (L1 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 131은 19C12 인간화 항체 (L2 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 132는 19C12 인간화 항체 (L2 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 133은 19C12 인간화 항체 (L3 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 134는 19C12 인간화 항체 (L3 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 135는 19C12 인간화 항체 (L4 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 136은 19C12 인간화 항체 (L4 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 137은 19C12 인간화 항체 (L5 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 138은 19C12 인간화 항체 (L5 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 139는 19C12 인간화 항체 (L6 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 140은 19C12 인간화 항체 (L6 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 141은 인간화 항체 2107 버전 4B (VH4B)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열 번호: 142는 인간화 항체 2107 버전 5B (VH5B)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
정의
치료를 위한 길항제, 예컨대 단클론성 항체가 전형적으로 단리된 형태로 제공된다. 이는 단클론성 항체 또는 다른 길항제는 이의 생산 또는 정제로부터 발생한 단백질 및 다른 거대분자의 적어도 50% w/w로 순수하다는 것을 의미하지만, 단클론성 항체 또는 다른 길항제가 이의 용도를 촉진하는 것으로 의도된, 과잉의 약제학적 허용가능한 담체(들) 또는 다른 비히클과 조합될 가능성도 배제되지 않는다. 때때로, 단클론성 항체 또는 다른 길항제는 생산 또는 정제로 인한 단백질 및 다른 거대분자의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95 또는 99% w/w로 순수하다.
단클론성 항체의, 이의 표적 항원으로의 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M- 1 의 친화성을 의미한다. 특이적 결합은 보다 높은 규모로 검출가능하며, 적어도 하나의 비관련 표적에 발생하는 비특이적 결합과 구별가능하다. 특이적 결합은, 특정 작용기 또는 특정 공간적 피트 (spatial fit) (예컨대, 자물쇠(lock) 및 열쇠(key) 유형) 사이의 결합 형성의 결과 일 수 있으며, 반면 비특이적 결합은 보통 반데르발스력의 결과이다. 특이적 결합은, 그러나, 단클론성 항체가 하나의, 그리고 단하나의 표적에 결합한다는 것을 필연적으로 암시하지는 않는다.
기본 항체 구조 단위는 하부단위의 사량체이다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일 쌍을 포함하고, 각 쌍은 하나의 "경" 쇄 (약 25 kDa) 및 하나의 "중" 쇄 (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노 말단 부분은 항원 인식에 주로 책임이 있는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 절단가능 신호 펩티드에 연결된, 이러한 가변 영역은 초기에 발현된다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙 가변 영역이라고 지칭된다. 따라서, 예를 들면, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각 쇄의 카복시 말단 부분은 효과기 기능에 주로 책임이 있는 불변 영역을 정의한다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 각각 항체의 이소형 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. (참조: 일반적으로, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고로 편입됨).
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 성숙한 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이적 항체에서를 제외하고, 2개 결합 부위는 동일하다. 이러한 쇄는 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR로 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 결합된 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개 쇄로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의하여 정렬되고, 이는 특이적 에피토프로의 결합을 가능하게 한다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인으로의 아미노산의 배정은 면역학적 관심 대상인 단백질 서열, 카밧의 정의에 따른다 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), or Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). 카밧은 또한 널리 사용되는 넘버링 관례(convention) (카밧 넘버링)을 제공하며, 이는, 상이한 중쇄 사이에서, 또는 상이한 경쇄 사이에서의 잔기가 동일한 번호 (예를 들면, H83은 성숙 중쇄 가변 영역 내에서 카밧 넘버링에 의한 위치 83을 의미하며; 마찬가지로 위치 L36은 성숙 경쇄 가변 영역 내에서 카밧 넘버링에 의한 위치 36을 의미함)로 배정된다. 카밧 넘버링은, 달리 명백히 언급하지 않는다면, 항체의 가변 영역 내의 위치를 언급함에 있어 전체적으로 사용된다.
용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 의미한다. 전형적으로, 단편은 개별 중쇄, 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 디아바디, Dab, 나노바디, 및 Fv를 포함하는 표적에 대한 특이적 결합을 위해 유도된 온전한 항체와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의하여, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의하여 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 이중특이적 항체 및/또는 인간화 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 이중작용적 항체는 2개의 상이한 무거운/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 혼성화 항체이다 (참고: 예컨대, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992).
용어 "에피토프"는, 항체가 결합하는 항원에서의 부위를 지칭한다. 에피토프는, 하나 이상의 단백질의 3차 접힘에 의하여 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 변성 용매에 대한 노출에서 전형적으로 유지되며, 반면 3차 접힘에 의하여 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로의 처리에서 유실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 배좌에서 적어도 3개, 그리고 더욱 일반적으로는, 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 배좌를 결정하는 방법은, 예를 들면, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명을 포함한다. 다음을 참고한다: 예를 들면, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
인간화 항체는 유전적으로 조작된 항체이며, 여기서 비-인간 "공여체" 항체로부터의 CDR은 인간 "수용체" 항체 서열로 이식된다 (참고: 예를 들어, Queen, 미국 특허 번호 5,530,101 및 5,585,089; Winter, U.S. 특허 번호 5,225,539; Carter, 미국 특허 번호 6,407,213; Adair, 미국 특허 번호 5,859,205 및 6,881,557; Foote, U.S. 특허 번호 6,881,557). 수용체 항체 서열은, 예를 들면, 성숙 인간 항체 서열, 그러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 생식계열 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는, 바람직하게는 카밧에 의하여 정의된 바와 같이, 공여체 항체 및 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역으로부터 전체적으로 또는 실질적으로 유래된, 만약 존재한다면, 인간 항체 서열로부터 전체적으로 또는 실질적으로 유래된, CDR을 갖는 항체이다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화 항체에서의 CDR은, 상응하는 잔기 (카밧에 의하여 정의된)의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각 CDR 사이에서 동일할 경우, 비-인간 항체에서의 상응하는 CDR로부터 실질적으로 유래된다. 항체 쇄의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 쇄의 불변 영역은 실질적으로, 상응하는 잔기 (카밧에 의하여 정의된)의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각 동일할 경우, 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 각각 유래된다.
키메라 항체는, 비-인간 항체 (예를 들면, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙한 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합되는 항체이다. 그러한 항체는 실질적으로 또는 전적으로, 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하며, 인간 서열의 약 3분의 2이다.
베니어(veneered) 항체는 비-인간 항체의 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부 및 CDR 중 일부, 일반적으로 모두를 보유하나, B-세포 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 기타 가변 영역 프레임워크 잔기, 예컨대 노출된 잔기 (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)를 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기로 대체하는 인간화 항체의 유형이다. 상기 결과는 CDR이 비-인간 항체로부터 전적으로 또는 실질적으로 유래하는 항체이고, 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크는 치환에 의하여 더욱 인간과 유사하도록 제조되었다.
동일하거나 중첩되는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원으로의 또 다른 항체의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역검정에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 접촉 잔기를 동정하는 이의 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학에 의하여 또한 정의될 수 있다. 대안적으로, 만약 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거한다면, 2개의 항체가 동일한 에피토프를 갖는다. 만약 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거한다면, 2개의 항체가 중첩된 에피토프를 갖는다.
항체 사이의 경쟁은, 시험 하의 항체가 공통의 항원으로의 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의하여 결정된다 (참고, 예를 들면, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). 시험 항체는, 경쟁적 결합 검정에서 측정 시, 만약 과잉의 시험 항체 (예를 들면, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 참조 항체의 결합을 적어도 50%, 예를 들면, 75%, 90% 또는 99% 만큼 억제할 경우, 참조 항체와 경쟁한다. 경쟁 검정 (경쟁 항체)에 의하여 동정된 항체는, 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애가 발생하도록 참조 항체에 의하여 결합된 에피토프에 충분히 원위인 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
"대상체"는 예방적 또는 치료성 치료를 수용하는 인간 또는 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
백분율 서열 동일성은 카밧 넘버링 관례에 의하여 최대로 정렬된 항체 서열로 결정된다. 정렬 후, 만약 대상체 항체 영역 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 참조 항체의 상동한 영역과 비교될 경우, 대상체 및 참조 항체 사이의 퍼센트 서열 상동성은, 100을 곱하여 퍼센트를 변환한, 갭이 계수되지 않은, 2개 영역의 정렬 위치의 총 수로 나눈, 대상체 및 참조 항체 영역 둘 모두에서의 상동한 아미노산에 의하여 점유된 위치의 수이다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체를 포함하는 조성물은 항체를 단독으로, 또는 다른 성분과 병용하여 함유할 수 있다.
값의 범위 지정은 상기 범위 내에 있거나 이를 정의하는 모든 정수, 및 상기 범위 내의 정수에 의하여 정의된 모든 하부범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 분명하게 언급되지 않는다면, 용어 "약"은 언급된 값의 측정 (SEM)의 표준 오차 한계 내의 값을 포괄한다.
개체는 하기의 경우 질환의 증가된 위험에 처한다: 대상체가 적어도 하나의 공지된 위험-인자 (예를 들면, 유전적, 생화학적, 가족력, 상황적 노출)을 가지고 있어 상기 개체가 위험 인자가 없는 개인 보다 상기 질환이 발병될 통계적으로 유의미한 더 큰 위험에 처해있도록 그러한 위험 인자를 가질 경우.
용어 "증상"은 대상체에 의하여 인지된, 의 주관적 증거, 예컨대 변경된 보행을 지칭한다. "징후"는 의료진에 의하여 관찰된 질환의 객관적인 증거를 지칭한다.
약리적 길항제의 공-투여는 하기를 의미한다: 길항제는 혈장 내에 동시에 존재하는 길항제의 검출가능한 양으로 충분히 가까운 시간 간격으로 투여됨; 및/또는 길항제는 질환의 동일한 에피소드 상의 치료 효과를 가하거나, 길항제는 질환의 동일한 에피소드를 치료함에 있어서 동시-작동가능하게, 또는 상승작용적으로 작용한다.
"통계적으로 유의미함"은 <0.05, 바람직하게는 <0.01, 그리고 가장 바람직하게는 <0.001인 p-값을 지칭한다.
"소분자"는 약 600 미만의, 바람직하게는 약 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 정의된다. 일반적으로, 소분자는 비-펩티드 소 유기 분자이다.
I. 일반론
나탈리주맙이 실질적으로 인테그린 알파-4 인테그린으로의 이의 결합을 통하여 T-세포, 특히 TH1 세포의 CNS로의 분출을 억제한다고 하더라도, 일부 T-세포 (TH17)는 여전히 이의 리간드 라민-알파-4와의 MCAM 상호작용에 의하여 매개된 CNS로 진입한다. 본 출원은 알파-4 인테그린에 대한 조합된 봉쇄에 대한 증거를 제공하고, MCAM은 분자 단독보다 이들 세포에 의한 분출에 대해 더욱 효과적이다. 부분적으로 이러한 결과에 기반하여, 본 발명은 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제가 둘 다 다발성 경화증 또는 다른 자가면역 질환을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 투여되는 병용 치료 방법을 제공한다. 제제의 상기 조합은, 개별 길항제의 사용과 비교하여, 협조적 또는 상승작용적 효과, 그리고 결과적으로 더욱 큰 효능, 감소된 부작용, 및/또는 개선된 치료적 비전을 제공할 수 있다.
II. 표적 분자 및 그것의 리간드
알파-4 인테그린은 이종이량체 인테그린 알파4 베타1 (VLA-4) 및 알파4 베타7의 성분이다. 이의 리간드는 VCAM-1 및 파이브로넥틴을 포함한다. 인간 단백질의 예시적인 형태에 대한 스위스 프롯(Prot) 수탁 번호는 하기와 같다: 알파 -4, P13612, vcam-1, P19320.
MCAM (흑색종 세포 접합 부착, CD146 및 MUC18로도 공지됨)은 세포 부착이 관여된, 그리고 혈관 조직에서 세포관 접합에서의 내피 단일층의 응집이 관여된, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속한 세포 표면 당단백질을 지칭한다. 이는 또한 흑색종 및 전립선암을 포함하는 많은 암의 종양 진행을 촉진한다. 이는 동형/동종친화성 방식으로 상호작용하고, 다른 리간드에 또한 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 인간 MCAM은 하기 5개 면역글로불린 도메인을 포함한다: (1: 아미노산 잔기 19-129; 2: 아미노산 잔기 139-242; 3: 아미노산 잔기 244-321; 4: 아미노산 잔기 335-424; 및 5: 아미노산 잔기 430-510).
라미닌 α4는 라미닌 분자에 발견된 폴리펩티드 쇄 중 하나를 지칭하며, 이는 대부분의 세포 및 기관에 대한 기저 판 (기저막의), 단백질 네트워크 토대에서 발현된다. 라미닌은 원형질막 분자를 통하여 세포막에 결합하고 세포 부착에 기여하는 것으로 알려져 있다. 라미닌 α4 쇄는 전형적으로 라미닌 β-쇄, 및 라미닌 γ-쇄와의 복합체를 형성한다. 라미닌 α4 쇄는 라미닌 411 (라미닌 8 또는 α4β1γ1); 라미닌 421 (라미닌 9 또는 α4β2γ1), 및 라미닌 423 (라미닌 14 또는 α4β2γ3)을 포함하는 수많은 라미닌 분자에서 발견된다. 인간 라미닌 α4 쇄의 2개의 주요 이소형이 있다: 유전자은행 수탁 번호 NP001098676 및 NP001098677. "라미닌 411"는 하기의 3개의 폴리펩티드 하부단위 또는 쇄로 구성된 삼량체 폴리펩티드 복합체를 지칭한다: α4-쇄, β1-쇄, 및 γ1-쇄.
문맥에서 달리 분명하게 언급되지 않는다면, 알파-4 인테그린, VCAM-1, 파이브로넥틴, MCAM 및 라미닌-알파-4에 대한 언급은, 일반적으로 신호 펩티드(존재 시)를 제외한 그러한 단백질의 천연 인간 서열을 지칭한다. MCAM의 예시적인 인간 서열 및 이의 리간드 라미닌-알파-4에 대한 스위스 프롯 참조는 각각 P43121 및 Q16363이다.
III. 예시적인 길항제
알파-4 인테그린 또는 MCAM에 대한 길항제는, 항체, IgG 불변 영역으로의 수용체 또는 리간드의 융합 단백질, 기타 생물학적 결합 분자, 및 소분자를 포함한다. 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 항체는 비인간, 예컨대 마우스 또는 래트, 비인간 영장류일 수 있거나, 인간일 수 있다. 항체는, 키메라성, 베니어화, 인간화, 영장류화(primatized) 등이 될 수 있다.
비-항체 결합 분자는 하기를 포함한다: 예를 들면, 안티칼린 (리포칼린 스캐폴드에 기반함), 단백질 구조 (리간드 결합 부위를 형성하는 4개의 초가변성 루프를 지지하는 경성 베타-배럴 (rigid beta-barrel)에 의하여 특성화됨). 신규 결합특이성은, 기능적 현시(display) 및 유도된 선택과 조합하여, 루프 영역 내에서의 표적화된 랜덤 돌연변이유발에 의하여 조작된다 (Skerra (2008) FEBS J. 275: 2677-2683). 다른 적합한 스캐폴드는, 예를 들면, 인간 파이브로넥틴 III의 제10의 세포외 도메인에 기반한, 아드넥틴, 또는 모노바디 (Koide and Koide (2007) Methods Mol. Biol. 352: 95-109); 포도상구균 단백질 A의 Z 도메인에 기반한 애피바디 (Nygren et al. (2008) FEBS J. 275: 2668-2676)); 안키린 반복 단백질에 기반한, DARPin (Stumpp et al. (2008) Drug. Discov. Today 13: 695-701); 인간 Fyn 단백질 키나아제의 SH3 도메인에 기반한 피노머(fynomer) (Grabulovski et al. (2007) J. Biol. Chem. 282: 3196-3204); 설포로버스 아키도라리루스(Sulfolobus acidolarius) 유래의 Sac7d에 기반한, 아피틴(affitin) (Krehenbrink et al. (2008) J. Mol. Biol. 383: 1058-1068); 인간 y-B-크리스탈린에 기반한, 아피틴(affitin) (Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372: 172-185); 막 수용체 단백질의 A 도메인에 기반한, 아비머 (Silverman et al. (2005) Biotechnol. 23: 1556-1561); 시스테인-풍부 크노틴(knottin) 펩티드 (Kolmar (2008) FEBS J. 275: 2684-2690); 및 조작된 쿠니츠(Kunitz)-유형 억제제 (Nixon and Wood (2006) Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9: 261-268)를 포함할 수 있다. 검토를 위하여, 다음을 참조: Gebauer and Skerra (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13: 245-255.
알파-4 길항제 또는 알파-4 인테그린 길항제에 대한 언급은 하기를 지칭한다: 길항제, 예컨대, 알파-4 인테그린에 결합하고, 리간드, 예컨대 VCAM-1 및 파이브로넥틴을 갖는 알파-4 베타-1 또는 알파-4- 베타-7의 성분으로서의 이의 상호작용을 억제하는 항체, 또는 VCAM-1 또는 파이브로넥틴에 결합하고, 알파-4 인테그린과의 그러한 분자의 상호작용을 억제하는 항체. 일부 알파-4 인테그린 길항제는, 단리되거나, 또는 이종이량체 인테그린, 예컨대 알파-4 베타 1 또는 알파-4 베타-7의 성분인지의 여부와 관계 없이, 알파-4에 특이적으로 결합한다. 다른 알파-4 인테그린 길항제는, 오직 이종이량체 인테그린, 예컨대 알파-4 베타-1 또는 알파-4 베타-7의 성분으로서, 알파-4 인테그린에 특이적으로 결합한다.
바람직한 알파-4 인테그린 길항제는, 알파-4 인테그린에 특이적으로 결합하는 IgG4 인간화 항체, 나탈리주맙이며, VCAM-1 및/또는 파이브로넥틴으로의 알파-4 베타 1 및 알파-4 베타 7의 결합을 억제한다. 상기 항체는 FDA-승인된 것이고, 상업적으로 이용가능하다. 몇몇 마우스 항-VLA-4 단클론성 항체 예컨대 HP1/2 및 다른 항-VLA-4 항체 (예를 들면, mAb HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9)는 이전에 기술된 바 있다 (참고: 예를 들면, Pulido et al. (1991) J. BIOL. CHEM. 266(16):10241-5 및 Fryer et al. (1997) J. CLIN. INVEST. 99: 2036-2044). 그러한 항체의 인간화된, 키메라성 또는 베니어(veneered) 버전이 사용될 수 있다. 나탈리주맙과 함께 알파-4 인테그린에 결합하기 위한 항체가, 나탈리주맙으로서 동일한 카밧 CDR을 편입하는 다른 인간화 항체와 같이, 또한 사용될 수 있다. 길항제는 또한, VCAM-1 융합 단백질, VCAM-1/Ig 융합 단백질, 항-VLA-4 항체, 및 파이브로넥틴 펩티드 (바람직하게는 아미노산 서열 EILDV 함유)를 포함한다. 몇 개의 소분자는 이미 VLA-4 및/또는 LPAM-1 길항제로서 제안되었다. 이들은 WO96/22966, WO98/53817, WO01/14328, WO99/06431, WO99/06432, WO99/06436, WO99/10312, WO99/48879, WO00/18759, WO00/20396, WO99/36393, WO99/52898, WO99/62901, WO00/67746 및 WO02/08206 및 US 7,361,679에 기술되어 있다. 이러한 화합물들은 우레아 구조 또는 페닐알라닌 구조, 또는 2-페닐-3-헤테로아릴프로피온산 구조를 갖는다.
길항제 활성은, 파이브로넥틴 또는 VCAM-1 코팅된 플레이트에 대한 VLA-4- 또는 VLA-7 발현 세포 (예를 들면, 라모스(Ramos) 세포, 주르카트(Jurkat) 세포, A375 흑색종 세포, 뿐만 아니라 인간 말초 혈액 림프구 (PBL))의 결합을 차단하기 위하여 필요한 길항제의 농도를 측정하기 위한 몇몇 검정에 의하여 분석될 수 있다. 예를 들면, 일단 미세적정 플레이트의 웰이 파이브로넥틴 또는 가용성 VCAM-1로 코팅되면, 가변 농도의 실험 길항제가 이후 적절하게 표지된 VLA-4-발현 세포와 함께 부가된다. 대안적으로, 시험 길항제가 우선 부가되고, 표지된 VLA-4-발현 세포의 부가 전에 코팅된 웰로 배양하도록 할 수 있다. 세포를 적어도 30분간 웰 내에서 배양하였다. 배양 후, 웰을 비우고 세정하였다. 결합의 억제는, 다양한 농도의 시험 화합물 각각에 대하여, 뿐만 아니라 시험 화합물을 함유하지 않는 대조군에 대하여, 플레이트에 결합된 형광 또는 방사능을 정량화함으로써 측정된다.
MCAM 길항제는, 하기의 MCAM 능력을 완전히 또는 부분적으로 억제하는 길항제를 지칭한다: (i) 이의 리간드: 라미닌 α4 쇄, 예를 들면, 라미닌 411의 α4 쇄에 특이적으로 결합함; 및/또는 (ii) 대상체 조직에 침윤되거나 이로 이주되는 MCAM-발현 세포, 예를 들면, TH17 세포를 촉진함. MCAM 길항제는 MCAM에, 또는 이의 리간드 라미닌 알파-4에 결합하는, 항체 또는 다른 길항제를 포함한다.
MCAM에 대한 바람직한 길항제는, 항체 (WO 2012/170071 및 PCT/US2013/058773 (2013년 9월 9일 출원)에 기술됨), 특히 항체 지정된 클론 17 (WO 2012/170071에 기술됨) 및 마우스 항-인간 MCAM 단클론성 클론 지정된 1174.1.3, 1414.1.2, 1415.1.1, 및 1749.1.3, 및 래트 항-인간 MCAM 단클론성 항체 클론 지정된 2120.4.19 및 2107.4.10 (PCT/US2013/058773에 기재됨)이다. 단클론성 항체 클론 2120.4.19의 변이체가 미국 출원 번호 61/952,116 (2014년 3월 12일 출원)에 기술된다. 항체 중 임의의 것의 카밧 CDR 을 포함하거나, 또는 WO 2012/170071, 국제 출원 번호 PCT/US2013/058773, 미국 출원 번호 61/952,123 (2014년 3월 12일 출원), 또는 미국 출원 번호 61/952,116 (2014년 3월 12일 출원)에 기술된, 이들 항체의 키메라, 베니어(veneered) 또는 인간화된 형태가 또한 사용될 수 있다. 인간 MCAM으로의 결합을 위한 이들 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 항체는 잔기 141 또는 잔기 318을 포함하는 MCAM 상에서의 에피토프에 결합한다.
바람직한 항-MCAM 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 1을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 5를 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 포함하는 지정된 클론 17이다.
항체 클론 17의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00001
항체 클론 17의 CDRL1의 아미노산 서열
Figure pct00002
항체 클론 17의 CDRL2의 아미노산 서열
Figure pct00003
항체 클론 17의 CDRL3의 아미노산 서열
Figure pct00004
항체 클론 17의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00005
항체 클론 17의 CDRH1의 아미노산 서열
Figure pct00006
항체 클론 17의 CDRH2의 아미노산 서열
Figure pct00007
항체 클론 17의 CDRH3의 아미노산 서열
Figure pct00008
바람직한 항-MCAM 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 9을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 13를 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스 항-인간 MCAM 단클론성 클론 지정된 1174.1.3이다.
항체 1174.1.3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00009
항체 1174.1.3의 CDRL1의 아미노산 서열.
Figure pct00010
항체 1174.1.3의 CDRL2의 아미노산 서열.
Figure pct00011
항체 1174.1.3의 CDRL3의 아미노산 서열.
Figure pct00012
항체 1174.1.3의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00013
항체 1174.1.3의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00014
항체 1174.1.3의 CDRH2의 아미노산 서열.
Figure pct00015
항체 1174.1.3의 CDRH3의 아미노산 서열.
Figure pct00016
바람직한 항-MCAM 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 17을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 21를 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스 항-인간 MCAM 단클론성 클론 지정된 1414.1.2이다.
항체 1414.1.2의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00017
항체 1414.1.2의 CDRL1의 아미노산 서열.
Figure pct00018
항체 1414.1.2의 CDRL2의 아미노산 서열.
Figure pct00019
항체 1414.1.2의 CDRL3의 아미노산 서열.
Figure pct00020
항체 1414.1.2의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00021
항체 1414.1.2의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00022
항체 1414.1.2의 CDRH2의 아미노산 서열.
Figure pct00023
항체 1414.1.2의 CDRH3의 아미노산 서열.
Figure pct00024
바람직한 항-MCAM 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 25을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 29를 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스 항-인간 MCAM 단클론성 클론 지정된 1415.1.1이다.
항체 1415.1.1의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00025
항체 1415.1.1의 CDRL1의 아미노산 서열.
Figure pct00026
항체 1415.1.1의 CDRL2의 아미노산 서열.
Figure pct00027
항체 1415.1.1의 CDRL3의 아미노산 서열.
Figure pct00028
항체 1415.1.1의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00029
항체 1415.1.1의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00030
항체 1415.1.1의 CDRH2의 아미노산 서열.
Figure pct00031
항체 1415.1.1의 CDRH3의 아미노산 서열.
Figure pct00032
바람직한 항-MCAM 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 33을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 37을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역을 포함하는 마우스 항-인간 MCAM 단클론성 클론 지정된 1749.1.3이다.
항체 1749.1.3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00033
항체 1749.1.3의 CDRL1의 아미노산 서열.
Figure pct00034
항체 1749.1.3의 CDRL2의 아미노산 서열.
Figure pct00035
항체 1749.1.3의 CDRL3의 아미노산 서열.
Figure pct00036
항체 1749.1.3의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00037
항체 1749.1.3의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00038
항체 1749.1.3의 CDRH2의 아미노산 서열.
Figure pct00039
항체 1749.1.3의 CDRH3의 아미노산 서열.
Figure pct00040
바람직한 항-MCAM 항체는 래트 항-인간 MCAM 단클론성 항체 지정된 2120.4.19이다.
항체 2120.4.19 버전 1의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00041
항체 2120.4.19 버전 2의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00042
항체 2120.4.19 버전 3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00043
항체 2120.4.19의 CDRL1의 아미노산 서열.
Figure pct00044
항체 2120.4.19의 CDRL2의 아미노산 서열.
Figure pct00045
항체 2120.4.19의 CDRL3의 아미노산 서열.
Figure pct00046
항체 2120.4.19의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00047
항체 2120.4.19의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00048
항체 2120.4.19의 CDRH2의 아미노산 서열.
Figure pct00049
항체 2120.4.19의 CDRH3의 아미노산 서열.
Figure pct00050
바람직한 항-MCAM 항체는 래트 항-인간 MCAM 단클론성 항체 지정된 2107.4.10이다.
항체 2107.4.10 버전 1의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00051
항체 2107.4.10 버전 2의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00052
항체 2107.4.10의 CDRL1의 아미노산 서열.
Figure pct00053
항체 2107.4.10의 CDRL2의 아미노산 서열.
Figure pct00054
항체 2107.4.10의 CDRL3의 아미노산 서열.
Figure pct00055
항체 2107.4.10의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00056
항체 2107.4.10의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00057
항체 2107.4.10의 CDRH2의 아미노산 서열.
Figure pct00058
항체 2107.4.10의 CDRH3의 아미노산 서열.
Figure pct00059
바람직한 버전의 인간화된 1749 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 62을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 65를 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 버전 VH2/VL2이다.
항체 1749.1.3의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00060
인간화 항체 1749 버전 1 (VH1)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00061
인간화 항체 1749 버전 2 (VH2)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00062
항체 1749.1.3의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00063
인간화 항체 1749 버전 1 (VL1)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00064
인간화 항체 1749 버전 2 (VL2)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00065
항체 2107.4.10.18의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00066
인간화 항체 2107 버전 1 (VH1)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00067
인간화 항체 2107 버전 2 (VH2)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00068
인간화 항체 2107 버전 3 (VH3)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00069
인간화 항체 2107 버전 4A (VH4A)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00070
인간화 항체 2107 버전 4B (VH4B)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00071
인간화 항체 2107 버전 5A (VH5A)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00072
인간화 항체 2107 버전 5B (VH5B)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00073
인간화 항체 2107 버전 6 (VH6)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00074
항체 2107.4.10.18의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00075
인간화 항체 2107 버전 1 (VL1)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00076
인간화 항체 2107 버전 2 (VL2)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00077
인간화 항체 2107 버전 3 (VL3)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00078
항체 2120.4.19.6의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00079
인간화 항체 2120 버전 1 (VH1)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00080
인간화 항체 2120 버전 2 (VH2)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00081
인간화 항체 2120 버전 3 (VH3)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00082
인간화 항체 2120 버전 4 (VH4)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00083
인간화 항체 2120 버전 5 (VH5)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00084
항체 2120.4.19.6의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00085
인간화 항체 2120 버전 1 (VL1)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00086
인간화 항체 2120 버전 2 (VL2)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00087
인간화 항체 2120 버전 3 (VL3)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00088
인간화 항체 2120 버전 3 (VH3)의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00089
인간화 항체 2120 버전 4 (VH4)의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00090
인간화 항체 2120 버전 5 (VH5)의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00091
바람직한 버전의 인간화된 2120 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 82을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 86를 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 버전 VH5/VL3이다.
인간화 항체 2107 버전 1 (VH1)의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00092
인간화 항체 2107 버전 4 (VH4)의 CDRH1의 아미노산 서열.
Figure pct00093
인간화 항체 2120 버전 1-5 (VH1-VH5)의 CDRH3의 아미노산 서열.
Figure pct00094
바람직한 버전의 인간화된 1749 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 93을 갖는 중쇄 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 94를 갖는 경쇄를 포함하는, 버전 VH3/VL3이다.
인간화 항체 1749 버전 3 (VH3)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00095
인간화 항체 1749 버전 3 (VL3)의 성숙 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00096
바람직한 버전의 인간화된 2120 항체는, 아미노산 서열 지정된 서열 번호: 100을 갖는 중쇄 및 아미노산 서열 지정된 서열번호: 86를 갖는 경쇄를 포함하는, 버전 VH5 Q1E/VL3이다.
항체 2120.4.19.Q1E의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로서, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
Figure pct00097
인간화 항체 2120 버전 1 Q1E (VH1.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로서, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
Figure pct00098
인간화 항체 2120 버전 2 Q1E (VH2.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로서, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
Figure pct00099
인간화 항체 2120 버전 3 Q1E (VH3.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로서, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
Figure pct00100
인간화 항체 2120 버전 4 Q1E (VH4.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로서, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
Figure pct00101
인간화 항체 2120 버전 5 Q1E (VH5.Q1E)의 성숙 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로서, 여기서 위치 1 (카밧 넘버링)은 E에 의하여 점유된다.
Figure pct00102
N-말단에 아르기닌을 갖는, 인간화된 2120 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00103
N-말단에 아르기닌이 없는, 인간화된 2120 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00104
인간화된 2120 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00105
BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00106
BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00107
인간화 항체 2120 버전 3 (VL3 + 경쇄 불변 영역)의 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00108
인간화 항체 2120 버전 5 (VH5 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00109
Figure pct00110
인간화 항체 2120 버전 5 (VH5 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00111
인간화 항체 2120 버전 5 Q1E (VH5.Q1E + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00112
인간화 항체 2120 버전 5 Q1E (VH5.Q1E + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00113
인간화 항체 1749 버전 3 (VL3 + 경쇄 불변 영역)의 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00114
인간화 항체 1749 버전 3 (VH3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00115
인간화 항체 1749 버전 3 (VH3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00116
라미닌 알파-4에 결합하고 MCAM와의 상호작용을 억제하는 일부 예시적인 항체는 하기 서열에 의하여 특성화된다.
인간화된 19C12 중쇄 가변 영역 버전 1 (H1)의 아미노산 서열.
Figure pct00117
인간화된 19C12 중쇄 가변 영역 버전 2 (H2)의 아미노산 서열.
Figure pct00118
인간화된 19C12 중쇄 가변 영역 버전 3 (H3)의 아미노산 서열.
Figure pct00119
인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 1 (L1)의 아미노산 서열.
Figure pct00120
인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 2 (L2)의 아미노산 서열.
Figure pct00121
인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 3 (L3)의 아미노산 서열.
Figure pct00122
인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 4 (L4)의 아미노산 서열.
Figure pct00123
인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 5 (L5)의 아미노산 서열.
Figure pct00124
인간화된 19C12 경쇄 가변 영역 버전 6 (L6)의 아미노산 서열.
Figure pct00125
19C12 인간화 항체 (H1 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00126
Figure pct00127
19C12 인간화 항체 (H1 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00128
19C12 인간화 항체 (H2 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00129
19C12 인간화 항체 (H2 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00130
19C12 인간화 항체 (H3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00131
19C12 인간화 항체 (H3 + BIP 버전 중쇄 G1m3 동종이인자형 불변 영역)의 예시적인 성숙 중쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00132
Figure pct00133
19C12 인간화 항체 (L1 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00134
19C12 인간화 항체 (L1 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00135
19C12 인간화 항체 (L2 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00136
19C12 인간화 항체 (L2 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00137
19C12 인간화 항체 (L3 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00138
19C12 인간화 항체 (L3 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00139
19C12 인간화 항체 (L4 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00140
19C12 인간화 항체 (L4 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00141
19C12 인간화 항체 (L5 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00142
19C12 인간화 항체 (L5 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00143
19C12 인간화 항체 (L6 + N-말단에 아르기닌을 갖는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00144
19C12 인간화 항체 (L6 + N-말단에 아르기닌이 없는 경쇄 불변 영역)의 예시적인 성숙 경쇄 영역의 아미노산 서열.
Figure pct00145
라미닌 알파-4에 대한 예시적인 항체 결합 및 MCAM과의 그 상호작용 억제에는 예시된 인간화 19C12 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역(예로, H1L1, H1L2, H1L3, H1L4, H1L5, H1L6, H2L1, H2L2, H2L3, H2L4, H2L5, H2L6, H3L1, H3L2, H3L3, H3L4, H3L5, 및 H3L6)의 임의의 치환 또는 조합이 포함된다. 인간화 19C12 항체의 바람직한 버전은 H2 또는 H3 및/또는 L3 또는 L6을 포함하는 버전, 예컨대 H3 및 L6의 조합 또는 H2 및 L3의 조합이다.
키메라, 베니어 또는 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은, 부분적으로 항체-의존적 세포-매개된 세포독성, 항체 의존적 세포 포식작용 및/또는 보체 의존적 세포독성이 바람직한지 여부에 의존한다. 예를 들면, 인간 동위원소 IgG1 및 IgG3은 보체-의존적 세포독성을 가지며 인간 이소형 IgG2 및 IgG4는 이를 갖지 않는다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 강한 세포 매개된 효과기 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서의 하나 또는 몇몇 아미노산, 예컨대 중쇄의 C-말단 라이신은 분자의 일부 또는 전부에서 소실되거나 유도체화될 수 있다. 치환은 효과기 기능, 예컨대 보체-매개된 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시키기 위해(예로, Winter et al., 미국 특허 번호 5,624,821; Tso et al., 미국 특허 번호 5,834,597; 및 Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006 참고), 또는 인간에서 반감기를 연장하기 위해(예로, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004 참고) 불변 영역에서 수행될 수 있다. 예시적인 치환에는 항체의 반감기를 증가시키기 위해 위치 250에서 Gln 및/또는 위치 428에 Leu(불변 영역에 대해 본 단락에서는 EU 넘버링이 이용됨)이 포함된다. 임의 또는 전체 위치 234, 235, 236 및/또는 237에서의 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다(예로, US 6,624,821 참고). 인간 IgG1의 위치 234, 235, 및 237에서의 알라닌 치환이 효과기 기능을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 항체는 효과기 기능을 감소시키기 위해 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 237에서 알라닌 치환을 갖는다. 임의로, 인간 IgG2에서 위치 234, 236 및/또는 237은 알라닌으로 그리고 위치 235는 글루타민으로 치환된다(예로, US 5,624,821 참고). 일부 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 하나 이상의 위치 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329, 및 331에서의 돌연변이가 사용된다. 일부 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 하나 이상의 위치 318, 320, 및 322에서의 돌연변이가 사용된다. 일부 항체에서, 위치 234 및/또는 235는 알라닌으로 치환되고/되거나 위치 329는 글리신으로 치환된다. 일부 항체에서, 위치 234 및 235는, 예컨대 서열 번호: 105에서 알라닌으로 치환된다. 일부 항체에서, 이소형은 인간 IgG2 또는 IgG4이다. 예시적인 인간 경쇄 카파 불변 영역은 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 갖는다. 서열 번호: 101의 N-말단 아르기닌은 생략될 수 있고, 이 경우 경쇄 카파 불변 영역은 서열 번호: 102의 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 인간 IgG1 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 103의 아미노산 서열을 갖는다(C-말단 라이신을 갖거나 갖지 않음). 항체는 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄를 함유하는 사량체로서, 별도 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결되는 단일쇄 항체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개인 간에 동종이인자형(allotypic) 변이 및 이소동종이인자형(isoallotypic) 변이를 나타낸다, 즉 불변 영역은 하나 이상의 다형성 위치에서 상이한 개체에서 상이할 수 있다. 이소동종이인자형은 이소동종이인자형을 인식하는 혈청이 하나 이상의 이소형의 비-다형성 영역에 결합한다는 점에서 동종이인자형과 상이하다. 따라서, 예를 들면 또 다른 중쇄 불변 영역은 IgG1 G1m3 동종이인자형이고 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 중쇄 불변 영역은 C-말단 라이신이 없다는 것을 제외하고 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 중쇄 불변 영역은 C-말단 라이신이 없다는 것을 제외하고, 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 임의의 상기 불변 영역을 암호화하는 핵산을 추가로 제공한다. 임의로, 이러한 핵산은 신호 펩티드를 추가로 암호화하며, 불변 영역에 연결된 신호 펩티드와 함께 발현될 수 있다.
MCAM 길항제는 하기 방식으로 스크리닝될 수 있다. 하기 단계를 포함하는 MCAM-발현 세포: (a) 후보 분자의 존재 또는 부재 하에, 라미닌 α4 쇄, 예로 라미닌 411의 α4 쇄을 발현하는 세포 집단을 MCAM과 인큐베이션하는 단계; (b) 세포에 대한 MCAM 결합 수준을 모니터링하는 단계; 및 (c) MCAM 결합 수준이 상기 후보 분자의 부재 하에서보다 존재 하에 더 낮은 경우, 상기 후보 분자를 MCAM-발현 세포에 의한 CNS 침윤 억제제로서 확인하는 단계. 대안적인 스크리닝 프로토콜에는 라미닌 α4 쇄, 예로 라미닌 411의 α4 쇄을 발현하는 세포 집단의 이용이 관여되며, 이는 평가 화합물의 존재 및 부재 하에 MCAM과 인큐베이션될 수 있고, 세포 집단에 대한 MCAM의 결합은, 예로 형광 현미경에 의해 모니터링될 수 있다.
IV. 다발성 경화증 및 다른 자가면역 질환
본 방법은 다발성 경화증의 임의의 또는 전체 그 하위유형을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 적어도 4 개의 하위유형이 존재한다. 재발-완화 MS(RR-MS)는 MS의 가장 일반적인 형태로, 부분적 또는 완전 회복이 뒤따르는 명확히 정의된 악화/재발(급성 발작)을 특징으로 한다. 재발 기간 사이에는 질환이 진행되지 않는다. 처음에(진단 시), RR-MS가 모든 새로 진단된 대상체의 약 85%를 차지한다. 체온 상승이 침묵 또는 기존 병소를 드러낼 수 있으므로, 재발의 정의는 열 또는 병발성 질병(예컨대 "독감" 또는 요로 감염)과 연관되지 않는 신규 증상 또는 징후가 적어도 24 시간 동안 존재하는 것을 필요로 한다.
일차 진행(PP-MS)은 명확한 재발 없이 시작부터 지속된다. 편평기(안정화 기간)가 존재할 수 있다. 전체 MS 대상체의 10-15%가 이 그룹에 속하며, 고령 개인에서 일어나는 경향이 있다. 여성이 약 2:1로 우세한 다른 형태들과는 달리, 이 그룹에서 여성 대 남성 비는 동일하다. 또한 PP-MS는 더 적은 대뇌 MRI 변화 및 더 많은 척수병증/척추 관련 변화를 나타내는 경향이 있다.
이차 진행 형태(SP-MS)는 RR-MS로 시작되며, 이후 일정한 진행이 재발을 갖거나 갖지 않고 일어난다. 대략 50%의 재발-완화 대상체가 이차 진행 형태로 진행된다.
약 5% 개인에서 일어나는 진행 재발 형태(PR-MS)는 중첩된 재발과 더불어 개시 시부터 진행된다(회복을 포함하거나 포함하지 않음).
MS의 진단은 보통 자기 공명 조영(MRI), 유발 전위(EP) 및 척수액 분석을 포함하는 병력, 신경학적 검사 및 다양한 테스트에 기반한다. MS의 확진은 뇌, 척추 및 시신경을 포함하는 중추 신경계(CNS)의 적어도 2 개의 별도 영역 내 손상 증거, 그리고 손상이 적어도 1 개월 떨어져 발생했다는 증거 그리고 모든 다른 가능한 진단의 배제를 필요로 한다. 본 방법은 당분야에서 인식하는 기준에 의한 MS 진단을 갖는 대상체의 치료적 처치뿐만 아니라, 건강한 개인의 일반 집단에 비해 MS 진행에 대해 증가된 위험을 갖도록 하는 적어도 하나의 MS 징후 또는 증상을 갖는 개인을 치료하기 위해 예방적으로도 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 방법은 MS-유사 증상이 1 회 발작한(또한 재발 또는 악화로 불림)-임상적으로 분리된 증후군(CIS)으로 불림-개인을 치료하기 위해 이용될 수 있고, 이들은 MS가 발생하도록 진행될 수도 진행되지 않을 수도 있다. MS 발생 위험이 있는 개인은 다른 방법 중에서도 이들의 혈청 중 단백질 KIR4.1에 대한 항체의 존재에 의해 또한 확인될 수 있다.
병용 치료 방법은 또한 다른 자가면역 질환, 특히 나탈리주맙이 개별적으로 효능 증거를 실증한 크론병 또는 류마티스성 관절염과 같은 것들뿐만 아니라 나탈리주맙이 아직까지 단독으로 허용가능한 효능 증거를 나타내지 않았지만 MCAM 길항제와 조합되어 효능 증거를 나타낼 수 있는 다른 자가면역 질환에 대해 이용될 수 있다. 자가면역 질환에는 전신 자가면역 질환, 기관- 또는 조직-특이적 자가면역 질환, 및 자가면역-유형 발현을 나타내는 질환이 포함된다. 이들 질환에서, 신체는 그 자신의 항원 중 하나에 대해 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 개발하여 그 항원의 파괴 및 잠재적으로 심각한 및/또는 치명적인 결과로 이어진다. 존재하는 경우, 세포 반응은 B-세포 또는 T-세포 또는 둘 다일 수 있다. 본 방법은 특히 적어도 그 일부가 TH1 또는 TH17 세포이고, 바람직하게는 TH1 및 TH17 세포 둘 다인 T-세포에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 자가면역 질환의 치료에 특히 적합하다. 인터류킨(IL)-17 및 IL-22의 생산을 특징으로 하는 T 헬퍼 세포 계통의 TH17 세포는 조직이 인간에서 다발성 경화증 및 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 포함하는 병원성 자가면역 반응을 촉진하도록 하는 것으로 보고되었다. 예로, [Cua et al., Nature 421: 744-748 (2003); Ivonov et al., Cell 126: 1121-1133 (2006)]을 참고하라. TH17 세포는 이들의 조직으로의 특이적 모집 및 침윤에 의해 염증 반응을 개시하거나 전파할 수 있다. 치료에 적합한 T-세포 매개된 자가면역 질환의 예에는 다발성 경화증, 크론병, 류마티스성 관절염, 건선, 건선 관절염 및 사르코이드증이 포함된다.
치료에 적합한 추가적인 자가면역 질환의 예에는 그레이브스병, 하시모토 갑상샘염, 자가면역 다분비선 증후군, 인슐린-의존적 당뇨병(1 형 당뇨병), 인슐린-저항성 당뇨병(2 형 당뇨병), 면역-매개 불임, 자가면역 애디슨병, 보통 천포창, 낙엽 천포창, 포진 피부염, 자가면역 탈모증, 백반증, 자가면역 용혈 빈혈, 특발성 저혈소판 자색반병, 자가면역 저혈소판 자색반병, 악성 빈혈, 중증 근무력증, 길랭-바레 증후군, 강직 증후군, 급성 류마티스열, 교감 눈염증, 굿파스처 증후군, 자가면역 포도막염, 측두 동맥염, 바체트병, 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 원발 쓸개관 경화, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 섬유근통, 다발근육염, 피부근염, 강직 척추염, 다카야스 동맥염, 지방층염, 유사 천포창, 원인불명 혈관염, anca 음성 혈관염, anca 양성 혈관염, 전신 홍반성 루푸스, 피부경화증, 전신 괴사 혈관염, 베게너 육아종증, CREST 증후군, 항인지질 증후군, 쇼그렌 증후군, 호산구성 위장염, 비정형 국소 피부염, 심근병증, 감염-후 증후군, 감염후 심내막심근염, 및 셀리악병이 포함된다.
V. 병용 치료
본 발명은 나타낸 알파-4 인테그린 및 MCAM 길항제가 다발성 경화증, 또는 본원에 개시된 다른 질환을 갖거나 그에 대해 증가된 위험을 갖는 대상체에 투여되는 치료 방법을 제공한다. 아래에 추가로 기재되는 바와 같이, 길항제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있고, 순차적으로 투여되는 경우 어느 순서로든 투여될 수 있다. 본 방법은 인간 대상체의 치료에 특히 적합하다.
길항제는 임의의 적합한 경로, 특히 생물학적 제제의 경우, 정맥내(IV) 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 근육내, 또는 피하, 또는 복강내로 대상체에 비경구 투여될 수 있다. IV 주입은, 예를 들면 15 분 내지 3 시간, 보다 전형적으로 30-90 또는 45-75 분의 기간에 걸쳐 제공될 수 있다.
길항제는 치료적 처치의 경우, 질환의 징후 또는 증상을 감소시키거나 적어도 증상의 진행 또는 악화를 지연하기 위해, 그리고 예방적 처치의 경우 증상의 발생을 지연하거나 억제하기 위해 유효한 방식(용량, 투여 빈도, 투여 경로, 상대적 투여 순서)으로 투여된다.
알파-4 인테그린 길항제가 MCAM 길항제와 조합 사용되는 경우, 조합은 임의의 편리한 시간틀에 걸쳐 일어날 수 있다. 예를 들면, 각각의 길항제는 같은 날 대상체에 투여될 수 있고, 길항제는 동일한 정맥내 주입으로 투여될 수도 있다. 그러나, 길항제는 날짜를 교대하거나 주를 교대하여, 2 주를 교대하거나 개월을 교대하는 등으로 투여될 수 있다. 일부 방법에서, 각각의 길항제는 길항제가 치료받는 대상체에서(예로 혈청 중) 검출가능한 수준으로 동시에 존재하는 충분히 가까운 시간으로 투여된다. 일부 방법에서, 일정 시기(상기 참고)에 걸쳐 여러 용량으로 구성된 하나의 길항제의 전체 치료 과정에는 또한 여러 용량으로 구성되는 다른 길항제의 치료 과정이 뒤따른다. 일부 방법에서, 대상체가 최초 투여된 길항제에 대해 내성을 갖거나 내성이 발생하는 경우 두 번째 투여되는 길항제를 이용한 치료가 시작된다. 일부 방법에서, 환자에서의 자가면역 반응의 성질이 주로 TH1 세포에서 TH17 세포에 의해 매개되는 것으로 변화하는 경우 두 번째 투여되는 길항제의 치료가 시작된다.
일부 방법에서, 알파-4 인테그린 길항제의 치료 과정이 먼저 투여된 후 MCAM 길항제의 치료 과정이 뒤따른다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 첫 번째 알파-4 인테그린 길항제 치료 과정의 개시 시 재발-완화 다발성 경화증을 갖거나 그의 증강된 위험을 가지며, MCAM 길항제를 이용한 치료 과정의 개시 시 이차 진행 형태로 이행하였다.
대상체는 각 길항제를 이용한 1 회 치료 과정만을 받을 수도 있고 하나 또는 두 길항제 모두의 다회 과정을 받을 수도 있다. 때때로 주치의가 판단하여 대상체에게 유익한 경우, 두 길항제의 투여 사이에 1, 2 또는 수 일 또는 주의 회복 기간이 허용된다. 적합한 치료 방식이 이미 하나의 길항제에 대해 구축된 경우(예로, 나탈리주맙에 대해 iv 주입에 의해 4 주 마다 300 mg), 그 방식이 해당 길항제를 다른 길항제와 조합 사용할 때 이용될 수도 있지만, 길항제 간의 협력 또는 상승 효과로 인해 더 낮은 투여량이 투여될 수도 있다. 길항제는 일생 동안 또는 길항제에 의한 뚜렷한 억제 없이 질환이 진행될 때까지 투여될 수 있다.
병용 치료의 효능은 CNS 내 총 병소의 수, 가돌리늄-증강된(즉, 신규 병소)의 수, 재발 빈도, 최초 재발까지의 시간 및 다양한 장애 지수, 예컨대 확장된 장애 상태 척도(Expanded Disability Status Scale) 또는 기능적 시스템 스코어(Functional System Score)를 포함하는 다발성 경화증에 대한 통상적 종결점에 의해 평가될 수 있다. 2 개 길항제를 이용하는 치료를 투여하는 경우, 각각의 길항제가 투여되는 방식은 각각의 길항제가 요법에 기여를 할 수 있도록 하는 방식으로 조합된다. 바람직하게는, 제1 및 제2 길항제를 이용하는 본 발명에 따른 치료는 조합에서와 같이 개별적으로 동일한 몰 용량이 개별적으로 사용되는 제1 및 제2 길항제 각각에 비해 바람직한 반응의 객관적 측정치 증가로 이어진다(길항제가 협력 작용함). 보다 바람직하게는, 제1 및 제2 길항제를 이용한 치료는 조합에서의 조합된 몰 투여량으로서와 개별적으로 동일한 몰 투여량으로 개별적으로 사용되는 제1 및 제2 길항제 각각에 비해 바람직한 반응의 객관적 측정치 증가로 이어진다(즉, 길항제가 상승 작용함). 바람직하게는, 조합된 길항제에 대한 반응의 객관적 측정치의 증가는 조합에서 동일한 길항제와 동일 몰 용량에서 또는 조합에서 조합된 길항제의 몰 용량과 동일 몰 용량에서 개별 길항제를 이용한 치료에 비해 적어도 10%, 20%, 30% 또는 40% 그러나 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 80%, 90% 또는 100% 더 효과적이다.
전형적으로, 객관적 반응률은 개별 치료 또는 위약을 수여받는 대상체의 대조군에 비해 병용 치료를 수여받는 대상체로부터 임상 시험(예로 II 상, II/III 상 또는 III 상 시험)에서 평가된다.
각각의 항체 또는 다른 생물학적 길항제의 용량은 때때로 0.1 내지 20 mg/체중 kg, 예를 들면 0.5 내지 10 또는 3-7 mg/kg이다. 때때로 용량은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 mg/kg이지만, 10 mg/kg 또는 심지어 15 또는 20 또는 30 mg/kg만큼 높을 수 있다. 고정 단위 용량, 예를 들면 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 제공될 수도 있고, 또는 용량은 대상체의 표면적에 기반할 수도 있다, 예로 100 mg/m2일 수도 있다. 각 제제의 예시적인 고정 용량은 50-500 mg/대상체, 100-200 mg/대상체 또는 50-150 mg/대상체이다. 용량은 1 일 1 회, 1 주 2 회, 1 주 1 회, 2 주 1 회, 4 주 1 회 또는 일부 다른 간격으로 투여될 수 있다. 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 다발성 경화증의 유형을 포함하는 대상체의 생리적 상태, 대상체의 유전적 상태, 대상체가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 포함하는 여러 상이한 요인에 따라 변한다.
소분자 길항제는 전형적으로 더 자주, 바람직하게는 1 일 1 회 투여되지만, 2 일 1 회, 주 1 회 또는 일부 다른 간격과 마찬가지로 1 일 2, 3, 4 회 이상도 가능하다. 소분자 약물은 종종 경구 섭취되지만, 예로 IV 주입 또는 볼루스 주사에 의해 또는 피하 또는 근육내로, 비경구 투여도 가능하다. 소분자 약물의 용량은 전형적으로 1 또는 10 내지 1000 mg이고, 매우 전형적으로는 100, 150, 200 또는 250 mg이며, 최적 용량은 임상 시험에서 구축된다.
알파-4 인테그린 및 MCAM 길항제의 조합은 또한 다발성 경화증에 대해 유효한 임의의 다른 약물, 예컨대 배경 섹션에 개시된 것들과 함께 투여될 수 있다.
임의로, 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 조합 제품 또는 키트에서, 예를 들면 동일 패키지 또는 홀더 내 별도의 바이알로 조합될 수 있다. 이들 길항제의 일부 조합은 또한 동일한 조성물에서 혼합될 수 있다. 이러한 조성물 및 키트는 제조사에 의해 또는 헬쓰 케어 제공자에 의해 형성될 수 있다. 키트 및 조성물은 본 발명의 임의 방법에서 이용하기 위한 지침과 함께 제공될 수 있다.
VI. 약제학적 조성물, 투여량, 투여 경로
비경구 투여용 약제학적 조성물은 멸균성이고 실질적으로 등장성이며(230-350 mOsm/kg) GMP 조건 하에 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 단위 투여량 형태(즉, 단회 투여용 투여량)로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 주사를 위해, 항체는 수용액, 바람직하게는 생리적 상용성 버터, 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리적 염수 또는 아세테이트 완충제 중에 제형화될 수 있다(주사 부위에서의 불편함을 감소시키기 위해). 용액은 제형 길항제, 예컨대 현탁, 안정화 및/또는 분산 길항제를 함유할 수 있다. 대안적으로 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예로 발열원-비함유 멸균수로 구성하기 위한 동결건조된 형태일 수 있다.
상기 또는 하기 언급되는 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 공보, 접근 번호 등은 각각의 개별 항목이 구체적이고 개별적으로 참고로 편입되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 이들의 전체가 참고로 편입된다. 상이한 시점에 상이한 버전의 서열이 접근 번호와 연관되는 경우, 본 출원의 유효 출원일 당시 접근 번호와 연관된 버전이 의도된다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 해당되는 경우, 접근 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 중 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 시점에 상이한 버전의 공보, 웹사이트 등이 공개되는 경우, 달리 나타내지 않는 한 출원의 유효 출원일에서 가장 최근 공개된 버전이 의도된다. 본 발명의 임의의 특색, 단계, 요소, 구현예 또는 측면은 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 임의의 다른 것과 조합 사용될 수 있다. 본 발명이 예시로서 그리고 명확성 및 이해의 목적을 위한 예로서 일부 상세히 기재되었으나, 첨부된 청구범위의 범위 내에서 일정 변화 및 변경이 실시될 수 있음이 자명할 것이다.
실시예
나탈리주맙의 포화율은 (T) 림프구의 진입을 완전 차단하지만, 나탈리주맙 치료 하의 대상체는 CSF 및 추정하면 CNS에 여전히 검출가능한 수의 면역 세포를 가져서 일부 면역 세포 집단에 있어서 CNS에 진입하는 대안적 기전이 존재함을 제시한다. 따라서 본 발명자들은 조기 이동 이벤트의 기전과 그 주요 분자인 매우 후기 항원-4(VLA-4, α4β1 = CD49d/CD29 인테그린) 및 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1 = CD162)을 연구하였다. 이들 분자 및 이들의 리간드 또는 상대 수용체(VLA-4의 경우 VCAM-1 및 PSGL-1의 경우 P-셀렉틴)가 T 세포의 내피 장벽으로의 테더링(tethering), 롤링 및 부착, 그리고 CNS 내로의 성공적인 유출에 관여된다.
물질 및 방법:
대상체 및 건강한 대조군
2005 개정 McDonald 진단 기준(Polman et al., Ann. Neurol. 58(6):840-846 (2005))에 따라 임상적으로 확진된 활성 RRMS가 진단된 381 명의 대상체가 본 연구에 참여하였다. 이들 MS 대상체를 최대 80 개월 동안 나탈리주맙으로 계속 치료하였고, 임상 및 MRI 파라미터 평가에 따르면 안정하였다. 상기 코호트에서 21 명의 대상체는 말초혈 평가와 병행하여 CSF 분석을 받았다. 신경 또는 면역-매개 질환의 이전 병력이 없는 39 명의 연령 및 성별-매치된 건강한 공여체(HD)가 대조군으로 작용하였다. 또한 49 명의 나탈리주맙-비처리 MS 대상체, 32 명의 비-염증성 신경 질환(NIND)을 갖는 대상체, 및 14 명의 신경 질환이 없는 대상체가 대조군으로 작용하였다.
생체물질 및 유세포 측정
말초혈 단핵 세포(PBMC)를 이전에 기재된 바와 같이(Schwab et al., J. Immunol. 184(9):5368-5374 (2010)) 림프구 분리 매질(PAA Laboratories, Pasching, Austria)을 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. CSF의 유세포 측정 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Schwab et al., Mult. Scler. 18(3):335-344 (2012)). 생체외 단리되거나 배양된 세포를 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 인산염-완충 염수(PBS)로 세정하고 30 분 동안 4℃에서 차단 마우스 IgG(Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany)와 함께 형광-표지된 단클론성 항체(Mab)로 염색하였다. 이어서 세포를 FACSCalibur(BD Biosciences, Heidelberg, Germany) 및 Gallios™ 뿐만 아니라 Navios™ 유세포 측정기(Beckman Coulter, Krefeld, Germany) 상에서 측정하고 FlowJo(Tree Star, Ashland, OR, USA) 및 Kaluza(Beckman Coulter) 소프트웨어를 이용해서 분석하였다. 연구에서 사용된 MAb를 표 1에 나타낸다. 유세포 측정 항-CD49d mAb(클론 9F10)는 CD49d 및 결합된 나탈리주맙(IgG로 이차 표지됨, 데이터는 나타내지 않음)의 동시 표지를 가능케 한다. 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMECs)를 융합성으로 키우고 트립신 처리하였다. 세포를 0.1% 나트륨 아자이드 및 1% 소 혈청 알부민 함유 PBS(FACS 완충제) 중에 1 회 세정하고, 15 분 동안 항-인간 단클론성 항체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 FACS 완충제로 1 회 다시 세정하고, 200 ㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁하였다. HBMEC 염색을 위해 사용된 항-인간 단클론성 항체를 표 2에 제공한다. 각각의 이소형 대조군(마우스 IgG1 및 마우스 IgG2a)는 BioLegend/Becton Dickinson Biosciences 또는 Exbio에서 가져왔다. 데이터를 Gallios™ 유세포 측정기(Beckman Coulter) 상에서 획득하고 Kaluza 소프트웨어, 버전 1.2(Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.
유세포 측정을 위해 사용된 단클론성 항체
항체 대상: 클론 제조사
CD3 UCHT1 Beckman Coulter
CD4 13B8.2 Beckman Coulter
CD8 B9.11 Beckman Coulter
CD11a HI111 BD Pharmingen
CD14 MoP9 BD Biosciences
CD19 HIB19 BD Biosciences
CD31 WM59 BioLegend
CD45 J33 Beckman Coulter
CD45RA HI100 BD Biosciences
CD49d 9F10 BioLegend
CD54 MEM-111 BioLegend
CD56 NCAM16.2 BD Biosciences
CD62E HAE-1F BioLegend
CD62L DREG-56 BioLegend
CD62P AK6 Acris
CD106 STA BioLegend
CD146 P1H12 BD Biosciences
CD162 KPL-1 BioLegend
CD197 (CCR7) 3D12 BD Biosciences
면역세포화학을 위해 사용된 단클론성 항체
항체 대상: 클론 제조사
CD8 144B Abcam
CD54 3H1547 Acris
CD62P 1E3 Santa Cruz
CD106 1.4C3 Acris
CD146 EPR3208 Millipore
면역세포화학
조직화학 연구를 위해, 4 ㎛ 두께의 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 조직 섹션을 미엘린 온전성에 대해 록솔 패스트 블루로, 그리고 염증성 침윤물에 대해 H&E로 염색하였다. 면역조직화학 연구를 위해, 사용된 항체는 항-CD68, CD106(VCAM1, 마우스-IgG1, 1.4C3, Acris) 및 CD62P(P-셀렉틴, 마우스 IgG2a, 1E3, Santa Cruz)였다. 이차 항체(Envision™ + Dual Link System-HRP, DAKO)는 HRP 접합되었고, 디아미노벤지딘(DAKO)을 발색 기질로 사용하였다. 항원 검색은 EnVision™ FLEX 표적 검색 솔루션, 저 pH(DAKO)을 이용하여 수행하였고, 내인성 페록시다제 활성을 메탄올 중 3% 과산화수소로 차단하였다. 총 3 명의 MS 대상체 및 3 명의 대조군을 염색을 위해 이용하였다.
모세관 유동 챔버
백혈구 부착을 연구하기 위해, 본 발명자들은 인간 유동 챔버 시스템을 이용하였다. 간략하게, 유리 모세관을 2 h 동안 P-셀렉틴(20 ㎍/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN), VCAM-1(20 ㎍/ml, R&D Systems) 또는 P-셀렉틴(20 ㎍/ml, R&D Systems), VCAM-1(20 ㎍/ml, R&D Systems) 및 SDF1(20 ㎍/ml, R&D Systems)로 코팅하였다. 챔버를 1 h 동안 1% 카제인(Fisher Scientific, Waltham, MA)으로 차단한 후 1 dynes/cm2의 일정한 전단 응력에서 단리된 CD4 세포로 관류시켰다. CD4 세포의 포획을 연구하기 위해, 유동 챔버를 P-셀렉틴(20 ㎍/ml)만으로 코팅하고 2 분 동안 1 dynes/cm2의 일정한 전단 응력에서 단리된 CD4 세포로 관류시킨 후 시야 필드 당 롤링 세포의 수를 결정하였다. 10x/0.25 대물 렌즈 및 디지털 카메라(Pixelfly, Cooke Corporation, Romulus, MI)가 장착된 반전 TS1000 투과 광 현미경(Nikon)으로 비디오를 수득하였다.
평행 판 유동 챔버
일차 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)를 ScienCell Research Laboratories(San Diego, CA, USA)에서 구매하여 35 mm 배양 디쉬 상에 융합성으로 성장시켰다. 세포를 16 시간 동안 TNFα(10 nM)로 자극하였다. 인간 CD4+ T-세포를 계수하고, 관류 완충제(FCS 및 HEPES가 보충된 배지 199)에 재현탁하였다. 세포를 8 분 동안 0.25 dyne/cm2의 일정한 전단 응력으로 평행 판 유동 챔버(Glykotech, Gaithersburg, MD, USA)를 통해 관류시켰다. 10x/0.25NA 대물 렌즈 및 디지털 카메라가 장착된 반전 현미경(Nikon TS-1000)을 이용해서 세포를 관측하였다. CamWare 소프트웨어(PCO Ag, Kelheim, Germany)를 이용해서 비디오를 녹화하고, 시야 필드 당 롤링 및 부착 세포를 분석하였다.
통계 분석
페어형성 스튜던트 t-테스트를 이용한 동일한 대상체의 말초혈 및 CSF 간 대조를 제외하고, 비-페어형성 스튜던트 t-테스트를 이용해서 두 그룹 간 통계적 유의차를 결정하였다. p* 값 < 0.05, p** < 0.01 및 p*** < 0.001인 경우, 차이가 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 통계 및 연관성 평가를 위한 소프트웨어는 Prism 5(GraphPad, La Jolla, CA, USA)였다.
실시예 1. 나탈리주맙을 이용한 장기 치료 하의 MS 대상체에서 단리된 뇌척수액이 중추 면역 반응의 정상화를 반영함
도 1(a-c)는 나탈리주맙을 이용한 장기 치료 하의 뇌척수액 중 변화가 MS 대상체에서 중추 면역 반응의 정상화를 반영함을 보여준다. 도 1a는 비처리 RRMS 대상체(흰 원; n=4) 또는 대조군 대상체(검은 사각형; n=14)로부터의 대응하는 말초혈 샘플(검은 원) 및 CSF 값과 비교되는 경우, 장기 치료된 나탈리주맙 대상체(검은 삼각형; n=18)의 CSF 조성을 나타낸다. 도 1b는 장기 치료된 나탈리주맙 대상체(n=18)의 CSF에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 효과기/기억 구획을 나타낸다. 비처리(CD45RA+CCR7+), 중추 기억(CD45RA-CCR7+), 및 효과기 기억(CD45RA-CCR7-) CD4+ 및 CD8+ T 세포를 나타낸다. 추가로, CD8+ T 세포의 경우 TEMRA(CD45RA+CCR7-)를 나타낸다. 도 1c는 비-염증성 신경 질환(NIND; n=33), RRMS 대상체(n=12), 및 장기 나탈리주맙 요법 하의 MS 대상체(n=18)에서 효과기 기억 CD4+ T 세포(EM) 및 중추 기억 CD4+ T 세포(CM)에 관한 CSF 조성을 나타낸다.
장기 나탈리주맙-치료받은(LTNT, 18 개월 이상 연속 치료) RRMS 대상체로부터의 PBMC의 유세포 측정 분석은 모든 주요 면역 세포 하위세트의 상대 수준이 정상 한계 내에 있음을 드러내었다. 그러나 임상적으로 안정한 LTNT 대상체의 뇌척수액으로부터 유도된 면역 세포의 평가는 치료받은 적 없는(비처리) 안정한 RRMS 대상체에 비해 하위세트 간에 뚜렷한 차이를 드러내었다: CD14+ 단핵구의 백분율은 나탈리주맙-치료받은 대상체에서 상승하였고(18.9% 대 1.4%), 임의의 신경 질환이 없는 대조군 대상체에서와 유사하였다(13.2%). CD4+ T 세포의 백분율은 감소된 반면(11.8% 대 66.5%) CD8+ T 세포는 변하지 않아서 비처리 MS 대상체에 비해 역전된 CD4:CD8 비를 일으켰다(0.54 대 3.24)(도 1a). CD4+ 및 CD8+ T-세포 효과기-기억 구획을 살펴보면, 말초 효과기-기억 구획에 비해 CSF에서 기억 세포쪽으로 예상되는 이동이 있었다(도 1b). 중요하게는 LTNT 대상체에서 CD4 효과기-기억(EM) 및 중추-기억(CM) 세포 간 비(EM:CM 81:7)가 또한 비-염증성 신경 질환과 유사하였고(62:32), 치료받은 적 없는 안정한 RRMS 대상체(27:68)에 비해 역전되었다(도 1c). 이들 결과는 효과기 기억 세포가 나탈리주맙의 존재 하에 중추 기억 세포보다 CNS에 대해 더 우수한 접근을 허용하는 기전을 가짐을 제시한다.
실시예 2. 장기 나탈리주맙 요법 하의 말초 및 중추 T-세포 구획에서의 CD49d 발현
도 2(a-c)는 장기 나탈리주맙 요법 하의 말초 및 중추 T-세포 구획에서의 CD49d 발현을 나타낸다. 도 2a는 건강한 대조군(n=26) 또는 나탈리주맙 요법 시작 전(MS 비처리; n=33), 또는 나탈리주맙 요법 동안(n=486) MS 대상체의 말초 CD4+ 및 T 세포 상에서 CD49d의 발현을 나타낸다. 도 2b는 건강한 대조군(n=10), 치료 전(n=15) 및 나탈리주맙 치료 동안(n=49) MS 대상체의 혈청 중 가용성 VCAM-1을 나타낸다. 도 2c는 장기 치료받은 나탈리주맙 대상체(n=18)의 말초 및 CSF CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD49d의 발현 대조를 나타낸다.
세포 집단에서의 변화에 이어서, 나탈리주맙, CD49d, 및 그 리간드 VCAM-1에 의해 표적화된 분자의 발현을 평가하였다. 나탈리주맙 치료는 말초혈 CD4+ T 세포 상 CD49d 표면 발현의 신속한 감소를 유도하였고, 여기에는 유전자 발현에서의 하향조절이 수반되지 않았다(도 2a). 또한, 나탈리주맙 치료는 첫 번째 주입을 받은 혈청 중 CD49d 리간드의 가용성 형태, VCAM-1을 실질적으로 감소시켰다(도 2b). 놀랍게도, CD49d 발현은 말초 T 세포에서의 하향조절된/낮은 CD49d 수준과 비교되는 경우에도, LTNT 대상체의 CSF T 세포 상에서 검출불가능하였다(도 2c).
실시예 3. 나탈리주맙 치료가 PSGL-1의 상향조절을 유도함
도 3(a & b)는 나탈리주맙 치료가 PSGL-1의 상향조절을 유도함을 나타낸다. 도 3a는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 건강한 대조군(흰색; n=15), 장기 나탈리주맙 요법 이전(검은색; n=15) 또는 이후(회색; n=47) 대상체에서의 PSGL-1의 표면 발현 수준을 나타낸다. 도 3b는 건강한 대조군(n=15)과 비교되는 경우 나탈리주맙 치료 이전(MS 비처리; n=26) 및 동안(n=330) PSGL-1 발현의 시간 경과를 CD4+ T 세포에 대해 나타낸다.
부착 분자 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)은 치료 전 대상체(CD4MFI 43.97±5.10; CD8MFI 64.53±10.85)와 비교되는 경우, LTNT 이후 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 강력히 상향조절되었다(CD4MFI 58.12±7.35; CD8MFI 86.79±9.23)(도 3a). 치료 4 년 후 피크를 이루며, PSGL-1 상향조절에 대해 뚜렷하고 재현성 있는 시간 운동학이 존재하였다(도 3b).
실시예 4. CD4+ T 세포 상에서 CD49d 및 PSGL-1의 분자 편재
도 4(a-k)는 CD4+ T 세포 상 CD49d 및 PSGL-1의 분자 분포를 나타낸다. 대표적인 비처리(도 4a), 중추-기억(도 4b), 및 효과기-기억(도 4c) CD4+ T 세포를 CD49d는 녹색으로 표지하고 PSGL-1은 빨간색으로 표지하여(공동-편재는 노란색) 나타낸다. 각각의 3D 삽입물은 예시적인 분자 클러스터를 나타낸다. CD49d(도 4d), PSGL-1(도 4e) 및 이들의 조합(도 4f)의 최인근 분석, 비처리(도 4g), CM(도 4h), 및 EM(도 4i) 상의 CD49d(검은색) 및 PSGL-1(빨간색)의 클러스터 사이즈를 나타낸다. 도 4j는 비처리(1), EM(2), 및 CM(3) 상에서 CD49d의 평균 클러스터 크기를 나타내는 반면, 도 4k는 PSGL-1 클러스터 크기에 대한 것을 나타난다.
CD4+ T 세포 상의 CD49d 및 PSGL-1의 발현에서 나탈리주맙에 의해 유도된 매우 유의미한 변화를 관측한 후, 본 발명자들은 CD49d에 대한 나탈리주맙의 결합이 다른 분자, 예컨대 공통-편재될 수 있는 PSGL-1에 영향을 미칠 수 있다는 가능성을 배제할 수 있는지 여부를 연구하였다. 비처리, 중추-, 및 효과기-기억 CD4+ T 세포 상에서 이들 두 분자의 분포를 측정하기 위해, 단일 세포 상에서 직접 확률 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 이용하였다(도 4a-c). 비처리 상 CD49d 및 PSGL-1 간에 공동-편재(co-localization)가 존재하지 않았고, CM 상에는 공동-편재가 거의 없었고, EM 세포 상에만 강력한 공동-편재가 존재하였다. 최인근 분석은 비처리 CD4+ T 세포에 비해 기억 CD4+ T 세포 상 CD49d 분자(도 4d)뿐만 아니라 PSGL-1(도 4e) 분자 간에 더 작은 거리를 나타내었고 EM 세포 상에서 특히 강력한 발현을 가지며, 유세포 측정 염색에 대한 피팅은 이들 분자의 더 높은 발현을 시사하였다. 따라서, 분자 CD49d 및 PSGL-1은 서로, 특히 EM 세포 상에서 더 가까이 인접하였다(도 4f). 분자 클러스터의 외관에 관해, CD49d만 비처리 세포 상에서 드문 클러스터를 나타내었고, 기억 세포 상에서는 클러스터를 나타내지 않은 반면, PSGL-1은 모든 3개 하위집단 상에서 강력히 클러스터링되었다(도 4g-k). 그 결과, PSGL-1의 평균 클러스터 크기는 CD49d의 클러스터 크기보다 높았다(도 4j-k). 비처리 및 CM 세포 상 CD49d 및 PSGL-1의 공동-편재의 부재는 PSGL-1 발현에서의 변화가 나탈리주맙 결합에 기인한 인공물이 아닐 수 있음을 제시한다.
실시예 5. 다발성 경화증 대상체 및 대조군 조직에서 가능한 진입 경로 상의 VCAM-1 및 P-셀렉틴의 발현
도 5(a & b)는 다발성 경화증 대상체 및 대조군 조직 내 가능한 진입 경로 상의 VCAM-1 및 P-셀렉틴의 발현을 나타낸다. 실질(병소 영역), 맥락총 및 수막 혈관에서의 VCAM-1 및 P-셀렉틴 발현을 각각 도 5a 및 b에 나타낸다. 삽입물은 100X 확대를 나타낸다. DAB를 발색 기질로서 그리고 헤마톡실린을 카운터 염색으로 사용하였다. 표 3은 P-셀렉틴 및 VCAM-1의 발현 수준의 면역조직학적 평가를 제공한다.
생체내 상이한 혈액-CNS 장벽에 걸친 T 세포의 이동에 대한 본 발명자들의 발견의 관련성을 평가하기 위해, MS 대상체 및 대조군의 조직에서 CD49d 및 PSGL-1의 일차 리간드(즉, VCAM-1 및 P-셀렉틴)에 대해 염색하였다. 관심 영역은 혈액-연수막 장벽을 평가하기 위한 수막, 혈관으로부터 CNS 조직/전통적 혈액-혈관 장벽까지의 직접적 이동을 평가하기 위한 (정상-외관/병소) 백색 물질, 및 혈액-CSF 장벽을 평가하기 위한 맥락총였다. 본 발명자들은 모든 내피 장벽 상에 다양한 정도의 VCAM-1이 존재하지만, P-셀렉틴의 발현은 훨씬 더 제한됨을 나타내었다. 백색 물질(병소) 혈관 상에는 P-셀렉틴 발현이 없으며, 수막 혈관 내피 상에는 발현이 매우 적고, 맥락총 내피 상에서는 발현이 현저하였다. 주지할 것은, MS 대상체의 조직에서 맥락총 내피 상 발현이 대조군 조직에서에 비해 일반적으로 더 현저하였다(도 5).
P- 셀렉틴 및 VCAM -1의 발현 수준의 면역조직학적 평가
대조군 MS 대상체
맥락총 수막 백색 물질 맥락총 수막 백색 물질
P-셀렉틴 -/++ + - +/++ + -
VCAM-1 +++ ++ ++ +++ ++ +
실시예 6. CD49d 및 PSGL-1의 리간드(즉, VCAM-1/P-셀렉틴)에 대한 CD4+ T 세포의 롤링 및 부착에 대한 나탈리주맙의 영향
도 6(a-g)는 CD49d 및 PSGL-1의 리간드(즉, VCAM-1/P-셀렉틴)에 대한 CD4+ T 세포의 롤링 및 부착에 대한 나탈리주맙 치료의 영향을 나타낸다.
도 6a는 SDF-1 함유 및 비함유 그리고 나탈리주맙 함유 및 비함유(n=4) VCAM-1 코팅된 모세관 유동 챔버의 부착 CD4+ T 세포/시야 필드를 나타낸다. 도 6은 SDF-1 함유 및 비함유(n=4) VCAM-1 코팅된 모세관 유동 챔버에 대한 나탈리주맙-치료받은 대상체 및 대조군/시야 필드의 부착 CD4+ T 세포를 나타낸다. 도 6c는 P-셀렉틴 코팅된 모세관 유동 챔버에 대한 건강한 대조군 및 나탈리주맙-치료받은 대상체/시야 필드의 포획된 CD4+ T 세포를 나타낸다(n=4). 나탈리주맙 첨가 및 비첨가(n=4) 비염증 또는 TNF-알파 염증성 일차 내피 세포로 코팅된 평행판 유동 챔버 상의 부착 또는 롤링 CD4+ T 세포/시야 필드를 도 6d 및 e에 각각 나타낸다. PSGL-1 차단 항체 함유 및 비함유(n=4) 비염증 또는 TNF-알파 염증성 일차 내피 세포로 코팅된 평행판 유동 챔버 상의 나탈리주맙-치료받은 대상체 및 대조군/시야 필드의 부착 롤링 CD4+ T 세포를 도 6f 및 g에 각각 나타낸다.
CD49d 및 PSGL-1은 둘 다 림프구 유출의 첫 번째 단계: 속박, 롤링 및 부착에 중추적으로 관여되는 분자이다(Engelhardt and Ransohoff, Nat. Rev. Immunol. 12(9):623-635 (2012); Engelhardt and Ransohoff, Trends Immunol. 33(12):579-589 (2012)에서 검토됨). 따라서 본 발명자들은 CD49d의 나탈리주맙-매개된 차단 및 PSGL-1의 후속 상향조절이 전단-유동 조건 하에 기능적으로 관련되는지 여부를 평가하였다. 나탈리주맙을 이용한 건강한 대조군의 CD4+ T 세포의 시험관내 치료는 유리 모세관-기반 시스템에서 CD49d와 VCAM-1의 상호작용을 폐지하였고, 구축된 관점과 일관되게, VCAM-1에 대한 결합에는 케모카인 자극(SDF-1/CXCL12)에 의한 VLA-4의 형태적 변화가 필요하였다(도 6a). 본 발명자들은 이어서 상기 감소된 부착이 LTNT 하의 대상체의 혈액에서 새로 단리된 CD4+ T 세포에서도 명백함을 나타내어(도 6b), 시험관내 치료 효능을 실증하였다. P-셀렉틴(PSGL-1 수용체) 코팅된 유리 모세관의 분석은 대상체 세포의 포획능이 건강한 대조군 세포에 비해 크게 상승되었음을 드러내었다(도 6c). 융합성으로 성장시킨 일차 인간 뇌-유래 미세혈관 내피 세포(HBMEC)를 다음 단계에서 사용하여 CD49d- 및 PSGL-1 결합 파트너의 자연적 발현을 모방하였다. 본 발명자들은 건강한 대조군의 CD4+ T 세포가 나탈리주맙과 사전-인큐베이션되는 경우, 내피에 부착할 수 없음을 나타내어, 본 시스템에서 VLA-4/VCAM-1 상호작용의 관련성을 입증하였다(도 6d). CD49d의 차단은 내피에 걸친 CD4+ T 세포의 롤링 능력에 영향을 미치지 않았다(도 6e). 내피층에 대한 단단한 부착은 감소되었지만 나탈리주맙-치료받은 대상체에서 완전 폐지되지는 않았고, 대상체- 뿐만 아니라 대조군 세포는 둘 다 PSGL-1 차단 항체의 존재 하에 잔여 부착을 나타내지 않았다(도 6f). 마지막 단계로서, 본 발명자들은 모세관 시스템에서 CD49d에 독립적인 것으로 나타난(도 6e) 내피에 걸친 CD4+ T 세포의 롤링이 나탈리주맙-치료받은 대상체에서 더욱 현저하였고, 상기 롤링이 다시 PSGL-1 차단 항체의 첨가에 의해 방지될 수 있음을 나타내었다(도 6g).
실시예 7. TH17 세포가 VCAM-1/VLA-4 상호작용과 독립적으로 내피에 부착하기 위해 MCAM을 이용할 수 있음
도 7(a-g)는 TH17 세포가 내피에 대한 단단한 부착을 위해 MCAM을 이용할 수 있음을 나타낸다. 나탈리주맙 첨가 및 비첨가 부착 세포/시야 필드(n=3)(도 7a); 나탈리주맙 첨가 및 비첨가 롤링 세포/시야 필드(n=3)(도 7b); PSGL-1 차단 함유 및 비함유 롤링 세포/시야 필드(n=3)(도 7c); 나탈리주맙 및 CD11a 차단 첨가 및 비첨가 부착 세포/시야 필드(n=3)(도 7d); MCAM 차단 포함 및 비포함 롤링 세포/시야 필드(n=3)(도 7e); MCAM 차단 포함 및 비포함 부착 세포/시야 필드(n=3)(도 7f) 및 나탈리주맙 및 MCAM 차단 첨가 및 비첨가 부착 세포/시야 필드(n=3)(도 7g)의 TNF-알파 염증 일차 내피 세포로 코팅된 평행판 유동 챔버 상 CD4+CD45RO+MCAM+/- T 세포를 나타낸다.
LTNT 대상체에서 내피에 대한 잔여 부착이 여전히 존재하며(도 6d), 이들 대상체에서의 CSF 세포가 CD49d를 발현하지 않고(도 2c), 최근 연구가 TH1 세포와 대조적으로 TH17-극화된 세포가 CD49d 결핍 마우스에서 EAE를 유도할 수 있으며(Rothhammer et al., J. Exp. Med. 208(12):2465-2476 (2011)), 흑색종 세포 부착 분자(=MCAM, CD146)가 인간에서 TH17 세포에 대한 특이적 마커임을 나타내었으므로(Larochelle et al., Brain 135(Pt 10):2906-2824 (2012); Flanagan et al., PLoS One 7(7):e40443 (2012)), 본 발명자들은 TH17/MCAM+ 세포에 초점을 맞추었다. TH17 세포가 인간 시스템에서 LTNT 하에 CSF에 여전히 진입할 수 있다는 가설에 이의를 제기하기 위해 본 발명자들의 시험관내 검정을 이용하였고 나탈리주맙에 의한 CD49d의 차단이 MCAM- 기억 세포(CD3+CD4+CD45RO+MCAM-)의 부착을 폐지함을 나타낼 수 있지만 MCAM+ 기억 세포의 부착을 방해하지 않음을 보일 수 있었다(도 7a). 본 발명자들은 또한 상기 가설을 2 명의 개념-증명 대상체에서 추가적으로 생체외 평가하였으며, 여기서 CSF 물질을 이용하였고 CD3+CD4+CD45RA- 세포의 MCAM+ 세포 백분율이 나탈리주맙 치료하지 않은 안정한 MS 대상체에 비해 LTNT 대상체에서 훨씬 더 높음을 나타내어(19.8 대 3.2%), LTNT 대상체의 CSF에서 TH17 세포의 우세를 제시하였다. 이들 TH17 세포는 또한 도 2c에서 전체 CD4+ T 세포에 대해 상기 나타낸 바와 같이, LTNT 대상체에서 CD49d를 발현하지 않았다. MCAM+ 세포의 시험관내 롤링은 증강되지 않았고, 또한 CD49d의 차단은 포획에 영향을 미치지 않았다(도 7b). PSGL-1 차단은 두 집단에서 모두 롤링을 폐지하였다(도 7c). CD49d에 더하여 CD11a를 차단함으로써, MCAM+ 세포의 부착을 감소시킬 수 있었다(도 7d). 마지막으로, 본 발명자들은 잠재적 임상 적용(즉, 자가면역 공정을 방해하기 위한 생체내 TH17 세포의 기능 차단)을 위해 개발된 항체를 이용하여 시험관내 이들의 특징 분자(MCAM)를 차단하였다. MCAM 차단만으로는 내피 세포에 대한 롤링(도 7e) 또는 부착(도 7f)에 영향을 미치지 않았다. 그러나 CD49d 및 MCAM의 공동 차단은 내피에 대한 MCAM+ 세포의 부착을 폐지하였다(도 7g).
실시예 8. MS 병소에서 MCAM+ T 세포의 원 위치 검출이 MS 병리에서 TH17 세포의 역할을 제시함.
도 8(a-i)는 활성 MS 병소에서 MCAM+ 림프구를 나타낸다. 도 8a-e는 3 명의 MS 대상체 검시에서 얻은 활성 백색 물질 병소의 예를 나타내며, MCAM은 녹색으로 DAPI는 파란색으로 나타낸다. MCAM+CD8+ 림프구의 가능성을 배제하기 위해, 도 8e는 DAPI 카운터 염색을 이용해서 MCAM(녹색) 및 CD8(빨간색)의 이중 염색을 나타내어, 내피 세포의 현저한 MCAM 발현 및 혈관 근처의 2 개의 MCAM+CD8- 림프구를 나타낸다. 도 8f-i는 3 명의 MS 대상체의 검시로부터 얻은 회색 물질에서 MCAM+ 세포의 예를 나타낸다. MCAM+ 림프구는 별표로 표시된다.
MS 병리에서 TH17로 얻은 본 발명자들의 관측을 뒷받침하기 위해, MS 백색 물질 병소를 MCAM+ 림프구의 존재에 대해 평가하였다(도 8a-d). MCAM+ 세포는 Iba1-, CD68-, GFAP-, NeuN-, 및 CD8-인 것으로 나타났다(도 8e). MCAM+ 세포는 또한 MS 대상체의 회색 물질에서도 검출할 수 있었으며(도 8f-i) 몇몇 세포는 혈관벽에 직접 부착되어 있었다(도 8h-i).
VLA-4 및 MCAM의 공동 차단은 MCAM+ 세포의 부착 감소로 이어져서, TH17 세포가 내피로의 단단한 부착을 매개하기 위해 VLA-4 또는 이들의 특징 분자 MCAM을 둘 다 이용할 수 있다는 증거를 제공하고, MCAM을 특히 TH17 세포를 위한, 표적 조직 내로의 이동 케스케이드의 일환으로서 소개하였다. MCAM은 내피 세포에 의해 특이적으로 생성되는 라미닌 형태(라미닌 α4)에 결합하며, 내피 매트릭스의 일부이다. 그러나 라미닌 α4는 또한 내피 세포의 내강 표면 상에 제시되고 부착 케스케이드 내에서 조기 이벤트에 기여하며 이어서 혈관벽을 통한 이동을 촉진할 수 있다. 라미닌 결합을 차단하는 MCAM에 대한 항체의 존재 하에 본 발명자들의 시스템에 잔여 부착이 존재하지 않는다는 사실이 상기 가설과 일치한다. 본 발명자들의 결과는 TH17 세포가 나탈리주맙의 존재 하에서도 CNS 진입을 촉진할 수 있는 추가적인 부착 기전을 가짐을 나타낸다. LFA-1도 조건적 α4 인테그린 녹아웃 마우스를 이용한 EAE에서 [Rothhammer et al., J. Exp. Med. 208(12):2465-2476 (2011)]의 발견과 일치하게, MCAM/라미닌도 [Flanagan et al., PLoS One 7(7):e40443 (2012) 및 Larochelle et al., Brain 1353(Pt 10):2906-2924 (2012)]의 결과와 일치하게 중요한 역할을 담당할 수 있다. 이들 결과는 나탈리주맙-치료받은 대상체에서 CSF에 여전히 진입할 수 있는 대부분의 세포가 TH17 세포일 가능성이 높다는 증거를 제공하여, 상기 집단의 병리에서뿐만 아니라 CNS 면역 감시에서의 역할을 제시하거나, 또는 단순히 TH1 세포의 존재가 없이 TH17 세포의 존재만으로는 TH17 세포가 EAE 증상을 유도하는 것으로 나타난 EAE에서와는 달리 MS에서 병리를 매개하지 않음을 제시한다(Rothhammer et al., J. Exp. Med. 208(12):2465-2476 (2011)). 상기 결과는 일부 대상체가 왜 나탈리주맙의 치료 종료 후 TH1 세포가 다시 CNS 내로의 진입을 획득할 수 있고 이미 원 위치에 있는 TH17 세포가 조직 손상 및 임상 증상을 악화시키는 강한 재발을 나타내는지에 대한 설명을 제공한다(Melis et al., Neurol. Sci. 35(3):401-408 (2014)). 상기 데이터 세트는 VLA-4 및 MCAM의 공동 차단이 VLA-4 단독 차단에 비해 더욱 강력한 치료가 될 수 있거나 TH1 이동의 차단이 임상 증상을 완화시키기 불충분한 경우(예로 강한 TH17-편향 제시를 나타내는 경우, 예컨대 시신경척수염(Varrin-Doyer et al., Ann. Neurol. 72(1):53-64 (2012)) 효율적인 치료 대안이 될 수 있다는 증거를 제공한다. 본 연구에서의 발견을 모식도에 요약한다(도 9). MS에서의 진행 및 회색 물질 위축에 관해, 본 발명자들의 데이터는 TH17 세포를 회색 물질에서 또한 확인하였고, 이들의 진입이 치료에 의해 차단되지 않으므로, 이들 세포가 나탈리주맙 하에 잔여 진행을 매개할 수 있다는 증거를 제공한다. 상기 결과는 SPMS 및 PPMS에서의 진행이 또한 TH17 성분을 가지며, VLA-4 및 MCAM의 조합 차단이 이들 질환에 대한 유효한 치료 옵션이 될 수 있다는 증거를 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> TAM, Stephen Jed LIU, Yue YEDNOCK, Theodore <120> Combination Treatment for Multiple Sclerosis <130> 057450/455719 <150> US 61/952,835 <151> 2014-03-13 <150> US 62/023,577 <151> 2014-07-11 <160> 142 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Arg Val Gln Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Thr Ser 1 5 10 15 Val Val Gln Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala 20 25 30 Thr Ser Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Lys Asn 35 40 45 Ile Asp Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg 85 90 95 Asn Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn 100 105 110 Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 130 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Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 140 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 140 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 141 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 141 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Ser 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg His Arg Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 142 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 142 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Gln 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg His Arg Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115

Claims (37)

  1. 자가면역 질환의 치료 또는 예방 실시 방법으로서,
    알파-4 인테그린 길항제를 또한 수여받는 다발성 경화증을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 MCAM 길항제를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 MCAM 길항제 및 알파-4 인테그린 길항제는 상기 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 유효한 방식으로 제공되는, 방법.
  2. 자가면역 질환의 치료 또는 예방 실시 방법으로서,
    MCAM-길항제를 또한 수여받는 다발성 경화증을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 알파-4 인테그린 길항제를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 유효한 방식으로 제공되는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 자가면역 질환이 다발성 경화증인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제가 VCAM-1에 대한 알파-4 인테그린 결합에 길항되는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제가 알파-4 인테그린에 특이적으로 결합하는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제가 단클론성 항체인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단클론성 항체가 나탈리주맙인, 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCAM-길항제가 라미닌-알파-4에 대한 MCAM 결합에 길항되는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 MCAM에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체인, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 라미닌-알파-4에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체인, 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 MCAM 항체가 1749 또는 2120, 또는 이들의 키메라, 베니어(veneered), 또는 인간화 버전인, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제가 나탈리주맙이고, 그리고 상기 MCAM 길항제가 1749 또는 2120, 또는 이들의 키메라, 베니어, 또는 인간화 버전인, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12, 28, 29 또는 32 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제가 둘 다 상기 대상체의 혈청 중에서 동시에 검출가능하도록 동시에 제공되는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제가 동시 주입에 의해 제공되는, 방법.
  15. 청구항 1 내지 12, 28, 29 또는 32 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제가 순차적으로 제공되는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제가 먼저 제공되고, 상기 대상체에서 상기 알파-4 인테그린 길항제에 대해 내성이 발생한 뒤 상기 MCAM 길항제가 제공되는, 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 먼저 제공되고, 상기 대상체에서 상기 MCAM 길항제에 대해 내성이 발생한 뒤 상기 알파-4 인테그린 길항제가 제공되는, 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 길항제를 이용한 치료 과정이 먼저 투여되고, 상기 대상체가 상기 치료 과정의 개시 시 재발 완화 다발성 경화증(relapsing remitting multiple sclerosis)을 갖거나 그 위험이 있으며, 그리고 상기 대상체가 상기 MCAM 길항제를 이용한 치료 과정 개시 시 이차 진행 다발성 경화증(secondary progressive multiple sclerosis)으로 진행된, 방법.
  19. 청구항 1 내지 18, 28, 29 또는 32 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 및 MCAM 길항제가 각각 주 내지 분기 간격으로 제공되는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 알파-4 인테그린 및 MCAM 길항제가 각각 4 주 간격으로 제공되는, 방법.
  21. 청구항 1 내지 20, 28, 29 또는 32 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 항체의 투여량이 50 내지 500 mg/대상체인, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 각 항체의 투여량이 100 내지 200 mg/대상체인, 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 각 항체의 투여량이 50 내지 150 mg/대상체인, 방법.
  24. T-세포 침윤(T-cell infiltration)이 관여되는 자가면역 질환의 치료 또는 예방 실시 방법으로서,
    염증성 질환을 갖거나 그 위험이 있는 대상체에 알파-4 길항제 및 MCAM 길항제를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 알파-4 인테그린 길항제 및 MCAM 길항제는 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위해 유효한 방식으로 제공되는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 자가면역 질환이 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환, 사르코이드증, 또는 건선 관절염인, 방법.
  26. 청구항 24 또는 25에 있어서, 상기 MCAM 길항제 및 알파-4 인테그린 길항제가 순차적으로 투여되며, 상기 알파-4 인테그린 길항제가 먼저 투여되는, 방법.
  27. 청구항 24 또는 25에 있어서, 상기 MCAM 길항제 및 알파-4 길항제가 동시 투여되는, 방법.
  28. 청구항 12에 있어서, 상기 MCAM 항체가 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 방법.
  29. 청구항 12에 있어서, 상기 MCAM 항체가 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 방법.
  30. 청구항 24 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론성 항체인, 방법.
  31. 청구항 24 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론성 항체인, 방법.
  32. 청구항 12에 있어서, 상기 MCAM 항체가 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 12에 있어서, 상기 MCAM 항체가 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 방법.
  34. 청구항 12에 있어서, 상기 MCAM 항체가 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 방법.
  35. 청구항 24 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론성 항체인, 방법.
  36. 청구항 24 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론성 항체인, 방법.
  37. 청구항 24 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCAM 길항제가 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역, 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역, 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론성 항체인, 방법.
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