KR101723514B1 - Sno-ogt 억제제를 포함하는 알츠하이머병, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포에서 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준을 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법 또는 SNO-OGT 억제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환, 예컨대 알츠하이머의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 베타아밀로이드에 의하여 유도되는 SNO-OGT에 의해서 타우 단백질의 과인산화 또는 타우 단백질의 하이포-오글루넥당화가 유도되므로, 시료에서 SNO-OGT의 수준을 감소시키는 물질을 확인함으로써 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝할 수 있으며, OGT 내의 S-니트로실화 부위인 Cys845, Cys921 또는 Cys965에서 S-니트로실화를 억제할 수 있는 물질을 이용하여 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

SNO-OGT 억제제를 포함하는 알츠하이머병, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmecuetical composition for preventing or treating of Alzheimer disease, neurodegenerative disease containing SNO-OGT inhibitor}

본 발명은 신경세포에서 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준을 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법 또는 SNO-OGT 억제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 장애는 주로 베타아밀로이드(beta-amyloid: Aβ)의 축적으로 인한 것으로 알려져 왔으며, 이들 단백질이 응집되어 형성된 플라크(plaque)를 제거하기 위한 연구에 집중되어 왔다. 최근들어 타우(Tau) 단백질이 비정상적인 구조를 가지면서 내포체(inclusion body)를 형성하고 이로 인한 퇴행성 뇌질환이 발생된다는 연구가 발표된 바 있어 타우 단백질이 이들 질환에 새로운 표적으로 대두되고 있다.

타우 단백질은 철도의 연결 철근처럼 미세소관을 안정화시키는 데 필요한 물질로서 타우 단백질이 과도하게 축적되면 미세소관이 붕괴되면서 정상 신경세포의 네트워크가 와해되는 것으로 알려져 있다. 타우 단백질이 축적되는 원인으로는 타우 단백질에 인이 과도하게 부착되어 인산화로 인한 중량체를 형성하는 데에 있다. 이들 타우 단백질이 축적되고 신경세포의 응집으로 인한 질환을 타우병증(tauopathy)이라 불리고 있으며 여러 가지의 퇴행성 뇌질환의 원인으로 지목되고 있다.

그러나 종래 신경 퇴행성 질환 치료제에 있어서 타우 단백질을 표적으로 한 뇌질환 치료제는 많이 개발되지 않고 있으며, 특히, 타우 단백질이 매개하는 뇌질환은 구체적으로 어떠한 기작으로 신호 전달을 하고 독성을 나타내는지 정확히 규명되지 않고 있어 타우병증과 관련된 질환에 아직까지 뚜렷한 치료법이나 치료제가 존재하지 않고 있다. 따라서, 궁극적인 치료제 개발을 위하여 독성을 일으키는 기작을 충분히 규명하고 그 기작을 특이적으로 억제할 수 있는 치료제에 대한 연구가 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 베타아밀로이드 독성을 유발하는 SNO-OGT에 대한 작용기전 및 OGT 내 Cys-NO 결합 위치에 대한 연구를 수행한 결과 SNO-OGT에 대한 작용기전을 이용하여 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝을 달성할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 신경세포에 베타아밀로이드(Aβ) 펩타이드를 처리하고 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 후보물질을 처리하고 SNO-OGT 수준을 감소시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 억제제를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 신경세포에 베타아밀로이드(Aβ) 펩타이드를 처리하고 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 후보물질을 처리하고 SNO-OGT 수준을 감소시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 억제제를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 베타아밀로이드에 의하여 유도되는 SNO-OGT에 의해서 타우 단백질의 과인산화 또는 타우 단백질의 하이포-오글루넥당화가 유도되므로, 시료에서 SNO-OGT의 수준을 감소시키는 물질을 확인함으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝할 수 있으며, OGT 내의 S-니트로실화 부위인 Cys845, Cys921 또는 Cys965에서 S-니트로실화를 억제할 수 있는 물질을 이용하여 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 베타아밀로이드가 SNO-OGT를 유발하는지 여부를 biotin-switch assay를 통하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 OGA의 활성이 베타아밀로이드에 의해 변화하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 베타아밀로이드의 처리에 의해 세포 내로 칼슘 이온의 유입이 증가하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 칼슘 이오노포어(A23187)와 탑시가르긴(thapsigargin)이 오글루넥당화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 베타아밀로이드의 처리가 NO(Nitric Oxide)의 생성을 촉진하는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 OGT와 nNOS 사이에 상관관계가 있는지 여부를 면역침전법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 nNOS의 저해가 오글루넥당화의 정상화를 유도하는지 여부를 면역블롯팅과 biotin-switch assay를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 nNOS의 저해가 오글루넥당화의 정상화를 유도하는지 여부를 면역블롯팅과 biotin-switch assay를 통해 확인한 결과를 수치화한 그래프이다.
도 9는 베타아밀로이드와 SNO-Akt의 관계를 면역블롯 분석법 및 면역침전법을 통해서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 베타아밀로이드와 SNO-Akt의 관계를 면역블롯 분석법 및 면역침전법을 통해서 확인한 결과를 수치화한 그래프이다.
도 11은 세포내 하이포-오글루넥당화가 ROS를 유발하는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 세포내 과잉생성된 ROS가 글루코사민에 의해 정상 수준으로 회복됨을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 베타아밀로이드 처리에 의한 세포 사멸을 MTT 분석법에 의해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 OGT를 과발현하는 세포에서 OGT 발현에 의한 오글루넥당화의 패턴을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 하이퍼-오글루넥당화에 의해 세포내로 칼슘 이온의 유입이 차단되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 메만틴에 의해 NMDA에 의해 매개된 칼슘 이온의 유입이 차단되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 메만틴에 의해 NMDA에 의해 매개된 칼슘 이온의 유입이 차단되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 메만틴에 의해 NMDA에 의해 매개된 오글루넥당화가 억제되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 베타아밀로이드에 의한 SNO의 증가, 오글루넥당화의 감소, 및 인산화된 GSK3β(p-GSK3β)의 감소를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 인간 ncOGT를 도식화하여 나타낸 도이다.
도 21은 인간 ncOGT의 506번째 아미노산에서 1007번째 아미노산까지의 서열을 나타낸 도이다.
도 22는 OGT의 CAT 도메인과 TPR 도메인 중 어떤 도메인이 SNO-Cys 결합을 갖는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 OGT의 CAT 도메인 내의 시스테인 잔기 중 SNO-Cys 결합을 갖는 잔기를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 OGT 내의 시스테인을 돌연변이시킨 후 시스테인 잔기가 OGT 활성에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 SNO-OGT 내의 Cys-NO 결합 트리플렛의 SNO 모티프를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 SNO-OGT와 관련된 메커니즘을 도식화하여 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 신경세포에 베타아밀로이드(Aβ) 펩타이드를 처리하고 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 후보물질을 처리하고 SNO-OGT 수준을 감소시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 방법 중 각 단계에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명의 (a) 단계는, 신경세포에 베타아밀로이드(Aβ) 펩타이드를 처리하고 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준을 확인하는 단계이다.

본 발명에서 신경세포는 개체로부터 분리된, 타우 단백질을 발현하는 세포일 수 있으며, 바람직하게는 신경아세포종일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 개체는 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 소, 양, 쥐, 및 원숭이를 포함한 포유동물로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서 "후보물질"은 퇴행성 뇌질환을 완화, 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 화학물질, 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 유전자, 단백질, 식품, 제형, 화합물, 조성물, 의약, 영양보조제, 건강관리제품 또는 음료 등의 물질을 제한 없이 포함한다.

본 발명에서 "베타아밀로이드(Aβ) 펩타이드"는 이의 축적에 의하여 알츠하이머가 발생하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 베타아밀로이드는 세포 내로의 칼슘 이온의 유입을 증가시키는 역할을 하며, 상기 칼슘 이온의 세포 내로의 유입은 NMDA-R을 통하여 이루어짐을 본 발명의 구체적인 실시예로 확인하였다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 시료에 처리하는 후보물질은 0.001 내지 5 mM의 농도인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않고 시료의 양에 따라 당업자에 의해 적절한 농도로 선택될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 시료에 처리하는 베타아밀로이드는 10 내지 100 μM, 바람직하게는 50μM 이나, 이제 제한되지 않고 시료의 양에 따라 당업자에 의해 적절한 농도로 선택될 수 있다.

본 발명에서 후보물질 및 베타아밀로이드는 동시에, 또는 순차로 처리할 수 있다.

본 발명에서 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준의 확인은 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해서 수행할 수 있으나, 바람직하게는 biotin-switch assay에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에서 "SNO-OGT 수준"이란 OGT에 SNO가 결합된 형태로 존재하는 단백질의 발현 수준을 말하며, S-니트로실화된 OGT의 발현 수준을 의미한다.

또한 본 발명에서 SNO-OGT의 확인은 OGT 내에 존재하는 Cys845-NO(nitric oxide) 결합(linkage), Cys921-NO 결합, Cys965-NO 결합을 측정함으써 수행할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 OGT에 존재하는 Cys 잔기 중 Cys845, Cys921, Cys965가 NO와의 결합에 관여함을 확인하였다. 따라서, OGT 내에 존재하는 Cys845-NO(nitric oxide) 결합(linkage), Cys921-NO 결합 및 Cys965-NO 결합 중 1종 이상을 포함하는 결합을 측정함으로써 SNO-OGT의 수준을 측정할 수 있다.

본 발명의 (b) 단계는, 후보물질을 처리하고 SNO-OGT 수준을 감소시키는 후보물질을 선별하는 단계이다.

본 발명에서 선별된 후보물질은 OGT의 S-니트로실화를 억제하는 것을 특징으로 하며, 상기 선별된 후보물질은 OGT 내 Cys845, Cys921 및 Cys965로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 잔기에서 OGT의 S-니트로실화를 억제할 수 있다.

본 발명에서 OGT(O-linked N-acetylglucosaminyltransferase)는 OGT 유전자에 의하여 암호화되는 단백질로, 단일 O-글리코시드 결합 내의 N-아세틸글루코사민을 단백질의 세린 또는 트레오닌 잔기에 첨가하는 역할을 한다. 본 발명에서 OGT는 ncOGT(nuclearcytosolic OGT)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

세포에 베타아밀로이드가 노출되면 NMDA-R을 통해서 세포 내로 유입되는 칼슘 이온의 수준이 증가하게 된다. OGT는 nNOS와 결합하여 상호작용할 수 있는데, 베타아밀로이드와 접촉하는 경우 세포 내 칼슘 이온의 수준 증가에 따라 OGT와 nNOS의 상호작용은 더욱 증가하게 된다. 이에 따라 SNO-OGT가 증가하게 되고, 증가된 SNO-OGT에 따라 OGT의 활성이 감소하고 세포내 단백질의 하이포-오글루넥당화(hypo-O-GlcNAcylation)가 유도된다. 이때 타우의 하이포-오글루넥당화 또한 유도되고, 이에 따라 타우의 과인산화가 진행된다. 또한, 증가된 SNO-OGT는 SNO-Akt를 유도하여 Akt의 비활성화 및 Akt 하류에 존재하는 GSK3β의 활성화를 촉진한다. 활성화된 GSK3β에 의해 타우의 과인산화가 유도된다. 타우의 과인산화로 인해 신경섬유매듭이 생성되며, 이로 인해 알츠하이머를 포함하는 타우 매개된 퇴행성 뇌질환이 발생할 수 있으며, 그 증세가 더욱 심각해질 수 있다.

본 발명에서 "타우(tau) 단백질"은 미세소관을 안정화시키는 데 필요한 단백질로서 타우 단백질이 과도하게 축적되면 미세소관이 붕괴되면서 정상 신경세포의 네트워크가 와해되므로 퇴행성 퇴질환의 원인으로 알려져 있다.

즉, 베타아밀로이드에 의하여 유발된 SNO-OGT가 타우의 하이포-오글루넥당화 및 타우의 과인산화를 통해서 타우에 의해 매개되는 퇴행성 뇌질환에 관여할 수 있으며, 본 발명은 이러한 사실에 대하여 최초로 발견한 발명이다.

따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 SNO-OGT 수준을 감소시키는 후보물질을 선별하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서 용어 "오글루넥당화(O-GlcNAcylation)"는 단백질에 아세틸글루코사민이 결합하는 현상을 지칭하며, 용어 "하이포-오글루넥당화(hypo-O-GlcNAcylation)"는 세포 내 단백질의 오글루넥당화 수준이 보통의 수준보다 낮아지는 현상을 지칭한다.

본 발명에서 SNO-OGT는 타우의 하이포-오글루넥당화 또는 타우의 과인산화를 유도하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 유발하거나 상기 질환의 증세를 악화시킨다. 따라서, 본 발명의 (b) 단계에서 SNO-OGT 수준을 감소시킨 후보물질을 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료제로 선별할 수 있다.

본 발명에서 퇴행성 뇌질환은 루이소체치매(Dementia with Lewy Bodies, DLB), 다발성 경색치매(Multi-Infarct Dementia, MID), 전두측두엽변성증(frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 픽병(Pick's disease), 피질기조퇴행 (Corticobasal degeneration, CBD), 퇴행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy, PSP), 파킨슨병, 알츠하이머 및 헌팅톤병으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 타우 단백질의 하이포-오글루넥당화 또는 타우 단백질의 과인산화에 의하여 매개되는 퇴행성 뇌질환을 제한 없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 억제제를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 SNO-OGT 억제제는 OGT 내 Cys845, Cys921 및 Cys965로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 잔기에서 OGT의 S-니트로실화(S-nitrosylation)를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에 따르면, OGT 내에서 NO와의 결합에 관여하는 시스테인 잔기는 Cys845, Cys921, Cys965이므로, OGT의 Cys845, Cys921 및 Cys965로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 잔기에 대한 S-니트로실화(S-nitrosylation)를 억제하는 SNO-OGT 억제제는 알츠하이머의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 Cys845, Cys921, Cys965는 각각 OGT 내의 845번째 시스테인 잔기, 921번째 시스테인 잔기, 965번째 시스테인 잔기를 의미한다.

본 발명에서 "니트로실화(S-nitrosylation)"는 화합물에 니트로소기(-N=O)를 도입하는 반응을 지칭한다.

상기 SNO-OGT 억제제는 타우 단백질의 하이퍼 오글루넥당화를 유발 또는 타우 단백질의 하이포 오글루넥당화를 억제할 수 있으며, 타우 단백질의 과인산화를 억제하는 것을 특징으로 하므로, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 조성물의 투여에 의해 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 "치료"는 조성물의 투여에 의해 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 또한, 상기 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클, 방부제, 또는 결합제 등과 조합하여, 약학적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. OGT(O-linked N-acetylglucosaminyltransferase)의 Cys845, Cys921 및 Cys965로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 잔기에 대한 S-니트로실화(S-nitrosylation) 억제제 또는 글루코사민의 용량은 넓은 범위로 변하며 각각의 특별한 경우의 개별적인 요구 조건에 따라 결정된다.

본 발명의 약학적 조성물은 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료를 위한 공지의 약제와 병용하여 투여할 수 있으며, 상기 치료제와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예, 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제제예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Aβ(베타아밀로이드)가 SNO - OGT (S- nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase)를 유발함을 확인

Aβ와 SNO-OGT의 관계를 확인하기 위해서, biotin-switch assay를 수행하여 Aβ가 SNO-OGT를 유발하는지 확인하였다. 구체적으로, 인간 신경아세포종 SK-N-MC 세포를 10, 20, 40 μM의 Aβ에 48시간 동안 노출한 후, 150mM NaCl을 포함하는 HEN 완충액(25 mM HEPES, 1 mM EDTA, 0.1 mM 네오쿠프로인, pH 7.6)으로 세척하였다. 그 후 HEN 용해 완충액(25 mM HEPES, 1 mM EDTA, 0.1 mM 네오쿠프로인, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 프로테아제 저해제 칵테일, pH 7.6)으로 추출하였다. 16,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하고 20mM 메틸-메탄에티오설포네이트(MMTS)와 5% SDS를 포함하는 HEN 완충액을 50℃, 20분 동안 암조건에서 처리하였다. 잔여 MMTS를 제거한 후, 1% SDS를 포함하는 HEN 완충액에 결과물인 단백질을 다시 현탁한 후, 0.4mM 비오틴-HPDP((N-[6-(biotinamido)hexyl]-3-pyridyldithio)-propionamide)로 암조건의 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 이후 특이적인 결합에 의해서 NeutrAvidin-비드로 비오틴화된 단백질을 분리하였다. 결합된 NeutrAvidin-비드를 PBS 세척 완충액(6.7 mM KH₂PO₄, 600 mM NaCl, pH 7.4)으로 두 번 세척하고 SDS-PAGE를 수행한 후, 면역블롯 분석법을 수행하였다. 면역블롯 분석법에서 O-GlcNAc-특이적 RL2 항체를 사용하였다.

OGT(O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 활성을 측정하기 위해서, 면역침전된 OGT를 이용하여 이를 측정하였다. 구체적으로, 정제된 His₆-p62와 Aβ를 처리한 세포의 용해물로부터 얻은 면역침전된 OGT를 이용하여 OGT의 활성을 측정하였다. OGT의 활성을 측정하기 위해서, 세포를 5 mM MgCl₂, 10 μM PUGNAc, 및 1% Triton X-100, 20mM을 포함하는 HEPES(pH7.4)에 용해시킨 후, 깨끗한 용해물을 원심분리에 의하여 얻고 p62-코팅된 ELISA 96 웰에 웰 당 100μl씩 분주하였다. 이후 UDP-GlcNAc의 존재 또는 부존재 하에서 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 상온에서, 3% BSA로 차단하고, RL2(1:1000)를 3시간 동안 로딩한 후, HRP-접합된 이차 항체와 1시간 동안 배양하였다. HRP 신호는 TMB(Sigma Chemical Co.)로 생성하였고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 내인성 OGT 및 액틴의 수준을 사용하였으며, 실험 결과, Aβ에 대한 용량 의존적으로 SNO-OGT가 유발되어 그 결과, 대조군에 비해서 SNO-액틴의 증가가 나타남을 관찰하였다. 따라서 Aβ의 처리는 오글루넥당화를 감소시켰으며, SNO-OGT가 하이포-오-글루넥당화(hypo-O-GlcNAcylation)의 원인이 됨을 확인하였다. 또한, OGT의 활성을 측정한 결과, OGT 활성이 Aβ의 용량에 의존적으로 상당히 감소함을 확인하였고, OGT의 활성이 Aβ 처리시의 SNO-OGT와 연관되어 있음을 확인하였다.

실시예 2: OGA ( N - acetylglucosaminidase )의 활성이 Aβ에 의해 유도된 오글루넥당화의 감소에 미치는 영향 확인

Aβ에 의해 유도된 오글루넥당화의 전반적인 감소가 OGA의 활성 때문인지 여부를 확인하였다. 구체적으로, Aβ를 처리하지 않은 SK-N-MC 세포, 50μM의 Aβ를 처리한 세포, 2mL의 L-MMA를 처리한 세포, 또는 Aβ와 L-MMA를 모두 처리한 세포의 OGA 활성을 측정하였다. OGA 활성은 50mM 소듐 카코딜레이트 완충액(sodium cacodylate buffer)(pH 7.0) 내에서 5mM pNP-β-GlcNAc(St. Louis, MO)를 이용하여 30℃에서 1시간 동안 처리한 후, 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다. 데이터를 평균±에 의하여 표현하였으며 통계적 유의성은 S-PLUS two-way ANOVA(n=7)를 이용하여 계산하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, Aβ의 처리 후에도 OGA의 활성에는 변화가 없었다. 따라서, OGT는 하이포-오글루넥당화와 연관되어 있지만, OGA의 활성은 Aβ에 의하여 유도되는 하이포-오글루넥당화와는 연관이 없음을 확인하였다.

실시예 3: Aβ에 의해 유도된 오글루넥당화의 감소와 칼슘 이온의 세포내 유입과의 관계 확인

Aβ에 의해 유도된 하이포-오글루넥당화와 칼슘 이온의 세포내 유입과의 관계를 확인하기 위해서, Aβ 처리 후 칼슘 이온의 세포로의 유입 변화를 확인하였다. 구체적으로, 접종된 SK-N-MC 세포(10⁴ 세포/웰)를 ELISA 96 웰 플레이트에서 10μM PUGNAc를 포함하는 DMEM 콤플렉스 배지에서 12시간 동안 배양하였고 추가적으로 10μM Fura 2-AM을 포함하는 신선한 배지에서 1시간 동안 배양하였다. Fura 2-AM 배지를 제거한 후, 세포를 50μM Aβ의 존재 하에서 0-90분 동안 표시된 간격으로 배양하였고, 세포를 PBS 완충액으로 세척한 후, 세포 용균(lysis)을 200μl의 1N NaOH로 용해하였다. 깨끗한 세포 용해물을 16,000 ×g로 5분 동안 원심분리에 의해서 준비한 뒤, 340nm 및 380nm의 파장에서 형광의 세기를 Spectrofluorometer(Molecular Device, USA)를 이용하여 측정함으로써 칼슘 유입을 측정하였다. 이와 동시에 50μM의 메만틴(memantine)과의 공동 처리에 의하여 Aβ에 의해 유발된 칼슘 이온의 유입을 차단하였다. 메만틴은 NMDA-R(N-methyl-D-aspartate receptor)의 길항제이다. 칼슘 이온 유입의 측정 결과를 도 3에 나타내었다. 칼슘 이온의 유입 수준은 340nm/380nm 비율의 형광 세기에 의해서 나타내어지고, PUGNAc가 처리되지 않은 대조군 세포에 대해 표준화하여 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군인 Aβ가 처리되지 않은 세포에 비해서, 50μM의 Aβ가 처리된 세포에서 세포내로 유입된 칼슘 이온의 수준이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 따라서, Aβ의 처리에 의해서 세포내로의 칼슘 이온의 유입이 증가함을 확인하였다. 또한, Aβ와 메만틴을 공동처리한 군의 경우, 칼슘 이온의 유입이 차단됨을 확인하였다.

추가적으로, 칼슘의 연결통로인 칼슘 이오노포어(A23187)와 탑시가르긴(thapsigargin)을 SK-N-MC 세포에 처리한 후 RL2로 면역블롯을 수행하여 오글루넥당화의 변화 양상을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 칼슘 이오노포어(A23187)와 탑시가르긴(thapsigargin)의 처리는 Aβ 처리와 유사하게 용량 의존적으로 전반적인 오글루넥당화의 감소를 유도함을 확인하였다.

따라서, Aβ의 처리가 칼슘 이온이 세포 내로 유입되는 것을 증가시킴을 확인하였으며, 칼슘 이온의 유입 증가로 오글루넥당화의 감소가 유도됨을 확인하였다.

실시예 4: Aβ의 처리가 NO(Nitric Oxide)의 생성 촉진 여부 확인

Aβ를 처리한 세포에서 NO의 생성이 촉진되는지 여부를 확인하기 위해서, 50μM의 Aβ를 처리한 SK-N-MC 세포(Aβ), 아무것도 처리하지 않은 대조군 SK-N-MC 세포(-), 50μM의 Aβ 및 2mM의 L-MMA를 모두 처리한 SK-N-MC 세포(Aβ+MMA), 2mM의 L-MMA를 처리한 SK-N-MC 세포(MMA)에 대한 각각의 배양액 내의 NO 생성량을 Griess 분석법에 의하여 측정하였다. 데이터를 평균±에 의하여 표현하였으며 통계적 유의성은 S-PLUS one-way ANOVA(n=3)를 이용하여 계산하였고, 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 세포에 Aβ를 처리한 후 NO₂ ^-(nitrite)가 2배 이상 많이 생성된 반면, NO의 생성은 pan-NOS 저해제인 L-MMA의 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다.

추가적으로, OGT와 nNOS 사이의 상관관계가 있는지 여부를 면역침전에 의하여 확인하였다. 50μM의 Aβ를 처리하기 전과 후의 침전 수준을 OGT와 nNOS에 특이적인 항체를 이용하여 확인하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, Aβ의 처리 이전에 OGT가 nNOS와 상호작용을 하지만, Aβ의 처리 후에 OGT와 nNOS의 상호작용이 더 증가함을 확인하였다.

실시예 5: SNO-OGT가 타우 오글루넥당화에 미치는 영향과 관련된 경로 확인

SNO-OGT가 어떠한 경로로 세포의 하이포-오글루넥당화를 유발하는지 확인하기 위해서, nNOS의 저해를 통한 SNO-OGT의 차단이 오글루넥당화의 정상화를 유도하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, SK-N-MC 세포에 아무것도 처리하지 않거나, 50μM의 Aβ를 처리하거나, 50μM의 Aβ와 2mM의 L-MMA를 공동 처리하거나, 2mM의 L-MMA를 처리한 후, 상기 실시예 1에 기술한 것과 같은 방법으로 RL2 면역블롯팅과 biotin-switch assay를 통해 상기 세포군의 오글루넥당화와 SNO를 측정하였다. 측정 결과를 도 7에 나타내었으며, 밴드의 밀도를 수치화하여 도 8에 그래프로 나타내었다.

도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, Aβ가 처리된 세포에서 세포의 하이포-오글루넥당화가 나타나는 것과 L-MMA와 Aβ를 공동처리한 세포에서 오글루넥당화의 수준이 정상적으로 회복되는 것을 RL2 면역블롯에 의해서 분석하였다. Aβ를 처리한 세포에서 SNO-OGT가 유도되는 것과 Aβ와 L-MMA의 공동처리에 의해서 Aβ와 L-MMA가 처리되지 않은 세포 수준인 SNO 정상 수준까지의 SNO-OGT의 회복을 biotin-switch assay로 분석하였다. biotin-switch assay에서 SNO-액틴을 대조군으로 사용하였다.

또한, Aβ가 처리된 세포 및 Aβ가 처리되지 않은 세포로부터 유래한 면역침전된 타우(Tau IP)에 β-헥소사미니다아제(hexosaminidase)를 처리한 군(β-Hex+)과 처리하지 않은 군(β-Hex-)에 대하여 RL2 및 타우 면역블롯에 의한 분석을 수행하였다. 인 비트로 OGT 활성은 정제된 His₆-tagged p62로 측정하였고, 오글루넥당화된 p62의 수준은 RL2 면역블롯으로 측정하였다.

또한, Aβ와 L-MMA의 동시 처리 동안, Aβ에 의해서 유도된 세포의 하이포-오글루넥당화 및 타우 하이포-오글루넥당화는 거의 정상 수준으로 되돌아왔고, OGT의 활성의 감소 또한 정상으로 돌아옴을 확인하였다. 따라서, L-MMA에 의한 nNOS의 저해에 의해서 Aβ에 의한 하이포-오글루넥당화와 OGT 활성이 정상 수준으로 회복됨을 확인하였다.

타우 오글루넥당화에 대한 추가적인 확인을 위해서, O-GlcNAc를 제거하기 위해 β-헥소사미니다아제로 면역침전된 타우를 처리한 후 RL2 면역블롯 분석을 수행하였으며, 그 결과 β-헥소사미니다아제 처리는 Aβ가 처리되거나 처리되지 않은 세포 모두에서 타우 오글루넥을 충분히 제거할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6: Aβ가 SNO-Akt에 미치는 영향 확인

Aβ와 SNO-Akt의 관계를 확인하기 위해서, 아무것도 처리하지 않은 세포(-/-), Aβ를 처리한 세포(Aβ+), Aβ와 L-MMA를 공동 처리한 세포(Aβ+/MMA+), 및 L-MMA를 처리한 세포(MMA+)에 대하여 biotin-switch assay에 의해 SNO-Akt를 분석하였다. Akt의 인산화(Ser473), p-GSK3β(Ser9) 및 p-Tau(pSer, pThr)를 포함하는 하류의 타겟은 타겟-특이적 면역블롯 분석법에 의해서 측정하였다. 타우의 인산화(pSer 및 pThr)는 타우의 면역침전(Tau IP)에 의해서 측정한 후, pSer 및 pThr에 특이적인 면역블롯 분석법을 수행하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었고, 도 9에서 확인한 밴드를 수치로 나타낸 그래프를 도 10에 나타내었다.

도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 타우 인산화와 연관된 Akt 신호전달 경로를 분석한 결과, Aβ의 처리는 SNO-Akt를 유발하고, Ser473에서 감소된 인산화로 Akt의 비활성화가 일어나게 된다. Ser9에서 감소된 인산화에 의한 GSK3β 활성화가 유도되며, 활성화된 GSK3β는 세린과 트레오닌 잔기의 인산화에 의한 타우 과인산화를 유도함을 확인하였다.

따라서, Aβ 처리 동안, L-MMA에 의한 nNOS의 저해는 SNO-Akt 유도의 저해, GSK3β 활성의 저해로 인해 최종적으로 타우 과인산화를 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 7: 세포의 하이포-오글루넥당화가 Aβ 신경독성을 유발하는지 여부 확인

세포내 하이포-오글루넥당화가 Aβ 신경독성을 유발하는지 확인하기 위해서, 신경독성의 특성인 세포내 활성 산소종(Reactive oxygen species: ROS)의 생성량과 세포 사멸을 하기와 같이 측정하였다.

7.1 ROS 확인

Aβ를 처리하는 동안 아무것도 처리하지 않은 SK-N-MC 세포(intact), 50 μM의 Aβ를 처리한 SK-N-MC 세포(Aβ), 20μM의 PUGNAc의 존재 하에 Aβ를 처리한 SK-N-MC 세포(Aβ+PUGNAc), 1mM의 DON 존재 하에 Aβ를 처리한 SK-N-MC 세포(Aβ+DON)에서 세포내 활성 산소종(Reactive oxygen species: ROS)의 생성량을 측정하였다. 데이터를 평균±S.D.로 표현하였고 통계적 유의도를 S-PLUS one-way ANOVA(n=4)로 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, Aβ를 처리한 세포의 경우 Aβ를 처리하지 않은 대조군 세포(intact)에 비해서 ROS 생성이 1.25배 이상 증가함을 확인하였다. Aβ를 GFAT(글루타민:프럭토오스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼라제) 저해제인, DON과 공동처리하는 경우, ROS의 생성은 1.47배 이상 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이는 세포 내의 하이포-오글루넥당화가 심해짐에 따라 더 많은 ROS가 생성됨을 의미한다. 대조적으로, Aβ 단독 처리에 의한 ROS 생성 수준의 증가가 Aβ와 PUGNAc(OGA 저해제) 또는 L-MMA(pan-NOS 저해제)와의 공동처리에 의하여 대조군 세포의 수준까지 회복됨을 확인하였다.

또한, SK-N-MC 세포를 아무것도 처리하지 않거나(intact), 50μM의 Aβ로 처리하거나(Aβ), 50μM의 Aβ와 1mM의 DON을 처리하거나(Aβ+DON), 50μM의 Aβ, 1mM의 DON 및 10mM 글루코사민(GlcNH₂)을 처리하거나(Aβ+DON+GlcNH₂), 50μM Aβ 및 10mM 글루코사민 처리하거나(Aβ+GlcNH₂)한 후, 각각 세포내 ROS의 생성 수준을 측정하였다. 데이터를 평균±S.D.로 표현하였고 통계적 유의도를 S-PLUS one-way ANOVA(n=4)로 측정하였으며, 측정 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, Aβ 및 DON에 의한 ROS의 과잉 생성이 글루코사민에 의하여 회복됨을 확인하였다. 글루코사민의 처리에 의해서, Aβ 또는 Aβ/DON 처리된 ROS의 과잉 생성이 거의 정상 수준으로 회복되었다.

따라서, 글루코사민이 Aβ와 Aβ/DON에 의해 유발된 신경독성을 회복시킴을 확인하였다.

7.2 세포 사멸 확인

Aβ를 처리하는 동안 세포 사멸을 관찰하였다. PUGNAc, DON, 또는 L-MMA의 존재 또는 부존재 하에서 SK-N-MC 세포에 10, 20, 40 μM의 Aβ를 처리하는 동안, MTT assay에 의하여 세포 사멸의 수준을 측정하였다. 동시에, 재조합 OGT를 발현하는 안정한 세포(ncOGT #9)에서도 마찬가지로 MTT assay에 의해서 세포 사멸의 수준을 측정하였다. 측정 결과를 도 13에 나타내었으며, 데이터를 평균±S.D.로 표현하였고 통계적 유의도는 S-PLUS two-way ANOVA(n=7)로 측정하였다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 세포 사멸은 Aβ에 대해 용량 의존적으로 증가함을 확인하였다. 또한 Aβ와 DON을 함께 처리할 경우 세포 사멸이 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 이와는 반대로 PUGNAc 또는 L-MMA를 Aβ와 함께 처리하는 경우, Aβ 단독으로 처리하는 경우에 비해서 세포 사멸이 2배 이상 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 또한, OGT를 과발현하는 세포(ncOGT #9)를 Aβ로 처리하는 경우의 세포 사멸은 Aβ를 PUGNAc 또는 L-MMA와 함께 처리하는 경우와 비슷한 수준으로 감소하였다.

또한, SK-N-MC 세포를 20μM PUGNAc, 2mM L-MMA, 및 1mM DON으로 10시간 동안 처리한 뒤 오글루넥당화의 패턴을 RL2 면역블롯 분석법에 의하여 분석하였다. 이 때 OGT 및 액틴의 발현 수준을 대조군으로 하였다. 또한 OGT를 과발현하는 세포(OGT #9)를 RL2 면역블롯 분석법에 의하여 분석하였고, 대조군인 mock 세포와 비교하였다. 재조합 OGT의 발현을 Flag-tag-특이적 면역블롯팅으로 확인하였고, 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. 결과를 도 14에 나타내었다.

따라서, Aβ 신경독성과 관련된 ROS 생성 및 세포 사멸 모두 세포의 하이포-오글루넥당화에 의하여 촉진되는 반면, 세포의 하이퍼-오글루넥당화에 의하여 예방됨을 확인하였다.

실시예 8: 하이퍼-오글루넥당화(hyper-O-GlcNAcylation)의 Aβ 신경독성 억제 효과 확인

세포의 하이퍼-오글루넥당화가 Aβ 신경독성을 억제하는지 확인하기 위해서, 초기 타임-코스 ELISA 분석법을 수행하여 Aβ 신경독성이 나타내는 특성인 칼슘이온의 증가, SNO의 중가, 오글루넥당화의 감소, 및 인산화된 GSK3β(p-GSK3β)의 감소를 측정하였다.

OGA 저해제인 PUGNAc의 전처리가 칼슘 이온의 유입에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 10μM의 PUGNAc로 전처리한 세포, 50μM의 메만틴으로 전처리한 세포, 및 전처리하지 않은 대조군 세포(-)를 10 μM Fura 2-AM에 각각 노출한 후, 표시된 시간동안 50μM의 Aβ를 처리하고 시간의 흐름에 따라 상기 실시예에 기재한 바와 같이 세포 내의 칼슘 이온의 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었고, 데이터를 평균±S.D.로 표현하였고 통계적 유의도를 S-PLUS two-way ANOVA(n=4)로 측정하였다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 전처리 없이 Aβ를 처리한 대조군 세포(-)에서 칼슘 이온의 유입은 2분 이내에 시작된 반면, PUGNAc 및 메만틴으로 전처리한 세포에서는 이와 같은 칼슘 이온의 유입이 차단됨을 확인하였다.

또한, 메만틴에 의한 NMDA-매개된 칼슘이온 유입의 차단을 확인하기 위해서, 10μM Fura 2-AM이 미리 로딩된 세포를 50μM의 메만틴의 존재 또는 부존재 하에서 처리하였고, 표시된 농도의 NMDA와 함께 배양한 후, 시간의 흐름에 따른 칼슘 이온의 유입의 증가를 확인하였다. 데이터를 평균±S.D.로 표현하였고 통계적 유의도를 S-PLUS two-way ANOVA(n=4)로 측정하였으며, 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, NMDA에 의해 매개되는 칼슘 이온의 유입이 메만틴의 처리에 의해 억제됨을 확인하였다.

또한, Aβ에 의한 칼슘 이온의 유입 및 NMDA에 의해 매개되는 칼슘의 유입 모두 PUGNAc 전처리에 의해 차단됨을 확인하기 위해서, 50μM Aβ와 10μM NMDA를 각각 처리한 후 Fura 2-AM을 사전로딩한 세포를 사용하여 세포내 칼슘 이온의 유입을 분석하였고, 10μM PUGNAc 전처리 및 50μM 메만틴 전처리 사이의 칼슘 이온 유입의 차단을 측정하였다. 측정 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에 나타낸 바와 같이, Aβ 처리 및 NMDA에 의해 매개되는 칼슘 이온의 유입이 메만틴에 의해서 완전히 차단됨을 확인하였다.

또한, 표시된 농도의 NMDA의 처리 도중 전처리 하지 않은 대조군 세포(-)와 50μM 메만틴을 전처리한 세포에서 오글루넥당화의 변화 양상을 확인하였고, 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18에 나타낸 바와 같이, NMDA에 의해 매개되는 오글루넥당화가 메만틴의 처리에 의해서 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.

따라서, NMDA-R의 길항제인, 메만틴을 처리하는 경우 Aβ를 처리하는 경우에도 세포내로 칼슘 이온의 유입이 차단됨을 확인하였다. 즉, NMDA에 의해 매개되는 칼슘 이온의 유입이 메만틴의 처리에 의해 저해됨을 알 수 있으며, NMDA을 처리하면 NMDA의 용량 의존적으로 오글루넥당화가 감소하는 것을 확인하였으므로, 하이퍼-오글루넥당화가 유지되는 세포에서, NMDA 수용체를 통해서 Aβ에 의해 영향 받는 칼슘의 유입을 차단할 수 있음을 확인하였다.

또한, 신경독성의 또다른 특성인 SNO의 증가, 오글루넥당화의 감소, 및 인산화된 GSK3β(p-GSK3β)의 감소를 측정하였다. 구체적으로, 표시된 시간에 50μM의 Aβ의 처리시 사전처리를 하지 않은 대조군 세포(-) 및 10μM PUGNAc로 사전처리한 세포에서 SNO-OGT(n=4), SNO-Akt(n=4), 및 대조군인 SNO-액틴의 수준을 biotin-switch assay에 의하여 측정하였다. 또한 동일한 시료에서 OGT 활성(n=4), 총 오글루넥당화(n=6), 및 p-GSK3β(n=4)의 수준을 RL2 및 p-GSK3β 면역블롯 분석을 통하여 각각 측정하였다. 측정 결과를 도 19에 나타내었다.

도 19에 나타낸 바와 같이, 0 내지 8시간 동안 Aβ를 처리하는 도중, SNO-OGT, SNO-Akt, 및 SNO-액틴은 PUGNAc를 전처리한 세포에서 유의적인 증가 없이 유지되었으나, 전처리하지 않은 대조군 세포(-)에서는 Aβ의 처리에 의해 시간 의존적으로 증가함을 확인하였다. PUGNAc로 처리하지 않은 대조군의 SNO 프로파일로부터 Aβ를 처리하고 2시간이 지나기 전에 OGT, Akt, 및 액틴이 S-니트로실화(S-nitrosylation)되기 시작함을 알 수 있다.

또한, PUGNAc를 사전처리한 세포에서는 Aβ의 처리 도중 OGT 활성 및 오글루넥당화가 변화하지 않은 반면, 이들은 사전처리하지 않은 대조군 세포(-)에서 시간 의존적으로 감소함을 확인하였다. 대조군에서 세포의 오글루넥당화가 3시간까지 점차적으로 감소함을 확인하였다. 반면, OGT 활성은 Aβ를 처리한 후 2시간 까지 빠르게 감소하였다.

또한, PUGNAc를 사전처리한 세포에서 p-GSK3β의 형성은 변화하지 않은 반면, 대조군 세포에서 Aβ를 처리한 후 4시간까지 p-GSK3β의 형성이 감소하였다.

또한, 0-120분 이하의 기간 동안 Aβ의 효과를 ELISA 분석법에 의하여 측정하였고, SNO, 오글루넥당화, 및 p-GSK3β을 관찰한 결과, Aβ를 처리한 후 SNO-OGT는 20분 이내에 변화하기 시작한 반면, SNO-Akt 또는 SNO-액틴은 40분 내에 변하기 시작하는 것을 확인하였다.

따라서, Aβ에 의해 유도된 칼슘 이온의 세포로의 유입이 2분 이내에 시작되고, Aβ의 처리 후 20 내지 40분 이내에 SNO-OGT, SNO-Akt, 및 SNO-액틴의 유도가 시작됨을 알 수 있다. 따라서, SNO-OGT에 의해 매개된 세포의 하이포 오글루넥당화 및 SNO-Akt에 의해 매개된 GSK3β 활성이 유사하게 Aβ의 처리 후 2시간 이내에 시작함을 확인하였다.

실시예 9: SNO-OGT 내 Cys-NO 결합에 관여하는 Cys 잔기 확인

SNO-OGT 내의 Cys-NO 결합에 관여하는 Cys 잔기를 확인하기 위해서 Cys 매핑(mapping)을 수행하였고 도 20에 인간 ncOGT를 도식화하여 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, OGT는 TPR(tetratricorepeat domain) 및 CAT(catalytic domain)으로 구성되고, ncOGT는 13개의 Cys 잔기를 포함하는 TPR을 포함하고 CAT은 9개의 Cys 잔기를 포함한다. 인간 ncOGT는 1046 개의 아미노산으로 구성되며, 1 내지 1046 서열 중 TPR은 1 내지 476 서열에 해당하고 CAT은 477 내지 1046 서열에 해당한다. CAT을 구성하는 도메인은 N-CAT, 인터도메인(Interdomain: Int-D) 및 C-CAT이다. 이 중 C-CAT에 Cys-NO 결합에 관여하는 3개의 Cys 잔기(Cys845, Cys921, Cys965)가 존재한다. CAT을 구성하는 506번째 아미노산에서 1007번째 아미노산의 서열을 도 21에 나타내었다.

실시예 10: CAT 서열 중 SNO-Cys 결합을 갖는 Cys 잔기 확인

재조합 TPR과 CAT을 발현하는 E. coli의 세포 용해물을 1mM CysNO로 30분 동안 처리한 후 SNO를 biotin-switch assay를 통해서 확인하였고, CAT과 TPR은 His₆-tag-특이적 면역블롯 분석법에 의한 방법으로 어떤 도메인이 SNO-Cys 결합을 갖는지 확인하였다. 도 22에 나타내었다.

도 22에 나타낸 바와 같이, CAT이 S-니트로실화(S-nitrosylation)된 반면, TPR은 S-니트로실화되지 않았음을 확인하였으며, 이는 TPR에 있는 13개의 Cys 잔기가 SNO 변형으로부터 자유로움을 의미한다.

또한, OGT의 CAT 내에 있는 모든 9개의 Cys 잔기(Cys962, Cys965, Cys921, Cys927, Cys845, Cys758, Cys620, Cys590, Cys531)를 Ser으로 돌연변이시키고, 9개의 단일 돌연변이 및 1개의 삼중 돌연변이(Cys965/Cys921/Cys845)를 각각 HEK 293 T 세포에서 발현하였다. 형질감염된 세포를 1 mM CysNO로 1시간 동안 처리하고 SNO-OGT를 biotin-switch assay에 의해서 확인하였고, OGT의 발현 수준은 DM-17 면역블롯 분석법에 의하여 측정하였다. 측정 결과를 도 23에 나타내었으며, 밴드의 밀도를 OGT 단백질 수준으로 표준화화여 그래프로 나타내었다. 데이터를 평균±S.D.로 나타내었다(n=3).

도 23에 나타낸 바와 같이, Cys845, Cys921, Cys965 3개의 단일 돌연변이가 각각 SNO에서 부분적으로 파괴되어 있음을 확인하였으며, 반면 나머지 Cys 잔기에서의 6개의 단일 돌연변이는 거의 영향을 받지 않음을 확인하였다. Cys845/Cys921/Cys965에서 삼중 Cys 돌연변이의 SNO는 완전히 파괴되었으며, 이에 따라 상기 Cys 잔기가 실질적으로 Cys-NO 결합에 관여함을 확인하였다. Cys845 및 Cys921은 S-니트로실화에 유사하게 기여하는 것으로 보이는 반면 Cys965는 나머지의 잔기보다 각각 1.5배 이상 더 높은 기여를 하는 것으로 확인하였다.

또한, Cys 돌연변이가 OGT 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, E.coli에서 OGT의 모든 Cys가 돌연변이된 OGT를 p62와 함께 발현시켰고 인 비보 OGT 활성을 오글루넥당화된 p62의 RL2(O-GlcNAc-p62) 면역블롯에 의하여 측정하였다, 측정 결과, 오글루넥당화된 p62 웨스턴 블롯의 밴드 강도를 p62에 대하여 표준화한 그래프 및 OGT의 모든 Cys 돌연변이에서의 상대적인 OGT 활성에 대한 표를 도 24에 나타내었다.

도 24에 나타낸 바와 같이, 모든 Cys 돌연변이에서 감소된 OGT 활성을 확인하였다. 특히, 4개의 단일 Cys 돌연변이(Cys590, Cys620, Cys927, Cys962)에서 가장 높은 수준의 OGT 활성의 감소를 확인하였으며, 이로부터 상기 Cys 잔기가 OGT 활성에 결정적인 요소임을 확인하였다. 반면, 2개의 단일 Cys 돌연변이(Cys531 및 Cys758)는 대조군의 OGT 활성인 100%에 비해서 각각 47%, 85%의 OGT 활성을 나타내었다. 더욱이, 3개의 단일 Cys 돌연변이(Cys845, Cys921, Cys965)는 각각 30%, 6%, 9%의 OGT 활성을 나타내어 Cys-NO 결합에 관여하는 것으로 확인되었다. 반면, 2개의 이중 Cys 돌연변이(Cys845/Cys921 및 Cys921/Cys965) 및 1개의 삼중 Cys 돌연변이(Cys845/Cys921/Cys965)는 OGT 활성이 없어지는 결과를 나타내었다.

따라서, CAT 내에 존재하는 변형되지 않은 Cys 잔기는 OGT의 활성에 중요한 역할을 함을 확인하였고, CAT에서, SNO 변형과 같은 번역후의 Cys 변형은 OGT 활성을 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 11: SNO-OGT 내 SNO 모티프 분석

SNO-OGT 내의 Cys-NO 결합 트리플렛(triplet)의 SNO 모티프를 분석하기 위해서, Swiss-PdbViewer 4.1.0을 사용하였다. SNO 3D 모티프의 분석 결과를 도 25에 나타내었다.

도 25에 나타낸 바와 같이, Cys845와 Cys921 잔기 사이 거리는 4.2Å로 인접해있다. Cys845를 포함하는 SNO-3D 모티프(C845(0):F847(+2):R994(+149))로부터 황(sulfur)이 8.2Å 거리에 위치하는 염기성 잔기(R994, C845로부터 149 아미노산 떨어져 있음)와 4.1Å 거리에 위치하는 방향족 고리 곁사슬(F847, C845로부터 2 아미노산 떨어져 있음)을 포함함을 확인하였다. 또한, Cys921을 포함하는 SNO-3D 모티프(F847(74):C921(0):D923(+2))로부터 황이 5.6Å 거리에 위치하는 산성 잔기(D923, C921로부터 2 아미노산 떨어져 있음) 및 6.6Å 거리에 위치하는 방향족 고리 곁사슬(F847, C921로부터 74 아미노산 떨어져 있음)을 포함함을 확인하였다. 또한, Cys965를 포함하는 SNO 3D 모티프(C965(0):E967(+2):K996(+31))로부터 황이 4.1Å 거리에 있는 산성 잔기(E967, C965로부터 2 아미노산 떨어져 있음) 및 4.6Å 거리에 있는 염기성 잔기(K996, C965로부터 31 아미노산 떨어져 있음)를 포함함을 확인하였다.

상기 실시예로부터 확인한 본 발명에 개시된 타우 과인산화에 대한 기작을 도 26에 도식화하여 나타내었다.

통계적 분석

실험 데이터는 평균±으로 표현하였으며, 통계적 유의도는 S-PLUS one-way 또는 two-way 분석(ANOVA)(TIBCO Software Inc. Palo Alto, CA)을 이용하여 측정하였다. 대조군에 대하여 ***p < 0.001, **p < 0.01, 또는 *p < 0.05이다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (12)

1. (a) 신경세포에 베타아밀로이드(Aβ) 펩타이드를 처리하고 SNO-OGT(S-nitrosylation of O-linked N-acetylglucosaminyltransferase) 수준을 확인하는 단계; 및
   (b) 후보물질을 처리하고 SNO-OGT 수준을 감소시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 신경세포는 신경아세포종(neuroblastoma)인, 스크리닝 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 OGT는 ncOGT(nuclearcytosolicOGT)인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 선별된 후보물질은 OGT의 S-니트로실화(S-nitrosylation)를 억제하는 것인, 스크리닝 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 선별된 후보물질은 OGT 내 Cys845, Cys921 및 Cys965로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 잔기에서 OGT의 S-니트로실화를 억제하는 것인, 스크리닝 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 선별된 후보물질은 하이퍼 오글루넥당화(hyper-O-GlcNAcylation)를 유발하는 것인, 스크리닝 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 선별된 후보물질은 타우 단백질의 과인산화를 억제하는 것인, 스크리닝 방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 루이소체치매(Dementia with Lewy Bodies, DLB), 다발성 경색치매(Multi-Infarct Dementia, MID), 전두측두엽변성증(frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 픽병(Pick's disease), 피질기조퇴행 (Corticobasal degeneration, CBD), 퇴행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy, PSP), 파킨슨병, 알츠하이머 및 헌팅톤병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 스크리닝 방법.
   
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