KR20170047469A - 미토콘드리아 dna의 snp 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물 및 이를 이용한 개 품종 식별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미토콘드리아 DNA의 SNP 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물 및 이를 이용한 개 품종 식별방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 토종견과 해외품종견의 식별을 포함하여 개 품종 식별을 신속하고 정확하며 경제적으로 할 수 있는 이점이 있다.

Description

미토콘드리아 DNA의 SNP 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물 및 이를 이용한 개 품종 식별방법{Composition for Breed Discrimination of Dog comprising mitochondria SNP Markers and Diagnosing Method using the Same}

본 발명은 미토콘드리아 DNA의 SNP 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물 및 이를 이용한 개 품종 식별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게 토종견종과 해외품종견의 식별을 포함하여 개 품종 식별을 신속하고 정확하며 경제적으로 할 수 있는 미토콘드리아 DNA의 SNP 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물 및 이를 이용한 개 품종 식별방법에 관한 것이다.

개는 전 세계적으로 사육되는 동물이며, 약 200여 품종이 있다. 특수견으로 활용도가 높은 개 품종 및 토종견 보호 차원에서 유전체 연구를 통해 선발육종 및 활용이 가능하다.

미국의 2008년도 반려견 시장규모가 약 432억달러로서 개 사육두수가 약 7,700만 마리이고 주로 사료시장이 전체의 39%를 차지하고 있다. 독일은 세퍼트, 도베르만 등 애견 수출로 연간 2조원이 넘는 부가가치 창출(05년)하고 있으며, 특히 세퍼드는 1899년 만들어진 품종으로, 학습능력, 지구력, 체형 등이 특징이고 세계적으로 군견, 경찰견, 특수목적견 등에 많이 활용하고 있으며, 세퍼드는 50만의 마니아들과 매년 생산되는 5만 마리의 자견들이 세계의 애견 시장을 주도, 애견 총 매출의 1위를 기록하고 있다. 일본은 반려견 사육두수가 1,100만마리가 사육되고 있으면 시장규모는 약 12조원이고 중국도 2008년 약60억 8천만위안의 애완용품 시장규모에 다다르고 있다.

또한, 국내에 애견산업이 성장하고 있지만, 그에 따라 유기견도 증가하고 있는 실정이다. 유기견이 증가함에 따라, 광견병과 같은 질병감염이나 자연파괴와 같은 문제가 대두되고 있다. 따라서 유기견 발생을 줄이기 위해 반려견 등록제 제도를 도입하여 실행되고 있다. 반려견 등록제란 내장형 무선식별장치, 즉 마이크로칩을 동물 몸속에 삽입하는 것과 외장형 무선식별장치를 부착하는 것, 또는 등록인식표를 부착하는 것을 포함한다. 하지만, 반려견 등록제의 경우 반려견의 몸에 이물질을 삽입하여 생기는 부작용에 대한 우려가 있어서 실질적으로 적용이 되지 않고 있는 실정이다. 또한, 외장형인 경우에는 쉽게 분리가 가능하므로 그 실효성에 많은 의문이 있다.

그러므로 보다 안정하고 실용적인 토종개와 외국개 식별, 품종식별 및 개체식별에 활용 가능한 품종식별 마커에 관한 필요성이 대두되고 있다.

본 발명의 선행기술로 대한민국 특허등록 제10-1156047호(2012.06.27)에는 초위성체 마커 조성물 및 이를 이용한 개의 개체 식별방법이 개시되어 있다.

대한민국 특허등록 제10-1156047호(2012.06.27)

본 발명의 목적은 서열번호 1의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 개의 품종 식별방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 SNP 마커는 서열번호 1의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 위치(position) 15595의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15611의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15612의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15618의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15627의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15632의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15639의 뉴클레오티드 T가 A 또는 G, 위치 15643의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15650의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15652의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 15665의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15750의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15800의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15811의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15814의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15815의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15912의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15955의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 16003의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16025의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 16083의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16248의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16268의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16276의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16306의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16326의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16338의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16346의 뉴클레오티드 G가 A, 및 위치 16671의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커이다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개 품종 식별용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 개의 혈액으로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 유전자 산물을 정제하여 염기서열을 분석하거나, 제2항의 마커와 혼성화하는 단계를 포함하는 개 품종 식별 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 미토콘드리아 DNA 내의 SNP 마커를 이용하여 개 품종 식별, 개체 식별 및 친자감별을 신속하고 정확하며 경제적으로 할 수 있다.

특히, 본 발명에 의하면 미토콘드리아 DNA의 SNP 마커를 이용하여 모계유전을 추적할 수 있는 경제성이 높은 분석법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 미토콘드리아 DNA의 SNP 마커의 특이적 발현을 이용하여 토종견과 해외품종견을 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 개의 품종식별, 개체식별 및 친자감별이 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물은 반려견 등록제의 과학적 근거 마련 및 추적이력시스템의 보완 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 미토콘드리아 DNA의 SNP 마커를 보여주는 도면이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 미토콘드리아 DNA의 SNP 마커를 이용하여 모계유전을 추적할 수 있는 경제성이 높은 개 품종 식별용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 SNP 마커는 서열번호 1의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 위치(position) 15595의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15611의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15612의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15618의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15627의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15632의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15639의 뉴클레오티드 T가 A 또는 G, 위치 15643의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15650의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15652의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 15665의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15750의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15800의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15811의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15814의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15815의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15912의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15955의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 16003의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16025의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 16083의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16248의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16268의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16276의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16306의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16326의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16338의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16346의 뉴클레오티드 G가 A, 및 위치 16671의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커이다.

본 발명은 총 65개의 SNP를 이용하여 개의 품종에서 나타날 수 있는 특이 SNP에 의한 대립유전자들을 분석하여 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 품종식별, 개체식별 및 친자감별에 활용 가능이 가능하다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개 품종 식별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 키트는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함한다.

본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 DNA 마커를 포함하는 개 품종 식별용 마이크로어레이 키트일 수 있다.

본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 키트는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 개의 혈액으로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 유전자 산물을 정제하여 염기서열을 분석하거나, 제2항의 마커와 혼성화하는 단계를 포함하는 개 품종 식별 방법을 제공한다.

본 발명은 한국 토종견 및 해외품종견을 판별할 수 있는 SNP 마커뿐만 아니라 개 품종별 특이적인 SNP 마커를 분리하여 상기 마커를 이용하여 신속, 정확하고 경제적으로 개 품종 식별, 개체 식별 및 친자감별을 할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서 혼성화란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다. 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다.

혼성화 정도를 검출하기 위해, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지물질로 표지될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 P32 또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 16248의 뉴클레오티드 A가 G SNP 마커 및 위치 16268의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 동경개인 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 16276의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16306의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16326의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16338의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16346의 뉴클레오티드 G가 A, 및 위치 16671의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 삽살개인 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15627의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15639의 뉴클레오티드 T가 A, 위치 15814 뉴클레오티드 C가 T, 및 위치 16025 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커만을 포함하면 풍산개인 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15618의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 및 위치 15811의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 진돗개인 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15618의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15665의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15811의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16025의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 16248의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16268의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16276의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16306의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16326의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16338의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16346의 뉴클레오티드 G가 A, 및 위치 16671의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 토종견종인 것으로 판단한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 상기 SNP 마커 중 서열번호 1의 위치 16025의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커만 포함하면 풍산개인 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15627의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15639의 뉴클레오티드 T가 A, 위치 15814의 뉴클레오티드 C가 T, 및 위치 15955의 뉴클레오티드 C가 T인 SNP 마커만 포함하면 라브라도 레트리버인 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15611의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15643의 뉴클레오티드 A가 G, 및 위치 15650의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 독일 세퍼트인 것으로 판단한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15750의 뉴클레오티드 C가 T인 SNP 마커 및 위치 16083의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15595의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15611의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15612의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15643의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15650의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15750의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15815의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 16003의 뉴클레오티드 A가 G, 및 위치 16083의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 해외품종견인 것으로 판단한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 상기 SNP 마커 중, 서열번호 1의 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커만 포함하면 라브라도 레트리버로 판단한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예

공시 재료 및 게놈 DNA ( Genomic DNA) 추출

본 연구에 이용된 공시재료는 진돗개 사업소, 삽살개 보호소, 탐지견센터, 삼성 도우미견 등에서 수집된 진돗개(JinDo Dog) 32두, 삽살개(Sapsal Dog) 45두, 독일 세퍼트(German Shepherd) 20두, 라브라도 레트리버(Labrador Retriever) 8두, 풍산개(PoongSan Dog) 19두, 동경이(DongKangEi) 43두, 벨기안 말라노이즈(Belgian Malinois) 총 7품종 181두의 혈액 DNA을 이용하였다. 표 1에 견종별 개체수를 나타내었다.

중합효소연쇄반응 ( PCR ) 프라이머 제작 및 유전자 증폭

mtDNA 염기서열 분석을 위해서 NCBI(National Center for Biotechnology Information) GenBank에 등록된 유전자 정보 (U96639의 D-loop 15,458-16,055 부위)를 이용하였고, Primer3 프로그램(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 통해 제작하였다. 제작된 Primer는 순방향 Primer F(5'-TCC CTG ACA CCC CTA CAT TC-3'; 서열번호 2)와 역방향 Primer R(5'-GCG ACT CAT CTT GGC ATT TT-3'; 서열번호 3)로 염기서열이 중첩되도록 하여 염기서열을 확인하였다. mtDNA 증폭 PCR은 gDNA 1㎕, 10X buffer 1㎕, 2.5mM dNTP 0.8㎕, primer (10 pmol/㎕) 0.2㎕, Hot start Taq DNA 중합효소(2U/㎕) 0.1㎕의 조성에 증류수를 채워 총 반응액은 20㎕가 되도록 하였다. 상기 혼합물은 Verti 96 well Thermal Cycler(Applied Biosystem, CA, USA)을 이용하여 95℃에서 11분간의 첫 반응을 시작으로 94℃에서 1분간 변성, 60℃에서 1분간 결합, 72℃에서 2분간 신장하여 25 cycle 실시한 후, 마지막으로 60℃에서 60분간 최종 신장반응을 실시하였다.

증폭산물 정제 및 염기 서열 결정을 이용한 검증

증폭 산물은 MultiScreen HTS^TM PCR (MILLIPORE, Seoul, Korea)을 이용하였다. 96 well PCR clean up filter plate에서 정제하여 씨퀀싱 반응을 실시하였고 PCR 생성물은 이소프로판올(isopropanol) 및 에탄올(ethanol)을 이용하여 정제하였으며, 건조된 96 well Plate pellet 에 10 ul 의 Hi-Di formamide를 넣었다. 95℃에서 5분간 변성 과정을 거쳐 36 cm의 capillary를 장착한 염기서열 분석기 ABI 3730 XL (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.

표 2는 한국 토종견 및 해외품종견의 품종별 mtDNA 변이의 위치와 수를 나타낸다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 시험에 이용되어진 동경개는 총 43마리로, 위치 15639, 15814, 16025, 16248, 16268 총 5개의 위치에서 변이가 발견되었다. 동경개에서만 나타나는 특이적인 SNP는 위치 16248, 16268로 총 2개의 SNP가 발견되었다.

삽살개는 총 45마리로, 위치 15627, 15639, 15652, 15665, 15814, 16276, 16306, 16326, 16338, 16346, 16671 총 11개의 위치에서 변이가 발견되었다. 삽살개에서만 나타나는 특이적인 SNP는 위치 16276, 16306, 16326, 16338, 16346, 16671로 총 6개의 SNP가 발견되었다.

풍산개는 총 19마리로, 위치 15627, 15639, 15814, 16025 총 4개의 위치에서 변이가 발견되었다. 풍산개에서만 나타나는 특이적인 SNP는 없었으나, 토종개에서만 발견되는 SNP 중 위치 16025에서 풍산개 역시 SNP가 발견되었다.

진돗개는 총 32마리로, 위치 15618, 15627, 15632, 15639, 15652, 15800, 15811, 15814, 15912, 15955, 16025 총 11개의 위치에서 변이가 발견되었다. 진돗개에게서만 나타나는 특이적인 SNP는 위치 15618, 15811로 총 2개의 SNP가 발견되었다.

한국 토종 견종에서만 변이가 일어나는 곳은 총 12곳으로 위치 15618, 15655, 15811, 16025, 16248, 16268, 16276, 16306, 16326, 16338, 16346, 및 16671이다.

라브라도 리트리버는 총 8마리로, 위치 15620, 15627, 15639, 15814, 15955 총 5개의 위치에서 변이가 발견되었다.

독일 세퍼트는 총 20마리로, 위치 15595, 15611, 15612, 15620, 15627, 15632, 15639, 15643, 15650, 15652, 15800, 15814, 15815, 15912, 15955, 16003 총 16개의 위치에서 변이가 발견되었다. 독일 세퍼트에서만 나타나는 특이적인 SNP는 위치 15611, 15643, 15650으로 총 3개의 SNP가 발견되었다.

말라노이즈는 총 14마리로, 위치 15595, 15612, 15632, 15639, 15652, 15750, 15800, 15814, 15815, 15912, 15955, 16003, 16083 총 13개의 위치에서 변이가 발견되었다. 말라노이즈에서만 나타나는 특이적인 SNP는 위치 15750, 16083으로 총 2개의 SNP가 발견되었다.

해외품종견에서만 변이가 일어나는 곳은 총 10곳으로 위치 15595, 15611, 15612, 15620, 15643, 15650, 15750, 15815, 16003, 및 16083이다.

상술한 바와 같이 본 발명에 의한 총 65개의 SNP를 이용하여 개의 품종에서 나타날 수 있는 특이 SNP에 의한 대립유전자들을 분석하여 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로 품종식별, 개체식별 및 친자감별에 활용 가능하다. 또한 반려견 등록제의 과학적 근거 마련 및 추적이력시스템의 보완 등에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Composition for Breed Discrimination of Dog comprising mitochondria SNP Markers and Diagnosing Method using the Same <130> NPF-28142 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16726 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 1 gttaatgtag cttaattaat aaagcaaggc actgaaaatg ccaagatgag tcgcacgact 60 ccataaacat aaaggtttgg tcctagcctt cctattagtt tttagtagac ttacacatgc 120 aagcctccac gccccagtga gaatgccctt aaaatcacca gtgatctaaa ggagcaggta 180 tcaagcacac tcttaagtag ctcataacac cttgctaagc cacaccccca cgggatacag 240 cagtgataaa aattaagcca taaacgaaag tttgactaag ccatactaaa tagggttggt 300 aaatttcgtg ccagccaccg cggtcatacg attaacccaa actaataggc ctacggcgta 360 aagcgtgttc aagatacttt tacactaaag ttaaaactta actaagccgt aaaaagctac 420 agttatcata aaataaacca cgaaagtgac tttataataa tctgactaca cgatagctaa 480 gacccaaact gggattagat accccactat gcttagccct aaacatagat aattttacaa 540 caaaataatt cgccagagga ctactagcaa tagcttaaaa ctcaaaggac ttggcggtgc 600 tttatatccc tctagaggag cctgttctat aatcgataaa ccccgataaa cctcaccacc 660 tttcgctaat tcagtctata taccgccatc ttcagcaaac cctcaaaagg tagaacagta 720 agcacaatca ttttacataa aaaagttagg tcaaggtgta acttatgagg tgggaagaaa 780 tgggctacat tttctaccca agaacatttc acgaatgttt ttatgaaatt aaaaactgaa 840 ggaggattta gtagtaaatt aagaatagag agcttaattg aatagggcca tgaagcacgc 900 acacaccgcc cgtcaccctc ctcaagtaat aagacacaac cataaccata ttaacttaac 960 taaaacacaa gaggagacaa gtcgtaacaa ggtaagcata ccggaaggtg tgcttggatt 1020 aatcaaagtg tagcttaact aaagcgtctg gcctacaccc agaagatttc attacttatg 1080 gccactttga acaaaagcta gcccaactaa ccccaaactt aagtattaca gacacataaa 1140 ataaaacatt tagttaaaca ataaaagtat aggagataga aattttaatt ggagcgatag 1200 agatagtacc gtaagggaat gatgaaagac atcttaacag tattaaacag caaagattac 1260 cccttctacc ttttgcataa tgaactagcc agaaacaact taacaaagag aacttaagct 1320 aagctccccg aaaccagacg agctacccat aaacaatcta aaaggatcaa ctcatctatg 1380 tagcaaaata gtgagaagat ttgtgggtag aggtgaaaag cctaacgagc ctggtgatag 1440 ctggttaccc acagacagaa ttttagttca actttaaatt tacctaaaaa aaataaaatt 1500 ttaatgtaaa tttaaaatat agtctaagaa ggtacagctt cttagaatca ggatacaacc 1560 tttattagag agtatatact aatatcacca tagttggctt aaaagcagcc accaattgag 1620 aaagcgttcc agctcaacaa acaatataac ttaatcccaa ccatactaca tcaactccta 1680 attatacccc ctgggtcatt ctatttaagt atagaagcaa taatgctagt atgagtaaca 1740 agaaccattt tctccccgca taagcttata tcaggaacgg atagaccact gatagttaac 1800 aatctgataa tatcaaccca aaaatgaaat acttatccac cccattgtta acccaacaca 1860 ggtatgcatt caaggaaaga ttaaaaggag taaaaggaac tcggcaaaca caaaccccgc 1920 ctgtttacca aaaacatcac ctccagcatt tctagtattg gaggcactgc ctgcccggtg 1980 acacttgttt aacggccgcg gtatcctgac cgtgcaaagg tagcataatc atttgttctc 2040 taaataggga cttgtatgaa tggccacacg agggtttaac tgtctcttac tcccaatcag 2100 tgaaattgac cttcccgtga agaggcggga ataccacaat aagacgagaa gaccctatgg 2160 agctttaatt aactaaccca aacttatgga tactagatac ctacaaggca taacataaca 2220 ccattattat gagttagcaa tttaggttgg ggtgacctcg gaatataaaa aaactcccga 2280 gtgattaaaa tttagaccca caagtcaaaa 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cctttcttct actattagca tcttctatgg 5700 tagaagcagg tgcaggaacg ggatgaaccg tatacccccc actggctggc aatctggccc 5760 atgcaggagc atccgttgac cttacaattt tctccttaca cttagccgga gtctcttcta 5820 ttttaggggc aattaatttc atcactacta ttatcaacat aaaaccccct gcaatatccc 5880 agtatcaaac tcccctgttt gtatgatcag tactaattac agcagttcta ctcttactat 5940 ccctgcctgt actggctgct ggaattacaa tacttttaac agaccggaat cttaatacaa 6000 cattttttga tcccgctgga ggaggagacc ctatcctata tcaacaccta ttctgattct 6060 tcggacatcc tgaagtttac attcttatcc tgcccggatt cggaataatt tctcacattg 6120 tcacttacta ctcagggaaa aaagagcctt tcggttatat aggaatagta tgagcaataa 6180 tatctattgg gtttttaggc tttatcgtat gagctcacca tatgtttacc gtaggaatag 6240 atgtagacac acgagcgtac tttacgtccg ccactataat tatcgctatt ccaacgggag 6300 taaaagtatt tagttgactg gcaacacttc atggaggcaa tattaaatga tctccagcta 6360 tgctatgagc tttagggttt attttcttat ttacagtagg cgggttaaca ggtattgtcc 6420 tagctaattc gtccttagac atcgttcttc atgatacata ttatgttgtg gctcattttc 6480 actatgtgct ttcaatagga gcagtttttg ccattatggg aggatttgcc cactgattcc 6540 ctttattctc aggttatact cttaacgata cttgagcaaa gattcacttt acaattatgt 6600 ttgtgggagt aaatataact ttcttccctc aacatttcct aggtttatct ggaatacctc 6660 gtcgatactc tgactaccca gatgcatata ctacctgaaa taccgtctcc tctataggat 6720 cgtttatctc gcttacagcg gtgatgctta taatttttat gatctgggaa gcctttgcat 6780 ccaaacgaga agttgctata gtagaactta ctacaactaa cattgagtga ctacatggat 6840 gtccccctcc ataccacacg ttcgaagaac ctacatatgt gatccaaaaa taagaaagga 6900 aggaatcgaa ccccctaaaa ttggtttcaa gccaatgtca taaccattat gtctttctca 6960 atcaggaggt attagtaaaa cattacatga ctttgtcaaa gttaaattat aggtgaaacc 7020 cctatatatc tctatggcgt acccatttca actcggatta caggacgcaa cctcccctat 7080 tatagaggag ctacttcatt ttcatgacca tacactaata attgtattct taatcagttc 7140 tttagttctc tatatcattt cactaatatt gactacaaaa ttaacccata caagcacaat 7200 agacgcacaa gaagtggaaa cagtatgaac cattctaccc gccattatcc taatcctaat 7260 cgctctacct tccctccgaa tcctttatat aatggacgaa attaataacc cctctttaac 7320 cgtgaaaaca ataggccacc aatgatactg 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tctatttatt ggctcaacta atctacttgg 8220 actattacct cactcattta cgcccacaac acaactctct ataaacctcg gaatagcaat 8280 tcccctatga gcagggacag taattaccgg tttccgctat aaaaccaaag catccttagc 8340 acactttcta ccccaaggca cccctctccc cctaattcca atactagtag tcatcgaaac 8400 tattagtcta tttattcaac ccatggctct agccgttcga ttaaccgcca atattactgc 8460 aggacacctc ctaatccatt tgattggagg ggctacctta gctcttatca atattagcgc 8520 gaccacagct tttatcactt ttattattct aatcctactt acgatcctag aatttgctgt 8580 tgccttaatt caagcctatg tttttacctt actagtgagt ctatacttac atgacaacac 8640 ctaatgaccc accaaactca cgcttaccac atagtcaacc caagcccatg accgctgaca 8700 ggggcccttt ctgccctcct tataacatcg ggtcttatca tatgatttca ctataactca 8760 atagccctac ttacattagg attcacaacc aacctgttaa ccatatgcca gtgatgacga 8820 gatgtgatcc gagaaggcac attccaagga catcataccc ctattgtaca aaaaggacta 8880 cgatacggaa tagttctttt tatcgtatca gaagtatttt tctttgcagg cttcttctga 8940 gccttttacc actccagcct agcccctact cctgaacttg ggggttgctg acctcctacc 9000 ggcattattc ctcttaaccc attagaagtg 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ctacacaatc aaggatatcc taggagcctt 14880 actcctactc ctaatcctaa tatcactagt tttattttca cctgacctat taggagaccc 14940 agataactac acccctgcaa accccctaaa cacccctcca catattaaac ctgagtgata 15000 ttttctattc gcctatgcta tcctacgatc cattcctaat aaattaggag gtgtactcgc 15060 cctagtattc tccatcctaa tcttggcatt cattccactc ctccacacat ctaagcaacg 15120 cagcataata ttccggcccc ttagccaatg cctattctga cttttagtcg ccgatcttct 15180 cactttaaca tgaattggag gacaaccagt tgagcaccct ttcatcatta tcggacaagt 15240 cgcttcaatc ttatatttca ccatcttatt gatcctaata ccaacagtta gcgttatcga 15300 aaacaacctt ctaaaatgaa gagtctttgt agtataatca ttaccttggt cttgtaaacc 15360 aaaaatggag agtaaccgcc ctccctaaga ctcaaggaag aagctcttgc tccaccatca 15420 gcacccaaag ctgagattct tcttaaacta ttccctgaca cccctacatt catatattga 15480 atcaccccta ctgtgctatg tcagtatctc caggtaaacc cttctcccct cccctatgta 15540 cgtcgtgcat taatggtttg ccccatgcat ataagcatgt actaatatta tatccttaca 15600 taggacatat taactcaatc tcataattca ctgatctttc aacagtaatc gaatgcatat 15660 cacttagtcc aataagggct taatcaccat gcctcgagaa accatcaacc cttgctcgta 15720 atgtccctct tctcgctccg ggcccatact aacgtggggg ttactatcat gaaactatac 15780 ctggcatctg gttcttactt cagggccata accttattta ctccaatcct actaattctc 15840 gcaaatggga catctcgatg gactaatgac taatcagccc atgatcacac ataactgtgg 15900 tgtcatgcat ctggtatctt ttaattttta gggggggaat ctgctatcac tcacctacga 15960 ccgcaacggc actaactcta acttatcttc tgctctcagg gaatatgccc gtcgcggccc 16020 taatgcagtc aaataacttg tagctggact tattcattat catttatcaa ctcacgcata 16080 aaatcaaggt gctattcagt caatggtttc aggacatata gttttagggt acacgtacgt 16140 acacgtacgt acacgtacgt acacgtacgt acacgtacgt acacgtgcgt acacgtgcgt 16200 acacgtacgt acacgtgcgt acacgtgcgt acacgtgcgt acacgtacgt acacgtgcgt 16260 acacgtacgt acacgtgcgt acacgtacgt acacgtacgt acacgtgcgt acacgtacgt 16320 acacgtgcgt acacgtgcgt acacgtgcgt acacgtacgt acacgtgcgt acacgtgcgt 16380 acacgtacgt acacgtacgt acacgtgcgt acacgtacgt acacgtacgc acgcgcgtaa 16440 gacattaagt taacttatac aaacccccct taccccccgt aaactcatgt catctattat 16500 acacttattt atgtcccgcc aaaccccaaa aacaggacta agtgcataca atactcacaa 16560 gctttattta aattatatac aaatgtattg ctactctagt taacttaaca caacagtctt 16620 acacgcattt ggtctcgtag tctatctata gatagcattc cctttttttt ccctctcata 16680 tttactatgt attttattta ttacgcacac tacaatttca gtataa 16726

Claims (17)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 개 품종 식별용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 SNP 마커는 서열번호 1의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 위치(position) 15595의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15611의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15612의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15618의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15627의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15632의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15639의 뉴클레오티드 T가 A 또는 G, 위치 15643의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15650의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15652의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 15665의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15750의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15800의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15811의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15814의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15815의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15912의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15955의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 16003의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16025의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 16083의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16248의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16268의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16276의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16306의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16326의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16338의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16346의 뉴클레오티드 G가 A, 및 위치 16671의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커인 개 품종 식별용 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 기재된 조성물을 포함하는 개 품종 식별용 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 키트는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 개 품종 식별용 키트.
5. 제3항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 개 품종 식별용 키트.
6. 개의 혈액으로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭된 유전자 산물을 정제하여 염기서열을 분석하거나, 제2항의 마커와 혼성화하는 단계를 포함하는 개 품종 식별 방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 16248의 뉴클레오티드 A가 G SNP 마커 및 위치 16268의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 동경개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
8. 제6항에 있어서,
   상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 16276의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16306의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16326의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16338의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16346의 뉴클레오티드 G가 A, 및 위치 16671의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 삽살개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
9. 제6항에 있어서,
   상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15627의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15639의 뉴클레오티드 T가 A, 위치 15814 뉴클레오티드 C가 T, 및 위치 16025 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커만을 포함하면 풍산개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
10. 제6항에 있어서,
    상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15618의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 및 위치 15811의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나를 포함하면 진돗개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
11. 제6항에 있어서,
    상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15618의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15665의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15811의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16025의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 16248의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16268의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 16276의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16306의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16326의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16338의 뉴클레오티드 G가 A, 위치 16346의 뉴클레오티드 G가 A, 및 위치 16671의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 토종견종인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 SNP 마커 중 서열번호 1의 위치 16025의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커만 포함하면 풍산개인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
13. 제6항에 있어서,
    상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15627의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15639의 뉴클레오티드 T가 A, 위치 15814의 뉴클레오티드 C가 T, 및 위치 15955의 뉴클레오티드 C가 T인 SNP 마커만 포함하면 라브라도 레트리버인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
14. 제6항에 있어서,
    상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15611의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15643의 뉴클레오티드 A가 G, 및 위치 15650의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 독일 세퍼트인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
15. 제6항에 있어서,
    상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15750의 뉴클레오티드 C가 T인 SNP 마커 및 위치 16083의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커 중 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 말라노이즈인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
16. 제6항에 있어서,
    상기 증폭된 유전자 산물에서, 서열번호 1의 위치 15595의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15611의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15612의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15643의 뉴클레오티드 A가 G, 위치 15650의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 15750의 뉴클레오티드 C가 T, 위치 15815의 뉴클레오티드 T가 C, 위치 16003의 뉴클레오티드 A가 G, 및 위치 16083의 뉴클레오티드 A가 G인 SNP 마커로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 SNP 마커를 포함하면 해외품종견인 것으로 판단하는 개 품종 식별 방법.
17. 제16항에 있어서,
    상기 SNP 마커 중, 서열번호 1의 위치 15620의 뉴클레오티드 T가 C인 SNP 마커만 포함하면 라브라도 레트리버로 판단하는 개 품종 식별 방법.

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