KR20170021525A

KR20170021525A - p62 ZZ 도메인에 결합하는 리간드 또는 아르기닌화된 BiP에 의해 매개되는 오토파지 활성을 통한 신경변성 질환 예방 및 치료

Info

Publication number: KR20170021525A
Application number: KR1020150116015A
Authority: KR
Inventors: 권용태; 김보연; 차현주; 유영동; 유지은
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-08-18
Filing date: 2015-08-18
Publication date: 2017-02-28
Also published as: CN108883149A; CN108883149B; EP3338787A1; JP2018533544A; EP3338787A4; US10391067B2; EP3338787B1; US20180243244A1; JP6518835B2; WO2017030292A1; KR101731908B1

Abstract

본 발명의 약물작용 기전 및 핵심적인 기술들은 도 1에 요약되어 있다. 구체적으로, 돌연변이 헌팅틴이나 알파 시뉴클레인 등 악성 변성 단백질들은 서로 엉기면서 올리고머 응고체(①, ②), 섬유질(fibrillar) 응고체(③), 궁극적으로 인클루젼 보디(④)로 자란다. 젊은 신경세포는 BiP 등 소포체 샤프롱들의 N-말단 아르기닌화(⑤)를 통해 Nt-Arg를 다량 만들어내며, 이후 아르기닌화된 BiP(R-BiP)은 세포질로 나와서 변성 단백질과 결합한다(⑥). R-BiP의 Nt-Arg는 리간드로서 p62의 ZZ 도메인에 결합하여(⑦), 평소에 닫혀있는 불활성 형태의 p62가 열린형태로 바뀌면서 구조적인 활성화가 유도됨으로서(⑧), PB1 및 LC3-결합 도메인이 노출된다. PB1 도메인에 의한 올리고머화(⑨)를 기반으로 변성 단백질 응고체와 결합하면서 오토파지 분해가 가능한 응고체, 즉 p62 바디로 농축이 된다(⑩). 이후 p62가 오토파고좀 막에 돌출되어 있는 LC3와 결합을 통해 오토파지 타겟팅(⑪)과 리소좀 단백질 분해가 완료된다. 젊은 신경세포는 단계 ⑤-⑪로 이루어진 오토파지 단백질분해가 강력해서 세포독성 단백질 응고체(①-⑤)가 누적되지 않지만, 노화된 신경세포는 단계 ⑤-⑪의 오토파지 단백질분해가 약화됨으로서 단백질 응고체(①-⑤)가 누적이 되면서 악순환에 빠지게 된다. 본 발명에서는 p62 ZZ 도메인의 저질량 리간드를 이용하여 p62를 인위적으로 활성화하여(⑫, ⑬) 헌팅턴 및 알파 시뉴클레인 단백질 응고체 등을 효과적으로 제거하고자 한다. 구체적으로, 단계 ⑫를 통하여 리간드와 결합한 p62가 p62-R-BiP-변성단백질 올리고머화(⑨) 및 오토파지 응고체 형성(⑩)을 촉진하고자 한다. 또한 단계 ⑬을 통하여 리간드-p62 결합체는 오토파지 활성제로 작용하여(⑭) LC3의 합성, LC3-I의 LC3-II로의 변환 등을 촉진함으로서 오토파고좀 형성을 촉진하고자 한다(⑮).

Description

p62 ZZ 도메인에 결합하는 리간드 또는 아르기닌화된 BiP에 의해 매개되는 오토파지 활성을 통한 신경변성 질환 예방 및 치료{Autophagy stimulation using p62 ZZ domain binding compounds or arginylated BiP for the prevention or treatment of neurodegenerative disease}

본 발명은 오토파지에 관여하는 p62 단백질의 ZZ 도메인에 결합하는 리간드(ligand) 및 아르기닌화된 Bip(arginylated Bip; R-Bip) 단백질에 의하여 오토파지 조절을 통한 신경변성 질환의 치료에 관한 것이다.

N-end rule (N-엔드룰) 경로는 특정 단백질 N-말단을 분해신호로 사용하는 단백질 분해 시스템이다(도 1 및 2). N-엔드룰 분해신호로는 타입 1인 N-말단 아르기닌(Nt-Arg), 리신(Nt-Lys) 및 히스티딘(Nt-His)을 갖는 염기 잔기와 타입 2인 페닐알라닌(Nt-Phe), 루신(Nt-Leu), 트립토판(Nt-Trp), 타이로신(Nt-Tyr) 및 아이소루신(Nt-Ile)의 소수성 잔기가 있다(도 2). 이들 N-말단 잔기들은 특정 인식요소들(N-recognins; N-레코그닌)의 리간드 (N-리간드라 명함)로 결합된다(도 3). 본 발명자들은 기존에 알려진 N-레코그닌들, 즉 UBR1, UBR2, UBR4, 및 UBR5를 최초로 발견하거나 클로닝 하였으며, 이들이 기질인식 도메인으로 UBR box를 가지고 있음을 밝힌 바 있다(Tasaki et al. 2005) (도 3). 또한, UBR box가 N-말단 Arg 잔기 등 type-1 N-엔드룰 리간드(Nt-Arg, Nt-Lys, Nt-His)를 결합하여 기질을 인식하고 기질에 유비퀴틴 사슬을 붙혀줌을 밝힌 바 있다. UBR1과 UBR2가 또한 N-도메인을 가지고 있으며, N-도메인은 type-2 N-end rule 리간드(Nt-Trp, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Leu, Nt-Ile)와 결합하는데 중요한 역할을 한다는 사실도 밝혔다(Sriram et al., 2011). N-레코그닌이 N-end rule 리간드와 결합함으로써 만들어진 유비퀴틴화된 기질은 프로테아좀에 전달되어 짧은 펩타이드로 분해된다. 이러한 과정에서 특정 N-말단 잔기(Nt-Arg, Nt-His, Nt-Lys, Nt-Trp, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Leu, Nt-Leu)는 N-레코그닌이 N-end rule 기질을 타겟팅할 때 필요한 수소결합(hydrogen bond)를 대부분 제공하기 때문에 결합에 꼭 필요한 결정인자이며 리간드의 유효성분이다(도 3c 및 3d) (Sriram and Kwon, 2010).

퇴행성뇌질환(degenerative brain disease)은 나이가 들어감에 따라 뇌에서 발생하는 퇴행성 질환을 의미한다. 주요 증상과 침범되는 뇌부위를 고려하여 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 헌팅턴병 (Huntington's disease; HD), 프리온병/인간 광우병(Prion disease), 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증 (루게릭병) 등으로 나눌 수 있다. 대부분의 알려진 퇴행성뇌질환은 병인 단백질의 대사가 원활하게 일어나지 않고 응고체 형태로 누적이 되기 때문에 생기며, 따라서 단백질대사 이상 질병(protein misfoldiong disorder)군에 속한다. 특히 헌팅턴 질병의 돌연변이 헌팅턴 단백질(Williams et al., 2008; Tsoi et al. 2012), 파킨슨병의 돌연변이 알파 시뉴클레인(Martin et al. 2011), 인간광우병의 돌연변이 프리온(Griffith, 1967), 루게릭병의 돌연변이 SOD1 및 TDP-34(Andersen et al. 2011) 등의 변성단백질은 빨리 응고체로 변환이 되기 때문에 신경세포에 독성물질이 된다.

이중 파킨슨병은 도파민 신경세포 소실을 보이는 대표적인 신경계 퇴행성 질환으로 안정 떨림(resting tremor), 경직, 운동 완만, 자세 불안정 (postural instability)과 같은 증상을 동반한다. 파킨슨병의 약물 치료는 대증적 요법과 신경보호 요법으로 구분된다. 대증적 치료 약물로는 레보도파, 도파민 작용제, 항콜린제제, COMT억제제, 아만타딘 등이 있으며, 신경보호 요법으로는 항산화제, MAO-B 억제제 등이 있다. 이중 가장 강력한 효과를 발휘하는 약물이 레보도파로서 도파민 전구체가 대사되어 도파민을 생성하므로 가장 효과적이다. 레보도파는 L-dopa decarboxylase 뿐만아니라 catechol-O-methyltransferase (COMT)에 의해서 대사되므로 COMT 억제제를 병용하면 혈액에서 COMT에 의해 대사되는 것을 차단하여 레보도파의 효과와 작용 시간을 증가시킬 수 있다. 레보도파를 이용하는 도파민 대체 요법의 경우 많은 파킨슨병 환자에게서 효과를 보고 있으나, 대다수의 환자들이 투약 후 5-10년이 경과하면 운동 이상과 운동 반응의 변동과 같은 부작용을 나타내거나 자율신경계 기능 장애, 자세 불안정 등이 생기며 더 이상 레보도파 치료에 호전되지 않는다.

대표적인 헌팅턴병 체료제로는 테트라베나진(TBZ)이 사용된다. TBZ의 작용 기전은 잘 알려져 있지 않지만 presynaptic neuron에서 vesicular monoamine transporter를 억제하여 dopamine, serotonin, norepinephrine등과 같은 monoamine을 고갈시킨다. 또한 post-synaptic neuron에 있는 D2 dopamine receptor에 대해서 약하긴 하지만 antagonist로서도 기능한다. 클로자핀은 비정형 신경이완제로서 운동 장애를 효과적으로 감소시킨다. NMDA receptor antagonist로 작용하는 아만타딘도 헌팅턴병 치료제로 사용된다. 헌팅턴병은 도파민과 글루탐산 수용체의 과도한 흥분에 의해 발생하므로 아만타딘 또는 리루졸에의한 글루탐산 수용체의 억제에 의해 증상을 완화시킬 수 있다.

파킨슨병과 헌팅턴병 치료의 공통적인 문제점은 치료가 대증 요법과 신경세포 보호 요법으로 진행되며, 질병의 근본 원인의 제거와는 거리가 있기 때문에 치료 효과와 지속성 측면에서 많은 한계점을 가지고 있다. 따라서 질병의 원인이 되는 변성 단백질 응고체들을 원천적으로 제거하지 않고 신경 전달물질의 공급 및 조절로는 질병의 치료에 한계점을 가지고 있다.

세포에서 폴딩이 제대로 되지않는 변성(misfolded) 단백질들이 장시간 방치할 경우 응고되어(aggregated) 프로테아좀을 막아버리던가 다른 세포기능을 저하하는 등 세포독성 물질이 되기 때문에, 유비퀴틴 리가제(ubiquitin ligase)가 유비퀴틴화시킴으로서 프로테아좀에 전달시켜 분해된다(도 4). 정상적인 세포에서는 이러한 과정이 원활해서 변성단백질로 인한 피해를 최소화하는 반면, 노인의 신경세포는 이과정이 느려져서 변성단백질들이 누적이 되고, 이들 잉여 단백질 쓰레기들은 다시 응고체로 전환이 된다. 또한 헌팅턴병, 파킨슨병, 인간광우병, 루게릭병 등 퇴행성 뇌질환을 앓고 있는 환자의 신경세포에는 특정 돌연변이 단백질들이 응고체로 변형이 되는 성질이 강해서 상기 설명한 프로테아좀으로 분해가 되지 않는다. 왜냐하면 프로테아좀은 내경이 13 옹스트롬(angstrom) 정도로 좁기 때문에 변성단백질이 풀려져야만(unfolding)되는데 단백질이 응고가 되면 풀리지 않기 때문이다. 본 발명에서 핵심적인 기술은 p62와 오토파지를 동시에 활성화함으로서 퇴행성 뇌질환의 원인이 되는 변성 단백질 응고체를 효과적으로 제거하는 것이다.

오토파지(autophagy)는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system)과 더불어 세포내 주용 단백질 분해 시스템이다. 오토파지는 노화되거나 제 기능을 못하게 된 세포 소기관들 및 손상되거나 폴딩(folding)이 제대로 안된 단백질들을 분해함으로써 세포의 항상성과 유전적인 안정성을 유지하기 위해 필수적인 단백질 분해 과정이다. 특히 세포질에 변성단백질 응고체가 누적이 될 경우 세포독성 물질이 되기 때문에, 이들을 오토파지가 받아서 분해를 해야한다(도 4). 이때 p62/SQRSM1/Sequestosome-1이 변성단백질 및 그 응고체와 결합하여 이들을 오토파고좀(autophagosome)에 전달한다(도 4). 변성단백질을 오토파고좀에 전달할 때 핵심적인 과정으로 p62가 자가 올리고머화(self-oligomerization)을 거친다. 이때 변성단백질은 같이 농축이 되어 부피가 줄어들고 오토파지에 의한 분해가 용이하게된다. p62가 자가 올리고머화를 매개하는 것은 PB1 도메인인데 그 조절기작은 잘 알려져 있지 않다. 오토파고좀에 전달된 변성단백질-p62 결합체는 오토파고좀이 리소좀과 결합함에 따라 리소좀의 효소에 의해 분해가 된다(도 4). 이러한 기작을 통해 오토파지는 손상된 단백질 및 세포 소기관의 세포내 변동을 통한 세포 항상성의 유지를 위해 중요한데, 오토파지가 저하될 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생하기도 한다. 본 발명의 핵심적인 기술은 세포내 오토파지를 활성화하는 방법을 제공하는 것이다.

퇴행성뇌질환을 치료하기 위해 오토파지를 활성화하는 연구가 활발하게 진행되어오고 있다. 오토파지를 평소에 억제하는 조절인자가 mTOR인데, mTOR 저해제를 사용하여 오토파지를 활성화하는 방법이 가장 광범위하게 사용된다. 구체적으로, 라파미이신을 이용하요 APP를 과발현하는 AD 동물모델에서 아밀로이드 베타(Ab) 및 타우(tau)를 제거함과 동시에 인지력을 증진시켰으며(Caccamo et al., 2010), tau를 과발현하는 AD 동물모델에서 tau를 제거하였고(Rodriguez-Navarro et al., 2010), PD 마우스 모델에서 과발현된 돌연변이 알파 시뉴클레인(a-synuclein) 단백질 응고체를 제거하였다(Webb et al., 2003). 라파마이신 유사물질인 CCI-779를 이용하여 상기 HD 마우스에서 헌팅틴 응고체를 효과적으로 제거하고 동물 행동이나 인지력도 개선시킴을 확인하였다(Ravikumar et al., 2002). 그러나, mTOR가 NF-kB 등 매우 다양한 세포내 경로들에 있어서 매우 중요한 역할을 하며, 따라서 퇴행성 뇌질환의 변성 단백질 응고체를 제거하는 뛰어난 활성을 보임에도 불구하고 mTOR를 약물타겟으로 하는 것으로 알려진 이들 오토파지 활성제들을 치료제로 사용하기에 한계가 있다.

mTOR외의 약물타겟으로 하는 오토파지 활성제를 이용한 연구도 보고되었다. 구체적으로, HD 마우스 모델에서 mTOR를 경유하지 않고 오토파지를 활성화시키는 Rilmenidine을 이용하여 헌팅틴 응고체를 성공적으로 제거하였다(Rose et al., 2010). 프리온병/인간광우병(prion disease) 모델 마우스에서 inositol monophosphatase 저해제로서 오토파지를 활성화시키는 리튬(lithium)을 이용하여 과발현된 돌연변이 프리온(PrPSc) 응고체를 성공적으로 제거하였다(Heiseke et al., 2009). 리튬을 이용하여 PD 마우스 모델에서 과발현된 돌연변이 알파 시뉴클레인(a-synuclein) 단백질 응고체를 제거하였고(Sarkar et al., 2005), amyotrophic lateral sclerosis (ALS) 마우스 모델의 뇌에서 과발현된 돌연변이 SOD1 G93A 응고체를 제거하였다(Feng et al., 2008; Pizzasegola et al., 2009). Trehalose는 식물에서 추출된 알려진 물질인데, mTOR를 경유하지 않고 오토파지를 활성화시키는 것으로 알려졌다. Trehalose를 이용해서 HD 마우스 모델의 뇌에서 돌연변이 헌팅틴(Sarkar et al., 2007), PD 마우스 모델에서 운동능력과 수명을 향상시켰고(Tanaka et al., 2004), PD 모델 세포에 과발현된 A30P 및 A53T 돌연변이 알파 시뉴클레인 응고체를 제거하였다(Sarkar et al., 2007). 자연 추출물인 flavone의 일종인 finsetin은 TORC1과 AMPK를 통해서 오토파지를 활성화시키는 것으로 알려져있다. Finsetin을 이용해서 퇴행성 뇌질환 동물모델에서 증상을 완화하던지 개선시킴으로 확인하였다(Maher et al., 2011). 이들 mTOR을 경유하지 않거나 mTOR를 포함해서 두 개 이상의 타겟을 통해 오토파지를 활성화시키는 물질들 또한 이들 타겟들이 세포내 신호전달체계에서 다양한 역할을 함으로서 치료제로 사용하기에 한계가 있다.

상기 설명한 바와 같이 헌팅턴병 등 대부분의 퇴행성 뇌질환의 치료제는 전무하고 또한 오토파지 활성제로서 가장 많이 사용되는 화합물인 mTOR 저해제는 오토파지의 조절 외에도 다양한 외부 환경으로부터의 자극에 대하여 세포내의 전반적인 유전자 발현을 조절하는 광범위한 역할을 하기 때문에 치료제로서는 부적합하다. 본 발명에서는 변성 단백질 응고체를 직접 오토파고좀에 전달하는 p62을 활성화함으로서 퇴행성 뇌질환의 원인 인자인 변성 단백질 응고체를 제거하는 기술을 제공한다.

본 발명의 약물작용 기전 및 핵심적인 기술들은 도 1에 요약되어 있다. 구체적으로, 돌연변이 헌팅틴이나 알파 시뉴클레인은 물에 녹지 않는 변성체(misfolded)로 변환이 된 후 서로 응겨 붙어 올리고머 형태의 응고체로 자란다(①). 이들 변성체들은 신경세포에서 세포독성 물질로서 작용하면서 더욱 자라서 큰 올리고머(②)나 섬유질(fibrillar) 응고체(③)로 자란 뒤, 궁극적으로 인클루젼(inclusion) 보디가 형성된다(단계 ④). 상기 과정에서 젊은 신경세포에서는 BiP 등 소포체 샤프롱들이 ATE1 R-transferase에 의한 N-말단 아르기닌화(⑤)를 통해 Nt-Arg를 다량 만들어내며, 이후 아르기닌화된 BiP(R-BiP)은 세포질로 나와서 변성된 헌팅턴이나 알파 시뉴클레인과 결합한다(⑥). R-BiP의 Nt-Arg는 리간드로서 p62의 ZZ 도메인에 결합한다(⑦). 상기 결합으로 인하여 평소에 닫혀있는 불활성 형태의 p62가 열린형태로 바뀌면서 구조적인 활성화가 유도됨으로서(단계 ⑧), PB1 및 LC3-결합 도메인이 노출된다. PB1 도메인에 의한 올리고머화(⑨)를 기반으로 헌팅턴 및 알파 시뉴클레인 단백질 응고체과 결합하면서 오토파지 분해가 가능한 응고체, 즉 p62 바디(body 또는 sequestosome)로 농축이 된다(⑩). 이후 p62가 오토파고좀 막에 돌출되어 있는 LC3와 결합을 통해 오토파지 타겟팅(⑪)과 리소좀 단백질 분해가 완료된다. 젊은 신경세포는 단계 ⑤-⑪로 이루어진 오토파지 단백질분해가 강력해서 세포독성 단백질 응고체(①-⑤)가 누적되지 않지만, 노화된 신경세포는 단계 ⑤-⑪의 오토파지 단백질분해가 약화됨으로서 단백질 응고체(①-⑤)가 누적이 되면서 악순환에 빠지게 된다. 본 연구에서는 p62 ZZ 도메인의 저질량 리간드를 이용하여 p62를 인위적으로 활성화하고자 하여(⑫, ⑬) 헌팅턴 및 알파 시뉴클레인 단백질 응고체 등을 효과적으로 제거하고자 하였다. 구체적으로, 단계 ⑫를 통하여 리간드와 결합한 p62가 p62-R-BiP-변성단백질 올리고머화(⑨) 및 오토파지 응고체 형성(⑩)을 촉진하고, 또한 단계 ⑬을 통하여 리간드-p62 결합체는 오토파지 활성제로 작용하여(⑭) LC3의 합성, LC3-I의 LC3-II로의 변환 등을 촉진함으로서 오토파고좀 형성을 촉진하고자 한다(⑮).

문헌 조사를 한 결과, p62는 본 발명자들이 제안한 오토파지 활성제의 first-in-class 타겟이다(도 1, ⑧). 또한 p62를 오토파지 활성제 개발이나 퇴행성뇌질환의 단백질 응고체 제거를 위한 약물타겟으로 연구한 예는 전무하다. 따라서, 신경변성 질환의 치료제로서, 오토파지에 관여하는 물질을 표적으로 하는 새로운 치료제 및 방법의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 오토파지 활성에 관여하는 물질을 이용하여 신경변성 질환을 예방 및 치료제로 개발하기 위해 노력한 결과, p62 ZZ 도메인과 결합하는 리간드가 LC3와 결합하고 오토파지를 활성화시켜 헌팅턴 및 알파 시뉴클레인 단백질 응고체 등을 효과적으로 제거함으로써, 신경변성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 및 이의 조절 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 p62 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 p62의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 (1) p62 올리고머화 및 구조적 활성화를 유도하는, (2) 오토파지를 활성화하는, 및 (3) 변성 단백질 응고체를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명은 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

나아가, p62의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는 (1) p62 올리고머화 및 구조적 활성화를 유도하는, (2) p62의 LC3와의 결합을 증대시키는, (3) p62의 오토파고좀(autophagosome)으로의 전달을 증대시키는, (4) 오토파지를 활성화하는, 및 (5) 변성 단백질 응고체를 제거하는 방법을 제공한다

본 발명은 p62의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 하는 p62 활성 조절제, 오토파지 활성제, 및 퇴행성 뇌질환 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 p62 ZZ 도메인 리간드는 X-11 펩타이드 (X= Nt-Arg, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Trp), Arg-Ala(RA), Trp-Ala(WA), ZZ-L1 및 ZZ-L2 소화합물, 및 N-말단 아르기닌화된 BiP(Nt-arginylated BiP; R-Bip)을 포함한다. 특히 X-11 펩타이드, Arg-Ala, Trp-Ala, 및 R-BiP의 유효성분은 N-말단에 붙어있는 Nt-Arg, Nt-Phe, Nt-Tyr 및 Nt-Trp를 포함한다. 따라서, p62 ZZ 도메인에 결합하는 리간드는 오토파지 조절을 통한 신경변성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제안하는 약물 타겟 및 기전을 나타내는 도이다.
도 2는 N-말단 단백질분해 경로를 나타내는 모식도이다. 상기 경로에서는 Nt-Arg 등 N-말단 잔기가 분해 리간드로 작용하여 N-레코그닌에 의해서 인식된 뒤 결합되고, 상기 결합이 기질의 분해를 유도한다. 기존의 경로에서는 Nt-Arg가 유비퀴틴화를 유도함으로서 기질의 프로테아좀으로의 타겟팅을 증진시키는 역할을 한다. 본 발명에서는 Nt-Arg가 오토파지의 p62에 결합함으로써 p62를 활성화시킬 뿐만 아니라 오토파지 경로도 활성화시킨다는 것을 발견하였다.
도 3은 N-말단 단백질분해 경로의 N-레코그닌들의 구조 및 서열을 나타낸 도이다. (a) UBR box 단백질 군(UBR1-UBR7)의 일차구조 모식도. 이들은 Nt-Arg와 결합할 수 있는 UBR box를 가지고 있으며 이중 UBR1, UBR2, UBR4, UBR5는 실제 Nt-Arg와 결합할 수 있음이 밝혀졌다. (b) UBR box들의 서열을 비교한 도. (c, d) UBR1의 UBR box의 결정구조.
도 4는 유비퀴틴-프로테아좀(UPS), 샤프롱-매개 오토파지(chaperone-mediated autophagy), 및 마크로 오토파지(오토파지, macroautophagy)가 어떻게 서로 협조하여 변성 단백질를 제거하는지를 보여주는 모식도이다.
도 5는 p62를 N-엔드룰의 신규 N-레코그닌으로 Nt-Arg, Nt-Trp 등 N-리간드와 선택적으로 결합할 수 있음을 나타낸 도이다. (a) N-데그론과 결합하는 신규 N-레코그닌을 발굴하기 위하여 N-데그론을 N-말단에 장착한 펩타이드를 합성하여 동물조직 추출액에서 어떤 단백질들이 붙는지 조사한 모식도. (b, c) 래트(rat)의 정소 추출물(extracts)를 이용하여 X-펩티드 풀다운을 수행하여 얻은 단백질들을 실버염색법으로 분석한 결과. (d) X-펩티드 풀다운 기법으로 얻은 단백질들을 질량분광분석과 연계된 iTRAQ(Isobaric tags for relative 및 absolute quantitation)을 수행한 결과. (e-i) X-펩티드 풀다운 기법을 이용하여 얻은 단백질들의 면역블롯 분석을 실행한 결과이다.
도 6은 비아코어 분석(Biacore assay)을 이용하여 p62의 Nt-Arg (Kd, 40 nM)와 Nt-Phe (Kd, 3.4 mM)에 대한 결합력을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 p62가 ZZ 도메인을 통해서 N-엔드룰 리간드와 결합하며, ZZ 도메인을 UBR box와 일차구조를 비교한 결과를 나타낸 도이다. (a, c, e, g, I) p62의 여러 가지 조각들을 나타내는 모식도. (b, d, f, h, j) p62 조각들을 가지고 X-펩파이드 풀다운 분석을 실행한 결과들이다. l, p62 ZZ 도메인과 UBR box의 일차구조를 비교 분석한 결과.
도 8은 Arg-Ala가 p62의 자가 올리고머화(self-oligomerization)을 유도하며 p62의 LC3와의 결합을 증대시킴을 나타낸 도이다. (a-c) p62의 자가 올리고머화 분석. N-리간드인 Arg-Ala가 p62 ZZ 도메인에 결합했을 때 p62의 자가 올리고머화 및 응집체 형성을 유도하는지 조사하기 위하여, 비환원 SDS-PAGE를 이용하여 전장 p62가 발현되는 HEK293세포 융해물로 시험관내 올리고화 분석(in vitro oligomerization assays)을 수행하였다. (d) Arg-11 펩티드에 결합할 수 없는 p62 ZZ 돌연변이체를 이용하여 시험관내 p62 올리고머화를 분석한 결과. (e) p62의 PB1 도메인이 p62의 응집체에 관여하는가를 조사하기 위하여, D69A 돌연변이체의 응집 능력을 평가하였다. (f-h) p62와 LC3의 결합에 대한 Arg-Ala의 효과를 확인하기 위하여, ELISA 분석을 수행하였다. (i) p62 ZZ 도메인에 Nt-Arg가 결합함으로서 p62의 구조적인 활성화를 유도하는 모식도.
도 9는 소포체 샤프롱들의 일차 단백질 서열을 비교한 그림이다. 이들 단백질들은 번역후 소포체 내부에 들어갈 때 시그널 펩타이드(signal peptide)가 잘려지며, 이때 성숙된 단백질(mature protein)의 N-말단 잔기에 N-리간드를 노출하게 된다(박스로 표시). 변성 단백질이 세포질에 누적이 되면, 이들 샤프롱들이 N-말단 아르기닌화를 통해서 세포질로 이동하게 된다.
도 10은 N-말단 아르기닌화를 통해서 Nt-Arg를 N-리간드로 획득하는 소포체 단백질들의 발굴을 나타낸 도이다. (a) 변성 단백질의 누적 등 세포질이 스트레스에 노출될 경우, 샤프롱들이 세포질로 이동하며 ATE1 R-transferase에 의해서 N-말단 아르긴닌화가 되는 과정을 설명한 모식도. (b) R-BiP 항체의 특이성과 결합력을 측정하기위한 펩타이드 결합분석을 실행한 결과. (c) R-BiP 항체를 이용한 돗블랏(dot blot) 분석. (d) ATE1 R-transferase 동종효소 (isomerase)를 과발현시킨 뒤 상기 R-BiP 항체를 이용하여 R-BiP 형성이 유도됨을 확인하였다.(e) ATE1을 siRNA를 이용하여 녹다운 시켰을 때, R-BiP의 형성이 줄어듦을 확인하였다.
도 11은 BiP, CRT 및 PDI가 ATE1에 의해 N-말단 아르기닌화가 매개됨을 규명한 도이다. (a) Ub-X-BiP-flag(X= Glu 혹은 Val)를 발현시켜 아르기닌화를 검정하였다. (b) 재조합 단백질 Ub-X-Bip-myc/his 구조체를 생성하는 모식도. (c) 이 구조체를 이용하여 X-BiP이 Nt-Glu19에 아르기닌화됨을 확인하였다. (d) ATE1 녹아웃 세포에서는 R-BiP이 생성되지 않았다. (e) ER 스트레스를 일으키는 thapsigargin을 사용하여 R-BiP이 ER 스트레스 때문에 생기는 것이 아니라 ATE1 R-tranferase에 의해 일어나는 효소반응의 산물임을 밝혔다. (f) 세포 분획기법을 이용하여 이렇게 생성된 R-BiP이 다량 세포질로 이동함을 밝혔다. (g) 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 단백질 분해 기법을 이용하여 세포질로 이동한 R-BiP이 소포체 내의 아르기닌화 되지 않은 BiP에 비해서 상대적으로 분해가 되지 않는 것을 확인하였다. (h) CRT와 PDI도 ATE1에 의해 N-말단 아르기닌화 과정을 거치는지 조사한 결과, ATE1 동종효소를 과발현했을 때 R-CRT와 R-PDI가 생성됨을 확인하였다.
도 12는 세포질의 외부 DNA가 R-BiP 생성을 유발함을 규명한 도이다. (a, b) R-BiP의 생성이 double stranded DNA (dsDNA)가 세포질에 유입이 되었을 때 특이적으로 유발됨. (b, c) R-BiP와 비슷하게 R-CRT도 dsDNA가 세포질로 유입이 되었을 때 유도됨을 확인함. (d) 세포분획기법을 이용햐여 dsDNA에 의해서 유도된 R-BiP이 세포질로 이동함을 관찰함. (e-g) DNA을 함유하는 병원체(바이러스나 박테리아)를 모방하는 poly(dA:dT)를 이용하여 R-BiP, R-CRT, P-PDI등이 침입 DNA에 대한 innate 면역반응의 일부로서 생성된다는 것을 확인하였다. (f) 이때 오토파지 작용이 같이 활성화됨을 확인하였다.
도 13은 R-BiP이 p62와 더불어 오토파지의 오토파고좀에 전달됨을 확인한 도이다. (a) 면역염색법을 이용하여 R-BiP이 세포질로 이동한 뒤 반점(puncta)같은 세포 구조물에 모이는 것을 확인. (b-d) 상기 R-BiP 반점은 p62 반점과 동시배치(colocalization) 했으며(a, c), LC3와도 동시배치 함을 확인(b-d). (e) 마우스 배아 심장에서도 BiP이 LC3 양성 autophagosome에 전달되는 것을 확인. (f-h) siRNA를 이용하여 ATE1이나 BiP을 녹다운 시켰을 때, R-BiP가 오토파고좀으로 이동하지 못함. p62 녹아웃도 비슷한 결과를 나타냈다.
도 14는 R-BiP이 오토파고좀에 전달될 때 Nt-Arg이 필요함을 확인한 도이다. (a) Ub-X-BiP-GFP 재조합 단백질(X= Arg, Glu, 혹은 Val)을 세포에 과발현시켜 X-BiP-GFP를 생성한 모식도. (b) 면역염색기법을 이용하여 자가포식으로 이동상황을 조사. (c) R-BiP은 오토파지 오토파고좀으로 전달되었다. 반면 Val-BiP (Nt-Glu19가 Val으로 치환되어 아르기닌화의 기질이 될 수 없음)은 Nt-Arg가 없기 때문에 오토파지 오토파고좀으로 전달되지 못하였다. (d) R-BiP의 세포내 위치를 LC3 반점과 비교하였을 때도 비슷한 결과를 얻었다. (e) BiP의 대부분을 제거하고 잔기서열 19-124만 남긴 Ub-X-BiP^Δ(도 14a)을 과발현한 다음 X-BiP^ΔD의 세포내 위치를 면역염색기법을 이용하여 조사. (f) X-BiP과 LC3의 세포내 위치를 면역염색기법으로 조사해 보았을 때도 비슷한 결과를 얻었다.
도 15는 R-BiP의 Nt-Arg가 p62 ZZ 도메인에 직접 결합함을 확인한 도이다. (a, b) R-BiP의 Nt-Arg가 p62 ZZ 도메인에 결합하는지 조사하기 위한 X-펩타이드 풀다운 분석. (c, d) R-BiP 펩타이드는 세포추출액으로부터 p62를 풀다운 시켰지만, E-BiP이나 V-BiP 펩타이드는 p62를 풀다운 시키지 않았다. (e) R-BiP의 Nt-Arg가 p62의 어느 부위에 결합하는지 조사하기 위해 p62을 작은 조각들로 나눈 모식도. (f) 상기 p62 조각들과 R-Bip peptide을 가지고 풀다운실험을 실행한 결과, R-BiP의 Nt-Arg가 p62 ZZ 도메인에 결합함을 나타냈다. (g) p62 ZZ 도메인만 잘라내어서 p62-ZZ83-175-GST 및 p62-ZZ(D129A)83-175 라 명명하였다. (h) 상기 p62 조각들을 이용하여 GST 풀다운 분석을 실행하였다. (i) p62-ZZ83-175-RFP 및 유비퀴틴-X-Bip19-124-GFP를 MEF세포에 동시발현시켰을 때 Arg18-Bip19-124는 반점형태(puncta formation)를 나타내는 p62-ZZ83-175-RFP와 동시이동 형태를 나타냈지만, Val19-Bip19-124-GFP 와 p62-ZZ83-175-RFP 는 반점형태 및 동시이동을 하지 못하였다.
도 16은 R-BiP이 p62 의존적으로 오토파지 작용에 의해 분해됨을 확인한 도이다. (a, b) Ub-X-BiP^Δ-GST를 제작하여 +/+ 및 p62-/- 세포에서 과발현한 뒤 BiP의 분해를 분석한 결과이다. (c) Ub-X-BiP^Δ-GST의 R-BiP은 오토파지 과정이 결여된 ATG5-/- 세포에서 분해가 되지 않고 누적되었다. (d, e) Ub-R-BiP-myc/his를 가지고 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 단백질분해 정량 분석을 실행하였을 때, R-BiP이 ATG5-/- 세포에서 현저히 안정화됨을 확인하였다.
도 17은 R-BiP이 세포질의 유비퀴틴화된 단백질에 의해 생성된 뒤 세포질 변성 단백질들과 결합하며 이들을 오토파지에 전달하는 것을 확인한 도이다. (a) HeLa 세포에 poly(dA:dT)를 처리한 뒤 면역블롯기법을 실행한 결과 R-BiP 생성이 유도될 때 유비퀴틴이 결합된 세포내 단백질군들도 같이 누적됨을 확인. (b) 유비퀴틴화 된 세포내 단백질들의 일부는 반점형태로 p62 보디에 전달되고, 이 구조체안에서 R-BiP 및 p62와 동시위치 함을 확인. (c) 여러 가지 화학물들을 세포에 처리한 다음 R-BiP의 형성을 면역블롯 기법을 사용하여 조사한 결과, 프로테아좀 억제제가 공통적으로 R-BiP 형성을 유도하였다. (d, e) 프로테아좀 저해제와 소포체의 스트레스를 유발하는 탑시가긴(thapsigargin)을 동시에 처리했을 때 R-BiP, R-CRT, 및 R-PDI의 생성이 더 강력하게 유발된다는 결과이다. (f) Hsp90의 저해제인 겔데나마이신(geldenamycin)을 처리하여 세포내 변성단백질의 형성을 촉진시킨 결과, R-BiP의 형성이 유도됨을 확인하였다. (g) 스스로 폴딩이 풀려서 변성이 되는 모델 기질인 YFP-CL1을 과발현 시켰을 때, R-BiP이 직접 결합함을 확인하였다. (h, i) 면역 형광염색법을 이용하여 YFP-CL1이 오토파지 수포(vacuole)에 전달되고, 상기 구조물속에서 R-BiP 및 p62와 동시위치함을 확인하였다.
도 18은 소화합물(small compound)인 ZZ-L1과 ZZ-L2가 p62 올리고머화 및 LC3와의 결합을 증대시킴을 확인한 도이다. (a, b) ZZ-L1을 p62을 과발현 하는 세포 extracts에 처리한 뒤 시험관내 올리고머화 분석(in vitro oligomerization assay)을 사용하여 p62 응집체 정도를 측정. (c) Arg-Ala을 이용하여 p62의 LC3와의 결합을 증대시킨 실험과 비슷한 방법으로 ZZ-L1이 p62을 활성화 시키는지 조사한 결과, ZZ-L1가 농도의존적(0, 10, 25, 100, 500, 1000 μM)으로 LC3와의 결합을 증대시킴을 확인. (d-f) ZZ-L1와 ZZ-L2가 p62의 반점형성(puncta formation)을 유도하는지를 확인하기 위하여, 면역형광분석법(immunofluorescence confocal microscopy)을 이용하여 관찰하였다.
도 19는 ZZ-L1과 ZZ-L2가 오토파지 활성제임을 나타낸 도이다. (a) 면역 형광염색법을 이용하여 상기 ZZ 리간드가 HeLa 세포에서 p62 오토파지 반점 외에도 LC3 오토파지 반점의 형성을 촉진하다는 것을 밝힘. 이는 상기 ZZ 리간드들이 오토파지 활성제의 기능이 있음을 나타냄. (b) ZZ-L1과 ZZ-L2의 오토파지에 대한 영향을 조사하기 위하여 웨스턴블랏을 실행. (c) LC3의 증가 및 LC3-II의 형성은 si-대조군(si-control)을 혈질감염시킨 ZZ 화합물 ZZ-L1 및 ZZ-L2에 의해 유도되었으나 상기 효과는 p62 넉다운(knock down)에 의해 저해됨. (d) +/+와 p62-/- 세포를 이용한 비슷한 실험에서도 ZZ-1 (5 mM)이 p62-/- 세포에서 오토파지 활성제로 작용하지 못함을 나타냄. (e) ZZ 리간드를 처리한 세포에 오토파지 억제제인 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine(HCQ))를 같이 처리한 뒤, 면역블롯을 이용하여 LC3의 양을 조사한 결과. (f) 산성에 민감한 GFP와 민감하지 않은 RFP가 조합된 RFP-GFP-LC3가 안정적으로 형질전환된 HeLa 세포를 사용하여 상기에서 사용한 동일한 방법으로 오토파지 역동분석을 수행하였다. (g) ZZ 리간드에 의해서 활성화된 p62가 오토파지 활성제로 기능을 한다는 것을 나타내는 모식도이다.
도 20은 ZZ 리간드와 결합한 p62가 mTOR와 관계없이 오토파지를 활성화 시킴을 나타낸 도이다. (a) HeLa 세포에 ZZ-L1을 처리하고 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 단백질분해분석기법을 수행한 결과, ZZ-L1이 p62의 분해를 촉진시킨다는 것을 나타냄. (b, c) ZZ 리간드와 rapamycin의 오토파지 활성제로서의 효능과 기작을 비교하기 위해 HeLa 세포에 농도 별로, 또는 시간 별로 처리를 한 뒤 LC3의 생성과 LC3-II의 전환을 비교해본 결과. (d) 라파마이신이 mTOR(mammalian Target Of Rapamycin)의 저해제로서, mTOR가 억제되면서 오토파지의 핵심 조절인자(ULK, Beclin 등)이 활성화 되면서 LC3의 합성, LC3-II 형태로의 전환 등을 통해서 오토파고좀의 생성이 증대된다는 것을 나타내는 모식도. (e) HeLa 세포에 ZZ 리간드 나 rapamycin을 처리한 뒤, mTOR에 의해서 조절받는 p70S6K의 인산화를 조사. (f) ZZ 리간드가 유비퀴틴화된 세포내 단백질들의 오토파지로의 이동을 증진하는지 면역형광염색법으로 조사. 5 mM ZZ-L1이 유비퀴틴화된 단백질들을 오토파지 수포(vacuole)로 유도함을 확인하였다. 또한 오토파지 저해제 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)을 처리하였을 때 유비퀴틴화 된 단백질들이 오토파지 수포에 누적이 되는 것을 확인하였다.
도 21은 ZZ 리간드가 돌연변이 헌팅틴 단백질 응고체를 제거함을 나타낸 도이다. (a) 야생형 헌턴틴 (HDQ25-GFP)와 돌연변이 헌팅틴(HDQ103-GFP; CAG가 103번 반복)의 모식도. (b) 상기 헌팅틴 단백질들을 과발현하는 세포에 10 mM ZZ-L1이나 1 mM 라파마이신을 처리하고 돗블랏기법(dot blot assay)을 이용하여 세포내 잔여 헌팅틴 단백질을 조사한 결과. (c) HDQ103-GFP 단백질 응고체를 과발현하는 HeLa 세포에 10 mM ZZ 리간드를 처리한 뒤 면역형광염색기법을 실행한 결과. (d) 세포를 0.5% Triton X-100에서 녹는 분획(soluble fraction)가 안녹는 분획(insoluble fraction; 응고체 포함)로 나눈뒤 면역블롯을 시행한 결과, ZZ-L1을 처리한 응고체 분획에서 효과적으로 헌팅틴 변성단백질을 제거함을 확인. (e) HeLa 세포를 ZZ-L1, ZZ-L2, 및 라파마이신을 처리한 뒤 면역블롯 기법을 실행한 결과. (f) +/+ 및 ATG5-/- 세포에 10 mM ZZ 리간드와 1 mM 라파마이신을 처리한 뒤 면역블롯을 수행한 결과.
도 22은 HDQ103-GFP 헌팅틴 단백질 응고체가 형성한 인클루젼 바디(inclusion body)에 R-BiP과 p62가 동시위치함. (a, b, c) HDQ103-GFP 단백질 응고체를 과발현하는 HeLa 세포에 10 mM ZZ 리간드를 처리한 뒤 면역형광염색기법을 실행한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 p62-ZZ1, p62-ZZ2, rapamycin의 화학적 성질을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 p62-ZZ1의 pharmacokinetic profile을 마우스에서 비교한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 p62의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 함유하여 p62의 기능을 활성화하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 p62 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 이용하여 오토파지 활성제를 제공한다.

또한 본 발명은 p62 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 이용하여 변성단백질 응고체를 제거하는 방법을 제공한다.

더 나아가 본 발명은 p62 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 p62은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 ZZ 도메인은 서열번호 1로 기재되는 p62 단백질의 아미노산 서열의 128 내지 163 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 리간드는 하기의 펩타이드를 포함한다. 하기의 서열번호 2 내지 9로 기재되는 리간드에서 p62 ZZ 도메인에 직접 결합하는 유효성분은 Nt-Arg (화학식 1), Nt-Phe (화학식 2), Nt-Trp (화학식 3), 또는 Nt-Tyr (화학식 4)의 N-말단 잔기이다:

서열번호 2: Arg-Ala ;

서열번호 3: Phe-Ala ;

서열번호 4: Trp-Ala ;

서열번호 5: Tyr-Ala ;

서열번호 6: Arg-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys (R-11) ;

서열번호 7: Trp-Ile-Phe-Ser-Thr-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-Tyr-Lys (W-11) ;

서열번호 8: BiP 단백질의 N-말단 Glu 19가 아르기니화된 단백질 (R-BiP) ; 및

서열번호 9: 아르기니화된 Bip N-말단 펩타이드 (R-BiPD).

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

또한, 상기 리간드는 하기 화학식 5 (p62-ZZ1; 2-(3,4-bis(benzyloxy)benzylamino)ethanol ) 또는 화학식 6 (p62-ZZ2; 1-(3,4-bis(benzyloxy)phenoxy)-3-(isopropylamino)propanol)로 기재되는 화합물을 포함한다. 특히, p62-ZZ2는 NCI314953으로 알려진 물질이다.

[화학식 5]

[화학식 6]

아울러, 상기 리간드는 p62 ZZ 도메인에 결합하여, p62 단백질의 PB1 도메인 및 LIR 도메인을 활성화시켜 p62의 올리고화 및 응집체를 유도하고, p62 응집체 유도를 통한 오토파고좀(autophagosome) 형성을 증대시키는 것을 특징으로 한다. 상기 과정을 통해 변성 단백질 응고체가 원활하게 제거된다(도 1 참조).

상기 신경변성 질환은 라임병(Lyme borreliosis), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia), 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD), 다발성경화증(multiple sclerosis; MS), 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 간질(epilepsy), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중(stroke), 헌팅턴병(huntington's disease), 피크병(Picks disease) 및 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 p62가 Nt-Arg, Nt-Phe, Nt-Trp, 및 Nt-Tyr과 결합할 수 있는 N-레코그닌임을 규명하였고(도 5 참조), 특히 p62가 Nt-Arg에 대해 결합력이 우수함을 확인하였으며(도 6 참조), p62의 ZZ 도메인이 결합에 관여함을 확인하였다(도 7참조). N-리간드인 Arg-Ala는 p62의 자가올리고머화 및 응집체 형성을 유도하였고(도 8d 참조), p62와 LC3와의 결합을 증대시킴을 확인하였다(도 8f 참조). N-말단 아르기닌화를 통해서 Nt-Arg를 획득하는 소포체 단백질들의 발굴한 결과, N-말단 아르기닌화된 BiP(R-BiP), calreticulin(R-CRT), 및 protein disulfide isomearase(R-PDI)를 확인하였고(도 9 참조), 이들은 ATE1에 의해 N-말단 아르기닌화가 매개됨을 확인하였다(도 10 참조). 또한 세포질에 있는 외부 DNA가 R-BiP 생성을 유발함을 확인하였으며(도 12 참조), 상기 R-BiP은 p62와 같이 오토파고좀에 전달됨을 확인하였다(도 13 참조). R-BiP은 p62 의존적으로 오토파지 작용에 의해 분해되며 유비퀴틴화가 되는 것이 확인되었다(도 16 참조). Nt-Trp와 구조적으로 유사한 소화합물(ZZ-L1 및 ZZ-L2)을 발굴하였고(도 18 참조), 상기 ZZ-L1 및 ZZ-L2가 세포내 오토파고좀 형성을 증대시킴을 확인하였다(도 19 참조). 또한 상기 ZZ 화합물(리간드)은 이들에 의해 형성된 오토파고좀과 리소좀의 융합하게 하며(도 20 참조), 오토파지 활성화를 통해서 헌팅턴 응고체를 포함하는 변성 단백질을 제거함을 확인하였다(도 21 및 도 22 참조).

따라서, 본 발명의 p62 ZZ 도메인에 결합하는 리간드는 p62의 올리고화 및 응집체를 유도함으로써 오토파지 조절을 통한 신경변성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 치료제 또는 약학적 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용되는 ”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 예로서 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

본 발명의 [화학식 5] 또는 [화학식 6]로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, [화학식 5] 또는 [화학식 6]으로 표시되는 벤조퓨란계 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화학식 5 또는 화학식 6으로 표시되는 벤조퓨란계 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 유효 투여량은 통상적으로 성인(60 kg)의 경우, 약 1 ng 내지 10 mg/일, 특히 약 1 g 내지 1mg/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드(ligand)를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 리간드는 Arg-Ala(서열번호 2), Phe-Ala(서열번호 3), Trp-Ala(서열번호 4), Tyr-Ala(서열번호 5), R-11(서열번호 6), W-11(서열번호 7), R-BiP(서열번호 8), 및 R-BiPD(서열번호 9) 로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 리간드의 유효성분은 N-말단 잔기로서, 상기 Nt-Arg(화학식 1), Nt-Phe(화학식 2), Nt-Trp(화학식 3), 및 Nt-Tyr(화학식 4)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

또한, 상기 리간드는 상기 p62-ZZ1(화학식 5), 또는 p62-ZZ2(화학식 6; NCI314953)이다.

본 발명의 화합물이 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 건강식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 10 g이다.

또한, 본 발명에 따른 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

따라서, 본 발명의 p62 ZZ 도메인에 결합하는 리간드는 p62의 올리고화 및 응집체를 유도함으로써 오토파지 조절을 통한 신경변성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 리간드를 p62 단백질의 ZZ 도메인에 결합시켜 p62의 올리고머화를 유도하고 p62의 LC3와의 결합을 증대시키는 과정을 포함하는 p62 활성을 증대시키는 방법, 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 p62의 오토파고좀(autophagosome)으로의 전달을 증대시키는 방법, 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 오토파지를 활성화하는 방법, 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 변성 단백질 응고체가 오토파고좀에 전달되는 과정을 활성화하는 방법, 및 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 오토파지를 활성화함으로서 리소좀(lysosome)에 의한 변성 단백질 응고체 분해를 증대시키는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 p62 ZZ 도메인에 결합하는 리간드는 p62의 올리고화 및 응집체를 유도함으로써 오토파지 조절을 통한 신경변성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> p62 가 신규한 N- 레코그닌임을 발견

N-데그론과 결합하는 신규 N-레코그닌을 발굴하기 위하여 N-데그론을 N-말단에 장착한 펩타이드를 합성하여 동물조직 추출액에서 어떤 단백질들이 붙는지 조사하였다.

구체적으로, 이를 위하여 X-펩티드 풀다운 분석 및 질량분광분석과 연계된 iTRAQ(Isobaric tags for relative 및 absolute quantitation)을 수행하였다. N-엔드룰 상호작용 단백질로는 래트 정소 추출물을 사용하였으며 스트렙타빈 비드에 고정화된 바이오틴으로 표지된 X-펩티드(R11 sequence: RIFSTIEGRTY(타입 1)), F11 sequence: FIFSTIEGRTY(타입 2), 및 V11(안정화 대조군)(VIFSTIEGRTY)을 사용하였다(도 5a, d). X-펩티드에 연결된 10 mer 링커는 N-엔드룰의 기질인 신드비스 바이러스 폴리머라제(Sindbis virus polymerase) nsP4에서 유래한 것이다. 혼합물을 5배의 PBS 볼륨으로 희석하고 4℃에서 밤사이 동안 배양하였다. 각 X-펩티드를 이용하여 풀다운한 단백질은 ITRAQ 표지 기법을 사용하여 상이한 색의 형광물질로 표지되었다. 마스코트(Mascot) 스코어를 근거로 한 상기 단백질체 분석을 통해 약 200여 개의 단백질을 규명하였으며, N-엔드룰 경로에 관여하는 공지의 포유류 UBR box E3 패밀리, UBR1, UBR2, UBR4 및 UBR5을 포함하였다(도 5b, c).

상기 결과를 X-펩티드 풀다운 분석에 이은 면역블롯기법으로 확인하였다(도 5e-i). UBR1은 R11 및 F11 풀다운 분석 모두에서 나타났으며, UBR2는 F11 풀다운 분석에서만 나타났고, UBR4 및 UBR5는 R11 분석에서 나타났다. 안정화 대조군인 V11을 사용한 풀다운 분석에서는 UBR 단백질이 침강되지 않았다. UBR E3 라이게이즈 이외에, R11 침강 시료에서 질량분광분석으로 확인된 것이 시케스토좀(sequestosome) 1(p62) 단백질이다. 상기 결과는 X-펩티드 풀다운 분석 후, 침강된 단백질의 전기영동/실버 염색과 웨스턴블랏으로 확인하였다.

그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 실버 염색된 젤에서 R11-풀다운 시료에서는 분자량 62 kDa 부근에서 강한 밴드가 있었으나, 음성 대조군인 V11-풀다운 시료에서는 이러한 밴드가 관찰되지 않았다. 질량분광분석(mass-spec)을 실행한 결과, 상기 밴드는 p62/sqstm1(이하 p62) 단백질인 것으로 나타났다(도 5c). 이러한 실험결과, 본 발명자들은 p62가 신규 N-레코그닌이라는 것을 확인하였다.

< 실시예 2> p62 가 Nt - Arg , Nt - Phe , Nt -Trp, 및 Nt - Tyr 과 결합할 수 있는 N-레코그닌임을 규명

상기 실시예 <1-1>에서 확인된 p62 단백질을 더욱 확실히 규명하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 인간 p62의 아미노산 1-440에 해당하는 재조합 전장 단백질에 의해 생성된 마우스 모노클로널(monoclonal) p62 항체(1:500, ab56416, Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 웨스턴블랏을 실행하였다. 그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, 시험관내에서 전사되고 번역된 p62가 R11 펩티드에 특이적으로 강한 결합을 나타내었지만, F11 펩티드에는 약하게, 그리고 V11-펩티드에는 결합하지 않았다(도 1d). 실험에 사용한 양을 기준으로, R11 펩티드는 40%를 초과하는 효율로 p62를 침강할 수 있는 반면 F11 펩티드의 효율은 5% 이었다. 상기 결과는 디펩티드 경쟁 분석(dipeptide competition assay)으로 확인하였고, RA 펩티드(Arg-Ala)가 p62와의 결합에서 R11 펩티드와 가장 효과적으로 경쟁하였으며, 또 다른 타입 1 N-엔드룰 펩티드인 HA(His-Ala)가 그 다음으로 경쟁에 효과적이었다(도 5h, i). 타입 2 펩티드 중에서, WA(Trp-Ala)는 효과가 있었으며, FA(Phe-Ala)는 효과가 없었다. N-엔드룰 펩티드가 아닌, AR과의 경쟁 분석 결과 RA, HA 및 WA이 N-엔드룰 특이적인 것으로 나타났다. 상기 결과는 p62가 광범하게 타입 1 및 타입 2의 N-엔드룰 펩티드에 결합할 수 있음을 나타내는 것이다.

p62의 N-말단 잔기에 대한 결합 특이성을 직접 결정하기 위해서 여러 가지 N-말단 잔기를 가지는 펩파이드와 p62와의 결합을 X-펩타이드 풀다운 기법을 사용하여 결정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 p62는 3 종류의 모든 타입 1 N-엔드룰 N-말단 잔기인 R11, H11 및 K11와 결합할 수 있었다(도 5h). p62는 R11-펩티드에 강하게 결합하며, K11에는 중간정도, H11에는 약하게 결합하였다. 내인성 p62는 또한 4 종류의 N-엔드룰 N-말단 잔기 중 3 종류, 즉, F11, W11 및 Y11에 결합하였으나, L11에는 결합하지 않았다(도 5h). Arg(R), His(H) 및 Lys(K)은 양하전된 측쇄기를 가지며, Phe(F), Trp(W) 및 Tyr(Y)은 방향족 측쇄를 가진다. p62와 결합하는 아미노산의 특징으로부터 p62가 양성으로 하전되거나 방향족 측쇄를 선호한다는 것을 알 수 있다. 반면, p62는 Val(V), Leu(L) 및 Gly(G)과 같은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산과 음하전된 측쇄를 갖는 Asp(D)과 같은 아미노산은 선호하지 않았다. 상기 결과는 p62가 Nt-Arg, Nt-Trp, Nt-Phe, 및 Nt-Tyr에 선택적으로 결합한다는 것을 의미한다.

< 실시예 3> p62 의 Nt - Arg 와 Nt - Phe 에 대한 결합력을 결정

p62의 Nt-Arg 및 Nt-Phe에 대한 결합 상수를 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, p62-D3-GST를 E.coli에서 발현하여 50% 순도로 정제하였다. 비아코어 분석 기법(surface plasmon resonance biosensors; Biacore)을 사용하여 바이오틴이 표지된 X-펩티드를 스트렙타비딘 코팅된 칩에 고정한 후, p62-D3-GST 단백질을 고정된 펩티드에 주입하였다.

그 결과, 도 6에 내타낸 바와 같이 p62-D3-GST는 R11 펩티드에는 강하게, F11에는 약하게, V11에는 결합하지 않았다(도 6). R11 및 F11의 Kd 값은 각각 44 nM 및 3.4 μM인 것으로 나타났다. 특히 Nt-Arg에 대한 결합력은 UBR box를 가지는 N-레코그닌의 결합력(Kd, 3.2 μM)에 비해 약 50 배 이상 높았다.상기 결과들은 p62가 신규한 약물타겟임을 나타낸다.

< 실시예 4> Nt - Arg 와 Nt - Phe 가 p62 의 ZZ 도메인에 직접 결합을 확인

Nt-Arg가 p62의 어느 부위에 결합하는지 결정하기위해 p62에서 일련의 결실 돌연변이(deletion mutants)(D1 내지 D8)을 구축한 후 이들의 R11 및 W11에의 결합여부를 상기 <실시예 1>의 동일한 방법으로 X-펩티드 풀다운 분석으로 확인하였다.

구체적으로, D1 내지 D4는 C-말단부위에서 연속적으로 결실된 돌연변이체이고, D5 내지 D8은 N-말단부위에서 연속적으로 결실된 돌연변이체이다. Nt-Arg와 Nt-Trp는 모두 ZZ 도메인을 포함하는 D2, D3, D4 및 D5에는 결합하였으나 ZZ 도메인이 없는 D1, D6 및 D7에는 결합하지 않았다(도 7a-b). Nt-Arg와 Nt-Trp에 결합하는 p62의 부위를 더 정확하게 결정하기 위해 p62 D3 C-말단에 결실 돌연변이체를 만들고, 이의 N-엔드룰 N-말단에의 결합여부를 X-펩티드 풀다운 분석으로 확인하였다(도 7c). 총 9개의 p62 결실 돌연변이체들 중 CD1 내지 CD6는 Nt-Arg와 Nt-Trp에 모두 결합하였다(도 7d). ZZ 도메인의 징크 핑거 모티브의 구조체인 두 개의 히스티딘 잔기가 없는 CD7 부터의 돌연변이체는 결합하지 않았다. 또한, N-말단의 최소 ZZ 도메인을 X-펩티드 풀다운 분석으로 결정하였다(도 7e). 전장 p62의 PB1 영역부터 시작하여 ZZ 도메인의 중간까지의 부위에서 6개의 N-말단 결실 돌연변이체를 만들었다. ND-1, ND-2, ND-3 및 ND-4는 Nt-Arg에 결합하였으나, ND-5 및 ND-6는 결합하지 못하였다(도 7f). ND-5는 UBR 박스에서 보존된 비정형적 이핵징크 핑거(binucleate Zn-finger)의 요소인 시스테인(cysteine) 잔기(C128) 및 아스파르트산(aspartic acid)(D129)가 없다. ZZ 도메인이 없는 돌연변이 p62는 Nt-Arg에 결합할 수 없었다(도 7g-h). ZZ 도메인(#83-175)만 잘라낸 조각도 Nt-Arg에 결합할 수 있으나, D129A 돌연변이는 결합할 수 없었다(도 7i-j). 상기 결과는 Nt-Arg와 Nt-Trp가 p62의 ZZ 도메인에 결합함을 나타낸다.

Nt-Arg와 Nt-Trp가 p62에 결합하는 것이 N-엔드룰을 따르는지 결정하기 위해 p62(1-440)의 D129, D142_145, D147_149, D151_154, H160_163 및 E177가 알라닌으로 치환된 6개의 점 돌연변이체(point mutants)를 구축하여 X-펩티드 풀다운 분석을 수행하였다. ZZ 도메인 내의 돌연변이체는 Nt-Arg 및 Nt-Trp에 결합하지 못하였다(도 7k). 상기 결과는 ZZ 및 UBR box가 공히 N-엔드룰에 의거해서 Nt-Arg 및 Nt-Trp와 결합한다는 것을 나타내며, 여기에서 Cys 및 His 잔기가 구조적 요소로 작용하며, 아스파르트산이 N-데그론 인식에 중요한 역할을 하는 것임을 나타낸다. 종합하면 상기 결과는 p62의 ZZ 도메인의 N-엔드룰 N-말단에의 결합 특성이 UBR 박스와 유사하며, 이는 ZZ 도메인과 UBR 박스가 구조적으로 유사함을 나타낸다. 또한 X-peptide가 p62와 결합할 때, Nt-Arg 나 Nt-Trp와 같은 N-말단 잔기가 N-리간드의 유효성분임을 나타낸다.

< 실시예 5> p62 의 ZZ 도메인은 UBR N- 레코그닌의 UBR box와 구조적 및 기능적 상동성 존재 확인

70개 잔기로 이루어진 UBR 박스는 UBR1 내지 UBR7로 명명된 N-엔드룰 E3 패밀리에 존재하는 기질인식 도메인이다. p62 ZZ 도메인의 일차 서열을 클러스탈W(ClustalW) 프로그램을 사용하여 다양한 생물 유래의 UBR E3 라이게이즈의 UBR 영역의 서열과 비교하였다.

그 결과, p62 ZZ 도메인이 UBR 박스와 구조적인 유사성을 보였다(도 7l). UBR 박스의 전형적인 C2H2 징크 핑거 배수(C2H2 zinc finger fold)가 p62-ZZ에서도 잘 보존된 반면, 비정형적인 UBR 박스의 이핵징크 핑거 배수(binucleate Zn-finger fold)는 p62-ZZ에서 부분적으로만 발견되었다. UBR 영역은 매우 잘 보존된 3개의 아스파르트산(D118, D150 및 D153)을 포함하며, 이는 기질의 N-말단의 불안정화 잔기에의 결합에 필수적이다. p62-ZZ 도메인 또한 D129, D147 및 D149를 포함하는 3개의 아스파르트산 잔기를 포함하고 있었다. ZZ 도메인의 D147만이 UBR 박스(D118)에서 보존이 되었지만, 음하전된(산성) 위의 3개의 아스파르트산 잔기가 UBR 박스의 경우와 마찬가지로 N-말단의 불안정화 잔기에의 결합에 필수적인 것으로 나타난다. 상기 결과는 p62가 양하전된(염기성) 측쇄와의 결합을 선호하는 풀다운 분석결과와 일치하는 것이다. C2H2 징크 핑거 구조 및 3 개의 아스파르트산 잔기이외에, 모든 서열에서 ZZ 영영내에 3 개의 동일한(적색) 잔기(Y140, D147 및 L150)와 ZZ 도메인바깥의 두 개의 동일한 잔기(G173 및 W184) 및 하나의 보존된(적색) 잔기(E177)이 발견되었다(도 2b).

< 실시예 6> N- 리간드인 Arg -Ala가 p62 의 자가 올리고머화 및 응집체 형성을 유도함을 확인

N-리간드인 Arg-Ala가 p62 ZZ 도메인에 결합했을 때 p62의 자가 올리고머화 및 응집체 형성을 유도하는지 조사하기 위하여, 비환원 SDS-PAGE를 이용하여 전장 p62가 발현되는 HEK293세포 융해물로 시험관내 올리고화 분석(in vitro oligomerization assays)을 수행하였다(도 8).

구체적으로, HEK293 세포에 p62-myc/his을 발현하는 플라스미드 DNA를 형질감염시켰다. 24시간 후에, 세포를 용해버퍼(50 mM 헤페스, pH 7.4, 0.15 M KCl, 0.1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제제 및 포스포테아제 억제제)로 용해시키고 냉각-해동 사이클을 반복하였다. 세포 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 배양한 후, 4℃, 13,000 x g에서 20분 동안 원심분리하였다. 단백질 농도를 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 결정하였다. p62 올리고머라이제이션 실험을 위하여, 상온에서 100 μM 베스타틴(Bestatin)의 존재하에서 디펩티드(최종농도 0.5 또는 1 M이 되도록 물에 녹임)가 있거나 없이 1 ㎍의 단백질을 배양하였다. 상기 샘플을 4% 리튬도데실설페이트(lithium dodecyl sulfate(LDS))를 포함하는 비환원 로딩버퍼와 혼합하였고, 95℃에서 10분 동안 가열하고 SDS 전기영동하였다. p62의 모노머, 올리고머, 응집체를 p62 및 myc 항체의 혼합물로 검출하였다. 상기 융해물에 다양한 디펩티드, 예를 들면, Arg-Ala, Lys-Ala 및 His-Ala(타입 1), Phe-Ala, Trp-Ala 및 Tyr-Ala(타입 2), 및 Ala-Arg 및 Ala-Phe(안정화)를 배양한 후, myc/p62 항체를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이 여러 가지 다이펩타이드 중에서 유일하게 Nt-Arg를 가지는 Arg-Ala만 특이적으로 p62 올리고화 및 응집체 형성을 유도함을 나타냈다(도 8a-ca). 상기 결과는 N-리간드인 Arg-Ala가 p62의 자가 올리고머화 및 응집체 형성을 유도함을 나타낸다.

또한, p62의 PB1 도메인이 p62의 응집체에 관여하는가를 조사하기 위하여, D69A 돌연변이체의 응집 능력을 평가한 결과, D69A 돌연변이체는 정상적으로 Nt-Arg에 결합하였으나, Arg-Ala는 D69A p62 돌연변이체의 응집체 형성을 유도할 수 없음을 나타냈다 (도 8e).

< 실시예 7> Arg -Ala가 p62 의 올리고머화를 유도할 때 ZZ 도메인이 필요함을 확인

Arg-Ala가 p62의 올리고머화를 유도할 때 ZZ 도메인과의 결합이 필요한지 알기위해, Arg-11 펩티드에 결합할 수 없는 p62 ZZ 돌연변이체를 이용하여 p62 올리고머라이제이션 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 8d에 나타낸 바와 같이 Arg-Ala의 존재하에서 야생형 p62은 효과적으로 올리고화/응집체를 형성한 반면에, ZZ 돌연변이체는 전혀 올리고화/응집체를 형성하지 않았다(도 8d). 이는 Arg-Ala가 ZZ 도메인에 결합함으로서 p62 올리고머가 유도됨을 나타낸다.

< 실시예 8> Arg -Ala가 p62 의 LC3 과의 결합 증대 확인

p62의 올리고화는 처음에 오토파지체(autophagosome) 개시 부위(initiation site)에 p62의 모집을 위해 요구되고, 이후에 LC3와 p62 올리고머 상호작용을 통해 자가소포체의 멤브린(membrane)으로 도입되는 것으로 알려져 있다(Itakura et al., 2011). p62와 LC3의 결합에 대한 Arg-Ala의 효과를 확인하기 위하여, ELISA 분석을 수행하였다(도 8f-h).

구체적으로, 전장의 p62 및 p62의 돌연변이체들을 p62 KO 마우스 배아 섬유모세포(mouse embryonic fibroblasts)에 감염시키고 24시간 후에 수확하여 용해버퍼에 용해시킨 후 4℃, 1,3000 rpm에서 원심분리하였다. 타입 1 및 타입 2 디펩티드가 배양된 GSH가 코팅된 플레이트(Priece, 15140)상에 고정되어 있는 GST가 태그된 LC3 재조합 단백질(Enzo lifescience, BML-UW1155)과 20 ㎍의 세포 용해물을 함께 상온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 결합된 p62는 상온에서 1시간 동안 항-p62 항체(SC-28359, santa cruz)로 배양하고 HRP가 부착된 2차 항체를 45분 동안 배양하여 검출하였다. PBS로 3회 세척하고, TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine) 기질(Priece, 34021)을 각각의 웰에 첨가하고 상온에서 10분동안 어두운 곳에서 색깔을 변화시켰다. TMB 정지용액인 2N H2SO4를 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 8f에 나타낸 바와 같이 여러 가지의 다이펩타이드 중 Arg-Ala가 유일하게 p62와 LC3의 결합을 강화시켰다(도 8f). 나아가, p62 ZZ 돌연변이체들, 예를 들면, D129A, C142/145A, D147/149A, C151/154A, H160/163A 및 ZZ 결실(ZZdel)와 PB1 돌연변이체, 예를 들면, D69A는 LC3의 결합에 작용하지 않았다(도 8g, h). 따라서 상기 결과로부터, p62-ZZ 도메인에 Arg-Ala가 결합하여 입체형태 변화를 유도하고 PB1 도메인을 경유하여 p62 응집체를 활성화한 후 LIR 도메인을 경유하여 p62-LC3 상호결합을 유도함을 나타냈다. 도 8i는 p62의 비활성화 형태와 활성화 형태를 쉽게 나타내기 위한 도이다.

< 실시예 9> N-말단 아르기닌화를 통해서 Nt - Arg 를 획득하는 소포체 단백질들의 발굴

p62 ZZ 도메인의 생리적인 N-리간드인 Nt-Arg가 ATE1 R-transferase에 의한 N-말단 아르기닌화를 통해 생성될 수 있기 때문에, 생물정보학을 이용하여 소포체 단백질들의 N-말단 서열을 조사하였다.

그 결과, N-말단 분해경로에 의하면 Nt-Asp와 Nt-Glu는 ATE1 R-transferase에 의한 아르기닌화의 기질로 작용할 수 있으며, 결과적으로 생성되는 Nt-Arg는 N-리간드로서 기능을 할 가능성이 있다(도10a). 정보생물학적인 기법을 이용하여 BiP, calreticulin (CRT), protein disulfide isomerase (PDI), GRP94, ERdJ5 등 다수의 소포체 샤프롱들이 Nt-Asp나 Nt-Glu를 가지며, 따라서 ATE1 R-transferase에 의한 아르기닌화를 통해서 아미노산 L-Arg를 획득할 수 있음을 규명하였다(도 9).

< 실시예 10> N-말단 아르기닌화된 BiP , CRT 및 PDI 의 subpopulation에 특이적인 항체 제작

상기 소포체들 중 N-말단 아르기닌화된 BiP (R-BiP), calreticulin (R-CRT), 및 protein disulfide isomearase (R-PDI)를 특이적으로 인식하는 항체 제작을 위해 N-말단 아르기닌화된 단백질들의 N-말단 부위에 해당하는 펩타이드들, 즉, REEEDKKEDVG (R-BiP), REPAVYFKEQ (R-CRT), 및 RDAPEEEDHVL (R-PDI)을 각각 합성하였다. 상기 펩타이드를 토끼에 접종해서 항체 혈청을 얻은뒤 IgG 크로마토그래피을 이용해 항체을 정제하였다. 상기 항체 군을 EEEDKKEDVGC, EPAVYFKEQ, 및 DAPEEEDHVL,즉 아르기닌화가 일어나지 않는 펩타이드를 리간드로 사용하는 크로마토 그래피를 통과시켜 불특정 항체을 제거하였다. 최종적으로 REEEDKKEDVGC (R-BiP), REPAVYFKEQ (R-CRT), 및 RDAPEEEDHVL (R-PDI) 즉 아르기닌화된 펩타이드를 리간드로 사용하는 크로마토그래피에 통과시켜 아르기닌화 특이적인 항체를 정제하였다(도 10b).

< 실시예 11> BiP , CRT 및 PDI 가 ATE1 에 의해 N-말단 아르기닌화가 매개됨을 규명

ATE1 R-transferase 동종효소 (isomerase)를 과발현시킨 뒤 상기 R-BiP 항체를 이용하여 R-BiP 형성이 유도됨을 확인하였다(도 10d). 또한 ATE1을 siRNA를 이용하여 녹다운 시켰을 때, R-BiP의 형성이 줄어듦을 확인하였다(도 10e). 나아가 Ub-X-BiP-flag(X= Glu 혹은 Val)를 발현시켜 아르기닌화를 검정하였다(도 11a). Ub-X-BiP-flag는 번역과 동시에 탈유비퀴틴 효소(deubiquitinating enzyme)에 의해 Ub와 X-BiP-flag로 분리가 된다. 상기 재조합 단백질을 이용하여 X-BiP의 Nt-Glu19가 아르기닌화되는 잔기임을 밝혔다(도 11a).

또다른 재조합 다백질, 즉 Ub-X-Bip-myc/his 구조체를 생성하였다(도 11b). 여기서 X는 Arg18, Glu19 또는 Val19를 가지며, 상기 구조체는 ER 신호를 포함하고 있지 않으므로 세포질에 남아있고 유비퀴틴 가수분해효소(ubiquitin hydrolases)에 의해 유비퀴틴이 제거된 후 N-말단 부위는 노출된다. 이 구조체를 이용하여 X-BiP이 Nt-Glu19에 아르기닌화됨을 다시 한번 확인하였다(도 11c). ATE1 녹아웃 세포에서는 R-BiP이 생성되지 않았다(도 11d). ER 스트레스를 일으키는 thapsigargin을 사용하여 R-BiP이 ER 스트레스 때문에 생기는 것이 아니라 ATE1 R-tranferase에 의해 일어나는 효소반응의 산물임을 밝혔다(도 11e). 또한 세포 분획기법을 이용하여 이렇게 생성된 R-BiP이 다량 세포질로 이동함을 밝혔다(도 11f). 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 단백질 분해 기법을 이용하여 세포질로 이동한 R-BiP이 소포체 내의 아르기닌화 되지않은 BiP에 비해서 상대적으로 분해가 되지 않는 것을 확인하였다(도 11g). 이는 R-BiP이 오토파지로 전달된다는 실험결과와 일치한다. 이러한 결과들은 BiP이 ATE1에 의해서 N-말단 Nt-Glu19에 아르기닌화를 거치면서, 그 산물인 R-BiP이 세포질로 이동함을 나타낸다.

CRT와 PDI도 ATE1에 의해 N-말단 아르기닌화 과정을 거치는지 조사한 결과, ATE1 동종효소를 과발현했을 때 R-CRT와 R-PDI가 생성됨을 확인하였다(도 11h). 상기 결과들은 BiP, CRT, PDI외에도 다수의 소포체 샤프롱이나 다른 단백질들이 ATE1에 의해서 매개되는 N-말단 아르기닌화에 의해서 수식화될 수 있다는 것을 나타낸다.

< 실시예 12> 세포질의 외부 DNA가 R- BiP 생성을 유발함을 규명

R-BiP 생성의 원인을 알아보기 위하여 소포체 단백질들의 N-말단 아르기닌화를 유발하는 스트레스 조건들을 다양한 방법으로 조사하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 R-BiP의 생성이 double stranded DNA (dsDNA)가 세포질에 유입이 되었을 때 특이적으로 유발됨을 확인하였다(도 12a, b). R-BiP외에도 R-CRT도 비슷하게 dsDNA가 세포질로 유입이 되었을 때 유도됨을 확인하였다(도 12b, c). 세포분획기법을 이용하여 dsDNA에 의해서 유도된 R-BiP이 세포질로 이동함을 관찰하였다(도 12d). DNA을 함유하는 병원체(바이러스나 박테리아)를 모방하는 poly(dA:dT)를 이용하여 R-BiP, R-CRT, P-PDI등이 침입 DNA에 대한 innate 면역반응의 일부로서 생성된다는 것을 확인하였다(도 12e-g). 또한 이때 오토파지 작용이 같이 활성화됨을 확인하였다(도 12b, f).

< 실시예 13> R- BiP 이 p62 와 더불어 오토파지의 오토파고좀에 전달됨을 확인

R-BiP이 p62와 동시에 오토파고좀에 전달되는지를 알아보기 위하여 면역염색법을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 R-BiP이 세포질로 이동한 뒤 반점(puncta)같은 세포 구조물에 모이는 것을 확인하였다(도 13a). 상기 R-BiP 반점은 p62 반점과 동시배치(colocalization) 했으며(도 13a, c), LC3와도 동시배치 함을 확인하였다(도 13b-d). 마우스 배아 심장에서도 BiP이 LC3 양성 autophagosome에 전달되는 것을 확인하였다(도 13e). siRNA를 이용하여 ATE1이나 BiP을 녹다운 시켰을 때, R-BiP가 오토파고좀으로 이동하지 못했다(도 13f-h). p62 녹아웃도 유사한 결과를 나타냈다(도 13f-h). 상기 결과들은 R-BiP이 세포질로 나와서 p62를 통해서 오토파고좀으로 전달되며 결국 리소좀에 의해 분해된다는 것을 나타낸다.

< 실시예 14> R- BiP 이 오토파고좀에 전달될 때 Nt - Arg 이 필요함을 확인

Ub-X-BiP-GFP 재조합 단백질(X= Arg, Glu, 혹은 Val)을 세포에 과발현시켜 X-BiP-GFP를 생성한 뒤(도 14a), 면역염색기법을 이용하여 자가포식으로 이동상황을 조사하였다. R-BiP은 오토파지 오토파고좀으로 전달되었다(도 14c). 반면 Val-BiP (Nt-Glu19가 Val으로 치환되어 아르기닌화의 기질이 될 수 없음)은 Nt-Arg가 없기 때문에 오토파지 오토파고좀으로 전달되지 못하였다(도 14c). R-BiP의 세포내 위치를 LC3 반점과 비교하였을 때도 비슷한 결과를 얻었다(도 14d). BiP 단백질의 다른 부위가 오토파지 타겟팅에 영향을 줄 수 있기 때문에, BiP 단백질의 대부분을 제거하고 잔기서열 19-124만 남긴 Ub-X-BiP^Δ(도 14a)을 과발현한 다음 X-BiP^Δ의 세포내 위치를 면역염색기법을 이용하여 조사하였다(도 14e). R-BiP^Δ는 +/+ 와 p62-/- 세포에서 공통적으로 세포질 반점을 형성하고 또한 오토파지 오토파고좀을 이동하였다(도 14e). 반면 E-BiP^Δ는 +/+ 세포에서는 아르기닌화 될수 있기 때문에 정상적으로 오토파지 오포파고좀으로 이동한 반면, p62-/- 세포에서는 그러한 활성을 보이지 않았다(도 14e). 또한 V-BiP^Δ는 +/+ 및 p62-/- 세포 양쪽다 오토파고좀으로 이동하지 않았다(도 14e). X-BiP과 LC3의 세포내 위치를 면역염색기법으로 조사해 보았을 때도 비슷한 결과를 얻었다(도 14f). 상기 결과들은 BiP이나 다른 소포체 단백질들이 아르기닌화되어 세포질로 나왔을 때 (변성 단백질이나 다른 기질들과 결합한 뒤) 번역후 수식화로 생긴 Nt-Arg가 N-리간드로 작용하여 p62 ZZ 도메인에 결합한다는 것을 나타낸다.

< 실시예 15> R- BiP 의 Nt - Arg 가 p62 ZZ 도메인에 직접 결합함을 확인

R-BiP의 Nt-Arg가 p62 ZZ 도메인에 결합하는지 조사하기 위해 X-펩타이드 풀다운 분석을 실행하였다(도 15a, b).

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 R-BiP 펩타이드는 세포추출액으로부터 p62를 풀다운 시켰지만, E-BiP이나 V-BiP 펩타이드는 그렇지 못하였다(도 15c, d). R-BiP의 Nt-Arg이 p62의 어느 부위에 결합하는지 조사하기 위해 p62을 작은 조각들로 나누었다(도 15e). 이 p62 조각들과 R-BiP peptide을 가지고 풀다운 실험을 실행한 결과, R-BiP의 Nt-Arg이 p62 ZZ 도메인에 결합함을 나타내었다(도 15f).

R-BiP이 p62 ZZ 도메인에 결합하는 것을 확실히 알기위해서, p62 ZZ 도메인만 잘라내어서 p62-ZZ83-175-GST 및 p62-ZZ(D129A)83-175 라 명명하고 GST 풀다운 분석을 실행하였다(도 15g). ZZ83-175 는 Arg18-Bip19-654 를 풀다운 하였으나 Val19-Bip19-654 를 풀다운 하지 못했고, ZZ 돌연변이체인 ZZ(D129A)83-175는 Arg-Bip18-654 또는 Val-Bip19-654 모두를 풀다운 하지 못했다. 따라서, p62의 ZZ 도메인은 N-엔드룰 의존적으로 아르기닌화된 Bip과 p62의 상호작용에 필요하다(도 15h).

또한, p62-ZZ83-175-RFP 및 유비퀴틴-X-Bip19-124-GFP를 MEF세포에 동시발현시켰을 때 Arg18-Bip19-124는 반점형태(puncta formation)를 나타내는 p62-ZZ83-175-RFP와 동시이동 형태를 나타내었지만, Val19-Bip19-124-GFP 와 p62-ZZ83-175-RFP 는 반점형태 및 동시이동을 하지 못했다(도 15i).

< 실시예 16> R- BiP 이 p62 의존적으로 오토파지 작용에 의해 분해됨을 확인

R-BiP이 p62를 통하여 오토파지에 의해서 분해되는지 결정하기 위해 Ub-X-BiP^Δ-GST를 제작하여 +/+ 및 p62-/- 세포에서 과발현하였다(도 16a).

그 결과, 도 16에서 나타낸 바와 같이 R-BiP은 V-BiP에 비해서 +/+ 세포에서 잘 분해가 되는 반면, p62-/- 세포에서는 분해가 되지 않고 누적이 되었다(도 16a, b). 반면 V-BiP은 +/+ 및 p62-/- 세포 양쪽에서 분해되지 않고 누적되었다(도 16a, b). 오토파지 저해제인 Hydroxychloroquine을 처리했을 때, R-BiP이 분해가 되지 않고 누적되었다(도 16a, b). 또한 R-BiP은 오토파지 과정이 결여된 ATG5-/- 세포에서 분해가 되지 않고 누적되었다(도 16c). Ub-R-BiP-myc/his를 가지고 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 단백질분해 정량 분석을 실행하였을 때, R-BiP이 ATG5-/- 세포에서 현저히 안정화 됨을 확인하였다(도 16d, e). 상기 결과는 R-BiP이 p62에 의해 리소좀에 전달되어 분해된다는 것을 나타낸다.

< 실시예 17> R- BiP 이 세포질의 유비퀴틴화된 단백질에 의해 유도됨을 확인

R-BiP이 유도되는 스트레스의 종류를 알아내기 위해 여러 가지 화학물들을 세포에 처리한 다음 R-BiP의 형성을 면역블롯 기법을 사용하여 조사하였다.

그 결과, 프로테아좀 억제제가 공통적으로 R-BiP 형성을 유도함을 알수 있었다(도 17c). R-BiP 생성이 유도될 때 유비퀴틴이 결합된 세포내 단백질 군들과 같이 누적이 됨을 확인하였으며(도 17c), 이러한 경향은 poly(dA:dT)를 처리하였을 때도 공통적으로 관찰되었다(도 17a). 유비퀴틴화 된 세포내 단백질들의 일부는 반점형태로 p62 보다 (p62가 끌고온 단백질들이 오토파고좀에 전달되기 전에 일시적으로 응고체 형태로 존재하는 구조체)에 전달되었고, 여기에서 R-BiP 및 p62와 동시위치 함을 확인하였다(도 17b). 이러한 결과들은 세포질에 누적된 변성 단백질들이 유비퀴틴화된 뒤 오토파지로 전달되어야 할 때 소포체에 신호를 주어서 소포체내부에 존재하는 샤프롱들의 N-말단 아르기닌화 및 세포질로의 이동을 촉진하며, 세포질에 나온 R-BiP은 유비퀴틴화된 단백질들과 같이 p62 보디에 이동한다는 것을 나타낸다.

< 실시예 18> R- BiP 이 세포질 변성 단백질들과 결합하며 이들을 오토파지에 전달한다는 것을 확인

Hsp90의 저해제인 겔데나마이신(geldenamycin)을 처리하여 세포내 변성단백질의 형성을 촉진시켰다.

그 결과, R-BiP의 형성이 유도됨을 확인하였고(도 17f), 스스로 폴딩이 풀려서 변성이 되는 모델 기질인 YFP-CL1을 과발현 시켰을 때, R-BiP이 직접 결합함을 확인하였다(도 17g). 또한 면역 형광염색법을 이용하여 YFP-CL1이 오토파지 수포(vacuole)에 전달되고, 이 구조물속에서 R-BiP 및 p62와 동시위치함을 확인하였다(도 17h, i). 이러한 결과들은 R-BiP이 세포질에 누적되는 변성단백질과 결합하여 p62와 더불어 오토파지 오토타고좀에 이동함을 나타낸다.

이러한 결과들을 종합할 때, 도 1에 설명한 것처럼, 세포질에 변성 단백질과 그 응고체가 누적이 되면 소포체에 신호를 보내 소포체 내부에 있던 BiP, CRT, PDI등 다양한 샤프롱들이 N-말단 아르기닌화에 의해 Nt-Arg 리간드를 장착하여 세포질로 이동한다. 이후 이들은 변성 단백질과 결합하는 한편 p62 ZZ 도메인에 Nt-Arg 리간드를 통해서 결합한다. 상기 결합으로 인하여 p62는 폐쇠된 구조에서 열린 구조로 변함에 따라 PB1 도메인 (올리고머화를 매게)이 노출되어 자가 올리고머화를 거치면서 변성 단백질, R-BiP과 더불어 p62 보디를 형성한다. 또한 LC3 결합 도메인도 노출이 되어 오토파고좀의 막에 돌출되어있는 LC3와의 결합을 촉진하게 한다. 결과적으로 변성단백질-R-BiP-p62는 복합응고체의 형태로 오토파고좀에 전달되고 이후 리소좀의 분해효소에 의해서 분해된다.

< 실험예 1> 저질량 화합물인 p62 - ZZ1 이 p62 의 올리고머화 및 LC3와의 결합을 증대시킴을 확인

Arg-Ala외에 p62 ZZ 도메인의 리간드를 더 발굴하기 위한 노력으로 N-엔드룰 리간드인 Nt-Trp의 구조적인 유사성을 가지는 소화합물인 2-((3,4-bis(benzyloxy)benzyl)amino)ethan-1-ol hydrochloride (ZZ-L1이라 명명; 화학식 5) 및 1-(3,4-bis(benzyloxy)phenoxy)-3-(isopropylamino)-2-propanol (ZZ-L2라 명명; 화확식 6)이 p62의 활성 특히 올리고머화 및 오토파지의 활성을 증대시킴을 발견하였다. 특히 ZZ-L2는 NCI314953로 알려진 물질이다. 이들 저질량 화합물들은 Arg-Ala 보다는 Phe-Ala나 Trp-Ala와 구조적인 유사성이 있으며 따라서 ZZ 도메인의 type-2 결합 서브도메인(subdomain)에 결합하는 것으로 생각된다.

이들 저질량 화합물들이 p62 ZZ 도메인에 결합하였을 때 Arg-Ala처럼 p62의 올리고머화와 활성증대를 유도하는지 조사였다.

구체적으로, 시험관내 올리고머화 분석(in vitro oligomerization assay)을 사용하여 p62 응집체 정도를 농도 의존적(0, 10, 100, 1000 μM)으로 측정하였다.

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 Arg-Ala와 동일하게, ZZ-L1는 농도 의존적으로 p62 응집체를 유도함을 확인하였다(도 18a, b). 또한 Arg-Ala을 이용하여 p62의 LC3와의 결합을 증대시킨 실험과 비슷한 방법으로 ZZ-L1이 p62을 활성화 시키는지 조사한 결과, ZZ-L1가 농도의존적(0, 10, 25, 100, 500, 1000 μM)으로 LC3와의 결합을 증대시킴을 확인하였다(도 18c). 이로 미루어 ZZ-L1이 p62 ZZ 도메인에 결합하여 Arg-Ala와 비슷한 패턴으로 p62의 구조적 활성화를 유도함을 알 수 있다.

또한, ZZ-L1와 ZZ-L2의 p62 반점형성(puncta formation)을 유도하는지를 확인하기 위하여, 면역형광분석법(immunofluorescence confocal microscopy)을 이용하여 관찰하였다 (도 18d-g). 구체적으로, 커버슬립 상의 HeLa 세포에 다른 농도(0, 1, 2.5 , 5, 및 10 μM)의 XIE ZZ 화합물을 12시간 동안 처리하거나(도 18f, g) 또는 다른 시간(0, 1, 3, 6, 및 12시간) 동안 10μM의 XIE ZZ 화합물을 처리하였다(도 18e, e). 그 결과, ZZ-L1및 ZZ-L2가 HeLa 세포내에서 12 시간 동안 농도 의존적(0, 1, 5, 10 μM)으로 또는 10 μM에서 시간 의존적(1, 3, 6, 12 h)으로 p62 반점형성(puncta formation)을 유도함을 알 수 있었다(도 18d-g).

< 실험예 2> ZZ - L1 과 ZZ - L2 가 세포내 오토파고좀 형성을 증대시킴을 확인

ZZ-L1과 ZZ-L2의 오토파지에 대한 영향을 조사하기 위하여 웨스턴블랏을 실행하였다.

구체적으로, ZZ-L1 및 ZZ-L2는 농도 의존적(0, 1, 5, 10 μM) 및 시간 의존적(1, 3, 6, 12 h)으로 LC3양을 증가시켰으며 LC3-I (비활성 형태)의 LC3-II (활성 형태)로의 전환도 증진시켰다(도 19b). 면역 형광염색법을 이용하여 상기 ZZ 리간드가 HeLa 세포에서 p62 오토파지 반점 외에도 LC3 오토파지 반점의 형성을 촉진한다는 것을 밝혔다(도 19a). 이는 상기 ZZ 리간드들이 오토파지 활성제의 기능이 있음을 나타낸다.

화합물로 유도된 LC3 단백질의 증가와 LC3-II의 형성이 p62에 의한 것인지를 조사하였다. 6-웰 플레이트에 있는 HeLa 세포(1x106/well)에 RNAi Max 시약(Invitrogen)을 사용하여 40nM의 p62 siRNA를 처리하여 p62를 녹다운 시켰으며, 이때 siRNA 대조군도 병행 처리하였다. 이후 DMSO 또는 5 mM ZZ 화합물을 3시간 또는 6시간 배양하였다.

그 결과, LC3의 증가 및 LC3-II의 형성은 si-대조군(si-control)을 형질감염시킨 ZZ 화합물 ZZ-L1 및 ZZ-L2에 의해 유도되었으나 상기 효과는 p62 넉다운(knock down)에 의해 완전히 저해되었다(도 19c). 또한 +/+와 p62-/- 세포를 이용한 비슷한 실험에서도 ZZ-L1 (5 mM)이 p62-/- 세포에서 오토파지 활성제로 작용하지 못함을 나타내었다(도 19d). 상기 결과는 ZZ 화합물이 p62의 ZZ 도메인에 결합하는 Arg-Ala에 의해 유도되는 효과를 흉내내어 p62의 PB1 도메인을 경유한 p62의 응집체를 유도하고 나아가 오토파고좀 형성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

< 실험예 3> ZZ 리간드가 오토파지 흐름(flux)를 증가시킴을 확인

ZZ 리간드를 처리했을 때 LC3 합성과 LC3-II 형태가 증가한 것이 오토파지 흐름(flux)의 상류(핵심 인자들의 합성, 전사 등)가 활성화 되어서 일어날 수도 있지만 하류(리소좀의 오토파고좀과의 융합이나 리소좀내의 분해과정)가 막혀서 일어날 가능성도 있다. ZZ 리간드를 처리했을 때 오토파지 흐름이 정상적인지 확인하기 위해, 상기 ZZ 리간드를 처리한 세포에 오토파지 억제제를 같이 처리한 뒤, 면역블롯을 이용하여 LC3의 양을 조사하였다. 구체적으로, 리소좀에서 분해작용을 방지하는 억제제인 NH4Cl(Sigma, A9434), 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1)(Sigma, B1793) 및 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine(HCQ))(Sigma, H0915)을 사용하여 오토파지 역동분석(autophagy flux assay)을 하였다(도 19e). XIE ZZ 화합물을 먼저 3시간 처리한 후에 자기포식체 억제제를 넣고 3시간 더 배양시킨 후, 세포 추출물을 얻은 후 웨스턴 분석을 실시하여 LC3-II 밴드 강도를 이미지J(imageJ)로 측정해 LC3-II 형성의 증가정도를 GAPDH로 표준화해준 후 계산하였다.

그 결과, XIE ZZ 화합물을 처리한 후에도 하이드록시클로로퀸(HCQ)에 의한 오토파지 억제는 LC3-II의 축적을 포함한 오토파지 역동을 2배 이상 증가시켰다(도 19e). 상기 결과는 ZZ 리간드가 LC3 등 실제로 오토파지의 핵심 구성요소의 합성을 증가시켜 오토파고좀 형성을 촉진시킬뿐더러, 이렇게 형성된 오토파고좀이 정상적으로 리소좀과 융합을 통하여 내부로 전달된 기질(p62, R-BiP, 변성단백질 등)을 분해시킨다는 것을 나타낸다(도 19g).

< 실험예 4> ZZ 리간드에 의해 형성된 오토파고좀이 리소좀과 융합함을 확인

ZZ 리간드에 의해서 형성된 오토파고좀이 리소좀에 전달되는지 확인하기 위해서, 산성에 민감한 GFP와 민감하지 않은 RFP가 조합된 RFP-GFP-LC3가 안정적으로 형질전환된 HeLa 세포를 사용하여 상기에서 사용한 동일한 방법으로 또 다른 오토파지 역동분석을 수행하였다.

그 결과, ZZ-L1 과 ZZ-L2가 RFP+GFP+ 인 오토파고좀(중성 pH)의 형성을 촉진시키는 것을 확인하는 동시에, 일부 RFP+ 반점에서는 GFP+ 신호가 사라진 것을 확인하였다(도 19f). 이러한 RFP+GFP- 반점은 RFP+GFP+ 오토파고좀이 리소좀과 융합해서 자가소포체(autolysosome)(산성 pH)을 형성할 때, 산성 환경 하에서 산성에 민감한 GFP 형광이 사라졌기 때문이다. 이러한 결과는 ZZ 리간드에 의해서 형성된 오토파고좀이 정상적으로 리소좀에 전달되어 분해가 됨을 나타낸다(도 19g).

ZZ 리간드에 의한 오토파지 흐름의 변화를 측정하는 또 다른 방법으로 p62의 세포내 농도의 변화를 직접 측정하였다. HeLa 세포에 ZZ-L1을 처리하고 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 단백질분해분석기법을 수행한 결과, ZZ-L1이 p62의 분해를 촉진시킨다는 것을 나타내었다(도 20a). 상기 결과들은 ZZ 리간드와 결합한 p62가 오토파지 활성제로 작용한다는 것을 의미한다.

< 실험예 5> ZZ 리간드와 결합한 p62 가 mTOR 와 관계없이 오토파지를 활성화 시킴을 확인

오토파지 활성제로 대표적으로 알려진 화합물이 라파미이신(rapamycin)이다. 라파마이신은 mTOR(mammalian Target Of Rapamycin)의 저해제로서[ref], mTOR가 억제되면서 오토파지의 핵심 조절인자(ULK, Beclin 등)이 활성화 되면서 LC3의 합성, LC3-II 형태로의 전환 등을 통해서 오토파고좀의 생성이 증대된다(도 20d). Rapamycin의 오토파지 활성제로서의 효능은 치료제로서 가치가 높으나, mTOR를 통한 광범위한 생물학적인 영향 등 부작용 때문에 mTOR를 거치지 않는 오토파지 활성제의 개발이 시급하다.

ZZ 리간드와 rapamycin의 오토파지 활성제로서의 효능과 기작을 비교하기 위해 HeLa 세포를 농도 별로, 또는 시간 별로 처리를 한 뒤 LC3의 생성과 LC3-II의 전환을 비교하였다.

그 결과, 전체적으로 ZZ 리간드가 rapamycin에 비해서 효능이 비슷하거나 경우에 따라서는 더 우수한 것으로 나타났다(도 20b, c).

ZZ 리간드가 mTOR를 경유해서 오토파지를 활성화 하는지 조사하기 위해, HeLa 세포에 ZZ 리간드나 rapamycin을 처리한 뒤, mTOR에 의해서 조절받는 p70S6K의 인산화를 조사하였다(도 20d). 예상대로 rapamycin은 mTOR를 억제하여 p70S6K의 인산화가 억제하였지만, ZZ 리간드는 70S6K의 인산화를 억제하지 않았다(도 20e). 상기 결과는 ZZ 리간드는 기존의 rapamycin과는 다르게 mTOR를 경유하지 않고 오토파지를 활성화함을 나타내며, 따라서 ZZ 리간드는 지금까지 알려지지 않은 신규성 오토파지 활성제이다.

< 실험예 6> ZZ 리간드가 세포내 유비퀴틴에 의해서 타겟팅된 단백질들을 오 토파지로 유도함을 확인

세포내 변성 단백질들은 일차적으로 유비퀴틴에 의해서 타겟팅된 다음 프로테아좀에 의해서 분해된다. 변성 단백질이 응고되던지 (예: 돌연변이 헌팅틴 단백질) 프로테아좀 활성이 저하되어 있던지, 프로테아좀으로 들어갈 수 없는 상황 하에서는 오토파지에 의해서 수거된 다음 리소좀에 의해서 분해된다. ZZ 리간드가 오토파지 흐름을 증대시킨다는 결과를 바탕으로, ZZ 리간드가 유비퀴틴화된 세포내 단백질들의 오토파지로의 이동을 증진하는지를 면역형광염색법으로 조사하였다.

그 결과, 5 mM ZZ-L1이 유비퀴틴화된 단백질들을 오토파지 수포(vacuole)로 유도함을 확인하였다(도 20f). 또한 오토파지 저해제 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)을 처리하였을 때 유비퀴틴화 된 단백질들이 오토파지 수포에 누적이 되는 것을 확인하였다(도 20f). 상기 결과들은 ZZ 리간드가 세포내 변성 단백질들을 오토파지로 모으는 것을 증진시킨다는 것을 나타낸다.

< 실험예 7> ZZ 리간드가 돌연변이 헌팅틴 단백질 응고체를 제거함을 확인

헌팅턴 병(Huntington’s disease)은 헌팅틴 단백질의 CAG 코돈이 과다하게 반복(~36회 이상)되어 쉽게 변성(misfolded)될 뿐더러 응고체(aggregates)로 빨리 변환이 되는 성질 때문에 유비퀴틴-프로테아좀 시스템으로 분해가 되지 않는다(도 21a). 라파마이신을 가지고 오토파지를 활성화 시킴으로서 제거하는 기술이 개발되었지만 라파마이신이 mTOR를 통해 다양한 생물학적인 경로에 영향을 주는 활성 때문에 치료제로 사용하기 어렵다. ZZ 리간드가 mTOR를 경유하지 않고 오토파지를 활성화시키는 점을 고려하여 헌팅틴 단백질 응고체를 제거할 수 있는지를 조사하였다.

구체적으로, 야생형 헌턴틴 (HDQ25-GFP)와 돌연변이 헌팅틴(HDQ103-GFP; CAG가 103번 반복)을 HeLa 세포에 발현을 시켜 면연형광염색법으로 관찰하였을 때, HDQ25-GFP는 세포전체에 퍼져있는 반면, HDQ103-GFP는 단백질 응고체 형태로 모여 있는 것으로 관찰되었다(도 21c). 상기 헌팅틴 단백질들을 과발현하는 세포에 10 mM ZZ-L1이나 1 mM 라파마이신을 처리하고 돗블랏기법(dot blot assay)을 이용하여 세포내 잔여 헌팅틴 단백질을 조사한 결과, ZZ-1이 더 효과적으로 돌연변이 헌팅틴 단백질 응고체를 제거함을 나타내었다(도 21b). 비슷한 실험 세팅에서 세포를 0.5% Triton X-100에서 녹는 분획(soluble fraction)가 안녹는 분획(insoluble fraction; 응고체 포함)로 나눈뒤 면역블롯을 시행한 결과, ZZ-L1을 처리한 응고체 분획에서 효과적으로 헌팅틴 변성단백질을 제거함을 확인하였다(도 21d). 라파마이신도 비슷한 효과를 나타내었다(도 21d). HeLa 세포를 ZZ-L1과 ZZ-L2를 라파마이신과 비교한 또 다름 실험에서도 비슷한 겨과를 얻었다(도 21e).

ZZ 리간드가 헌팅틴 응고체를 제거하는 것이 오토파지 활성화를 통해서 이루어지는지 조사하기 위해, +/+ 및 ATG5-/- (ATG5 없이는 오토파고좀이 형성이 안됨) 세포에 10 mM ZZ 리간드와 1 mM 라파마이신을 처리한 뒤 면역블롯을 수행하였다. +/+ 세포에서는 ZZ 리간드가 효과적으로 헌팅틴 응고체를 제거하는 반면, ATG5-/- 세포에서는 효과를 보이지 않았다(도 21f). 이는 ZZ 리간드가 오토파지를 활성화 함으로서 헌팅틴 단백질 응고체를 제거함을 나타낸다.

ZZ 리간드가 헌팅틴 응고체를 제거하는 기작을 조사하기 위해 HDQ103-GFP 단백질 응고체를 과발현하는 HeLa 세포에 10 mM ZZ 리간드를 처리한 뒤 면역형광염색기법을 실행하였다. ZZ-L1을 처리하지 않은 세포에서는 HDQ103-GFP가 인클루전바디(inclusion body)를 형성하였는데, 이 구조물에는 p62 및 R-BiP이 동시위치 하였다(도 22a, b). 또한 ZZ-L1을 처리한 세포에서는, 효과적으로 헌팅틴 인클루전바디가 축소되거나 없어진 것을 알 수 있었다(도 22a-c). 상기 결과들은 종합할 때, ZZ 리간드가 오토파지를 활성화시켜 변성 단백질 응고체를 효과적으로 제거할 수 있다는 것을 알 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Seoul National University <120> Autophagy stimulation using p62 ZZ domain binding compounds or arginylated BiP for the prevention or treatment of neurodegenerative disease <130> 2014P-02-049 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala 1 5 10 15 Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu 20 25 30 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu 35 40 45 Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln 50 55 60 Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp 65 70 75 80 Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg 85 90 95 Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Glu Cys Arg Arg Asp His Arg Pro Pro 100 105 110 Cys Ala Gln Glu Ala Pro Arg Asn Met Val His Pro Asn Val Ile Cys 115 120 125 Asp Gly Cys Asn Gly Pro Val Val Gly Thr Arg Tyr Lys Cys Ser Val 130 135 140 Cys Pro Asp Tyr Asp Leu Cys Ser Val Cys Glu Gly Lys Gly Leu His 145 150 155 160 Arg Gly His Thr Lys Leu Ala Phe Pro Ser Pro Phe Gly His Leu Ser 165 170 175 Glu Gly Phe Ser His Ser Arg Trp Leu Arg Lys Val Lys His Gly His 180 185 190 Phe Gly Trp Pro Gly Trp Glu Met Gly Pro Pro Gly Asn Trp Ser Pro 195 200 205 Arg Pro Pro Arg Ala Gly Glu Ala Arg Pro Gly Pro Thr Ala Glu Ser 210 215 220 Ala Ser Gly Pro Ser Glu Asp Pro Ser Val Asn Phe Leu Lys Asn Val 225 230 235 240 Gly Glu Ser Val Ala Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ile Glu Val Asp 245 250 255 Ile Asp Val Glu His Gly Gly Lys Arg Ser Arg Leu Thr Pro Val Ser 260 265 270 Pro Glu Ser Ser Ser Thr Glu Glu Lys Ser Ser Ser Gln Pro Ser Ser 275 280 285 Cys Cys Ser Asp Pro Ser Lys Pro Gly Gly Asn Val Glu Gly Ala Thr 290 295 300 Gln Ser Leu Ala Glu Gln Met Arg Lys Ile Ala Leu Glu Ser Glu Gly 305 310 315 320 Arg Pro Glu Glu Gln Met Glu Ser Asp Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp 325 330 335 Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp Pro Ser Thr Gly Glu 340 345 350 Leu Gln Ser Leu Gln Met Pro Glu Ser Glu Gly Pro Ser Ser Leu Asp 355 360 365 Pro Ser Gln Glu Gly Pro Thr Gly Leu Lys Glu Ala Ala Leu Tyr Pro 370 375 380 His Leu Pro Pro Glu Ala Asp Pro Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Gln 385 390 395 400 Met Leu Ser Met Gly Phe Ser Asp Glu Gly Gly Trp Leu Thr Arg Leu 405 410 415 Leu Gln Thr Lys Asn Tyr Asp Ile Gly Ala Ala Leu Asp Thr Ile Gln 420 425 430 Tyr Ser Lys His Pro Pro Pro Leu 435 440 <210> 2 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arg Ala peptide <400> 2 Arg Ala 1 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phe Ala peptide <400> 3 Phe Ala 1 <210> 4 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp Ala peptide <400> 4 Trp Ala 1 <210> 5 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr Ala peptide <400> 5 Tyr Ala 1 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R-11 peptide <400> 6 Arg Ile Phe Ser Thr Ile Glu Gly Arg Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W-11 peptide <400> 7 Trp Ile Phe Ser Thr Ile Glu Gly Arg Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 636 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Bip peptide <400> 8 Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly Ile Asp 1 5 10 15 Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly Arg Val 20 25 30 Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser Tyr Val 35 40 45 Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn 50 55 60 Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu 65 70 75 80 Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile Lys Phe 85 90 95 Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile Gln Val 100 105 110 Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu Ile Ser 115 120 125 Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Leu Gly 130 135 140 Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp 145 150 155 160 Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu Asn 165 170 175 Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly 180 185 190 Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly 195 200 205 Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly Val Phe 210 215 220 Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe 225 230 235 240 Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys Lys Thr 245 250 255 Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu Arg Arg 260 265 270 Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln Ala Arg 275 280 285 Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr Leu 290 295 300 Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Ser Thr 305 310 315 320 Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys Lys Ser 325 330 335 Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys 340 345 350 Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser Arg 355 360 365 Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala 370 375 380 Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Leu Asp 385 390 395 400 Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met Thr 405 410 415 Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Ile 420 425 430 Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys Val Tyr 435 440 445 Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr Phe 450 455 460 Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu 465 470 475 480 Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr Ala Glu 485 490 495 Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Gln 500 505 510 Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp Ala Glu 515 520 525 Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp Thr Arg 530 535 540 Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile Gly Asp 545 550 555 560 Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu Thr Met 565 570 575 Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His Gln Asp 580 585 590 Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu Glu Ile 595 600 605 Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro Pro Pro 610 615 620 Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu 625 630 635 <210> 9 <211> 637 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R-BipD peptide <400> 9 Arg Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly Ile 1 5 10 15 Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly Arg 20 25 30 Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser Tyr 35 40 45 Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys 50 55 60 Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg 65 70 75 80 Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile Lys 85 90 95 Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile Gln 100 105 110 Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu Ile 115 120 125 Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Leu 130 135 140 Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn 145 150 155 160 Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu 165 170 175 Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr 180 185 190 Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp Leu 195 200 205 Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly Val 210 215 220 Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp 225 230 235 240 Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys Lys 245 250 255 Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu Arg 260 265 270 Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln Ala 275 280 285 Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr 290 295 300 Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Ser 305 310 315 320 Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys Lys 325 330 335 Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro 340 345 350 Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser 355 360 365 Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln 370 375 380 Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Leu 385 390 395 400 Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met 405 410 415 Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln 420 425 430 Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys Val 435 440 445 Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr 450 455 460 Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile 465 470 475 480 Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr Ala 485 490 495 Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp 500 505 510 Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp Ala 515 520 525 Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp Thr 530 535 540 Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile Gly 545 550 555 560 Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu Thr 565 570 575 Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His Gln 580 585 590 Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu Glu 595 600 605 Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro Pro 610 615 620 Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu 625 630 635

Claims

p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드(ligands)를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 p62 단백질을 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 ZZ 도메인은 서열번호 1로 기재되는 p62 단백질의 아미노산 서열의 128 내지 163 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리간드는 Arg-Ala(서열번호 2), Phe-Ala(서열번호 3), Trp-Ala(서열번호 4), Tyr-Ala(서열번호 5), R-11(서열번호 6), W-11(서열번호 7), R-BiP(서열번호 8), 및 R-BiPD(서열번호 9)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 리간드의 유효성분은 N-말단 잔기로서, Nt-Arg(화학식 1), Nt-Phe(화학식 2), Nt-Trp(화학식 3), 및 Nt-Tyr(화학식 4)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 6항에 있어서, 상기 리간드는 하기의 p62-ZZ1(화학식 5), 또는 p62-ZZ2(화학식 6; NCI314953)인 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 5]

[화학식 6]
제 1항에 있어서, 상기 신경변성 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 헌팅턴병 (Huntington's disease; HD), 프리온병/인간 광우병(Prion disease), 다발성경화증(multiple sclerosis; MS), 라임병(Lyme borreliosis), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia), 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD), 치매(dementia), 간질(epilepsy), 뇌졸중(stroke), 피크병(Picks disease) 및 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS; 루게릭병) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리간드는 p62 ZZ 도메인에 결합하여, p62 단백질의 PB1 도메인 및 LIR 도메인을 활성화시켜 p62의 올리고화 및 응집체를 유도하는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리간드는 p62 응집체 유도를 통한 자가포식체(autophagosome)를 형성시키는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드(ligand)를 유효성분으로 함유하는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
제10항에 있어서, 상기 리간드는 Arg-Ala(서열번호 2), Phe-Ala(서열번호 3), Trp-Ala(서열번호 4), Tyr-Ala(서열번호 5), R-11(서열번호 6), W-11(서열번호 7), R-BiP(서열번호 8), 및 R-BiPD(서열번호 9) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
제11항에 있어서, 상기 리간드의 유효성분은 N-말단 잔기로서, Nt-Arg(화학식 1), Nt-Phe(화학식 2), Nt-Trp(화학식 3), 및 Nt-Tyr(화학식 4)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
제11항에 있어서 상기 리간드는 하기의 p62-ZZ1(화학식 5), 또는 p62-ZZ2(화학식 6; NCI314953)인 것을 특징으로 하는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품:
[화학식 5]

[화학식 6]
제 11항에 있어서, 상기 신경변성 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 헌팅턴병 (Huntington's disease; HD), 프리온병/인간 광우병(Prion disease), 다발성경화증(multiple sclerosis; MS), 라임병(Lyme borreliosis), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia), 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD), 치매(dementia), 간질(epilepsy), 뇌졸중(stroke), 피크병(Picks disease) 및 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS; 루게릭병)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경변성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 리간드를 p62 단백질의 ZZ 도메인에 결합시켜 p62의 올리고머화를 유도하고 p62의 LC3와의 결합을 증대시키는 과정을 포함하는 p62 활성을 증대시키는 방법.
p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 p62의 오토파고좀(autophagosome)으로의 전달을 증대시키는 방법.
p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 오토파지를 활성화하는 방법.
p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 변성 단백질 응고체가 오토파고좀에 전달되는 과정을 활성화하는 방법.
p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 리간드를 p62 ZZ 도메인에 결합시켜 오토파지를 활성화함으로서 리소좀(lysosome)에 의한 변성 단백질 응고체 분해를 증대시키는 방법.