WO2020022783A1 - 신규한 p62 리간드 화합물, 이를 포함하는 단백질이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a novel p62 ligand compound, a pharmaceutical or food composition for the prophylaxis or treatment of proteolytic disorders comprising the same.
  • N-end rule pathway is a proteolytic system that uses a specific protein N-terminus as a degradation signal (FIG. 1).
  • N-endrule degradation signals include base residues having N-terminal arginine (Nt-Arg), lysine (Nt-Lys) and histidine (Nt-His) of type 1, and phenylalanine (Nt-Phe) and leucine of type 2 (Nt-Leu), tryptophan (Nt-Trp), tyrosine (Nt-Tyr) and isoleucine (Nt-Ile).
  • N-terminal residues are bound to ligands (N-ligand business cards) of certain N-recognins (N-recognin).
  • N-recognins namely UBR1, UBR2, UBR4, and UBR5
  • UBR box As a substrate recognition domain
  • the UBR box binds type-1 N-endrule ligands (Nt-Arg, Nt-Lys, Nt-His) such as N-terminal Arg residues to recognize the substrate and attaches the ubiquitin chain to the substrate.
  • UBR1 and UBR2 also have N-domains, which play an important role in binding to type-2 N-endrule ligands (Nt-Trp, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Leu, Nt-Ile) (Sriram, SM, Kim, BY & Kwon, YT, Nat Rev Mol Cell Biol 12, 735-47 (2011)).
  • Nt-Trp, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Leu, Nt-Ile type-2 N-endrule ligands
  • Ubiquitinylated substrates produced by the binding of N-recognin with N-end rule ligands are delivered to the proteasome and degraded into short peptides.
  • Nt-Arg Nt-His, Nt-Lys, Nt-Trp, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Leu, Nt-Leu
  • It is a necessary determinant for binding because it provides most of the hydrogen bonds required for targeting rule substrates (Sriram, SM & Kwon, YT, Nat Struct Mol Biol 17, 1164-5 (2010)).
  • Ubiquitin ligase is a poorly foldable protein that can be misfolded and left unfolded for long periods of time to become a cytotoxic substance, such as clogged proteasomes or other cellular functions. It is digested by delivery to the proteasome by ubiquitination (Ji, CH & Kwon, YT, Mol Cells 40, 441-449 (2017)). In normal cells, this process is smooth, minimizing the damage caused by denatured protein, while neuronal cells in the elderly slow down the process, accumulating ubiquitinated denatured proteins, and these excess protein debris are converted back into coagulants (Ciechanover). , A. & Kwon, YT, Exp Mol Med 47, e147 (2015)).
  • neuronal cells of patients with degenerative brain diseases such as Huntington's disease, Parkinson's disease, human mad cow disease, and Lou Gehrig's disease, among protein abnormalities, have strong properties that certain mutant proteins are transformed into coagulants and are not decomposed by the proteasome described above. Because the proteasome has a narrow inner diameter of about 13 angstroms, the denatured protein must be unfolded because it will not be released when the protein coagulates.
  • autophagy along with the ubiquitin-proteasome system, is a major intracellular proteolytic system.
  • Autophagy is an essential proteolytic process for maintaining cellular homeostasis and genetic stability by degrading aged or dysfunctional organelles and damaged or poorly folded proteins (Ji, CH & Kwon, YT, Mol Cells 40, 441-449 (2017)). In particular, if denatured protein coagulant accumulates in the cytoplasm, it becomes a cytotoxic substance, and thus autophagy should be received and decomposed.
  • the mechanism of autophagy is largely divided into macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy, and for non-selective autophagy depending on the purpose of decomposing the intracellular matrix for purposes. (bulk autophagy) and selective autophagy (Dikic, I. & Elazar, Z., Nat Rev Mol Cell Biol 19, 349-364 (2016)). Dual-selective autophages and chaperone-mediated autophages cause selective degradation of organ dysfunction or unnecessary proteins in cells. By inducing selective autophagy, the development of new therapies for diseases based on malignant etiological protein accumulation and dysfunctional organelles is currently establishing a new paradigm.
  • the p62 / SQSTM1 / Sequestosome-1 protein is important for initiation of autophagosome formation and delivery of contents, which are mediators of selective autophagy mechanisms.
  • p62 / SQRSM1 / Sequestosome-1 binds to the denatured protein and its coagulant and delivers them to the autophagosome.
  • p62 undergoes self-oligomerization (Ji and Kwon, Mol Cells 40, 441-449 (2017)).
  • the denatured protein is concentrated together to reduce the volume and easy decomposition by autophagy.
  • the core technology of the present invention is to provide a method for effectively removing the denatured protein or its coagulator, which is the cause of abnormal protein disease. To this end, it is necessary to activate only selective autophages rather than activating non-selective autophages that have a wide range of effects on various biological pathways.
  • the mTOR inhibitor that normally inhibits nonlinear autophagy is mTOR.
  • the most widely used method of activating autophagy with mTOR inhibitors is the most widely used (Jung, CH, Ro, SH, Cao, J., Otto, NM). & Kim, DH, FEBS Lett 584, 1287-95 (2010)).
  • the rapamycin removes amyloid beta (Ab) and tau from the AD animal model that overexpresses APP and enhances cognition (Caccamo, A., Majumder, S., Richardson, A). , Strong, R.
  • mTOR plays a very important role in a wide variety of intracellular pathways such as NF-kB, and thus, mTOR is known to be a drug target despite its excellent activity in eliminating denatured protein coagulants of proteolytic diseases. There are limitations to using autophagy actives as therapeutics.
  • mTOR inhibitor which is the most used compound, has a disadvantage of being unsuitable as a therapeutic agent because it plays a wide range of roles in controlling overall gene expression in cells against stimulation from various external environments. Therefore, there is a need to develop a method for removing denatured protein coagulators by activating p62, a key regulator of selective autophagy, without lowering the activity of mTOR, a nonselective autophagy regulator.
  • the present inventors have repeatedly tried to develop a prophylactic and therapeutic agent for proteinopathy using a material that activates autophagy in an mTOR-independent manner.
  • p62 more specifically, the ZZ of p62 Ligands that bind to the domain bind to LC3 and activate autophagy to effectively eliminate the pathological aggregates of proteins such as mutant huntingtin and alpha synuclein, thereby preventing, ameliorating or treating various proteolytic disorders. It was confirmed that it could be used to complete the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for enhancing macroautophage activity through p62 protein using the novel compound.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical or food composition for preventing, ameliorating or treating proteolytic disorders comprising the novel compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a novel compound that acts as a ligand of the p62 protein.
  • the novel p62 ligand according to the invention binds to the ZZ domain of the p62 protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating protein disorders, such as neurodegenerative diseases, or a health functional food for preventing or improving protein disorders, containing a ligand binding to the ZZ domain of p62 protein as an active ingredient. do.
  • the present invention also provides a method of inducing p62 oligomerization and structural activation comprising the steps of treating a cell or p62 protein with a ligand that binds the ZZ domain of p62, and (2) enhancing the binding of p62 to LC3.
  • the present invention provides a technique for removing a denatured protein coagulant which is a causative agent of degenerative brain disease by activating p62 which delivers a denatured protein coagulant directly to an autophagosome.
  • a key technique in the present invention is to effectively remove the denatured protein coagulation causing degenerative brain disease by activating p62 and autophagy simultaneously.
  • FIG. 1 Mechanisms of action and key techniques of the present invention are summarized in FIG. 1.
  • the main pathogens of proteolytic disorders such as mutant huntingtin or alpha synuclein are transformed into insoluble in water (misfolded) and then tangled with each other to grow into oligomeric form of coagulum.
  • These metamorphisms act as cytotoxic substances in neurons, grow larger, grow into large oligomers or fibrillar coagulants, and ultimately form an inclusion body.
  • endoplasmic reticulum chaperones (1) generate large amounts of Nt-Arg through N-terminal argination (2) by ATE1 R-transferase, and then arginated BiP (R-BiP).
  • Nt-Arg of R-BiP binds to the ZZ domain of p62 as a ligand.
  • the binding usually leads to the activation of structural activation by changing the closed inactive form of p62 into an open form (4), thereby exposing the PB1 and LC3-binding domains.
  • This activation results in the formation of oligomers and high molecular weight aggregates due to the disulfide bond of p62 (5) and the increased binding to the autophagosome marker LC3 (6).
  • p62 coupled with N-terminal arginine migrates to the endoplasmic reticulum and increases intracellular autophagy by activating (7) autophagosome biogenesis mediated by PI3P (8).
  • p62 is the first-in-class target of the autophagy activator proposed by the present inventors (FIGS. 1 and 8).
  • p62 as a drug target for coagulation removal in modified protein diseases such as autophagy activator development or degenerative brain disease.
  • Autophagy is a mechanism that acts to break down or recycle unwanted or functioning cellular components in a cell, and in the presence of nutrients or energy deficiencies, it can work for the production of metabolites for energy or biosynthetic processes.
  • the mechanism of autophagy is largely divided into macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy, and for non-selective autophagy depending on the purpose of decomposing the intracellular matrix for purposes. It is divided into bulk autophagy and selective autophagy. Dual-selective autophages and chaperone-mediated autophages cause selective degradation of organ dysfunction or unnecessary proteins in cells.
  • p62 protein is important for initiation of autophagosome formation and delivery of contents, which are mediators of selective autophagy mechanisms.
  • Significant p62 activation of the novel p62 ligands according to the present invention was observed to cause self oligomerization of p62.
  • the increased autophagosome targeting of p62 through this self oligomerization is evidence that the novel p62 ligands according to the present invention can induce targeting and degradation of p62 protein by intracellular autophagy.
  • PROTAC PROteolysis Targeting Chimera
  • PROTAC PROteolysis Targeting Chimera
  • the existing disease paradigm is protein enzyme inhibition, it is very important to develop new therapeutic agents for untargetable proteins.
  • PROTEC is an attractive new therapeutic development method that enables selective degradation of proteins that cannot be targeted by existing enzyme inhibition methods under the ubiquitin-proteasome system.
  • protec is limited to only the ubiquitin-proteasome system by utilizing only ligands that recognize the E3 ubiquitin enzyme, and thus has a problem regarding folding of the denatured protein in the aforementioned proteasome system.
  • novel p62 ligands according to the present invention can not only induce intracellular autophagy but also induce autophagosome targeting of cargo substrate proteins interacting with p62, thus making existing enzyme inhibition schemes.
  • novel therapeutics may be provided that allow for the selective degradation of autophagy mechanisms of untargetable proteins.
  • novel compound according to the present invention acts as a ligand that binds to the ZZ domain of p62 protein to increase the delivery of p62 as an autophagosome to activate autophagy to remove denatured protein coagulants, preventing various protein abnormalities, Have utility as ameliorating and therapeutic agents.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing that proteins arginated by the N-terminal law bind to p62 ZZ domain and decompose intracellular substances such as proteins through intracellular autophagy activity.
  • Figure 2 shows the p62 ligand compound (YOK-1104, YOK-2204, YOK-3304, YOK-1204, YOK-4404, YOK-1107, YOK-1109, YOK-2207, YOK according to the present invention using immunoblotting) -2209, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-6-2, YT-6-7, YT-6-8, YT-9-1 and YT-9-2 ) Has the effect of increasing p62 protein oligomerization activity.
  • Figure 3 is a result showing the efficacy of the p62 ligand compounds (YOK-1107, YOK-4404, 3301, 3302, YOK-1104) according to the present invention to increase the autophagy activity using the immunoblotting method.
  • Figure 4 shows the efficacy of the p62 ligand compounds (YOK-1106, YOK-1107, YOK-1204, YOK-1304, YOK-2204, YOK-4404) according to the present invention to increase the autophagy activity using the immunoblotting method Showing results.
  • FIG. 5 shows that the control compounds (1101, 1102, 1103, 1201, 1202, 1203, 1301, 1302, YTK-1105-1, 4402, 1401, 1402, 2201, 2202) enhance autophagy activity using immunoblotting. The result shows that you don't want to.
  • 6a and b are p62 ligand compounds (YOK-1106, YOK-1204, YOK-1504, YOK-2204, YOK-3304, YOK-4404) according to the present invention using immunofluorescence staining to activate and oligomer p62 protein The result is confirmed that it shows the efficacy to increase the autophagy activity and then delivered to the autophagosome.
  • a control compound (YOK-A-1104, YOK-G-1104, YTK-1005, YTK-1105-1) using the immunofluorescence staining method after activating and oligomerizing the p62 protein and delivered to the autopagosome At the same time, the results confirm that the effect of increasing the autophagy activity.
  • Figures 8a, b and 9a, b is a result showing the target protein autophagy delivery efficacy using immunofluorescence staining method.
  • FK2 FIGS. 8A and 8B
  • HuntingtinQ103-GFP FIGS. 9A and 9B
  • each group used in this specification is explained in full detail. Unless otherwise specified, each group has the following definitions.
  • halogen examples include fluoro, chloro, bromo and iodo.
  • alkyl refers to a straight or branched aliphatic saturated hydrocarbon group, preferably alkyl having 1 to 6 carbon atoms, more preferably alkyl having 1 to 4 carbon atoms.
  • alkyls are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, 1,1-dimethyl Butyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl and 2-ethylbutyl.
  • the present invention relates to a compound represented by Formula 1, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, solvate, hydrate or prodrug thereof:
  • W is C6-C10 aryl
  • L is -O- (CH 2 ) n 1 -CH (OH)-, provided that O in -O- (CH 2 ) n 1 -CH (OH)-is bonded to the benzene ring, wherein n 1 is 1 to 4 Is an integer of;
  • n is an integer from 0 to 2;
  • R a is R 1 or -OR 1 ,
  • R 1 is hydrogen or- (CH 2 ) n 2 -R ' 1 ,
  • R ' 1 is unsubstituted; Or phenyl substituted with hydroxy, halogen, C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy, nitro, amino, (C 1-4 alkyl) amino, or di (C 1-4 alkyl) amino
  • n2 is an integer from 1 to 6;
  • R b is -OR 2 ,
  • R 2 is H, or - a (CH 2) n3 -R '2 ,
  • R ' 2 is unsubstituted; Or phenyl substituted with hydroxy, halogen, C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy, nitro, amino, (C 1-4 alkyl) amino, or di (C 1-4 alkyl) amino,
  • n3 is an integer from 1 to 6;
  • n4 is an integer of 2 to 4
  • n5 is an integer of 1 to 4,
  • R 3 is hydrogen, or C 1-4 alkyl
  • R 4 is hydrogen, or C 1-4 alkyl
  • W may be phenyl
  • n1 may be 1 or 2.
  • R a may be hydrogen or —O— (CH 2 ) n 2 —R ′ 1 .
  • R ' 1 is unsubstituted; Or phenyl substituted with hydroxy, fluoro, chloro, bromo, methyl, ethyl, methoxy, ethoxy, nitro, amino or dimethylamino.
  • n2 may be an integer of 1 to 4.
  • the R b may be hydroxy, or -O- (CH 2) n3 -R ' 2.
  • R ' 2 is unsubstituted; Or phenyl substituted with hydroxy, fluoro, chloro, bromo, methyl, ethyl, methoxy, ethoxy, nitro, amino or dimethylamino.
  • n3 may be an integer of 1 to 4.
  • n4 may be an integer of 2 to 3.
  • n5 may be an integer of 1 to 3.
  • R 4 may be hydrogen or methyl.
  • the compound of the present invention may exist in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salts acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid are useful.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a compound having a relatively nontoxic and harmless effect on a patient, wherein the side effects caused by the salt do not reduce the beneficial efficacy of the compound represented by the formulas (1) to (3). Any of the organic or inorganic addition salts.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethylether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethylether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • organic acids and inorganic acids may be used as the free acid
  • hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid
  • methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, and maleic acid may be used as the organic acid.
  • maleic acid succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid (gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid, etc. It is not limited to these.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal salts or alkaline earth metal salts are obtained by, for example, dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium, or calcium salt, but is not limited thereto.
  • Corresponding silver salts can also be obtained by reacting an alkali or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention include salts of acidic or basic groups which may be present in the compounds of Formula 1 unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate , Dihydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts, and the like. It can be prepared through the method.
  • Salts of the compounds of formula (I) of the present invention are pharmaceutically acceptable salts, for example, due to autophagy of intracellular neurodegenerative diseases and tumor-associated proteins with ligands of p62 which exhibit the same pharmacological activity as compounds of formula (I).
  • Any salt of a compound of Formula 1 capable of inducing degradation and preventing or treating neurodegenerative diseases can be used without limitation.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 according to the present invention includes not only pharmaceutically acceptable salts thereof, but also solvates such as possible hydrates and all possible stereoisomers which can be prepared therefrom. All stereoisomers of the present invention, including enantiomeric and diastereomeric forms, (eg those that may be present due to asymmetric carbon in various substituents) are included within the scope of the present invention. Individual stereoisomers of the compounds of the invention may be, for example, free of substantially other isomers (eg, as pure or substantially pure optical isomers having a specific activity), or for example as racemates or It can be mixed with all other, or other selected stereoisomers.
  • the chiral center of the compounds of the present invention may have an S or R structure as defined by the IUPAC 1974 Recommendations. Racemic forms can be analyzed by physical methods such as separation by chiral column chromatography or separation or crystallization of diastereomeric derivatives, fractional shape crystallization. Individual optical isomers can be obtained from the racemate by any suitable method including, but not limited to, salt formation with an optically active acid followed by crystallization.
  • Solvates and stereoisomers of the compound represented by Formula 1 may be prepared from the compound represented by Formula 1 using methods known in the art.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 according to the present invention may be prepared in crystalline form or in amorphous form, and when prepared in crystalline form, may be optionally hydrated or solvated.
  • a compound containing various amounts of water as well as stoichiometric hydrate of the compound represented by Formula 1 may be included.
  • Solvates of the compounds represented by Formula 1 according to the present invention include both stoichiometric and non stoichiometric solvates.
  • the compound of Formula 1 according to the present invention may be prepared by the same method as in Schemes 1 to 5, which is an exemplary method, and specific examples thereof are the same as those described in the following Examples.
  • the production method of the present invention can be used by purchasing a commercially available compound as it is, or by performing one or more reactions known in the art as it is or as appropriately modified.
  • one or more reactions may be synthesized by performing a series of sequences in consideration of the presence, type, and / or location of reactive functional groups and / or heteroelements included in a skeleton structure, but are not limited thereto.
  • the compound of formula 1 according to the present invention is characterized by activating the function of p62 by acting as a ligand that binds to the ZZ domain of p62. By activating the function of p62, the compound of formula 1 according to the present invention can activate autophagy.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for autophagy activity comprising a compound of formula (1), a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, hydrate, solvate or prodrug thereof.
  • the compound of formula 1 can eliminate aggregate proteins related to diseases associated with denatured protein aggregation due to the activating action of autophagy.
  • the compound of Formula 1 binds to the p62 ZZ domain as a p62 ligand, activates the PB1 domain and the LIR domain of the p62 protein to induce oligos and aggregates of p62, and autophagosomes through p62 aggregate induction It is characterized by increasing the formation. Through this process, the denatured protein coagulant is smoothly removed (see FIG. 1).
  • Such proteins may be major proteins of proteolytic disorders, more preferably prion protein, amyloid precursor protein (APP), alpha-synuclein, superoxide dismutase 1, tau (tau), immunoglobulins, amyloid-A, transthyretin, beta2-microglobulin, cystatin C, apolipoproteine A1, TDP-43, islet amyloid polypeptide, ANF, gelsolin gelsolin), insulin, lysozyme, fibrinogen, huntingtin, alpha-1-antitrypsin Z, crystallin, c9 open reading frame 72 (c9orf72), glia fibrillary acidic protein ), Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, rhodopsin and ataxin, and other proteins with Poly-Q stretching.
  • Emitter may be at least one selected.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a modified protein disease comprising the p62 ligand compound of Formula 1, a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, hydrate, solvate or prodrug thereof do.
  • aggregation in accordance with the present invention typically refers to the formation of oligomers or multimeric complexes of one or more proteins, which may be accompanied by the integration of additional biomolecules such as carbohydrates, nucleic acids and lipids. Such aggregated proteins can form deposits in specific tissues, more preferably neural or brain tissues. The degree of aggregation depends on the disease involved.
  • protein dysfunction or “disease associated with protein aggregation” refers to a disease characterized by the presence of aggregated protein, for example neurodegenerative diseases, anti-alpha-1 antitrypsin deficiency, cornea Hypertension, retinitis pigmentosa, type 2 diabetes, cystic fibrosis, and the like.
  • the neurodegenerative diseases include Lyme borreliosis, Fatal familial insomnia, Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD), multiple sclerosis (MS), dementia, dementia, Alzheimer's disease, epilepsy, Parkinson's disease, stroke, Huntington's disease, Picks disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) Ataxia, other poly-Q diseases, hereditary brain amyloid angiopathy, familial amyloid polyneuropathy, primary systemic amyloidosis (AL amyloidosis), reactive systemic amyloidosis (AA amyloidosis), injection-localized amyloidosis, beta-2 microglobulin amyloidosis, Preferred is selected from the group consisting of hereditary non-neuropathy amyloidosis, Alexander's disease and Finnish hereditary systemic amyloidosis Do.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease, etc., but the effective dosage is usually For adults (60 kg), it is about 1 ng to 10 mg / day, in particular about 1 g to 1 mg / day. Since the dosage may vary depending on various conditions, it will be apparent to those skilled in the art that the dosage may be added or subtracted, and thus the dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the frequency of administration can be administered once a day or divided into several times within the desired range, the administration period is not particularly limited.
  • treatment of the present invention refers to any action in which administration of the pharmaceutical composition of the present invention improves or advantageously alters various diseases associated with denatured protein coagulation, such as proteolytic disorders.
  • the compounds of the present invention (1) induce p62 oligomerization and structural activation, (2) increase the binding of p62 to LC3, and (3) deliver the p62 to autophagosomes.
  • pharmaceutical compositions comprising it as an active ingredient can be used to prevent, improve or It can be used for treatment.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient, and according to the conventional method for each purpose of use powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, It can be formulated in various forms such as oral formulations such as syrups and aerosols, injections of sterile injectable solutions, and can be administered orally or through various routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal and topical administration. .
  • compositions of the present invention may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient in the composition, for example starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. Are formulated by mixing.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may be used in addition to simple excipients.
  • Oral liquid preparations may include suspensions, solvents, emulsions, syrups, and the like, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. Can be.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • the suppository base includes Uittepsol, Macrogol, and Twin 61. Cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and the like.
  • the formulations may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods and comprise the active ingredient in an amount effective for medical treatment, specifically for preventing, ameliorating or treating a disease associated with denaturing protein aggregation.
  • the composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and not causing side effects.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered in single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the dose may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like, and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • Preferred dosages of the compounds of the present invention depend on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for preventing, ameliorating or treating a disease associated with aggregation of denatured protein, comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject in need thereof.
  • the term "individual” means monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits or guinea pigs, including humans with diseases associated with aggregation of denatured proteins. It means all animals, including, and can effectively prevent, ameliorate or treat a disease associated with aggregation of denatured protein by administering to the subject a pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention acts as a p62 ligand to activate autophagy and removes aggregates of denatured protein by such autophagy activation, it exhibits a prophylactic or therapeutic effect of a disease associated with such aggregated proteins. Synergistic effects can be achieved by administration in combination with a therapeutic agent.
  • administration means providing the patient with a predetermined substance in any suitable way, and the route of administration of the composition of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered by any device in which the active substance may migrate to target cells. Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, drip and the like.
  • Injections include non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as physiological saline solution and ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.).
  • aqueous solvents such as physiological saline solution and ring gel solution
  • vegetable oils e.g., oleic acid, etc.
  • alcohols e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.
  • Stabilizers e.g.
  • Preservatives eg, mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc. may be included.
  • the present invention provides a food composition for preventing or ameliorating a modified protein disease comprising a p62 ligand compound of Formula 1, a pharmaceutically acceptable salt thereof, stereoisomer, hydrate, solvate or prodrug thereof.
  • the food composition may be used in its own form as a dietary supplement, or may be included in other dietary supplements as an additive to the dietary supplement.
  • Health functional food refers to foods that have bioregulatory functions such as prevention or improvement of disease, biological defense, immunity, recovery from illness, and suppression of aging.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the kind of the food There is no particular limitation on the kind of the food.
  • the food to which the substance may be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drink, Alcoholic beverages and vitamin complexes and the like, and include all of the dietary supplements in the conventional sense.
  • the food composition of the present invention comprises conventional ingredients used in the manufacture of food or food additives, specifically, flavoring agents;
  • Natural carbohydrates include glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and natural sweeteners such as dextrin, cyclodextrin, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame; Nutrients; vitamin; Electrolyte; coloring agent; Organic acid; Protective colloidal thickeners; pH regulators; Stabilizer; antiseptic; glycerin; Alcohol; And carbonizing agents used in the carbonated beverage.
  • the compounds of novel p62 ligand examples 1 to 19 represented by Formula 1 were newly synthesized.
  • the novel p62 ligand compound according to the present invention is applied to Hela cell line, which is a cervical cancer patient-derived cell line, by immunoblotting to evaluate whether the novel p62 ligand compounds according to the present invention can increase autophagy in cultured cells. After treatment by culturing, autophagy activity in the cultured cells was confirmed. As a result, it was confirmed that the level of LC3, which is a marker of autophagy activity, increased gradually with time of treatment of p62 ligand compounds according to the present invention.
  • P62 ligand compounds according to the present invention activate and oligomerize p62 proteins. It was confirmed that the coagulation of denatured proteins was effectively eliminated by increasing autophagy activity while delivering to autophagosomes.
  • Reagent supply sources include, but are not limited to, companies such as Aldrich, Sigma, TCI, Wako, Kanto, Fluorchem, Acros, Alfa, Fluka, and the like.
  • Step 3 After diluting R-2-((3,4-bis (benzyloxy) phenoxy) methyl) oxirane (1103, 9 mg, 25 nmol) in anhydrous ethanol (1 ml), 2-aminoethane- 1-ol (7.6 ⁇ L, 125 nmol) is added and stirred for 4 hours at room temperature. After confirming the reaction by TLC, the reaction solvent was concentrated under reduced pressure, water was added to the concentrated reaction mixture, and extracted with dichloromethane ((3 ⁇ 5 mL) . The extracted organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and filtered under reduced pressure.
  • Step 1) R-2-((3,4-bis (benzyloxy) phenoxy) methyl) oxirane (1103, 500 mg, 1.38 mmol) was dissolved in methanol (10 ml) and then tert-butyl 2-amino Ethyl carbamate (442 mg, 2.76 mmol) was added thereto and stirred at 50 ° C. for 10 hours. When the reaction is completed, the reaction solvent is concentrated under reduced pressure.
  • Step 2 tert-Butyl (R)-(2-((3- (3,4-bis (benzyloxy) phenoxy) -2-hydroxypropyl) amino) ethyl) carmamate (1105, 600 mg, 1.15 mmol) is dissolved in methanol (3 ml), then methanol / hydrochloric acid (3N, 2 ml) is added and stirred at room temperature for 4 hours.When the reaction is complete the reaction is concentrated under reduced pressure (white solid, 1106) Use as starting material for the step.
  • Step 3 (R) -1-((2-aminoethyl) amino) -3- (3,4-bis (benzyloxy) phenoxy) propan-2-ol (1106, 400 g, 0.95 mmol) in DMF After dissolving in (3 ml), additionally 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride (553 mg, 3.8 mmol) and diisopropylethylamine (0.3 g, 2.4 mmol) are added. After stirring for 12 hours, the mixture was concentrated under reduced pressure, purified by high resolution liquid chromatography, and then washed with white solid, (R) -1- (2-((3- (3,4-bis (benzyloxy) phenoxy) -2-hydroxy).
  • Step 1) R-2-((3,4-bis (benzyloxy) phenoxy) methyl) oxirane (1103, 500 mg, 1.38 mmol) was dissolved in methanol (10 ml) and then ammonia / methanol (2N, 3 ml) and stirred at 50 ° C. for 10 hours. When the reaction is complete, the reaction solvent is concentrated under reduced pressure.
  • Step 2 dissolving (R) -1-amino-3- (3,4-bis (benzyloxy) phenoxy) propan-2-ol (1107, 300 mg, 0.8 mmol) in DMF (3 ml), 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride (570 mg, 3.9 mmol) and diisopropylethylamine (0.3 g, 2.4 mmol) are added in turn.
  • the reaction is stirred at 30 ° C. for 12 h and then depressurized.
  • Example 10 The preparation method of Example 10 was the same as the preparation method of Example 10, except that R-2-((3,4-diphenoxyphenoxy) methyl) oxirane (2203) was used instead of 1103 in step 1.
  • R-2-((3,4-diphenoxyphenoxy) methyl) oxirane (2203) was used instead of 1103 in step 1.
  • (R) -1- (3- (3,4-diphenoxyphenoxy) -2-hydroxypropyl) guanidine (YOK-2207, 25 mg) was synthesized by the procedure.
  • Step 1) Dissolve 1,3-dihydroxybenzene (5.0 g, 45.4 mmol) in acetonitrile (100 ml), and then add K 2 CO 3 . Then 1- (bromomethyl) -4-chlorobenzene (9.3 g, 45.4 mmol) is added to the reaction and then stirred at 80 ° C. for 16 hours. After cooling to room temperature, the reaction solvent was concentrated under reduced pressure. Water was added to the concentrated residue, followed by extraction with ethyl acetate, and then the organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and filtered under reduced pressure. The filtrate was taken, and concentrated under reduced pressure, followed by column chromatography.
  • Step 2 Dissolve 3-((4-chlorobenzyl) oxy) phenol (2011, 1.0 g, 4.2 mmol) in ethanol (10 ml) and then (R) -2- (chloromethyl) oxirane (1.17 g, 12.7 mmol), purified water (1 ml), and KOH (0.24 g, 4.2 mmol) are added, followed by stirring at room temperature for 16 hours.
  • Water (30 ml) is added to the reaction, followed by extraction with ethyl acetate (30 ml). The organic layer was extracted two more times with ethyl acetate, and the organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and filtered under reduced pressure.
  • Step 3 (R) -2-((3-((4-chlorobenzyl) oxy) phenoxy) methyl) oxirane (3011, 300 mg, 1.03 mmol) was dissolved in methanol (5 ml), then 2- Aminoethanol (189 mg, 3.09 mmol) is added. The reaction is stirred at 65 ° C. for 5 hours. After cooling to room temperature, the reaction solvent is concentrated under reduced pressure and purified by high resolution liquid chromatography to give a white solid (R)-. 1- (3-((4-chlorobenzyl) oxy) phenoxy) -3-((2-hydroxyethyl) amino) propan-2-ol (YT-6-7, 15 mg) was synthesized.
  • Step 1) 4- (benzyloxy) -3-phenoxybenzaldehyde (1201, 332 mg, 1.0 mmol) was dissolved in dichloromethane, and then m-chloroperbenzoic acid (mCPBA, 260 mg, 1.5 mmol) was added. After stirring for 4 hours at room temperature, an excess of ethyl acetate was added to the reaction mixture, saturated aqueous sodium carbonate solution was added thereto, washed, and the organic layer was separated. The filtrate was concentrated under reduced pressure, and then dissolved in methanol (10 ml) again, then 6N NaOH was added and stirred for 30 minutes at room temperature. 4N HCl solution was added to the reaction, followed by further stirring for 30 minutes.
  • mCPBA m-chloroperbenzoic acid
  • Step 2 4- (benzyloxy) -3-phenoxyphenol (1202, 320 mg, 1.0 mmol) was diluted in ethanol (5 ml), followed by KOH aqueous solution (KOH 66 mg, 1.2 mmol, 1 ml) and ( R) -2- (chloromethyl) oxirane (410 ul, 5.0 mmol) is added in turn.
  • the reaction is stirred at room temperature for 5 hours, then the organic solvent is removed under reduced pressure.
  • the concentrated reaction is diluted with ethyl acetate again. After washing with water and then with brine, the extracted organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and filtered under reduced pressure.
  • Step 3 Dilute R-2-((4- (benzyloxy) -3-phenoxyphenoxy) methyl) oxirane (1203, 9.4 mg, 25 nmol) in anhydrous ethanol (1 ml) and then isopropylamine (10 ⁇ L, 125 nmol) is added and stirred for 4 hours at room temperature. After confirming the reaction by TLC, the reaction solvent was concentrated under reduced pressure, water was added to the concentrated reaction mixture, and extracted with dichloromethane ((3 ⁇ 5 mL) . The extracted organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and filtered under reduced pressure.
  • Example 16 In the preparation method of Example 16, the starting material was changed in step 1 to 4- (benzyloxy) -3- (3-phenylpropoxy) benzaldehyde instead of 4- (benzyloxy) -3-phenethoxybenzaldehyde (1201). 1301, 346 mg, 1.0 mmol), and the white solid (R) -1- (4- (benzyloxy) -3- (3-phenylpropoxy) phenoxy) as a white solid. 3- (Isopropylamino) propan-2-ol (YOK-1304, 9.5 mg, yield 85%) was synthesized.
  • Example 19 except that glycine methyl ester was used in place of 2-aminoethan-1-ol in Step 3, except that methyl (R)-(3- (3, 4-bis (benzyloxy) phenoxy) -2-hydroxypropyl) glycineate (YOK-G-1104) was synthesized.
  • Example 19 except that alanine ethyl ester was used instead of 2-aminoethan-1-ol in step 3, and ethyl (R)-(3- (3, 4-bis (benzyloxy) phenoxy) -2-hydroxypropyl) alanineate (YOK-A-1104) was synthesized.
  • HEK293 cell line a human embryonic kidney-derived cell
  • Representative compounds of the present compounds as YOK-1104, YOK-2204, YOK-3304, YOK-1204, YOK-4404, YOK-1107, YOK-1109, YOK-2207, YOK-2209, YT-4-1, YT -4-2, YT-6-1, YT-6-2, YT-6-7, YT-6-8, YT-9-1, YT-9-2, and treatment of these selected representative compounds
  • each cell was dispensed at 100 phi dish.
  • the cells were harvested after 24 hours of additional incubation so that the cells were completely attached to the surface of the plate, and 100 ul of lysis buffer (20 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2) was added to each sample. mM NaF, 2 mM EDTA, 2 mM beta - glycophosphate, 5 mM sodium orthovanadate, 1 mM PMSF, leupeptin, aproteinin) were injected and the cells were lysed. Based on the measured total protein concentration, each sample was treated with test compounds at room temperature for 2 hours, and then a sample buffer was added and reacted at 95 ° C for 10 minutes. 25 ul was taken from the samples after the reaction, and each well of the acrylamide gel was dispensed, followed by immunoblotting. Immunoblotting plotted a representative from three or more independent experiments. The results are shown in FIG.
  • the compounds were identified by treatment by time or concentration and immunoblotting was representative of three or more independent experiments. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 5, the control compounds did not increase the level of LC3, a marker of macroautophage activity, regardless of the treatment time or concentration.
  • p62 protein activity and autophagy activity of the compounds were determined using p62 and LC3 as markers.
  • a novel p62 ligand compound (YOK-1106, YOK-1204, YOK- 1504, YOK-2204, YOK-3304, YOK-4404, YOK-1107, YOK-1109, YOK-2207, YOK-2209, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT- 9-1 and YT-9-2) were cultured, and the degree and location of spot expression of LC3 and spot location coexistence with p62 were observed as markers of autophagy.
  • the cover glass was placed in a 24-well plate for immunofluorescence staining, and the cells were aliquoted and incubated for 24 hours, and then treated with 5 uM of the novel p62 ligand according to the present invention. After 24 hours of incubation for the action of the compound, the medium was removed, and the cells were fixed using formaldehyde at room temperature. In order to prevent non-specific staining, the cells were allowed to react with the blocking solution at room temperature for 1 hour, and then treated with a blocking solution diluted with LC3 antibody at a constant rate for 1 hour at room temperature.
  • Htt-Q103 Degeneration huntingtin (Htt-Q103), a major protein in Huntington's disease, degenerative brain disease of the compounds (Examples 1-19), markers p62 and Htt-Q103-GFP to determine the degree of autophagy transfer activity mediated by p62 Using immunofluorescence staining was carried out in the same manner as in Experiment 4.
  • the compound is YOK-1106, YOK-1107, YOK-1109, YOK-1204, YOK-2204, YOK-4404, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-6-7, YT-9-1 was used.

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Abstract

본 발명은 신규한 p62 리간드 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭, 이를 유효성분으로 포함하는 단백질이상질환의 예방 또는 치료용 약학적 또는 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물은 세포 내 오토파지를 활성화하여 체내 단백질, 소기관 및 응고체들을 선택적으로 제거함에 따라 다양한 단백질이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 p62 리간드 화합물, 이를 포함하는 단백질이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 신규한 p62 리간드 화합물, 이를 포함하는 단백질이상질환의 예방 또는 치료용 약학적 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
N-엔드룰(N-end rule) 경로는 특정 단백질 N-말단을 분해신호로 사용하는 단백질 분해 시스템이다(도 1). N-엔드룰 분해신호로는 타입 1인 N-말단 아르기닌(Nt-Arg), 리신(Nt-Lys) 및 히스티딘(Nt-His)을 갖는 염기 잔기와 타입 2인 페닐알라닌(Nt-Phe), 루신(Nt-Leu), 트립토판(Nt-Trp), 타이로신(Nt-Tyr) 및 아이소루신(Nt-Ile)의 소수성 잔기가 있다. 이들 N-말단 잔기들은 특정 인식요소들(N-recognins; N-레코그닌)의 리간드 (N-리간드라 명함)로 결합된다.
본 발명자들은 기존에 알려진 N-레코그닌들, 즉 UBR1, UBR2, UBR4, 및 UBR5를 최초로 발견하거나 클로닝 하였으며, 이들이 기질인식 도메인으로 UBR box를 가지고 있음을 밝힌 바 있다(Tasaki, T. et al., Mol Cell Biol 25, 7120-36 (2005)). 또한 UBR box가 N-말단 Arg 잔기 등 type-1 N-엔드룰 리간드(Nt-Arg, Nt-Lys, Nt-His)를 결합하여 기질을 인식하고 기질에 유비퀴틴 사슬을 붙혀줌을 밝힌 바 있다. UBR1과 UBR2가 또한 N-도메인을 가지고 있으며, N-도메인은 type-2 N-엔드룰 리간드(Nt-Trp, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Leu, Nt-Ile)와 결합하는데 중요한 역할을 한다는 사실도 밝혔다(Sriram, S.M., Kim, B.Y. & Kwon, Y.T., Nat Rev Mol Cell Biol 12, 735-47 (2011)). N-레코그닌이 N-end rule 리간드와 결합함으로서 만들어진 유비퀴틴화된 기질은 프로테아좀에 전달되어 짧은 펩타이드로 분해된다. 이러한 과정에서 특정 N-말단 잔기(Nt-Arg, Nt-His, Nt-Lys, Nt-Trp, Nt-Phe, Nt-Tyr, Nt-Leu, Nt-Leu)는 N-레코그닌이 N-end rule 기질을 타겟팅할 때 필요한 수소결합(hydrogen bond)를 대부분 제공하기 때문에 결합에 꼭 필요한 결정인자이다(Sriram, S.M. & Kwon, Y.T., Nat Struct Mol Biol 17, 1164-5 (2010)).
세포에서 폴딩이 제대로 되지않는 변성(misfolded) 단백질들이 장시간 방치할 경우 응고되어(aggregated) 프로테아좀을 막아버리던가 다른 세포기능을 저하하는 등 세포독성 물질이 되기 때문에, 유비퀴틴 리가제(ubiquitin ligase)가 유비퀴틴화시킴으로서 프로테아좀에 전달시켜 분해된다 (Ji, C.H. & Kwon, Y.T., Mol Cells 40, 441-449 (2017)). 정상적인 세포에서는 이러한 과정이 원활해서 변성단백질로 인한 피해를 최소화하는 반면, 노인의 신경세포는 이과정이 느려져서 유비퀴틴화된 변성단백질들이 누적이 되고, 이들 잉여 단백질 쓰레기들은 다시 응고체로 전환이 된다 (Ciechanover, A. & Kwon, Y.T., Exp Mol Med 47, e147 (2015)). 또한 단백질이상질환 중에서도 헌팅턴병, 파킨슨병, 인간광우병, 루게릭병 등 퇴행성 뇌질환을 앓고 있는 환자의 신경세포에는 특정 돌연변이 단백질들이 응고체로 변형이 되는 성질이 강해서 상기 설명한 프로테아좀으로 분해가 되지 않는다. 왜냐하면 프로테아좀은 내경이 13 옹스트롬(angstrom) 정도로 좁기 때문에 변성단백질이 풀려져야만(unfolding)되는데 단백질이 응고가 되면 풀리지 않기 때문이다.
한편, 오토파지(autophagy)는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system)과 더불어 세포내 주요 단백질 분해 시스템이다. 오토파지는 노화되거나 제 기능을 못하게 된 세포 소기관들 및 손상되거나 폴딩(folding)이 제대로 안된 단백질들을 분해함으로써 세포의 항상성과 유전적인 안정성을 유지하기 위해 필수적인 단백질 분해 과정이다 (Ji, C.H. & Kwon, Y.T., Mol Cells 40, 441-449 (2017)). 특히 세포질에 변성단백질 응고체가 누적이 될 경우 세포독성 물질이 되기 때문에, 이들을 오토파지가 받아서 분해를 해야 한다. 오토파지의 기전은 크게 마크로오토파지(macroautophagy), 마이크로오토파지(microautophagy)와 샤페론 매개 오토파지(chaperone-mediated autophagy)로 나누어지며, 무슨 목적을 위해 세포 내 기질을 분해하는지에 따라 비선택적 오토파지(bulk autophagy)와 선택적 오토파지(selective autophagy)로 나뉘어진다 (Dikic, I. & Elazar, Z., Nat Rev Mol Cell Biol 19, 349-364 (2018)). 이중 선택적 오토파지와 샤페론 매개 오토파지는 세포 내 기능이상 소기관이나 불필요한 단백질의 선택적 분해를 일으킨다. 선택적 오토파지를 유도함으로서 악성 병인 단백질 축적 및 기능 불능 소기관을 기반으로 하는 질환들에 대한 신규 치료법 개발이 현재 새로운 패러다임을 구축하고 있는 상황이다. p62/SQSTM1/Sequestosome-1 단백질은 선택적 오토파지 기전에서 매개물인 오토파고좀 형성 개시와 내용물 전달에 중요하다. 이때 p62/SQRSM1/Sequestosome-1이 변성단백질 및 그 응고체와 결합하여 이들을 오토파고좀(autophagosome)에 전달한다. 변성단백질을 오토파고좀에 전달할 때 핵심적인 과정으로 p62가 자가 올리고머화(self-oligomerization)을 거친다 (Ji and Kwon, Mol Cells 40, 441-449 (2017)). 이때 변성단백질은 같이 농축이 되어 부피가 줄어들고 오토파지에 의한 분해가 용이하게된다. p62가 자가 올리고머화를 매개하는 것은 PB1 도메인인데 그 조절기작은 잘 알려져 있지 않다. 오토파고좀에 전달된 변성단백질-p62 결합체는 오토파고좀이 리소좀과 결합함에 따라 리소좀의 효소에 의해 분해가 된다. 이러한 기작을 통해 오토파지는 손상된 단백질 및 세포 소기관의 세포내 변동을 통한 세포 항상성의 유지를 위해 중요한데, 오토파지가 저하될 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적과 응고가 초래되어 이로 인해 단백질이상질환이 발생하기도 한다 (Ciechanover, A. & Kwon, Y.T., Exp Mol Med 47, e147 (2015)). 본 발명의 핵심적인 기술은 단백질이상질환의 원인이 되는 변성단백질이나 그 응고체를 효과적으로 제거하는 방법을 제공하는 것이다. 이를 위해, 다양한 생물학적 경로에 광범위한 영향을 미치는 비선택적 오토파지는 활성화 하지 않고 선택적 오토파지만 활성화 하는 것이 필요하다.
단백질이상질환을 치료하기 위해 오토파지를 활성화하는 연구가 활발하게 진행되어오고 있다. 비선태적 오토파지를 평소에 억제하는 조절인자가 mTOR인데, mTOR 저해제를 사용하여 오토파지를 활성화하는 방법이 가장 광범위하게 사용된다 (Jung, C.H., Ro, S.H., Cao, J., Otto, N.M. & Kim, D.H., FEBS Lett 584, 1287-95 (2010)). 구체적으로, 라파미이신을 이용하여 APP를 과발현하는 AD 동물모델에서 아밀로이드 베타(Ab) 및 타우(tau)를 제거함과 동시에 인지력을 증진시켰으며(Caccamo, A., Majumder, S., Richardson, A., Strong, R. & Oddo, S., J Biol Chem 285, 13107-20 (2010)), tau를 과발현하는 AD 동물모델에서 tau를 제거하였고(Rodriguez-Navarro, J.A. et al., Neurobiol Dis 39, 423-38 (2010)), PD 마우스 모델에서 과발현된 돌연변이 알파 시뉴클레인(α-synuclein) 단백질 응고체를 제거하였다(Webb, J.L., Ravikumar, B., Atkins, J., Skepper, J.N. & Rubinsztein, D.C., J Biol Chem 278, 25009-13 (2003)). 라파마이신 유사물질인 CCI-779를 이용하여 상기 HD 마우스에서 헌팅틴 응고체를 효과적으로 제거하고 동물 행동이나 인지력도 개선시킴을 확인하였다(Ravikumar, B., Duden, R. & Rubinsztein, D.C., Hum Mol Genet 11, 1107-17 (2002)). 그러나, mTOR가 NF-kB 등 매우 다양한 세포내 경로들에 있어서 매우 중요한 역할을 하며, 따라서 단백질이상질환의 변성 단백질 응고체를 제거하는 뛰어난 활성을 보임에도 불구하고 mTOR를 약물타겟으로 하는 것으로 알려진 이들 오토파지 활성제들을 치료제로 사용하기에 한계가 있다.
이상과 같이, 현재 대부분의 단백질이상질환에 대한 치료제는 전무하며, 주요 원인이 되는 변성 단백질의 제거를 위한 유비퀴틴 리가아제 리간드의 경우 변성 단백질이 응집되는 경우 제거가 어려우며, 또한 비선택적 오토파지 활성제로서 가장 많이 사용되는 화합물인 mTOR 저해제는 오토파지의 조절 외에도 다양한 외부 환경으로부터의 자극에 대하여 세포내의 전반적인 유전자 발현을 조절하는 광범위한 역할을 하기 때문에 치료제로서는 부적합하다는 단점을 가진다. 따라서, 비선택적 오토파지의 조절인자인 mTOR의 활성을 저하하지 않으면서도 선택적 오토파지의 핵심 조절인자인 p62를 활성화하여 변성단백질 응고체를 제거하는 방법의 개발이 필요하다.
상기와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 mTOR 비의존적으로 오토파지를 활성화하는 물질을 이용하여 단백질이상질환(proteinopathy)에 대한 예방 및 치료제를 개발하기 위해 거듭 노력한 결과, p62, 보다 상세하게는 p62의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드가 LC3와 결합하고 오토파지를 활성화시켜 돌연변이 헌팅틴이나 알파 시뉴클레인과 같은 단백질의 악성 응고체(pathological aggregates) 등을 효과적으로 제거함으로써, 다양한 단백질이상질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있을 것임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 p62 단백질의 활성화 및 올리고머화를 유발하는 신규한 p62 리간드 화합물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 신규 화합물을 이용하여 p62 및 p62가 결합한 변성단백질을 오토파고좀에 전달하고, 최종적으로 리소좀에 전달하여 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 화합물을 이용하여 p62 단백질을 통한 마크로오토파지 활성을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 변성 단백질 응집체 제거용 약학적 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는 단백질이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 p62 단백질의 리간드로 작용하는 신규한 화합물을 제공한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 신규한 p62 리간드는 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합한다.
또한, 본 발명은 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 유효성분으로 함유하는, 신경변성 질환과 같은 단백질이상질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 단백질이상질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 p62의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드를 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는 (1) p62 올리고머화 및 구조적 활성화를 유도하는 방법, (2) p62의 LC3와의 결합을 증대시키는 방법, (3) p62의 오토파고좀(autophagosome)으로의 전달을 증대시키는 방법, (4) 오토파지를 활성화하는 방법, 및 (5) 변성 단백질 응고체를 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 변성 단백질 응고체를 직접 오토파고좀에 전달하는 p62을 활성화함으로서 퇴행성 뇌질환의 원인 인자인 변성 단백질 응고체를 제거하는 기술을 제공한다.
본 발명에서 핵심적인 기술은 p62와 오토파지를 동시에 활성화함으로서 퇴행성 뇌질환의 원인이 되는 변성 단백질 응고체를 효과적으로 제거하는 것이다.
본 발명의 약물작용 기전 및 핵심적인 기술들은 [도 1]에 요약되어 있다.
구체적으로 도 1에 나타난 바와 같이, 돌연변이 헌팅틴이나 알파 시뉴클레인 같은 단백질이상질환의 주요 병인 단백질은 물에 녹지 않는 변성체(misfolded)로 변환이 된 후 서로 엉겨 붙어 올리고머 형태의 응고체로 자란다. 이들 변성체들은 신경세포에서 세포독성 물질로서 작용하면서 더욱 자라서 큰 올리고머나 섬유질(fibrillar) 응고체로 자란 뒤, 궁극적으로 인클루젼(inclusion) 보디가 형성된다. 상기 과정에서 BiP 등 소포체 샤페론(①)들이 ATE1 R-트랜스퍼라제(R-transferase)에 의한 N-말단 아르기닌화(②)를 통해 Nt-Arg를 다량 만들어내며, 이후 아르기닌화된 BiP(R-BiP)은 세포질로 나와서 변성된 헌팅틴이나 알파 시뉴클레인과 결합한다(③). R-BiP의 Nt-Arg는 리간드로서 p62의 ZZ 도메인에 결합한다. 상기 결합으로 인하여 평소에는 닫혀있는 불활성 형태의 p62가 열린 형태로 바뀌면서 구조적인 활성화가 유도됨으로서(④), PB1 및 LC3-결합 도메인이 노출된다. 이 활성화로 인해 p62의 다이설파이드 본드(disulfide bond)로 인한 올리고머 및 고분자량 응집체가 형성되고(⑤), 오토파고좀 표지자인 LC3와 결합이 증가함으로 최종적으로 오토리소좀에 전달된다(⑥). 추가적으로, N-말단 아르기닌과 결합한 p62는 소포체 막으로 이동해서 PI3P로 매개되는 오토파고좀 형성(autophagosome biogenesis)을 활성화(⑦) 시킴으로 세포내 오토파지를 증가시킨다(⑧).
p62는 본 발명자들이 제안한 오토파지 활성제의 혁신 신약(first-in-class) 타겟이다(도 1, ⑧). 또한 p62를 오토파지 활성제 개발이나 퇴행성 뇌질환 등과 같은 변형단백질환에 응고체 제거를 위한 약물타겟으로 연구한 예는 전무하다.
오토파지는 세포 내 불필요하거나 기능을 다한 세포 구성성분을 분해하거나 재활용하는데 작용하는 기작으로서 영양소나 에너지 결핍 등의 상태에서는 에너지 혹은 생합성 과정에 사용할 대사 산물들의 생산을 위해 작용할 수 있다. 오토파지의 기전은 크게 마크로오토파지(macroautophagy), 마이크로오토파지(microautophagy)와 샤페론 매개 오토파지(chaperone-mediated autophagy)로 나누어지며, 무슨 목적을 위해 세포 내 기질을 분해하는지에 따라 비선택적 오토파지(bulk autophagy)와 선택적 오토파지(selective autophagy)로 나뉘어진다. 이중 선택적 오토파지와 샤페론 매개 오토파지는 세포 내 기능이상 소기관이나 불필요한 단백질의 선택적 분해를 일으킨다. 선택적 오토파지를 유도함으로서 악성 단백질 축적 및 기능 불능 소기관을 기반으로 하는 질환들에 대한 신규 치료법 개발이 현재 새로운 패러다임을 구축하고 있는 상황이다.
p62 단백질은 선택적 오토파지 기전에서 매개물인 오토파고좀 형성 개시와 내용물 전달에 중요하다. 본 발명에 따른 신규 p62 리간드의 유의미한 p62 활성화는 p62의 자가 올리고머화를 유발하는 것으로 관찰되었다. 또한, 이런 자가 올리고머화를 통한 p62의 오토파고좀 타겟팅이 증가함을 보아 본 발명에 따른 신규 p62 리간드들이 p62 단백질을 세포내 오토파지에 의한 타겟팅 및 분해를 유도할 수 있다는 증거이다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 신규 p62 리간드 화합물들이 기존 항단백체질환 약물에 대한 더 효과적이거나 보충적인 대안으로 활용될 수 있음을 의미한다.
프로텍(PROTAC - PROteolysis Targeting Chimera)은 타겟 단백질를 인식하는 리간드와 E3 유비퀴틴 효소를 인식하는 리간드의 화합물 키메라이다. 현존하는 질환치료제 패러다임은 단백질 효소 억제이므로 치료제의 타겟이 불가능한 단백질들에 대한 신규 치료제 개발이 매우 중요한 상황이다. 그런 관점에서 프로텍은 기존 효소 억제 방식으로 타겟팅이 불가능한 단백질들의 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 하의 선택적인 분해를 가능케 함으로서 매력적인 신규 치료제 개발 방법이다. 그러나 현재로서 프로텍에 대한 연구는 E3 유비퀴틴 효소를 인식하는 리간드만을 활용함으로서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템만으로 제한되어 있으며 따라서 앞서 언급한 프로테아좀 시스템에서의 변성 단백질의 폴딩에 관한 문제점을 가지고 있다. 그러나, 본 발명에 따른 신규 p62 리간드는 세포 내 오토파지를 유발할 수 있을 뿐만 아니라 p62와 상호작용하는 화물 기질(cargo substrate) 단백질들의 오토파고좀 표적화(targeting)를 유도할 수 있어, 기존 효소 억제 방식으로 표적화가 불가능한 단백질들의 오토파지 기전 하의 선택적인 분해를 가능케 하는 신규 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 신규 화합물은 p62 단백질의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드로 작용하여 p62의 오토파고좀으로서의 전달을 증대시켜 오토파지를 활성화시켜 변성 단백질 응고체를 제거하는 바, 다양한 단백질이상질환의 예방, 개선 및 치료제로서의 유용성을 갖는다.
도 1은 N-말단 법칙에 의해 아르기닌화 된 단백질들이 p62 ZZ 도메인에 결합하여 세포내 오토파지 활성을 통해 단백질 등 세포내 물질들을 분해하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 2는 면역블로팅법을 이용해서 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물(YOK-1104, YOK-2204, YOK-3304, YOK-1204, YOK-4404, YOK-1107, YOK-1109, YOK-2207, YOK-2209, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-6-2, YT-6-7, YT-6-8, YT-9-1 및 YT-9-2)들이 p62 단백질 올리고머화 활성을 증가시키는 효과를 나타내는 결과이다.
도 3은 면역블로팅법을 이용해서 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물(YOK-1107, YOK-4404, 3301, 3302, YOK-1104)들이 오토파지 활성을 증대시키는 효능을 보여주는 결과이다.
도 4는 면역블로팅법을 이용해서 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물(YOK-1106, YOK-1107, YOK-1204, YOK-1304, YOK-2204, YOK-4404)들이 오토파지 활성을 증대시키는 효능을 보여주는 결과이다.
도 5는 면역블로팅법을 이용해서 대조군 화합물(1101, 1102, 1103, 1201, 1202, 1203, 1301, 1302, YTK-1105-1, 4402, 1401, 1402, 2201, 2202)들이 오토파지 활성을 증대시키지 않는 것을 보여주는 결과이다.
도 6a 및 b는 면역형광염색법을 이용하여 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물(YOK-1106, YOK-1204, YOK-1504, YOK-2204, YOK-3304, YOK-4404)들이 p62 단백질을 활성화 및 올리고머화 시킨 후 오토파고좀으로 전달시키고 동시에 오토파지 활성을 증대시키는 효능을 보여주는지 확인한 결과이다.
도 7은 면역형광염색법을 이용하여 대조군 화합물(YOK-A-1104, YOK-G-1104, YTK-1005, YTK-1105-1) 들이 p62 단백질을 활성화 및 올리고머화 시킨 후 오토파고좀으로 전달시키고 동시에 오토파지 활성을 증대시키는 효능을 보여주는지 확인한 결과이다.
도 8a, b 및 9a, b는 면역형광염색법을 이용해서 타겟 단백질 오토파지 전달 효능을 보여주는 결과이다. 화합물들을 처리한 후 점증적으로 타겟 단백질들의 마커인 FK2(도 8a, 8b)나 HuntingtinQ103-GFP(도 9a, 9b)가 p62 단백질과 세포내 반점과 공존성 증가함을 나타내는 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 각 기의 정의에 대해 상세히 설명한다. 명시하지 않는 한, 각 기는 하기의 정의를 갖는다.
본 명세서 중, "할로겐"의 예는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 포함한다.
본 명세서 중, "알킬"은 직쇄 또는 분지쇄의 지방족 포화 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게 탄소수 1 내지 6의 알킬, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬일 수 있다. 이러한 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, 터트-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 1-에틸프로필, 헥실, 이소헥실, 1,1-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸 및 2-에틸부틸을 포함한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000001
상기 화학식 1에서,
W는 C6-C10 아릴이고;
L은 -O-(CH2)n1-CH(OH)-이고, 단, 상기 -O-(CH2)n1-CH(OH)- 중 O가 벤젠 고리에 결합되고, 이때 n1은 1 내지 4의 정수이고;
m은 0 내지 2의 정수이고;
Ra는 R1 또는 -OR1이고,
이때, R1은 수소, 또는 -(CH2)n2-R'1이고,
R'1은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 할로겐, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 니트로, 아미노, (C1-4 알킬)아미노, 또는 디(C1-4 알킬)아미노로 치환된 페닐이고
n2는 1 내지 6의 정수이고;
Rb는 -OR2이고,
이때, R2는 H, 또는 -(CH2)n3-R'2이고,
R'2은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 할로겐, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 니트로, 아미노, (C1-4 알킬)아미노, 또는 디(C1-4 알킬)아미노로 치환된 페닐이고,
n3은 1 내지 6의 정수이고;
Rc는 -(CH2)n4-OH, -(CH2)n4-NH-C(=NH)NH2, -C(=NH)NH2, C1-6 알킬, -CH(R3)-COO-R4, 또는 -CH(COO-R4)-CH2CH2CH2-NH-C(=NH)NH2, -(CH2)n4-O-(CH2)n4-OR4, -CONH(CH2)n4-OR4, -CO(CH2)n5-OR4, -(CH2)n5-CH(NH2)-COOR4, -(CH2)n5-CONHR4 이고,
n4는 2 내지 4의 정수이고,
n5는 1 내지 4의 정수이고,
R3는 수소, 또는 C1-4 알킬이고,
R4는 수소, 또는 C1-4 알킬이다,
바람직하게, 상기 W는 페닐일 수 있다.
바람직하게, 상기 n1은 1 또는 2일 수 있다.
바람직하게, 상기 Ra는 수소, 또는 -O-(CH2)n2-R'1일 수 있다.
바람직하게, 상기 R'1은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 플루오로, 클로로, 브로모, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 니트로, 아미노 또는 디메틸아미노로 치환된 페닐일 수 있다.
바람직하게, 상기 n2는 1 내지 4의 정수일 수 있다.
바람직하게, 상기 Rb는 하이드록시, 또는 -O-(CH2)n3-R'2일 수 있다.
바람직하게, 상기 R'2은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 플루오로, 클로로, 브로모, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 니트로, 아미노 또는 디메틸아미노로 치환된 페닐일 수 있다.
바람직하게, 상기 n3은 1 내지 4의 정수일 수 있다.
바람직하게, 상기 Rc는 -(CH2)n4-OH, -(CH2)n4-NH-C(=NH)NH2, -C(=NH)NH2, 메틸, 에틸 또는 이소프로필일 수 있다.
바람직하게, 상기 n4는 2 내지 3의 정수일 수 있다.
바람직하게, 상기 n5는 1 내지 3의 정수일 수 있다.바람직하게, 상기 R4는 수소, 또는 메틸일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 대표적인 예는 하기와 같다:
1) (R)-1-(3,4-(비스(벤질옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YOK-1106);
2) (R)-1-(3,4-(비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-1);
3) (R)-1-(3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-2);
4) (R)-1-(3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-7);
5) (R)-1-(3-((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-8);
6) (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YOK-1109);
7) (R)-1-(2-((3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YOK-2209);
8) (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-클로로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YT-9-1);
9) (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YT-9-2);
10) (R)-1-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘 (YOK-1107);
11) (R)-1-(3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘 (YOK-2207);
12) (R)-1-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-1104);
13) (R)-1-(3,4-다이페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-2204);
14) (R)-1-(3,4-비스(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-3304);
15) (R)-1-(3,4-비스(4-페닐푸톡시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-4404);
16) (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-1204);
17) (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-1304);
18) (R)-1-(3,4-비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YT-4-1); 및
19) (R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YT-4-2).
한편, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.
산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 화학식 1의 화합물과 동등한 약리활성을 나타내는, 예컨대, p62의 리간드로 세포 내 신경변성 질환 및 종양 관련 단백질들의 오토파지로 인한 분해를 유도하며 신경변성 질환들을 예방 또는 치료할 수 있는 화학식 1의 화합물의 염이면 제한없이 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1으로 표시되는 화합물은, 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 수화물 등의 용매화물 및 가능한 모든 입체 이성질체를 제한없이 포함한다. 거울상이성질체 형태 및 부분입체이성질체 형태를 포함하는, 본 발명의 모든 입체 이성질체(예를 들어, 다양한 치환체에서 비대칭 탄소에 기인하여 존재할 수 있는 것들)가 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 화합물의 개별적인 입체이성질체는, 예를 들어, 실질적으로 다른 이성질체가 없거나(예를 들어, 특정의 활성을 갖는 순수한 또는 실질적으로 순수한 광학 이성질체로서), 또는 예를 들어, 라세미체로서 또는 모든 다른, 또는 다른 선택된 입체이성질체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 화합물의 키랄 중심은 IUPAC 1974 권고에 의해 정의된 S 또는 R 구조를 가질 수 있다. 라세미 형태는 키랄 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리 또는 부분입체이성질체 유도체의 분리 또는 결정화, 분별 형상 결정화와 같은 물리적 방법에 의해 분석될 수 있다. 개별적인 광학 이성질체는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 광학적으로 활성인 산과의 염 형성에 이어, 결정화를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 라세미체로부 터 얻을 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물 및 입체이성질체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 제조할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며, 결정 형태로 제조될 경우 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다. 본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 화학양론적 수화물뿐만 아니라 다양한 양의 물을 함유하는 화합물이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물은 화학양론적 용매화물 및 비화학양론적 용매화물 모두를 포함한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 하기 예시적인 방법인 반응식 1 내지 5와 같은 방법으로 제조될 수 있으며, 구체적인 일 예는 이하 실시예에 기재된 반응식들과 같다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000002
[반응식 2]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000003
[반응식 3]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000004
[반응식 4]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000005
[반응식 5]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000006
본 발명의 제조방법은, 상기 반응식들에 사용되는 반응물들로서, 시판되는 화합물을 구입하여 그대로 사용하거나, 당업계에 공지된 하나 이상의 반응을 그대로 또는 적절히 변경하여 수행함으로써 합성하여 사용할 수 있다. 예컨대, 골격 구조에 포함된 반응성 작용기 및/또는 헤테로원소의 존재, 종류 및/또는 위치를 고려하여 하나 이상의 반응을 일련의 순서로 수행하여 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 p62의 ZZ 도메인과 결합하는 리간드로서 작용하여, p62의 기능을 활성화 시키는 것을 특징으로 한다. 이러한 p62의 기능을 활성화시킴으로 인해, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 오토파지를 활성화시킬 수 있다.
따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 수화물, 용매화물 또는 프로드럭을 포함하는 오토파지 활성용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 오토파지의 활성화 작용으로 인해 변성 단백질 응집과 연관된 질환에 관련한 응집 단백질을 제거할 수 있다. 아울러, 상기 화학식 1의 화합물은 p62 리간드로서 p62 ZZ 도메인에 결합하여, p62 단백질의 PB1 도메인 및 LIR 도메인을 활성화시켜 p62의 올리고화 및 응집체를 유도하고, p62 응집체 유도를 통한 오토파고좀(autophagosome) 형성을 증대시키는 것을 특징으로 한다. 상기 과정을 통해 변성 단백질 응고체가 원활하게 제거된다(도 1 참조). 이러한 단백질은 단백질이상질환의 주요 단백질일 수 있고, 보다 바람직하게는, 프리온 단백질, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase 1), 타우(tau), 면역글로불린, 아밀로이드-A, 트랜스타이레틴, 베타2-마이크로글로불린, 시스타틴 C, 아포 지단백질(Apolipoproteine) A1, TDP-43, 섬 아밀로이드 폴리펩티드(islet amyloid polypeptide), ANF, 겔솔린(gelsolin), 인슐린, 리소자임, 피브리노겐, 헌팅틴(huntingtin), 알파-1-안티트립신 Z, 크리스탈린(crystallin), c9오픈리딩프레임72(c9orf72), 글리얼 피프릴래리 항 단백질(glial fibrillary acidic protein), 낭포 성 섬유증 막 투관 컨덕턴스 조절 단백질(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein), 로돕신(rhodopsin) 및 아탁신과, Poly-Q 연신을 갖는 기타 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.
따라서 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 p62 리간드 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 수화물, 용매화물 또는 프로드럭을 포함하는 변형단백질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 용어 "응집(aggregation)"은, 복합체 내로 탄수화물, 핵산 및 지질과 같은 추가적인 생체분자의 통합과 동반될 수 있는, 전형적으로 하나 이상의 단백질의 올리고머 또는 다량체 복합체의 형성을 나타낸다. 그러한 응집된 단백질은 특정 조직, 보다 바람직하게는 신경 조직 또는 뇌 조직에 침착물을 형성할 수 있다. 응집의 정도는 해당 질환에 의존한다.
여기에서 사용된 용어 "단백질이상질환" 또는 "단백질 응집과 관련된 질환"은, 응집된단백질의 존재를 특징으로 하는 질환을 의미하는 것으로, 예를 들어신경변성질환, 항알파1안티트립신 결핍증, 각막증, 색소 성 망막염, 타입 2 당뇨병, 낭포 성 섬유증 등을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신경변성 질환은 라임병(Lyme borreliosis), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia), 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD), 다발성경화증(multiple sclerosis; MS), 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 간질(epilepsy), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중(stroke), 헌팅턴병(huntington's disease), 피크병(Picks disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 척수소뇌실조증, 기타 폴리-Q 질환, 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 1차 전신 아밀로이드증(AL 아밀로이드증), 반응성 전신 아밀로이드증(AA 아밀로이드증),주사-국소화 아밀로이드증, 베타-2 마이크로글로불린 아밀로이드증, 유전성 비-신경병 아밀로이드증, 알렉산더 증 및 핀란드 유전성 전신 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 유효 투여량은 통상적으로 성인(60 kg)의 경우, 약 1 ng 내지 10 mg/일, 특히 약 1 g 내지 1mg/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 용어 "치료"란 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 변성 단백질 응고와 관련된 다양한 질환, 예를 들어 단백질이상질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 (1) p62 올리고머화 및 구조적 활성화를 유도하여, (2) p62의 LC3와의 결합을 증대시키고, (3) p62의 오토파고좀(autophagosome)으로의 전달을 증대시켜, (4) 오토파지를 활성화하여 최종적으로 (5) 변성 단백질 응고체를 제거하는 효과를 나타내므로, 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 다양한 변성 단백질 응집과 관련된 질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있으며 활성 성분을 의학적 치료, 구체적으로 변성 단백질 응집과 관련된 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유효한 양으로 포함한다.
이때, 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은, 상기 본 발명의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 변성 단백질의 응집과 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 변성 단백질의 응집과 관련된 질환이 발병한 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 변성 단백질의 응집과 관련된 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 p62 리간드로 작용하여 오토파지를 활성화시키고, 이러한 오토파지 활성화에 의해 변성 단백질의 응집체를 제거하여 이러한 응집 단백질과 관련된 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것이므로, 기존의 치료제와 병행하여 투여함으로써 시너지적인 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레졸, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 화학식 1의 p62 리간드 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 수화물, 용매화물 또는 프로드럭을 포함하는 변형단백질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품용 조성물은 건강기능식품으로서 그 자체로 제형화를 거쳐 사용되거나, 건강기능식품의 첨가물로서 다른 건강기능식품에 포함될 수 있다. 건강기능식품이란 질병의 예방 또는 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품용 조성물은 식품 또는 식품 첨가물의 제조에 사용되는 통상의성분들, 구체적으로, 향미제; 천연 탄수화물로서 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제; 영양제; 비타민; 전해질; 착색제; 유기산; 보호성 콜로이드 증점제; pH 조절제; 안정화제; 방부제; 글리세린; 알코올; 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 화학식 1로 표시되는 신규한 p62 리간드 실시예 1 내지 19의 화합물을 새롭게 합성하였다. 또한 본 발명에 따른 신규한 p62 리간드 화합물들이 배양된 세포에서 자가 포식 현상을 증가시킬 수 있는지를 평가하기 위하여 면역블로팅법을 통해 자궁경부암환자 유래 세포주인 Hela 세포주에 본 발명에 따른 신규한 p62 리간드 화합물을 처리하여 배양한 후, 배양 세포 내에서의 오토파지 활성을 확인하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물들을 처리한 시간에 따라 점증적으로 오토파지 활성의 표지자인 LC3의 수준이 증가함을 확인하여 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물들은 p62 단백질들을 활성화 및 올리고머화시켜 오토파고좀으로 전달시키는 동시에 오토파지 활성을 증대시켜 변성 단백질들의 응집체를 효과적으로 제거하는 것을 확인하였다.
[실시예]
이하의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
하기 표 1의 화합물을 이하의 실시예 1-19에 따른 방법에 따라 제조하였다.
Figure PCTKR2019009203-appb-T000001
Figure PCTKR2019009203-appb-I000007
본 발명의 화합물을 합성하기 위한 출발 물질의 경우, 다양한 합성법이 알려져 있으며, 상기 출발 물질이 시판되고 있는 경우는 공급처로부터 구매하여 사용할 수 있다. 시약공급처로는 Aldrich, Sigma, TCI, Wako, Kanto, Fluorchem, Acros, Alfa, Fluka 등의 회사가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 하기의 일반적인 방법 및 과정을 사용하여 쉽게 이용가능 한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 전형적인 또는 바람직한 공정 조건(즉, 반응온도, 시간, 반응물의 몰비, 용매, 압력) 등으로는 달리 언급하지 않는 한, 다른 공정 조건도 사용될 수 있다. 최적의 반응 상태는 사용된 특정 반응물 또는 용매에 따라 변할 수 있지만, 그러한 상태는 통상적인 최적화 과정에 의해 본 기술분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
이하, 상기 실시예 1 내지 실시예 19의 제조 방법에 대해 기술한다.
제조예 1) 하기 반응식 1에 개시된 방법으로 실시예 1, 2, 3, 12, 13, 14, 15, 18 및 19 화합물을 합성하였다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000008
실시예 1:(R)-1-(3,4-(비스(벤질옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YOK-1106)의 제조
단계1) 3,4-비스(벤질옥시)페놀(1102)의 제조
다이클로로메탄(15 ml)을 3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드(1101, 1.00 g, 3.0 mmol, 1 당량)에 넣어 용해한 후, mCPBA(0.78 g, 4.5 mmol, 1.5당량)을 반응물에 넣고 실온에서 4시간 교반한다. 반응물에 에틸아세테이트를 넣어 희석한 후, 탄산나트륨 포화수용액을 넣고 씻어준 후, 유기층을 분액한다. 유기층을 염화나트륨 수용액으로 씻어준 후, 무수황산나트륨으로 탈수하여 감압여과한다. 여과된 용액을 농축한 후, 다시 메탄올(10ml)에 용해한 후, 6N NaOH를 넣고 30분간 실온에서 교반한다. 반응물에 4N HCl 용액을 넣은 후, 30분간 더 교반한다. 반응물에 에틸아세테이트(50ml)를 넣어 희석한 후, 소금물로 씻어내고 이어서 무수황산나트륨을 넣어 탈수 및 감압여과한다. 여과된 용액을 농축한 후, 컬럼크로마토그래피(헥산/에틸아세테이트비율= 7/3)로 정제하여 3,4-비스(벤질옥시)페놀(1102, 0.87g, 수율90 %)을 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.25-7.42 (m, 10H), 6.80 (d, 1H, J =9.0 Hz), 6.48 (d, 1H, J = 3.0 Hz), 6.29 (dd, 1H, J = 3.0 and 9.0 Hz), 5.08 (d, 4H, J = 15 Hz), 4.55 (s, 1H); ESIMS m/z: 307.25 [M+H]+.
단계 2) R-2-((3,4-비스(벤질옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103)의제조
3,4-다이벤질옥시페놀(1102, 306mg, 1.0 mmol)을 에탄올(10ml)에 희석한 후, KOH수용액(KOH 66mg, 1.2 mmol, 1 ml)과 (R)-2-(클로로메틸)옥시란(410ul, 5.0 mmol)을 차례로 첨가한다. 반응물을 실온에서 5시간 교반한 후, 유기용매를 감압하여 제거한다. 농축된 반응물을 다시 에틸아세테이트로 희석한 후, 물로 씻어주고 이어서 소금물로 씻어준 후, 추출한 유기층을 무수황산나트륨으로 탈수한 후, 감압여과한다. 여과된 유기층을 농축해서 컬럼크로마토그래피로 정제하여 순수한 R-2-((3,4-비스(벤질옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103, 297mg, 수율82%)를 얻었다. ESIMS m/z: 363.5 [M+H]+.
단계 3) R-2-((3,4-비스(벤질옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103, 9 mg, 25 nmol)을 무수 에탄올(1ml)에 희석한 후, 2-아미노에탄-1-올(7.6 μL, 125nmol)을 첨가하고 4시간동안 실온에서 교반한다. TLC로 반응 확인한 후, 반응 용매를 감압 농축하고, 농축된 반응물에 물을 넣고 다이클로로메탄((3× 5 mL)으로 추출한다. 추출한 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수한 후, 감압 여과한다. 여과된 유기층을 농축해서 컬럼 크로마토그래피(다이클로로메탄:메탄올=19:1)로 정제하여 (R)-1-(3,4-(비스(벤질옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YOK-1106, 9.0 mg, 수율 85%)을 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz):δ 7.42-7.40 (m, 2H), 7.33-7.27 (m, 8H), 6.82 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 6.42 (d, 1H, J = 3.0 Hz), 6.28 (dd, 1H, J = 3.0 and 9.0 Hz), 5.09 (d, 1H, J = 12.9 Hz), 5.06 (s, 2H), 4.93 (d, 1H, J = 12.9 Hz), 4.35-4.25 (m, 1H), 3.94 (dd, 1H, J = 3.6 and 9.9 Hz), 3.89-3.72 (m, 3H), 3.34 (t, 1H, J = 11.4 Hz), 2.93 (brS, 2H), 2.80 (d, 1H, J = 10.8 Hz);ESIMS m/z: 424.67[M+H]+.
실시예 2:(R)-1-(3,4-(비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-1)의 제조
3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드(1101) 대신 3,4-비스((4-클로로벤질)옥시)벤즈알데하이드(1101-1)을 출발물질로 사용하여 실시예 19의 제조방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3,4-(비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-1)를 합성하였다. 1H NMR ( 400 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) 2.59 ( m, 4H ), 3.45 ( s, 2H ), 3.81 ( m, 3H ), 4.50 ( b, 1H ), 4.85 ( b, 1H ), 5.01 ( s, 2H ), 5.11 ( s, 2H ), 6.42 ( dd, J=8Hz and 2.8Hz, 1H ), 6.66 ( d, J=2.8Hz, 1H ), 6.92 ( d, J=8Hz, 1H ), 7.42 ( s, 4H ), 7.45 ( s, 4H ); ESI-MS Calcd m/z for C25H27Cl2NO5 [M+2]+ 493.90 Found 492.39
실시예 3:(R)-1-(3,4-(비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-2)의 제조
3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드(1101) 대신 3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)벤즈알데하이드(1101-2)을 출발물질로 사용하여 실시예 19의 제조방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3,4-(비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-2)를 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 2.82 ( m, 4H ), 3.69 ( t, J=5.2Hz, 2H ), 3.91 ( m, 2H ), 4.05 ( m, 1H ), 5.00 ( s, 2H ), 5.06 ( s, 2H ), 6.41( m, 1H ), 6.58 ( d, J=2.8Hz, 1H ), 6.84 ( d, J=8Hz, 1H ), 7.03 ( m, 4H ), 7.37 ( m, 4H ); ESI-MS Calcd m/z for C25H27F2NO5 [M+2]+ 461.0 Found 459.49
실시예 12:(R)-1-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-1104)의 제조
실시예 1의 제조 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 이소프로필 아민을 사용하여 (R)-1-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-1104)을 합성하였다.1H NMR ( 300 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 1.12 ( d, J=6 Hz, 6H ), 2.81 ( m, 5H ), 3.88 ( d, J=3 Hz, 2H ), 4.04 ( m, 1H ), 5.09 ( d, J=15 Hz ), 6.38 ( dd, J=9 Hz and 3 Hz, 1H ), 6.59 ( s, 1H ), 6.85 ( d, J=9 Hz, 1H ), 7.35 ( m, 10H ; ESI-MS Calcd m/z for C26H31NO4 [M+H]+ 422.42 Found 421.54
실시예 13:(R)-1-(3,4-다이페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-2204)의 제조
실시예 1의 제조방법 중, 단계 1에서 3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드(1101) 대신 3,4-다이페네톡시벤즈알데하이드(2201)을 출발물질로 사용한 것과, 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 이소프로필아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 제조방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3,4-다이페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-2204)를 합성하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 1.17 ( d, J=6Hz, 6H ), 2.79 ( dd, J=9Hz and 3Hz, 1H ), 2.95 ( m, 2H ), 3.08 ( m, 4H ), 3.34 ( b, 2H ), 3.89 ( m, 2H ), 4.13 ( m, 5H ), 6.37 ( dd, J=6Hz and 3Hz, 1H ), 6.52 ( d, J=3Hz, 1H ), 6.78 ( d, J=9Hz, 1H ), 7.25 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C28H35NO4 [M+H]+ 451.00 Found 449.59
실시예 14:(R)-1-(3,4-비스(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-3304)의 제조
실시예 1의 제조방법 중, 단계 1에서 3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드(1101)대신 3,4-비스(3-페닐프로폭시)벤즈알데하이드(3301)을 출발물질로 사용한 것과, 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 이소프로필아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3,4-비스(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-3304)를 합성하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.21 ( d, J=6Hz, 6H ), 2.12 ( m, 4H ), 2.83 ( t, J=9Hz, 5H ), 3.01 ( m, 2H ), 3.30 ( b, 3H ), 3.93 ( m, 6H ), 4.18 ( m, 1H ), 6.38 ( dd, J=6Hz and 3Hz, 1H ), 6.52 ( d, J=3Hz, 1H ), 6.80 ( d, J=9Hz, 1H ), 7.25 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C30H39NO4 [M+H]+ 479.09 Found 477.65
실시예 15:(R)-1-(3,4-비스(4-페닐부톡시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-4404)의 제조
실시예 1의 제조방법 중, 단계 1에서 3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드 (1101) 대신 3,4-비스(4-페닐부톡시)벤즈알데하이드(4401)을 출발물질로 사용한 것과, 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 이소프로필아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3,4-비스(4-페닐부톡시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-4404)를 합성하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) 1.26 ( dd, J=6Hz and 3Hz, 8H ), 1.81 ( m, 7H ), 2.66 ( t, J=6Hz, 4H ), 2.85 ( m, 1H ), 3.06 ( m, 2H ), 3.46 ( b, 2H ), 3.93 ( m, 6H ), 4.24 ( m, 1H ), 6.36 ( dd, J=6Hz and 3Hz, 1H ), 6.52 ( d, J=3Hz, 1H ), 6.78 ( d, J=9Hz, 1H ), 7.23 ( m, 10H ), ESI-MS Calcd m/z for C32H43NO4 [M+H]+ 505.70 Found 503.45
실시예 18:(R)-1-(3,4-비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YT-4-1)의 제조
실시예 1의 제조방법 중, 단계 1에서 3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드 (1101) 대신 3,4-비스(4-클로로벤질옥시)벤즈알데하이드(1101-1)을 출발물질로 사용한 것과, 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 이소프로필 아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3,4-비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YT-4-1)을합성하였다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.08 ( d, J=6.4Hz, 6H ), 2.68 ( dd, J=12Hz and 8Hz, 1H ), 2.83 ( m, 2H ), 3.88 ( d, J=5.2Hz, 2H ), 3.95 ( m, 1H ), 5.01 ( s, 2H ), 5.06 ( s, 2H ), 6.40 ( dd, J=8Hz and 4Hz, 1H ), 6.56 ( d, J=2.8Hz, 1H ), 6.82 ( d, J=8Hz, 1H ), 7.31 ( m, 8H ); ESI-MS Calcd m/z for C26H29Cl2NO4 [M+H]+ 491.40 Found 490.42
실시예 19:(R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YT-4-2)의 제조
실시예 1의 제조방법 중, 단계 1에서 3,4-비스(벤질옥시)벤즈알데하이드 (1101) 대신 3,4-비스(4-플루오로벤질옥시)벤즈알데하이드(1101-2)을 출발물질로 사용한 것과, 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 이소프로필 아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YT-4-2)을 합성하였다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.08 (d, J=6.4Hz, 6H), 2.68 (dd, J=12Hz and 8Hz, 1H), 2.83 (m, 2H), 3.89 (d, J=4Hz, 2H), 3.95 (m, 1H), 5.00 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 6.40 ( dd, J=8Hz and 2.8Hz, 1H), 6.59 (d, J=2.8Hz, 1H), 6.83 (d, J=9.6Hz, 1H), 7.03 (m, 4H), 7.37 (m, 4H); ESI-MS Calcd m/z for C26H29F2NO4 [M+H]+ 457.90 Found 457.52
제조예 2) 실시예 6-11은 아래의 반응식 2의 과정을 따라 합성하였다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000009
실시예 6:(R)-1-(2-((3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YOK-1109)의 제조
단계 1) R-2-((3,4-비스(벤질옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103, 500 mg, 1.38 mmol)을 메탄올(10 ml)에 용해한 후, tert-부틸 2-아미노에틸카바메이트(442 mg, 2.76 mmol)를 넣고 50 ℃에서 10시간 교반한다. 반응이 종료되면 반응 용매를 감압 농축한다.
단계 2) tert-부틸 (R)-(2-((3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)카마메이트(1105, 600 mg, 1.15 mmol)을 메탄올(3ml)에 용해한 후 메탄올/염산(3N, 2 ml)을 첨가한 후,실온에서 4시간 교반한다.반응이 종료되면 반응물을 감압 농축한 후(흰색 고체, 1106)정제 없이 다음 단계의 출발 물질로 사용한다.
단계 3) (R)-1-((2-아미노에틸)아미노)-3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)프로판-2-올(1106, 400 g, 0.95 mmol)을 DMF(3ml)에 용해한 후, 1H-피라졸-1-카르복스아미딘 염산염 (553 mg, 3.8 mmol)과 다이이소프로필에틸아민(0.3 g, 2.4 mmol)를 추가로 첨가한다.반응물을 30 ℃에서 12시간동안 교반한 후,감압 농축해서 고분해능 액체크로마토그래피로 정제해서 흰색 고체의 (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YOK-1109, 22 mg)을 합성하였다.1H NMR (400 MHz, DMSO+D2O) δ (ppm) 3.13 ( m, 4H ), 3.47 ( s, 2H ), 3.89 ( s, 2H ), 5.04 ( s, 2H ), 5.12 ( s, 2H ), 6.46 ( d, J=8Hz, 1H ), 6.67 ( s, 1H ), 6.97 ( d, J=8Hz, 1H ), 7.39 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C26H32N4O4 [M+H]+ 465.00 Found 464.57.
실시예 7:(R)-1-(2-((3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YOK-2209)의 제조
실시예 6의 제조방법 중, 단계 1에서 R-2-((3,4-비스(벤질옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103) 대신 R-2-((3,4-다이페네톡시페녹시)메틸)옥시란(2203)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(2-((3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YOK-2209)을 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ (ppm) 3.00 ( t, J=6.8Hz, 2H ), 3.06 ( t, J=6.8Hz, 2H ), 3.23 ( m, 1H ), 3.28 ( m, 3H ), 3.62 ( t, J=6.4Hz, 2H ), 6.46 ( dd, J=8Hz and 2.8Hz, 1H ), 6.60 ( d, J=2.8Hz, 1H ), 6.85 ( d, J=8Hz, 1H ), 7.25 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C28H36N4O4 [M+H]+ 493.00 Found 492.62
실시예 8:(R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-클로로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YT-9-1)의 제조
실시예 6의 제조방법 중, 단계 1에서 1103 대신 R-2-((3,4-비스(4-클로로벤질)옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103-1)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-클로로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YT-9-1)을 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO+D2O) δ (ppm) 3.13 ( m, 4H ), 3.47 ( t, J=6Hz, 2H ), 3.90 ( m, 2H ), 4.13 ( m, 1H ), 5.03 ( s, 2H ), 5.10 ( s, 2H ), 6.47 ( dd, J=8Hz and 2Hz, 1H ), 6.66 ( d, J=2.4Hz, 1H ), 6.97 ( d, J=8.8Hz, 1H ), 7.42 ( s, 4H ), 7.45 ( s, 4H ); ESI-MS Calcd m/z for C26H30Cl2N4O4 [M+H]+ 532.90 Found 533.45
실시예 9:(R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YT-9-2)의 제조
실시예 6의 제조방법 중, 단계 1에서 1103 대신 R-2-((3,4-비스(4-플루오로벤질)옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103-2)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 6의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘(YT-9-2)을 합성하였다.1H NMR ( 400 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) 3.13 ( m, 4H ), 3.45 ( t, J=6Hz, 2H ), 3.89 ( m, 2H ), 4.15 ( m, 1H ), 5.01 ( s, 2H ), 5.09 ( s, 2H ), 6.46 ( dd, J=8Hz and 2.8Hz, 1H ), 6.68 ( d, J=2.8Hz, 1H ), 6.96 ( d, J=9.2Hz, 1H ), 7.20 ( m, 4H ), 7.46 ( m, 4H ); ESI-MS Calcd m/z for C26H30Cl2N4O4 [M+H]+ 501.00 Found 500.55
실시예 10:(R)-1-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘 (YOK-1107)의 제조
단계 1) R-2-((3,4-비스(벤질옥시)페녹시)메틸)옥시란(1103, 500 mg, 1.38 mmol)을 메탄올(10 ml)에 용해한 후, 암모니아/메탄올 (2N, 3ml)를 넣고 50 ℃에서 10시간 교반한다.반응이 종료되면 반응 용매를 감압 농축한다.
단계 2) (R)-1-아미노-3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)프로판-2-올(1107, 300 mg, 0.8 mmol)을 DMF(3 ml)에 용해한 후,1H-피라졸-1-카르복스아미딘 염산염 (570 mg, 3.9 mmol)과 다이이소프로필에틸아민(0.3 g, 2.4 mmol)을 차례로 첨가한다.반응물을 30 ℃에서 12시간동안 교반한 후,감압 농축해서 고분해능 액체크로마토그래피로 정제해서 흰색 고체의 (R)-1-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘(YOK-1107, 23 mg)을 합성하였다 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) 3.20 ( m, 1H ), 3.31 ( m, 1H ), 5.03 ( s, 2H ), 5.12 ( s, 2H ), 6.44 ( dd, J=8.8Hz and 2.8Hz, 1H ), 6.68 ( d, J=2.8Hz, 1H ), 6.95 ( d, J=8Hz, 1H ), 7.38 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C24H27N3O4 [M+H]+ 422.00 Found 421.50.
실시예 11:(R)-1-(3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘 (YOK-2207)의 제조
실시예 10의 제조 방법 중, 단계 1에서 1103 대신 R-2-((3,4-다이페네톡시페녹시)메틸)옥시란(2203)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 10의 제조 방법과 동일한 과정으로 (R)-1-(3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘(YOK-2207, 25mg)을 합성하였다.1H NMR ( 400 MHz, CD3OD ) δ (ppm) 3.00 ( t, J=8Hz, 2H ), 3.06 ( t, J=8Hz, 2H ), 3.33 ( m, 1H ), 3.42 ( dd, J=24Hz and 4Hz, 1H ), 3.91 ( m, 2H ), 4.08 ( m, 3H ), 4.16 ( t, J=6.4Hz, 2H ), 6.46 ( dd, J=8Hz and 2Hz, 1H ), 6.60 ( d, J=2.8Hz, 1H ), 6.84 ( d, J=8Hz, 1H ), 7.25 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C26H31N3O4 [M+H]+ 450.00 Found 449.55.
제조예 3) 하기 반응식 3에 개시된 방법으로 실시예 4 및 5 화합물을 합성하였다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000010
실시예 4:(R)-1-(3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-7)의 제조
단계 1) 1,3-다이하이드록시벤젠(5.0 g, 45.4 mmol)을 아세토나이트릴(100ml)에 용해한 후, K2CO3를 첨가한다. 이어서 1-(브로모메틸)-4-클로로벤젠(9.3 g, 45.4 mmol)을 반응물에 첨가한 후, 80 ℃에서 16시간 교반한다. 실온으로 냉각한 후,반응 용매를 감압하여 농축한다.농축 잔유물에 물을 넣은 후,에틸 아세테이트로 추출한 후,유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수 및 감압 여과한다.여액을 취해 감압하여 농축한 후,컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/석유에테르 1:15~1:8)로 정제해서 밝은 노란색 오일형태의 3-((4-클로로벤질)옥시)페놀(2011, 2.3 g)을 합성하였다. 1H NMR ( 400 MHz, CD3OD ) δ (ppm) 5.03(s, 2H), 6.35-6.43(m, 3H), 7.04(t, 1H), 7.45(s, 4H), 9.41(s, 1H).
단계 2) 3-((4-클로로벤질)옥시)페놀(2011, 1.0 g, 4.2 mmol)을 에탄올(10 ml)에 녹인 후, (R)-2-(클로로메틸)옥시란(1.17g, 12.7 mmol), 정제수(1 ml), 그리고 KOH(0.24 g, 4.2 mmol)을 첨가한 후,실온에서 16시간동안 교반한다.반응물에 물(30 ml)을 넣고 에틸 아세테이트(30 ml)로 추출한다.물층을 에틸 아세테이트로 2회 더 추출한 후,유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수 및 감압 여과한다.여과된 액을 감압 농축하여 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/석유에테르 1:15~1:8)로 정제해서 무색 오일 형태의 (R)-2-((3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)메틸)옥시란(3011, 0.85 g)을 합성하였다.1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ (ppm) 2.74(m, 1H), 2.90(m, 1H), 3.34(m, 1H), 3.91-3.95(m, 1H), 4.18-4.22(m, 1H), 5.01(s, 2H), 6.52-6.59(m, 3H), 7.16-7.26(m, 1H), 7.35(s, 4H).
단계 3) (R)-2-((3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)메틸)옥시란(3011, 300 mg, 1.03 mmol)을 메탄올 (5 ml)에 녹인 후, 2-아미노에탄올(189 mg, 3.09 mmol)을 첨가한다.반응물을 65 oC에서 5시간 교반한다.실온으로 냉각한 후,반응 용매를 감압 농축해서 고분해능 액체 크로마토그래피로 정제해서 흰색의 고체인 (R)-1-(3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-7, 15 mg)을 합성하였다.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 2.83 ( m, 4H ), 3.69 ( m, 2H ), 2.96 ( m, 2H ), 4.08 ( m, 1H ), 5.00 ( s, 2H ), 6.55 ( m, 3H ), 7.18 ( t, J=8Hz, 1H ), 7.35 ( s, 4H ); ESI-MS Calcd m/z for C18H22ClNO4 [M]+ 352.00 Found 351.83
실시예 5:((R)-1-(3-((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-8)의 제조
실시예 4의 제조 방법 중, 단계 1에서 1-(브로모메틸)-4-클로로벤젠 대신 1-(브로모메틸)-4-플루오로벤젠을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4의 제조 방법과 동일한 과정으로 흰색 고체인((R)-1-(3-((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올(YT-6-8, 20mg)을 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 2.03 ( b, 3H ), 2.83 ( m, 4H ), 3.69 ( t, J=4.8Hz, 2H ), 3.96 ( m, 2H ), 4.08 ( m, 1H ), 4.99 ( s, 2H ), 6.56 ( m, 3H ), 7.07 ( m, 2H ), 7.18 ( t, J=8Hz, 1H ), 7.40 ( m, 2H ); ESI-MS Calcd m/z for C18H22FNO4 [M+H]+ 336.00 Found 335.38
제조예 4) 하기 반응식 4에 개시된 방법으로 실시예 16, 17 화합물을 합성하였다.
[반응식 4]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000011
실시예 16: (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-1204)의 제조
단계 1) 4-(벤질옥시)-3-페네톡시벤즈알데하이드(1201, 332 mg, 1.0 mmol)을 다이클로로메탄에 용해한 후,m-클로로퍼벤조산(mCPBA, 260 mg, 1.5 mmol)을 첨가한 후,실온에서 4시간 동안 교반한다.반응물에 과량의 에틸 아세테이트를 넣은 후,포화 탄산나탄산나트륨 포화 수용액을 넣고 씻어준 후, 유기층을 분액한다.유기층을 염화나트륨 수용액으로 씻어준 후,무수 황산나트륨으로 탈수하여 감압 여과한다.여과된 용액을 농축한 후,다시 메탄올(10 ml)에 용해한 후, 6N NaOH를 넣고 30분간 실온에서 교반한다.반응물에 4N HCl 용액을 넣은 후, 30분간 더 교반한다.반응물에 에틸 아세테이트(50 ml)를 넣어 희석한 후,소금물로 씻어내고 이어서 무수 황산나트륨을 넣어 탈수 및 감압 여과한다.여과된 용액을 농축한 후,컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸아세테이트비율= 7/3)로 정제하여4-(벤질옥시)-3-페네톡시페놀(1202, 310mg, 수율 90%)를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7.23-7.42(m, 10H), 6.77(d, 1H, J=9.0 Hz), 6.46(d, 1H), 6.28(dd, 1H, J=3.0 and 9.0 Hz), 4.98(s, 2H), 4.58(s, 1H), 4.20(t, 2H, J=6 Hz), 3.14(t, 2H, J=6 Hz).
단계 2) 4-(벤질옥시)-3-페네톡시페놀(1202, 320 mg, 1.0 mmol)을 에탄올(5 ml)에 희석한 후, KOH수용액(KOH 66 mg, 1.2 mmol, 1 ml)과 (R)-2-(클로로메틸)옥시란(410 ul, 5.0 mmol)을 차례로 첨가한다.반응물을 실온에서 5시간 교반한 후,유기용매를 감압하여 제거한다.농축된 반응물을 다시 에틸 아세테이트로 희석한 후,물로 씻어주고 이어서 소금물로 씻어준 후,추출한 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수한 후,감압 여과한다.여과된 유기층을 농축해서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 R-2-((4-(벤질옥시)-3-페네톡시페녹시)메틸)옥시란(1203, 308mg,수율 82%)를 얻었다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7.44-7.47(m, 2H), 7.26-7.39(m, 5H), 7.19-7.22(m, 3H), 6.84(d, 1H, J=6.0 Hz), 6.54(d, 1H, J=3.0 Hz), 6.36(dd, 1H), 5.07(s, 2H), 4.15(dd, 1H), 4.00(t, 2H, J=6.0 Hz), 2.84 (t, 2H, J=9.0 Hz), 2.73 (dd, 1H), 2.10-2.19 (m, 2H);ESIMS m/z: 363.5 [M+H]+.
단계 3) R-2-((4-(벤질옥시)-3-페네톡시페녹시)메틸)옥시란(1203, 9.4 mg, 25 nmol)을 무수 에탄올(1ml)에 희석한 후, 이소프로필아민(10 μL, 125 nmol)을 첨가하고 4시간 동안 실온에서 교반한다. TLC로 반응 확인한 후, 반응 용매를 감압 농축하고, 농축된 반응물에 물을 넣고 다이클로로메탄((3× 5 mL)으로 추출한다. 추출한 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수한 후, 감압 여과한다. 여과된 유기층을 농축해서 컬럼 크로마토그래피(다이클로로메탄:메탄올=19:1)로 정제하여 (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-1204, 9.3 mg, 수율 86%)을 얻었다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.15 (d, J=6Hz, 6H), 2.71 ( m, 4H ), 2.80 ( m, 2H ), 3.14 ( t, J=6Hz, 2H ), 3.91 ( d, J=3Hz, 2H ), 4.09 ( m, 1H ), 4.21 ( t, J=6Hz, 2H ), 4.99 ( s, 2H ), 6.35 ( dd, J=6Hz and 3Hz, 1H ), 6.54 ( d, J=3Hz, 1H ), 6.82 ( d, J=9Hz, 1H ), 7.26 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C27H33NO4 [M+H]+ 437.00 Found 435.56.
실시예 17: (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-1304)의 제조
실시예 16의 제조 방법 중, 단계 1에서 출발 물질을4-(벤질옥시)-3-페네톡시벤즈알데하이드(1201) 대신 4-(벤질옥시)-3-(3-페닐프로폭시)벤즈알데하이드(1301, 346 mg, 1.0 mmol)을 사용하여 실시예 16의 제조 방법과 동일한 과정으로 흰색 고체인 (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올(YOK-1304, 9.5 mg, 수율 85%)을 합성하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.13 (d, J=6Hz, 6H), 2.15 ( m, 2H ), 2.33 ( b, 3H ), 2.80 ( m, 5H ), 3.91 ( d, J=6Hz, 2H ), 4.01 ( m, 3H ), 5.07 ( s, 2H ), 6.36 ( dd, J=6Hz and 3Hz, 1H ), 6.53 ( d, J=3Hz, 1H ), 6.84 ( d, J=9Hz, 1H ), 7.33 ( m, 10H ); ESI-MS Calcd m/z for C28H35NO4 [M+H]+ 451.00 Found 449.59.
제조예 5) 하기 반응식 5에 개시된 방법으로 비교예 1 및 2 화합물을 합성하였다.
[반응식 5]
Figure PCTKR2019009203-appb-I000012
비교예 1: 메틸 (R)-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)글라이신에이트(YOK-G-1104)의 제조
실시예 19의 제조방법 중, 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 글라이신 메틸 에스터를 이용한 것을 제외하고는 실시예 19의 제조 방법과 동일한 과정으로 메틸 (R)-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)글라이신에이트(YOK-G-1104)를 합성하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.55(m, 1H), 2.81(m, 1H ), 3.51 (s, 2H), 3.66(s, 3H), 4.05(m, 1H), 4.20(m, 2H), 5.16(s, 2H), 5.18(s, 2H), 5.37(br s, 1H), 5.52(br s, 1H), 6.57(s, 1H), 6.67(d, 1H), 6.96(d, 1H), 7.32-7.48(m, 10H).
비교예 2: 에틸 (R)-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)알라닌에이트(YOK-A-1104)의 제조
실시예 19의 제조방법 중, 단계 3에서 2-아미노에탄-1-올 대신 알라닌 에틸에스터를 사용한 것을 제외하고는 실시예 19의 제조 방법과 동일한 과정으로 에틸 (R)-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)알라닌에이트(YOK-A-1104)를 합성하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.21(t, 3H), 1.27(m, 3H), 2.56-2.81(m, 2H), 3.56(m, 1H), 4.05(m, 1H), 3.95-4.20(m, 4H), 5.16(s, 2H), 5.18(s, 2H), 5.37(br s, 1H), 6.57(s, 1H), 6.67(d, 1H), 6.96(d, 1H), 7.32-7.48(m, 10H).
실험예 1.면역블로팅을 통한 배양 세포 내 p62 단백질 올리고머와 활성 평가
상기 화합물들(실시예 1-19)의 p62 단백질 올리고머화 활성 효능을 평가하기 위해 인간 배아 신장 유래세포인 HEK293 세포주를 취합하였다. 본 화합물들 중 대표 화합물로서 YOK-1104, YOK-2204, YOK-3304, YOK-1204, YOK-4404, YOK-1107, YOK-1109, YOK-2207, YOK-2209, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-6-2, YT-6-7, YT-6-8, YT-9-1, YT-9-2을 선택하고, 이들 선택된 대표 화합물의 처리에 따른 세포 내 p62 단백질 활성화 및 올리고머화를 측정하기 위하여, 100파이 디시에 각각의 세포를 분주하였다. 세포가 플레이트의 표면에 완전히 부착되도록 24 시간의 추가적인 배양한 후 세포를 취합하였고, 각 샘플에100 ul의 용해버퍼(20 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM NaF, 2 mM EDTA, 2 mM beta-glycerophosphate, 5 mM sodium orthovanadate, 1 mM PMSF, leupeptin, aproteinin)을 주입하고 세포를 용해시켰다. 측정된 총 단백질의 농도를 기반으로 각 샘플에 상온에서 2시간 동안 시험 화합물들을 처리한후, 샘플버퍼를 추가하여 95℃에서 10분간 반응시켰다. 반응을 마친 샘플들로부터 25 ul를 취하여 아크릴아마이드 겔의 각 웰에 분주한 후 면역블로팅법을 실시하였다. 면역블로팅법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물을 처리한 경우 화합물들의 처리에 따라 p62 단백질의 단위체(monomer)의 감소와 동시에 올리고머(oligomer)와 고분자량 응집체(high-molecular aggregates)의 증가를 확인할 수 있다.
실험예 2.면역블로팅을 통한 배양 세포 내 오토파지 활성 평가
상기 화합물들(실시예 1-19)의 오토파지 활성 효능을 평가하기 위해 자궁경부암 환자 유래 세포인 Hela 세포주를 5% 이산화탄소가 유지되는 배양기내에서 10% FBS와 1% 스트렙토마이신/페니실린을 함유한 DMEM배지를 사용하여 배양하였다. 본 화합물들 중 대표 화합물로서 YOK-1107, YOK-4404, YOK-1104를 선택하고, 이들 선택된 대표 화합물의 처리에 따른 오토파지 활성도를 측정하기 위하여, 6웰 플레이트에 각각의 세포를 분주하였다. 세포가 플레이트의 표면에 완전히 부착되도록 24 시간의 추가적인 배양을 하였다. 각각의 화합물이 오토파지현상을 증가시킬 수 있는 농도를 찾기 위해 시험 화합물들을 1, 2, 5, 10, 20 μM로 희석하여 처리하였다. 각 화합물 처리 후 세포를 다시 세포배양기에서 24시간 배양한 후 세포를 취합하였다. 취합된 세포로부터 단백질을 추출하기 위해 각 샘플에 100 ul의 용해버퍼(20 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM NaF, 2 mM EDTA, 2 mM beta-glycerophosphate, 5 mM sodium orthovanadate, 1 mM PMSF, leupeptin, aproteinin)을 주입하고 세포를 용해시켰다. 측정된 총 단백질의 농도를 기반으로 각 샘플에 샘플버퍼를 추가하여 100℃에서 5분간 반응시켰다. 반응을 마친 샘플들로부터 5 ul를 취하여 아크릴아마이드 겔의 각 웰에 분주한 후 면역블로팅법을 실시하였다. 면역블로팅법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물을 처리한 경우 화합물들의 농도에 따라 점증적으로 마크로오토파지 활성의 표지자인 LC3의 수준이 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 면역블로팅을 통한 배양 세포 내 오토파지 활성 평가
상기 화합물들(실시예 1-19)의 오토파지 활성 효능을 조사하기 위해 LC3를 마커로 사용해서 실험예 2와 같은 방법으로 면역블로팅법을 수행하였다. 차이점으로는 활성화에 요구되는 처리 시간 및 활성 유지 시간을 평가하기 위해 1, 3, 6, 12, 24, 48 시간 동안 5 μM의 본 화합물들 중 선택된 대표 화합물로서 YOK-1107, YOK-1204, YOK-1304, YOK-2204, YOK-3304, YOK-4404를 처리하였다. 다른 한편으로는, 24 시간 동안 10 μM의 본 화합물들 중 선택된 대표 화합물 YOK-1107, YOK-1109, YOK-2207, YOK-2209, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-6-2, YT-6-8, YT-6-7, YT-9-1, YT-9-2를 처리하였다. 면역블로팅법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물을 처리한 경우 화합물들의 처리함에 따라 점증적으로 마크로오토파지 활성의 표지자인 LC3의 수준이 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 면역블로팅을 통한 배양 세포 내 오토파지 활성 평가
대조군 화합물의 오토파지 활성 효능을 조사하기 위해 LC3를 마커로 사용해서 실험예 2와 같은 방법으로 면역블로팅을 수행하였다. 대조군 화합물로서는 하기 구조를 갖는 화합물들을 사용하였다.
Figure PCTKR2019009203-appb-T000002
Figure PCTKR2019009203-appb-I000013
상기 화합물들을 시간별 또는 농도별로 처리하여 확인하였으며 면역블로팅법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 대조군 화합물들은 처리한 시간 또는 농도와 상관없이 마크로오토파지 활성의 표지자인 LC3의 수준이 증가하지 않음을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 면역형광염색법 및 공초점 현미경을 통한 배양 세포 내 오토파지 활성 평가
상기 화합물들(실시예 1-19)의 p62 단백질 활성 및 오토파지현상의 활성 정도를 파악하기 위하여 p62와 LC3를 마커로 사용해서 면역형광염색법을 수행하였다. 배양된 세포 내에서 신규 p62 리간드와 이의 이성질체에 의한 p62 활성 및 오토파지현상의 활성 정도를 파악하기 위해서 자궁경부암환자 유래 세포주인 Hela 세포주에 신규 p62 리간드 화합물(YOK-1106, YOK-1204, YOK-1504, YOK-2204, YOK-3304, YOK-4404, YOK-1107, YOK-1109, YOK-2207, YOK-2209, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-9-1 및 YT-9-2)을 처리하여 배양한 후, 오토파지현상의 표지자로서 LC3의 반점 발현 정도와 위치 및 p62와의 반점 위치 공존성을 관찰하였다.
면역형광염색을 위해 24-웰 플레이트에 커버글라스를 위치시키고 세포를 분주하여 24시간 배양한 후, 5 uM의 본 발명에 따른 신규 p62 리간드를 처리하였다. 화합물의 작용을 위해 24시간을 추가로 배양한 뒤 배지를 제거하고, 상온에서 포름알데하이드를 이용하여 세포를 고정하였다. 비특이적 염색을 막기 위해 세포를 차단 용액에 상온에서 1시간 반응시킨 뒤 차단용액을 이용하여 일정비율로 희석된 LC3 항체를 처리한 뒤 상온에서 1시간 반응시켰다. 항체 처리가 완료된 세포는 PBS로 3회 세척하고 차단용액을 이용하여 염소유래 이차항체를 일정비율로 희석한 뒤, 상온에서 30분 반응시켰다. 다시 PBS로 3회 세척하고 세포 내 핵 염색을 위해 DAPI 염색 후 공초점 현미경을 통해 p62 또한 LC3의 발현 정도, 세포 내 반점 형성 및 세포 내 공존하는 정도를 관찰하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 면역형광염색법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물들을 처리한 후 p62 단백질의 세포내 반점 형성, 오토파고좀 표지자인 LC3의 세포내 반점과 위치 공존성 증가 및 LC3의 세포내 반점 형성이 증가함을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 면역형광염색법 및 공초점 현미경을 통한 배양 세포 내 오토파지 활성 평가
대조군 화합물(YOK-A-1104, YOK-G-1104, YTK-1005, YTK-1105-1)의 p62 단백질 활성 및 오토파지현상의 활성 정도를 파악하기 위하여 p62와 LC3를 마커로 사용해서 실험예 4와 같은 방법으로 면역형광염색법을 수행하였다. YOK-A-1104, YOK-G-1104는 다음 화학식을 갖는 화합물이다.
Figure PCTKR2019009203-appb-T000003
화합물을 농도별로 처리하여 p62 또는 LC3의 세포내 반점, 즉 오토파고좀이 형성되고 p62가 전달되는 정도를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 7 에 나타내었다. 면역형광염색법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군 화합물들을 처리한 농도와 상관없이 p62 단백질의 세포내 반점 형성, 오토파고좀 표지자인 LC3의 세포내 반점과 위치 공존성 증가 및 LC3의 세포내 반점 형성이 증가하지 않음을 확인할 수 있었다.
실험예 7. 면역형광염색법 및 공초점 현미경을 통한 배양 세포 내 유비퀴틴화 된 단백질이 p62로 매개되는 오토파지로 전달 활성 평가
상기 화합물들(실시예 1-19)의 유비퀴틴화 된 단백질들의 p62로 매개되는 오토파지 전달 활성 정도를 파악하기 위하여 p62와 FK2를 마커로 사용해서 실험예 4와 같은 방법으로 면역형광염색법을 수행하였다. 화합물은 YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-6-7, YT-6-8, YOK-4404, YOK-1106, YOK-1107, YOK-1109, YOK-1204, YOK-1204를 처리하였다. 화합물을 처리한후 p62 또는 FK2의 세포내 반점, 즉 p62와 유비퀴틴화 된 단백질들이 오토파고좀으로 전달되는 정도를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 8a 및 8b 에 나타내었다. 면역형광염색법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였다.
도 8a 및 8b 에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물들을 처리한 후 p62 단백질과 유비퀴틴화 된 단백질들의 표지자인 FK2의 세포내 반점 형성 및 이 반점들의 위치 공존성 증가를 확인할 수 있었다.
실험예 8. 면역형광염색법 및 공초점 현미경을 통한 배양 세포 내 변성 헌팅틴 단백질이 p62로 매개되는 오토파지로 전달 활성 평가
상기 화합물들(실시예 1-19)의 퇴행성뇌질환 헌팅턴병의 주요 단백질인 변성 헌팅틴(Htt-Q103)이 p62로 매개되는 오토파지 전달 활성 정도를 파악하기 위하여 p62와 Htt-Q103-GFP를 마커로 사용해서 실험예 4와 같은 방법으로 면역형광염색법을 수행하였다. 화합물은 YOK-1106, YOK-1107, YOK-1109, YOK-1204, YOK-2204, YOK-4404, YT-4-1, YT-4-2, YT-6-1, YT-6-7, YT-9-1을 사용하였다. 화합물을 처리한후 p62 또는 Htt-Q103-GFP의 세포내 반점, 즉 p62와 변성 헌팅틴 단백질들이 오토파고좀으로 전달되는 정도를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 9a 및 9b 에 나타내었다. 면역형광염색법은 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 대표적인 것을 도식화하였다.
도 9a 및 9b 에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 p62 리간드 화합물들을 처리한 후 p62 단백질과 유비퀴틴화 된 단백질들의 표지자인 FK2의 세포내 반점 형성 및 이 반점들의 위치 공존성 증가를 확인할 수 있었다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 p62 리간드 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019009203-appb-I000014
    상기 화학식 1에서,
    W는 C6-C10 아릴이고;
    L은 -O-(CH2)n1-CH(OH)-이고, 단, 상기 -O-(CH2)n1-CH(OH)- 중 O가 벤젠 고리에 결합되고, 이때 n1은 1 내지 4의 정수이고;
    m은 0 내지 2의 정수이고;
    Ra는 R1 또는 -OR1이고,
    이때, R1은 수소, 또는 -(CH2)n2-R'1이고,
    R'1은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 할로겐, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 니트로, 아미노, (C1-4 알킬)아미노, 또는 디(C1-4 알킬)아미노로 치환된 페닐이고
    n2는 1 내지 6의 정수이고;
    Rb는 -OR2이고,
    이때, R2는 H, 또는 -(CH2)n3-R'2이고,
    R'2은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 할로겐, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 니트로, 아미노, (C1-4 알킬)아미노, 또는 디(C1-4 알킬)아미노로 치환된 페닐이고,
    n3은 1 내지 6의 정수이고;
    Rc는 -(CH2)n4-OH, -(CH2)n4-NH-C(=NH)NH2, -C(=NH)NH2, C1-6 알킬, -CH(R3)-COO-R4, 또는 -CH(COO-R4)-CH2CH2CH2-NH-C(=NH)NH2, -(CH2)n4-O-(CH2)n4-OR4, -CONH(CH2)n4-OR4, -CO(CH2)n5-OR4, -(CH2)n5-CH(NH2)-COOR4, 또는 -(CH2)n5-CONHR4 이고,
    n4는 2 내지 4의 정수이고,
    n5는 1 내지 4의 정수이고,
    R3는 수소, 또는 C1-4 알킬이고,
    R4는 수소, 또는 C1-4 알킬이다,
  2. 제1항에 있어서,
    상기 W는 페닐이고,
    n1은 1 또는 2인 것인, 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Ra는 수소, 또는 -O-(CH2)n2-R'1이고, R'1은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 플루오로, 클로로, 브로모, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 니트로, 아미노 또는 디메틸아미노로 치환된 페닐이고, n2는 1 내지 4의 정수인, 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Rb는 하이드록시, 또는 -O-(CH2)n3-R'2이고, R'2은 비치환되거나; 또는 하이드록시, 플루오로, 클로로, 브로모, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 니트로, 아미노 또는 디메틸아미노로 치환된 페닐이고, n3은 1 내지 4의 정수인, 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 Rc는 -(CH2)n4-OH, -(CH2)n4-NH-C(=NH)NH2, -C(=NH)NH2, 메틸, 에틸, 또는 이소프로필이고, n4는 2 내지 3의 정수인, 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물이 하기 화합물 1) 내지 19)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭:
    1) (R)-1-(3,4-(비스(벤질옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YOK-1106);
    2) (R)-1-(3,4-(비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-1);
    3) (R)-1-(3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-2);
    4) (R)-1-(3-((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-7);
    5) (R)-1-(3-((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-((2-하이드록시에틸)아미노)프로판-2-올 (YT-6-8);
    6) (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YOK-1109);
    7) (R)-1-(2-((3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YOK-2209);
    8) (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-클로로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YT-9-1);
    9) (R)-1-(2-((3-(3,4-비스(4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)아미노)에틸)구아니딘 (YT-9-2);
    10) (R)-1-(3-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘 (YOK-1107);
    11) (R)-1-(3-(3,4-다이페네톡시페녹시)-2-하이드록시프로필)구아니딘 (YOK-2207);
    12) (R)-1-(3,4-비스(벤질옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-1104);
    13) (R)-1-(3,4-다이페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-2204);
    14) (R)-1-(3,4-비스(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-3304);
    15) (R)-1-(3,4-비스(4-페닐푸톡시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-4404);
    16) (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-페네톡시페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-1204);
    17) (R)-1-(4-(벤질옥시)-3-(3-페닐프로폭시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YOK-1304);
    18) (R)-1-(3,4-비스((4-클로로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YT-4-1); 및
    19) (R)-1-(3,4-비스((4-플루오로벤질)옥시)페녹시)-3-(이소프로필아미노)프로판-2-올 (YT-4-2).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭을 포함하는, 단백질이상질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단백질이상질환은 신경변성질환, 항알파1안티트립신 결핍증, 각막증, 색소 성 망막염, 타입 2 당뇨병 또는 낭포 성 섬유증 것인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 신경변성질환은 라임병(Lyme borreliosis), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia), 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD), 다발성경화증(multiple sclerosis; MS), 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 간질(epilepsy), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중(stroke), 헌팅턴병(huntington's disease), 피크병(Picks disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 척수소뇌실조증, 기타 폴리-Q 질환, 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 1차 전신 아밀로이드증(AL 아밀로이드증), 반응성 전신 아밀로이드증(AA 아밀로이드증), 타입 Ⅱ 당뇨병, 주사-국소화 아밀로이드증, 베타-2 마이크로글로불린 아밀로이드증, 유전성 비-신경병 아밀로이드증, 및 핀란드 유전성 전신 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭을 포함하는, 변성 단백질의 오토파지 활성 증가용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질은 암유발 단백질, 프리온 단백질, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 알파-시누클레인, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 타우, 면역글로불린, 아밀로이드-A, 트랜스타이레틴, 베타2-마이크로글로불린, 시스타틴 C, 아포 지단백질(Apolipoproteine) A1, TDP-43, 섬 아밀로이드 폴리펩티드(islet amyloid polypeptide), ANF, 겔솔린(gelsolin), 인슐린, 리소자임, 피브리노겐, 헌팅틴(huntingtin) 및 아탁신과, Poly-Q 연신을 갖는 기타 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭을 포함하는, 단백질이상질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백질이상질환은 신경변성질환, 항알파1안티트립신 결핍증, 각막증, 색소 성 망막염, 타입 2 당뇨병 또는 낭포 성 섬유증인 것인, 식품조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신경변성질환은 라임병(Lyme borreliosis), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia), 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD), 다발성경화증(multiple sclerosis; MS), 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 간질(epilepsy), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중(stroke), 헌팅턴병(huntington's disease), 피크병(Picks disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 척수소뇌실조증, 기타 폴리-Q 질환, 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 1차 전신 아밀로이드증(AL 아밀로이드증), 반응성 전신 아밀로이드증(AA 아밀로이드증), 타입 Ⅱ 당뇨병, 주사-국소화 아밀로이드증, 베타-2 마이크로글로불린 아밀로이드증, 유전성 비-신경병 아밀로이드증, 알렉산더증 및 핀란드 유전성 전신 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식품조성물.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 p62 리간드 화합물을 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 변성 단백질 응고체 분해를 증대시키는 방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 p62 리간드 화합물을 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 오토파지 활성화 방법.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 p62 리간드 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 p62 단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 단백질이상질환의 예방, 개선 또는 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단백질이상질환은 암 신경변성질환, 항알파1안트트립신 결핍증, 각막증, 색소 성 망막염, 타입 2 당뇨병 또는 낭포 성 섬유증인 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 신경변성질환은 라임병(Lyme borreliosis), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia), 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob Disease; CJD), 다발성경화증(multiple sclerosis; MS), 치매(dementia), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 간질(epilepsy), 파킨슨병(Parkinson's disease), 뇌졸중(stroke), 헌팅턴병(huntington's disease), 피크병(Picks disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 척수소뇌실조증, 기타 폴리-Q 질환, 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 1차 전신 아밀로이드증(AL 아밀로이드증), 반응성 전신 아밀로이드증(AA 아밀로이드증), 타입 Ⅱ 당뇨병, 주사-국소화 아밀로이드증, 베타-2 마이크로글로불린 아밀로이드증, 유전성 비-신경병 아밀로이드증, 알렉산더증 및 핀란드 유전성 전신 아밀로이드증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 방법.
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