KR20110008066A - 골량 관련 질병의 진단, 예방 및 치료 방법 - Google Patents

골량 관련 질병의 진단, 예방 및 치료 방법 Download PDF

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제라드 카센티
패트리시아 에프 듀시
율리 크시이
도날드 랜드리
비야이 야다브
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더 트러스티이스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

본 발명은 각각 골량을 증가 또는 감소시키기 위하여 환자의 혈청 세로토닌 수치를 감소 또는 증가시키기 위한 치료제 및 방법을 제공한다. 바람직한 구체 예에서, 환자는 골다공증과 같은 저골량 질병을 갖거나 또는 위험이 있는 것으로 알려져 있으며 시약은 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제이다.

Description

골량 관련 질병의 진단, 예방 및 치료 방법{METHODS OF DIAGNOSING, PREVENTING AND TREATING BONE MASS DISEASES}
정부 권리에 대한 명시
본 발명은 NIH-5R01 DK 067936에 의한 정부 지원 및 March of Dimes grant 6FY05-1260에 의해 달성되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 표준 골량에 비하여 더 많거나 또는 더 적은 골량과 관계된 골질병(bone disease)의 진단 및 치료 분야에 관한 것이다.
발명의 배경
척추동물이 성년기에 걸쳐서 골 조직을 재건하는 메커니즘인 골 재형성(Bone remodeling)은 두 단계를 포함하는데: 특화된 세포 유형인 파골세포(osteoclast)에 의한 기존재하는 무기질화된 골 기질(matrix)의 재흡수, 그 후 또 다른 특화된 세포 유형인 조골세포(osteoblast)에 의한 새로운 골 형성이 후속한다. 유전 및 분자 연구에 따르면, 국지적 작동체(effector) (사이토킨 및 성장 인자) 및 전신 작동체(호르몬 및 신경매개인자(neuromediator))가 골 재형성의 두 단계를 조절한다고 밝혀졌다.
골 재형성을 조절하는 가장 집중적으로 연구된 유전자 중 하나는 LDL-수용체 관련 단백질 5(LDL-receptor related protein 5, LRP5)이다. LRP5 내 기능-소실 변종(loss-of-function mutation)은 골다공증-가성신경교종(osteoporosis pseudoglioma, OPPG)을 유발하는데, 이는 골 형성의 감소로 인한 심각한 골 손실 및 안구의 배아 혈관신생(embryonic vascularization)의 지속으로 인한 시력 상실을 초래하는 것을 특징으로 하는 질병이다. 이와 반대로, LRP5에서의 기능-획득 변종(gain-of-function mutation)은 또 다른 골질병인 고도 골량 증후군(high bone mass syndrome)을 유발한다. 상반되는 특성의 두 가지 인간 질병에 대한 Lrp5의 연관은 골 형성 조절에 있어 이러한 유전자에 의해 제어되는 경로의 중요성을 강조한다. 그렇지만, LRP5가 골 발달에 영향을 미치는 메커니즘은 알려져 있지 않다.
발명의 요약
십이지장(duodenum)의 장크롬친화성세포(enterochromaffin cell) 내에서 그리고 가능한 경우 조골세포 내에서 세로토닌 합성의 첫 단계를 담당하는 효소인 트립토판 하이드록실라제 1(tryptophan hydroxylase 1)의 과발현 때문에, 혈청 세로토닌(serum serotonin)의 상승된 농도는 LRP5 기능 소실 변종에서 감소된 골량을 유발한다. 따라서, 본 발명의 일부 구체 예는, 세로토닌 합성을 억제하거나 또는 십이지장에서의 세로토닌 합성에 필요한 효소인 TPH1을 억제하는 치료제(therapeutic agent)를 투여함으로써, 또는 조골세포에 대한 세로토닌의 영향을 조절하는 수용체인 세로토닌 수용체 HT1B의 길항제를 투여함으로써, 골다공증(osteoporosis) 및 OPPG와 같은 저골량 질병을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일부 구체 예는, 혈청 세로토닌 수치를 감소시키고 1종 이상의 TPH 1 억제제 또는 1종 이상의 세로토닌 수용체 길항제 또는 이들 둘 모두를 포함하는 치료제를 함유하며, 저골량 질병의 치료 또는 예방을 위하여 사용하기 위한, 골량을 증가시키기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 몇몇 구체 예에서, 본 발명은 불안증(anxiety) 또는 우울증의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 포함하며, 여기서 상기 약제학적 조성물은 SSRI 및 약물 둘 모두를 포함하는데 상기 약물은 세로토닌 재흡수 억제제로 치료받은 환자에게 골다공증이 발생하는 것을 방지하기 위하거나 또는 SSRI를 취한 환자에 있어서 골다공증을 치료하기 위하여 혈청 세로토닌의 수치를 감소시킨다.
또 다른 구체 예에서, 본 발명은 불안증 또는 우울증에 대하여 환자를 치료하는 방법을 제공하는데 여기서 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 약물 및 SSRI가 별개의 약제학적 조성물을 통하여 환자에게 투여된다.
비정상 고골량(high bone mass)과 관련된 질병은, 세로토닌 그 자체를 투여함으로써, 또는 말초(periphery), HT1B 작용제, TPH1의 활성제, 또는 이들의 혼합에서 작용하는 세로토닌 재흡수 억제제를 투여함으로써, 말초 세로토닌(peripheral serotonin)의 수치를 증가시킴으로써 치료될 수 있다.
그 전체가 본 발명의 참조문헌으로 수록되는 미국 가특허출원 제60/976,403호(2007.09.28. 출원)가 개시한 바에 따르면, 뇌-유래 세로토닌(brain-derived serotonin, 이하 BDS라 약칭함)은 말초 세로토닌과 상반되는 효과를 갖는다. 증가된 BDS는 시상하부(hypothalamus)에서 표적 뉴런 상의 HT2C 수용체를 통하여 활성화함으로써 골량을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 일부 구체 예는 말초 세로토닌을 감소시키는 시약 및 BDS를 증가시키는 시약을 포함하는 치료제의 배합물을 투여하는 것을 포함한다. 뇌간(brain stem)의 뉴런에서 세로토닌 합성의 첫 단계를 담당하는 효소인 TPH2의 활성을 증가시키거나, 또는 뇌에 HT2C 세로토닌 수용체의 작용제(agonist)를 투여함으로써, BDS가 증가될 수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 방법은, 연령, 성별, 또는 혈청 세로토닌 수치에 영향을 미치는 또 다른 인자를 고려하여, 말초 내 세로토닌의 혈청 수치가 정상 개체에 비하여 비정상적으로 높은지를 결정함으로써(약 25% 또는 그 이상), 골다공증과 같은 저골량 질병의 발생 위험이 있는 사람을 진단하는 것에 관한 것이다. 이러한 위험에 있는 사람은 저골량 질병의 발생을 방지하기 위하여 혈청 세로토닌을 감소시키는 치료제로 치료될 수도 있다. 당업계의 통상의 기술자들은 혈청 세로토닌 수치가 특정 요인에 따라 개인별로 변화하며 특정인이 비정상적으로 높은 혈청 세로토닌 수치를 갖는지 여부를 결정하는데 있어서 이러한 요인들을 고려할 수 있음을 이해할 것이다. 통상의 기술자들이 정상 혈청 세로토닌 수치라고 간주할 수 있는 한가지 가능한 범위는 101-283 ng/ml(나노그램/밀리리터)이다.
증가된 혈청 세로토닌이 저골량 관련 질병의 유일한 원인이 아닐 것이기 때문에, 골다공증과 같은 저골량 질병을 갖는 사람이 혈청 세로토닌을 감소시키는 약물로 치료되어야만 하는지를 결정하기 위하여, 혈청 세로토닌 수치를 측정하는 방법 이외의 방법이 또한 사용된다.
본 발명은 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에 있어서 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에게 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에 있어서 저골량 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에게 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양(therapeutically effective amount)을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체 예에서, 시약은 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제이다. 바람직한 구체 예에서, 시약은 뇌혈관장벽(blood brain barrier)을 횡단하지 않는 TPH1 억제제이다. 또 다른 구체 예에서, 시약은 TPH2를 상당히 억제하지 않는 TPH1 억제제이다.
일부 구체 예에서, 시약은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 TPH1 억제제이며:
(a)
Figure pct00001
(b)
Figure pct00002
(c)
Figure pct00003
및 이들의 약제학적으로 수용가능한 염 및 용매화물, 여기서: A는 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; X는 결합(즉, A가 직접 D에 결합함), -O-, -S-, -C(O)-, -C(R4)=, =C(R4)-, -C(R3R4)-, -C(R4)=C(R4)-, -C≡C-, -N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(R3R4)N(R5)-, -N(R5)C(R3R4)-, -ONC(R3)-, -C(R3)NO-, -C(R3R4)O-, -OC(R3R4)-, -S(O2)-, -S(O2)N(R5)-, -N(R5)S(O2)-, -C(R3R4)S(O2)-, 또는 -S(O2)C(R3R4)-이며; D는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; R1은 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R3은 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬이며; R4는 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 각 R5는 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 그리고 n은 0-3이며;
(d)
Figure pct00004
및 이들의 약제학적으로 수용가능한 염 및 용매화물, 여기서: A는 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; X는 결합(즉, A가 직접 D에 결합함), -O-, -S-, -C(O)-, -C(R4)=, =C(R4)-, -C(R3R4)-, -C(R4)=C(R4)-, -C≡C-, -N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(R3R4)N(R5)-, -N(R5)C(R3R4)-, -ONC(R3)-, -C(R3)NO-, -C(R3R4)O-, -OC(R3R4)-, -S(O2)-, -S(O2)N(R5)-, -N(R5)S(O2)-, -C(R3R4)S(O2)-, 또는 -S(O2)C(R3R4)-이며; D는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; E는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; R1은 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R3은 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬이며; R4는 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 각 R5는 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 그리고 n은 0-3이며;
(e)
Figure pct00005
(f)
Figure pct00006
(g)
Figure pct00007
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
n은 1, 2, 또는 3이며;
(h)
Figure pct00008
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
n은 1, 2, 또는 3이며;
(i)
Figure pct00009
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며;
R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
수소;
할로겐;
저급 알킬;
알콕시; 또는
아미노; 그리고
n은 1, 2, 또는 3이며;
(j)
Figure pct00010
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며;
R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
수소;
할로겐;
저급 알킬;
알콕시; 또는
아미노; 그리고
n은 1, 2, 또는 3이며;
(k)
Figure pct00011
여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
(l)
Figure pct00012
여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
(m)
Figure pct00013
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
(n)
Figure pct00014
여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
(o)
Figure pct00015
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 사이클로알킬, F, Cl, 또는 OH이며;
(p)
Figure pct00016
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
상기 시약의 임의 라세믹 혼합물 및 개별적인 거울상이성질체, 상기 시약의 에스테르, 및 생리학적으로 수용가능한 산의 염을 포함한다.
본 발명은 치료를 위한 효과적인 양의 전술한 TPH1 억제제 및 1종 이상의 약제학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구체 예에서, 시약은 세로토닌 수용체 길항제, 바람직하게는 HT1B, HT2A 또는 HT2B 세로토닌 수용체 길항제, 가장 바람직하게는 HT1B 세로토닌 수용체 길항제이다. 일부 구체 예에서, 세로토닌 수용체 길항제는 표 3에 제시된 HT1B 세로토닌 수용체 길항제이다.
본 발명은 또한 환자에게 TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제 둘 모두가 투여되는 방법을 제공한다. TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제는 단일 약제학적 조성물에서 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구체 예에서, 저골량 질병은 골다공증, 골다공증-가성신경교종 증후군(OPPG), 골감소증(osteopenia), 골연화증(osteomalacia), 신성골이영양증(renal osteodystrophy), 불량 골형성 또는 재흡수, 파제트병(Paget's disease), 골절 및 부서진 뼈(fractures and broken bones), 또는 골전이(bone metastasis)이다. 바람직하게는, 저골량 질병은 골다공증이다.
본 발명의 또 다른 구체 예에서, 환자는 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약에 부가하여 SSRI, 비스포스포네이트(bisphosphonate), 또는 베타 차단제(beta blocker)로 치료된다. 일부 구체 예에서, 본 발명의 방법은 또한 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약에 부가하여 SSRI, 비스포스포네이트, 또는 베타 차단제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체 예에서, 환자는 혈청 세로토닌의 수치를 증가시키는 시약(예를 들면, SSRI)으로 치료되거나, 또는 환자는 혈청 세로토닌의 증가된 수치와 관계된 상태(condition)를 갖는다. 일부 구체 예에서, 상기 방법은 또한 환자를 혈청 세로토닌의 수치를 증가시키는 시약(예를 들면, SSRI)으로 치료하는 단계를 포함한다.
일부 구체 예에서, 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약을 투여하기에 앞서 환자의 혈청 세로토닌 수치를 측정한다. 또 다른 구체 예에서, 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약을 투여한 이후에 환자의 혈청 세로토닌 수치를 측정한다. 일부 구체 예에서, 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약을 투여하기 이전 및 이후에 환자의 혈청 세로토닌 수치를 측정한다.
일부 구체 예에서, 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약을 환자에게 반복적으로 투여하고, 환자의 혈청 세로토닌 수치가 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약의 첫 번째 투여에 앞서 측정된 수치에 비하여 최소 약 10% 감소될 때까지 환자의 혈청 세로토닌 수치를 측정한다.
일부 구체 예에서, 환자가 혈청 세로토닌의 정상 수치보다 25% 더 높은 혈청 세로토닌 수치를 갖는 것으로 확인되었다.
일부 구체 예에서, 환자에게 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약에 부가하여 뇌 유래 세로토닌을 증가시키는 시약을 투여한다. 바람직한 구체 예에서, 상기 뇌 유래 세로토닌을 증가시키는 시약은 TPH2 활성을 증가시키는 시약이다.
일부 구체 예에서, 환자의 혈청 세로토닌 수치는 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약을 투여하기 이전의 수치에 비하여 최소 약 10% 감소된다.
일부 구체 예에서, 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약은 약 1 mg/day 내지 약 2 g/day의 양으로 투여된다.
본 발명은 환자의 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 소정 용량의 시약을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데 상기 환자에게 상기 조성물은 최소 약 10%로 투여된다. 바람직한 구체 예에서, 상기 시약은 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제이다.
본 발명은 환자의 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 상기 환자에게 투여된다. 바람직한 구체 예에서, 상기 시약은 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제이다.
일부 구체 예에서, 약제학적 조성물은 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약 및 뇌-유래 세로토닌의 수치를 증가시키는 시약을 포함한다.
일부 구체 예에서, 약제학적 조성물은 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약 그리고 SSRI, 비스포스포네이트, 또는 베타 차단제를 포함한다. 바람직한 구체 예에서, 상기 시약은 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제이다. 일부 구체 예에서, 상기 세로토닌 수용체 길항제는 HT1B, HT2A 또는 HT2B 세로토닌 수용체 길항제이며, 바람직하게는 HT1B 세로토닌 수용체 길항제이다.
일부 구체 예에서, 약제학적 조성물은 TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제 둘 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 저골량과 관계된 질병의 발생 위험이 있는 대상을 확인하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 환자 및 정상 개체로부터 채취한 생체 시료 내 혈청 세로토닌의 수치를 결정하는 단계,
b) 환자로부터 채취한 시료 내 혈청 세로토닌의 수치가 정상 개체로부터 채취한 시료 내 혈청 세로토닌 수치보다 최소 약 25% 더 높으면 환자가 질병 발생 위험이 있다고 결론을 내리는 단계.
일부 구체 예에서, 상기 방법은 단계 (b) 이후에, 질병 발생 위험이 있는 환자에게 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약을 투여하는 단계를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1. Lrp5-/- 쥐(mice)는 변화없는 파골세포 표면(B) 및 감소된 조골세포 수(C)와 함께 저골량(A)을 갖는다. Lrp5-/- 분자 지표(molecular signature)의 실시간 PCR 분석. Lrp5-/- 조골세포는 조골세포-특이성 유전자 발현(D)에서 변화를 나타내지 않았으나 감소된 사이클린(cyclin) 유전자 발현(E)을 나타낸다.
도 2. β-catob -/- 골(ob-/-)에서 세포 주기 표지 유전자(cell cycle marker gene) 의 실시간 PCR 분석.
도 3. Lrp5-/- 골의 마이크로어레이 분석(Microarray analysis)은 wt 골(wt bone)에 비하여 트립토판 하이드록실라제 1(Tph1) 유전자 발현의 증가된 발현을 나타낸다. 녹색 막대와 적색 막대는 유전자 발현의 감소 및 증가를 각각 나타낸다. Hk2를 포함하는 유전자 및 그 왼쪽의 유전자들은 감소된 발현을 나타냈으며, 반면에 Spna1을 포함하는 유전자 및 그 오른쪽의 유전자들은 증가된 발현을 나타냈다.
도 4. Tph1 발현은 Lrp5-/- 쥐의 십이지장에서 증가된다(A). Tph1 발현은 Lrp5-/- 쥐의 골 내에서보다 십이지장 내에서 1000배 더 높다(B). 십이지장 내 Tph1 발현(C) 및 혈청 세로토닌 수치(D)는 Lrp5-/- 쥐에서 연령에 따라 혁신적으로 증가한다. Lrp5-/- 쥐의 뇌에서는 Tph2 발현 및 세로토닌 수치 중 어느 것도 변하지 않는다(E 및 F).
도 5. 5Htt-/- 쥐는 저골량 및 감소된 조골세포 수(A)를 갖는다. 골에서의 유전자 발현의 실시간 PCR 분석은 5Htt-/- 쥐의 감소된 사이클린 발현을 나타내었지만, 조골세포 분화 표지 또는 I형 콜라겐 유전자의 발현 변화는 탐지될 수 없었다(B).
도 6. Lrp5 /5 Htt ( Htt ) 컴파운드 쥐의 조직학적 및 조직계측학적 비교. Lrp5+/-;Htt+/- 이중 이형접합체성 쥐(double heterozygous mice)는 Lrp5+/- 또는 5Htt+/- 단일 이형접합체성 쥐에 비하여 더욱 급격한 골량 감소를 나타낸다. 또한 조골세포 수의 감소에 대하여도 이와 같다.
도 7. 트립토판 하이드록실라제 억제제(Tryptophan hydroxylase inhibitor, pCPA) 치료는 혈청 세로토닌 수치를 정상화하며 Lrp5 -/- 쥐에서 관찰된 골격 이상(bone abnormality)을 교정한다. pCPA 치료에 대한 치료 섭생(A), 골 표현형(bone phenotype)의 조직계측학적 분석(B), 혈청 세로토닌 수치(C), 장(gut) Tph1 발현 수치(D), 담체(vehicle) 및 pCPA 치료시의 뇌 Tph2 발현.
도 8. WT 조골세포 내 공지된 세로토닌 수용체 발현의 실시간 PCR 분석(A) 및 세로토닌 또는 담체로 처리된 1차(primary) 조골세포 내 사이클린 및 조골세포-특이성 유전자 발현의 실시간 PCR 분석(B).
도 9. 지정된 시간 동안 세로토닌으로 처리된 1차 조골세포 내에서, CREB 인산화의 웨스턴 블랏 분석(Western Blot Analysis)(A) 및 사이클린 D1 프로모터에 결합한 CREB의 ChIP 분석(B).
도 10. 지정된 연령의 WT 쥐의 십이지장에서, Tph1(A) 및 Lrp5(B) 발현의 실시간 PCR 분석.
도 11. CBMIDA의 경구 공급(oral feeding)은 말초 세로토닌을 감소시킨다.
도 12. 사람에서 고골량을 유발하는 변종인 십이지장 세포의 Lrp5 유전자의 두 대립형질 모두에서 발현하도록 개조된 쥐는 정상쥐(wild-type (WT) mice)보다 더욱 높은 골량을 나타낸다. 척추(Vertebrae)에 플라스틱 매질을 삽입하고, 5 마이크로미터 절개하고, 본 코사/반 기손 시약(von Kossa/Van gieson reagent)으로 착색하였다. 골 기질은 검은색으로 착색되었다.
도 13. CBMIDA 및 실시예 11의 또 다른 화합물의 경구 공급에 대한 섭생.
도 14. CBMIDA 및 실시예 11의 또 다른 화합물의 경구 공급시 세로토닌 수치의 변화.
도 15. 난소절제된 쥐(ovariectomized mice)에서 말초 세로토닌 생성에 대한 CBMIDA 및 pCPA의 효과.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 사용된 저골밀도와 관련된 질병("저골량 질병")은 비정상적인 저골량으로 인하여 골의 건강 또는 무결성의 상실을 유발하거나 또는 이런 것들을 특징으로 하는 모든 골질병(bone disease) 또는 골상태를 의미하며, 골다공증, 골다공증-가성신경교종 증후군(OPPG), 골감소증, 골연화증, 신성골이영양증, 불량 골형성 또는 재흡수, 파제트병, 골절 및 부서진 뼈, 및 골전이를 포함하며, 여기에 제한되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 본 발명에 따라 치료 및/또는 예방될 수 있는 골질병은 대응하는 무-질병 골의 골량에 비하여 감소된 골량을 특징으로 하는 골질병을 포함한다.
본 명세서에 사용된 고골밀도와 관련된 질병은 고도 골량 증후군과 같이, 비정상적인 고골밀도를 유발하거나 이를 특징으로 하는 모든 골질병 또는 골상태를 의미한다.
골질병의 예방은 명백한 질병 발생 이전에 본 명세서에 개시된 바에 따라 적극적으로 개입하여 질병을 예방하거나 질병의 정도를 최소화하거나 또는 그 진척 정도를 늦추는 것을 의미한다.
골질병의 치료는 발병 이후에 적극적으로 개입하여 골질병, 특히 저골량 질병을 갖는 것으로 알려졌거나 또는 의심되는 환자의 증상을 완화 또는 개선하거나, 또는 질병 또는 상태를 반전시키는 것을 의미한다. 더욱 상세하게는, 치료는 무-질병 상태인 대응하는 무-질병 골(즉, 대응하는 동일 유형, 예를 들면 길이, 척추 등의 골)의 골량과 더욱 유사하도록 골량을 조절하는 방법을 의미한다.
다른 언급이 없는 한, 화합물의 "치료를 위한 효과적인 양(therapeutically effective amount)"은 질병 또는 질환의 치료 또는 관리에서 치료적 이득을 제공하거나, 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 지연 또는 최소화시키거나, 또는 또 다른 치료제의 치료 효과를 강화시키는 용량이다. 투여된 용량이 치료-전 수치에 비하여 수혜 포유류(recipient mammal)의 생리에 있어서 바람직한 변화를 유발하거나(예를 들면, 저골량 질병을 갖거나 또는 발병 위험이 있는 포유류에서 골량을 증가시킴) 또는 고골량 질병을 갖거나 또는 발병 위험이 있는 동물에서 골량을 감소시킨다면(치료-전 수치에 비하여), 시약이 "치료를 위한 효과적인 양"으로 투여되었다고 언급된다. 즉, 약물 요법은 치료를 유발하는데, 즉, 무-질병 상태인 대응하는 무-질병 골(예를 들면, 대응하는 동일 유형, 예를 들면 길이, 척추 등의 골)의 골량과 더욱 유사하도록 골량을 조절한다. 예를 들면, TPH1 억제제 또는 세로토닌 합성을 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양은 약물 치료 이전의 수치보다 최소 약 10% 낮은 수치로 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 용량을 포함한다.
세로토닌의 치료-후 수치가 치료-전 수치에 비하여 최소 약 10% 또는 그 이상 감소된다면, TPH1 억제제와 같은 치료제는 혈청 세로토닌을 현저하게 감소시키는 것이다. 혈청 세로토닌 수치가 정상 개체의 혈청 세로토닌 수치에 비하여 약 25% 또는 그 이상 증가된다면, 환자는 저골량 질병의 발병 위험에 처해 있는 것이다. 그 대신에, 혈청 세로토닌 수치가 정상 개체의 혈청 세로토닌 수치에 비하여 약 25% 또는 그 이상 감소된다면, 환자는 고골량 질병의 발병 위험에 처해 있는 것이다.
"환자"는 포유류, 바람직하게는 인간이며, 또한 개 또는 고양이와 같은 반려동물일 수 있거나, 또는 말, 소, 돼지, 또는 양과 같은 가축일 수 있다.
골질병의 치료 또는 예방이 필요한 환자는 골질병을 갖거나 갖는 것으로 의심되거나 또는 골질병 발명의 위험이 있거나 의심되는 환자를 포함한다. 이러한 치료가 필요한 환자는 예를 들면, 골다공증이 있는 것으로 알려진 사람일 수 있다. 골질병의 발병 위험이 있는 환자는 노인, 폐경기 이후 여성, 글루코코르티코이드(glucocorticoids)로 치료받는 환자, SSRI로 치료받는 환자, 및 정상 범위를 벗어난 골밀도를 갖는 환자를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의한 치료 또는 예방을 필요로 하는 또 다른 환자는 골질병, 예를 들면 골다공증을 치료 또는 예방하기 위하여 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 처치가 필요한 것으로 알려진 사람을 포함한다. 이러한 사람은 정상 개체의 혈청 세로토닌 수치에 비하여 약 25% 또는 그 이상 더 높은 혈청 세로토닌 수치를 갖는 것으로 확인된 사람을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의한 골질병 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 TPH1 억제제, 세로토닌 HT1B 길항제, 또는 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 또 다른 시약으로 치료를 받는 환자는 포함하지 않는데, 여기서 상기 환자는 골질병 이외의 목적을 위하여 TPH1 억제제, 세로토닌 HT1B 길항제, 또는 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 또 다른 시약으로 치료를 받는 경우이다. 따라서, 본 발명의 방법에 의한 골질병 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 과민성 대장 증후군과 같은 화학요법으로 인한 구토 또는 위장 장애를 치료할 목적으로 TPH1 억제제로 치료받는 환자는 포함하지 않는다.
"소규모 유기 분자(small organic molecule)"는 분자량이 100 이상, 그리고 약 2,500 돌턴 이하, 바람직하게는 500 돌턴 이하인 유기 화합물을 의미한다.
"TPH1 억제제"는, TPH1 억제제가 없는 검정에서 TPH1에 의해 트립토판으로부터 생성된 5-하이드록시트립토판의 양에 비하여, 적절한 검정에서 TPH1에 의해 트립토판으로부터 생성된 5-하이드록시트립토판의 양을 최소 약 10% 감소시키는 물질이다. 시약의 TPH1 억제 수준을 결정하는 검정은 국제 특허 공보 WO 2007/089335에 개시되어 있다.
"TPH2 억제제"는, TPH2 억제제가 없는 검정에서 TPH2에 의해 트립토판으로부터 생성된 5-하이드록시트립토판의 양에 비하여, 적절한 검정에서 TPH2에 의해 트립토판으로부터 생성된 5-하이드록시트립토판의 양을 최소 약 10% 감소시키는 물질이다.
골량을 측정하는 기술은 다음 기술들을 비롯하여 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 기술들을 포함하며, 여기에 제한되는 것은 아니다: 골격 X-선(skeletal X-ray), 이것은 골의 투명 수치를 나타낸다(투명 수치가 낮을수록 골량이 높다); 전통적인 골 조직학(예를 들면, 골 부피, 수주/섬유주(trabiculi/trabiculation)의 수 및 형상, 대조군 및/또는 파골세포와 비교한 조골세포의 수); 및 이중 에너지 X-선 흡수계(dual energy X-ray absorptiometry, DEXA) (levis & Altman, 1998, Arthritis and Rheumatism, 41:577-587), 이는 골량을 측정하며 골다공증에서 흔히 사용된다. BFR은 골형성률(bone formation rate)을 의미한다. 당해 업계에 공지된 임의 방법이 고골량 질병 또는 저골량 질병의 발명 위험이 있는 사람을 진단하기 위하거나 또는 약물 요법의 효과를 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
선택성 세로토닌 재흡수 억제제(Selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)는 우울증, 불안 장애, 및 몇몇 인격 장애의 치료에 사용되는 항우울증제(antidepressant) 류를 의미한다. 이들은 또한 조루증 문제(premature ejaculation problem)의 치료에 전형적으로 효과적이며 이러한 치료에 사용된다. SSRI는 시냅스전 세포(presynaptic cell)로의 재흡수를 억제하여 신경전달물질 세로토닌의 세포 외 수치를 증가시켜, 시냅스후 수용기(postsynaptic receptor)에 결합할 수 있는 세로토닌의 수치를 증가시킨다. 이들은 노르아드레날린 및 도파민 운반체에 대한 결합 친화도를 거의 갖지 않는 그 밖의 다른 모노아민 운반체에 대하여 다양한 선택도를 갖는다. 합리적으로 고안된 제1류 향정신성 약물인 SSRI는 많은 국가에서 가장 광범위하게 처방되는 항우울증제이다. SSRI는 다음을 포함한다: 시탈로프람(citalopram) (CELEXA®, CIPRAMIL®, EMOCAL®, SEPRAM®, SEROPRAM®); 에스시탈로프람 옥살레이트(escitalopram oxalate) (LEXAPRO®, CIPRALEX®, ESERTIA®); 플루옥세틴(fluoxetine) (PROZAC®, FONTEX®, SEROMEX®, SERONIL®, SARAFEM®, FLUCTIN® (EUR), FLUOX® (NZ)); 플루복사민말레이트(Fluvoxamine maleate) (LUVOX®, FAVERIN®); 파록센틴(paroxetine) (PAXIL®, SEROXAT®, AROPAX®, DEROXAT®, REXETIN®, XETANOR®, PAROXAT®); 세르트랄린(Sertraline) (ZOLOFT®, LUSTRAL®, SERLAIN®), 및 다포섹틴(dapoxetine)(알려진 상표명 없음).
하나 이상의 메커니즘을 통한 Lrp5 의 골 성장 조절
골격 생물학에 관하여 쥐와 인간 사이의 유전자 기능의 극단적인 보존은 왜 골격 생물학, 특히 골 재형성 및 항상성의 연구가 쥐 및 인간 유전자 연구에 의해 심도깊은 영향을 받아왔는지를 설명한다. 비록 초기에는 쥐에 대한 유전자 비활성화 실험 또는 인간에 대한 질병 유전자의 분자 복제가 배아의 발달 동안 중요한 유전자를 확인하기 위하여 고안되었으나, 이러한 연구의 결과는 출생 이후 골격 생물학의 분자적 기초를 새롭게 조명하여 상기 초기 목적보다 한발 더 나아갔다. 유전자 제거 실험을 통하거나 또는 성인의 골량 유지를 위하여 중요하다고 밝혀진 인간 유전자 연구를 통하여 확인된 유전자들 중에서, 비타민 D 수용체, 인터루킨 6, 에스트로겐 수용체 α 및 LDL 수용체 연관 단백질 5(Lrp5)이 인용될 수 있다(Gong et al., 2001, Cell 107: 513-523; Boyden et al., 2002, N. Engl. J. Med. 346:1513-1521; Yoshizawa et al., 1997, Nat. Genet. 16: 391-396; Ohshima et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8222822-6; Windahl et al., 2002, Trends Endocrinol. Metab. 13:195-200).
출생-후 골 형성의 조절자로서 Lrp5의 확인은 발달 연구(developmental studies)가 어떻게 생리학의 이해에 깊이 있게 영향을 미칠 수 있는가에 대한 가장 분명한 예 중의 하나인데, 왜냐하면 이러한 수용체는 발달 과정 동안 발현되지만 그 기능은 출생 후에야 명확해지기 때문이다. 실제로, Lrp5의 기능-소실 변종은 인간에서 골다공증-가성신경교종 증후군(OPPG), 즉 소아 질병을 유발하며, 그리고 Lrp5의 기능-획득 변종은 고골량, 즉 청소년기에만 가장 흔히 나타나며 성년 동안 지속되는 표현형을 유발한다(Gong et al., 2001, Cell 107: 513-523; Boyden et al., 2002, N. Engl. J. Med. 346:1513-1521; Johnson et al., 1997, Am. J. Hum. Genet. 60:1326-1332). 이와 유사하게, 골격발생(skeletogenesis)은 Lrp5 -/- 쥐에서 정상이며 이들의 저골량 표현형은 단지 출생-후에 전개된다(Kato et al., 2002, J. Cell. Biol. 157: 303-314).
LDL 수용체 연관 단백질 5(LRP5)은 정상 골량을 위하여 요구되며, 저골량 표현형은 인간 및 쥐에서 Lrp5 비활성화에 의해 유발된다(Gong et al., 2001, Cell 107:513-523; Kato et al., 2002, J. Cell. Biol. 157: 303-314). Lrp5 -/- 쥐는 변화없는 파골세포 표면 및 감소된 조골세포 수와 함께 저골량을 갖는다. Lrp5 -/- 분자 지표의 실시간 PCR 분석에 의하면, Lrp5-/- 조골세포는 조골세포-특이성 유전자 발현에서 변화를 나타내지 않았으나 사이클린 유전자의 감소된 발현을 갖는다(도 1). Lrp5 및 이와 가장 가까운 친족인 Lrp6은 초파리 유전자 애로우(Drosophila gene arrow)의 척추동물 동족체(vertebrate homologue)인데, 초파리 유전자 애로우는 Wnt 단백질의 초파리 동족체(drosophila homologue)인 윈글레스(Wingless)를 위한 보조-수용체로서 기능을 하는 표면 수용체를 인코딩한다(Wehrli et al., 2000, Nature 407:527-530; Tamai et al., 2000, Nature 407:530- 535). 척추 세포(vertebrate cell)에 있어서, Wnt 신호전달(Wnt signaling)은 주로 β-카테닌에 의해 중개된다. Wnt 리간드가 그 수용체에 결합하면, β-카테닌이 핵으로 이동되며 여기서 상기 β-카테닌은 Lef/Tcf 전사 인자(transcription factor)와 협력하여 유전자 발현을 활성화시킨다(logan et al., 2004, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20:781-810; Mao et al., 2001, Mol. Cell, 7:801-809). 이러한 정규 모델에 따르면, Lrp5의 공-형질도입(co-transfection)은 탑플래쉬 프로모터와 같은 Tcf-의존 프로모터의 활성을 강화시키는 Wnt 단백질의 능력을 증가시킨다(Gong et al., 2001, Cell 107: 513-523; Boyden et al., 2002, N. Engl. J. Med. 346:1513-1521; Mao et al., 2001, Mol. Cell, 7:801-809). 협력적으로, 애로우(arrow)와 Lrp5 사이의 서열의 동족관계 및 표준 경로를 통하여 Wnt 신호전달을 제공하는 Lrp5의 능력은 모델을 유발하였는데 이 모델에 의하면 Wnt 신호전달이 조골세포 증식 및 기능을 조절함으로써 출생 후 그리고 성년기 동안 골량을 조절한다. Lrp5가 Wnt에 대한 보조-수용체일 수 있고 Wnt 신호전달이 골 형성의 조절에 관련된다는 개념에 대해서는 의문의 여지가 없다(Glass et al., 2005, Dev. Cell 8:751-764; Holmen et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:21162-21168; Day et al., 2005, Dev. Cell, 8:739-750; Hu et al., 2005, Development 132:49-60). 그럼에도, Lrp5 기능-소실 또는 기능-획득 모델 중 어느 하나에서 관찰되는 골 비정상성을 설명하는 추가적인 메커니즘이 있을 수 있다.
세로토닌을 통한 말초에서의 Lrp5 의 골량 조절
TPH1은 생화학적 통로에서 제1 효소를 인코딩하여 중추 신경계 외부에서의 세로토닌 합성을 유발한다. 십이지장의 장크롬친화성세포에서 대부분 발현되는 세포-특이성 유전자처럼 보인다(Gershon and Tack, Gastroenterology, 2007, 132:397-414). 이와 대조적으로, 뇌에서의 세로토닌 합성은 TPH2에 의존하는데, 이는 중추 신경계(CNS)에서 발현된 서로 다른 유전자에 의해 인코딩된다.
Lrp5 비활성화가 골 형성에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 밝히려는 노력의 일환으로, WT 및 Lrp5 -/- 골에서의 마이크로어레이 분석이 수행되었다. 트립토판 하이드록실라제 1(TPH1)은 저골량 질병을 갖는 Lrp5 -/- 골에서 가장 고도로 과발현된 유전자로 확인되었다. 이러한 결과는 놀라운 것인데 왜냐하면 이러한 결과는 골량을 증가시키는 뇌에서의 세로토닌의 역할을 고려하여 기대될 수 있는 결과와 상반된 것이기 때문이다. 놀랍게도, 조골세포에서만 β-카테닌이 결핍된 쥐에서 TPH1 발현은 정상적이었다(Glass et al., 2005, Dev. Cell 8:751-764).
TPH1은 Lrp5 -/- 쥐에 있어서 골에서뿐만 아니라 십이지장에서도 과발현되는 것으로 밝혀졌는데, 여기서 TPH1 발현은 조골세포에서보다 1300-배 이상 더 높다. 혈청 세로토닌 수치는 갓 태어난 Lrp5 -/- 쥐에서는 정상이나 골 표현형 발달에 따라 나이가 들면서 점차적으로 증가한다는 것이 더욱 논의되었다. 이는 Lrp5 -/- 쥐에서 저골량 표현형이 출생시에는 존재하지 않으나 발달 동안 추후에 나타난다는 사실과 일치한다. 추가적인 발견에 따르면, Lrp5 -/- 쥐를 pCPA라 불리는 세로토닌 합성 억제제로 치료하는 것은 이들의 저골 표현형을 교정한다(도 7). 마지막으로, TPH1 발현은 나이 든 동물에서 증가되는데, 즉 골량이 감소하는 것으로 알려졌을 시기에 증가된다고 밝혀졌다. 이러한 자료 및 이하에서 설명하는 추가적인 자료를 바탕으로 하면, 아직 밝혀지지 않은 메커니즘에 의하여, LRP5는 십이지장에서 세로토닌 합성의 음성 조절자(negative regulator)이며, 혈청 세로토닌 신호전달을 증가시키는 것은 조골세포 증식 및 기능에 부정적인 영향을 미친다고 결론내릴 수 있다.
세로토닌, 다면적( Multifaceted ) 분자
세로토닌(5-하이드록시트립타민, 5-hydroxytryptamine, 5-HT)은 포유류의 중추 신경계에서 신경전달물질로서 그리고 말초(periphery)에서 호르몬으로서 작용하는 생체 아민(biogenic amine)이며, 말초에서 이것의 대부분이 생성된다(Gershon et al., 1990, Neuropsychopharmacology, 3:385-395). 세로토닌은 효소의 연쇄증폭(enzymatic cascade)을 통하여 생성되는데 여기서 L-트립토판은 트립토판 하이드록실라제(TPH)라 불리는 효소에 의해 L-5-하이드록시트립토판으로 전환된다. 이러한 중간 생성물은 그 후 방향족 L-아미노산 디카르복실라제에 의해 세로토닌으로 전환된다. 두 가지 TPH 인코딩 유전자, 즉 TPH1 및 TPH2가 있는데, 이들은 아미노산 서열이 71% 동일하며 촉매 도메인이 약 90% 유사하다. TPH1은 말초에서 세로토닌 합성을 제어하는 반면, TPH2는 뇌에서의 세로토닌 합성을 담당한다(Walther et al., 2003, Science 299:76). 세로토닌이 뇌혈관 장벽을 횡단할 수 없다는 것을 고려하면, 이들 두 유전자는 각각 말초 및 뇌에서 이들 분자의 수치를 조절하는 것만을 담당한다. 결과적으로, 뇌혈관장벽을 횡단할 수 없는 TPH1 억제 화합물을 고안하는 것은 말초에서 TPH1의 선택성 억제를 달성하고 이러한 생리적 구획에서 세로토닌 수치를 감소시키는 방법 중 하나이다.
TPH1은 거의 유일하게 십이지장의 세포에서 발현되며, 전체 세로토닌의 95%를 나타내는 말초 세로토닌의 합성을 담당한다(Gershon & Tack, 2007, 132:397-414). 십이지장 이외의 임의 조직에서의 TPH1 발현은 최소 100-1000배 낮다. 따라서, TPH1은 십이지장-특이성 유전자로서, 그리고 말초 세로토닌 생산은 십이지장-특이성 과정으로 간주 될 수 있다.
신경매개인자로서의 역할 이외에, 대순환에서의 풍부함으로 인하여, 세로토닌은 심장 발달, 위장 운동, 간 재생성 및 젖샘 발달을 비롯하여, 말초 조직에서의 다양한 발달 과정 및 생리학적 과정에 관여되어 왔다(lesurtel et al., 2006, Science, 312:104-107; Matsuda et al., 2004, Dev. Cell, 6:193-203; Nebigil et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9508-9513). 그 기능을 실행하기 위하여, 세로토닌은 최소 14개 수용체에 결합할 수 있는데, 이들 중 대부분은 G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)이다. 하나 또는 몇몇 세로토닌 수용체가 조골세포를 비롯한 대부분의 세포 유형에 존재한다(Westbroek et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:28961-28968).
제1형 콜라겐, 오스테오칼신 , 조골세포 분화 및/또는 세포외 기질 단백질 합성{ 런엑스2 ( Runx2 ) 및 오스테릭스 ( Osterix ) 및 Atf4 } 그리고 파골세포 분화{ 랑클( RankL ) 및 오스테오프로테그린( Osteoprotegrin )} 에 영향을 미치는 조절 유전자는 Lrp5 -결핍 쥐에서 정상이다.
Lrp5 -/- 쥐들은 출생시에는 모든 면에서 WT 쥐와 구별되지 않지만, 추후 혁신적으로 상당한 저골량 표현형을 발달시킨다(Kato et al., 2002, J. Cell. Biol. 157: 303-314). 조직학적 및 조직계측학적 분석에 따르면, 이러한 저골량 표현형은 골 형성은 감소되는 반면 골 재흡수는 영향을 받지 않기 때문이다. 중요한 것은, 조골세포 분화는 변종 쥐에서 영향을 받지 않는 반면 조골세포 증식은 Lrp5의 부존재시 2배 감소된다는 것이다. Lrp5 -/- 쥐가 변화없는 파골세포 표면(B) 및 감소된 조골세포 수(C)와 함께 저골량(A)을 갖는 것을 나타내는 도 1을 참조하라.
Lrp5 -/- 분자 지표의 실시간 PCR 분석.
Lrp5 신호전달 분열의 분자 지표를 나타내기 위하여, 조골세포 혈통 또는 세포 증식 결정을 특징으로 하는 다중 유전자의 발현이 Lrp5 -/- 쥐를 사용하여 연구되었다(Kato et al., 2002, J. Cell. Biol. 157: 303-314). 특히 골 형성과 관련된 유전자의 발현이 먼저 분석되었다. 조골세포에서 고도로 발현된 두 유전자인 제1형 콜라겐 및 오스테오칼신의 발현은 Lrp5 -/- 골에서 정상이다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 발견은 Lrp5 -/- 쥐의 골 표현형이 골 세포외 기질(ECM)의 주요 성분인 제1형 콜라겐 합성에서의 결함에 의해 유발되지 않는다는 것을 밝혔다는 점에서 중요하다. 조골세포 분화 및/또는 세포외 기질 단백질 합성에 영향을 미치는 조절 유전자의 발현이 또한 연구되었다. 세 개의 공지된 조골세포-특이성 전사 인자인 런엑스2 및 오스테릭스 및 Atf4의 발현은 Lrp5 -/- 골에서 변화하지 않았다(도 1D). 이와 유사하게, 조골세포에 의해 발현된 파골세포 분화의 두 조절자인, 랑클 및 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin, OPG)의 발현은 Lrp5 제거에 의해 영향을 받지 않는다(도 1D). 이러한 후자의 특징은 Lrp5 -/-를 β-카테닌 조골세포-특이성 결핍(βcat ob -/-) 골과 구별시킨다(Glass et al., 2005, Dev. Cell 8:751-764; Holmen et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:21162-21168).
Lrp5 -/- 골의 특성을 나타내는 조골세포 증식의 감소를 고려하여, 세포 주기 진전의 표지 유전자의 발현이 또한 연구되었다. 세포 주기의 G1 상으로부터 S 상으로의 전환에 필수적인 세 가지 유전자인 사이클린 D1, D2 및 E1의 발현은 Lrp5 -/- 골에서 감소되었다(도 1E). 이러한 결과에 기초하면, 분자 수치에 있어서 Lrp5의 부존재로 인하여 유발된 저골량 표현형은 순수하게 세포 증식 결함인 반면,골 세포외 기질(ECM)의 주된 단백질 성분인 제1형 콜라겐의 발현, 및 공지된 조골세포-특이성 전사 인자 3가지 모두는 정상이라 여겨진다.
Lrp5 -/- 쥐에서의 저골 표현형은 비정상 Wnt 신호전달 때문이 아님.
Lrp5가 Wnt에 대한 보조-수용체일 수 있고 Wnt 정규 신호전달 통로의 일부분일 수 있음을 제안하는 신뢰할 만한 실험적 주장 및 서열 동족성을 고려하여, Lrp5 -/- 쥐의 골 표현형이 비정상 Wnt 신호전달에 기인한 것인지에 대하여 연구되었다. 이를 위하여, 조골세포 내 β-카테닌이 결핍된 쥐만이 분석되었다(Glass et al., 2005, Dev. Cell 8:751-764). 조골세포에서 단지 β-카테닌만이 결핍된 쥐는 저골량 표현형을 발달시키며 이러한 표현형은 Lrp5 -/- 쥐에서 작동하는 메커니즘과 완전히 상이한 메커니즘에 의해 유발된다는 것이 일찍이 밝혀졌다. 실제로, β-cat ob -/- 쥐는 정상적인 조골세포 수, 파골세포 수의 증가, 및 디옥시피리디놀린 제거의 증가를 가지며, 이는 OPG 발현의 감소에 대하여 부차적인 비정상성이다(Glass et al., 2005, Dev. Cell 8:751-764). 더욱이, Lrp5 -/- 골과는 달리, 세포 주기 표지인 사이클린 D1, D2 및 E1의 발현은 β-cat ob -/- 골에서 정상이었다(도 2). 따라서, β-cat ob -/- 및 Lrp5 -/- 쥐 골 표현형의 세포 기저 및 분자 기저는 완전히 상이한 것으로 나타난다. 비록 이러한 예상치 못한 결과가 Lrp5가 Wnt 보조-수용체로서 작용할 수 있음을 배제하지는 않지만, Lrp5 손실이 골 형성에 어떻게 특이적으로 영향을 미치는가를 설명할 수 있는 또 다른 메커니즘의 가능성은 여전히 존재하였다. 이를 위하여, WT 골에 비하여 Lrp5 -/- 에서 비정상적으로 발현된 유전자를 찾기 위한 마이크로어레이 분석이 수행되었다.
TPH1 은 Lrp5 -/- 쥐의 골 및 십이지장에서 과발현됨.
놀랍게도 Lrp5 -/- 골의 마이크로어레이 분석에 의하면, 유전자들 중 가장 고도로 과발현된 유전자는 TPH1 이었다(도 3). TPH1 발현은 β-catob -/- 골 및 조골세포에서는 정상이며, 더욱이 이들 두 변종 쥐 계통(mouse strain) 사이에 존재하는 분자 차이점을 이해는 것을 강조하는 것이 중요하다. 십이지장에 제한된 WT 쥐에서 TPH1 발현의 다소 한정된 패턴을 고려하면, Lrp5 -/- 골에서의 TPH1의 과발현은 놀라운 것었으며, 이것이 조골세포-특이성 특성인지 여부에 대한 문제를 제기했다.
이러한 문제에 답변하기 위하여, WT 및 Lrp5 -/- 쥐의 모든 조직에서의 TPH1 발현이 qPCR에 의해 분석되었다. TPH1 발현이 WT 쥐에 비하여 Lrp5 -/- 쥐의 십이지장에서 3배 증가되었음이 밝혀졌다(도 4A). 그렇지만, TPH1 발현은 Lrp5 -/- 쥐에 있어서 조골세포에서보다 십이지장에서 1300배 이상 더 높게 유지되었다(도 4B). 이러한 후자의 데이터는 Lrp5 -/- 쥐에서 관찰된 골 표현형이 주로 장 기원(gut origin)을 가질 수 있음을 처음으로 제안했다. 비록 낮은 수치로 예상되었기는 하지만 Lrp5 +/- 쥐에서 TPH1 발현의 증가가 또한 관찰되었다(도 4C). 이는 중요한 관찰인데 왜냐하면 이형접합체성 Lrp5 +/- 쥐가 또한 저골량 표현형을 갖기 때문이다. 중요하게도, 갓 태어난 Lrp5 -/- 쥐에서 골 표현형의 부재와 일치하게도, TPH1 발현은 갓 태어난 쥐에서는 증가되지 않았다(도 4C). TPH1 발현의 변화는 Lrp5 +/- 및 Lrp5-/- 쥐 둘 모두에서의 증가된 혈청 세로토닌 수치에 반영되었다(도 4D); 혈청 세로토닌 수치는 출생시 0이었지만 2, 4, 및 8주 연령에서 존재하였다. 더욱이, 이러한 변화는 Lrp5 -/- 쥐에서 골 표현형이 나타나는 것에 선행하였다.
이와 대조적으로, 뇌에서의 TPH2의 발현은 Lrp5 -/- 쥐에서 영향을 받지 않았으며 뇌의 세로토닌 함량은 WT 및 Lrp5 -/- 쥐에서 유사하였다(도 4E 및 4F). 이러한 관찰은 세로토닌이 뇌혈관장벽을 횡단하지 않는다는 사실과 일치하며(Mann et al., 1992, Arch. Gen. Psychiatry, 49:442-446) Lrp5 기능과 세로토닌 생물학 사이의 연계가 말초 세로토닌에 부합해야 함을 제시한다.
TPH1 유전자의 발현은, 특히 십이지장 세포 내 쥐 Lrp5 유전자의 하나의 대립형질 (Lrp5 +/ act duo) 또는 둘 모두의 대립형질(Lrp5 act duo)을 갖는 인간에서 높은 골량을 유발하는 변종에 의해 개량된 쥐에서, 정상(wild type, WT) 쥐에서보다 감소되었다. RNA가 1개월 연령 쥐의 십이지장으로부터 추출되었으며 TPH1 유전자의 발현이 실시간 PCR에 의해 정량화되었다(도 12).
Figure pct00017
특히 십이지장 세포 내 Lrp5 유전자(Lrp5 act duo)를 갖는 인간에서 높은 골량을 유발하는 변종으로 개량된 쥐는 정상 쥐에 비하여 더 높은 골량을 나타낸다(도 12).
이를 종합하면, 이러한 분석 결과에 의하면, Lrp5 결핍에 의해 유발된 TPH 발현의 증가는 TPH1(및 따라서 말초 세로토닌)에 한정되며, 비록 이러한 발현이 십이지장에서 최소 1300-배 더 높을지라도 이는 조골세포 및 십이지장 세포 둘 모두에서 일어난다. 이러한 결과는 두 가지 의문을 야기한다: 혈청 세로토닌의 증가가 Lrp5-/- 쥐 골 표현형의 원인인가 그리고 이것이 십이지장 세포에 의한 세로토닌의 생성에 의해 중개된 내분비 효과 및/또는 조골세포에 의한 세로토닌의 국지적 생성에 관련된 자가분비 효과인가?
Lrp5 -/- 및 5 Htt -/- 쥐는 동일한 골 표현형을 가짐.
Lrp5 -/- 쥐의 골 표현형이 혈청 세로토닌의 수치 증가에 대한 부차적인 것이라면, 혈청 세로토닌의 증가를 특징으로 하는 쥐 모델은 Lrp5 -/- 쥐와 동일한 조직학적 골 표현형을 가질 뿐만 아니라 앞서 정의된 동일한 분자 지표, 즉 감소된 사이클린 유전자 발현 및 정상 제1형 콜라겐 발현(도 1)을 가져야한다. 이러한 것이 관찰되었다.
세로토닌 합성 억제제( pCPA )는 Lrp5 -/- 쥐의 골 표현형을 구제함.
pCPA, 즉 세로토닌 합성 억제제(Eldridge et al., 1981, Ann. Rev. Physiol. 43:121-135)가 세로토닌 생성을 감소시켜 Lrp5 -/- 골 표현형의 발생을 방지한다는 발견이 혈청 세로토닌 수치의 증가가 Lrp5 -/- 쥐의 골 표현형을 전적으로 또는 부분적으로 담당한다는 결론과 일치한다. WT 및 Lrp5 -/- 쥐는 3주 내지 12주 연령에서 일주일에 3회 300 mg/kg pCPA로 복강내로(intraperitoneally) 처리되었으며(도 7A) 혈청 세로토닌 수치, 장(gut) 내 TPH1 발현 및 뇌간(brain stem) 내 TPH2 발현의 변화를 분석하였다. 골 조직 형태 계측(Bone histomorphometry)이 또한 수행되었다. 도 7B에 도시되 바와 같이, pCPA 처리는 WT 쥐에서 골량에 명백한 영향 없이 Lrp5-/- 쥐에서 관찰된 골 비정상성을 교정하였다. 이러한 Lrp5 -/- 표현형의 복구는 장(gut) TPH1 mRNA의 정상화 및 혈청 세로토닌 수치의 정상화에 의해 달성되었다(도 7C 및 7D). 뇌 TPH2 mRNA 수치는 처리된 쥐에서 영향을 받지 않았으며, 이는 또한 Lrp5 -/- 골에서 관찰된 표현형이 혈청의 변화에 직접적으로 야기된 것이지 뇌, 세로토닌 수치에 의해 야기된 것이 아님을 나타낸다.
세로토닌은 조골세포 내 특정 세로토닌 수용체에 결합함.
Lrp5가 혈청 세로토닌을 통하여 골 형성에 대하여 작용한다는 연구 가설로부터, 다음과 같은 세 번째 추론이 시험되었다: 조골세포는 일부 세로토닌 수용체를 발현하여야 하며, 조골세포의 세로토닌 처리는 α(I) 콜라겐, 런엑스2 또는 오스테오칼신의 발현에 영향을 주지 않으면서 사이클린 D1, D2 및 E1의 발현을 둔화시켜야 한다. 이러한 관점의 첫 번째 부분을 해결하기 위하여, 공지된 세로토닌 수용체 각각의 발현이 WT 조골세포 내에서 qPCR에 의해 분석되었다. 조골세포 내에서 모두 G-단백질 결합 수용체 상과(superfamily)에 속하는 세 가지 서로 다른 세로토닌 수용체들의 발현이 탐지되었다(Noda et al., 2004, Mol. Neurobiol. 29:31-39). HT1B가 가장 고도로 발현된 수용체였다. 이는 Gi-형 G 단백질에 결합하고 아데닐일 사이클라제(adenylyl cyclase) 활성을 억제한다. HT2B는 두 번째로 풍부한 수용체이며 포스파티딜-이노시톨-칼슘 2차 전령계(second messenger system)를 활성화시키는 G 단백질과 결합한다. 마지막으로, HT2A는 조골세포 내에서 현저하게 발현되는 세 번째 수용체이다. HT2B와 유사하게, HT2A는 포스파티딜이노시톨-칼슘 2차 전령계를 활성화시키는 G 단백질과 결합한다. 놀랍게도, 조골세포에서 가장 고도로 발현된 세로토닌 수용체인 HT1B는 또한 그 밖의 다른 세포에서보다 이러한 세포 내에서 더욱 고도로 발현된다. 따라서, 조골세포 내에서 발생하는 적어도 부분적으로 세포-특이성인 신호전달 통로가 존재하며 이러한 통로는 이러한 세포 내에서 세로토닌 신호전달을 특이적으로 전달시킬 수 있다. WT 조골세포 내 공지된 세로토닌 수용체 발현의 실시간 PCR 분석(A) 및 세로토닌 또는 담체로 처리된 1차 조골세포 내 사이클린 및 조골세포-특이성 유전자 발현의 실시간 PCR 분석(B)을 나타내는 도 8을 참조하라.
세로토닌이 조골세포 내 사이클린의 발현을 조절하는지 여부를 시험하기 위하여, 세로토닌 또는 담체로 처리된 1차 조골세포 내 사이클린 발현의 실시간 PCR 분석이 수행되었다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 사이클린 D1 및 D2의 발현은 세로토닌의 존재시에 감소되었다. 이와 대조적으로, 런엑스2, 오스테오칼신 및 제1형 콜라겐의 발현은 변하지 않았다(도 8B). 조골세포의 세로토닌 처리의 분자 지표가 Lrp5의 부존재시에 나타난 것과 유사하다는 것은 조골세포 내에서 Lrp5와 세로토닌 신호전달의 기능적 결합에 대한 가설을 더욱 강화시킨다.
사이클린 D1의 감소된 발현은 조골세포의 세로토닌 치료 및 Lrp5 결함 둘 모두의 주된 특징이다(도 1 및 8). 사이클린 유전자의 발현을 조절하고 조골세포에서 발현되는 것으로 알려진 한 전사 인자는 CREB이다(Fu et al., 2005, Cell 122:803-815). 그러므로, 이러한 세포들 내에서 세로토닌이 CREB 활성을 감소시킬 수 있는지 여부가 시험되었다. 도 9A에 도시된 바와 같이, 세로토닌 처리는 1차 조골세포에서 CREB 인산화를 상당히 감소시켰다. 더욱이, 사이클린 D1 쥐 프로모터 내 CREB 결합 부위가 확인되었으며, ChIP 검정을 사용하여 세로토닌이 상기 프로모터에 대한 CREB의 결합을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 이러한 두 가지 관찰은 CREB가 조골세포에 대한 세로토닌의 작용을 조절할 수 있다는 가설을 제기한다.
TPH1 발현은 나이 든 동물에서 증가됨 .
TPH1 발현이 나이에 따라 증가한다는 것이 꼬마선충(C. elegans)에서 밝혀졌다(Murakami et al., 2007 Feb 28 [Epub ahead of print], Neurobiol Aging). 이러한 것이 포유류에서도 그러한지를 시험하기 위하여, 나이 든 쥐에서의 TPH1 발현이 분석되었다. 실시간 PCR을 사용하여, Lrp5의 발현은 나이에 따라 안정하게 유지되는 반면, TPH1의 발현은 2-개월 연령 쥐에 비하여 1-년 연령 쥐에서 두 배임이 밝혀졌다(도 10). 혈청 세로토닌이 골 형성의 음성 조절자(negative regulator)로서 작용하기 때문에, 나이에 따른 이러한 TPH1 발현의 증가는 노화와 관련된 골 손실을 악화시키고 그에 따라 연령-관련 골 손실에 대한 치료적 개입을 위한 표적이 된다.
진단 방법
본 명세서에 개시된 결과에 따르면 증가된 혈청 세로토닌은 골량을 감소시키며 낮은 혈청 세로토닌은 골량을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 일부 구체 예는 고골량 질병 또는 저골량 질병의 발명 위험이 있는 사람을 진단하는 방법 및 말초 혈청 세로토닌의 수치를 각각 감소시키거나 또는 증가시키는 약물을 투여함으로써 비정상적인 저골량(예를 들면 골다공증 및 OPPG) 및 비정상적인 고골량(예를 들면 고도 골량 증후군)과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체 예는 고골량 또는 저골량의 골질병을 치료 또는 예방하기 위한 신규한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체 예는 환자의 혈청 세로토닌 수치를 결정하여 환자가 골질병 발병의 위험에 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 환자의 수치가 정상 개체의 수치에 비하여 현저히 낮으면(최소 약 25% 낮음), 환자는 비정상적인 고골량 발달의 위험이 있으며 혈청 세로토닌을 정상화시키기 위하여 세로토닌이 투여(바람직하게는 정맥내로)될 수 있으며, 이에 따라 고골량이 발달하는 것을 방지한다. 그 대신에, 환자의 혈청 세로토닌 수치가 정상 개체의 수치에 비하여 현저하게 높으면(약 25% 이상 높음), 환자는 비정상적인 저골량 발달의 위험에 있으며 혈청 세로토닌 수치를 감소시키기 위하여(그리고 바람직하게는 정상화시키기 위하여) TPH1 억제제 또는 세로토닌 합성, 또는 세로토닌 수용체 길항제를 감소시키는 그 밖의 다른 치료제(이들은 HT1B, HT2A 및/또는 HT2B를 표적으로 함)가 투여될 수 있으며, 이에 따라 저골량이 발달하는 것을 방지한다. 환자 관찰은 비정상적 혈청 세로토닌 특질이 만성적인지 여부를 결정할 것이다. 만약 만성적이라면, 환자는 혈청 세로토닌을 정상화하기 위하여 지속적으로 치료될 필요가 있다.
본 명세서에서, 환자의 혈청 세로토닌 수치가 정상 개체의 혈청 세로토닌 수치와 비교될 때, "정상 개체"는 혈청 세로토닌 수치에 영향을 미칠 것으로 예상될 수 있는 특성, 예를 들면 성별, 나이, 일반적 건강, 투약되는 약물에 있어서 환자와 대응하는 사람을 일컫는 것으로 이해되어야 한다.
저골량 질병 및 고골량 질병의 치료 및 예방 방법
본 발명은 저골량 질병 예방 또는 치료를 필요로 한다고 알려지거나 또는 의심되는 환자에 있어서 저골량 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체 예에서, 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 시약은 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제이다.
일부 구체 예에서, 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 시약은 TPH1 억제제인데 이는 TPH1 억제제로 치료되기 전의 수치에 비하여 최소 약 10% 낮은 수치로 혈청 세로토닌을 감소시킨다. 일부 구체 예에서, TPH1 억제제는 TPH1 억제제로 치료되기 전의 수치에 비하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 낮은 수치로 혈청 세로토닌을 감소시킨다.
일부 구체 예에서, 상기 시약은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 TPH1 억제제이다:
pCPA;
CBMIDA;
LP-533401;
LP-615819;
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((4'-메틸바이페닐-4-일)메틸아미노-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(4-모폴리노-6-(나프탈렌-2-일메틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-p-톨일에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-사이클로헥실-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일(페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(6-(2-플루오로페녹시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-(3-(4-클로로페닐)피페리딘-1-일)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-페닐에톡시)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(5-(4-아미노-6-((R)-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)피리딘-2-일)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(3-(4-아미노-6-(R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)-1H-피라졸-1-일)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4'-(3-(사이클로펜틸옥시)-4-메톡시벤질아미노)바이페닐-4-일)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(6-(3-(사이클로펜틸옥시)-4-메톡시벤질아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(6-(3-(사이클로펜틸옥시)-4-메톡시벤질아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-((4'-메틸바이페닐-2-일)메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-페닐에톡시)-피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(3,4-디플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(3-(사이클로펜틸옥시)-4-메톡시벤질아미노)-피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-((3-(사이클로펜틸옥시)-4-메톡시벤질)-(메틸)아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-((1,3-디메틸-1H-피라졸-4-일)메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((S)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일옥시)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((R)-1-(바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(1-(6,8-디플루오로나프탈렌-2-일)에틸아미노)-l ,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메틸바이페닐-2-일)에톡시)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(3,4-디메톡시페닐카르바모일)-피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(4-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-피페리딘-1-일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(메틸(R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸)아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((S)-2,2,2-트리플루오로-1-(6-메톡시나프탈렌-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(바이페닐-4-일메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(나프탈렌-2-일메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-(터트-부톡시카르보닐아미노)-3-(4-(5-(나프탈렌-2-일메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-모폴리노에틸 2-아미노-3-(4-(5-(나프탈렌-2-일메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노에이트;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-플루오로바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(벤질티오)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(나프탈렌-2-일메틸티오)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(3,4-디플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메틸바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(3-(사이클로펜틸옥시)-4-메톡시벤질아미노)피리딘-3-일)페닐)프로파노산;
2-아미노-3-(3-(4-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)-2-플루오로페닐)프로파노산;
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(1-(아다만틸)에틸아미노)-1.3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(5-플루오로-4-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)피리미딘-2-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(4-(트리플루오로메틸)-벤질아미노)피리미딘-4-일)페닐) 프로파노산;
2-아미노-3-(5-(5-페닐티오펜-2-일)-1H-인돌-3-일)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(4-(4-페녹시페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)프로파노산;
(S)-2-아미노-3-(4-(4-(4-(티오펜-2-카르복사미도)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)프로파노산; 및
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(페닐에틴일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산;
뿐만 아니라 상기 화합물들의 라세믹 혼합물 및 개별적인 거울상이성질체, 및 상기 화합물과 생리학적으로 수용가능한 산과의 염.
본 발명에서 사용될 수 있는 추가적인 TPH1 억제제는 아래 표에 나열되어 있다.
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(2-플루오로-4,5-디메톡시벤질아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(4-(2-메톡시페닐)피페리딘-1-일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(6-(3-(사이클로펜틸옥시)-4-메톡시벤질아미노)-2-(디메틸아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(3,4-디메틸벤질아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(바이페닐-2-일메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(S)-에틸 2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(4-(트리플루오로메틸)벤질아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노에이트
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(사이클로펜틸메틸아미노)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(3-(2-(트리플루오로메틸)페닐)피롤리딘-1-일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-1-일아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1,2-디페닐에틸아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-1-(4-(벤조[b]티오펜-3-일)페닐)에틸아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((R)-1-(4'-메톡시바이페닐-4-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
2-아미노-3-(1-(4-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)피페리딘-4-일)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(1-(4-플루오로나프탈렌-1-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((3'-플루오로바이페닐-4-일)메틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)-2-플루오로페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-플루오로바이페닐-2-일)에톡시)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(1-(4-터트-부틸페닐)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-플루오로바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(6,7-디하이드록시-1-메틸-3,4-디하이드로이소퀴놀린-2(1H)-일)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메틸바이페닐-4-일)에톡시)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)피리미딘-2-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(벤질티오)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4'-플루오로바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(3-(4-클로로페녹시)피페리딘-1-일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-3-(4-(4-아미노-6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)-2-(2-아미노아세트아미도)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(6-((R)-1-(나프탈렌-2-일)에틸아미노)-2-(트리플루오로메틸)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(4-(3-클로로페닐)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-페닐에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1,4-디페닐부틸아미노)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(3'-클로로바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-(1-(바이페닐-4-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)-1,3,5-트리아진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,3,3,3-펜타플루오로-1-(3-플루오로-4-메틸페닐)프로폭시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-에틸 2-아미노-3-(4-(2-아미노-6.((R)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노에이트
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((S)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3-플루오로-3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(3'-(디메틸아미노)바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시-5-메틸바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4'-메톡시-5-메틸바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시-3-(메틸설포닐)바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-(사이클로프로필메톡시)-4-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(2-(사이클로프로필메톡시)-4-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(이소펜틸옥시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(5-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-플루오로바이페닐-4-일)에톡시)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4'-메톡시바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(3'-카르바모일바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4'-카르바모일바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-(2-메톡시페녹시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-(2-메톡시페녹시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(이소펜틸옥시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-3-(4-(6-(1-(3'-아세트아미도바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)-2-아미노피리미딘-4-일)페닐)-2-아미노프로파노산
(2S)-3-(4-(6-(1-(4'-아세트아미도바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)-2-아미노피리미딘-4-일)페닐)-2-아미노프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4-시아노페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-에틸 2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-p-톨일에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노에이트
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(1-메톡시바이사이클로[2.2.2]옥트-5-엔-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4-(사이클로펜틸옥시)페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(4-(사이클로펜틸옥시)페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-(3-메톡시페녹시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4,5-디메톡시바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4,5-디메톡시-3'-메틸바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(5-(2,2,2-트리플루오로-1-(2'-메틸바이페닐-2-일)에톡시)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-(3-메톡시페녹시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-(3,5-디플루오로페녹시)페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-(4-메톡시페녹시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4'-((S)-2-아미노-2-카르복시에틸)바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-브로모페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(5-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메틸바이페닐-2-일)에톡시)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-메톡시바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(5-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(4-메틸티오펜-3-일)페닐)에톡시)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-메톡시-3'-메틸바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-(하이드록시메틸)바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(3'-시아노바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(2-(3,5-디플루오로페녹시)페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-(4-메톡시페녹시)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(4-메틸티아졸-2-일)티오펜-3-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(5-(4-메톡시페닐)이속사졸-3-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(1-페닐-5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-(사이클로헥실옥시)-4-메틸페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-(사이클로펜틸옥시)-4-메틸페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(l-(벤조[d]티아졸-6-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(2-(사이클로펜틸옥시)-4-메틸페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(2-(사이클로헥실옥시)-4-메틸페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(피리딘-3-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(1,3-디메틸-1H-피라졸-5-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(3-하이드록시페닐)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-하이드록시바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(3,5-디플루오로페닐)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(3',5'-디플루오로바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-플루오로바이페닐-3-일)에톡시)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(5-에톡시-2-메틸-2,3-디하이드로벤조푸란-6-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(벤조푸란-5-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-m-톨일푸란-3-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-에틸 3-(4-(2-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)-2-(2-아미노아세트아미도)프로파노에이트
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(4-메틸티오펜-3-일)페닐)에톡시)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(5-메틸-3-페닐이속사졸-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(3-(메틸티오)페닐)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-(메틸티오)바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(3'-((디메틸아미노)메틸)바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(3-(트리플루오로메톡시)페닐)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6.(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-(트리플루오로메톡시)바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-3-(4-(2-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)-2-(2-아미노아세트아미도)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(1-메틸-5-페닐-1H-피라졸-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-(메틸설포닐)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-1-(3'-(디메틸아미노)바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-클로로-4-(메틸설포닐)페닐-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(3-(푸란-2-일)테오펜-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-(사이클로펜틸옥시)-4-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(3-메톡시페닐)사이클로헥스-1-엔일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(피리미딘-5-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(5-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-3-일)에톡시)피라진-2-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((S)-1-(3'-(디메틸아미노)바이페닐-2-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(2-(푸란-2-카르복사미도)페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4-클로로-2-(메틸설포닐)페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-이소프로필 2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노에이트
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(2-(사이클로펜틸옥시)-4-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(1-(2-(사이클로헥실옥시)-4-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(1-(티오펜-2-일)사이클로헥실)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-(2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)티아졸-5-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-(사이클로헥실옥시)-4-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(1-(4-메톡시페닐)사이클로헥실)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-플루오로-2-메틸페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(4-플루오로-2-메틸페닐)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(옥사졸-2-일(페닐)메톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-사이클로헥실-2,2,2-트리플루오로에틸이덴아미노옥시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(2-(3-(디메틸아미노)페닐)푸란-3-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(5-페닐티오펜-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-페닐 2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노에이트
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-1-(3'-((디메틸아미노)메틸)바이페닐-4-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(1-(3-메톡시벤조일)-1H-피라졸-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(5-페닐푸란-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4-클로로-2-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S,E)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(4-(트리플루오로메틸)스티릴)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(3,4-디클로로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-(4-클로로-3-플루오로페닐)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((R)-1-(3'-(디메틸아미노)바이페닐-4-일)-2,2,2-트리플루오로에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1-클로로-2,2,2-트리플루오로-1-(4-메톡시바이페닐-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(6-(2,2,2-트리플루오로-1-(5-페닐티오펜-2-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(5-(4-페녹시페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)프로파노산
(S,E)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2-(바이페닐-4-일)비닐)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(4-아미노-6-((R)-2,2,2-트리플루오로-1-(3'-메톡시바이페닐-4-일)에톡시)피리미딘-2-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(4'-메톡시바이페닐-4-일설폰아미도)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(6-(3-메톡시페닐)피리딘-3-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(6-(2-플루오로-3-메톡시페닐)피리딘-3-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
2-아미노-3-(5-(4'-메틸바이페닐-4-일)-1H-인돌-3-일)프로파노산
2-아미노-3-(5-m-톨일-1H-인돌-3-일)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-(2-메톡시페닐)푸란-3-카르복사미도)페닐)프로파노산
2-아미노-3-(5-(1-벤질-1H-피라졸-4-일)-1H-인돌-3-일)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(2,2,2-트리플루오로-1-(6-(티오펜-2-일)피리딘-3-일)에톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
2-아미노-3-(6-(1-벤질-1H-피라졸-4-일)-1H-인돌-3-일)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-((2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)티아졸-4-일)메틸아미노)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-((4'-메톡시바이페닐-4-일설폰아미도)메틸)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(3-(2-메톡시디벤조[b,d]푸란-3-일)우레이도)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(3-(2,2-디페닐에틸)우레이도)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(페닐에틴일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-((5-(1-메틸-5-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-3-일)티오펜-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(1,1,1-트리플루오로-3-((R)-2,2,3-트리메틸사이클로펜트-3-엔일)프로판-2-일옥시)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(3-(2-하이드록시에틸카르바모일)피페리딘-1-일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(2S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(3-(피리딘-2-일옥시)피페리딘-1-일)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
(S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노-6-(4-클로로-3-(피페리딘-1-카르보닐)페닐)피리미딘-4-일)페닐)프로파노산
본 발명에서 사용될 수 있는 추가적인 TPH1 억제제는 다음을 포함한다:
N-[(1R,4R,9aS)-4-페닐 옥타하이드로피리도[2,1-c][1,4]옥사진-1-일]3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드;
2,6-피페리딘디온, 3-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-(3-메톡시페닐)-4,4-디메틸-, 모노하이드로클로라이드; 및
트립토신(CAS 등록 번호 86248-47-7; 미국 특허 4,472,387).
전술한 문단에 기재된 많은 치료제의 제조 방법은 국제 특허 공보 WO 2007/089335에 개시되어 있다. 이러한 문헌들은 본 발명의 참조문헌으로 수록된다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00018
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00019
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00020
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타내며(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 그리고
n은 1, 2, 또는 3이다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00021
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타내며(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 그리고
n은 1, 2, 또는 3이다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00022
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타내며(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실);
R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
수소;
할로겐(바람직하게는 F 또는 Cl);
저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타내며(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실);
알콕시, 여기서 알콕시는 R'-O- 그룹을 나타내며, 여기서 R'는 앞서 정의된 저급 알킬이며;
아미노; 또는
니트로;
그리고
n은 1, 2, 또는 3이다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00023
여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타내며(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실);
R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
수소;
할로겐(바람직하게는 F 또는 Cl);
저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타내며(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실);
알콕시, 여기서 알콕시는 R'-O- 그룹을 나타내며, 여기서 R'는 앞서 정의된 저급 알킬이며;
아미노; 또는
니트로;
그리고
n은 1, 2, 또는 3이다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00024
여기서 R은 수소; 저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타냄(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 또는 사이클로알킬이며, 여기서 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소기를 의미한다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00025
여기서 R은 수소; 저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타냄(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 또는 사이클로알킬이며, 여기서 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 포화 탄화수소기를 의미한다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00026
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소; 저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타냄(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 또는 사이클로알킬이며, 여기서 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 포화 탄화수소기를 의미한다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00027
여기서 R은 수소; 저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타냄(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 또는 사이클로알킬이며, 여기서 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 포화 탄화수소기를 의미한다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00028
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소; 저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타냄(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 사이클로알킬, 여기서 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 포화 탄화수소기를 나타냄; F, Cl, 또는 OH이다.
일부 구체 예에서, 치료제는 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00029
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소; 저급 알킬, 여기서 저급 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소기를 나타냄(예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 또는 사이클로알킬이며, 여기서 사이클로알킬은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 포화 탄화수소기를 의미한다.
상기 시약이 또 다른 약제학적 활성 물질(예를 들면 SSRI, 베타 차단제, 또는 세로토닌 수용체 길항제)의 투여 없이 투여되는 TPH1 억제제인 일부 구체 예에서, TPH1 억제제는 pCPA, CBMIDA, 또는 아래 화합물이 아니다:
Figure pct00030
여기서 n은 2, 3, 또는 5이며; 그리고
R은 독립적으로 OCH3, CH2O2, CH3, NO2, 또는 Cl이다.
pCPA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00031
CBMIDA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00032

혈청에서 측정된 말초 세로토닌을 감소시키는 선택성 TPH1 억제제 CBMIDA의 능력이 시험되었다. 250 또는 500 mg/kg 복용량의 CBMIDA가 그룹 당 4-5 마리 쥐로서, 4주 연령 쥐에 20시간에 2회 경구 투여되었다. 대조군으로서, 일부 쥐는 처리되지 않았으며 일부 쥐는 250 mg/kg pCPA가 경구투여되었다. 결과에 의하면, CBMIDA 투여에 대한 용량 반응(dose response)이 존재하여 250 mg/kg은 말초 세로토닌의 약 45% 감소를 유발하였으며, 500 mg/kg은 말초 세로토닌을 약 80% 감소시켰다. pCPA(250 mg/kg)는 혈청 세로토닌의 약 50% 감소를 유발하였다. 이러한 결과는 pCPA가 CBMIDA보다 더욱 효과적이며 사용 용량(250 mg/kg)에서 pCPA가 뇌혈관장벽을 횡단하지 않았음을 나타냈다. 그러므로, 세로토닌이 말초 세로토닌과는 상반되는 효과를 갖는 뇌에서는 pCPA가 세로토닌을 감소시키지 않았다. CBMIDA는 비글(beagle dog)에서 골 부피(osteoid volume)를 증가시키고 체외에서 쥐 두개골-유래 조골세포의 증식을 유도하는 EDTA 유사체라 보고되었다(Xie, et al., Bioorganic & Medicine Chemistry Letters 15(2005) 3267-3270, 전체 내용이 참조문헌으로 수록됨).
pCPA 및 CBMIDA가 그 밖의 다른 약제학적 활성 물질과 함께 혈청 세로토닌 수치를 감소시키기 위하여 사용될 때 본 발명은 pCPA 및 CBMIDA의 사용을 포함할 수 있다고 이해되어야 하며, 여기서 그 밖의 다른 약제학적 활성 물질은 또 다른 목적을 위하여 사용될 수 있거나(예를 들면 우울증 치료를 위하여 사용되는 SSRI) 또는 그 밖의 다른 약제학적 활성 물질은 TPH1의 억제를 포함하지 않는 방법에 의해 혈청 세로토닌을 감소시키기 위해 사용된다.
본 발명은 또한 아래 화합물의 사용을 더욱 포함할 수 있다:
Figure pct00033
여기서 n은 2, 3, 또는 5이며; 그리고
R은 독립적으로 OCH3, CH2O2, CH3, NO2, 또는 Cl이며,
여기서 상기 화합물은 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 그 밖의 다른 약제학적 활성 물질과 함께 사용된다.
전술한 문단에 개시된 화합물을 제조하는 방법은 Xie, et al.의 Bioorganic & Medicine Chemistry Letters 15(2005) 3267-3270에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체 내용이 참조문헌으로 본 발명에 수록된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 TPH1 억제제의 일부 유도체의 사용을 포함한다. 예를 들면, TPH1 억제제의 전구약물은 TPH1 억제제의 카르복시산 기능기를 저급 알코올, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 등으로 에스테르화 시킴으로써 생성될 수 있다. 에스테르가 아닌 TPH1 억제제의 전구약물 또한 고려된다. 예를 들면, TPH1 억제제의 약제학적으로 수용가능한 카보네이트, 티오카보네이트, N-아실 유도체, N-아실옥시알킬 유도체, 3차 아민의 4차 유도체, N-만니 염기(Mannich base), 쉬프 염기(Schiff base), 아미노산 접합체(conjugate), 포스페이트 에스테르, 금속 염 및 설포네이트 에스테르가 또한 고려된다. 일부 구체 예에서, 상기 전구약물은 생가수분해가능 부분(예를 들면, 생가수분해가능 아마이드, 생가수분해가능 카바메이트, 생가수분해가능 카보네이트, 생가수분해가능 에스테르, 생가수분해가능 포스페이트, 또는 생가수분해가능 우레이드 유사체)을 함유할 것이다. 본 명세서에 개시된 TPH1 억제제의 전구약물의 제조에 대한 지침은 다음과 같은 공개문헌에서 찾을 수 있다: Design of Prodrugs, Bundgaard, A. Ed., Elsevier, 1985; Design and Application of Prodrugss , A Textbook of Drug Design and Development, Krosgaard-Larsen and H. Bundgaard, Ed., 1991, Chapter 5, pages 113-191; 및 Bundgaard, H., Advanced Drug Delivery Review, 1992, 8, pages 1-38.
일부 구체 예에서, TPH1 억제제는 뇌-유래 세로토닌의 수치에 상당히 영향을 미치지 않으면서 TPH1을 억제한다. 이러한 억제제를 수득하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (1) TPH2보다 TPH1을 훨씬 더 많은 정도로 억제하는 화합물을 선별(screening)하는 단계; 및 (2) TPH1 및 TPH2 둘 모두를 억제하지만 뇌혈관장벽을 횡단할 수 없어 그에 따라 환자의 중추 신경계 외부에 투여될 때 TPH1에 대하여 효과적으로 특이성인 화합물을 선별하는 단계. 물론, TPH2보다 TPH1을 훨씬 더 많은 정도로 억제하면서 뇌혈관장벽을 횡단할 수 없는 화합물이 또한 적절하다. 바람직하게는, TPH2보다 TPH1을 훨씬 더 많은 정도로 억제하는 화합물은 TPH1에 대한 IC50보다 최소 약 10-배 더 큰 TPH2에 대한 IC50을 갖는다.
몇 가지 사실이 CBMIDA가 뇌혈관장벽을 횡단하지 않으므로 TPH2 선택성인 것을 제안한다. 첫째, CBMIDA의 구조가 EDTA에 기초하며 경구투여시 순환으로 잘 운송되지 않는다(단지 3-5%). 둘째, EDTA-기초 화합물은 일반적으로 우수하지 못한 뇌혈관장벽 횡단 운송을 갖는다.
일부 구체 예에서, 상기 시약은 조골세포에서 제1형 콜라겐, 오스테오칼신, 런엑스2, 오스테릭스, 또는 Atf4의 발현 수치에 상당히 영향을 미치지 않는 TPH1 억제제이다. 일부 구체 예에서, 상기 시약은 조골세포에서 사이클린 D1, D2 및 E1의 발현을 감소시키는 TPH1 억제제이다.
일부 구체 예에서, 상기 시약은 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제, 및 이들의 약제학적으로 수용가능한 염 및 용매화물이다:
Figure pct00034
여기서 A는 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; X는 결합(즉, A가 직접 D에 결합함), -O-, -S-, -C(O)-, -C(R4)=, =C(R4)-, -C(R3R4)-, -C(R4)=C(R4)-, -C≡C-, -N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(R3R4)N(R5)-, -N(R5)C(R3R4)-, -ONC(R3)-, -C(R3)NO-, -C(R3R4)O-, -OC(R3R4)-, -S(O2)-, -S(O2)N(R5)-, -N(R5)S(O2)-, -C(R3R4)S(O2)-, 또는 -S(O2)C(R3R4)-이며; D는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; R1은 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R3은 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬이며; R4는 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 각 R5는 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 그리고 n은 0-3이다. 이러한 TPH1 억제제는 국제 특허 공보 WO 2007/089335에 개시되며, 여기서 이들 억제제는 위장관 질환 및 장애(gastrointestinal diseases and disorders) 뿐만 아니라 카르시노이드 증후군(Carcinoid Syndrome)의 치료에 유용하다고 개시된다.
일부 구체 예에서, 상기 시약은 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제, 및 이들의 약제학적으로 수용가능한 염 및 용매화물이며:
Figure pct00035
여기서: A는 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; X는 결합(즉, A가 직접 D에 결합함), -O-, -S-, -C(O)-, -C(R4)=, =C(R4)-, -C(R3R4)-, -C(R4)=C(R4)-, -C≡C-, -N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(R3R4)N(R5)-, -N(R5)C(R3R4)-, -ONC(R3)-, -C(R3)NO-, -C(R3R4)O-, -OC(R3R4)-, -S(O2)-, -S(O2)N(R5)-, -N(R5)S(O2)-, -C(R3R4)S(O2)-, 또는 -S(O2)C(R3R4)-이며; D는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; E는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; R1은 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R3은 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬이며; R4는 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 각 R5는 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 그리고 n은 0-3이다. 이러한 TPH1 억제제는 국제 특허 공보 WO 2007/089335에 개시되며, 여기서 이들 억제제는 위장관 질환 및 장애뿐만 아니라 카르시노이드 증후군의 치료에 유용하다고 개시된다.
바로 앞 두 문단에 개시된 화합물에 있어서:
"사이클로알킬"은 1 내지 20(예를 들면, 1 내지 10 또는 1 내지 4)의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소를 의미한다. 사이클로알킬 부분은 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭일 수 있으며, 그 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 아다만틸이 포함된다.
"아릴"은 탄소 및 수소 원자로 구성된 방향족 고리 또는 방향족 또는 부분적 방향족 고리계를 의미한다. 아릴 부분은 함께 결합되거나 융합된 다중 고리를 포함할 수 있다. 아릴 부분(aryl moieties)의 예에는 안트라센일, 아줄렌일, 바이페닐, 플루오렌일, 인단, 인덴일, 나프틸, 펜안트렌일 페닐, 1,2,3,4-테트라하이드로-나프탈렌, 및 톨일이 포함된다;
"헤테로사이클"은 탄소, 수소 및 최소 하나의 헤테로원자(예를 들면, N, O 또는 S)로 구성된 방향족, 부분적인 방향족 또는 비-방향족 모노사이클 또는 폴리사이클 고리 또는 고리계를 의미한다. 헤테로사이클은 함께 융합되거나 결합된 다중(즉 2 또는 그 이상)고리를 포함할 수 있다. 헤테로사이클은 헤테로아릴을 포함한다. 그 예에는 벤조[1,3]디옥솔일, 2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신일, 신놀린일, 푸란일, 하이단토인일, 모폴린일, 옥센탄일, 옥시란일, 피레라진일, 피페리딘일, 피롤리딘온일, 피롤리딘일, 테트라하이드로푸란일, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로피리딘일, 테트라하이드로피리미딘일, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피란일 및 발레로락탐일이 포함된다;
"알킬"은 1 내지 20(예를 들면, 1 내지 10 또는 1 내지 4)개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄, 측쇄 및/또는 사이클릭("사이클로알킬") 탄화수소를 의미한다. 알킬 기의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸, 논일, 데실, 운데실 및 도데실이 포함된다. 사이클로알킬 부분은 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭일 수 있으며, 그 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 아다만틸이 포함된다. 알킬 부분의 추가적인 예는 선형, 측쇄 및/또는 사이클릭 일부분을 갖는다(예를 들면, 1-에틸-4-메틸-사이클로헥실). 용어 "알킬"은 알켄일 및 알킨일 부분뿐만 아니라 포화 탄화수소를 포함한다.
"알킬-아릴"은 아릴 부분(moiety)에 결합된 알킬 부분을 의미한다.
"알킬-헤테로아릴"은 헤테로아릴 부분에 결합된 알킬 부분을 의미한다.
"알콕시"는 -O-알킬기를 의미한다. 알콕시기의 예는 -OCH3, -OCH2CH3, -O(CH2)2CH3, -O(CH2) 3CH3, -O(CH2)4CH3, 및 -O(CH2)5CH3를 포함한다;
일부 구체 예에서, 상기 시약은 다음 구조를 갖는 TPH1 억제제이다:
Figure pct00036
또는
Figure pct00037
LP-533401 및 LP-615819는 Liu et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2008, Jan 11 [Epub ahead of print] #132670에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체 내용이 참조문헌으로 본 명세서에 수록된다. LP-615819는 LP-533401의 전구약물(즉, 에틸 에스테르)이다. Liu et al.에 개시된 바와 같이, LP-533401 및 LP-615819 둘 모두가 3-4일 기간 동안 약 30-90 mg/kg의 용량으로 매일 2회 쥐에 투여되었다. 소장(small intestine) 내 세로토닌 수치는 단지 6번의 연속 복용 이후에 현저하게 감소된 반면, 뇌-유래 세로토닌은 변화하지 않았다. 비록 LP-533401이 TPH1만큼 효과적으로 TPH2를 억제하지만, 생체 내에서 뇌혈관 장벽을 횡단하지 않았으며 그 결과 뇌-유래 세로토닌의 감소를 유발하지 않았다. Liu et al.는 LP-533401 및 LP-615819가 화학요법으로 인한 구토 및 과민성 대장 증후군의 치료에 유용할 수 있다는 점을 개시하였다.
LP-533401 및 LP-615819는 뇌-유래 세로토닌과 대조적으로 말초 세로토닌을 선택적으로 감소시킨다. 동물 연구에서, LP-533401은 135 mg/kg, po, qd를 사용하여 위장관(GI tract) 내 세로토닌을 정상 수치의 약 3/2 이하로 감소시켰다. 효과가 용량 반응 곡선을 따라갔다. 쥐에 투여된 용량에서, 뇌 세로토닌 수치는 영향을 받지 않았다. 렉시콘 약학 회사(Lexicon Pharmaceuticals Incorporated)는 특히 설사(diarrhea) 또는 과민성 대장 증후군을 치료하기 위하여 이러한 TPH1 억제제를 개발하였다. LP-533401은 렉시콘 약학 회사에 의해 단계 I 임상시험에서 현재 평가되고 있다. 단일 복용 섭생에서, 250 mg 내지 2,000 mg/일(day)이 경구 투여되었다. LP-533401은 또한 250-1,000 mg/일의 용량으로 다중 복용으로 경구 투여되었다. 한 양상에서, 약물은 14일에 걸쳐서 하루 2회 500 mg 복용 또는 하루 4회 500 mg 복용으로 투여되었다. 간헐적인 이상반응이 모든 복용 수준에서 보고되었다. 이들 TPH1 억제제는 골다공증 및 골다공증-가성신경교종을 포함하는 저골량 질병의 치료 또는 예방을 위하여 본 발명에서 사용될 수 있다.
멀티사이클릭 아미노산 유도체를 포함하여, LP-533401 및 LP-615819에 관계된 다양항 그 밖의 다른 TPH1 억제제가 미국 특허 출원 공개공보 2007/191370, 및 국제 특허 공보 WO 2007/089335를 비롯한 관련 출원에 개시되며, 상기 문헌들은 그 내용 전체가 참조문헌으로 본 명세서에 수록된다. 이들 억제제들 또한 저골량 질병을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체 예에서, 전술한 문단에 개시된 하나 이상의 화합물의 치료를 위한 효과적인 양이 단독으로 또는 골량을 증가시키는 것으로 알려진 또 다른 화합물과 함께 저골량 질병을 갖거나 또는 발명 위험이 있는 대상에 상기 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 투여된다.
TPH1 억제제 투여에 의한 저골밀도 치료법의 효과를 치료 이전 또는 이후의 기간에 골 밀도 변화를 측정함으로써 검사하여 약물 효과를 결정할 수 있다.
본 발명은 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에 있어서 저골량 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 환자에게 세로토닌 수용체 길항제의 치료를 위한 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체 예에서, 세로토닌 수용체 길항제는 HT1B, HT2A 또는 HT2B 수용체 길항제이다. 바람직한 구체 예에서, 세로토닌 수용체 길항제는 HT1B 길항제이다.
세로토닌 수용체 길항제는 조골세포에 존재하는 말초 세로토닌 수용체 HT1B, HT2A 또는 HT2B의 많은 공지된 길항제 중 하나일 수 있다. HT1B, HT2A 또는 HT2B 수용체에 대하여 선택성 있는 길항제가 바람직하다. HT1B, HT2A 또는 HT2B 길항제 투여에 의한 저골밀도 치료법의 효과를 치료 이전 또는 이후의 기간에 골 밀도 변화를 측정함으로써 검사하여 약물 효과를 결정할 수 있다. 저골량 관련 질병은 아래 표 3에 기재된 것과 같은 HT1B 길항제로 치료될 수 있다.
선택성 5-HT1B 길항제 GR 55562 Mlinar 및 Corradetti, Neurosci., 2003, 18: 1559-1571
엘자소난(elzasonan)
AZD1134
AR-A2		 미국 특허 출원 공보 2005/0203130
트라조돈 하이드로클로라이드 (항우울증제) 미국 특허 번호, 7,198,914
고도 선택성 5-HT 1B 길항제
(SB216641)

말단 5-HT1B 수용체에서 선택성인 길항제, N-[3-(2-디메틸아미노)에톡시-4-메톡시페닐]-2'-메틸-4'-(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-(1,1'-바이페닐)-4-카르복사마이드 (SB216641, 0.1-0.8 mg/kg)		 미국 특허 출원 공보 2006/0135415
Rojas-Corrales et al., Eur. J. Pharmacol., 511:21-26
GR 127,935
혼합 HT1B/1D 길항제		 Naunyn Schmiedebergs Arch . Pharmacol., 1997, 355:423-430; Wurch, et al., British J. Pharmacol., 1997, 120:153-159
시아노핀돌올 J. Neurochem ., 2000, 75:2113-2122
-GR 125,743
메티오테핀(Methiothepin)
케탄세린(ketanserin)		 2'-메틸-4-(5-메틸-[1,2,4]옥사디아졸-3-일)-바이페닐-4-카르복시산 [4-메톡시-3-(4-메틸-피페라진-1-일)-페닐]-아마이드 (GR 127,935), 케탄세린 및 메티오테핀, 각각은 rb 5-HT1B 수용체에서 조용한, 경합 길항제로서 행동함

British Journal of Pharmacology (1997) 120, 153 ±159
ICS 205-930(산도즈)는 5-하이드록시트립타민3 수용체에서 선택성 길항제이며 동물 장(Gut) 특이적으로 위장관 운동에 대하여 현저한 영향을 발휘한다. Br J Clin Pharmacol. 1989 September; 28(3): 315-22
핀돌올(pindolol)
베타-

베타-아드레날린수용체 차단제/5-하이드록시트립타민1 A/1B 수용체 길항제		 핀돌올은 또한 비선택성 베타 차단제이며; 위장관(GI tract)으로부터 신속하게 그리고 우수하게 흡수된다.
AR-A000002 - 신규한 선택성 5-HT1B 길항제

선택성 5-HT1B 길항제의 불안완화 및 항우울증 잠재력, AR-A000002 ((R)-N-[5-메틸-8-(4-메틸피페라진-1-일)-1,2,3,4-테트라하이드로-2-나프틸]-4-모폴리노벤즈아마이드). AR-A000002는 생체 내에서 5-HT1B 길항제로서의 기능을 한다.		 Journal of Pharmacology And Experimental Therapeutics Fast Forward

2002.11.25. 최초 공개됨
시아노핀돌올, 5-HT-모둘린 및 메티오테핀 Daws, et al., Neuroscience Letters, 1999, 266:165-168; Daws, et al., J. Neurochem., 2000, 75:2113-2122
GR 55562, 선택성 5-HT1B 길항제
선택성 5-HT1B 수용체 길항제 3-[3-(디메틸아미노)프로필]-4-하이드록시-N-[4-(4-피리딘일)페닐]벤즈아마이드 디하이드로클로라이드
(GR 55562; KB~100nM)		 British Journal of Pharmacology (2003) 138, 71-80
SB224289 Brain Res. 2004 May 8; 1007(1-2): 86-97
SB 216641 Roca-Vinardell et al., Anesthesiology, 2003, 98:741-747
비선택성 5-HT(1B/D) 수용체 길항제 예를 들면 케탄세린, 리탄세린(ritanserin) 및 메티오테핀
일부 구체 예에서, 말초 혈청 세로토닌 수치를 증가시키는 시약은 소규모 유기 분자, 항체, 항체 단편, 단백질, 또는 폴리펩티드이다.
본 발명은 또한 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에 있어서 저골량 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제 둘 모두를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체 예에서, TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제는 단일 약제학적 조성물에서 함께 투여된다. 또 다른 구체 예에서, TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제는 별개의 약제학적 조성물에서 투여된다.
본 명세서에 개시된 방법 중 일부 구체 예에서, 저골량 질병은 골다공증, 골다공증-가성신경교종 증후군(OPPG), 골감소증, 골연화증, 신성골이영양증, 불량 골 형성(faulty bone formation), 불량 골 재흡수(faulty bone resorption), 파제트병, 뼈 골절, 부서진 뼈(broken bone), 또는 골전이 이다, 바람직한 구체 예에서, 저골량 질병은 골다공증이다.
사용되는 치료제의 용량은 본 명세서에서 언급된 바와 같이 많은 요인에 의존한다. 그렇지만, 인간에서는, 예를 들어, 상기 용량은 약 1 mg/일 내지 약 2 g/일; 바람직하게는 약 15 mg/일 내지 약 500 mg/일; 또는 약 20 mg/일 내지 약 250 mg/일; 또는 약 40 mg/일 내지 약 100 mg/일 범위이다. 또 다른 바람직한 복용량은 약 2 mg/일, 약 5 mg/일, 약 10 mg/일, 약 15 mg/일, 약 20 mg/일, 약 25 mg/일, 약 30 mg/일, 약 40 mg/일, 약 50 mg/일, 약 60 mg/일, 약 70 mg/일, 약 80 mg/일, 약 90 mg/일, 약 100 mg/일, 약 125 mg/일, 약 150 mg/일, 약 175 mg/일, 약 200 mg/일, 약 250 mg/일, 약 300 mg/일, 약 350 mg/일, 약 400 mg/일, 약 500 mg/일, 약 600 mg/일, 약 700 mg/일, 약 800 mg/일, 및 약 900 mg/일을 포함한다. 통상적인 실험은 자주 그리고 용이하게 감시되는 혈청 세로토닌 수치에 대한 화합물의 효과를 감시함으로써 각 환자에 대한 적절한 값을 결정할 것이다. 시약은 하루에 1회 또는 여러 번 투여될 수 있다. 혈청 세로토닌 수치가 치료 전 및 치료 동안 감시되어, 혈청 세로토닌 수치를 감소시키거나 또는 혈청 세로토닌 수치를 정상 수치로 만들고 연장된 시간 기간 동안 정상 수치로 유지하기 위하여 투여되는 TPH1 억제제의 적절한 양을 결정할 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 환자의 혈청 세로토닌 수치가 TPH1 억제제 및/또는 HT1B, HT2A 또는 HT2B 수용체 길항제를 사용한 투여 치료 이전의 정상 수치보다 현저하게 증가되었는지(약 25% 이상) 여부를 결정하기 위하여 환자를 시험한다. 투여 빈도는 하루마다 단일 투여에서부터 하루마다 다중 투여까지 변화할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 경구, 정맥내, 및 복강내 투여를 포함하며, 또 다른 투여 형식 또한 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체 예는 골 상실을 방지하거나 또는 정상 골량을 유지 또는 증가시키기 위하여, 장기간의 SSRI 투여로 치료받는 대상에 치료하기 위한 SSRI과 배합된 TPH1 억제제 또는 세로토닌 합성 억제제의 약제학적 제제에 관한 것이다.
일부 구체 예에서, 본 발명의 치료제는 말초 세로토닌에 대하여 선택적으로 작용하거나, 또는 뇌-유래 세로토닌을 증가시키지 않으면서 혈청 세로토닌을 감소시키는 용량으로 투여된다.
또 다른 구체 예에서, TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제는 제제화되고 비스포스포네이트 예들 들면 FOSAMAX®(알렌드로네이트 소듐), FOSAMAX PLUS D™ (알렌드로네이트 소듐/콜레칼시페롤) 또는 그 밖의 다른 골 생성 약물(bone building drug), 비타민 또는 미네랄과 함께 투여되어 골량을 증가시키는 이들의 영향을 강화시킨다.
TPH1 억제제 및 세로토닌 합성 억제제의 치료 효과를 감시하는 것은 간단한데, 왜냐하면 상기 억제제들을 말초 혈청 세로토닌 수치를 감소시키고 시간이 지남에 따라 골량을 증가시키는 기간 동안 소정의 용량으로 투여할 수 있기 때문이다. 혈청 세로토닌 및 골량 둘 모두는 용이하게 특정될 수 있다. 실시예 1은 혈청 세로토닌의 수치를 감시하기 위한 한가지 면역학적 검정의 상세사항을 제공한다. 실시예 3은 사용될 수 있는 혈청 세로토닌에 대한 또 다른 검정을 제공한다. 혈청 세로토닌을 감시하는 것은 단순하며 치료 과정 동안 자주 수행되어 각 환자에 적절한 복용량을 결정할 수 있다. 혈청 세로토닌을 검정하기 위한 당해 업계의 공지된 모든 방법이 사용될 수 있다. 증가된 골량은 골 밀도 및 골 성장 표지를 측정하는 다양한 수단을 이용하여 본 명세서에 개시된 바와 같이 측정되거나 또는 당해 업계에 공지된 또 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 구체 예에서, 저골량 질병은 항-세로토닌 항체 또는 항체 단편을 바람직하게는 정맥내 주사 또는 복강내 주사로서 투여함으로써 치료된다. 이러한 항체는 뇌혈관장벽을 횡단하지 않을 것이며, 세로토닌을 중화시킬 것이며, 이에 따라 세로토닌이 골량을 감소시키는 것을 방지할 것이다. TPH1 또는 세로토닌 수용체(예를 들면, HT1B)를 인지하고 불활성화시키며 그에 따라 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 항체 또는 항체 단편이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
용어 "항체" 또는 "항체들"은 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 또는 잡종 항체, 단일 사슬 Fv 항체 단편, Fab 단편, 및 F(ab')2 단편을 포함한다. 다클론 항체는 특정 항원에 대하여 특이성인 항체 분자의 이종 개체군이며, 반면에 단일클론 항체는 항원 내에 함유된 특정 항원요소(epitope)에 대한 항체의 동종 개체군이다. 단일클론 항체가 본 발명에서 특히 유용하다.
관심 표적(예를 들면, TPH1 또는 HT1B)에 대하여 특이적 결합 친화도를 갖는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다. 이러한 항체 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 디설파이드 다리를 감소시킴으로써 생산될 수 있는 Fab 단편을 포함하며, 여기에 제한되는 것은 아니다. 그 대신에, Fab 발현 라이브러리(expression libraries)가 구성될 수 있다. 예를 들면 Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281를 참조하라. 단일 사슬 Fv 항체 단편은, 아미노산 다리(예를 들면, 15 내지 18개 아미노산)를 통하여 Fv 영역의 중질사슬과 경질 사슬을 결합시켜, 단일 사슬 폴리펩티드를 산출시킴으로써 형성될 수 있다. 관심 표적을 인식하는 단일 사슬 Fv 항체 단편은 미국 특허 번호 4,946,778에 개시된 기술과 같은, 표준 기술에 의해 생성될 수 있다.
일단 생성되면, 항체 또는 이들의 단편은 효소-결합 면역흡수 검정(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 방사성면역학적검정 검정법(radioimmunoassay assay, RIA)을 비롯한 표준 면역학적 검정법에 의해 관심 표적의 인식에 대하여 시험될 수 있다. Short Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Green Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)를 참고하라.
투여하는 항체 또는 항체 단편의 용량은 특히 말초 세로토닌의 수치가 정상 수치에 비하여 얼마나 높은가에 의존한다. 당해 업계에 공지되거나 또는 새롭게 고안된 단일 클론 및 다클론 항-세로토닌 항체가 사용될 수 있으며, 단일 치료법으로서 또는 TPH1 억제제 및/또는 HT1B 길항제와 함께 배합 치료법으로서 투여될 수 있다.
본 명세서에 전체 내용이 참고문헌으로 수록된 미국 가특허 출원 번호 60/976,403(2007.09.28. 출원)이 개시한 바에 의하면, 뇌-유래 세로토닌은 골량을 증가시키고 교감신경도(sympathetic tone)를 감소시킨다. 저골량 질병을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 또 다른 구체 예는 교감신경도를 감소시키는 시약, 예를 들면 베타 차단제를 TPH 1 억제제, 세로토닌 합성 억제제, HT1B, HT2A 또는 HT2B 길항제 및/또는 항-세로토닌 항체와 함께, 단일 제제에서 또는 별개로 투여하는 것에 의한 저골량 치료 및 예방 방법에 관한 것이다. 교감신경도를 감소시키는 모든 화합물의 사용이 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게는 상기 화합물은 베타-2 수용체 길항제인데, 이들 중 많은 것들이 당해 업계에 공지되어 있다. 사용될 수 있는 베타 차단제 중에서 교감신경도를 감소시키고 골량을 증가시키기 위하여, 단독으로 또는 본 명세서에 개시된 또 다른 치료제와 함께 사용될 수 있는 세 가지 베타-2 특이성 차단제가 있는데 다음과 같다: IPS339, ICI118,551, 및 산도즈(Sandoz) L1 32-468(Br. J. Ophthalmol. 1984 April; 68(4): 245-247). 부탁사민(Butaxamine)이 또한 본 발명에서 사용될 수 있는 베타-2 차단제이다. 비-선택성인 베타 차단제는 다음을 포함한다: 메티프라놀올(metipranolol), 나돌(nadol) (베타-2 아드레날린 수용체를 비-선택적으로 차단하는 베타-특이성 교감신경차단제(sympatholytic)); 옥스프레놀올(oxprenolol) (수용성 베타 차단제보다 뇌혈관 장벽을 더욱 용이하게 지나가는 호지성 베타 차단제), 펜부톨올(penbutolol), 핀돌올(pindolol) (뇌에서 세로토닌 5-HT1A 수용체에 작용하여 증가된 시냅스후부 세로토닌 농도를 유발하는 베타 차단제), 및 프로프라놀올(propranolol) (용이하게 뇌혈관 장벽을 횡단하는 것으로 알려져 있음), 티놀올(timolol) 및 소탈올(sotalol). 베타 차단제는 HT2C 수용체 작용제를 비롯하여 뇌-유래 세로토닌을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시키는 시약, TPH2 활성 또는 발현을 증가시키는 시약, 및 BDS의 재흡수를 특이적으로 감소시키는 시약과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 또 다른 구체 예는 개별적으로 또는 배합하여 TPH1 억제제; HT1B, HT2A 또는 HT2B 길항제; 및/또는 항-세로토닌 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 저골량 관련 질병 치료를 위하여, 하나 이상 유형의 TPH1 억제제, HT1B, HT2A 또는 HT2B 길항제, 또는 항-세로토닌 항체가 함께 투여될 수 있으며, 일부 구체 예는 이들 화합물들을 포함하는 대응 약제학적 조성물을 포함한다. 또 다른 구체 예에서, 서로 다른 유형의 시약이 같은 날 또는 여러 날 동안 1회 또는 2회에 걸쳐 별도로 투여되며, 가끔 다양한 각종 시약을 교대로 투여한다.
일부 구체 예는 불안증 또는 우울증을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것인데, 상기 약제학적 조성물은 세로토닌 재흡수 억제제를 섭취한 환자에 골다공증이 발생하는 것을 방지하기 위하여 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약(예를 들면, TPH1 억제제 또는 HT1B 길항제) 및 SSRI 둘 모두를 포함한다. 이러한 조제품은 SSRI가, 골다공증과 같은 저골량 질병을 일으킬 수 있는 말초 세로토닌을 증가시키지 않으면서 불안증을 치료하기 위하여 뇌-유래 세로토닌을 증가시키는 것을 허용한다.
증가된 뇌-유래 세로토닌은 시상하부에서 HT2C 수용체를 통하여 표적 뉴런에 작용함으로써 골량을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 일부 구체 예는 말초 세로토닌을 감소시키고 뇌-유래 세로토닌을 증가시키는 조제약을 사용하는 배합 약물 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, HT2C 작용제는 TPH1 억제제 또는 HT1B 길항제와 배합될 수 있다.
고도 골량 증후군과 같은 비정상적 고골량 관련 질병은, 세로토닌, 세로토닌 재흡수 억제제, TPH1 활성화제, TPH2 억제제, 세로토닌 수용체 작용제, 또는 이들의 혼합물을 투여하여 혈청 세로토닌을 증가시키고, 그 후 이것이 골량을 감소시킴으로써 치료될 수 있다. HT1B 작용제, 또는 또 다른 세로토닌 수용체 작용제가 조골세포 상의 수용체를 활성화시켜 골량을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다. TPH1 억제제, HT1B 작용제, HT2A 작용제 또는 HT2B 작용제는 세로토닌과 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구체 예는 세로토닌을 바람직하게는 경구 투여, 복강내 투여, 또는 정맥내 투여로, 단독으로 또는 TPH1 억제제, HT1B 작용제, HT2A 작용제 또는 HT2B 작용제와 함께 투여하여 바람직하게는 정상 수치로 골량을 감소시킴으로써 고골량 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 구체 예에서, 본 발명의 방법은 골질병의 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 골질병의 치료 필요성이 있는 환자를 확인하는 단계;
(b) 상기 환자에게 혈청 세로토닌 수치를 증가 또는 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 투여하는 단계.
일부 구체 예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 저골량 질병의 치료 필요성이 있는 환자를 확인하는 단계;
(b) 상기 환자에게 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 투여하는 단계.
일부 구체 예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 고골량 질병의 치료 필요성이 있는 환자를 확인하는 단계;
(b) 상기 환자에게 혈청 세로토닌 수치를 증가시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 투여하는 단계.
본 발명은 골질병(예를 들면, 골다공증과 같은 저골량 질병)을 예방 또는 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제(예를 들면, HT1B 길항제)의 용도를 포함한다. 본 발명은 골질병(예를 들면, 골다공증과 같은 저골량 질병)을 예방 또는 치료하기 위한 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제(예를 들면, HT1B 길항제)의 용도를 포함한다.
약제학적 조성물
본 명세서에 개시된 TPH1 억제제, 세로토닌 수용체 길항제, 세로토닌 수용체 작용제, SSRI, 및 베타 차단제와 같은 치료제는 제제화되어 약제학적 조성물이 될 수 있다. 상기 치료제는 약제학적으로 수용가능한 산의 염 형태 또는 염기(base) 형태로 약제학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 치료제는 수화물(hydrate) 및 용매화물(solvate)을 비롯하여, 무정형 또는 결정형으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 TPH1 억제제 또는 세로토닌 수용체 길항제의 치료를 위한 효과적인 양을 포함한다.
본 명세서에 개시된 모든 TPH1 억제제, 세로토닌 수용체 길항제, 또는 세로토닌 수용체 작용제의 약제학적으로 수용가능한 유도체가 본 발명의 범위에 포함된다. TPH1 억제제, 세로토닌 수용체 길항제, 또는 세로토닌 수용체 작용제의 "약제학적으로 수용가능한 유도체(Pharmaceutically acceptable derivative)"는, 투여자에게 투여될 때, 본 명세서에 개시된 TPH1 억제제, 세로토닌 수용체 길항제, 또는 세로토닌 수용체 작용제가 혈청 세로토닌 발현을 감소 또는 증가시키는 것과 동일한 또는 유사한 생물학적 활성을 나타내는 본 명세서에 개시된 TPH1 억제제, 세로토닌 수용체 길항제, 또는 세로토닌 수용체 작용제의 모든 무-독성 유도체를 의미한다.
비정상적 고골량 또는 저골량과 관련된 골질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 치료제의 약제학적으로 수용가능한 염은 약제학적으로 수용가능한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 염을 포함한다. 적절한 산 염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 사이트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포메이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트 염을 포함한다. 옥살산과 같은 그 자체로 약제학적으로 수용가능하지 않는 또 다른 산이 본 발명의 화합물 및 이들의 약제학적으로 수용가능한 부가 염을 얻기 위하여 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속(예를 들면, 소듐 및 포타슘), 알칼리 토금속(예를 들면, 마그네슘), 암모늄 및 N+(C1 -4 알킬)4 염을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명에 개시된 치료제의 모든 염기성 질소-함유 기의 사차화(quaternization)를 고려한다. 수용성 또는 지용성 또는 분산성 생성물이 이러한 사차화에 의하여 수득될 수 있다.
본 발명의 치료제는 또한 상기 치료제의 모든 입체화학적 형태(즉, 각 비대칭 중심에 대한 R 또는 S 배열)를 포함하는 것으로 간주된다. 그러므로, 상기 치료제의 단일 거울상이성질체, 라세믹 혼합물, 및 부분입체이성질체가 본 발명의 범위에 포함된다. 또한 상기 치료제의 입체 이성질체(steric isomer) 및 위치 이성질체(positional isomer)가 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 치료제는 또한 하나 또는 그 이상의 동위원소 풍부 원자의 존재에 있어서만 차이가 나는 화합물들을 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들면, 수소가 중수소 또는 삼중수소에 의해 대체되거나 또는 탄소 분자가 13C- 또는 14C-풍부 탄소에 의해 대체되는 치료제가 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 구체 예에서, 본 발명의 치료제는 약제학적으로 수용가능한 운반체(carrier), 보조제(adjuvant), 또는 담체(vehicle)를 포함하는 약제학적 조성물로 투여된다. 용어 "약제학적으로 수용가능한 운반체, 보조제, 또는 담체"는 함께 제제화되는 화합물의 약학적 활성을 파괴하거나 또는 현저하게 감소시키지 않는 무-독성 운반체, 보조제, 또는 담체를 의미한다. 본 발명이 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 수용가능한 운반체, 보조제 또는 담체는 모든 표준 약제학적으로 수용된 액상 운반체, 예를 들면 포스페이트-완충 살린 용액, 물, 뿐만 아니라 에멀젼, 예를 들면 오일/물 에멀젼 또는 트리글리세리드 에멀젼을 포함한다. 화합물의 정맥내 투여 및 복강내 투여에 유용한 수용가능한 트리글리세리드 에멀젼의 예는 상업적으로 INTRALIPID RTM®로 알려진 트리글리세리드 에멀젼이다. 고형 운반체(solid carrier)는 전분, 우유, 설탕, 특정 유형의 점토, 스테아린산, 탈크, 검(gum), 글리콜, 또는 또 다른 공지된 부형제와 같은 부형제(excipient)를 포함할 수 있다. 운반체(carrier)는 방향 첨가제 또는 색 첨가제 또는 또 다른 구성성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 경구 투여된다. 그렇지만, 약제학적 조성물은 흡입 분무, 국소 투여, 직장 투여, 비강 투여, 구강 투여(buccally), 질 투여(vaginally) 또는 이식 저장소(implanted reservoir)를 통하여 비경구적으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 경구 투여, 복강내 투여, 또는 정맥내 투여된다. 약제학적 조성물의 무균 주사가능 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제(wetting agent) 및 현탁화제를 사용하여 당 업계에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 무균 주사가능 조제품(sterile injectable preparation)은 또한 무독성의 비경구적으로 수용가능한 희석제 또는 용매에 용해된 무균 주사가능 용액 또는 현탁액, 예를 들면 1,3-부탄디올에 용해된 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 수용가능한 담체 및 용매는 물, 링거액(Ringer's solution) 및 염화소듐 등장액일 수 있다. 또한, 무균의 고정유(fixed oil)가 용매 또는 현탁 매질로서 전통적으로 사용된다.
이러한 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함하는 임의 완하성 지방유(bland fixed oil)가 사용될 수 있다. 특히 폴리옥시에틸화된 상태로서 올레산과 같은 지방산 및 이들의 글리세리드 유도체가 올리브유 또는 카스터유와 같은 천연의 약제학적으로-수용가능한 오일처럼, 주사제 제조에 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한 에멀젼 및 현탁액을 비롯하여 약제학적으로 수용가능한 복용 형태의 제제화에 통상적으로 사용되는 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 이와 유사한 분산제와 같은, 긴-사슬 알코올 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다. 트윈스(Tweens), 스판(Spans) 및 약제학적으로 수용가능한 고형, 액상, 또는 또 다른 복용 형태의 제조에 흔히 사용되는 또 다른 에멀젼화제 또는 생체이용률 증강제와 같은 그 밖의 다른 통상적으로 사용되는 계면활성제가 또한 제제화 목적을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐 및 테블릿과 같은 고형 형태를 포함하여 임의 경구 수용가능한 복용 형태로 경구 투여될 수 있으며, 여기에 제한되는 것은 아니다. 경구 사용을 위한 태블릿의 경우에 있어서, 흔히 사용되는 운반체는 마이크로결정형 셀룰로오스, 락토스 및 옥수수전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 수성 현탁액이 경구 사용을 위하여 요구될 때, 활성 성분이 에멀젼화제 및 현탁화제와 배합될 수 있다. 필요하다면, 특정 감미료, 착향료 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 비강 분문 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 약제학 제제 분야에 공지된 기술에 따라 제조되며, 벤질 알코올 또는 그 밖의 다른 적절한 보존제, 생체이용률을 증강시키기 위한 흡수 프로모터, 불화탄소, 및/또는 그 밖의 다른 종래의 용해제 또는 분산제를 포함하는, 살린에 용해된 용액으로서 제조될 수 있다.
국소 투여가 요구되는 경우, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의 방법을 사용하여 달성될 수 있으며, 여기에는 약제학적 조성물을 크림, 연고, 또는 경피투여 패치(transdermal patch)에 혼입시키는 것이 포함되며 여기에 제한되는 것은 아니다.
약제학적 조성물이 HT1B 길항제 또는 TPH1 억제제처럼 말초적으로 작용하는 시약 및 HT2C 작용제처럼 중추적으로 작용하는 시약 둘 모두를 함유하는 경우, 상기 조성물은 제제화되어 중추적으로 작용하는 치료제의 중추 신경계로의 전달을 증가시킬 수 있다. 치료 능력을 갖는 화합물이 뇌혈관장벽을 용이하게 횡단하지 않는다면, 상기 화합물은 뇌혈관장벽을 통하는 투과성을 개선하기 위하여 다양한 측면 그룹(side group)을 부착하는 당해 분야에 공지된 약물 화학 분야의 다양한 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
세로토닌 수용체 길항제(예를 들면, HT1B 수용체 길항제)는 골에 의한 흡수를 증가시키기 위하여 당해 분야에 공지된 약물 화학을 이용하여 유도체화되거나 또는 또 다르게 설계될 수 있다.
본 발명의 TPH1 억제제 및 HT1B 길항제는 하나 또는 그 이상의 적절한 기(group)와 함께 가역적 연결을 형성하여 유도체화됨으로써 "전구-약물", 즉 호스트에 의해 흡수된 후 모 화합물(parent compound)로 전화되는 화학적 유도체를 산출할 수 있다. 모 화합물의 방출은 화학적 가수분해 또는 효소 공격에 의해 이루어질 수 있다. 유도체 또는 전구-약물은 표적 기관에 대한 증강된 투과성을 가질 수 있다. TPH1 억제제의 경우, 표적 기관은 십이지장이며 여기서 말초 세로토닌의 95%가 생성된다. HT1B 길항제는 조골세포 표적에 도달하기 위한 골에 대한 증강된 침투성을 갖기 위하여 제제화될 수 있다. 만약 전구-약물 또는 이들의 유도체가 살아있는 유기체에 투여된 이후, 유도체화되지 않은 기저 화합물의 투여와 비교하여, 더 많은 양의 화합물이 표적 기관에 도달하여 더 높은 효과 시약의 수치를 산출한다면, 전구약물은 본 발명에 의한 증강된 투과성을 갖는 것이다.
단일 복용 형태의 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 운반체 물질과 배합될 수 있는 본 발명에 따르는 치료제의 양은 치료되는 호스트 및 특정 투여 방법에 따라 변화한다. 임의 특정 환자에 대한 구체적인 복용량 및 치료 섭생은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 몸무게, 일반적 건강, 성별, 식단, 투여 시간, 배설 속도, 약물 배합, 및 치료 의사의 판단뿐만 아니라 치료되는 특정 질병의 심각성을 비롯하여, 다양한 요인에 의존할 것이라는 것을 이해하여야 한다. 이러한 다양성에도, 적절한 복용량 또는 치료 섭생을 선택하기 위하여 이러한 요인을 밝히는 것은 단지 반복적인 실험을 요구할 것이다.
비정상적 고골량 또는 비정상적 저골량과 관련된 골질병을 치료하기 위하여 일반적으로 투여되는 추가 치료제가 또한 본 발명의 약제학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 특정 질병 또는 질환을 치료하기 위하여 일반적으로 투여되는 추가 치료제는 "치료되는 질병, 또는 질환에 적절"하다고 알려져 있다. 골다공증에 대한 적절한 시약의 예는 FOSAMAX®, 또 다른 비스포스포네이트, FORTEO®(파라티로이트 호르몬) 및 베타-차단제를 포함한다. 이러한 추가 시약은 다중 복용 섭생의 일부로서, 본 발명의 치료제와 별도로 투여될 수 있다. 그 대신에, 이러한 시약은 단일 약제학적 조성물 내 본 발명의 치료제와 함께 혼합된 단일 복용 형태의 일부분일 수 있다. 다중 복용 섭생의 일부로서 투여된다면, 상기 두 활성 시약은 동시에, 순차적으로 또는 서로 일정 기간 간격으로 투여될 수 있다. 본 발명의 치료제 및 단일 복용 형태를 생성하기 위하여 운반체 물질과 배합될 수 있는 추가 치료제 둘 모두의 양(전술한 추가 치료제를 포함하는 조성물 내에서)은 치료될 호스트 및 특정 투여 방법뿐만 아니라 본 발명의 치료제 및 추가 치료제의 특성에 의존하여 변화할 것이다.
본 명세서에서 개시된 TPH1 억제제 및 그 밖의 다른 치료제(예를 들면, HT1B 길항제, HT2C 작용제)는 단백질 또는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이들의 모든 생물학적 활성 단편, 항원요소, 변이물, 유도체 또는 변형물일 수 있다. 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편은 전체 단백질 또는 폴리펩티드의 활성과 유사한(그러나 동일한 필요는 없음) 활성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드의 단편들이다. 단편의 생물학적 활성은 개선된 바람직한 활성, 또는 감소된 바람직하지 않은 활성을 포함한다. 변형은 (i) 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환, 여기서 치환된 아미노산 잔기는 유전 코드에 의해 인코딩된 것 또는 인코딩되지 않은 것일 수 있음, 또는 (ii) 치환기를 갖는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드와 폴리펩티드의 안정성 및/또는 용해도를 증가시키는 화합물(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 또 다른 화합물, 또는 위(경구 투여 경우) 또는 내피세포(endothelium)(정맥내 투여 경우)를 통한 운반을 촉진하는 또 다른 분자와의 융합, 및 (iv) 폴리펩티드와 IgG Fc 펩티드와 같은 추가 아미노산, 또는 선도 또는 보조 서열, 또는 서열 촉진 정제와의 융합을 포함한다. 이러한 변형물 폴리펩티드는 이들이 치료 효과를 보유한다면 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 여겨진다.
"아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 일부인 아미노산을 의미한다. 본 명세서에서 개시되는 아미노산 잔기는 바람직하게는 L 이성질체 형태이다. 그렇지만, 원하는 기능 특성이 폴리펩티드에 의해 보유되는 한, D 이성질체 형태의 잔기가 임의 L-아미노산 잔기에 대하여 치환될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 자유 아미노기를 일컫는다. COOH는 폴리펩티드의 카르복실 말단에 존재하는 자유 카르복실기를 일컫는다. "아미노산 잔기"는 천연 단백질에서 통상적으로 발견되는 20개 아미노산, 뿐만 아니라 개질되고 흔치 않는 아미노산, 예를 들면 37 C.F.R. 섹션(Sections) 1.821-1.822에서 언급된 것들을 포함하는 것으로 광범위하게 정의되며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에서 제시되는 한 그 전체 내용이 참고문헌으로 본 명세서에 수록된다. 폴리펩티드 또는 단백질에 있어서, 아미노산의 적절한 보전적 치환은 당해 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며 일반적으로 산출되는 분자의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 수행될 수 있다. 당해 업계의 통상의 지식을 가진 자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비-본질적 영역에서의 단일 아미노산의 치환이 생물학적 활성을 본질적으로 변화시키지 않는다는 것을 인식하고 있다(예를 들면, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224를 참조하라).
보존적 치환의 예는 소수성 아미노산 Ala, Val, Leu, 및 Ile 사이의 상호 대체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교체; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 상호교환; 아마이드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환; 염기성 잔기 Lys, His 및 Arg의 상호교환; 방향족 잔기 Phe, Trp 및 Tyr 사이의 대체; 극성 잔기 Gln 및 Asn의 상호교환; 및 소규모 잔기 Ala, Ser, Thr, Met, 및 Gly의 상호교환이다.
N-말단 아미노기의 아실화는 하이드로오로트산(hydroorotic acid) 또는 그 유사체와 같은 친수성 화합물을 사용하거나, 또는 메틸이소시아네이트 또는 이소프로필이소시아네이트와 같은 적절한 이소시아네이트와의 반응에 의해 달성되어, N-말단에서의 우레아 부분(moiety)을 생성한다. 또 다른 시약이 또한 N-말단 연결되어 당해 업계에 공지된 변형물의 작용 기간을 증가시킬 것이다.
환원성 아미노화는 암모니아가 알데히드 또는 케톤에 의해 축합되어 이민을 형성하고 이것은 그 후 아민으로 환원되는 과정을 일컫는다. 하나 또는 그 이상의 아미노기를 함유하는 치료제에 대하여, 환원성 아미노화는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)에 대한 짝지움(conjugation)을 위한 잠재적인 유용한 방법이다. 약물 분자에 대한 PEG의 공유 결합은 변화된 생체이용률, 약물동태학(pharmacokinetics), 면역 특성, 및 생물학적 활성을 갖는 수용성 짝화합물(conjugate)을 산출한다. 하나 또는 그 이상의 아미노기를 함유하는 약물에 대하여, 환원성 아미노화는 PEG에 대한 짝지움을 위한 잠재적인 유용한 방법이다(Bentley et al., J. Pharm. Sci. 1998 Nov; 87(11):1446-1449).
또한 공지된 바와 같이, 폴리펩티드는 항상 전체적으로 선형은 아니다. 예를 들면, 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과에 따라 측쇄화될 수 있으며, 이들은 천연 프로세스 이벤트 및 천연적으로는 발생하지 않는 인위 조작에 의해 발생하는 이벤트를 비롯하여, 일반적으로 후-번역 이벤트(post-translational event)의 결과로서, 가지를 갖거나 또는 갖지 않는 고리일 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 고리, 측쇄 및 측쇄고리 폴리펩티드는 비-번역 천연 과정에 의해서 그리고 합성적 방법에 의해서 합성될 수 있다.
개질(Modification)은 펩티드 뼈대(backbone), 아미노산 곁-사슬 및 아미노 또는 카르복실 말단을 비롯하여, 본 발명에서의 사용을 위한 단백질 또는 폴리펩티드 내 임의 영역에서 일어날 수 있다. 공유성 개질에 의한 폴리펩티드 내 아미노기 또는 카르복실기 또는 둘 모두의 봉쇄는 천연적으로 발생하는 폴리펩티드 및 합성 폴리펩티드 내에서 흔하다. 예를 들면, 단백질분해 가공과정(proteolytic processing)에 앞서서, E. coli에서 만들어진 폴리펩티드의 아미노-말단 잔기는 거의 변함없이 N-포밀메티오닌일 것이다.
개질은 단백질이 어떻게 만들어지는지에 대한 기능이다. 예를 들면 본 발명에 사용된 재조합 폴리펩티드에 대하여, 개질은 숙주 세포 번역후 개질 능력 및 폴리펩티드 아미노산 서열에서의 개질 신호전달에 의해 결정될 것이다. 따라서, 글리코실화가 바람직한 경우, 폴리펩티드는 일반적으로 진핵세포(eukaryotic cell)인 글리코실화 호스트에서 발현되어야 한다. 곤충 세포(Insect cell)는 종종 포유류 세포와 동일한 번역후 글리코실화를 수행하며, 이러한 이유 때문에, 글리코실화의 선천적 패턴을 갖는 포유류 단백질을 효과적으로 발현시키기 위하여 곤충 세포 발현 시스템이 개발되었다. 따라서, 본 발명에서의 곤충 시스템의 사용이 고려된다. 유사한 고려사항이 글리코실화 이외의 또 다른 개질에 대하여 적용된다. 동일한 유형의 개질이 주어진 폴리펩티드의 여러 장소에서 동일한 정도 또는 변화하는 정도로 존재할 수 있다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 한 가지 유형 이상의 개질을 함유할 수 있다.
다음 표는 본 발명에서 사용될 수 있는 단백질 및 폴리펩티드의 몇몇 공지된 개질을 나타낸다.
단백질 개질 설명
아세틸화 N-말단 또는 ε-리신의 아세틸화. 아세틸기를 단백질에 도입시킴, 특히 활성 수소 원자에 대한 아세틸기의 치환.

하이드록실기의 수소원자를 아세틸기(CH3CO)로 대체하는 것을 포함하는 반응은 특정 에스테르, 아세테이트를 산출한다.
무수아세트산이 아세틸화제로서 흔히 사용되는데, 이는 자유 하이드록실기와 반응한다.

아실화는 또 다른 작용기의 첨가를 촉진할 수 있다. 흔한 반응은 예를 들면 바이오틴 부속물을 갖는 보존된 리신 잔기의 아실화이다.
ADP-리보실화 아르기닌-특이성 반응을 통하여 단백질 또는 그 밖의 다른 화합물을 공유결합적으로 연결시킴.
알킬화 알킬화는 한 분자로부터 다른 분자로의 알킬기의 이동이다. 알킬기는 알킬 카르보양이온, 자유 라디칼 또는 카르보음이온(또는 이들의 등가물)로서 이동될 수 있다. 알킬화는 알킬 친전자체, 알킬 친핵체, 또는 가끔 알킬 라디칼 또는 카르빈 받개와 같은 특정 작용기를 사용하여 달성된다. 흔한 예는 (일반적으로 리신 또는 아르기닌 잔기에서의) 메틸화이다.
아미드화 N-말단에서의 환원성 아미드화. 아미드화 방법은 미국 특허 번호. 4,489,159에 개시된다.
카르바밀화 카르바모일기를 단백질 또는 폴리펩티드에 첨가함.
카르복실화 카르복실화는 전형적으로 단백질의 글루타메이트 잔기에서 일어난다. 카르복실화는 카르복실라제 효소에 의해 촉진될 수 있다(비타민 K-보조인자 존재 하에서).
시트룰린화 시트룰린화는 시트룰린 아미노산을 단백질의 아르기닌 잔기에 첨가하는 것을 포함하며, 이는 펩티딜 아르기닌 데아미나제 효소(PAD)에 의해 촉진된다. 이는 일반적으로 양으로 하전된 아르기닌을 중성 시트룰린 잔기로 전환시키며, 이는 단백질의 소수성에 영향을 미칠 수 있다(그리고 풀림을 유발할 수 있다).
아민과 아스파르테이트 또는 글루타메이트와의 축합 이러한 반응은 예를 들면 펩티드를 또 다른 단백질에 부착하거나 또는 단백질 또는 폴리펩티드에 라벨을 부착하기 위하여 사용될 수 있다.
플라빈의 공유성 부착 플라빈 모노뉴글레오티드(FAD)는 세린 및/또는 트레오닌 잔기에 공유적으로 부착될 수 있다. 예를 들면 광-활성 태그로서 사용될 수 있다.
힘 부분(heme moiety)의 공유성 부착 힘 부분(heme moiety)은 포피린으로 불리는 거대 헤테로사이클 유기 고리의 중심에 함유된 철 원자로 구성된 보결기이다. 힘 부분(heme moiety)은 예를 들면 펩티드에 대한 대그로서 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 부착 펩티드를 더욱 유도체화하기 위한 태그 또는 염기로서 사용될 수 있다.
가교-결합 가교-결합은 두 단백질을 공유적으로 연결시키는 방법이다. 가교-결합제는 단백질 또는 또 다른 분자 상의 특정 작용기(1차 아민, 설프하이드릴, 등)에 대하여 반응성인 말단을 함유한다. 몇 가지 화학기가 단백질 및 펩티드 내에서 반응의 표적일 수 있다. 예를 들면, 아민에 대한 에틸렌 글리콜 비스[숙신이미딜숙시네이트, 비스[2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]설폰, 및 비스[설포숙신이미딜] 서베레이트 결합 아민.
사이클화 예를 들면, 예를 들면 아미노펩티다제에 저항성인 최적화된 전달 형태를 생성하기 위한 아미노산의 사이클화(예를 들면, 글루탐산의 사이클화된 형태인, 피로글루타메이트의 형성).
디설파이드 결합 형성 단백질 내 디설파이드 결합은 특히 시스테인 잔기 사이의 티올-디설파이드 상호교환에 의해 형성된다(예를 들면, 시스테인의 형성).
디메틸화 예를 들면, 미국 특허 번호 4,250,088 (메틸화 공정)를 참조하라.
포밀화 포밀기를 예를 들면 단백질의 N-말단에 첨가하는 것. 예를 들면, 미국 특허 번호 4,059,589, 4,801,742, 및 6,350,902를 참조하라.
글리코실화 글리코실화는 당(또는 다당)을 세린 및 트레오닌 곁 사슬의 하이드록시 산소 원자에 첨가하기 위하여 사용될 수 있다(이는 또한 O-연결된 글리코실화로 알려져 있다). 글리코실화는 또한 예를 들면 올리고당 이전효소(transferase)를 통하여 당(또는 다당)을 아스파라긴 곁 사슬의 아마이드 질소에 첨가하기 위하여 사용될 수 있다(이는 또한 N-연결된 글리코실화로 알려져 있다).
GPI 앵커(anchor) 형성 글리코실포스파티딜이노시톨을 단백질의 C-말단에 첨가하는 것. GPI 앵커 형성은 소수성 포스파티딜이노시톨기 - 카르보하이드레이트 함유 링커(예를 들면, 포스포릴 에탄올아민 잔기에 연결된 글루코사민 및 만노오스)를 통하여 연결됨 - 를 단백질의 C-말단 아미노산에 첨가하는 것을 포함한다.
하이드록실화 하나 이상의 하이드록실기(-OH)를 단백질(또는 폴리펩티드)에 도입하는 화학 과정. 하이드록실화 반응은 전형적으로 하이드록실라제에 의해 촉진된다. 프롤린이 단백질에서 하이드록실화되는 주된 잔기이며, 이는 Cγ 원자에서 일어나며, 하이드록시프롤린(Hyp)을 형성한다. 일부 경우에서, 프롤린은 Cβ 원자에서 하이드록실화될 수 있다. 리신이 또한 그의 Cδ 원자에서 하이드록실화되어, 하이드록시리신(Hyl)을 형성한다. 이러한 세 가지 반응은 각각 프롤일 4-하이드록실라제, 프롤일 3-하이드록실라제 및 리실 5-하이드록실라제로 알려진 거대 다중-서브유닛 효소에 의해 촉진된다. 이러한 반응은 산화를 실행하기 위하여 철(뿐만 아니라 분자 산소 및 α-케토글루타레이트)을 요구하며, 철을 그의 환원된 상태로 되돌리기 위하여 아스코르브산을 사용한다.
요오드화 단백질 또는 폴리펩티드를 요오드화할 수 있는 효소를 개시하고 있는 예를 들면, 미국 특허 번호 6,303,326를 참조하라. 미국 특허 번호 4,448,764는 예를 들면 단백질을 요오드화하기 위하여 사용되는 시약을 개시한다.
ISG 결합(ISGylation) 예를 들면 면역 반응(immune response)을 조절하기 위하여 펩티드를 ISG15(Interferon-Stimulated Gene 15) 단백질에 공유적으로 연결하는 것.
메틸화 포름알데히드 및 소듐 시아노보로하이드라이드에 의한 단백질 아미노산의 환원성 메틸화는 최대 25% 수득률의 N-시아노메틸(-CH2CN) 생성물을 제공하는 것으로 알려져 있다. 자유 시아나이드 이온과 착물을 형성하는 Ni2 +와 같은 금속이온의 첨가는 부산물의 형성을 억제함으로써 환원성 메틸화 수득률을 개선한다. 시아나이드 이온이 시아노보로하이드라이드를 대체할 때 우수한 수득률로 생성되는 N-시아노메틸기 자체는 단백질 내 아미노기의 가역적 개질제로서 어느 정도의 가치를 가질 수 있다. 메틸화는 단백질의 아르기닌 및 리신 잔기, 뿐만 아니라 그 N- 및 C-말단에서 일어날 수 있다.
미리스토일화 미리스토일화는 아마이드 결합을 통하여 미리스토일기(미리스트산의 유도체)가 N-말단 글리신 잔기의 알파-아미노기에 부착하는 것을 포함한다. 이러한 첨가는 N-미리스토일 이전효소에 의해 촉진된다.
산화 -시스테인의 산화.
-N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기의 산화(후속하여 하이드라진 또는 아미노옥시 축합).
-글리코실화의 산화(후속하여 하이드라진 또는 아미노옥시 축합).
팔미토일화 팔미토일화는 지방산, 예를 들면 팔미트산이 단백질의 시스테인 잔기에 부착하는 것이다. 팔미토일화는 단백질의 소수성을 증가시킨다.
(폴리)글루타밀화 폴리글루타밀화는 단백질의 글루타메이트 잔기에서 일어난다. 구체적으로, 글루타메이트의 감마-카르복시기는 폴리글루타메이트 사슬까지 연장될 수도 있는 알파-카르복시기를 갖는 자유 글루타메이트의 아미노기와 펩티드-유사 결합을 형성할 것이다. 글루타밀화 반응은 글루타밀라제 효소에 의해 촉진된다(또는 데글루타밀라제 효소에 의해 제거된다). 폴리글루타밀화는 최대 약 6 개 글루타메이트 잔기를 첨가하기 위하여 단백질의 C-말단에서 수행되었다.
포스포판테타닐화
(Phosphopantetheinylation)		 4'-포스포판테타닐기의 첨가.
포스포릴화 비-수성 무극성 유기 용매의 존재하에 단백질 또는 펩티드를 인산과 접촉시키는 단계 및 산출된 용액을 탈수제와 접촉시키는 단계에 의한 단백질 또는 펩티드의 포스포릴화 공정이 예를 들면, 미국 특허 번호 4,534,894에 개시된다. 전형적으로, 포스포릴화는 단백질의 세린, 트레오닌, 및 티로신 잔기에서 일어난다.
프레닐화 프레닐화(또는 이소프레닐화 또는 리피드화(lipidation))는 단백질에 대한 소수성 분자의 첨가이다. 단백질 프레닐화는 파르네실(farnesyl)(세 개의 이소프렌 유닛의 선형 그룹) 또는 게라닐-게라닐 부분 중 어느 하나가 표적 단백질 또는 폴리펩티드의 C-말단 시스테인으로 이동하는 것을 포함한다.
단백질분해 가공과정(proteolytic processing) 예를 들면, 펩티드 결합에서 단백질의 절단 과정.
셀레노일화 셀레노포스페이트와 같은 셀레늄 주개를 사용하여, 펩티드 내 황 원자를 셀레늄과 상호교환하는 것.
설파화(Sulfation) 하이드록실 부분, 특히 3차 아민을 설파화하는 공정이 예를 들면, 미국 특허 번호 6,452,035에 개시되어 있다. 비-수성 무극성 유기 용매 존재하에 단백질 또는 폴리펩티드를 황산과 접촉시키는 단계 및 산출된 용액을 탈수제와 접촉시키는 단계에 의한 단백질 또는 폴리펩티드의 설파화 공정이 개시된다.
SUMO결합(SUMOylation) 예를 들면 펩티드를 안정화시키기 위하여, 단백질 또는 폴리펩티드를 SUMO (small ubiquitin-related modifier, 소규모 유비퀴틴-관련 개질제) 단백질에 공유결합시키는 것.
트란스글루타민화
(Transglutamination)		 글루타민 잔기의 다리를 통하여 또 다른 단백질(들) 또는 화학기(예를 들면, PEG)를 공유결합시키는 것.
아미노산의 tRNA-매개된 첨가(예를 들면, 아르기닐화) 예를 들면, 아미노산 유사체의 펩티드로의 위치-특이성 개질(삽입).
유비퀴틴화 소규모 펩티드 유비퀴틴은 예를 들면 단백질의 리신 잔기에 공유결합된다. 유비퀴틴-프로테아솜 시스템은 이러한 반응을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공보 2007/0059731를 참조하라.
본 발명의 치료제 확인하기
TPH1의 억제제는 당해 업계에 공지된 임의 방법에 의해 확인될 수 있다. 특히, TPH1의 억제제는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 확인될 수 있다:
(a) TPH1의 공급원을 제공하는 단계;
(b) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 TPH1의 공급원을 L-트립토판에 노출시키는 단계;
(c) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 TPH1의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양을 측정하는 단계;
(d) 후보 화합물의 존재하에서 상기 TPH1의 공급원을 L-트립토판에 노출시키는 단계;
(e) 후보 화합물의 존재하에서 상기 TPH1의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양을 측정하는 단계;
(f) 여기서, 후보 화합물의 존재하에서 상기 TPH1의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양이 후보 화합물의 부존재하에서 상기 TPH1의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양 이하인 경우, 상기 후보 화합물은 TPH1 억제제이다.
일부 구체 예에서, 전술한 방법은 저골량 질병의 치료가 필요한 환자에게 단계 (f)에서 확인된 TPH1 억제제를 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
후보 화합물의 집합체로부터 치료제를 확인하는 본 명세서에 개시된 방법의 목적을 위한 "이하"는 당해 업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해 상기 방법에서 제시된 정상 변화(normal variation)에 기여하지 않는 양을 의미한다. 바람직하게는, "이하"는 후보 화합물의 부존재에서 관찰된 양보다 최소 약 10%, 최소 약 20%, 최소 약 50%, 최소 약 75%, 또는 최소 약 95% 이하이다.
일부 구체 예에서, TPH1의 공급원은 바람직하게는 인간의 유리된 TPH1 효소 이다. 유리된 TPH1은 예를 들면, 짝지은 생체 외 전사/번역 시스템에서 TPH1의 생체 외 발현에 의해 생성될 수 있다. 그 대신에, TPH1의 공급원은 TPH1을 발현하는 세포로부터 유래된 부분적으로 또는 고도로 정제된 조제품일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, TPH1의 공급원은 바람직하게는 인간의 TPH1을 발현하는 전세포(whole cell)이다. 일부 구체 예에서, 전세포는 TPH1을 포함하는 발현 벡터(expression vector)에 의해 핵산삽입(transfect)되고 그에 따라 상기 세포는 바람직하게는 인간의 재조합 TPH1을 발현한다.
인간 TPH1의 mRNA 및 아미노산 서열은 접근번호 X52836로 유전자은행(GenBank)에서 찾을 수 있다. 게놈 서열은 AF057280에서 찾을 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 세포 내, 또는 생체 외에서 재조합적으로 TPH1을 발현시키기 위한 적절한 발현 벡터를 구성하기 위한 당해 기술분야에서 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
TPH2의 활성제는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 확인될 수 있다:
(a) TPH2의 공급원을 제공하는 단계;
(b) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 TPH2의 공급원을 L-트립토판에 노출시키는 단계;
(c) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 TPH2의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양을 측정하는 단계;
(d) 후보 화합물의 존재하에서 상기 TPH2의 공급원을 L-트립토판에 노출시키는 단계;
(e) 후보 화합물의 존재하에서 상기 TPH2의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양을 측정하는 단계;
(f) 여기서, 후보 화합물의 존재하에서 상기 TPH2의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양이 후보 화합물의 부존재하에서 상기 TPH2의 공급원에 의해 생성된 5-하이드록시트립토판의 양 이상인 경우, 상기 후보 화합물은 TPH2 활성제이다.
후보 화합물의 집합체로부터 치료제를 확인하는 본 명세서에 개시된 방법의 목적을 위한 "이상"은 당해 업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해 상기 방법에서 제시된 정상 변화(normal variation)에 기여하지 않는 양을 의미한다. 바람직하게는, "이상"은 후보 화합물의 부존재에서 관찰된 양보다 최소 약 50%, 최소 약 75%, 최소 약 100%, 최소 약 250%, 또는 최소 약 500% 이상이다.
일부 구체 예에서, 전술한 방법은 저골량 질병의 치료가 필요한 환자에게 단계 (f)에서 확인된 TPH2 활성제를 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 구체 예에서, TPH2의 공급원은 바람직하게는 인간의 유리된 TPH2 효소이다. 유리된 TPH2는 예를 들면, 짝지은 생체 외 전사/번역 시스템에서 TPH1의 생체 외 발현에 의해 생성될 수 있다. 그 대신에, TPH2의 공급원은 TPH2를 발현하는 세포로부터 유래된 부분적으로 또는 고도로 정제된 조제품일 수 있다. 또 다른 구체 예에서, TPH2의 공급원은 바람직하게는 인간의 TPH2를 발현하는 전세포이다. 일부 구체 예에서, 전세포는 TPH2를 포함하는 발현 벡터에 의해 핵산삽입되고 그에 따라 상기 세포는 바람직하게는 인간의 재조합 TPH2를 발현한다.
인간 TPH2의 mRNA 및 아미노산 서열은 접근번호 AY098914로 유전자은행(GenBank)에서 찾을 수 있다. 게놈 서열은 AC090109에서 찾을 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 세포 내, 또는 생체 외에서 재조합적으로 TPH2를 발현시키기 위한 적절한 발현 벡터를 구성하기 위한 당해 기술분야에서 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
세로토닌 수용체의 길항제는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 확인될 수 있다:
(a) 세로토닌 수용체를 발현하는 세포를 제공하는 단계;
(b) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 세로토닌 수용체를 발현하는 세포를 세로토닌 또는 세로토닌 유사체에 노출시키는 단계;
(c) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 세로토닌 수용체의 활성을 측정하는 단계;
(d) 후보 화합물의 존재하에서 상기 세로토닌 수용체를 발현하는 세포를 세로토닌 또는 세로토닌 유사체에 노출시키는 단계;
(e) 후보 화합물의 존재하에서 상기 세로토닌 수용체의 활성을 측정하는 단계;
(f) 여기서, 후보 화합물의 존재하에서 상기 세로토닌 수용체의 활성 양이 후보 화합물의 부존재하에서 상기 세로토닌 수용체의 활성 양 이하인 경우, 상기 후보 화합물은 세로토닌 수용체 길항제이다.
세로토닌 수용체의 길항제는 또한 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 확인될 수 있다:
(a) 세로토닌 수용체를 발현하는 세포를 제공하는 단계;
(b) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 세로토닌 수용체를 발현하는 세포를 세로토닌 또는 세로토닌 유사체에 노출시키는 단계;
(c) 후보 화합물의 부존재하에서 상기 세로토닌 수용체에 대한 세로토닌 또는 세로토닌 유사체의 결합을 측정하는 단계;
(d) 후보 화합물의 존재하에서 상기 세로토닌 수용체를 발현하는 세포를 세로토닌 또는 세로토닌 유사체에 노출시키는 단계;
(e) 후보 화합물의 존재하에서 상기 세로토닌 수용체에 대한 세로토닌 또는 세로토닌 유사체의 결합을 측정하는 단계;
(f) 여기서, 후보 화합물의 존재하에서 상기 세로토닌 수용체에 대한 세로토닌 또는 세로토닌 유사체의 결합이 후보 화합물의 부존재하에서 상기 세로토닌 수용체에 대한 세로토닌 또는 세로토닌 유사체의 결합 이하인 경우, 상기 후보 화합물은 세로토닌 수용체 길항제이다.
"세로토닌 유사체(serotonin analogue)"는 세로토닌의 결합특성과 유사한 결합특성을 가지면서 세로토닌 수용체에 결합하거나 및/또는 세로토닌과 유사한 방식으로 세로토닌 수용체를 활성화시키는 물질을 의미한다.
일부 구체 예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에 있어서 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 방법을 제공한다:
(a) 복수의 후보 화합물을 제공하는 단계;
(b) 상기 복수의 후보 화합물 중 하나가 TPH1의 억제제임을 결정하는 단계;
(c) 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에게 상기 단계 (b)에서 TPH1 억제제로 결정된 후보 화합물의 치료를 위한 효과적인 양을 투여하는 단계.
일부 구체 예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에 있어서 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 방법을 제공한다:
(a) 복수의 후보 화합물을 제공하는 단계;
(b) 상기 복수의 후보 화합물 중 하나가 세로토닌 수용체 길항제임을 결정하는 단계;
(c) 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에게 상기 단계 (b)에서 세로토닌 수용체 길항제로 결정된 후보 화합물의 치료를 위한 효과적인 양을 투여하는 단계.
본 명세서에서, 본 발명은 본 발명의 특정 구체 예를 참조하여 기술된다. 그렇지만, 본 발명의 광범위한 개념 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 수정 및 변화가 있을 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서 명세서 및 도면은 제한적인 개념이 아닌 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
실시예
실시예 1
쥐에서 말초 세로토닌 생성에 대한 카테콜-3,6- 비스 메틸렌이미노디아세트산 (CBMIDA) 효과의 평가
동물
무게 15-16 g, 1개월 연령의 C57Bl/6 유전 수컷 쥐가 실험에 사용되었다. 동물들은 조절된 온도(22℃) 및 습도(60%)의 방에서 12 h 빛/12 h 암흑 조건 하에서 수용되었다. 쥐들은 자유롭게(ad libitum) 음식과 물에 접근하였으며, 수용 조건에 대하여 최소 4일의 새환경 순화 이후 사용되었다. 모든 실험은 실험실 쥐의 동물 사용 및 보호에 관한 콜럼비아 대학 지침(Columbia University Guidelines for the Animal Use and Care of laboratory mice)에 따라 수행되었다.
실험 프로토콜
실험 이전에, 동물들은 실험 하루 전에 개별 우리(cage)에 분리되었다. 화합물을 쥐의 무게에 따라 계산하여 1700h 및 1100h에서 하루에 2회 쥐에 경구로(위관) 공급하였다. 세로토닌을 합성하며 뇌에 존재하는 TPH2와 대비하여 장에 존재하는 트립토판 하이드록실라제-1(TPH1)의 더 우수한 억제를 위하여 경구 공급(feeding)이 화합물의 정맥내 또는 복강내 주사 대신에 선택되었다. 이러한 경로는 화합물이 뇌에 도달하는 데 있어 두 가지 잠재적 장애를 유발한다. 첫째, EDTA-기초 화합물(CBMIDA의 경우처럼)에 대한 열등한 투과성을 갖는 장 혈관 장벽(intestinal blood barrier)은 경구로 제공된 모든 양이 순환으로 흡수되는 것을 허용하지 않는다(단지 5-10%만이 혈액으로 운송됨). 두 번째 장애는 EDTA 화합물을 비롯하여 많은 수의 화합물에 대한 열등한 투과성을 나타내는 뇌혈관 장벽이다. 대조군 동물은 동일 부피의 담체를 수여받았다. 이소플루오란-마취된 동물에 대하여 심장 천자(heart puncture)를 통하여 혈액을 수집하였으며 얼음에서 5분 동안 응고시켰다. 혈청을 분리하고, 액체 질소에서 스냅 냉각(snap chilled)하고 분석시까지 -80℃에서 동결시켰다. 모든 동물로부터 쇠간을 수집하고 HPLC를 통한 뇌 세로토닌 측정을 위하여 처리하였다. 연구 과정 동안 모든 신체 또는 행동 이상에 대하여 쥐를 관찰하였다.
혈청 내 세로토닌 측정
Fitzgerald사로부터 구입한 세로토닌 ELISA 키트를 사용하여 혈청으로부터 유도체화된 세로토닌을 측정하였다. 유도체화(Derivatization)는 시료 제조의 일부이다. 혈청에 존재하는 세로토닌을 먼저 아실화제를 사용하여 정량적으로 아실화시켜 N-아실세로토닌으로 만들었다. 검정 원칙은 경쟁 ELISA에 기초하는데, 여기서 플레이트의 고체 상(solid phase)에 결합된 세로토닌과 N-아실세로토닌이 고정된 수의 항혈청 결합 위치에 대하여 경쟁한다. 반응이 평형이 되면, 자유 항원과 자유 항원-항혈청 복합체는 세척에 의해 제거된다.
고체 상 세로토닌에 결합한 항체는 그 후 안티래빗(antirabbit)/과산화효소(peroxidase)를 사용하여 탐지된다. 기질 TMB/과산화효소 반응은 450 nm에서 기록된다. 고체 상 세로토닌에 결합한 항체의 양은 시료 내 세로토닌의 농도에 반비례한다.
연구에 사용된 약물
콜롬비아 대학 화학 분과(Columbia University Chemistry division)에서 합성된 카테콜-3,6-비스 메틸렌이미노디아세트산(CBMIDA)(기본 구조는 EDTA-유사 화합물이며 카테콜 고리는 중앙에 있음) 및 Sigma Aldrich Corp.사로부터 구입한 파라-클로로페닐알라닌(pCPA)이 사용되었다. 각 화합물은 2배 몰의 NaHCO3과 함께 물에 용해되었으며 250 및 500 mg/kg/1회복용량(dose)으로 쥐에 경구로 투여되었다.
결과
도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, CBMIDA의 경구 투여는 1일 2회 500mg/kg의 1회복용량으로 세로토닌 혈청 수치를 정상보다 80% 낮게 감소시켰다. 1회복용량을 250mg/kg으로 감소시킨 것은 정도가 덜한 효과를 유발하였다. 실제로 두 가지 1회복용량을 대조군 동물과 비교할 때, 용량 반응 곡선이 생성된다. 한편, 대조군으로 사용된 트립토판 하이드록실라제의 공지된 억제제인 pCPA는 예상된 바와 같이 혈청 세로토닌 수치를 정상 범위보다 >60% 더 낮게 감소시켰다.
실시예 2
카테콜 TPH1 억제제의 합성
2,2',2'',2'''-(2,3-디하이드록시-1,4-페닐렌)비스(메틸렌) 비스(아잔트리일)테트라아세트산의 합성
Figure pct00038
카테콜(5.5 g, 0.05 mol) 및 이미노디아세트산(11.3 g, 0.1 mol)를 아세트산 (20 ml)과 물(40 ml)의 혼합물에 현탁시켰다. 포름알데히드(37%, 10 ml)를 천천히 첨가하였다. 반응을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 냉각시키고 백색 침전물을 여과하고, 물과 에탄올로 세척하고, 건조시켰다. 15.0 g의 생성물을 얻었다(수득률: 75%).
2,2'-(2,3-디하이드록시-1,4-페닐렌)비스(메틸렌)비스((2-아미노-2-옥소에틸)아잔디일)디아세트산의 합성
Figure pct00039
2,2',2'',2'''-(2,3-디하이드록시-1,4-페닐렌)비스(메틸렌)비스(아잔트리일)테트라아세트산(5 g, 12.5 mmol)을 아세틸 무수물(10 ml)에 첨가하였으며 후속하여 피리딘(3 ml)을 첨가하였다. 반응을 70℃에서 5시간 동안 가열하였다. 과량의 무수물과 피리딘을 감압하에서 제거하였으며 잔류물을 아세틸 무수물에서 재결정시켰다. 백색 고체로서 2.8 g의 3,6-비스((2,6-디옥소모폴리노)메틸)-1,2-페닐렌 디아세테이트를 얻었다(수득률: 51%).
3,6-비스((2,6-디옥소모폴리노)메틸)-1,2-페닐렌 디아세테이트(2.24 g, 10 mmol)를 메탄올에 용해된 암모니아 용액(7N, 20 ml)에 첨가하였다. 반응을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 메탄올을 제거한 후, 잔류물을 메탄올과 아세톤에서 재결정시켰다. 백색 고체로서 3.5 g의 생성물을 얻었다(수득률: 88%).
2,2'-((11,12-디하이드록시-6-메틸-4,5,6,8-테트라하이드로피리도[3,2,1-데]펜안트리딘-10-일)메틸아잔디일)디아세트산의 합성
Figure pct00040
카테콜(5.5 g, 0.05 mol)과 이미노디아세트산(11.3 g, 0.1mol)을 아세트산(20 ml)과 물(40 ml)의 혼합물에 현탁시켰다. 포름알데히드(37%, 10 ml)를 천천히 첨가하였다. 반응을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 냉각시키고 백색 침전물을 여과하였으며, 물과 에탄올로 세척하고, 건조시켰다. 15.0 g의 생성물을 얻었다(수득률: 75%).
6-메틸-4,5,6,8-테트라하이드로피리도[3,2,1-데]펜안트리딘-11,12-디올(1.33 g, 5 mmol)과 이미노디아세트산(1.13 g, 10 mmol)을 아세트산(2 ml)과 물(4 ml)의 혼합물에 현탁시켰다. 포름알데히드(37%, 1 ml)를 천천히 첨가하였다. 반응을 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 메탄올과 물에서 재결정하였다. 1.8의 생성물을 백색 고체로서 얻었다(수득률: 87%).
실시예 3
혈청 세로토닌의 측정
혈청 세로토닌 수치를 측정하는 두 가지 가능한 방법은 다음과 같다:
(1) 초기 단계는 실온에서 폴리프로필렌 튜브 및 피펫을 사용하여 수행된다. 정맥천자(venipuncture)에 의해 자유 흐름을 달성하여, EDTA-함유 진공 튜브에 삽입된 19-눈금, 얇은-벽 나비 바늘을 사용하여 전주정맥(antecubital vein)으로부터 혈액을 채취한다. 튜브는 실온에서 15분 동안 800 rpm(100 x g)으로 원심분리된다(Sorvall GLC-2B). 혈소판-풍부 혈장(platelet-rich plasma, PRP)의 상층, 즉 경계면 층(연막(buffy coat))으로부터 약 0.3 cm를 플라스틱 피펫을 사용하여 제거하고, 새로운 폴리프로필렌 시험 튜브로 옮긴다. 혈소판-부족 혈장(platelet-poor plasma, PRP)을 함유하는 튜브를 10분 동안 얼음냉각시키고 그 후 Sorvall SS-34 회전기에서 4℃에서 6분 동안 11,000 rpm(14,500 x g)으로 원심분리하여 혈소판 펠릿과 혈소판-부족 혈장(PPP)을 얻는다. PPP를 함유하는 상청액을 제거하고 에펜도르프 튜브 내 500 마이크로리터 부피의 새로운 폴리프로필렌 시험 튜브 내에 놓는다. 혈소판-풍부 펠릿을 1 ml 살린에 재현탁시킨다. 덩어리 없이 균질한 현탁액을 유지하기 위하여, 에펜도르프 튜브로의 운송 이전에, 혼합 또는 와동(vortexing)이 요구된다. 분취된 혈장 상청액(PPP)과 재현탁된 펠릿(PRP)은 -20에서 보관한다. 세로토닌 검정을 위하여, 시료들을 살린에 재현탁시킨다. 가장 관심의 대상인 세로토닌의 "호르몬" 원소는 PPP 내 순환 수치이나, PRP 분율 또한 측정될 것이다. 방법은 Fitzgerald Industries International (Concord, MA)사로부터 수득한 ELISA이다. 혈청 또는 혈장 시료 또는 유린 시료로부터 유래된 유도체화된 세로토닌을 측정한다. 유도체화는 시료 제조의 일부이다. 생물학적 유체(예를 들면, 혈청)에 존재하는 세로토닌을 먼저 아실화제를 사용하여 정량적으로 아실화시켜 N-아실세로토닌으로 만든다. 검정은 경쟁 ELISA 원리에 기초하는데, 여기서 플레이트의 고체 상(solid phase)에 결합된 세로토닌과 N-아실세로토닌이 고정된 수의 항혈청 결합 위치에 대하여 경쟁한다. 반응이 평형이 되면, 자유 항원과 자유 항원-항혈청 복합체는 세척에 의해 제거된다. 고체 상 세로토닌에 결합한 항체는 그 후 안티래빗(antirabbit)/과산화효소(peroxidase)를 사용하여 탐지된다. 기질 TMB/과산화효소 반응은 450 nm에서 기록된다. 고체 상 세로토닌에 결합한 항체의 양은 시료 내 세로토닌의 농도에 반비례한다. 비록 ELISA 검정이 유용하지만, 우리는 더욱 정밀한 검정, 즉 전기화학적 탐지와 관련된 HPLC를 적용할 기회를 가질 것이다.
(2) 또 다른 방법은 전기화학적 탐지와 관련된 HPLC에 의존한다. 전술한 방식으로 얻어진 시료들을 1N HClO4 (1:1)로 침전시키고, 희석하고 분취하여 32.5 ㎕의 0.02 M 아세트산을 함유하는 HPLC 바이알에 넣는다. 분획물을 길슨(Gilson) 223 XL 자동주입기를 통하여 칼럼에 주입시킨다. 20 ㎕의 마이크로투석 시료(microdialysis sample)를 100x2 mm C18 하이퍼실(Hypersil) 3 ㎛ 칼럼에 주입하고, 쉬마드주(Shimadzu) LC-10 AD 펌프를 사용하여 0.4 ml/분의 유속에서, pH 4.75이며 4.1 g/l 소듐 아세테이트, 500 mg/l Na2-EDTA, 50 mg/l 헵탄 술폰산, 4.5% 메탄올 v/v, 및 30 ㎕/l의 트리에틸아민으로 구성된 이동상으로 분리시킨다. 세로토닌은 Ag/AgCl에 대한 500 mV인 유리질 탄소 전극에서 엠페로메트리칼하게(amperometrically) 탐지된다. 20 ㎕ 시료 당 0.5 fmol 세로토닌 즉 10 pM인 탐지 한계는 세로토닌의 순환 농도에 충분히 포함된다. PPP에서 측정된 세로토닌이 혈장 단백질에 의해 어떠한 평가가능한 정도로 결합하지 않으므로, 이러한 측정은 자유 세로토닌 수치와 동등한 것으로 간주될 수 있다.
실시예 4
추가 TPH1 억제제에 대한 합성 계획
다음 구조를 갖는 TPH1 억제제가 아래 방법에 의해 합성될 수 있다:
Figure pct00041
n = 1에 대하여,
Figure pct00042
n = 2에 대하여,
Figure pct00043
n=3에 대하여,
Figure pct00044

다음 구조를 갖는 TPH1 억제제가 아래 방법에 의해 합성될 수 있다:
Figure pct00045
n = 1에 대하여,
Figure pct00046
n = 2에 대하여,
Figure pct00047
n = 3에 대하여,
Figure pct00048
실시예 5
변종 동물 발생 및 동물 치료
Lrp5 -/- (Kato et al., 2002, J. Cell Biol. 157:303-314) β-카테닌플록스드(floxed)/플록스드(floxed)(Glass et al., 2005, Dev. Cell 8:751-764), α1(I)콜라겐-크레(cre) 이식유전자(transgenic)(Dacquin et al., 2002, Dev. Dyn. 224:245-251) 및 Htt-/- (Ansorge et al., 2008, J. Neurosci. 28:199-207) 쥐의 발생은 앞서 설명된 바와 같다. Lrp5 +/-; Htt +/- 이중 이형접합체성 쥐는 Lrp5 +/- 및 Htt +/- 쥐를 교접시켜 발생시켰다. 3주-연령 Wt 또는 Lrp5 -/- 쥐에게 9주 동안 2일에 한번 pCPA를 복강(i.p.) 투여하였다. 모든 동물 프로토콜은 콜롬비아 대학의 동물 보호 위원회(Animal Care Committees of Columbia University)에 의해 승인되었다.
실시예 6
체형계측 측정
정적 조직형태학적 측정(Static histomorphometry measurement)이 오스테오메져 분석 시스템(Osteomeasure Analysis System) (Osteometrics, Inc)을 사용하여, 표준 명명법에 따라 전술한 바와 같이 수행되었다(Ducy et al., 2000, Cell 100:197-207). 그룹 당 4 내지 9마리 동물이 할당되었다.
실시예 7
세포 배양
두개관 조골세포가 삼중 콜라게나제/트립신 소화에 의해 4일-연령 CD1 새끼로부터 추출되었고 전술한 바와 같이 아스코르브산에 의해 분화되었다(Ducy et al., 2000, Cell 100:197-207).
실시예 8
유전자 발현 연구
조골세포를 무-혈청 배지에서 담체 또는 세로토닌(50 내지 100 μM, 시그마)으로 24시간 동안 처리하였다. 전체 RNA를 트리졸(Trizol)(인비트로젠(Invitrogen))로 추출하였다. cDNA를 ABI 역전사효소 시스템 및 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머(random hexanucleotide primer)를 사용하여 발생시켰다. 실시간 PCR이 스트라타젠(Stratagene) 실시간 PCR 사이클러에 대한 수퍼어레이 프라이머를 사용하여 수행되었으며 액틴 발현이 내인성 대조군(endogenous control)으로서 사용되었다. 크로마틴 면역침강 검정법(Chromatin immunoprecipitation assays, ChIP)이 1차 조골세포를 사용하여 표준 과정에 의해 수행되었다. 마이크로어레이 분석이 전술한 바와 같이 수행되었다(Glass et al., 2005, Dev. Cell 8:751-764).
실시예 9
생화학적 연구
조골세포를 무-혈청 배지에서 담체 또는 세로토닌(50 내지 100 μM, 시그마)으로 24시간 동안 처리하였다. 1차 조골세포 또는 분쇄된 동결 뼈로부터 유래된 용해물(Lysate)을 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 존재 하에서 RIPA 완충액에서 제조하였다. 20 내지 60 μg의 단백질을 환원 조건(reducing condition)에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였으며 표준 프로토콜을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 운송시켰다. 막은 전체 또는 항-포스포 CREB(세포 신호전달 기술, Cell Signaling Technology)을 포함하는 1차 항체로 배양되었다.
실시예 10
호르몬 측정
세로토닌 혈청 수치는 Fitzgerald(세로토닌(Serotonin))사로부터 구입한 면역학적 검정 키트를 사용하여 정량화되었으며 뇌의 서로 다른 영역에서의 세로토닌 수치는 전술한 바와 같이 HPLC 방법에 의해 정량화되었다(Mann et al., 1992, Arch. Gen. Psychiatry 49:442-446).
실시예 11
CBMIDA 및 그 밖의 다른 화합물의 경구 공급시 세로토닌 수치의 변화
다음 화합물을 4주 연령 쥐에 경구 공급한 후 담체와 비교한 세로토닌 혈청 수치가 측정되었다:
Figure pct00049
공급 프로토콜은 도 13에 제시된다. 결과는 도 14에 제시된다. 실험의 상세한 사항은 아래 실시예 12와 유사하다.
실시예 12
난소절제술에서 유래된 골 손실(ovariectomy-induced bone loss)의 방지에 대한 신규한 트립토판 하이드록실라제 억제제의 효과 평가
동물
무게 12-14 g, 6-주 연령의 C57Bl/6 유전 암컷 쥐가 실험에 사용되었다. 동물들은 조절된 온도(22℃) 및 습도(60%)의 방에서 12 h 빛/12 h 암흑 조건 하에서 수용되었다. 쥐들은 자유롭게(ad libitum) 음식과 물에 접근하였으며, 수용 조건에 대하여 최소 4일의 새환경 순화 이후 사용되었다. 모든 실험은 실험실 쥐의 동물 사용 및 보호에 관한 콜럼비아 대학 지침(Columbia University Guidelines for the Animal Use and Care of laboratory mice)에 따라 수행되었다.
실험 프로토콜
동물들을 실험 하루 전에 서로 다른 그룹으로 분리시켰다. 쥐를 마취(Avertin) 하에서 난소절제(ovariectomized)(OVX) 하였다. 시범 연구를 위하여 1700h 및 1100h에서 하루에 2회 화합물을 경구 공급(위관 공급)하였으며, 한편 장기간의 연구를 위하여 화합물을 1700h에서 하루에 1회 공급하였다. 장에 존재하는 트립토판 하이드록실라제-1(Tph1)의 더 우수한 억제를 위하여 그리고 뇌에서 Tph2 기능에 영향을 미치는 것을 피하기 위하여, 경구 공급이 화합물의 정맥내 또는 복강내 주사 대신에 선택되었다. 이러한 경로는 화합물이 뇌에 도달하는 데 있어 두 가지 잠재적 장애를 유발한다. 첫째, EDTA-기초 화합물(화합물 1의 경우처럼)에 대한 열등한 투과성을 갖는 장 혈관 장벽은 경구로 제공된 모든 양이 대순환으로 흡수되는 것을 허용하지 않는다(단지 5-10%만이 혈액으로 운송됨); 둘째, 뇌혈관 장벽 그 자체는 EDTA 화합물을 비롯하여 많은 수의 화합물에 대한 열등한 투과성을 나타낸다. 대조군 동물은 동일 부피의 담체를 수여받았다. 이소플루오란-마취된 동물에 대하여 심장 천자(heart puncture)를 통하여 혈액을 수집하였으며 얼음에서 5분 동안 응고시켰고, 그 후 혈청을 분리하고, 액체 질소에서 스냅 냉각(snap chilled)하고 분석시까지 -80℃에서 동결시켰다. 연구 과정 동안 모든 신체 또는 행동 이상에 대하여 매일 쥐를 관찰하였다.
실험 I: 시험되는 화합물의 효능을 결정하기 위한 시범 연구
그룹 1: 담체
그룹 2: 화합물 1
그룹 3: 화합물 2
그룹 4: 화합물 3
그룹 5: 화합물 4 (LP-533401)
실험 II : OVX - 유래된 골 손실의 방지에 대한 화합물 1 및 4의 효과
프로토콜 1: 화합물의 위관 공급이 6주 동안 OVX 후 1일 후에 시작될 것이다.
그룹 1: 위조치료(Sham treatment)
그룹 2: OVX
그룹 3: OVX + 화합물 1 (250 mg/kg)
그룹 4: OVX + 화합물 1 (500 mg/kg)
그룹 5: OVX + 화합물 4 (250 mg/kg)
프로토콜 2: 화합물의 위관 공급이 6주 동안 OVX 후 2주 후에 시작될 것이다.
그룹 1: 위조치료
그룹 2: OVX
그룹 3: OVX + 화합물 1 (250 mg/kg)
그룹 4: OVX + 화합물 1 (500 mg/kg)
그룹 5: OVX + 화합물 4 (250 mg/kg)
프로토콜 3: 화합물의 위관 공급이 6주 동안 OVX 후 4주 후에 시작될 것이다.
그룹 1: 위조치료
그룹 2: OVX
그룹 3: OVX + 화합물 1 (250 mg/kg)
그룹 4: OVX + 화합물 1 (500 mg/kg)
그룹 2: OVX + 화합물 4 (250 mg/kg)
혈청 내 세로토닌 측정
Fitzgerald사로부터 구입한 세로토닌 ELISA 키트를 사용하여 혈청으로부터 유도체화된 세로토닌을 측정하였다. 유도체화(Derivatization)는 시료 제조의 일부이다. 혈청에 존재하는 세로토닌을 먼저 아실화제를 사용하여 정량적으로 아실화시켜 N-아실세로토닌으로 만들었다. 검정 원칙은 경쟁 ELISA에 기초하는데, 여기서 플레이트의 고체 상(solid phase)에 결합된 세로토닌과 N-아실세로토닌이 고정된 수의 항혈청 결합 위치에 대하여 경쟁한다. 반응이 평형이 되면, 자유 항원과 자유 항원-항혈청 복합체는 세척에 의해 제거된다. 고체 상 세로토닌에 결합한 항체는 그 후 안티래빗(antirabbit)/과산화효소(peroxidase)에 의하여 탐지된다. 기질 TMB/과산화효소 반응은 450 nm에서 기록된다. 고체 상 세로토닌에 결합한 항체의 양은 시료 내 세로토닌의 농도에 반비례한다.
연구에 사용된 약물
콜롬비아 대학 화학 분과(Columbia University Chemistry division)에서 합성된 카테콜-3,6-비스 메틸렌이미노디아세트산 [(CBMIDA) 화합물 1: 기본 구조는 EDTA-유사 화합물이며 카테콜 고리는 중앙에 있음)] 및 Sigma Aldrich Corp.사로부터 구입한 파라-클로로페닐알라닌(pCPA)을 실험을 위하여 사용하였다. 화합물들은 2배 몰의 NaHCO3과 함께 물에 용해되었으며 250 및 500 mg/kg/1회복용량(dose)으로 쥐에 경구로 투여되었다. 화합물 2 및 3은 물에 용해되었다.
결과
쥐에서 말초 세로토닌 생성에 대한 효과에 대하여 전술한 4가지 화합물의 효과를 시험하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, 화합물 1 (CBMIDA)의 경구 투여는 매일 2회 500mg/kg의 1회복용량으로 세로토닌 혈청 수치를 정상보다 80% 낮게 감소시켰다. 1회복용량을 250mg/kg으로 감소시킨 것은 정도가 덜한 효과를 유발하였으며 화합물 2는 최소 효과를 나타냈다. 비록 화합물 3이 세로토닌 수치를 극적으로 감소시켰으나, 동물들이 심한 혼수상태였으며 아팠던 것으로 보아, 화합물 3은 동물에 대하여 독성이었다.
또한 세로토닌 수치에 대한 화합물 1의 서로 다른 1회 복용량의 효과를 시험하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, 화합물 1은 대조군 동물과 비교할 때 용량 반응 곡선을 생성하였다. 한편, 대조군으로 사용된 트립토판 하이드록실라제의 공지된 억제제인 pCPA는 예상된 바와 같이 세로토닌 수치를 정상 범위보다 >60% 더 낮게 감소시켰다.
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Claims (45)

  1. 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈청 세로토닌 수치를 감소시킬 필요가 있다고 알려졌거나 또는 의심되는 환자에 있어 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 방법.
  2. 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하거나 또는 의심되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하거나 또는 의심되는 환자에 있어 저골량 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 시약은 TPH1 억제제인, 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 환자에게 TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제가 투여되는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 TPH1 억제제 및 세로토닌 수용체 길항제는 단일 약제학적 조성물에서 투여되는, 방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 시약은 뇌혈관장벽을 횡단하지 않는 TPH1 억제제인, 방법.
  7. 청구항 3에 있어서, 상기 시약은 TPH2를 상당히 억제하지 않는 TPH1 억제제인, 방법.
  8. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약에 추가하여 SSRI, 비스포스포네이트, 또는 베타 차단제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 청구항 1-8 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 혈청 세로토닌 수치가 상기 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약의 투여 이전에 측정되는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 환자의 혈청 세로토닌 수치가 상기 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약의 투여 이전 및 이후에 측정되는, 방법.
  11. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 혈청 세로토닌의 정상 수치보다 25% 이상 높은 혈청 세로토닌 수치를 갖는 것으로 확인된, 방법.
  12. 청구항 1-11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자에게 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약에 추가하여 뇌 유래 세로토닌을 증가시키는 시약이 투여되는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 뇌 유래 세로토닌을 증가시키는 시약은 TPH2 활성을 증가시키는 시약인, 방법.
  14. 청구항 1-13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약은 약 1 mg/일 내지 약 2 g/일의 용량으로 투여되는, 방법.
  15. 청구항 1-14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저골량 질병은 골다공증, 골다공증-가성신경교종 증후군(OPPG), 골감소증, 골연화증, 신성골이영양증, 불량 골형성, 불량 골 재흡수, 파제트병, 골절, 부서진 뼈(broken bone), 또는 골전이인, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 저골량 질병은 골다공증인, 방법.
  17. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 시약은 다음인, 방법:
    Figure pct00050

    및 이의 약제학적으로 수용가능한 염, 여기서: A는 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; X는 결합(즉, A가 직접 D에 결합함), -O-, -S-, -C(O)-, -C(R4)=, =C(R4)-, -C(R3R4)-, -C(R4)=C(R4)-, -C≡C-, -N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(R3R4)N(R5)-, -N(R5)C(R3R4)-, -ONC(R3)-, -C(R3)NO-, -C(R3R4)O-, -OC(R3R4)-, -S(O2)-, -S(O2)N(R5)-, -N(R5)S(O2)-, -C(R3R4)S(O2)-, 또는 -S(O2)C(R3R4)-이며; D는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; R1은 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R3은 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬이며; R4는 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 각 R5는 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 그리고 n은 0-3이며;
    또는
    Figure pct00051

    및 이의 약제학적으로 수용가능한 염, 여기서: A는 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; X는 결합(즉, A가 직접 D에 결합함), -O-, -S-, -C(O)-, -C(R4)=, =C(R4)-, -C(R3R4)-, -C(R4)=C(R4)-, -C≡C-, -N(R5)-, -N(R5)C(O)N(R5)-, -C(R3R4)N(R5)-, -N(R5)C(R3R4)-, -ONC(R3)-, -C(R3)NO-, -C(R3R4)O-, -OC(R3R4)-, -S(O2)-, -S(O2)N(R5)-, -N(R5)S(O2)-, -C(R3R4)S(O2)-, 또는 -S(O2)C(R3R4)-이며; D는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; E는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로사이클이며; R1은 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로사이클이며; R3은 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬이며; R4는 수소, 알콕시, 아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 각 R5는 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴이며; 그리고 n은 0-3이다.
  18. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 시약은 다음인, 방법:
    Figure pct00052

    및 이들의 약제학적으로 수용가능한 염;
    또는
    Figure pct00053

    및 이들의 약제학적으로 수용가능한 염.
  19. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 시약은 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법:
    (a)
    Figure pct00054

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
    n은 1, 2, 또는 3이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (b)
    Figure pct00055

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
    n은 1, 2, 또는 3이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (c)
    Figure pct00056

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며;
    R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
    수소;
    할로겐;
    저급 알킬;
    알콕시; 또는
    아미노; and
    n은 1, 2, 또는 3이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (d)
    Figure pct00057

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며;
    R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
    수소;
    할로겐;
    저급 알킬;
    알콕시; 또는
    아미노; and
    n은 1, 2, 또는 3이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (e)
    Figure pct00058

    여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (f)
    Figure pct00059

    여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (g)
    Figure pct00060

    여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (h)
    Figure pct00061

    여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (i)
    Figure pct00062

    여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 사이클로알킬, F, Cl, 또는 OH이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (j)
    Figure pct00063

    여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이며;
    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    (k)
    Figure pct00064

    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염;
    및
    (1)
    Figure pct00065

    또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염.
  20. 세로토닌 수용체 길항제의 치료를 위한 효과적인 양을 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하거나 또는 의심되는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 저골량 질병의 치료 또는 예방이 필요하거나 또는 의심되는 환자에 있어 저골량 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 세로토닌 수용체 길항제는 HT1B, HT2A 또는 HT2B 세로토닌 수용체 길항제인, 방법.
  22. 청구항 21항에 있어서, 상기 세로토닌 수용체 길항제는 HT1B 세로토닌 수용체 길항제인, 방법.
  23. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00066

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
    n은 1, 2, 또는 3이다.
  24. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00067

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
    n은 1, 2, 또는 3이다.
  25. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00068

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며;
    R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
    수소;
    할로겐;
    저급 알킬;
    알콕시; 또는
    아미노; 그리고
    n은 1, 2, 또는 3이다.
  26. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00069

    여기서 R은 수소 또는 저급 알킬이며;
    R1, R2, 및 R3은 독립적으로 다음을 나타내며:
    수소;
    할로겐;
    저급 알킬;
    알콕시; 또는
    아미노; 그리고
    n은 1, 2, 또는 3이다.
  27. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00070

    여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이다.
  28. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00071

    여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이다.
  29. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00072

    여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이다.
  30. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00073

    여기서 R은 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이다.
  31. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00074

    여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 사이클로알킬, F, Cl, 또는 OH이다.
  32. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00075

    여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 저급 알킬, 또는 사이클로알킬이다.
  33. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00076
    .
  34. 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 약제학적으로 수용가능한 산과 이의 염:
    Figure pct00077
    .
  35. 청구항 23-34 중 어느 한 항에 따르는 화합물의 치료를 위한 효과적인 양 및 약제학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약 및 SSRI, 비스포스포네이트, 또는 베타 차단제를 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서, 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약 및 SSRI를 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약 및 뇌-유래 세로토닌의 수치를 증가시키는 시약을 포함하는 약제학적 조성물.
  39. 다음 단계를 포함하는, 저골량 질병 치료 방법:
    (a) 저골량 질병의 치료 필요성이 있는 환자를 확인하는 단계;
    (b) 상기 환자에게 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 시약의 치료를 위한 효과적인 양을 투여하는 단계.
  40. 불안증 또는 우울증을 앓고 있는 환자에게 SSRI 및 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 불안증 또는 우울증 치료 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 환자에게 SSRI 및 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 치료제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 불안증 또는 우울증 치료 방법.
  42. 청구항 40에 있어서, 상기 환자에게 SSRI를 포함하는 약제학적 조성물 및 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 치료제를 포함하는 별개의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 불안증 또는 우울증 치료 방법.
  43. 다음 단계를 포함하는, 저골량 질병 치료 방법:
    (a) 저골량 질병을 갖는 환자를 확인하는 단계;
    (b) 상기 환자에서 세로토닌의 혈청 수치가 정상 개체에 비하여 높은지 여부를 결정하는 단계;
    (c) 상기 환자에서 세로토닌의 혈청 수치가 정상 개체에 비하여 높은 경우 혈청 세로토닌 수치를 감소시키는 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계.
  44. 다음 단계를 포함하는, 저골량 관련 질병의 발생 위험이 있는 대상을 확인하는 방법:
    (a) 환자 및 정상 개체로부터 채취한 생체 시료 내 혈청 세로토닌의 수치를 결정하는 단계,
    (b) 환자로부터 채취한 시료 내 혈청 세로토닌의 수치가 정상 개체로부터 채취한 시료 내 혈청 세로토닌 수치보다 최소 약 25% 더 높으면 환자가 상기 질병의 발생 위험이 있다고 결론을 내리는 단계.
  45. 청구항 44에 있어서, 단계 (b) 이후에, 상기 질병 발생 위험이 있는 환자에게 혈청 세로토닌의 수치를 감소시키는 시약을 투여하는 단계를 더욱 포함하는, 저골량 관련 질병의 발생 위험이 있는 대상을 확인하는 방법.
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