JP6518835B2 - 合成リガンドまたはアルギニル化ｂｉｐのｐ６２ ｚｚドメインへの結合を介した、オートファジー活性による神経変性疾患の抑制および処置 - Google Patents

Description

本発明は、合成リガンドまたはアルギニル化ＢＩＰ（Ｒ−ＢｉＰ）のＰ６２ ＺＺドメインへの結合を介した、オートファジー活性の制御による神経変性疾患の処置のための方法に関する。

Ｎ−末端則経路は、タンパク質の単一のＮ−末端残基が分解シグナルとして作用するタンパク質分解系である（図１および図２）。Ｎ−末端則分解シグナルは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓを含むＩ型の塩基性残基；およびＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＩｌｅを含むＩＩ型の疎水性残基が典型的な例である（図２）。これらのＮ−末端残基は、特定のＮ−レコグニンに結合する（図３）。本発明者らは、既知のＮ−レコグニン、すなわち、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ４、およびＵＢＲ５を最初に発見またはクローニングし、それらが、ＵＢＲボックスを基質認識ドメインとして利用していることを見出した（Tasaki et al. 2005,図３）。本発明者らはまた、Ｎ−レコグニンのＵＢＲボックスが、Ｎ−末端アルギニン（Ｎｔ−Ａｒｇ）などのＩ型Ｎ−末端則リガンドに結合して、基質を認識しおよび基質にユビキチン鎖を連結させることを確認している。本発明者らにより確認されている通り、ＵＢＲ１およびＵＢＲ２は、ＩＩ型Ｎ−末端則リガンド（Ｎｔ−Ｔｒｐ、Ｎｔ−Ｐｈｅ、Ｎｔ−Ｔｙｒ、Ｎｔ−Ｌｅｕ、およびＮｔ−Ｉｌｅ）の結合において重要な役割を果たすＮ−ドメインを有する（Sriram et al., 2011）。Ｎ−レコグニンとＮ−末端則リガンドとの間の結合から生成されるユビキチン化された基質は、それが分解されるプロテアソームに送達される。Ｎ−レコグニンは、Ｎ−末端則基質に必要となる多くの水素結合を提供するため、このプロセスにおいて、特定にＮ−末端残基（Ｎｔ−Ａｒｇ、Ｎｔ−Ｈｉｓ、Ｎｔ−Ｌｙｓ、Ｎｔ−Ｔｒｐ、Ｎｔ−Ｐｈｅ、Ｎｔ−Ｔｙｒ、Ｎｔ−Ｌｅｕ、およびＮｔ−Ｉｌｅ）は、結合の重要な決定因子であり、かつリガンドの活性コンポーネントである（図３ｃおよび３ｄ）（Sriram and Kwon, 2010）。

神経変性疾患は、進行性の神経細胞変性および／または神経細胞死をもたらす消耗性疾患である。これらの疾患は、主たる症状および罹患脳領域によって分類され、とりわけアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、プリオン病／クロイツフェルト・ヤコブ病、強皮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）が含まれる。既知の神経変性疾患の多くは、タンパク質恒常性の障害による病原性タンパク質凝集塊の蓄積により引き起こされる。したがって、神経変性疾患は、タンパク質ミスフォールディング（misfolding）疾患に属し、主に顕著なものとして、変異ハンチントンタンパク質のミスフォールディングにより引き起こされるハンチントン病（Williams et al., 2008; Tsoi et al. 2012）、アルファ−シヌクレインタンパク質のミスフォールディングにより引き起こされるパーキンソン病（Martin et al. 2011）、変異プリオンタンパク質のミスフォールディングにより引き起こされるクロイツフェルト・ヤコブ病(Griffith, 1967)、および変異ＳＯＤ１およびＴＤＰ−３４タンパク質のミスフォールディングにより引き起こされるルー・ゲーリック病(Andersen et al. 2011)が含まれる。これらのミスフォールド（misfolded）タンパク質は全て、神経細胞にとっては毒性の凝集塊に迅速に変換され得る。

パーキンソン病は、最も代表的な神経変性疾患の一つであり、ドーパミン作動性ニューロンの喪失により引き起こされる。ＰＤの症状には、安静時振戦、硬直、運動緩徐および姿勢保持反射障害が含まれる。パーキンソン病の薬物療法は、対症療法および神経保護療法に分けられる。対象療法の薬剤には、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、抗コリン作動性薬剤、ＣＯＭＴ阻害剤およびアマンタジンが含まれる一方で、神経保護療法の薬剤には、抗酸化剤およびＭＡＯ−Ｂ阻害剤が含まれる。これらのうち、最も効果的な薬剤は、ドーパミンの直接前駆体で、脳内において代謝されるレボドパである。レボドパは、Ｌ−ドーパ脱炭酸酵素だけでなくカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によっても代謝される。したがって、レボドパは、その代謝を阻害し、その作用と血中での持続時間を延長させるために、ＣＯＭＴ阻害剤と一緒に投与される。レボドパを用いたドーパミン置換療法は、パーキンソン病患者を処置するのに有効である。しかしながら、処置の持続期間が５〜１０年を超えると、多くの患者は運動および運動反応における日内変動や、自律神経機能障害、ならびに姿勢保持反射障害などの副作用を示し；レボドパ処置の効能はもはやみられなくなる。

テトラベナジン（ＴＢＺ）は、ハンチントン病処置のための最も一般的な薬剤である。ＴＢＺの作用メカニズムは、よくわかっていないが、ＴＢＺは、シナプス前ニューロンにおける小胞体モノアミントランスポーターを阻害し、ドーパミン、セロトニン、およびノルエピネフリンなどのモノアミンの枯渇をもたらすことが確認されている。ＴＢＺはまた、シナプス後ニューロンにおけるＤ２ドーパミン受容体に対する弱いアンタゴニストとしても作用する。パーキンソン病を処置するのに用いられる他の薬剤には、クロザピンおよびアマンタジンが含まれる。クロザピンは、運動障害を効果的に軽減する非定型神経遮断薬である。アマンタジンは、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストとして作用し、また、ハンチントン病はドーパミン受容体およびグルタミン酸受容体の過剰興奮により引き起こされるという事実から、ハンチントン病の処置にも用いられる。

処置が、疾患の根本的原因を治療するのではない対症療法および神経保護療法に基づいているため、パーキンソン病およびハンチントン病の処置は、治療の効率および持続性の点において多くの制限がある。したがって、疾患の根本的原因を抑制または治癒させるであろう代替的処置を開発する必要がある。

ミスフォールドタンパク質（misfolded protein）が、細胞内に残存し、最終的に凝集すると、プロテアソームを介したタンパク質分解の阻害により、細胞機能の制限をもたらすことになり、細胞死を引き起こす。したがって、ミスフォールドタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）により速やかに除去される必要がある（図４）。正常な細胞では、ＵＰＳが、ミスフォールドタンパク質による細胞の損傷を最小限にする。しかし、古いニューロンでは、ＵＰＳが遅滞しているため、ミスフォールドタンパク質が蓄積し、凝集をもたらすようになる。ハンチントン病やパーキンソン病などの変性脳疾患の患者のニューロンにおいては、凝集したタンパク質は非常に狭いプロテアソーム内部を通過することができないため、特定の変異タンパク質は凝集してプロテアソームにより分解されるそれらの分解を抑制する。本発明の核心となる技術は、ｐ６２により誘導されるオートファジーを活性化することにより、神経変性疾患を引き起こすこれらのミスフォールドタンパク質凝集塊を効果的に除去することである。

オートファジーは、フォールドされていないまたは損傷したタンパク質および古くなったまたは正常に機能しない細胞小器官を分解することにより、細胞のホメオスタシスおよび遺伝的安定性を維持するのに必須である、主要な細胞内タンパク質分解システムである。マクロオートファジー（以後、オートファジーという）は、数多くの選択的オートファジー受容体により認識され選別される、細胞毒性のあるミスフォールドタンパク質（図４）を分解する役割を負っている。ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１／セクエストソーム−１（Sequestosome-1）は、ユビキチン化されたミスフォールドタンパク質に結合して、それらの共凝集およびオートファゴソームへの送達をもたらす、主要な選択的オートファジー受容体である（図４）。オートファゴソームへのｐ６２を介したミスフォールドタンパク質の輸送は、p６２のオリゴマー化能を必要とする。オリゴマー化によって、ｐ６２は、そのカーゴ（cargo）をパッケージングするのみならず、オートファジー共分解のためのオートファゴソーム形成部位にカーゴを送達する。この際、フォールドされていないタンパク質は、体積を小さくしてオートファジーにより分解されるのを容易にするために、一緒に集結される。ＰＢ１ドメインは、未知のメカニズムによるｐ６２の自己オリゴマー化を媒介する。オートファゴソームへ送達されるフォールドされていないタンパク質−ｐ６２結合体は、オートファゴソームがリソソームに結合するとリソソーム酵素により分解される（図４）。このメカニズムにより、オートファジーは、損傷したタンパク質および細胞小器官における細胞内変化を制御することにより、細胞のホメオスタシスを維持し得る。オートファジー機能が弱まると、ミスフォールドタンパク質の蓄積が増加し、神経変性疾患をもたらす。本発明の主要技術は、細胞内オートファジーを活性化させる方法を提供することである。

変性脳疾患を処置するためのオートファジーの効率的な活性化についての研究は、積極的に進められてきた。ＭＴＯＲはオートファジー阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンを用いるオートファジーの活性化は、最も広く用いられている方法である。ＡＰＰを過剰発現しているＡＤ動物モデルにおいては、アミロイドベータ（Ａｂ）およびタウがラパマイシン処置を用いて除去された（Caccamo et al., 2010）；タウを過剰発現しているＡｄ動物モデルにおいては、タウが、ラパマイシン処置を用いて除去された（Rodriguez-Navarro et al., 2010）；およびＰＤマウスモデルにおいては、過剰発現されたアルファ−シヌクレインタンパク質凝集体がラパマイシン処置を用いて除去された（Webb et al., 2003）。ＨＤマウスにおいては、ハンチントン凝集体は、動物の認知行動を改善するラパマイシン様物質であるＣＣＩ−７７９を用いることにより効率的に除去された（Ravikumar et al., 2002）。しかしながら、ｍＴＯＲは、ＮＦ−ｋＢを含む様々な細胞内経路において重要な役割を果たしているので、ｍＴＯＲ阻害剤をオートファジーの活性化剤として用いることには限りがある。

ｍＴＯＲ阻害剤以外のオートファジー活性化剤を用いてオートファジーを誘導する他の研究も存在する。特に、ＨＤマウスモデルにおいては、ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー活性化剤であるリルメニジンを用いることによって、ハンチントン凝集体の除去に成功した（Rose et al., 2010）。

プリオン病マウスモデルにおいては、イノシトールモノフォスファターゼ阻害剤であるリチウムを用いることによって、オートファジーを活性化し、過剰発現された変異プリオン（ＰｒＰＳｃ）凝集体を除去するのに成功した（Heiseke et al., 2009）。加えて、過剰発現されたアルファ−シヌクレインタンパク質凝集体は、ＰＤマウスもでるにおいてリチウムを用いることにより除去され（Sarkar et al., 2005）；および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）マウスモデルにおいては、過剰発現された変異ＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ凝集体はリチウムを用いて脳から除去された（Feng et al., 2008; Pizzasegola et al., 2009）。植物抽出物であるトレハロースは、ｍＴＯＲ経路非依存性のオートファジーを活性化することが知られているが、ＨＤマウスモデルにおいて脳から変異ハンチントンタンパク質を除去するのに用いられた（Sarkar et al., 2007）。加えて、トレハロースは、ＰＤマウスモデルにおいて、運動能力および寿命を改善するのに用いられ（Tanaka et al., 2004）、ならびに、異なるＰＤマウスモデルにおいても過剰発現されたＡ３０ＰおよびＡ５３Ｔ変異アルファ−シヌクレイン凝集体を除去するのに用いられた （Sarkar et al., 2007）。天然フラボンであるフィンセチンは、ＴＯＲＣ１およびＡＭＰＫによりオートファジーを活性化することが知られており、動物モデルにおいて変性脳疾患の症状を改善または緩和するのに用いられた（Maher et al., 2011）。しかしながら、このような追加的なオートファジー活性化剤は、細胞内シグナル伝達系において他の重要な役割も持っているため、これらを用いることには制限がある。

上記の通り、ハンチントン病などの多くの変性脳疾患を処置するための、広範囲の副作用がない効果的な治療剤は存在しない。ｍＴＯＲは、細胞における全体的な遺伝子発現を制御するのに広い役割を果たしており、したがって、ｍＴＯＲの阻害は、オートファジーのみならず多くの必須である生物学的経路にも影響を与えるため、ｍＴＯＲ阻害剤は、オートファジー活性化剤として最も一般的に用いられる化合物であるが、治療薬剤としては不適切である。本発明は、ミスフォールドタンパク質凝集体を除去するために直接的にオートファゴソームに送達するのに重要な役割を果たすｐ６２を活性化させることにより、変性脳疾患の原因因子であるミスフォールドタンパク質凝集体を除去する技術を提供する。ｐ６２によるオートファジーの活性化は、ｍＴＯＲの阻害のように追加的な生物学的経路に影響を与えることはなく、したがって、潜在的な副作用を低減する。

本発明の薬物動態および主要技術は、図１に要約される。特に、変異ハンチントンおよびアルファ−シヌクレインなどの悪性ミスフォールドタンパク質は、凝集し、オリゴマー凝集体（１、２）、線維性凝集体（３）となり、最終的には封入体（４）となる。若い神経細胞は、ＢｉＰなどの小胞体シャペロンのＮ末端アルギニル化（５）を介して大量のＮｔ−Ａｒｇを生成し、次いで、アルギニル化されたＢｉＰ（Ｒ−ＢｉＰ）は細胞質へ移行し、ミスフォールドタンパク質に結合する（６）。リガンドとしては、Ｒ−ＢｉＰのＮｔ−Ａｒｇがｐ６２ ＺＺドメインに結合し（７）、通常は不活性化していて閉じた形態のｐ６２が、開いた形態に変化して、構造的活性化をもたらす（８）。結果として、ＰＢ１およびＬＣ３−結合ドメインが露出する。ＰＢ１ドメインはｐ６２のオリゴマー化を促進して（９）、Ｒ−ＢｉＰおよびミスフォールドタンパク質を伴ったｐ６２の凝集、ならびにオートファゴソーム形成部位（１０）へのそれらのターゲティングをもたらす。大きくなっていくファゴフォアの膜におけるｐ６２のＬＣ３との相互作用は、オートファゴソーム（１１）へのｐ６２−Ｒ−ＢｉＰ−カーゴの相互作用およびリソソームタンパク質分解をもたらす。ステップ５〜１１を含むオートファジータンパク質分解は、若いニューロンでは非常に強力であるので、細胞毒性タンパク質の凝集体（１〜５）は蓄積しない。しかし、古いニューロンでは、ステップ５〜１１を含むオートファジータンパク質分解は、弱くなっており、タンパク質凝集体（１〜５）が蓄積して細胞毒性をもたらす。本発明においては、ｐ６２は、ｐ６２ ＺＺドメインの低質量リガンドを用いることにより、意図的に活性化され（１２、１３、ハンチントンおよびアルファ−シヌクレインタンパク質の凝集体を効果的に除去する。特に、ステップ１２において、リガンドとつながったｐ６２は、ｐ６２−Ｒ−ＢｉＰ−ミスフォールドタンパク質のオリゴマー化（９）とオートファジー凝集体の形成（１０）を加速させる。ステップ１３においては、リガンド−ｐ６２結合体は、オートファジー活性化因子（１４）として作用し、オートファゴソームの形成（１５）を加速するために、ＬＣ３の合成およびＬＣ３−ＩのＬＣ３−ＩＩへの変換を誘導する。

それらの研究および文献の再検討の結果として、本発明者らは、ｐ６２がオートファジーの活性化についてのファースト・イン・クラス（first-in-class）ターゲットであると提案している（図１の８）。変性脳疾患におけるオートファジー活性化またはタンパク質凝集体の除去に対する薬剤の標的としてｐ６２を提案している研究はこれまでなされていない。したがって、本発明者らは、オートファジーを活性化することにより神経変性疾患を処置するための方法としてｐ６２を標的とする新規治療薬剤を開発することに特許の申請をするものである。

オートファジーを活性化する手段としてｐ６２を標的とする神経変性疾患を抑制および処置するための新規薬剤を開発する過程において、本発明者らは、リガンドを結合するｐ６２ ＺＺドメインが、上記メカニズムを介してオートファジーを活性化し、変異ハンチントンおよびアルファ−シヌクレインタンパク質凝集体の効率的な除去をもたらし得ることを確認し、神経変性疾患の処置または抑制のための医薬組成物およびこれを制御するための方法を確認して、本発明を完成させた。

本発明の目的は、神経変性疾患の抑制および処置のための医薬組成物であって、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む、前記組成物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、神経変性疾患の抑制および改善のための食品サプリメントであって、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む、前記食品サプリメントを提供することである。

本発明の目的はまた、ｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを細胞に処理するステップを含む、ｐ６２のオリゴマー化および構造的活性化を誘導するための方法（１）；オートファジーを活性化するための方法（２）；ならびにミスフォールドタンパク質凝集体を除去するための方法（３）を提供することでもある。

上記目的を達成するため、本発明は、神経変性疾患の抑制および処置のための医薬組成物であって、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む、前記組成物を提供する。

本発明はまた、神経変性疾患の抑制および改善のための食品サプリメントであって、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む、前記食品サプリメントをも提供する。

加えて、本発明は、ｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドで細胞を処理するステップを含む、ｐ６２のオリゴマー化および構造的活性化を誘導するための方法（１）；ｐ６２−ＬＣ３結合を増加させるための方法（２）；ｐ６２のオートファゴソームへの輸送を増加させるための方法（３）；オートファジーを活性化するための方法（４）；ならびにミスフォールドタンパク質凝集体を除去するための方法（５）を提供する。

本発明はｐ６２活性の制御因子、オートファジー活性化因子、および活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む変性脳疾患のための治療薬剤に関する。本発明のｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドには、Ｘ−１１ペプチド（Ｘ＝Ｎｔ−Ａｒｇ、Ｎｔ−Ｐｈｅ、Ｎｔ−Ｔｙｒ、Ｎｔ−Ｔｒｐ）、Ａｒｇ−Ａｌａ（ＲＡ）、Ｔｒｐ−Ａｌａ（ＷＡ）、ＺＺ−Ｌ１、およびＺＺ−Ｌ２、ならびにＮｔ−アルギニル化ＢｉＰ（Ｒ−Ｂｉｐ）が含まれる。特に、Ｘ−１１ペプチド、Ａｒｇ−Ａｌａ、Ｔｒｐ−Ａｌａ、およびＲ−ＢｉＰの活性成分には、Ｎｔ−Ａｒｇ、Ｎｔ−Ｐｈｅ、Ｎｔ−Ｔｙｒ、およびＮｔ−Ｔｒｐが含まれる。したがって、ｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドは、オートファジーの制御を介して神経変性疾患の抑制または処置のための組成物のための活性成分として効果的に用いることができる。

本発明の好ましい態様の適用は、添付の図面を参照して極めてよく理解される；
図１は、本発明において提案されている薬剤の標的およびメカニズムを説明する図である。

図２は、Ｎ−末端タンパク質分解経路を説明するスキーム図である。この経路においては、Ｎｔ−ＡｒｇなどのＮ−末端残基が、分解リガンドとして作用し、Ｎ−レコグニンに認識されて結合することができ、結果として基質の分解をもたらす。従来の経路では、Ｎｔ−Ａｒｇがユビキチン化を誘導し、それにより基質のプロテアソームへのターゲティングが増強される。本発明においては、Ｎｔ−Ａｒｇはそれを活性化させるｐ６２に結合するのみならず、オートファジー経路も活性化することが見出された。

図３は、Ｎ−末端タンパク質分解経路（Ｎ−末端則経路）におけるＮ−レコグニンの構造および配列を説明する図である。（ａ）：ＵＢＲボックスタンパク質グループ（ＵＢＲ１〜ＵＢＲ７）の一次構造を説明するスキーム図。このグループは、Ｎｔ−Ａｒｇに結合できるＵＢＲボックスを有し、そのうちＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ４、およびＵＢＲ５がＮｔ−Ａｒｇに結合することが確認されている。（ｂ）：ＵＢＲボックス配列を比較する図。（ｃ、ｄ）：ＵＢＲ１のＵＢＲボックスの結晶構造。

図４は、ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）、シャペロンを介したオートファジー、およびマクロオートファジーが、どのように互いに協力してミスフォールドタンパク質を除去するかを説明するスキーム図である。

図５は、Ｎ−末端則新規Ｎ−レコグニン、Ｎｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−ＴｒｐなどのＮ−リガンドへのｐ６２の選択的結合を説明する図である。（ａ）：新規Ｎ−レコグニンを同定するために、ラット組織抽出物においてＮ−デグロン（degron）と一緒にロードされた合成ペプチドに結合する種々のタンパク質について調べた、スキーム図。（ｂ、ｃ）：ラット精巣抽出物を用いて行われたＸ−ペプチドプルダウン（pull down）により得られたそれらのタンパク質についての銀染色の結果。（ｄ）：Ｘ−ペプチドプルダウンにより得られたそれらのタンパク質を用いて行われたｉＴＲＡＱ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation（アイソバリックタグ相対および絶対定量法））の結果。（ｅ−ｉ）：Ｘ−ペプチドプルダウンにより得られたそれらのタンパク質を用いて行われたイムノブロッティングの結果。

図６は、Biacoreアッセイを用いることによりｐ６２のＮｔ−Ａｒｇ（Ｋｄ、４０ｎＭ）およびＮｔ−Ｐｈｅ（Ｋｄ、３．４μＭ）に対する結合力を測定した結果を説明する図である。

図７は、ｐ６２が、そのＺＺドメインを介してＮ−末端則リガンドに結合することを説明する図であり、また、ＺＺドメインおよびＵＢＲボックスドメインの一次構造の比較を表す。（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）：ｐ６２の様々なフラグメントを説明するスキーム図。（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ）：それらのｐ６２フラグメントを用いて行われたＸ−ペプチドプルダウン解析の結果。（ｌ）：ｐ６２ ＺＺドメインおよびＵＢＲボックスの一次構造の比較結果。

図８は、Ａｒｇ−Ａｌａがｐ６２の自己オリゴマー化を誘導し、ｐ６２のＬＣ３への結合を増加させることを説明する図である。（ａ−ｃ）：ｐ６２の自己オリゴマー化の解析。ｐ６２の自己オリゴマー化および凝集体形成が、Ｎ−リガンド Ａｒｇ−Ａｌａがｐ６２ ＺＺドメインに結合する際に、誘導され得るかどうかを調べるため、インビトロオリゴマー化アッセイを、全長ｐ６２を発現するＨＥＫ２９３細胞溶解液を用いて非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。（ｄ）：Ａｒｇ−１１ペプチドに結合することができないｐ６２ ＺＺ変異体を用いることにより行われたインビトロｐ６２オリゴマー化アッセイの結果。（ｅ）：ｐ６２ ＰＢ１ドメインが、ｐ６２の凝集体形成に関与しているかどうかを調べるため、Ｄ６９Ａ変異体の凝集能を評価した。（ｆ−ｈ）：ｐ６２のＬＣ３への結合におけるＡｒｇ−Ａｌａの効果を調べるため、ＥＬＩＳＡを行った。（ｉ）：Ｎｔ−Ａｒｇのｐ６２ ＺＺドメインへの結合によるｐ６２の構造的活性化の誘導を説明する図である。

図９は、小胞体シャペロンの一次タンパク質配列の比較を説明する図である。これらのタンパク質は、翻訳後小胞体に入るとそのシグナルペプチドを喪失する。この際、Ｎ−リガンドは成熟タンパク質で露出される（ボックスとして示す）。ミスフォールドタンパク質が細胞質において蓄積すると、シャペロンは細胞質に移動してＮ−末端アルギニル化される。

図１０は、Ｎ−末端アルギニル化を介してＮ−リガンドとしてＮｔ−Ａｒｇを得る小胞体タンパク質のスクリーニングを説明する図である。（ａ）：Ｎ−末端アルギニル化を説明するスキーム図。細胞がミスフォールドタンパク質の蓄積によりストレスを受けると、シャペロンが細胞質に移動して、ＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼによりＮ−末端アルギニル化をもたらす。（ｂ）：Ｒ−ＢｉＰ抗体の特異性および結合力を測定するために行われたペプチド結合アッセイの結果。（ｃ）：Ｒ−ＢｉＰ抗体を用いたドットブロットアッセイ。（ｄ）：ＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼイソメラーゼを過剰発現させて、次いで上記Ｒ−ＢｉＰ抗体を用いてＲ−ＢｉＰの形成を確認した。（ｅ）：ｓｉＲＮＡを用いてＡＴＥ１をノックダウンした際、Ｒ−ＢｉＰの形成は減少することが確認された。

図１１は、ＢｉＰ、ＣＲＴ、およびＰＤＩのＮ−末端アルギニル化がＡＴＥ１を介していることを説明する図である。（ａ）：アルギニル化は、Ｕｂ−Ｘ−ＢｉＰ−フラグ（flag）（Ｘ＝ＧｌｕまたはＶａｌ）を発現させることにより調べた。（ｂ）：組み換えタンパク質Ｕｂ−Ｘ−Ｂｉｐ−ｍｙｃ／ｈｉｓ構造の形成を説明するスキーム図である。（ｃ）：Ｎｔ−Ｇｌｕ１９におけるＸ−ＢｉＰアルギニル化は、上記構造を用いて確認した。（ｄ）：Ｒ−ＢｉＰは、ＡＴＥ１ノックアウト細胞においては生成されないことが確認された。（ｅ）：ＥＲストレスを引き起こすタプシガルジンを用いると、Ｒ−ＢｉＰは、ＥＲストレスによっては生成されないが、ＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼにより引き起こされる酵素反応における生成物であることが確認された。（ｆ）：上記の生成されるＲ−ＢｉＰは、細胞分画を用いることにより、大きい容積で細胞質に移動することが確認された。（ｇ）：細胞質中のＲ−ＢｉＰは、シクロヘキシミドタンパク質分解法を用いることにより、小胞体中の非アルギニル化ＢｉＰと比較して、相対的に分解されないことが確認された。（ｈ）：ＡＴＥ１により誘導されるＣＲＴおよびＰＤＩのＮ−アルギニル化を調べた。結果として、ＡＴＥ１アイソザイムを過剰発現すると、Ｒ−ＣＲＴおよびＲ−ＰＤＩが生成されることが確認された。

図１２は、Ｒ−ＢｉＰ生成が、細胞質における外部ＤＮＡにより誘導されることを説明する図である。（ａ、ｂ）：二重らせんＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が細胞質に導入されると、Ｒ−ＢｉＰ生成が特異的に誘導される。（ｂ、ｃ）：Ｒ−ＣＲＴ生成もまた、Ｒ−ＢｉＰと同様に、ｄｓＤＮＡが細胞質に導入されると、誘導される。（ｄ）：Ｒ−ＢｉＰは、ｄｓＤＮＡが細胞質に移動することにより生成されることが、細胞分画により確認された。（ｅ−ｇ）：Ｒ−ＢｉＰ、Ｒ−ＣＲＴ、およびＰ−ＰＤＩは、ＤＮＡを含む病原体（ウイルスまたは細菌）を模倣するポリ（ｄＡ：ｄＴ）を用い、侵襲ＤＮＡに対する先天性免疫反応の一部として生成された。（ｆ）：オートファジーはまた、上記プロセスとも連動して活性化される。

図１３は、Ｒ−ＢｉＰは、ｐ６２と連動してオートファゴソームに移行することを説明する図である。（ａ）：Ｒ−ＢｉＰは、細胞質に移行して斑点状（in puncta）に蓄積することが免疫組織化学染色により確認された。（ｂ−ｄ）：Ｒ−ＢｉＰの斑点は、ｐ６２の斑点と共局在化しており（ａ、ｃ）、ＬＣ３ともまた共局在化していた（ｂ−ｄ）。（ｅ）：マウス胎仔心臓において、ＢｉＰはＬＣ３陽性オートファゴソームに移行することが確認された。（ｆ−ｈ）：ＡＴＥ１またはＢｉＰがｓｉＲＮＡを用いてノックダウンされた場合には、Ｒ−ＢｉＰはオートファゴソームに移動しなかった。ｐ６２がノックダウンされた場合にも同様の結果が得られた。

図１４は、Ｒ−ＢｉＰがオートファゴソームに移行する際に、Ｎｔ−Ａｒｇが必要とされることを説明する図である。（ａ）：細胞におけるＵｂ−Ｘ−ＢｉＰ−ＧＦＰ組み換えタンパク質（Ｘ＝Ａｒｇ、Ｇｌｕ、またはＶａｌ）の過剰発現によるＸ−ＢｉＰ−ＧＦＰの生成を説明するスキーム図である。（ｂ）：オートファゴソームへの組み換えタンパク質の移動を、免疫染色を用いて調べた。（ｃ）：Ｒ−ＢｉＰはオートファゴソームに移行したが、Ｖａｌ−ＢｉＰ（アルギニル化の基質として用いることができないように、Ｎｔ−Ｇｌｕ１９がＶａｌで置換されている)は、Ｎｔ−Ａｒｇがないためオートファゴソームに移行しなかった。（ｄ）：Ｒ−ＢｉＰの細胞内での位置をＬＣ３の斑点の細胞内部位と比較したところ、同様の結果が得られた。（ｅ）：Ｕｂ−Ｘ−ＢｉＰ^Δ（図１４ａ）を過剰発現後（ここではＢｉＰのほとんどが除去されて１９〜１２４残基が残る）、Ｘ−ＢｉＰ^ΔＤの細胞内での位置を、免疫染色を用いて調べた。（ｆ）：Ｘ−ＢｉＰおよびＬＣ３の細胞内での位置を、免疫染色を用いて調べたところ、同様の結果が得られた。

図１５は、Ｒ−ＢｉＰのＮｔ−Ａｒｇが、ｐ６２ ＺＺドメインに直接結合することを説明する図である。（ａ、ｂ）：Ｒ−ＢｉＰのＮｔ−Ａｒｇがｐ６２ ＺＺドメインに直接結合することができるかどうかを調べるため、Ｘ−ペプチドプルダウンアッセイを行った。（ｃ、ｄ）：Ｒ−ＢｉＰは、細胞抽出物からｐ６２をプルダウンしたが、Ｅ−ＢｉＰまたはＶ−ＢｉＰはｐ６２をプルダウンしなかった。（ｅ）：Ｒ−ＢｉＰのＮｔ−Ａｒｇに対する、ｐ６２の結合領域を調べるために調製したｐ６２フラグメントを説明するスキーム図。（ｆ）：プルダウンアッセイは、ｐ６２フラグメントおよびＲ−ＢｉＰペプチドを用いて行った。結果として、Ｒ−ＢｉＰのＮｔ−Ａｒｇは、ｐ６２ ＺＺドメインに結合した。（ｇ）：ｐ６２ ＺＺドメインのみを切り出して、ｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＧＳＴおよびｐ６２−ＺＺ（Ｄ１２９Ａ）８３−１７５と名付けた。（ｈ）：ＧＳＴプルダウンアッセイを、ｐ６２フラグメントを用いて行った。（ｉ）：ｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＲＦＰおよびユビキチン−Ｘ−Ｂｉｐ１９−１２４−ＧＦＰをＭＥＦ細胞に同時に過剰発現させると、Ａｒｇ１８−Ｂｉｐ１９−１２４は、ｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＲＦＰと斑点形成を示しながら共局在するが、一方で、Ｖａｌ１９−Ｂｉｐ１９−１２４−ＧＦＰは、ｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＲＦＰと共局在せず斑点形成も示さなかった。

図１６は、Ｒ−ＢｉＰがｐ６２依存性のオートファジー作用により分解されることを説明する図である。（ａ、ｂ）：Ｕｂ−Ｘ−ＢｉＰ^Δ−ＧＳＴを構築して、＋／＋およびｐ６２−／−細胞において過剰発現させ、次に、ＢｉＰ分解アッセイを行った。（ｃ）Ｕｂ−Ｘ−ＢｉＰ^Δ−ＧＳＴのＲ−ＢｉＰは、オートファジー欠損ＡＴＧ５−／−細胞においては分解されずに蓄積された。（ｄ、ｅ）：Ｕｂ−Ｒ−ＢｉＰ−ｍｙｃ／ｈｉｓを用いて、シクロヘキシミドタンパク質分解定量アッセイを行った。結果として、Ｒ−ＢｉＰは、細胞内で極めて安定であることが確認された。

図１７は、Ｒ−ＢｉＰが、細胞質においてユビキチン化タンパク質により生成され、次いで、細胞質のミスフォールドタンパク質と結合し、オートファジーにそれらを送達することを説明する図である。（ａ）：ポリ（ｄＡ：ｄＴ）により処理したＨｅＬａ細胞を用いてイムノブロッティングを行った。結果として、Ｒ−ＢｉＰが生成されるのに伴って、ユビキチンが結合した細胞内タンパク質が蓄積されることが確認された。（ｂ）：ユビキチン化された細胞内タンパク質の一部は、斑点としてｐ６２に移動し、その構造内でＲ−ＢｉＰが共局在した。（ｃ）：種々の化学物質により細胞を処理した後、Ｒ−ＢｉＰの形成を調べるためイムノブロッティングを行った。結果として、Ｒ−ＢｉＰの形成は、プロテアソーム阻害剤により誘導されることが確認された。（ｄ，ｅ）：プロテアソーム阻害剤と小胞体ストレスを引き起こすタプシガルジンとで同時に細胞を処理した場合には、Ｒ−ＢｉＰ、Ｒ−ＣＲＴ、およびＲ−ＰＤＩの生成が強く誘導された。（ｆ）：細胞内のミスフォールドタンパク質の生成を加速させるため、 Ｈｓｐ９０阻害剤であるゲルデナマイシンで処理した。結果として、Ｒ−ＢｉＰの生成が誘導されることが確認された。（ｇ）：フォールドされていないモデル基質であるＹＦＰ−ＣＬ１を過剰発現したところ、Ｒ−ＢｉＰとの直接結合体が得られた。（ｈ、ｉ）：ＹＦＰ−ＣＬ１がオートファジー小胞（vacuole）に移行してその構造内でＲ−ＢｉＰおよびｐ６２と共局在することを確認するため、免疫蛍光染色を行った

図１８は、小化合物（small compound）ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２がｐ６２のオリゴマー化およびＬＣ３への結合を増加させることを説明する図である。（ａ、ｂ）：ｐ６２を過剰発現する細胞抽出物をＺＺ−Ｌ１で処理した後、Ｐ６２凝集体を測定するためにインビトロオリゴマー化アッセイを行った。（ｃ）：ＺＺ−Ｌ１が、Ａｒｇ−Ａｌｇと同じ様式でＰ６２の活性化を誘導し得るかどうかを調べた。結果として、ｐ６２のＬＣ３への結合は、ＺＺ−Ｌ１用量依存的に（０、１０、２５、１００、５００、および１０００μＭ）増加することが確認された。（ｄ−ｆ）：ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２がｐ６２の斑点形成を誘導し得るかどうかを調べるため、免疫蛍光共焦点顕微鏡法を行った。

図１９は、ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２がオートファジー活性化剤であることを説明する図である。（ａ）：ＺＺリガンドが、ＨｅＬａ細胞において、ｐ６２のオートファジー斑点の形成のみならずＬＣ３のオートファジー斑点の形成をも加速させ得ることを免疫蛍光染色により確認したが、このことは、ＺＺリガンドがオートファジー活性化剤として機能し得ることを示唆している。（ｂ）：ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２のオートファジーにおける効果を調べるため、ウェスタンブロッティングを行った。（ｃ）：ＬＣ３の増加およびＬＣ３−ＩＩの形成は、ｓｉ−コントロールを形質導入して、ＺＺ化合物であるＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２により誘導された。しかしながら、この効果は、ｐ６２のノックダウンにより抑制された。（ｄ）：＋／＋およびｐ６２−／−細胞を用いた同様の実験においては、ＺＺ−１（５ｍＭ）は、ｐ６２−／−細胞においてオートファジー活性化剤として機能しないことが確認された。（ｅ）：ＺＺリガンドで処理した細胞を、オートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）で処理した後、ＬＣ３を定量するためにイムノブロッティングを行った。（ｆ）：ＨｅＬａ細胞に、酸感受性ＧＦＰと酸非感受性ＲＦＰとを組み合わせて調製したＲＦＰ−ＧＦＰ−ＬＣ３を安定導入し、上記と同様の方法によりオートファジー動態解析を行った。（ｇ）：ＺＺリガンドにより活性化されるｐ６２は、オートファジー活性化剤として機能することを説明するスキーム図。

図２０は、ＺＺリガンドと組み合わせたｐ６２が、ｍＴＯＲ非依存性オートファジーを活性化することを説明する図である。（ａ）：ＨｅＬａ細胞をＺＺ−Ｌ１で処理した後、シクロヘキシミドタンパク質分解アッセイを行った。結果として、ｐ６２の分解はＺＺ−Ｌ１により加速されることが確認された。（ｂ、ｃ）：オートファジー活性化剤としての効果およびメカニズムをそれらの間で比較するため、ＨｅＬａ細胞をＺＺリガンドおよびラパマイシンにより、種々の濃度で、種々の処理時間にわたって処理した。次いで、ＬＣ３生成およびＬＣ３−ＩＩ変換を比較した。（ｄ）：ラパマイシンがｍＴＯＲ(mammalian Target Of Rapamycin（哺乳類ラパマイシン標的）)阻害剤として作用することを説明するスキーム図。ｍＴＯＲが阻害されると、オートファジーの主要制御因子（ＵＬＫ、ベクリン（Beclin）など）が活性化され、ＬＣ３合成およびＬＣ３−ＩＩ変換の増加が引き起こされて、オートファゴソーム生成の増加がもたらされた。（ｅ）：ＨｅＬａ細胞をＺＺリガンドおよびラパマイシンにより処理した。次いで、ｍＴＯＲにより制御されるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を調べた。（ｆ）：ＺＺリガンドが、ユビキチン化された細胞内タンパク質のオートファジーへの移動を増加させ得るかどうか調べるため、免疫蛍光アッセイを行った。結果として、５ｍＭ ＺＺ−Ｌ１が、オートファジー小胞へのユビキチン化タンパク質の移動を誘導することが確認された。オートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキンをこれに処理すると、ユビキチン化タンパク質は、オートファジー小胞に蓄積された。

図２１は、変異ハンチントンタンパク質凝集体が、ＺＺリガンドにより除去されることを説明する図である。（ａ）：野生型ハンチントン（HDQ25-GFP）および変異ハンチントン（ＨＤＱ１０３−ＧＦＰ；ＣＡＧが１０３回繰り返している）を説明するスキーム図。（ｂ）：ハンチントンタンパク質を過剰発現する細胞を、１０ｍＭ ＺＺ−Ｌ１または１ｍＭ ラパマイシンで処理した後、細胞内の残留ハンチントンタンパク質を調べるためにドットプロットアッセイを行った。（ｃ）：ＨＤＱ１０３−ＧＦＰタンパク質凝集体を過剰発現するＨｅＬａ細胞を、１０ｍＭ ＺＺリガンドで処理した後、免疫蛍光染色を行った。（ｄ）：細胞を、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００における可溶性画分と（凝集体を含む）不溶性画分とに分けた後、イムノブロッティングを行った。結果として、フォールドされていないハンチントンタンパク質は、ＺＺ−Ｌ１処理した凝集体画分から効率的に除去されることが確認された。（ｅ）：ＨｅＬａ細胞をＺＺ−Ｌ１、ＺＺ−Ｌ２、およびラパマイシンで処理した後、イムノブロッティングを行った。（ｆ）：＋／＋およびＡＴＧ５−／−細胞を、１０ｍＭ ＺＺリガンドおよび１ｍＭ ラパマイシンで処理した後、イムノブロッティングを行った。

図２２は、ＨＤＱ１０３−ＧＦＰハンチントンタンパク質凝集体により形成される封入体におけるＲ−ＢｉＰとｐ６２との共局在を説明する図である。（ａ、ｂ、ｃ）：ＨＤＱ１０３−ＧＦＰを過剰発現するＨｅＬａ細胞を１０ｍＭ ＺＺリガンドで処理した後、免疫蛍光染色を行った。

図２３は、ｐ６２−ＺＺ１、ｐ６２−ＺＺ２、およびラパマイシンの化学的特徴の比較を説明する図である。

図２４は、マウスにおけるｐ６２−ＺＺ１の薬物動態学的プロファイルを説明する図である。

好ましい態様の記載
以後、本発明を詳細に記載する。

本発明は、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを用いることによりｐ６２の機能を活性化するための方法を提供する。

本発明はまた、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む、オートファジー活性化剤をも提供する。

本発明はさらに、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを用いることにより、フォールドされていないタンパク質凝集体を除去するための方法を提供する。

加えて、本発明は、神経変性疾患の抑制および処置のための医薬組成物であって、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む、前記組成物を提供する。

前記ｐ６２は、配列番号１により表されるアミノ酸配列から構成されている。前記ＺＺドメインは、特徴として、配列番号１により表されるｐ６２タンパク質のアミノ酸配列の１２８〜１６３残基を含有する。

上記リガンドは、以下のペプチドを含有する。下記の配列番号２〜９により表されるリガンドにおいて、ｐ６２ ＺＺドメインに直接結合することができる活性成分は、Ｎｔ−Ａｒｇ（式１）、Ｎｔ−Ｐｈｅ（式２）、Ｎｔ−Ｔｒｐ（式３）、またはＮｔ−Ｔｙｒ（式４）のＮ−末端残基であった：
配列番号２：Ａｒｇ−Ａｌａ；
配列番号３：Ｐｈｅ−Ａｌａ；
配列番号４：Ｔｒｐ−Ａｌａ；
配列番号５：Ｔｙｒ−Ａｌａ；
配列番号６：Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｒ−１１）；
配列番号７：Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｗ−１１）；
配列番号８：ＢｉＰタンパク質のＮ−末端のＧｌｕ１９がアルギニル化されている（Ｒ−ＢｉＰ）；および
配列番号９：アルギニル化されたＢｉＰ Ｎ−末端ペプチド（Ｒ−ＢｉＰＤ）。
［式１］
［式２］
［式３］
［式４］

上記リガンドは、下記の式５（ｐ６２−ＺＺ１；２−（３，４−ビス（ベンジルオキシ）ベンジルアミノ）エタノール）により表される化合物または式６により表される化合物（ｐ６２−ＺＺ２；１−（３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェノキシ）−３−（イソプロピルアミノ）プロパノール）を含む。特に、ｐ６２−ＺＺ２はＮＣＩ３１４９５３として知られている。
［式５］
［式６］

加えて、上記リガンドは、ｐ６２ ＺＺドメインに結合し、ＰＢ１ドメインおよびｐ６２のＬＩＲドメインを活性化することで、ｐ６２のオリゴマー化および凝集体形成を誘導し、また、ｐ６２凝集体形成を誘導することによりオートファゴソーム形成を増加させる。上記で説明したプロセスにより、ミスフォールドタンパク質を効率的に除去することができる（図１参照）。

本明細書において、神経変性疾患は、ライムボレリア症、致死性家族性不眠症、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、てんかん、パーキンソン病（ＰＤ）、脳卒中、ハンチントン病（ＨＤ）、ピック病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される。

本発明の好ましい態様においては、本発明者らは、Ｎｔ−Ａｒｇ、Ｎｔ−Ｐｈｅ、Ｎｔ−Ｔｒｐ、およびＮｔ−Ｔｙｒに結合することができるＮ−レコグニンとしてｐ６２を同定した（図５参照）。特に、ｐ６２は、Ｎｔ−Ａｒｇに対する優れた結合力を有することが確認された（図６参照）。本発明者らはまた、ｐ６２ ＺＺドメインが上記結合に関与していることを確認した（図７参照）。Ｎ−リガンドであるＡｒｇ−Ａｌａは、ｐ６２の自己オリゴマー化および凝集体形成を誘導し（図８ｄ参照）、また、ｐ６２のＬＣ３への結合をも増加させた（図８ｆ）。Ｎ−末端がアルギニル化されたＢｉＰ（Ｒ−ＢｉＰ）、カルレティキュリン（calreticulin）（Ｒ−ＣＲＴ）、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｒ−ＰＤＩ）は、Ｎ−末端アルギニル化を介したＮｔ−Ａｒｇを得ることにより、小胞体タンパク質から同定された（図９参照）。これらのタンパク質のＮ−末端アルギニル化は、ＡＴＥ１を介していることが確認された（図１０参照）。また、細胞質内の外来ＤＮＡは、Ｒ−ＢｉＰ生成を誘導し得ること（図１２参照）、およびこの際に、Ｒ−ＢｉＰはｐ６２と一緒にオートファゴソームへ送達されること（図１３参照）が確認された。Ｒ−ＢｉＰは、Ｐ６２依存的にオートファジー作用によって分解され、次いでユビキチン化された（図１６参照）。本発明者らはまた、Ｎｔ−Ｔｒｐに構造的に類似している小化合物（ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２）をも同定した（図１８参照）。さらに、本発明者らは、ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２が細胞内オートファゴソーム形成を増加させることを確認した（図１９参照）。ＺＺ化合物は、リソソームおよびオートファゴソームに融合すること（図２０）、ならびにオートファジーの活性化を介して、ハンチントン凝集体を含むミスフォールドタンパク質を除去すること（図２１および２２参照）が確認された。

したがって、ｐ６２ ＺＺドメインに結合する本発明のリガンドは、ｐ６２のオリゴマー化および凝集体形成を誘導することができるため、これを用いてオートファジーを制御することにより、神経変性疾患の抑制および処置のための医薬組成物のための活性成分として効果的に用いることができる。

本発明による治療薬剤または医薬組成物は、通常用いられる薬学的に許容し得る担体と一緒に適切な形態に製剤することができる。本明細書において、前記「薬学的に許容し得る」は、生理学的に許容し得るものであって、いかなるアレルギー反応または胃腸疾患やめまいなどのアレルギー様反応を引き起こすことがない組成物を意味する。薬学的に許容し得る担体としては、水、適切な油、生理食塩水、含水グルコースおよびグリコールなどが例示され、追加的に安定剤および防腐剤を含み得る。適切な安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸などの抗酸化剤が例示される。適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベン、およびクロロブタノールが例示される。加えて、本発明の組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、等張化剤、防腐剤、吸収阻害剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、鎮痛剤、緩衝剤、抗酸化剤などの様々な添加剤を含有し得る。本発明に適切な、薬学的に許容し得る担体および製剤は、上記に例示されたものが含まれるが、Remingtons’s Pharmaceutical Science（最新版）に詳細に記載されている。

本発明の組成物は、単回投与または複数回投与の容器の形態で、薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤を用いることにより、当業者により実施し得る方法で製剤することができる。製剤は、溶液、懸濁液、油溶性もしくは水溶性媒体中の懸濁液またはエマルジョン、粉末、顆粒、錠剤あるいはカプセルの形態であり得る。

本発明の式５または式６により表される化合物は、薬学的に許容し得る塩の形態として用いることができ、ここで塩は、好ましくは、薬学的に許容し得る遊離酸により形成される酸付加塩である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸および亜リン酸などの無機酸、または、脂肪族一価／二価カルボン酸塩、フェニル置換アルカン酸塩、ヒドロキシアルカン酸塩、アルカン二酸塩、芳香族酸および脂肪族／芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から得ることができる。薬学的に非毒性である塩としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソブチル酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、カバカート（cabacate）、フマル酸塩、マリアート（maliate）、ブチン―１，４―ジオエート、ヘキサン―１，６―ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニルブチル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ヒドロキシブチル酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩およびマンデル酸が例示される。

本発明における酸付加塩は、当業者に既知の慣用の方法により調製することができる。例えば、式５または式６の化合物を、アセトン、メタノール、エタノール、またはアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒に溶解して、そこに過剰の有機酸または無機酸の酸性水溶液を加え、沈殿または結晶化を誘導する。次いで、溶媒または過剰の酸を混合物から蒸発させて、混合物を乾燥させ付加塩を得る、あるいは、沈殿した塩を吸引ろ過して付加塩を得る。

薬学的に許容し得る金属塩は、塩基を用いることにより調製することができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、以下のプロセスにより得られる：化合物を過剰の水酸化アルカリ金属または水酸化アルカリ土類金属溶液に溶解するプロセス；不溶性の化合物塩をろ過するプロセス；残留溶液を蒸発させて、それを乾燥させるプロセス。この際、金属塩は、好ましくは、薬学的に適切な形態のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩で調製される。また、対応する銀塩は、適切な銀塩（例；硝酸銀）とアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩の反応により調製される。

本発明の医薬組成物の投与方法は、剤形にしたがって容易に選択することができ、様々な経路を用いて家畜およびヒトなどの哺乳類に投与することができる。例えば、粉末、錠剤、丸薬、顆粒、糖衣錠、ハードまたはソフトカプセル、液剤、エマルジョン、懸濁剤、シロップ、エリキシル、外用剤、坐剤および滅菌注射液の形態に製剤することができ、全身または局所投与、あるいは経口または非経口投与することができる。この際、非経口投与が特に好ましい。

非経口投与の剤形は、滅菌水溶液、水不溶性賦形剤、懸濁剤、エマルジョン、凍結乾燥製剤、坐剤である。水不溶性賦形剤および懸濁剤は、活性化合物または化合物に加えて、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、エチルオラート（ethylolate）などの注射可能なエステルを含有し得る。坐剤は、活性化合物または化合物に加えて、ウイテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ６１、カカオバター、ラウリンバター、グリセロール、ゼラチンなどを含有し得る。

経口投与のための固形製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒およびカプセルである。これらの固形製剤は、式５または式６により表される化合物を、デンプン、炭酸カルシウム、蔗糖または乳糖、ゼラチン等、といった１種以上の適切な賦形剤と混合することにより調製される。簡単な賦形剤以外に、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の潤滑剤を使用することができる。経口投与のための液体製剤は、懸濁剤、溶液、エマルジョン、およびシロップであり、上記製剤は、一般的に用いられる水や流動パラフィンなどの簡単な希釈剤に加えて、湿潤剤、甘味料、香料、および防腐剤などの様々な賦形剤を含有し得る。

本発明の医薬組成物の効果的な用量は、体重、年齢、性別、健康状態、食習慣、投与頻度、投与方法、排泄および疾患の重症度にしたがって決定することができる。経口投与の場合には、医薬組成物は、成人（６０ｋｇ）に対して、１日あたり１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは、１日あたり１ｍｇ〜１ｇで投与することができる。当業者には、用量は様々な条件に依存して変化し得るため、用量は、追加しても、減じてもよく、したがって、用量によっては決して本発明の範囲を限定することはできない。

投与頻度は、望ましい範囲内で、１日に１回または１日に２〜３回であり、投与期間は特に限定されない。

本発明はまた、神経変性疾患の抑制および改善のための健康機能食品サプリメントであって、活性成分としてｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを含む、前記サプリメントをも提供する。

上記リガンドが、Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２）、Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号３）、Ｔｒｐ−Ａｌａ（配列番号４）、Ｔｙｒ−Ａｌａ（配列番号５）、Ｒ−１１（配列番号６）、Ｗ−１１（配列番号７）、Ｒ−ＢｉＰ（配列番号８）、およびＲ−ＢｉＰＤ（配列番号９）からなる群から選択される。上記リガンドの活性成分は、Ｎｔ−Ａｒｇ（式１）、Ｎｔ−Ｐｈｅ（式２）、Ｎｔ−Ｔｒｐ（式３）、およびＮｔ−Ｔｙｒ（式４）からなる群から選択される、Ｎ末端残基である。

上記リガンドは、ｐ６２−ＺＺ１（式５）またはｐ６２−ＺＺ２（式６；ＮＣＩ３１４９５３）である。

本発明の化合物を含有することができる食品の種類は、限定されないが、健康食品の生産に適用可能なほぼすべてのあらゆる食品が含まれ得る。

本発明の化合物は、そのままで加えることができ、または、慣用の方法にしたがって、他の食品成分と混合して加えることもできる。活性成分の混合比は、使用の目的（抑制または健康増進）にしたがって、調整され得る。一般には、健康食品または飲料を生産するためには、本発明の化合物は、好ましくは０．１〜９０重量部で加えられる。しかしながら、健康および衛生のためまたは健康状態を制御するために、長期投与が必要である場合には、含有量は、上記よりも少なくてもよいが、化合物は極めて安全であることが証明されているので、より高い含有量もまた許容され得る。

本発明の健康飲料のための組成物は、化合物に加えて、他の飲料のように、様々なフレーバーまたは天然の炭水化物を追加的に含んでもよい。上記の天然の炭水化物は、ブドウ糖および果糖などの単糖類、マルトースおよび蔗糖などの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトールおよびエリスリトールなどの糖アルコール類の１種であってもよい。さらに、甘味料としては、天然甘味料（タウマチン、ステビア抽出物、例えば、レバウジオシドＡ、グリシリジン等）、および合成甘味料（サッカリン、アスパルテート等）が含まれ得る。天然の炭水化物の含有量は、組成物１００ｍｌ中、好ましくは、１〜２０ｇ、およびより好ましくは５〜１０ｇである。

上記成分に加えて、本発明の健康食品組成物は、様々な栄養素、ビタミン、ミネラル（電解質）、天然フレーバーおよび合成フレーバーを含むフレーバー、着色料、および増量剤（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定剤、殺菌剤、グリセリン、アルコール、ソーダに加えるのに用いられる炭酸ガス（carbonator）等を含んでもよい。本発明の健康食品組成物はまた、野菜飲料に加えることができる天然の果汁、果物飲料および／または果肉を含んでもよい。

全ての上記成分は、単一で加えてもよく、一緒に加えてもよい。これらの成分の混合比は、実際には問題とならないが、一般的には、本発明の化合物１００重量部あたりそれぞれ０．１〜２０重量部で加えることができる。

したがって、本発明のｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドは、ｐ６２のオリゴマー化および凝集体形成を誘導することができるため、これを用いてオートファジーを制御することにより、神経変性疾患の抑制および改善のための健康食品サプリメントとして効果的に用いることができる。

加えて、本発明は、ｐ６２ ＺＺドメインまたはｐ６２タンパク質に結合するリガンドで細胞を処理するステップを含む方法であって、リガンドをｐ６２ ＺＺドメインに結合させることにより、ｐ６２のオリゴマー化を誘導するための；ｐ６２とＬＣ３との間の結合を増加させるステップを含む、ｐ６２の活性を増加させるための；ｐ６２ ＺＺドメインにリガンドを結合させることによりオートファゴソームへの６６２の輸送を増加させるための；ｐ６２ ＺＺドメインにリガンドを結合させることにより、オートファジーの活性化を誘導するための；ｐ６２ ＺＺドメインにリガンドを結合させることにより、フォールドされていないタンパク質凝集体をオートファゴソームへ送達するため；ならびに、ｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドを用いてオートファジーを活性化させることによって、ミスフォールドタンパク質凝集体のリソソームを介した分解を増加させるための、前記方法を提供する。

したがって、本発明のｐ６２ ＺＺドメインに結合するリガンドは、ｐ６２のオリゴマー化および凝集体形成を誘導することができるため、これを用いてオートファジーを制御することにより、神経変性疾患の抑制および処置のために効果的に用いることができる。

本発明の実際的で代表的な好ましい態様は、下記例に示されるように説明される。
しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、本発明の意図および範囲を逸脱することなく改変および改善し得ることが理解されるであろう。

例１：ｐ６２の新規Ｎ−レコグニンとしての同定
Ｎ−デグロンに結合する新規Ｎ−レコグニンを同定するため、Ｎ−末端にＮ−デグロンを付加うすることにより、ペプチドを合成した。次いで、ラット組織抽出物中で、合成されたペプチドに結合し得るタンパク質の種類を調べた。

特に、ｉＴＲＡＱ（（アイソバリックタグ相対および絶対定量法））に関連してＸ−ペプチドプルダウンアッセイおよび質量分析を行った。Ｎ−末端則相互作用タンパク質として、ラット精巣抽出物を用い、ストレプトアビジンビーズに固定したビオチンラベルしたＸ−ペプチド（Ｒ１１配列：ＲＩＦＳＴＩＥＧＲＴＹ（タイプ１））、Ｆ１１配列（ＦＩＦＳＴＩＥＧＲＴＹ（タイプ２）、およびＶ１１（安定化されたコントロール）（ＶＩＦＳＴＩＥＧＲＴＹ）も用いた（図５ａおよびｄ）。Ｘ−ペプチドに連結された１０−ｍｅｒリンカーは、Ｎ−末端則の基質であるシンドビスウイルスポリメラーゼｎｓＰ４に由来した。混合物を５×ＰＢＳで希釈した後、４℃で一晩培養した。各Ｘ−ペプチドを用いることによってプルダウンされたタンパク質は、ｉＴＲＡＱにより異なる蛍光色素でラベルした。Ｍａｓｃｏｔスコアに基づき、約２００種のタンパク質が同定されたが、これには、Ｎ−末端則経路に関与する、哺乳類ＵＢＲボックスＥ３ファミリー、ＵＲＢ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ４、およびＵＢＲ５が含まれていた。

結果は、Ｘ−ペプチドプルダウンアッセイ後のイムノブロッティングにより確認された（図５ｅ−ｉ）。ＵＢＲ１は、Ｒ１１およびＦ１１プルダウンアッセイの両方において観察された。ＵＢＲ２は、Ｆ１１プルダウンアッセイにおいてのみ観察された。ＵＢＲ４およびＵＢＲ５は、Ｒ１１アッセイにおいて観察された。Ｖ１１（安定化されたコントロール）プルダウンアッセイの結果として、ＵＢＲタンパク質は沈降しなかった。ＵＢＲ Ｅ３リガーゼに加えて、Ｒ１１沈降サンプルにおいて質量分析によって同定されたタンパク質は、セクエストソーム１（ｐ６２）タンパク質であった。

図５ｃにおいて示されるように、銀染色ゲルのＲ１１プルダウンサンプルにおいては６２ｋＤａ周辺領域に強いバンドが観察されたが、このバンドは、ネガティブコントロールであるＶ１１プルダウンサンプルにおいては観察されなかった。質量分析の結果によれば、バンドはｐ６２／ｓｑｓｔｍ１（以後、ｐ６２という）であることが確認された（図５ｃ）。上記の実験結果から、ｐ６２が新規Ｎ−レコグニンであることが確認された。

例２：Ｎｔ−Ａｒｇ、Ｎｔ−Ｐｈｅ、Ｎｔ−Ｔｒｐ、およびＮｔ−Ｔｙｒに結合することができるＮ−レコグニンとしてのｐ６２の同定
例＜１−１＞におけるｐ６２タンパク質をより明確に同定するため、以下の実験を行った。

特に、ヒトｐ６２のアミノ酸１〜４４０に対応する全長組み換えタンパク質により産生されたマウスモノクローナルｐ６２抗体（１：５００、ab56416, Abcam, Cambridge, UK）を用いてウェスタンブロッティングを行った。結果として、図５ｄに示されるように、インビトロ転写および翻訳されたｐ６２は、Ｒ１１ペプチドに対して特異的に強い結合親和性を示したが、Ｆ１１ペプチドに対しては弱い結合親和性を示し、Ｖ１１ペプチドに対しては有意な結合を示さなかった（図５ｄ）。Ｒ１１ペプチドは、本明細書の実験に用いられた濃度に基づき、少なくとも４０％の効率でｐ６２を沈殿させることができるが、一方で、Ｆ１１ペプチドは、５％の効率であった。この結果は、ジペプチド競合アッセイにより確認された。ＲＡペプチド（Ａｒｇ−Ａｌａ）は、ｐ６２の結合において、極めて効果的にＲ１１ペプチドと競合した。次に効率的な競合ペプチドは、もう一つのタイプ１Ｎ−末端則ペプチドである、ＨＡ（Ｈｉｓ−Ａｌａ）であった（図５ｈおよびｉ）。タイプ２ペプチドでは、ＷＡ（Ｔｒｐ−Ａｌａ）が効率的であったが、ＦＡ（Ｐｈｅ−Ａｌａ）は効率的でなかった。ＡＲを用いた競合アッセイの結果から、ＲＡ、ＨＡおよびＷＡは、Ｎ−末端則に特異的であることが確認された。上記結果は、ｐ６２がタイプ１およびタイプ２Ｎ−末端則ペプチドの両方に結合できることを意味する。

ｐ６２のＮ−末端残基への結合特異性を直接決定するため、Ｘ−ペプチドプルダウン法を用いることにより、様々なＮ−末端残基を有するペプチドとのｐ６２の結合を調べた。

結果として、図５ｈにおいて示されるように、ｐ６２は、三種類のＮ−末端則Ｎ−末端残基Ｒ１１、Ｈ１１、およびＫ１１に結合できることが確認された（図５ｈ）。また、ｐ６２は、Ｒ１１ペプチドに強く結合し、Ｋ１１に中程度に結合し、Ｈ１１に弱く結合することも確認された。内在性ｐ６２もまた、４種のＮ−末端則Ｎ−末端残基のうちの３種であるＦ１１、Ｗ１１およびＹ１１に結合し、Ｌ１１に結合しなかった（図５ｈ）。
Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）およびＬｙｓ（Ｋ）は、正電荷を持つ側鎖を有し、一方で、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）およびＴｙｒ（Ｙ）は、芳香族側鎖を有する。ｐ６２に結合するアミノ酸の特徴から、ｐ６２は、正に荷電しているかまたは、芳香族側鎖を好む可能性があることが確認された。ｐ６２は、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＧｌｙ（Ｇ）などの疎水性側鎖を有するアミノ酸、ならびにＡｓｐ（Ｄ）などの負に電荷している側鎖を有するアミノ段を好まなかった。上記結果は、ｐ６２が、Ｎｔ−Ａｒｇ、Ｎｔ−Ｔｒｐ、Ｎｔ−Ｐｈｅ、およびＮｔ−Ｔｙｒに選択的に結合することを意味する。

例３：ｐ６２のＮｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｐｈｅに対する結合力の評価
ｐ６２のＮｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｐｈｅに対する結合定数を決定するために以下の実験を行った。

特に、大腸菌においてｐ６２−Ｄ３−ＧＳＴを発現させた後、純度５０％で精製した。ビオチンラベルしたＸ−ペプチドを、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore）を用いて、ストレプトアビジンコートしたチップに固定し、次いでｐ６２−Ｄ３−ＧＳＴタンパク質を固定したペプチドに挿入した。

結果として、図６において示されるように、ｐ６２−Ｄ３−ＧＳＴは、Ｒ１１ペプチドに強く結合し、Ｆ１１に弱く結合し、Ｖ１１には結合しなかった（図６）。Ｒ１１およびＦ１１のＫｄ値は、それぞれ４４ｎＭおよび３．４μＭであった。特に、ｐ６２のＮｔ−Ａｒｇに対する結合力は、ＵＢＲボックスを含むＮ−レコグニンに対する結合力（Ｋｄ，３．２μＭ）よりも約５０倍も高かった。この結果は、ｐ６２が新規薬剤のターゲットであることを意味する。

例４：ｐ６２ ＺＺドメインに対するＮｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｐｈｅの直接結合
Ｎｔ−Ａｒｇが結合するｐ６２の位置を調べるため、一連のｐ６２の欠失変異体（Ｄ１〜Ｄ８）を構築し、Ｒ１１およびＷ１１に対するこれらの結合を、例１に記載されているのと同じ方法によるＸ−ペプチドプルダウンアッセイによって確認した。

特に、Ｄ１〜Ｄ４は、一連のｐ６２Ｃ−末端欠失変異体である。Ｄ５〜Ｄ８は、一連のｐ６２Ｎ−末端欠失変異体である。Ｎｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｔｒｐは、ＺＺドメインを含むＤ２、Ｄ３、Ｄ４、およびＤ５に結合したが、ＺＺドメインを含まないＤ１、Ｄ６、およびＤ７には結合しなかった（図７ａ−ｂ）。ｐ６２のＮｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｔｒｐとの結合領域をさらに正確に調べるため、ｐ６２ Ｄ３Ｃ−末端において欠失変異体を作製し、そのＮ−末端則Ｎ−末端との結合をＸ−ペプチドプルダウンアッセイにより調べた（図７ｃ）。全部で９種のｐ６２欠失変異体のうち、ＣＤ１〜ＣＤ６がＮｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｔｒｐと結合した（図７ｄ）。ＺＺドメインのジンクフィンガーモチーフ構造である、２個のヒスチジン残基がないＣＤ７由来の変異体は、これには結合しなかった。Ｎ−末端の最小ＺＺドメインは、Ｘ−ペプチドプルダウンアッセイにより決定された（図７e）。全長ｐ６２のＰＢ１ドメインから始まってＺＺドメインの真ん中領域までの領域において、６種のＮ−末端変異体を構築した。ＮＤ−１、ＮＤ−２、ＮＤ−３、およびＮＤ−４はＮｔ−Ａｒｇに結合したが、ＮＤ−５およびＮＤ−６はこれに結合しなかった（図７ｆ）。ＮＤ５は、ＵＢＲボックスにおいて保存されている非定型二核Ｚｎ−フィンガーの要素である、システイン残基（Ｃ１２８）およびアスパラギン酸（Ｄ１２９）を含まない。ＺＺドメインがないｐ６２変異体は、Ｎｔ−Ａｒｇに結合することができなかった（図７ｇ−ｈ）。ＺＺドメイン（＃８３〜１７５）のみを含むフラグメントが、Ｎｔ−Ａｒｇに結合することができたが、Ｄ１２９Ａ変異体は、これに結合することができなかった（図７ｉ−ｊ）。上記結果は、Ｎｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｔｒｐが、ｐ６２ ＺＺドメインに結合することを意味する。

Ｎｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｔｒｐのｐ６２への結合が、Ｎ−末端則によるものであるかどうかを調べるため、ｐ６２（１−４４０）のＤ１２９、Ｄ１４２＿１４５、Ｄ１４７＿１４９、Ｄ１５１＿１５４、Ｈ１６０＿１６３およびＥ１７７をアラニンにより置換することにより構築し、Ｘ−ペプチドプルダウンアッセイを行った。ＺＺドメイン変異体は、Ｎｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｔｒｐに結合することができなかった（図７ｋ）。上記結果は、ＺＺドメインおよびＵＢＲボックスが、Ｎ−末端則を介してＮｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｔｒｐに結合することを意味する。ＣｙｓおよびＨｉｓ残基は構造的要素として作用し、アスパラギン酸は、Ｎ−デグロンの認識において重要な役割を果たす。以前に記載したように、上記結果は、Ｎ−末端則Ｎ−末端に基づくｐ６２ ＺＺドメインの結合特性は、ＵＢＲボックスの結合特性を類似していることを意味し、これはまた、ＺＺドメインが、構造においてＵＢＲボックスと類似していることを意味する。Ｘ−ペプチドがｐ６２に結合する際、Ｎｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−ＴｒｐなどのＮ−末端残基は、Ｎ−リガンドの活性成分である。

例５：ｐ６２ ＺＺドメインのＵＢＲ Ｎ−レコグニンＵＢＲボックスとの構造的および機能的相同性
ＵＢＲボックスは、ＵＢＲ１〜ＵＢＲ７として指定されているＮ−末端則Ｅ３ファミリーに存在する基質認識ドメインである７０残基から構成されている。ｐ６２ ＺＺドメインの一次配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いることにより、種々の生物に由来するＵＢＲ Ｅ３リガーゼのＵＢＲ領域配列と比較した。

結果として、ｐ６２ ＺＺドメインは、構造においてＵＢＲボックスと類似していることが確認された（図７ｌ）。ＵＢＲボックスの典型的なＣ２Ｈ２ジンクフィンガーフォールドは、ｐ６２ ＺＺドメインにおいてもよく保存されていた。加えて、ＵＢＲボックスの非定型二核Ｚｎ−フィンガーフォールドは、ｐ６２ ＺＺドメインにおいて部分的に保存されていた。ＵＢＲ領域は、３つのよく保存されたアスパラギン酸（Ｄ１１８、Ｄ１５０およびＤ１５３）を含んでいたが、これは、基質のＮ−末端則Ｎ−末端残基への結合に必要であった。ｐ６２ ＺＺドメインもまた、Ｄ１２９、Ｄ１４７およびＤ１４９を含む３つのアスパラギン酸残基を含んでいた。ＺＺドメインのＤ１４７のみが、ＵＢＲボックスにおいて保存されていた（Ｄ１１８）。これら３つの負に荷電した（酸性）アスパラギン酸残基は、ＵＢＲボックスにおいてそうであるように、Ｎ−末端則Ｎ−末端残基への結合に必須であることが証明された。上記結果は、ｐ６２が正に荷電した（塩基性）側鎖への結合を好むことを証明した前記のプルダウンアッセイの結果と一致していた。Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー構造および３つのアスパラギン酸残基に加えて、３つの同一（赤い）残基（Ｙ１４０、Ｄ１４７およびＬ１５０）がＺＺドメインにおいて観察され、２つの同一残基（Ｇ１７３およびＷ１８４）ならびに１つの保存された（赤い）残基（Ｅ１７７）がＺＺドメインの外側に観察された（図２ｂ）

例６：Ｎ−リガンドＡｒｇ−Ａｌａにより誘導される、ｐ６２の自己オリゴマー化および凝集体形成
Ｎ−リガンドＡｒｇ−Ａｌａが、ｐ６２ ＺＺドメインへ結合することにより、ｐ６２の自己オリゴマー化および凝集体形成を誘導することができるかどうかを調べるため、全長ｐ６２を発現させたＨＥＫ２９３細胞溶解物を用いてインビトロオリゴマー化アッセイを行い、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図８）。

ＨＥＫ２９３細胞はｐ６２−ｍｙｃ／ｈｉｓを発現するＤＮＡプラスミドを形質導入した。２４時間後、細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＫＣｌ、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤）で溶解し、次いで２回の低温−解凍サイクルを行った。細胞懸濁液は、１時間、氷中で培養した後、４℃で１３，０００ｘｇにて２０分間遠心した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによりタンパク質濃度を測定した。ｐ６２オリゴマー化実験においては、１μｇのｐ６２タンパク質を、１００μＭのベスタチン存在下において室温で、（最終濃度０．５または１．０Ｍで水に溶解した）ジペプチドと一緒にまたはジペプチド無しで、培養した。サンプルは、４％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を含有する非還元ローディングバッファーと混合し、９５℃で１０分間加熱した後、ＳＤＳ電気泳動を行った。ｐ６２のモノマー、オリゴマー、および凝集体は、ｐ６２およびｍｙｃ抗体の混合物を用いて検出した。Ａｒｇ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−ＡｌａおよびＨｉｓ−Ａｌａ（タイプ１）；Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｔｒｐ−ＡｌａおよびＴｙｒ−Ａｌａ（タイプ２）；ならびにＡｌａ−ＡｒｇおよびＡｌａ−Ｐｈｅ（安定化）などの様々なペプチドは、溶解液中で培養され、ｍｙｃ／ｐ６２抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。

結果として、図８ａにおいて示される通り、これらのペプチドのうち、Ｎｔ−Ａｒｇを含むＡｒｇ−Ａｌａのみが、特異的なｐ６２のオリゴマー化および凝集体形成を誘導することができた（図８ａ−ｃａ）。この結果は、Ｎ−リガンドＡｒｇ−Ａｌａが、ｐ６２の自己オリゴマー化および凝集体形成を誘導することを意味する。

ｐ６２のＰＢ１ドメインが、ｐ６２の凝集体形成に関与しているかどうかを調べるため、Ｄ６９Ａ変異体の凝集能を評価した。結果として、Ｄ６９Ａ変異体は、Ｎｔ−Ａｒｇに結合したが、Ａｒｇ−Ａｌａは、ｐ６２変異体凝集体の形成を誘導しなかった（図８ｅ）。

例７：ＺＺドメインは、Ａｒｇ−Ａｌａにより誘導されるｐ６２のオリゴマー化に必須である
ｐ６２のオリゴマー化を誘導するために、ＺＺドメインがＡｒｇ−Ａｌａへ結合することが必要かどうかを調べるため、Ａｒｇ−１１ペプチドに結合することができないｐ６２ ＺＺ変異体を用いてｐ６２オリゴマー化アッセイを行った。

結果として、図８ｄにおいて示される通り、野生型ｐ６２は、効果的にオリゴマー化／凝集したのに対し、ＺＺ変異体はしなかった（図８ｄ）。この結果は、Ａｒｇ−ＡｌａがＺＺドメインに結合することによりｐ６２のオリゴマー化を誘導することを意味する。

例８：Ａｒｇ−Ａｌａにより誘導されるｐ６２およびＬＣ３の間の結合増加
ｐ６２のオリゴマー化は、まずオートファゴソーム開始部位へのｐ６２の送達が必要とされ、次いでＬＣ３とｐ６２のオリゴマーとの相互作用を介して、自己小胞体の膜へ導入される（Itakura et al., 2011）。ｐ６２のＬＣ３への結合におけるＡｒｇ−Ａｌａの効果を確認するため、ＥＬＩＳＡを行った（図８ｆ−ｈ）。

ｐ６２ＫＯマウス胎仔繊維芽細胞に全長ｐ６２およびｐ６２変異体を形質導入した。２４時間後、細胞を溶解バッファーで溶解した後、４℃にて１３０００ｒｐｍで遠心した。細胞溶解液（２０μｇ）を、タイプ１およびタイプ２ジペプチドを室温で１．５時間培養したＧＳＨでコートされたプレートに固定されたＧＳＴタグが付いたＬＣ３組み換えタンパク質（Enzo lifescience, BML-UW1155）と培養した。ｐ６２結合体は、抗ｐ６２抗体（SC-28359, Santa Cruz）と室温で１時間培養した。ＨＲＰ結合２次抗体を４５分間培養した後、検出した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質（Priece, 34021）をプレートの各ウェルに加え、これを室温で１０分間暗室において色素変化を誘導した。ＴＭＢ停止溶液である２ＮＨ_２ＳＯ_４をこれに加え、次いでＯＤ_４５０を測定した。

結果として、図８ｆにおいて示される通り、種々のペプチドのうち、Ａｒｇ−Ａｌａがｐ６２とＬＣ３との結合を増強する唯一のペプチドであった。例えば、１２９Ａ、Ｃ１４２／１４５Ａ、Ｄ１４７／１４９Ａ、Ｃ１５１／１５４Ａ、Ｈ１６０／１６３ＡおよびＺＺ ｄｅｌといったｐ６２ ＺＺ変異体、ならびに例えば、Ｄ５６ＡといったＰＢ１変異体は、ＬＣ３と結合しなかった（図８ｇおよびｈ）。したがって、上記結果から、Ａｒｇ−Ａｌａはｐ６２ ＺＺドメインと結合して立体構造変化を誘導し、ＰＢ１ドメインを介してｐ６２凝集体を活性化し、ＬＩＲドメインを介してｐ６２−ＬＣ３相互結合を誘導することが確認された。図８ｉは、ｐ６２の不活性化形態と活性化形態とを説明する図である。

例９：Ｎ−末端アルギニル化を介してＮｔ−Ａｒｇを得る小胞体タンパク質の同定
ｐ６２ ＺＺドメインの生理的Ｎ−リガンドであるＮｔ−Ａｒｇは、ＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼによるＮ−末端アルギニル化を介して生成されるため、小胞体タンパク質のＮ−末端配列を、バイオインフォマティクスを用いて調べた。

結果として、Ｎｔ−ＡｒｇおよびＮｔ−Ｇｌｕは、Ｎ−末端分解経路（Ｎ−末端則経路）に基づいてＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼによるアルギニル化のための基質として作用することが確認され；ならびにしたがって、Ｎｔ−ＡｒｇがＮ−リガンドとして機能する可能性が確認された（図１０ａ）。バイオインフォマティクス技術を用いることにより、Ｎｔ−ＡｓｐまたはＮｔ−Ｇｌｕおよびアミノ酸Ｌ−Ａｒｇを含むＢｉＰ、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＧＲＰ９４およびＥＲｄＪ５などの多数の小胞体シャペロンが、アルギニル化を媒介するＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼにより得られた（図９）。

例１０：Ｎ−末端アルギニル化ＢｉＰ、ＣＲＴおよびＰＤＩ亜集団特異的抗体の構築
Ｎ−末端アルギニル化ＢｉＰ（Ｒ−ＢｉＰ）、カルレティキュリン（Ｒ−ＣＲＴ）、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｒ−ＰＤＩ）を特異的に認識する抗体を構築するため、ＲＥＥＥＤＫＫＥＤＶＧ（Ｒ−ＢｉＰ）、ＲＥＰＡＶＹＦＫＥＱ（Ｒ−ＣＲＴ）、およびＲＤＡＰＥＥＥＤＨＶＬ（Ｒ−ＰＤＩ）などのこれらＮ−末端アルギニル化タンパク質のＮ−末端に対応するペプチドを合成した。これらのペプチドをウサギに接種し、抗体血清を得た。抗体はＩｇＧクロマトグラフィーにより精製した。抗体群は、非特異的抗体を除くために、リガンドとしてＥＥＥＤＫＫＥＤＶＧＣ、ＥＰＡＶＹＦＫＥＱ、およびＤＡＰＥＥＥＤＨＶＬなどの非アルギニル化ペプチドを用いたクロマトグラフィーに通した。最後に、アルギニル化特異的抗体は、リガンドとしてＲＥＥＥＤＫＫＥＤＶＧＣ（Ｒ−ＢｉＰ）、ＲＥＰＡＶＹＦＫＥＱ（Ｒ−ＣＲＴ）、およびＲＤＡＰＥＥＥＤＨＶＬ（Ｒ−ＰＤＩ）などのアルギニル化ペプチドを用いたクロマトグラフィーに通すことにより精製した（図１０ｂ）。

例１１：ＢｉＰ、ＣＲＴ、およびＰＤＩの、ＡＴＥ１を介したＮ−末端アルギニル化
ＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼイソメラーゼを過剰発現させ、次いでＲ−ＢｉＰ形成をＲ−ＢｉＰ抗体を用いて調べた（図１０ｄ）。ｓｉＲＮＡを用いてＡＴＥ１をノックダウンした場合、Ｒ−ＢｉＰの形成は減少した（図１０ｅ）。さらに、Ｕｂ−Ｘ−ＢｉＰフラグ（Ｘ＝ＧｌｕまたはＶａｌ）を過剰発現させて、アルギニル化を調べた（図１１ａ）。Ｕｂ−Ｘ−ＢｉＰ−フラグは、翻訳と同時に脱ユビキチン化酵素によりＵｂとＸ−ＢｉＰ−フラグに変換される。組み換えタンパク質を用いることで、Ｘ−ＢｉＰのＮｔ−Ｇｌｕ１９は、アルギニル化される残基であることが明らかになった（図１１ａ）。

もう一つの組み換えタンパク質であるＵｂ−Ｘ−ＢｉＰ−ｍｙｃ／ｈｉｓコンストラクトも作製した（図１１ｂ）。ここでＸには、Ａｒｇ１８、Ｇｌｕ１９、またはＶａｌ１９が含まれていた。コンストラクトは、ＥＲシグナルを含まないため、細胞質に留まった。いったんユビキチンが、ユビキチン加水分解酵素により除去されると、Ｎ−末端領域が露出する。このコンストラクトを用いることで、Ｘ−ＢｉＰはＮｔ−Ｇｌｕ１９がアルギニル化された（図１１ｃ）。Ｒ−ＢｉＰは、ＡＴＥ１ノックアウト細胞においては生成されなかった（図１１ｄ）。ＥＲストレスを引き起こすタプシガルジンを用いた実験によって、Ｒ−ＢｉＰはＥＲストレスによって生成するのではなく、ＡＴＥ１ Ｒ−トランスフェラーゼにより誘導される酵素反応の生成物として生成することが確認された（図１１ｅ）。細胞分画によって調べたところ、生成されたＲ−ＢｉＰは大量に細胞質に移動した（図１１ｆ）。シクロヘキシミドタンパク質分解法により調べたところ、細胞質中の移動したＲ−ＢｉＰは、小胞体中の非アルギニル化ＢｉＰと比べて、相対的に分解されていなかった（図１１ｇ）。これは、Ｒ−ＢｉＰがオートファジーに移行する実験結果と一致する。これらの結果は、ＢｉＰが細胞質に移動すると、ＢｉＰのＮ−末端Ｎｔ−Ｇｌｕ１９がＡＴＥ１によりアルギニル化されることを意味する。

ＣＲＴおよびＰＤＩもまたＡＴＥ１によるアルギニル化を受けるかどうかを調べた。結果として、ＡＴＥ１アイソザイムを過剰発現させた場合には、Ｒ−ＣＲＴおよびＲ−ＰＤＩが生成されることが確認された（図１１ｈ）。これらの結果は、ＢｉＰ、ＣＲＴ、およびＰＤＩに加えて、多数の小胞体シャペロンならびに他のタンパク質が、ＡＴＥ１を介したＮ−末端アルギニル化により修飾され得ることを意味する。

例１２：細胞質における外来ＤＮＡにより誘導されるＲ−ＢｉＰ生成
Ｒ−ＢｉＰ生成の原因を調べるため、小胞体タンパク質のＮ−末端アルギニル化を引き起こし得るストレスを種々の方法で調べた。

結果として、図１２において示される通り、Ｒ−ＢｉＰの生成は、細胞質に二重らせんＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が導入された場合に特異的に誘導された（図１２ａおよびｂ）。Ｒ−ＢｉＰに加えて、Ｒ−ＣＲＴ生成もまた、細胞質にｄｓＤＮＡが導入された場合に特異的に誘導された（図１２ｂおよびｃ）。細胞質へのＢｉＰの移行およびその引き続くＲ−ＢｉＰへのアルギニル化が、細胞質のｄｓＤＮＡにより誘導されることが、細胞分画法を用いて観察された（図１２ｄ）。Ｒ−ＢｉＰ、Ｒ−ＣＲＴ、およびＰ−ＰＤＩは、ＤＮＡを含む病原体（ウイルスまたは細菌）を模倣するポリ（ｄＡ：ｄＴ）を用いることで、侵襲ＤＮＡに対する先天性の免疫反応の一部として生成されることが確認された（図１２ｅ−ｇ）。侵襲ＤＮＡはまた、オートファジー活性化を引き起こした（図１２ｂおよびｆ）。

例１３：Ｒ−ＢｉＰのｐ６２を伴ったオートファゴソームへの輸送
Ｒ−ＢｉＰおよびｐ６２のオートファゴソームへの同時輸送を観察するため、免疫染色を行った。

結果として、図１３において示される通り、細胞質のＲ−ＢｉＰは、細胞構造のように斑点になって集結することが確認された（図１３ａ）。Ｒ−ＢｉＰの斑点は、ｐ６２の斑点と共局在しており（図１３ａおよびｃ）、またＬＣ３とも共局在していた（図１３ｂ−ｄ）。また、ＢｉＰは、マウス胎仔心臓においてはＬＣ３陽性オートファゴソームに移行することが確認された（図１３ｅ）。ｓｉＲＮＡを用いてＡＴＥ１またはＢｉＰをノックダウンすると、Ｒ−ＢｉＰはオートファゴソームに移動することができなくなった（図１３ｆ−ｈ）。ｐ６２がノックアウトされた場合にも、同様の結果が観察された（図１３ｆ−ｈ）。これらの結果は、細胞質のＲ−ＢｉＰが、ｐ６２を介してオートファゴソームに移行し、最終的にリソソームにより分解されることを意味する。

例１４：Ｎｔ−ＡｒｇはＲ−ＢｉＰのオートファゴソームへの送達に必要である
細胞においてＵｂ−Ｘ−ＢｉＰ−ＧＦＰ組み換えタンパク質（Ｘ＝Ａｒｇ、Ｇｌｕ、またはＶａｌ）を過剰発現することによりＸ−ＢｉＰ−ＧＦＰを生成し（図１４ａ）、その移動を調べるため、免疫染色を行った。Ｒ−ＢＩＰは、オートファゴソームに移行した（図１４ｃ）。一方、Ｖａｌ−ＢｉＰ（アルギニル化の基質としては用いることができないようにＮｔ−Ｇｌｕ１９がＶａｌで置換されている）は、Ｎｔ−Ａｒｇがないためにオートファゴソームに移行しなかった（図１４ｃ）。ＬＣ３の斑点と比較すると、Ｒ−ＢｉＰの細胞内局在は、ＬＣ３のそれと一致していた（図１４ｄ）。ＢｉＰタンパク質のもう一つの領域がオートファジーのターゲティングに影響を与えることができるので、ＢｉＰのほとんどの領域が除去され１９〜１２４の範囲の残基配列のみが残っているＵｂ−Ｘ−ＢｉＰ^Δ（図１４ａ）を過剰発現させた。ついで、ＢｉＰ^Δの細胞内局在を調べるため、免疫染色を行った（図１４ｅ）。結果として、ｐ６２＋／＋細胞においてはＲ−ＢｉＰ^Δは斑点を形成し、オートファゴソームに移動することが確認された（図１４ｅ）。正常にオートファゴソームに移動できるようにｐ６２＋／＋細胞においてアルギニル化され得るＥ−ＢｉＰ^Δは、ｐ６２−／−細胞においてオートファゴソーム移動しなかった（図１４ｅ）。Ｘ−ＢｉＰおよびＬＣ３の細胞内局在は、免疫染色により調べた。結果は、上記と一致していた（図１４ｆ）。したがって、これらの結果により、ＢｉＰまたは他の小胞体タンパク質が細胞質に移行すると、（ミスフォールドタンパク質または他の基質に結合した後に）アルギニル化され、翻訳後修飾により生成されるＮｔ−Ａｒｇが、ｐ６２ ＺＺドメインに結合するためのＮ−リガンドとして作用することが確認された。

例１５：Ｒ−ＢｉＰ Ｎｔ−Ａｒｇのｐ６２ ＺＺドメインへの直接結合
Ｒ−ＢｉＰ Ｎｔ−Ａｒｇがｐ６２ ＺＺドメインに結合し得るかどうかを調べるため、Ｘ−ペプチドプルダウンアッセイを行った（図１５ａおよびｂ）。

結果として、図１５において示される通り、Ｒ−ＢｉＰペプチドは、細胞抽出物中でｐ６２をプルダウンしたが、Ｅ−ＢｉＰまたはＶ−ＢｉＰはしなかった（図１５ｃおよびｄ）。Ｎｔ−Ａｒｇがｐ６２のどこに結合するかを調べるため、ｐ６２欠失変異体を作製した（図１５ｅ）。これらのｐ６２変異体とＲ−ＢｉＰペプチドとを用いてプルダウンアッセイを行った。結果として、Ｒ−ＢｉＰ Ｎｔ−Ａｒｇは、ｐ６２ ＺＺドメインに対してのみ結合することができた（図１５ｆ）。

Ｒ−ＢｉＰとｐ６２ ＺＺドメインとの間の結合を確認するため、ｐ６２ ＺＺドメインのみの変異体をｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＧＳＴおよびｐ６２−ＺＺ（Ｄ１２９Ａ）８３−１７５と名付け、ＧＳＴプルダウンアッセイを行った（図１５ｇ）。ＺＺ８３−１７５は、Ａｒｇ１８−Ｂｉｐ１９−６５４をプルダウンすることができたが、Ｖａｌ１９−Ｂｉｐ１９−６５４をプルダウンしなかった。ＺＺ変異体であるＺＺ（Ｄ１２９Ａ）８３−１７５は、Ａｒｇ−ＢｉＰ１８−６５４またはＶａｌ−ＢｉＰ１９−６５４のいずれもプルダウンすることができなかった。したがって、機能的ｐ６２ ＺＺドメインは、アルギニル化されたＢｉｐおよびｐ６２のＮ−末端則依存的な相互作用に必要であることが確認された（図１５ｈ）。

ｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＲＦＰおよびユビキチン−Ｘ−Ｂｉｐ１９−１２４−ＧＦＰをＭＥＦ細胞において共発現させた場合、Ａｒｇ１８−Ｂｉｐ１９−１２４は、斑点形成を示してｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＲＦＰと共局在したが、一方で、Ｖａｌ１９−Ｂｉｐ１９−１２４−ＧＦＰは、ｐ６２−ＺＺ８３−１７５−ＲＦＰと共局在せず、斑点形成もしなかった（図１５ｉ）。

例１６：オートファジーによるＲ−ＢｉＰのＰ６２依存的分解
Ｒ−ＢｉＰがｐ６２を介したオートファジーにより分解されるかどうかを調べるため、Ｕｂ−Ｘ−ＢｉＰ^Δ−ＧＳＴを構築し、次いでｐ６２＋／＋およびｐ６２−／−細胞において過剰発現させた（図１６ａ）。

結果として、図１６において示される通り、Ｒ−ＢｉＰは、Ｖ−ＢｉＰと比較して、ｐ６２＋／＋細胞においては容易に分解されたが、ｐ６２−／−細胞においては、分解されずにその代わりに蓄積された（図１６ａおよびｂ）。その一方、Ｖ−ＢｉＰは、ｐ６２＋／＋およびｐ６２−／−細胞の両方において分解されずに蓄積した（図１６ａおよびｂ）。ヒドロキシクロロキン（オートファジー阻害剤）を用いた場合には、Ｒ−ＢｉＰは、分解されずに蓄積された（図１６ａおよびｂ）。Ｒ−ＢｉＰは、オートファジー欠損ＡＴＧ５−／−細胞においては、分解されずに蓄積した（図１６ｃ）。Ｕｂ−Ｒ−ＢｉＰ−ｍｙｃ／ｈｉｓを用い、シクロヘキシミドタンパク質分解定量アッセイを行った。結果として、Ｒ−ＢｉＰは、ＡＴＧ５−／−細胞において極めて安定していることが確認された（図１６ｄおよびｅ）。上記結果は、Ｒ−ＢｉＰが、ｐ６２によりリソソームに送達された後、その中で分解されることを意味する。

例１７：細胞質中のユビキチン化タンパク質によるＲ−ＢｉＰの誘導
Ｒ−ＢｉＰを誘導するストレスの種類を調べるため、細胞を種々の化学物質で処理し、イムノブロッティングを行ってＲ−ＢｉＰの形成を調べた。

結果として、Ｒ−ＢｉＰの形成は、一般的にプロテアソーム阻害剤により誘導された（図１７ｃ）。Ｒ−ＢｉＰの形成が誘導される場合、それは、ユビキチンが結合した細胞内タンパク質と一緒に蓄積された（図１７ｃ）。この現象はまた、細胞がポリ（ｄＡ：ｄＴ）と処理した場合にも観察された（図１７ｃ）。それらのユビキチン化された細胞内タンパク質の一部は、斑点を形成し、ｐ６２集団（ｐ６２由来のタンパク質がオートファゴソームに移行する前に凝集体の形態として一時的に存在する構造物）に送達された。ここで、Ｒ−ＢｉＰとｐ６２は共局在していた（図１７ｂ）。これらの上記結果は、細胞質に蓄積されたミスフォールドタンパク質が、ユビキチン化されてオートファゴソームに送達されることを意味する。加えて、プロテアソーム阻害剤およびポリ（ｄＡ：ｄＴ）は、小胞体シャペロンを誘導し、これらのシャペロンのＮ−末端アルギニル化が生じる細胞質へ移動させた。細胞質中のＲ−ＢｉＰは、ユビキチン化タンパク質と一緒にｐ６２集団へ移行させた。

例１８：Ｒ−ＢｉＰは細胞質中でミスフォールドタンパク質と結合し、それらをオートファジーに送達する
細胞をゲルデナマイシン（Ｈｓｐ９０阻害剤）で処理し、細胞内ミスフォールドタンパク質の形成を促進した。

結果として、Ｒ−ＢｉＰの形成が誘導されることが確認された（図１７ｆ）。自己フォールドして変性するモデル基質であるＹＦＰ−ＣＬ１を過剰発現した場合、これはＲ−ＢｉＰに直接結合した（図１７ｇ）。免疫蛍光染色を行って、ＹＦＰ−ＣＬ１が、Ｒ−ＢｉＰおよびｐ６２が共局在するオートファジー小胞に送達されることを確認した（図１７ｈおよびｉ）。これらの結果は、Ｒ−ＢｉＰが細胞質中で蓄積されたミスフォールドタンパク質に結合し、ｐ６２と一緒にオートファゴソームに移行することを意味する。

図１において示される通り、ミスフォールドタンパク質とその凝集体が細胞質に蓄積すると、それらは小胞体にシグナルを送り、次いでＢｉＰ、ＣＲＴ、およびＰＤＩなどの種々のシャペロンが細胞質に移動し、ここでそれらはＡＴＥ１によるＮ−末端アルギニル化を受け、Ｎｔ−Ａｒｇを生成する。これらのシャペロンは、そのＮｔ−Ａｒｇリガンドを介してｐ６２ ＺＺドメインに結合する一方で、ミスフォールドタンパク質にも結合する。Ｎｔ−ＡｒｇリガンドがＺＺドメインに結合する際、ｐ６２は、閉じた構造から開いた構造に変化する。結果的に、ｐ６２のＰＢ１ドメイン（オリゴマー化を媒介する）が露出し、ｐ６２が自己オリゴマー化して、ミスフォールドタンパク質であるＲ−ＢｉＰを伴ったｐ６２集団を形成する。ｐ６２のＬＣ３結合ドメインはまた、露出して、オートファゴソーム膜上で突出したＬＣ３との結合を加速させた。結果として、ミスフォールドタンパク質−Ｒ−ＢｉＰ−ｐ６２は、凝集体複合体の形態でオートファゴソームに送達され、その後、リソソームタンパク質分解により分解された。

実験例１：低分子量化合物ｐ６２−ＺＺ１によるｐ６２オリゴマー化およびＬＣ３結合の増加
ｐ６２ ＺＺドメインリガンドをさらに同定するために、研究を行って、Ｎ−末端則リガンドであるＮｔ−Ｔｒｐに対して構造的類似性を有する小化合物２−（（３，４−ビス（ベンジルオキシ）ベンジル）アミノ）エタン−１−オール塩酸塩（ＺＺ−Ｌ１と名付けた；式５）および１−（３，４−ビス（ベンジルオキシ）フェノキシ）−３−（イソプロピルアミノ）−２−プロパノール（ＺＺ−Ｌ２と名付けた；式６）が、ｐ６２活性、特に、オリゴマー化およびオートファジー活性を促進することを確認した。ＺＺ−Ｌ２は、NCI314953として知られている物質である。これらの低分子量化合物は、Ａｒｇ−ＡｌａよりもむしろＰｈｅ−ＡｌａまたはＴｒｐ−Ａｌａに対して構造的類似性を有するため、ＺＺドメインのタイプ２結合サブドメインに結合する。

Ａｒｇ−Ａｌａのようなこれら低分子化合物がｐ６２ ＺＺドメインに結合する際、ｐ６２のオリゴマー化および活性化が増加するかどうかを調べた。

インビトロオリゴマー化アッセイを行い、用量依存的なｐ６２の凝集を測定した（０、１０、１００、および１，０００μＭ）。

結果として、図１８において示される通り、Ａｒｇ−Ａｌａのように、ＺＺ−Ｌ１はｐ６２の凝集を用量依存的に誘導した（図１８ａおよびｂ）。また、Ａｒｇ−Ａｌａを用いてｐ６２／ＬＣ３結合を調べるための実験に用いられたのと同じ方法により、ＺＺ−Ｌ１がｐ６２を活性化させることができるかどうかも調べた。結果として、ＺＺ−Ｌ１は、ｐ６２のＬＣ３との結合を用量依存的に増加させることができた（０、１０、２５、１００、５００、および１０００μＭ）（図１８ｃ）。したがって、ＺＺ−Ｌ１は、ｐ６２ ＺＺドメインへ結合することにより、Ａｒｇ−Ａｌａのそれと同様のパターンで、ｐ６２の構造的活性化を誘導することができることが確認された。

また、ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２がｐ６２の斑点形成を媒介することを調べるため、免疫蛍光共焦点顕微鏡法を行った（図１８ｄ−ｇ）。特に、カバースリップ上に層をなしたＨｅＬａ細胞を、ＸＩＥ ＺＺ化合物により異なる濃度（０、１、２．５、５、および１０μＭ）で１２時間処理し（図１８ｆおよびｇ）、またはＸＩＥ ＺＺ化合物１０μＭにより異なる処理時間（０、１、３、６、および１２時間）で処理した（図１８ｅ）。結果として、ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２は、ｐ６２の斑点形成を、１２時間、用量依存的に（０、１、５、および１０μＭ）誘導することができ、または１０μＭの濃度で時間依存的に（１、３、６、および１２時間）誘導することができた（図１８ｄ−ｇ）。

実験例２：ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２による細胞内オートファゴソーム形成の増加
ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２のオートファジーにおける効果を調べるため、ウェスタンブロッティングを行った。

結果として、ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２はＬＣ３を用量依存的（０、１、５、および１０μＭ）および時間依存的（１、３、６、および１２時間）に増加させ、また、ＬＣ３−１（不活性化形態）のＬＣ３−ＩＩ（活性化形態）への変換をも増加させた（図１９ｂ）。免疫蛍光染色を用いることにより、ＺＺリガンドは、ＨｅＬａ細胞においてｐ６２オートファジー斑点の形成のみならず、ＬＣ３オートファジー斑点の形成をも促進することもまた確認された（図１９ａ）。これらの結果は、ＺＺリガンドがオートファジー活性化剤として機能することを意味する。

これらの化合物により誘導されるＬＣ３タンパク質の増加およびＬＣ３−ＩＩの形成が、ｐ６２に起因するかどうかもまた調べた。ｐ６２ノックダウンを誘導するために、６ウェルプレート上のＨｅＬａ細胞（１ｘ１０^６／ウェル）を、ＲＮＡｉ Ｍａｘ ｒｅａｇｅｎｔ（Invitrogen）を用いることによりｐ６２ｓｉＲＮＡ ４０ｎＭで処理した。この際、ｓｉＲＮＡコントロール群もまたこれらで処理した。ＤＭＳＯまたはＺＺ化合物５ｍＭは３または６時間培養した。

結果として、ＬＣ３の増加およびＬＣ３−ＩＩの形成は、ＺＺ化合物であるＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２により誘導された。しかしながら、この効果は、ｐ６２ノックダウンにより完全に抑制された（図１９ｃ）。ｐ６２＋／＋およびｐ６２−／−細胞を用いたもう一つの実験においては、ＺＺ−Ｌ１（５ｍＭ）は、ｐ６２−／−細胞においてオートファジー活性化剤として機能することができなかった（図１９ｄ）。上記結果は、Ａｒｇ−Ａｌａのように、ＺＺ化合物がｐ６２ ＺＺドメインに結合することで、ｐ６２ ＰＢ１ドメインを介したｐ６２凝集およびさらなるオートファゴソーム形成が増加することを意味する。

実験例３：ＺＺリガンドによるオートファジーフラックス（ｆｌｕｘ）の増加
ＺＺリガンド処理により誘導されるＬＣ３合成およびＬＣ３−ＩＩ形成の増加は、オートファゴソーム形成におけるオートファジーフラックスの上流（主要因子の合成および翻訳）または下流（オートファゴソームおよびリソソームの融合またはリソソームおける分解プロセス）のいずれかの活性化に起因することができた。ＺＺリガンドで処理した細胞においてオートファジーフラックスが正常であるかどうかを調べるため、細胞をまたオートファジー阻害剤で処理した。次いで、ＬＣ３レベルを測定するため、イムノブロッティングを行った。リソソーム分解阻害剤として作用するＮＨ_４Ｃｌ（Sigma, A9434）、バフィロマイシンＡ１（Sigma, B1793）、およびヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）（Sigma, H0915）を用いることにより、オートファジーフラックスアッセイを行った（図１９ｅ）。細胞をＸＩＥ ＺＺ化合物で３時間処理し、これにオートファゴソーム阻害剤を処理してさらに３時間培養した。細胞溶解液を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＬＣ３−ＩＩバンドの強度は、ｉｍａｇｅＪを用いて測定した。ＬＣ３−ＩＩ形成の増加は、ＧＡＰＤＨで正規化して計算した。

結果として、ＸＩＥ ＺＺ化合物を処理した後でさえも、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）によるオートファジー阻害は、少なくとも２倍高いＬＣ３−ＩＩの蓄積を含むオートファジー動態を増加させた（図１９ｅ）。上記結果は、ＺＺリガンドがＬＣ３のようなオートファジー主要因子の合成を増加させ、その結果、オートファゴソームの形成を増加させ、生成されたオートファゴソームをリソソームに正常に結合させて、それによって、そこに送達された基質を分解した（ｐ６２、Ｒ−ＢｉＰ、フォールドされていないタンパク質等）ことを意味する（図１９ｇ）。

実験例４：ＺＺリガンドにより誘導されたオートファゴソームのリソソームとの誘導
ＺＺリガンドにより誘導されたオートファゴソームがリソソームに送達されるかどうかを調べるため、その中に酸感受性ＧＦＰおよび非感受性ＲＦＰを組み合わせたＲＦＰ−ＧＦＰ−ＬＣ３を安定的に形質導入したＨｅＬａ細胞を用いる実験において用いられたのと同じ方法で、オートファジー動態アッセイを行った。

結果として、ＺＺ−Ｌ１およびＺＺ−Ｌ２は、ＲＦＰ＋ＧＦＰ＋オートファゴソーム形成（中性ｐＨ）を加速させることが確認され、同時に、ＧＦＰ＋シグナルは、ＲＦＰ＋斑点の一部から消失することも確認された（図１９ｆ）。これは、ＲＦＰ＋ＧＦＰ＋オートファゴソームとリソソームが融合してオートリソソーム（酸性ｐＨ）を形成する際、酸感受性ＧＦＰ蛍光が、酸性環境下で消失したためである。上記結果は、ＺＺリガンドにより形成されるオートファゴソームが、リソソームへ送達されるのに成功して、その中で分解されたことを意味する（図１９ｇ）。

ｐ６２の細胞内濃度を直接的に測定したが、これはＺＺリガンドにより誘導されるオートファジーフラックスを調べるためのもう一つの方法である。ＨｅＬａ細胞をＺＺ−Ｌ１で処理して、シクロヘキシミドタンパク質分解アッセイを行った。結果として、ｐ６２の分解は、ＺＺ−Ｌ１により誘導されることが確認された（図２０ａ）。これらの結果は、ＺＺリガンドと組み合わせたｐ６２が、オートファジー活性化因子として作用することを意味する。

実験例５：ＺＺリガンドと組み合わせたｐ６２よる、ｍＴＯＲ非依存的なオートファジー活性化
これまで知られている最も代表的なオートファジー活性化剤は、ラパマイシンである。ラパマイシンは、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的）阻害剤である［参考文献］。ｍＴＯＲがラパマイシンにより阻害されると、ＵＬＫやベクリンなどのオートファジー関連主要因子が活性化され、それによりＬＣ３の合成およびＬＣ３−ＩＩの変換が誘導され、オートファゴソーム生成の増加をもたらす（図２０ｄ）。オートファジー活性化剤としてのラパマイシンの効果ゆえに、治療剤としてのその価値は高い。しかしながら、ｍＴＯＲを介した広範囲な生物学的効果などの副作用のために治療剤としての使用は未だ限定されている。したがって、ｍＴＯＲを介さない新規オートファジー活性化剤の開発が緊急に必要とされている。

オートファジー活性化剤としてのＺＺリガンドおよびラパマイシンの効果とメカニズムを比較するため、ＨｅＬａ細胞を、それらにより異なる濃度および異なる時間で処理した。次いで、ＬＣ３の生成およびＬＣ３−ＩＩの変換を調べた。

結果として、ＺＺリガンドはラパマイシンと同様の効率かまたはラパマイシンよりも優れた効率を有することが確認された（図２０ｂおよびｃ）。

ＺＺリガンドがｍＴＯＲを介してオートファジーを活性化することができるかどうか調べるため、ＨｅＬａ細胞をＺＺリガンドまたはラパマイシンで処理し、ｍＴＯＲにより制御されるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を調べた（図２０ｄ）。予測された通り、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は、ｍＴＯＲを抑制することにより、ラパマイシンによって阻害されたが、ＺＺリガンドは、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を阻害しなかった（図２０ｅ）。この結果は、ＺＺリガンドが、従来のラパマイシンとは違って、ｍＴＯＲを経ることなくオートファジーを活性化し得ることを意味する。したがって、ＺＺリガンドは、新規オートファジー活性化剤であることが確認された。

実験例６：細胞内ユビキチンにより標的とされるタンパク質の、ＺＺリガンドによるオートファジーへの輸送
細胞内のミスフォールドタンパク質は、最初にユビキチン化の標的となり、次いでプロテアソームにより分解される。ミスフォールドタンパク質が凝集体化する条件下（例:変異ハンチントンタンパク質）では、プロテアソーム活性が減少しているか、またはミスフォールドタンパク質がプロテアソームに入ることができないため、ミスフォールドタンパク質はオートファジーにより集結され、ついでリソソームにより分解される。ＺＺリガンドがオートファジーフラックスを増加させる結果に基づき、ＺＺリガンドがユビキチン化された細胞内タンパク質のオートファジーへの輸送を増加させることができるかどうかを免疫染色により調べた。

結果として、ＺＺ−Ｌ１ ５ｍＭは、ユビキチン化されたタンパク質のオートファジー小胞への移動を誘導することが確認された（図２０ｆ）。オートファジー阻害剤であるヒドロキシクロロキンをそれに処理すると、ユビキチン化されたタンパク質は、オートファジー小胞に蓄積した（図２０ｆ）。これらの結果は、ＺＺリガンドがオートファジーにおける細胞内ミスフォールドタンパク質の蓄積を促進することを意味する。

実験例７：ＺＺリガンドによるハンチントンタンパク質凝集体の除去
ハンチントン病において観察されるハンチントンは、ＣＡＧコドンの過剰な繰り返し（少なくとも３６リピート）のためにミスフォールドされやすいのみならず、凝集体（凝集塊）に迅速に変換されることから、タンパク質はユビキチン−プロテアソーム系により分解されないことが示唆される（図２１ａ）。ラパマイシンを用いてオートファジーの活性化を誘導することによりそのような変異タンパク質を除去する技術が開発されたとしても、ラパマイシンは、ｍＴＯＲを介する様々な生物学的経路に影響を与えるため、治療剤としては適切でない。ＺＺリガンドがｍＴＯＲを経ることなしにオートファジーを活性化することを考慮し、ＺＺリガンドがハンチントンタンパク質凝集体を除去することができるかどうかを調べた。

野生型ハンチントン（ＨＤＱ２５−ＧＦＰ）および変異ハンチントン（ＨＤＱ１０３−ＧＦＰ；ＣＡＧが１０３回繰り返す）をＨｅＬａ細胞に発現させ、免疫染色により観察した。結果として、ＨＤＱ２５−ＧＦＰは細胞全体に分布したのに対し、ＨＤＱ１０３−ＧＦＰは、タンパク質凝集体として集結した（図２１ｃ）。ハンチントンタンパク質を過剰発現させた細胞を、ＺＺ−Ｌ１ １０ｍＭまたはラパマイシン１ｍＭで処理した後、ドットブロットアッセイを行って、細胞内ハンチントンタンパク質を調べた。結果として、ＺＺ−１は、変異ハンチントンタンパク質凝集体をより効率的に除去した（図２１ｂ）。同様の実験を設定し、ここで細胞は、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に溶解することができる可溶性画分と（凝集体を含む）不溶性画分とに分けた後、免疫ブロッティングを行った。結果として、ハンチントンタンパク質は、ＺＺ−Ｌ１により処理された凝集体画分からより効率的に除去された（図２１ｄ）。これにラパマイシンを処理した場合、同様の結果が得られた（図２１ｄ）。ＨｅＬａ細胞をＺＺ−Ｌ１、ＺＺ−Ｌ２、およびラパマイシンで処理し、その結果を上記結果と比較した（図２１ｅ）。結果として、この結果は上記と一致していた。

ハンチントンタンパク質凝集体の除去が、ＺＺリガンドにより誘導されるオートファジー活性化に起因するかどうかを調べるため、ＡＴＧ５＋／＋およびＡＴＧ５−／−細胞（ＡＴＧ５非存在下ではオートファゴソームは形成されない）をＺＺリガンド１０ｍＭおよびラパマイシン１ｍＭで処理し、イムノブロッティングを行った。ＡＴＧ５＋／＋細胞においては、ＺＺリガンドによりハンチントン凝集体は効率的に除去されたのに対し、ＡＴＧ５−／−細胞においては、そのような効果は観察されなかった（図２１ｆ）。上記結果は、ＺＺリガンドが、オートファジー活性化を誘導することにより、ハンチントンタンパク質凝集体を除去することができることを意味する。

ハンチントン凝集体を除去するＺＺリガンドのメカニズムを調べるため、ＨＤＱ１０３−ＧＦＰタンパク質凝集体を過剰発現したＨｅＬａ細胞を、ＺＺリガンド１０ｍＭで処理した後、免疫蛍光染色を行った。ＺＺ−Ｌ１で処理していない細胞においては、ＨＤＱ１０３−ＧＦＰは、封入体を形成した。この構造内では、ｐ６２はＲ−ＢｉＰと共局在していた（図２２ａおよびｂ）。ＺＺ−Ｌ１で処理した細胞においては、ハンチントン封入体は減少したか、または効率的に除去されていた（図２２ａ−ｃ）。上記結果から、ＺＺリガンドは、オートファジーを活性化して、ミスフォールドタンパク質凝集体を効率的に除去することが確認された。

当業者は、前述の記載において開示された概念および特定の態様が、本発明と同じ目的を実施するために改変するまたは他の態様を設計するための基礎として、容易に用い得ることを理解するであろう。当業者はまた、そのような同等である態様が、添付の特許請求の範囲に記載の発明の意図および範囲から逸脱しないことも理解するであろう。

Claims (7)

1. 活性成分として下記式６により表される化合物またはその薬学的に許容し得る塩を含む、神経変性疾患の抑制および処置のための医薬組成物。
   ［式６］
   
2. 化合物が、ｐ６２タンパク質のＺＺドメインに結合し、ｐ６２タンパク質は、配列番号１により表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ＺＺドメインが、配列番号１により表されるｐ６２タンパク質のアミノ酸配列の１２８〜１６３残基を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 組成物が、Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号２）、Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号３）、Ｔｒｐ−Ａｌａ（配列番号４）、Ｔｙｒ−Ａｌａ（配列番号５）、Ｒ−１１（配列番号６）、Ｗ−１１（配列番号７）、Ｒ−ＢｉＰ（配列番号８）、およびＲ−ＢｉＰＤ（配列番号９）からなる群から選択される1種以上のペプチドをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 化合物が、ｐ６２ ＺＺドメインに結合して、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインおよびＬｌＲドメインを活性化し、ｐ６２のオリゴマー化および凝集体形成の誘導をもたらす、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 化合物が、ｐ６２の凝集体形成を誘導することにより、オートファゴソーム生成を促進する、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、プリオン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ライムボレリア症、致死性家族性不眠症、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、認知症、てんかん、脳卒中、ピック病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。