KR20160137985A - 아데노-부속 바이러스 벡터의 고역가 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아데노-부속 바이러스(AVV) 벡터, AAV 벡터의 제조용 생산자 세포주(producer cell lines) 및 상기 벡터의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 상기 벡터의 역가를 증가시키기에 적합한 생산자 세포주 및 상기 생산자 세포주를 이용한 AAV 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

Description

아데노-부속 바이러스 벡터의 고역가 제조{HIGH TITER PRODUCTION OF ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS}
본 발명은 아데노-부속 바이러스(AVV) 벡터, AAV 벡터의 제조용 생산자 세포주(producer cell lines) 및 상기 벡터의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 상기 벡터의 역가를 증가시키기에 적합한 생산자 세포주 및 상기 생산자 세포주를 이용한 AAV 벡터의 제조방법에 관한 것이다.
야생형 AAV는 어떠한 인간 질환과도 연관되지 않기 때문에 아데노-부속 바이러스(AAV) 벡터는 탁월한 안정성 프로파일을 가진다. 따라서, AAV는 유전자 치료를 위한 널리 알려지고 성공적인 벡터이다. AAV 벡터는 헤모필리아 B, 심장 질환 및 선천맹을 포함하는 많은 다양한 병태를 위한 임상시험에서 광범위하게 연구되어 왔다. 또한, 첫 번째로 EU 허가된 유전자 치료제, 가족성 지질단백 지질분해효소 결핍증(LPLD)의 치료를 위한 글리베라(Glybera)는 AAV 벡터에 기초하며, 유전자 치료에 있어 AAV 벡터의 가능성에 대한 예시이다.
비록 AAV 벡터 디자인에 있어 많은 발전이 생성되어 왔지만, 이미 존재하는 면역 반응과 같은 장벽이 고역가 AAV의 투여, 많은 경우에 있어, 임상적 효과를 달성하기 위한 면역-억제제의 조합 투여를 필요하게 만들었다. 이는 AAV 제조에 있어 중요한 도전을 제시하고 AAV 벡터의 임상적 사용에 있어 중요한 안정성 영향을 갖는다.
AAV 벡터는 AAV 플라스미드와 다른 바이러스, 예컨대 아데노바이러스에서 유래한 헬퍼(helper) 플라스미드의 일시적 공동-형질감염에 의해서 가장 흔하게 제조된다. 최근 임상적 개발을 돕기 위한 AAV의 대규모 제조 및 강력한 정제에서 중요한 진전이 있었다. 그러나, 필요한 용량을 달성하기 위해서 환자가 반복된 투여를 받도록 요구되기때문에 고역가 AAV의 제조는 여전히 중요한 도전이다. 예를 들어, 글리베라에 있어서, 40 또는 60의 복수 주입을 통해 3×1012 vg/kg 용량의 벡터를 투여하는 것이 요구된다.
또한, 최근의 정제 방법의 결과에 따르면, AAV 생성물은 일반적으로 높은 수준의 단백질 응집물 또는 벡터 DNA가 결핍된 불완전하게 패킹된 빈 캡시드를 포함한다. 최종 생성물에서 빈 캡시드는 종종 완전한 입자의 수준보다 40배 이상 더 높다. 이러한 불순물은 환자에서 예상하지 않은 면역 반응을 유발할 수 있다. 예를 들어, 최근의 연구는 마우스 및 인간에서 세포성 면역 반응이 AAV2 캡시드 내의 에피토프에 관한 것이고, 빈 캡시드의 존재가 인 비보에서 고 용량 벡터의 투여 후 간세포 형질도입을 저해한다고 밝혔다. 빈 캡시드의 예상하지 않은 면역원성의 잠재적인 부작용은 안정성 및 효율성을 좋지 않게 한다.
그들의 입자 크기, 부착성 및 벡터 DNA를 포함하는 완전한 입자에 대한 단백질 조성의 선천적 유사성 때문에 공지된 방법에 의해서 치료적 기능을 갖지 않는 빈 캡시드를 제거하기가 어렵다. 게놈을 포함하는 완전한 입자로부터 빈 AAV 캡시드를 분리하기 위한 지속적인 노력이 있어왔다. 차등 CHCl3에 의해서 빈 입자-없는 AAV2가 달성되었다. 그러나, 이 방법의 사용은 생산 규모 확대 및 GMP 제조에서의 문제점이 존재할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피 또한 AAV2, 4, 5 및 8에서 빈 캡시드의 분리를 위한 것으로 보고되어왔다. 그러나, 20%에서 30배까지의 빈 캡시드가 최종 생성물에 남아있다.
따라서, 최종 생성물 내의 빈 캡시드의 존재를 제거 또는 감소시키는 신규한 AAV 벡터 제조방법의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 이는 AAV 생성물의 안정성 및 효율성을 향상시킬 수 있다. 빈 입자의 감소는 또한 고역가 제조에 있어서의 문제를 극복할 수 있게 한다.
AAV 벡터 제조에 있어서 두 가지 유형의 입자의 형성에 기여하는 세포성 또는 바이러스성 인자는 여전히 알려져 있지 않다. 일반적으로, 바이러스는 구조 단백질과 바이러스 게놈의 결합을 통해서 또는 조립된 캡시드로 바이러스 게놈의 삽입을 통해서 그들의 게놈을 단백질 캡시드에 패키징한다. AAV는 그들의 게놈을 조립된 캡시드로 패키징하는 것으로 알려져 있다. 바이러스 DNA의 효과적인 삽입을 위해서는 특정 아미노산 상호작용이 필요한 것으로 보고되었고 단일 아미노산 돌연변이 및 AAV 캡시드 단백질의 총 형태 변화가 AAV 게놈을 패키징하는데 어려움을 야기하는 것으로 나타났다. 또한 AAV 조립에 있어서의 세포성 단백질의 연관성에 대해 거의 연구되지 않았고, 이는 전체 생산자 세포 단백질 및 DNA 헬리카제가 AAV 조립에 있어 필요한 것을 암시한다. 그러나, 어떻게 AAV DNA가 캡시드에 삽입되는지에 대한 진정한 메커니즘은 알려져 있지 않다.
AAV 조립에 있어서 세포성 단백질의 역할을 더 잘 이해하고, 궁극적으로 AAV 생성물의 안정성과 질을 향상시키기 위해서, 본 발명자들은 AAV 벡터 내에서 공동 생성되고 공동 정제되는 숙주 세포성 단백질을 분석했다. 특히, 본 발명자들은 3개의 AAV 혈청형: AAV2; AAV5; 및 AAV8에서 빈 캡시드와 완전한 벡터 사이의 단백질 조성에 대한 체계적인 분석과 비교를 최초로 수행하였다. 상이한 혈청형 사이에는 일부 중요한 차이점들이 있지만, 본 발명자들은 3개의 AAV 혈청형 사이에 고유한 유사성을 증명했다. 중요한 것은, 본 발명자들이 빈 캡시드와 완전한 벡터 사이에 중요한 차이점을 최초로 증명했다는 것이다. 결국, 본 발명자들은 AAV 생성물과 유전적으로 연관된 많은 숙주 세포 단백질을 동정했다. 특히, 본 발명자들은 숙주 세포 단백질 YB1, NPM1 및 NCL이 AAV 생성물에서 발견됨을 증명하였고, 이러한 숙주 세포 단백질의 발현 조절이 AAV 벡터 입자의 생성에 영향을 주는 것을 증명하였다.
따라서, 본 발명은 대조군 생산자 세포주와 비교하여 YB1, NPM1 및 NCL 중 하나 이상의 발현이 조절된 유전자 변형 생산자 세포주를 제공한다. 일반적으로, 대조군 생산자 세포주와 비교하여 본 발명의 생산자 세포주 내에서 (i) NPM1 및 NCL; (ⅱ) YB1 및 NPM1; (ⅲ) YB1 및 NCL; 또는 (ⅳ) YB1, NPM1 및 NCL;의 발현이 조절된다.
바람직한 구현예에서, 대조군 생산자 세포주와 비교하여 YB1, NPM1 및 NCL 중 하나 이상의 발현이 감소되고, 여기서 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 CRISPR 게놈 편집(CRISPR genome editing), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA 또는 안티센스 RNA를 사용하여 감소될 수 있다. 일반적으로 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 shRNA를 사용하여 감소되고, 바람직하게: YB1 발현은 서열번호 14 내지 서열번호 18(Y1 내지 Y5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고; NPM1 발현은 서열번호 4 내지 서열번호 8(NPM-N6 내지 NPM-N10)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고/감소되거나; NCL 발현은 서열번호 9 내지 서열번호 13(NCL-N1 내지 NCL-N5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소된다. YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 감소될 수 있다. 일 구현예에서, YB1의 발현은 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 서열번호 37 및 서열번호 38; 및/또는 서열번호 39 및 서열번호 40으로부터 선택된 gRNA 쌍을 사용하여 감소된다.
또한 대조군 생산자 세포주에 비하여 본 발명의 생산자 세포주에서 본원의 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 추가적인 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조절될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 유전자 변형 생산자 세포주는 인간 배아 신장 293T 세포주이다.
또한 본 발명은 YB1, NPM1 및 NCL 중 하나 이상의 발현이 조절된 생산자 세포주 내에서 아데노-부속 바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 아데노-부속 바이러스(AAV) 벡터의 제조방법을 제공한다.
일반적으로 본 발명의 방법에 따라 생산자 세포주 내에서 (i) NPM1 및 NCL; (ii) YB1 및 NPM1; (iii) YB1 및 NCL; 또는 (iv) YB1, NPM1 및 NCL;의 발현이 조절된다. 바람직하게 YB1, NPM1 및/또는 NCL 발현의 조절은 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현의 감소이고, 여기서 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 CRISPR 게놈 편집(CRISPR genome editing), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA 또는 안티센스 RNA를 사용하여 감소된다. 일반적으로 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 shRNA를 사용하여 감소되고, 바람직하게: YB1 발현은 서열번호 14 내지 서열번호 18(Y1 내지 Y5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고; NPM1 발현은 서열번호 4 내지 서열번호 8(NPM-N6 내지 NPM-N10)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고/감소되거나; NCL 발현은 서열번호 9 내지 서열번호 13(NCL-N1 내지 NCL-N5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소된다. YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 감소될 수 있다. 일 구현예에서, YB1의 발현은 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 서열번호 37 및 서열번호 38; 및/또는 서열번호 39 및 서열번호 40으로부터 선택된 gRNA 쌍을 사용하여 감소된다.
또한 본 발명의 방법에서 사용된 생산자 세포주에서 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 추가적인 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조절될 수 있다.
본 발명의 방법은 AAV 벡터의 역가를 대조군 방법에 의해서 제조된 AAV 벡터의 역가와 비교하여 2배 이상 증가시킬 수 있고/있거나 본 발명의 방법은 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 대조군 방법에 의해서 제조된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율과 비교하여 20% 이상 증가시킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 유전자 변형 생산자 세포주는 인간 배아 신장 293T 세포주이다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 AAV2, AAV5 및/또는 AAV8 혈청형의 AAV 벡터를 제조한다.
또한 본 발명은 본 발명 및/또는 본 발명의 방법의 생산자 세포주로부터 얻을 수 있는 아데노-부속 바이러스(AAV) 벡터의 집단을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 집단 내 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율은 대조군 방법에 의해서 제조된 집단 내 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율과 비교하여 20% 이상 증가된다. 바람직하게 본 발명의 AV 벡터 집단은 AAV2, AAV5 및/또는 AAV8 혈청형 벡터를 포함한다.
도 1. AVB 세파로오스 친화 크로마토그래피 전과 후에 AAV 벡터의 3개의 혈청형의 단백질 프로파일. (a) 결합하지 않은 세포 단백질로부터 AAV의 분리를 나타내는 일반적인 크로마토그래피 프로파일; (b) 크로마토그래피 전(조)과 후(정제됨)의 AAV 벡터의 순도를 나타내는 은 염색 SDS-PAGE의 단백질 프로파일. E: 빈 캡시드, G: 레포터 유전자 GFP, 및 AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3를 운반하는 완전한 벡터.
도 2. (a) 아넥신 A5, (b) CypA 및 RuvB2의 결합을 나타내는 세포성 단백질의 면역블롯 분석법; (c) 친화 크로마토그래피 전(조)과 후(정제됨)의 YB1이 있는 AAV 벡터. E: 빈 캡시드, G: GFP 를 운반하는 완전한 AAV 및 대조군 293T 세포 용해물; (d) 정제된 벡터 내 남아있고 벡터 캡시드에 의해서 보호되지 않은 미량의 포함되지 않은 세포성 단백질을 제거하기 위해서 프로테나제 K를 사용한 YB1과 AAV 벡터의 결합.
도 3. 생산자 세포 내에서 단백질 발현의 발생순서대로의 분석. (a) AAV 단백질(VP1, VP2 및 vP3)이 형질감염하고 24시간 내지 72시간 후부터 약간의 증가로 형질감염하고 24시간 후 검출하능하다; (b) Rep 단백질은 형질감염하고 24시간 후에 검출가능하다; (c) YB1 및 CypA의 발현이 완전한 제조 사이클 동안 변하지 않았고; (d) 아넥신 A5의 시간외 증가가 AAV의 3가지 혈청형 모두에서 관찰되었다. 대조군: 어떠한 플라스미드의 형질감염이 없는 293T 세포 용해물(293T), pcDNA3 플라스미드의 형질감염이 있는 293T 세포(Mock), 및 로딩 대조군으로서 하우스키핑 유전자 GAPDH.
도 4. 아넥신 A5 및 YB1을 타겟으로 하는 shRNA 서열의 면역블롯팅 분석법. 유의적인 유전자 넉다운이 shRNA A2 또는 A5 및 (a) 아넥신 A5 및 (b) YB1을 각각 타겟으로 하는 shRNA Y3, Y4 또는 Y5 서열을 운반하는 생산자 세포 내에서 발견되었다. 비-포유동물 유전자를 타겟으로 하는 shRNA 서열이 있는 293T 세포(Scramble) 및 어떠한 shRNA 서열도 없는 293T 세포(293T)를 대조군으로 사용하였다. 로딩 대조군으로 하우스키핑 유전자 GAPDH를 추가적으로 사용하였다.
도 5. 대조군 shRNA 스크램블과 비교하여 YB1 유전자 넉다운 세포에서 제조된 AAV의 벡터 게놈 역가, (a) AAV2에서 50배까지의 증가 및 (b) 90일 이상 배양시 넉다운 생산자 세포의 7 집단에서 유래한 AAV8에서 10배까지의 증가를 나타낸다.
도 6. 동결보존 및 80일까지의 배양 후 유전자 넉다운 세포의 6 집단에서 YB1의 유지된 하향 조절. 비-포유동물 유전자를 타겟으로 하는 shRNA 서열이 있는 293T 세포(Scramble) 및 어떠한 shRNA 서열도 없는 293T 세포(293T)를 대조군으로 사용하였다. 로딩 대조군으로 하우스키핑 유전자 GAPDH를 추가적으로 사용하였다.
도 7. 사용된 YB1_shRNA 바이러스의 양에 대한 YB1 하향 조절과 AAV 제조의 상관관계, (a) shRNA 바이러스가 증가하는 경우 YB1 하향조절에 있어서의 약간의 증가 및 (b) 대조군 스크램블 및 천연의 293T 세포에 대한 상대적인 AAV2 게놈 역가, 및 50ml YB1-shRNA 바이러스로 처리된 생산자 세포에서 벡터 게놈 역가에 대한 최대 효과를 나타낸다. 대조군 시료는 비-포유동물 유전자를 타겟으로 하는 shRNA 서열을 가진 293T 세포(Scramble), LV 빈 입자가 있는 그러나 shRNA 서열이 없는 293T 세포(Mock) 및 어떠한 LV 및 shRNA 서열도 없는 천연의 293T 세포(293T)를 포함한다. 로딩 대조군으로 하우스키핑 유전자 GAPDH를 추가적으로 사용하였다.
도 8. NPM1을 타겟으로 하는 shRNA 서열의 면역블롯팅 분석. (a) shRNA N6 및 N9를 운반하는 생산자 세포에서 유의적인 유전자 넉다운이 관찰되었다. (b) 80일 이상 동안(c) 및 동결보존으로부터 회복된 후에 NPM1의 하향 조절이 유지되었다. 비-포유동물 유전자를 타겟으로 하는 shRNA가 있는 293T 세포(Scramble) 및 어떠한 shRNA 서열도 없는 293T 세포(293T)를 대조군으로 사용하였다. 로딩 대조군으로 하우스키핑 유전자 GAPDH를 추가적으로 사용하였다.
도 9. NCL을 타겟으로 하는 shRNA 서열의 면역블롯팅 분석. (a) shRNA N4를 운반하는 생산자 세포에서 유의적인 유전자 넉다운이 관찰되었다. (b) 80일 이상 동안 배양한 후에 NCL의 하향 조절이 유지되었다. 비-포유동물 유전자를 타겟으로 하는 shRNA가 있는 293T 세포(Scramble) 및 어떠한 shRNA 서열도 없는 293T 세포(293T)를 대조군으로 사용하였다. 로딩 대조군으로 하우스키핑 유전자 GAPDH를 추가적으로 사용하였다.
도 10. 대조군 shRNA 스크램블과 비교하여 NMP1 유전자 넉다운 세포에서 제조된 AAV의 벡터 게놈 역가, (a) AAV2에서 35배까지의 증가 및 (b) AAV8에서 30배까지의 증가를 나타낸다.
도 11. 대조군 shRNA 스크램블과 비교하여 NCL 유전자 넉다운 세포에서 제조된 AAV의 벡터 게놈 역가, AAV2 게놈 역가에 있어서 2-40배 증가 범위의 유의적인 편차(a), 및 벡터 역가에 대한 더 적은 상향조절 효과(AAV5에서 10배까지의 증가(b) 및 AAV8 게놈 역가(c)를 나타낸다.
도 12. CRISPR gRNA 서열을 사용한 YB1 유전자 넉아웃의 면역블롯팅 분석. CRISPR gRNA sjrdkdnt 세포의 두 집단(B1 및 B2)을 각각의 CRISPR gRNA 서열 A, B, C 또는 D에 대해서 제조하였다. 모 B1 및 B2 gRNA 생산자 세포로부터 단일 세포 클론을 추가적으로 유래하였다. 10 단일 세포 클론 전체에서 YB1 유전자 넉아웃을 관찰하였다. 어떠한 gRNA 서열도 없는 모 293T 세포(293T0를 대조군으로 사용하였다; 로딩 대조군으로 하우스키핑 유전자 GAPDH를 추가적으로 사용하였다.
도 13. Yrep 및 cap 발현 및 벡터 DNA 제조에 대한 YB1 넉다운 세포의 분자적 분석: (a) 일시적인 형질감염 후 각각 24 및 72시간(H)에 YB1 넉다운 세포에서 AAV2 Rep 발현에 있어서 12 및 4배의 증가를 나타내는 면역블롯팅; (b) 스크램블 세포와 비교하여 YB1 넉다운 세포 용해물에서 cap 발현에 있어 7배 감소를 나타내는 ELISA 및 YB1 및 스크램플세포로부터 수확한 벡터에서 검출된 비슷한 양의 Cap 단백질 및 (c) 스크램블 세포와 비교하여 YB1 넉다운 세포에서 전체 벡터 DNA에서 13× 증가, 패키징되지 않은 벡터 DNA에서 8× 증가, 및 패키징된 벡터 DNA에서 4× 증가를 나타내는 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR). 면역블롯팅에 대해 하우스키핑 유전자 GAPDH 또는 qPCR 분석에 대해 또는 qPCR 분석에 대해 세포 수에 의해서 표준화한 후 하우스키핑 유전자 액틴에 의해서 표준화한 후의 YB1 및 스크램블 사이의 Y:S 비율. +PK, 프로테나제 K 처리됨; -PK, 프로테나제 K 처리되지 않음; +DNaseI, DNAseI로 처리됨; S, 대조군 스크램블; Y, YB1 넉다운 세포.
도 14. Homo sapiens Y 박스 결합 단백질 1(YB1/YBX1) mRNA(서열번호 3) 및 아미노산(서열번호 29) 서열.
도 15. Homo sapiens 뉴클레오포스민(핵소체 인단백질 B23, 뉴마트린, NPM1)(cDNA 클론 MGC:22724 IMAGEL4081364), 전체 cds, mRNA(서열번호 1) 및 아미노산(서열번호 27) 서열.
도 16a 내지 도 16e. 인간 뉴클레오린 유전자, 전체 cds, mRNA(서열번호 2) 및 아미노산(서열번호 28) 서열.
아데노-부속 바이러스 벡터(Adeno-associated virus vector)
아데노-부속 바이러스(AAV)는 인간 및 일부 다른 영장류를 감염하는 작은 바이러스 패밀리이다. AAV는 파보비리대(Parvoviridae)과의 디펜도바이러스(Dependovirus)속에 속한다. AAV는 작은(약 20nm), 비-외피성, 복제-결핍 바이러스이다. AAV는 양 또는 음의 가닥 중 하나일 수 있는 약 4.7 kb 길이의 단일가닥의 선형 DNA 게놈을 갖는다.
AAV 게놈은 DNA 가닥의 양 말단에 ITR(inverted terminal repeat), 및 두 개의 ORF(open reading frame): rep 및 cap를 포함한다. 전자는 AAV 생활사에 필요한 Rep 단백질을 암호화하는 4 개의 중첩된 유전자로 구성되고, 후자는 상호작용하여 정20면체 대칭의 캡시드를 형성하는 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3의 중첩된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질에 대한 유전자는 일반적으로 p40으로 지정된, 단일 프로모터에 의해서 조절되고 세 유전자 모두는 단일 mRNA로부터 번역된다. VP1, VP2 및 VP3의 분자량은 일반적으로 각각 약 87, 72 및 62 kDa이다. AAV 캡시드 단백질은 일반적으로 AAV DNA 게놈 상에서 암호화된다.
인간 집단 내에서 AAV의 높은 혈청학적 유병률(약 80%의 인간이 AAV2에 대해 혈청학적으로 양성을 나타냄)에도 불구하고 바이러스는 어떤 인간 질병과도 연결되어 있지 않다. AAV 벡터는 분열중인 세포와 휴지기의 세포 모두를 감염할 수 있다. 바이러스는 숙주 세포의 게놈으로 삽입되지 않고 염색체외부 상태에서 유지될 수 있다. 대신, 바이러스는 인간 염색체 19의 특정한 위치(AAVS1)에서 숙주 세포 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다. 아데노바이러스와 대조적으로, AAV는 보통 그것으로 감염된 세포에 대해 면역 반응을 유발하지 않고, 따라서 근육 및 안구 질환을 위한 유전자치료에서의 뇌를 포함하는 관심 위치로 유전자를 전달할 수 있다. 이러한 특징은 유전자 치료, 및 질환 모델 개발을 위한 바이러스 벡터 제조에 있어 AAV를 매우 매력적인 후보로 만든다.
AAV 조립 및 제조 과정 중, AAV 벡터는 유전적 및 복종적으로, 다양한 세포성 단백질을 획득한다, 그러나 이러한 단백질의 특성은 이전에 매우 적게 특징화되어 있었다. 본 발명자들은 유전자 치료를 위한 AAV 벡터의 제조를 향상시키기 위해서 유전적으로 AAV 벡터와 연관된 숙주 단백질을 최초로 동정하고 특징화하였다. 특히, 본 발명자들은 AAV2, AAV5 및 AAV8로 지칭된 3개의 혈청형의 재조합 AAV를 조사하였고 AAV 벡터 제조에 있어 NPM1, NCL 및 YB1의 중요한 역할을 증명하였다. 액체 크로마토그래피-질량분석기(LC/MS/MS)를 사용해서, 본 발명자들은 NPM1, NCL 및 YB1을 포함하는 66개의 AAV와 연관된 인간 세포성 단백질을 동정하였다. NPM1, NCL 및/또는 YB1을 타겟으로 하고 각각의 유전자를 하향조절하고 AAV 역가를 증가시키는 shRNA 서열을 도입한다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 제조된 바이러스 역가를 증가시키는 AAV 벡터의 제조를 위한 신규한 제조 시스템을 제공한다. 또한 본 발명의 제조 시스템은 제조된 완전한 바이러스 벡터 입자:빈 바이러스 벡터 입자의 비율을 증가시킨다. 본 발명의 제조 시스템은 AAV 벡터의 제조에 적합할 뿐만 아니라 상기 생산자 세포주를 사용하는 AAV 벡터의 제조방법에 적합한 생산자 세포주를 포함한다.
또한 본 발명은 상기 제조 시스템, 생산자 세포주 및 방법에 의해서 제조된 AAV 벡터를 제공한다. 본 발명의 AAV 벡터가 고역가, 향상된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터 비율 및/또는 세포 단백질, 특히 AAV 벡터 내에서 생산자 세포주에서 유래한 단백질의 조절된 수준을 갖기 때문에, 일반적으로, 본 발명의 AAV 벡터는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해서 제조된 AAV 벡터와 상이하다.
본 발명에 따르면, 완전한 바이러스 벡터 입자는 개체에 전달하기 위한 페이로드(payload)를 포함하는 바이러스 벡터 입자이다. 일반적으로, 페이로드는 본원에 기술된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명에 따르면, 빈 바이러스 벡터 입자는 상기 페이로드가 결핍된 바이러스 벡터 입자이다. 일반적으로, 본 발명의 빈 바이러스 벡터 입자는 빈 AAV 캡시드 또는 단백질 외피이다.
본 발명의 AAV 벡터는 유전자 치료 및 다양한 영역에서의 유전자 증폭 및 변형의 방법에서 유용하게 사용될 수 있다. 벡터는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 자가-상보적 DNA를 포함하는, 하나 또는 그 이상의 치료적 뉴클레오티드 서열을 임의의 적절한 형태로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 질환 또는 질병의 치료 또는 예방에 유용한 치료적 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 또한 다른 방법, 예컨대 약물 개발 및 연구에 유용할 수 있다. 이러한 비-치료적 적용은 유도 만능 줄기세포(IPS)를 생성하기 위한 유전자 증폭 및 예컨대 shRNA, 종양 유전자 등을 전달하기 위한 전달을 포함한다.
AAV 벡터는 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 중 어느 하나일 수 있다. 바람직한 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5 또는 AAV8로부터 선택된다. 또한 임의의 두 개 또는 그 이상의 AAV 혈청형의 조합이 본 발명에 의해 제공된다. AAV 혈청형의 조합은 AAV2 및 AAV5; AAV5 및 AAV8; AAV2 및 AAV8; 또는 AAV2, AAV5 및 AAV8을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 아데노-부속 마이러스(AAV) 벡터의 집단을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 발명의 방법에 의해서 얻을 수 있는 AAV 벡터의 집단을 제공한다. 본 발명에 따르면, AAV 벡터의 집단은 본 발명의 AAV의 복수 카피로 정의될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터의 집단은 109 vg/ml 이상, 109 vg/ml 이상, 209vg/ml 이상, 309 vg/ml 이상, 409 vg/ml 이상, 509 vg/ml 이상, 1010 vg/ml 이상 또는 그 이상의 AAV 벡터 입자를 포함할 수 있다. 본 발명의 AAV 집단은 본 발명의 단일 유형의 AAV 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 집단은 단일 혈청형의 AAV 벡터를 포함할 수 있고, 단일 페이로드(예를 들어 하나의 약물)를 포함할 수 있다. AAV 집단은 하나 또는 그 이상의 배치 또는 하나 또는 그 이상의 제조 사이클 내에서 제조될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터의 캡시드는 본원의 표 2에 열거된 단백질의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 AAV 벡터의 캡시드는 본원에 기술된 바와 같이 YB1, NPM1 및 NCL의 임의의 조합을 포함한다. 또한 상기 캡시드는 4개 또는 그 이상의 조사된 AAV 혈청형에 의해 공유되는 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질은 이미 AAV 내에서 기능을 갖는 것으로 알려진 것일 수도 있고, 또는 본원에서 AAV와 연관되어 있음이 최초로 알려진 것일 수 있다. 일반적으로 NPM1, NCL 및 YB1 중 하나 이상에 더하여 조절된 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질은 hnRNPK(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K), 단일-가닥 DNA 결합 단백질 1, CypA(nascent polypeptide-associated complex alpha subunit), 펩티딜-프롤릴- 시스-트랜스 이성질화효소, 알파-에놀라아제, 아넥신 A5, RuVB like 1 및 like 2로부터 선택된다.
본 발명의 AAV 벡터와 관련하여 본원에 기술된 임의의 것은 또한 본 발명의 AAV 벡터 집단에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 AAV 벡터 집단 내에서 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 바람직하게, 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 본 발명의 AAV 벡터 집단 내에서 완전한 AAV 벡터 입자:빈 AAV 벡터 입자의 비율을 50% 이상 증가시킨다. 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절에 의한 결과인 바이러스 역가에 있어의 임의의 증가는 본원에 기술된 바와 같은 대조군 방법으로부터 얻은 바이러스 역가와 비교할 수 있다. 대조군 방법은 AAV 벡터 제조 분야에 공지된 임의의 표준 방법일 수 있다. 예를 들어, 대조군 방법은 본 발명에 따라 적용되지 않은 생산자 세포주를 사용할 수 있다. 이러한 대조군/표준 방법에 의해서 제조된 AAV 벡터 및 AAV 벡터 집단은 본원에 기술된 바와 같이 대조군 벡터 및 집단으로서 사용될 수 있다.
당 분야에 공지된 표준 방법은 제조된 AAV 벡터의 100% 까지가 빈 것이거나, 또는 완전한 AAV 벡터보다 빈 AAV 벡터가 100배 이상인, AAV 벡터 집단을 제조할 수 있다. 추가적인 과정에도 불구하고, 표준 방법은 20% 이상의 AAV 벡터가 빈 것인 AAV 벡터 집단을 제조한다. 본 발명의 방법은 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 100% 까지의 AAV 벡터 집단이 완전한 AAV 벡터 집단을 제조할 수 있다(즉, 제조된 AAV 벡터의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0% 까지가 빈 벡터). 본 발명의 방법은 완전한 AAV 벡터의 수와 비교하여 50배 이하, 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하, 또는 그 이하의 빈 벡터가 있는 AAV 벡터 집단을 제조할 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터 집단 내에서 AAV 벡터 입자의 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 전부까지 및 전부를 포함하는 AAV 벡터 입자가 표 2에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 캡시드를 가질 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 AAV 벡터 집단 내에서 50% 이상의 AAV 입자가 표 2에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 캡시드를 갖는다. 바람직하게 하나 이상의 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 YB1, NPM1 및/또는 NCL 중 하나 또는 그 이상이고, 더욱 바람직하게 AAV 벡터 입자의 50% 이상은 YB1을 포함하는 캡시드를 갖고, 더더욱 바람직하게 AAV 벡터 입자의 50% 이상은 YB1, NPM1 및 NCL을 포함하는 캡시드를 갖는다.
본 발명의 AAV 벡터 또는 AAV 벡터 집단 내 AAV 벡터의 캡시드 내에서 표 2에 열거된 하나 이상의 단백질의 양은 대조군 AAV 벡터 집단 내 대조군 AAV 벡터의 캡시드 내에서 또는 AAV 벡터의 캡시드 내에서의 상기 하나 이상의 단백질의 양과 비교하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단백질의 양은 대조군 AAV 벡터 집단 내 대조군 AAV 벡터의 캡시드 내에서 또는 AAV 벡터의 캡시드 내에서 하나 이상의 단백질의 양과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 또는 그 이상 차이가 있을 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 단백질의 증가 또는 감소일 수 있다. 복수의 단백질이 대조군에 비하여 변형되는 경우, 대조군에 비하여 모든 것이 감소, 일부가 감소되고 나머지가 증가, 또는 모든 것이 증가될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터 집단 내 AAV 벡터의 캡시드 내에서 표 2에 열거된 임의의 단백질의 존재 및/또는 양은 임의의 표준 기술을 사용하여 결정 및/또는 정량될 수 있다. 본 발명에 따른 생산자 세포주 내에서 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 변형에 의한 결과인 표 2에 열거된 임의의 단백질의 존재 및/또는 양의 임의의 증가는 본원에 기술된 바와 같은 대조군 방법으로부터 얻은 AAV 벡터 집단 내에서 AAV 벡터의 캡시드 내 표 2에 열거된 임의의 단백질의 존재 및/또는 양과 비교될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터 또는 AAV 벡터 집단은 대조군 AAV 벡터 또는 AAV 벡터 집단과 비교하여 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상 또는 그 이상으로 증가된 역가를 가질 수 있다. 바람직하게, AAV 벡터 또는 AAV 벡터 집단의 역가는 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 증가될 수 있다. AAV 벡터 또는 AAV 벡터 집단 역가는 대조군 AAV 벡터 또는 AAV 벡터 집단의 역가와, 또는 본원에 기술된 바와 같은 대조군 방법으로부터 얻은 바이러스 역가와 비교할 수 있다.
아데노-부속 바이러스 벡터의 제조방법
본 발명은 AAV 벡터를 제조하기 위해 사용되는 생산자 세포주에서 특정 유전자 및/또는 단백질의 발현 조절이 상기 생산자 세포주로부터 제조된 바이러스 벡터의 역가에 영향을 줄 수 있다는 것을 최초로 나타낸다. AAV 벡터를 제조하기 위해 사용되는 생산자 세포주에서 특정 유전자 및/또는 단백질의 발현 조절은 또한 상기 생산자 세포주로부터 제조된 완전한 바이러스 벡터 입자:빈 바이러스 벡터 입자의 비율을 증가시킬 수 있다. AAV 벡터를 제조하기 위해 사용되는 생산자 세포에서 특정 유전자 및/또는 단백질의 발현 조절은 또한 AAV 벡터 캡시드 내의 단백질, 특히 생산자 세포주로부터 유래한 단백질의 존재 및/또는 양을 변형할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 제조되는 바이러스 역가를 증가시키는 AAV 벡터의 제조를 위한 신규한 제조 시스템을 제공한다. 또한 본 발명의 제조 시스템은 제조된 완전한 바이러스 벡터 입자:빈 바이러스 벡터 입자의 비율을 증가시킬 수 있다. 또한 본 발명의 제조 시스템은 AAV 벡터 캡시드 내의 단백질, 특히 생산자 세포주로부터 유래한 단백질의 존재 및/또는 양을 변형할 수 있다. 본 발명의 제조 시스템은 AAV 벡터의 제조에 적합한 생산자 세포주뿐만 아니라, 상기 생산자 세포주를 사용하는 AAV 벡터의 제조방법을 포함한다. 또한 본 발명은 상기 제조 시스템, 생산자 세포주 및 방법에 의해서 제조된 AAV 벡터를 제공한다.
따라서, 본 발명은 생산자 세포주 내에서 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 AAV 벡터의 제조방법을 제공한다.
조절은 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현의 증가 또는 저하(감소)일 수 있다. 복수의 유전자 및/또는 단백질이 조절되는 경우, 모든 유전자/단백질이 증가될 수 있고, 또는 모든 유전자/단백질이 감소될 수 있고, 또는 하나 또는 그 이상의 유전자/단백질이 증가될 수 있고 나머지의 유전자/단백질이 감소될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조절은 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현의 감소이다.
생산자 세포주 내에서 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 증가 또는 감소되는지, 조절은 대조군과 비교해서 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 생산자 세포주 내에서 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현은 대조군 내에서 상기 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현과 비교할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 실제 양, 예컨대 본 발명의 생산자 세포주 및 대조군 내 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 질량, 몰량, 농도 또는 몰 농도는 측정되고 대조군으로부터의 대응하는 값과 비교할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 생산자 세포주 내의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현은 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 질량, 몰량, 농도 또는 몰 농도의 정량 없이 대조군의 것과 비교할 수 있다.
일반적으로, 대조군은 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절이 영향받지 않은 동일한 생산자 세포주이다. 예를 들어, 본 발명의 생산자 세포주가 YB1 발현이 감소된 유전자 변형 세포주인 경우, 적절한 대조군은 YB1 발현이 변형되지 않은 동일한 세포주이다. 이러한 대조군 세포주는 야생형 세포주일 수 있다. 본 발명에 따른 대조군 방법은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 대조군 생산자 세포주를 사용한다. 공지된 방법을 포함하는 AVV의 제조 방법에 대한 관습적인 방법은 본 발명에 따른 대조군 방법으로 고려될 수 있다.
본 발명의 생산자 세포주 내에서 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현은 대조군과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 또는 그 이상으로 상이할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 생산자 세포주 내의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 대조군과 비교하여 감소된 경우, 발현은 대조군과 비교하여 부분적으로 또는 전체적으로 감소될 수 있다. 일반적으로 발현은 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질 발현의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 전제 제거(넉아웃)까지 감소된다.
본 발명의 생산자 세포주 내의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 대조군에 비해서 증가된 경우, 발현은 대조군에 비해서 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90& 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상으로 증가할 수 있다.
본 발명의 생산자 세포주 내의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현은 정량적 및/또는 정성적 분석법에 의해서 결정될 수 있다. 일반적으로, 유전자 발현은 mRNA 수준의 관점에서 표현될 수 있다.
본 발명의 생산자 세포주 내의 하나/또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 수준은 하나/또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 질량, 하나/또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 몰량, 하나/또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 농도 및 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 몰농도를 포함한다. 이러한 발현 수준은 임의의 적절한 단위로 주어질 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 농도는 pg/ml, ng/ml 또는 μg/ml로 주어질 수 있다.
본 발명의 생산자 세포주 내의 하나/또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 수준은 직접적으로 또는 간접적으로 측정될 수 있다.
대조군에 대한 본 발명의 생산자 세포주 내의 하나 또는 그 이상의 조절된 유전자 및/또는 단백질의 상대적인 발현은 임의의 적절한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 적절한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 웨스턴 블롯팅 및 ELISA이다.
조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 수준은 대조군과 비교하여 12시간 이상, 24시간 이상, 30시간 이상, 48시간 이상, 72시간 이상, 96시간 이상, 120시간 이상, 144시간 이상, 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 11주 이상, 12주 이상, 13주 이상, 14주 이상, 15주 이상 또는 그 이상으로 변화될 수 있다.
조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 수준은 대조군과 비교하여 배양에서 생산자 세포주의 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상 또는 그 이상의 계대에서 변화될 수 있다. 조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현 수준은 무제한적으로 변화될 수 있다.
조절된 유전자 및/또는 단백질
본 발명자들은 AAV의 캡시드 내에 포함된 비-바이러스성 단백질의 체계적인 분석을 최초로 수행하였고, 캡시드 또는 하나 또는 그 이상의 AAV 혈청형 2, 5 및 8 내에서 발견된 66개의 단백질을 동정하였다. 이러한 단백질은 본원의 표 2에서 동정하였다. 일반적으로 이러한 비-바이러스성 단백질은 AAV 벡터 입자가 생성된 생산자 세포주로부터 유래된다.
생산자 세포주 내에서 하나 또는 그 이상의 이러한 66개의 단백질의 발현 조절은 상기 생산자 세포주로부터 제조되는 AAV 벡터의 역가를 증가시키는 데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 표 2에 열거된 하나 이상의 단백질의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 AAV 벡터의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 DNA 결합 단백질인 표 2에 열거된 하나 이상의 단백질의 발현을 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가하여, 본 발명의 방법은 DNA 결합 단백질이 아닌 표 2에 열거된 하나 이상의 단백질의 발현을 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 표 2에 열거된 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 모든 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
표 2에 열거된 단백질 중, 일부는 DNA에 결합하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, NPM1(뉴클레오포스민, 핵소체 인단백질(nucleolar phosphoprotein) B23 및 뉴마트린으로도 알려져 있음), NCL 및 YB1은 모두 DNA 및/또는 RNA에 결합한다.
NPM1은 핵소체 인단백질 구조에 결합하고 단일 및 이중-가닥 DNA 모두에 결합한다. 인간 NPM1 유전자의 지노믹 DNA 서열은 서열번호 1(Genbank Accession No. BC016768, 버전 BC016768.1 GI:16876991)에 제시되어 있다. NPM1은 일반적으로 핵에 위치하지만, 일부 환경에서는 핵질로 이동할 수 있다.
NCL 유전자는 인단백질 뉴클레오린(nucleeolin)을 암호화한다. 뉴클레오린은 리보좀의 합성 및 성숙과 연관된 DNA 결합 단백질이다. NCL 단백질에 대한 본원의 임의의 참고문헌은 뉴클레오린에 대한 참고문헌으로 이해될 수 있다. 인간 NCL 유전자의 지노믹 DNA 서열은 서열번호 2(Genbank Accession No. M60858, 버전 M60858.1 GI:189305)에 제시되어 있다.
YB1 유전자는 Y 박스 결합 단백질 1(Y 박스 전사 인자 및 nuclease sensitive element binding protein 1로도 알려져 있음)을 암호화한다. 인간 YB1 유전자의 지노믹 DNA 서열은 서열번호 3(Genbank Accession No. NM_004559.3, 버전 NM_004559.3 GI:109134359)에 제시되어 있다. YB1 단백질에 대한 본원의 임의의 참고문헌은 Y 박스 결합 단백질 1에 대한 참고문헌으로 이해될 수 있다. YB1은 많은 DNA 및 mRNA 의존성 과정에 관여된 DNA 및 RNA 결합 단백질이다. YB1은 mRNA를 패킹하고 안정화시키며 다른 수준에서 유전자 조절에 관여한다.
아데노단백질(adenoprotein) E1B는 YB1과 상호작용 하는 것으로 알려져 있고, 세포 핵에서 YB1 축적 및 아데노바이러스 유전자 E2A의 활성화를 야기하는 것으로 나타났다. YB1의 과발현은 E1-비의존적 방식으로 아데노바이러스 E2 프로모터를 조절하고, 아데노바이러스 DNA 복제를 증가시키고 E1이 제거된 아데노바이러스 벡터로부터 유래한 감염성 바이러스 입자의 생성을 증가시키는 것으로 나타났다. 결과적으로, YB1의 과발현은 아데노바이러스-기반 벡터 개발 및 바이로테라피(virotherapy)에서 개발될 수 있다.
그러나, 본원의 실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명자들은 YB1의 넉아웃이 AAV 벡터 역가의 증가를 야기하는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은 생산자 세포 내에서 YB1 발현의 하향조절이 AAV rep 발현의 증가, AAV 벡터 DNA 생성 및 AAV cap 발현의 감소를 야기하는 것을 증명했다. 이론에 의해 제한되기를 바라지 않으며, 생산자 세포주에서 유래한 DNA 결합 단백질, 예컨대 YB1, NPM1 및 NCL이 DNA에 결합, 특히 단일-가닥 DNA(ssDNA)에 결합하기 위해 아데노바이러스 구성요소와 경쟁하는 것으로 생각된다. 이러한 아데노바이러스 구성요소는 바이러스 복제를 위해 요구되는 초기 기능 단백질인, 아데노단백질 E2a 및 E4, 및 DNA에 결합하기 위해 바이러스 mRNA의 번역을 조절함으로써 번역되지 않는 작은 RNA 분자를 암호화하는 아데노바이러스 게놈 부위인, VA를 포함한다. E4 부위의 ORF6은 단일-가닥 AAV 게놈의 DNA 복제에서 후속 단계를 위한 기질인 이중-가닥 형태로의 전환에 있어 중요하다. 단백질 E2A는 AAV 바이러스 DNA에 결합, DNA 신장 및 이의 주형으로부터 신장되는 가닥의 이동의 촉진을 통해 바이러스 DNA 복제에서 중요한 역할을 수행한다.
아데노바이러스 구성요소, 예컨대 E2a, E4 및 VA는 AAV 벡터 입자 제조에 필요하고, DNA에 결합하기 위해 이러한 아데노바이러스 구성요소와 경쟁함으로써, 생산자 세포 DNA 결합 단백질은 AAV 벡터 입자 제조를 감소시킬 수 있다. 따라서, 이론에 제한되지 않고, 생산자 세포주 DNA 결합 단백질, 예컨대 NPM1, NCL 및 YB1의 발현 감소는 이러한 생산자 세포주 DNA 결합 단백질과 E2A가 AAV DNA에 결합하기 위해 경쟁하는 것을 감소시키고, 결과적으로 E2A-AAV DNA 상호작용, AAV DNA 복제의 향상을 야기하며 궁극적으로 AAV 벡터 게놈 역가가 증가한다.
프로모터의 ssDNA 부위에 대한 YB1의 결합은 유전자 전사 및 번역이 또한 억제된 ssDNA의 안정화를 야기하는 것으로 나타났다. 따라서, YB1(또는 또다른 생산자 세포 DNA 결합 단백질 예컨대 NPM1 또는 NCL)의 하향 조절이 상승작용에 의해 AAV2 및 AAV8 역가의 향상에 기여하는 E2A의 AAV2p5 프로모터에 대한 결합을 촉진할 가능성이 있다(본 발명자들에 의해 관찰된 바에 따른다).
따라서, 일반적으로 본 발명의 방법은 NPM1, NCL 및 YB1 중 하나 이상의 발현을 조절하는 단계를 포함한다. 일반적으로 본 발명의 방법은 YB1의 발현을 조절하는 단계를 포함한다. NPM1, NCL 및 YB1의 조합이 조절된 방법 또한 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 (i) NPM1 및 NCL; (ⅱ) NPM1 및 YB1; (ⅲ) NCL 및 YB1; 또는 (ⅳ) NPM1, NCL 및 YB1:의 발현을 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 YB1, NPM1 및 NCL의 발현을 조절하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 NPM1, NCL 및 YB1의 발현을 감소시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 본 발명의 방법은 YB1의 발현을 감소시키는 단계를 포함한다. NPM1, NCL 및 YB1의 조합이 감소된 방법 또한 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 (i) NPM1 및 NCL; (ⅱ) NPM1 및 YB1; (ⅲ) NCL 및 YB1; 또는 (ⅳ) NPM1, NCL 및 YB1의 발현을 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 YB1, NPM1 및 NCL의 발현을 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 생산자 세포주 내의 하나 또는 그 이상의 추가적인 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 생산자 세포주 내의 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 추가적인 단백질의 발현을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 조절되는 추가적인 단백질은 DNA 결합 단백질일 수 있다. 본 발명에 따라 조절되는 추가적인 단백질은 DNA 결합 외의 기능을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 생산자 세포주 내에서 다른 기능을 갖고, 하나 이상은 DNA 결합 단백질인, 두 개 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절과 연관된다. 본 발명의 방법은 생산자 세포주 내에서 NPM1, NCL 및 YB1 중 하나 이상의 발현을 조절하는 단계 및 하나 또는 그 이상의 추가적인 유전자 및/또는 단백질의 조절과 연관되며, 여기서 하나 또는 그 이상의 추가적인 유전자 및/또는 단백질은 표 2에 열거되어 있다.
본 발명의 방법은 본원에 기술된 바와 같은 NPM1, NCL 및 YB1의 임의의 조합의 발현을 조절하는 단계를 포함할 수 있고, 또한 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 표 2의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질은 조사된 4개 또는 그 이상의 AAV 혈청형에 의해 공유된다. 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질은 이미 AAV 내에서 기능을 갖는 것으로 알려진 것일 수도 있고, 또는 본원에서 AAV와 연관되어 있음이 최초로 알려진 것일 수 있다. 일반적으로 NPM1, NCL 및 YB1중 어느 하나 이상에 더하여 조절된 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질은 hnRNPK(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K), 단일-가닥 DNA 결합 단백질 1, CypA(nascent polypeptide-associated complex alpha subunit), 펩티딜-프롤릴-시스-트랜스 이성질화효소, 알파-에놀라아제, 아넥신 A5, RuVB like 1 및 like 2로부터 선택된다.
본 발명에 따라 조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질은 임의의 적절한 방법에 의해서 조절될 수 있다. 적절한 표준 기술이 당업계에 공지되어 있다. 조절은 예를 들어 사용되는 조절자(modulator)의 특성(하기 참조), 예컨대 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 임의의 직접적 또는 간접적 상호작용 또는 조절에서의 입체적 방해에 의존하는, 임의의 적절한 메커니즘을 통해 일어날 수 있다.
본 발명의 조절자는 조절되는 유전자 또는 단백질에 대해 특이적일 수 있다. 구체적으로, 조절자는, 임의의 다른 분자, 특히 임의의 다른 단백질에 대해 중요한 상호 반응성 없이, 조절되는 유전자 또는 단백질, 예컨대 YB1, NPM1 또는 NCL 유전자에 결합하는 것으로 이해된다. 예를 들어, NPM1에 특이적인 조절자는 인간 뉴트로필 엘라스타제(neutrophil elastase)와 중요한 상호 반응성을 나타내지 않는다. 상호 반응성은 임의의 적절한 방법에 의해서 측정될 수 있다. 다른 유전자 또는 단백질 분자로 조절되는 유전자 또는 단백질에 대한 조절자의 상호 반응성은 조절자가 조절되는 유전자 또는 단백질에 대한 결합의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상 또는 100%만큼 강하게 다른 분자에 결합하는 경우 중요한 것으로 고려된다. 조절되는 유전자 또는 단백질에 특이적인 조절자는 또다른 분자 예컨대 인간 뉴트로필 엘라스타제에 그것이 조절되는 유전자 또는 단백질에 대한 결합의 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 이하로 결합할 수 있다. 바람직하게, 조절자는 조절되는 유전자 또는 단백질에 대한 결합의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하, 2% 또는 1% 이하의 세기로 다른 분자에 결합한다.
임의의 적절한 조절자가 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 예를 들어 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetics), 항체, 소분자 저해제, 이중-가닥 RNA, 안티센스(단일가닥) RNA, 앱타머 및 리보자임이다. 전사 및 전사후 유전자 사일런싱 기술이 하나 또는 그 이상의 본 발명의 유전자를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한 전사후 유전자 사일런싱은 RNA 간섭(RNAi)으로 알려져 있다. 바람직한 구현예에서, 조절은 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 게놈 편집(editing)에 의해서 수행되고, 이는 일반적으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용된다. 바람직하게 길항제는 이중-가닥 RNA 및 키메릭 가이드 RNA 전사체(gRNA)를 포함한다. gRNA는 CRISPR 게놈 편집 도중 관심 유전자에 구성된 박테리아 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 엔도뉴클레아제(일반적으로 CRISPR 연관된 뉴클레아제(Cas), 예컨대 Cas9)와 함께 결합한다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자는 동일한 분류의 조절자, 또는 다른 조절자의 사용에 의해서 조절될 수 있다. 비제한적인 예로서, YB1, NPM1 및/또는 NCL은 모두 CRISPR 게놈 편집을 사용해서 조절될 수 있고; 또는 YB1은 CRISPR 게놈 편집에 의해서 및 NPM1 및/또는 NCL은 shRNA를 사용해서 조절될 수 있다.
이중-가닥 RNA
이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자는 생산자 세포주 내 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, dsRNA는 본원에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용된다. dsRNA 분자는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자를 조절하기 위한 RNAi에 사용될 수 있다.
공지된 기술의 사용 및 조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자의 서열의 공지에 기초하여, dsRNA 분자는 대응되는 RNA 서열의 서열 상동성에 기초한 타겟팅에 의해서 하나 또는 그 이상의 유전자를 길항하기 위해 설계될 수 있다. 이러한 dsRNA는 일반적으로 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA, 또는 마이크로-RNA(miRNA)이다. 이러한 dsRNA의 서열은 조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자를 암호화하는 mRNA의 부분에 대응하는 부분을 포함할 수 있다. 이러한 부분은 하나 또는 그 이상의 유전자로부터 번역된 mRNA 내의 타겟 부분에 대해 보통 100% 상동적이지만, 더 낮은 수준의 상동성(예컨대 90% 이상 또는 95% 이상) 또한 사용될 수 있다. 일반적으로 % 상동성은 인접한 핵산 잔기의 길이로 결정된다. 본 발명의 dsRNA 분자는, 예를 들어, dsRNA 분자의 전체 서열로 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 또는 그 이상의 핵산 잔기에 걸쳐 측정된 하나 또는 그 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA 내의 타겟 부분에 대해 80% 이상, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA에 80% 이상의 상동성을 갖는 dsRNA 분자까지 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, dsRNA는 shRNA이다. shRNA는 임의의 적절한 방법에 의해서 본 발명의 생산자 세포주로 전달될 수 있다. 적절한 방법은 당업계에 공지되어 있고 shRNA를 생산자 세포주로 전달하기 위한 플라스미드, 바이러스 및 박테리아 벡터의 사용을 포함한다. 일반적으로, shRNA는 바이러스 벡터 전달 시스템을 사용하여 전달된다. 바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일반적으로, shRNA가 생산자 세포로 전달되면, 이후 핵 내에서 전사가 진행된다. 그 결과인 pre-shRNA가 핵으로부터 방출된 후 다이서(dicer)에 의해 프로세싱되고 RISC(RNA-induced silencing complex)에 로딩된다. 센스(패신저) 가닥은 분해된다. 안티센스(가이드) 가닥은 RISC에서 상보적인 서열을 갖는 mRNA로 향한다. 완전한 상보성의 경우, RISC는 mRNA를 절단한다. 완전하지 않은 상보성의 경우, RICS는 mRNA의 번역을 억제한다. 이러한 경우 모두에서, shRNA는 타겟 유전자 사일런싱을 유도한다.
shRNA는 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용된다. 복수의 shRNA가 표 2에 열거된 임의의 1 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, shRNA는 YB1, NPM1 및/또는 NCL 및/또는 YB1 중 하나 이상의 발현을 조절하기 위해 사용된다. 복수의 shRNA가 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
YB1 발현을 조절하기 위해 사용되는 shRNA는 서열번호 14 내지 서열번호 18(Y1 내지 Y5)로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 서열번호 14 내지 서열번호 18로부터 선택된 복수의 shRNA, 또는 이의 변이체는 YB1 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, YB1 발현을 조절하기 위해 사용되는 shRNA는 서열번호 17 및/또는 서열번호 18(YB1-Y4 및 Y5) 또는 이의 변이체이다.
NPM1 발현을 조절하기 위해서 사용되는 shRNA는 서열번호 4 내지 서열번호 8(NPM-N6 내지 NPM-N10)로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 서열번호 4 내지 서열번호 8로부터 선택된 복수의 shRNA, 또는 이의 변이체는 NPM1 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, NPM1 발현을 조절하기 위해 사용된 shRNA는 서열번호 4 및/또는 서열번호 7(NPM-N6 및 N9) 또는 이의 변이체이다.
NCL 발현을 조절하기 위해서 사용된 shRNA는 서열번호 9 내지 서열번호 13(NCL-C1 내지 NCL-N5)로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 서열번호 9 내지 서열번호 13로부터 선택된 복수의 shRNA, 또는 이의 변이체는 NCL 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, NCL 발현을 조절하기 위해 사용된 shRNA는 서열번호 9 및/또는 서열번호 12(NCL-N1 및 N4) 또는 이의 변이체이다.
NPM-N6 내지 N10, NCL-N1 내지 N5 및 YB1-Y1 내지 Y5(서열번호 4 내지 서열번호 18)의 서열은 하기의 표 1에 나타내었다.
서열번호 14 내지 18(YB1-Y1 내지 YB1-Y5), 서열번호 4 내지 서열번호 8(NPM-N6 내지 NPM-N10) 및 서열번호 9 내지 서열번호 13(NCL-N1 내지 NCL-N5), 또는 이의 변이체의 shRNA의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
변이체 서열은, 임의의 적절한 길이의 서열로 측정된, 본 발명의 서열에 대해 80%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일반적으로 % 서열 동일성은 인접한 핵산 또는 아미노산 잔기의 길이로 결정된다. 본 발명의 변이체 서열은 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 또는 그 이상의 핵산 또는 아미노산 잔기로 측정된다.
예를 들어, 본 발명의 변이체 shRNA 분자는, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상 또는 그 이상의 핵산 잔기로 측정된, 본 발명의 shRNA 분자와 80% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고, 변이체 shRNA 분자의 전체 길이에 걸쳐 본 발명의 shRNA 분자와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체 shRNA 분자일 수 있다. 일반적으로 본 발명의 변이체 shRNA 분자는 하나 또는 그 이상의 서열번호 4 내지 18의 shRNA 분자의 변이체이다.
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CRISPR 게놈 편집(CRISPR genome editing)
게놈 편집을 위한 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템은 일반적으로 두 개의 특징적인 구성요소를 포함한다: (1) 가이드 RNA(guide RNA) 및 (2) 엔도뉴클레아제, 구체적으로 CRISPR 연관된 (Cas) 뉴클레아제, 예컨대 Cas9. 가이드 RNA는 단일 키메릭 가이드 RNA(gRNA) 전사체로 들어간 내인성 박테리아 crRNA 및 tracrRNA의 조합이다. gRNA 및 Cas가 세포 내에서 발현되는 경우, 게놈의 타겟 서열이 변형되거나 영구적으로 파괴될 수 있다.
gRNA/Cas 복합체는 gRNA 서열과 지노믹 DNA 내의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자 내의 타겟 서열에 대한 상보 서열 사이의 염기쌍 형성에 의해서 타겟 서열로 구성된다. Cas의 성공적인 결합을 위해서, 게놈의 타겟 서열 또한 타겟 서열 직후에 PAM(Protospacer Adjacent Motiff) 서열을 포함해야 한다. 야생형 Cas가 이중 가닥의 단절을 유발하는 DNA의 두 가닥 모두를 절단할 수 있도록 gRNA/Cas 복합체의 결합은 Cas가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자 내의 게놈의 타겟 서열로 이동하게 한다. 이는 일반적인 두 회복 경로: (1) 비-상동성 말단 접합 DNA 회복 경로 또는 (2) 상동성에 의한 회복 경로 중 하나를 통해서 회복될 수 있다. 비-상동성 회복 경로는 종종 이중 가닥 단절에 프레임시프트(frameshift) 및/또는 이른 종결 코돈을 유도하는 삽입/결실을 야기하고, 효과적으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자의 ORF를 중단시킨다. 상동성에 의한 회복 경로는 이중 가닥 단절을 고치기 위해 필요한 회복 주형의 존재가 요구된다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자를 조절하는 것이 제공되는 본 발명에 따라 임의의 적절한 gRNA 쌍이 CRISPR 게놈 편집에 사용될 수 있다. 일반적으로 gRNA 쌍은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 감소시키기 위해서 사용된다. 바람직하게 임의의 적절한 gRNA 쌍이 YB1, NPM1 및/또는 NCL, 더욱 바람직하게는 YB1의 발현을 조절(일반적으로 감소, 바람직하게는 제거/넉아웃)하기 위해 사용된다.
gRNA 쌍은 공지된 기술을 사용해서 설계될 수 있고 조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자의 서열의 공지, 일반적으로는 적절한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 CRISPR/Cas9 프로그램(http://chopchop.re.fas.harvard.edu/)의 사용에 기초할 수 있다. 예를 들어, YB1을 조절하기 위한 gRNA는 CRISPR/Cas9 프로그램(http://chopchop.re.fas.harvard.edu/)을 사용하여 그리고 YB1 유전자 서열을 포함하는 전체 Homo sapiens 염색체 1 서열(Accession number NC_000001.11)을 타겟으로 하여 설계될 수 있다. 넉아웃 생산자 세포는 당업계에 공지된 기술 및 상업적으로 사용 가능한 적절한 키트와 함께 임의의 적절한 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
gRNA 쌍은 임의의 적절한 방법에 의해서 본 발명의 생산자 세포주로 전달될 수 있다. 적절한 기술은 당업계에 공지되어 있고 gRNA 쌍을 생산자 세포주로 전달하기 위한 플라스미드, 바이러스 및 박테리아 벡터의 사용을 포함한다. 일반적으로, gRNA 쌍은 플라스미드 DNA를 사용하여 전달된다.
gRNA 쌍은 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위해서 사용될 수 있다. 복수의 gRNA 쌍이 표 2에 열거된 임의의 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위해서 사용될 수 있다. 일반적으로, gRNA 쌍은 YB1, NPM1 및/또는 NCL 및/또는 YB1 중 하나 이상의 발현을 조절하기 위해 사용된다. 복수의 gRNA 쌍은 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현을 조절하기 위해서 사용될 수 있다.
YB1 발현을 조절하기 위해서 사용되는 gRNA 쌍은 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 서열번호 37 및 서열번호 38; 및/또는 서열번호 39 및 서열번호 40, 또는 이의 변이체로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 쌍을 포함할 수 있다. 복수의 gRNA 쌍은 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 서열번호 37 및 서열번호 38; 서열번호 39 및 서열번호 40, 또는 이의 변이체로부터 선택되고, YB1 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다.
변이체 서열은, 임의의 적절한 서열의 길이로 측정된, 본 발명의 서열에 대해서 80% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일반적으로 % 서열 동일성은 인접한 핵산 또는 아미노산 잔기의 길이로 정해진다. 본 발명의 변이체 gRNA 서열은, 예를 들어, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 또는 그 이상의 핵산 잔기에 걸쳐 측정된 본 발명의 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고, 변이체 gRNA 분자의 전체 길이에 걸쳐 본 발명의 shRNA 분자와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체 gRNA 분자일 수 있다. 일반적으로 본 발명의 변이체 gRNA 분자는 하나 또는 그 이상의 서열번호 33 내지 서열번호 40의 gRNA 분자의 변이체이다. 본 발명의 gRNA 쌍은 본원에 개시된 하나 또는 두 개의 gRNA 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 33 및 서열번호 34의 gRNA 쌍의 변이체는 서열번호 33의 변이체, 서열번호 34의 변이체 또는 서열번호 33 및 서열번호 34의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 원리는 본원에 개시된 모든 gRNA 쌍에 적용된다.
안티센스 RNA
안티센스 RNA로도 알려진 단일-가닥 DNA(ssDNA) 분자는 생산자 세포주 내의 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 안티센스 RNA는 본원에 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용된다.
공지된 기술을 사용해서 그리고 조절되는 하나 또는 그 이상의 유전자의 공지된 서열에 기초해서, 안티센스 RNA 분자는 대응하는 RNA의 서열 상동성에 기초한 타겟팅에 의해서 하나 또는 그 이상의 유전자를 길항하기 위해 설계될 수 있다. 이러한 안티센스의 서열은 하나 또는 그 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA의 부분에 대응하는 부분을 포함할 수 있다. 이러한 부분은 보통 전사된 mRNA 내의 타겟 부분에 대해 100% 상동성을 가지지만 더 낮은 수준의 상동성(예컨대 90% 이상 또는 95% 이상) 또한 사용될 수 있다.
앱타머
일반적으로 앱타머는 특정한 타겟 분자에 결합하는 핵산 분자이다. 앱타머는 완전히 인 비트로에서 설계될 수 있고, 화학적 합성에 의해서 미리 제조될 수 있고, 바람직한 저장 특성을 가지며, 치료적 적용에 있어 면역원성을 유도하지 않거나 거의 유도하지 않는다. 이러한 특성은 그들을 약학적 및 치료적 사용에 있어서 특히 유용하게 만든다.
본원에 사용된 바와 같이, “앱타머”는 일반적으로 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 뉴클레오티드의 혼합물을 지칭하고, 여기서 올리고뉴클레오티드 또는 혼합물은 타겟에 특이적으로 결합할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 앱타머는 여기서 논의될 수 있으나, 당업자는 동등한 결합 특성을 갖는 다른 앱타머, 예컨대 펩티드 앱타머 또한 사용될 수 있음을 인정할 것이다.
일반적으로, 앱타머는 5 이상, 10 이상 또는 15 이상의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 앱타머는 40까지, 60까지 또는 100까지 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 앱타머는 5 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 40 뉴클레오티드, 또는 15 내지 40 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 보통 다른 분자 또는 물질에 의해서 적은 간섭이 유도될 수 있으므로, 가능한 경우, 더 짧은 길이의 앱타머가 바람직하다.
앱타머는 일반적인 방법 예컨대 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 공정을 사용해서 생산될 수 있다. SELEX는 타겟 분자에 대해 매우 특이적인 결합을 갖는 핵산 분자의 발전을 위한 시험관 내 방법이다. 이것은 예를 들어 US 5,654, 151, US 5,503,978, US 5,567,588 및 WO 96/38579에 기술되어 있다.
SELEX 방법은 올리고뉴클레오티드의 집합으로부터 핵산 앱타머 및 구체적으로 요구되는 타겟에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산의 선택을 수반한다. 단일-가닥 핵산(예컨대 DNA, RNA, 또는 이의 변이체)의 집합은 결합을 위해 선호되는 조건 하에서 타겟과 접촉하고, 혼합물 내에서 타겟에 결합하는 이러한 핵산은 결합하지 않은 것들과 분리되고, 핵산-타겟 복합체가 분리되고, 타겟에 결합한 이러한 핵산은 요구되는 결합 활성을 갖는 핵산이 풍부한 집합 또는 라이브러리를 생산하기 위해 증폭된 후, 이러한 일련의 단계가 적절한 타겟에 대한 특이적 결합 관련성을 갖는 핵산(앱타머)의 라이브러리를 제조하기 위해 필요한 만큼 반복된다.
변이체 핵산 서열
80% 이상의 서열 동일성은 82% 이상, 84% 이상, 86% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 및 100%의 서열 동일성을 포함한다(본원에 제시된 각각의 및 모든 핵산 서열 및/또는 본원에 제시된 각각의 및 모든 서열 번호에 대해).
전체적인 방법, 지역적 방법 및 하이브리드 방법, 예컨대 부분 접근 방법(segment approach method)을 제한 없이 포함하는 임의의 다양한 서열 정렬 방법이 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 프로토콜은 당업자의 기준 내에서의 일반적인 공정이다. 전체적인 방법은 서열을 분자의 시작부터 말단까지 정렬하고 각각의 잔기 쌍의 스코어를 합하고 갭 패널티를 도입함으로써 최상의 정렬을 결정한다. 비제한적인 방법은 예를 들어 CLUSTAL W, 예컨대 Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994) 참조; 및 반복적 보정(iterative refinement), 예컨대 Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein 참조,를 포함한다. 반복적 보정에 의한 서열 정렬은 Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)에 대한 참조에 의해 평가 했다. 지역적 방법은 인풋 서열 전체에 의해서 공유되는 하나 또는 그 이상의 보존된 모티프를 동정함으로써 서열을 정렬한다. 비 제한적인 방법은 예를 들어 Match-box, 예컨대 Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992) 참조; Gibbs sampling, 예컨대 C. E. Lawrence et al. ,Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment ,262 (5131) Science 208-214 (1993) 참조; Align-M, 예컨대 Ivo Van WaIIe et al., Align-M- A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bioinformatics:1428-1435 (2004) 참조,를 포함한다. 따라서, 퍼센트 서열 동일성은 관습적인 방법에 의해서 결정된다. 예를 들어, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 및 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992 참조하라.
상기에 제공된 특정 서열의 변이체는 선택적으로 변이체 서열 및 상기 제공된 특정 기준 서열 사이에서 상이한 뉴클레오티드의 수를 인용함으로써 정의될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 서열은 5 이상이 아닌, 4 이상이 아닌, 3 이상이 아닌, 2 이상이 아닌 뉴클레오티드 위치, 예컨대 1 이상이 아닌 뉴클레오티드 위치에서 상기에 제공된 특정 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다(또는 구성된다). 보존적 치환이 바람직하다.
본 발명의 변이체 핵산 분자, 예컨대 변이체 shRNA 분자 및/또는 변이체 gRNA 분자 및/또는 본 발명의 변이체 gRNA 쌍은 일반적으로 여전히 본 발명의 대응하는 분자의 활성을 보유한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 변이체 shRNA 분자는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 조절하는 대응하는 shRNA 분자의 능력을 보유한다. 변이체 shRNA 분자는 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 까지 그리고 100%를 포함하는 본 발명의 shRNA 분자의 조절 활성을 보유할 수 있다. 이는 본 발명의 gRNA 분자 및/또는 gRNA 쌍에도 동일하게 적용된다.
본 발명의 핵산 분자, 예컨대 본 발명의 shRNA 분자, gRNA 분자 및/또는 gRNA 쌍은 shRNA 분자, gRNA 분자 및/또는 gRNA 쌍이 결핍된 생산자 세포의 제거를 가능하게 하기 위해 표시(또는 표지)될 수 있다. 퓨로마이신은 적절한 표지의 예이다. 본 발명의 gRNA 쌍을 형성하는 두 개의 gRNA 분자는 두 개의 gRNA 분자가 구별되도록 하기 위해 다른 표지(tag)으로 표시될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 gRNA 쌍을 형성하는 두 개의 gRNA 분자는 두 개의 gRNA 분자가 구별되도록 하기 위해서 상이한 표지로 표시될 수 있다.
조절의 효과
본 발명의 조절은 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 일반적으로 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 표 2에 열거되어 있다. 일반적으로 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 본 발명에 따른 생산자 세포주에 의한 AAV 벡터 제조의 역가의 증가를 야기할 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 AAV 벡터 제조의 역가를 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상, 55배 이상, 60배 이상, 65배 이상, 70배 이상 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 바람직하게, 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 AAV 벡터 제조의 역가를 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 증가시킨다. 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절로부터 야기된 바이러스 역가에 있어서 임의의 증가는 본원에 기술된 바와 같은 대조군 방법으로부터 얻은 바이러스 역가와 비교할 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 AAV 벡터 제조의 역가를 5일 이상, 10일 이상, 20일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 50일 이상, 60일 이상, 70일 이상, 80일 이상, 90일 이상, 100일 이상 또는 그 이상 동안 증가시킬 수 있다. 바람직하게, 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 AAV 벡터 제조의 역가를 40일 이상 증가시킨다. 반복하여, 증가된 바이러스 역가의 지속은 본원에 기술된 바와 같은 대조군과 비교할 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 AAV 벡터 제조의 역가를 배양에서 생산자 세포주의 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상 또는 그 이상의 계대 동안 증가시킬 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 AAV 벡터 제조의 역가를 무한적으로 증가시킬 수 있다.
바이러스 역가에 있어 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 시간 및 용량 의존성이 있다. 일반적으로, 낮은 용량 및 초기 시점에서도, AAV 벡터 역가에 있어서 2 이상, 5 이상 또는 10배 이상의 유의적인 배 증가가 성취될 수 있다(예를 들어, 도 6b 참조).
AAV 벡터 역가의 증가는 임의의 적절한 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 당업계에 공지된 바이러스 역가를 측정하기 위한 표준 기술은, 예컨대 세포 기반 분석법, 예컨대 플라크 분석법 및/또는 정량적 PCR(qPCR)을 사용하는 것이다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 본 발명에 따른 생산자 세포주에 의해 제조되는 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 증가시킬 수 있다. AAV 벡터 역가의 증가 및/또는 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율의 증가는 본원에 기술된 바와 같이 대조군과 비교할 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 생산자 세포주에 의해 제조되는 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 바람직하게 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 생산자 세포주에 의해 제조되는 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 50% 이상으로 증가시킨다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 완전한 AAV 벡터의 수와 비교하여 AAV 벡터 집단이 50배 이하, 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하, 또는 그 이하인 빈 AAV 벡터를 포함하도록 생산자 세포주로부터 제조된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 증가시킬 수 있다.
하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절로부터 야기된 바이러스 역가에 있어서 임의의 증가는 본원에 기술된 바와 같이 대조군 방법에 의해 얻은 바이러스 역가와 비교할 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 생산자 세포주로부터 제조된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 5일이상, 10일 이상, 20일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 50일 이상, 60일 이상, 70일 이상, 80일 이상, 90일 이상, 100일 이상 또는 그 이상 동안 증가시킬 수 있다. 바람직하게, 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 생산자 세포주로부터 제조된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 40일 이상 동안 증가시킨다. 반복하여, 증가된 바이러스 역가의 지속은 본원에 기술된 바와 같은 대조군과 비교할 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 생산자 세포주로부터 제조된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 배양에서 생산자 세포주의 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상 또는 그 이상의 계대 동안 증가시킬 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 생산자 세포주에 의해 제조되는 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 무제한적으로 증가시킬 수 있다.
생산자 세포주로부터 제조된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율은 임의의 적절한 기술에 의해서 측정될 수 있다. 바이러스 역가의 측정을 위한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, qPCR 및 ELISA의 조합이 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율을 정량하는데 사용될 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 독립적으로 AAV rep 발현을 증가, AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킬 수 있다. 일반적으로 AAV rep 발현에 있어서의 변화는 본원에 정의된 바와 같은 대조군 세포주 또는 방법과 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 11배 이상, 12배 이상, 13배 이상, 14배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상, 55배 이상, 60배 이상, 65배 이상, 70배 이상 또는 그 이상으로 AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킨다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 5일 이상, 10일 이상, 20일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 50일 이상, 60일 이상, 70일 이상, 80일 이상, 90일 이상, 100일 이상 또는 그 이상 동안 독립적으로 AAV rep 발현을 증가, AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킬 수 있다. 바람직하게, 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 40일 이상 동안 독립적으로 AAV rep 발현을 증가, AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킨다. 반복하여, 효과의 지속은 본원에 기술된 바와 같은 대조군과 비교할 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 배양에서 생산자 세포주의 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상 또는 그 이상의 계대 동안 독립적으로 AAV rep 발현을 증가, AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킬 수 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 무제한적으로 독립적으로 AAV rep 발현을 증가, AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킬 수 있다.
AAV rep 발현, AAV 벡터 DNA 생성 및/또는 AAV cap 발현에 있어서 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 시간 및 용량 의존성이 있다. 일반적으로, 낮은 용량 및 초기 시점에서도, AAV rep 발현, AAV 벡터 DNA 생성 및/또는 AAV cap 발현에 있어서의 유의적인 배수(fold) 효과가 성취될 수 있다.
AAV rep 발현의 증가, AAV 벡터 DNA 생성의 증가 및/또는 AAV cap 발현의 감소는 임의의 적절한 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 바이러스 역가를 측정하기 위한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있다.
생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 또는 그 이상으로 독립적으로 AAV rep 발현을 증가, AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킬 수 있다. 바람직하게, 생산자 세포주의 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 50% 이상으로 독립적으로 AAV rep 발현을 증가, AAV 벡터 DNA 생성을 증가 및/또는 AAV cap 발현을 감소시킨다.
AAV 벡터의 제조
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 대조군과 비교하여 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조절된 생산자 세포주를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 유전자 및/또는 단백질의 조절은 shRNA 또는 CRISPR 게놈 편집에 의해서 달성될 수 있다. shRNA가 사용되는 경우, 일반적으로 shRNA는 shRNA가 결핍된 생산자 세포의 제거를 가능하게 하기 위해 표지되어 있다. CRISPR 게놈 편집이 사용되는 경우, PCR 프라이머는 비-절단된/비-gRNA 편집 대조군 세포에서의 단일 PCR 생성물/밴드와 비교하여 양성 넉아웃 세포에서 gDNA의 절단에 의한 2개의 생성물(밴드)을 생성하기 위해 설계될 수 있다. 반복하여, 이는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 유전자가 조절되지 않은 생산자 세포의 제거를 가능하게 한다.
본 발명의 이러한 생산자 세포주가 확립되었으므로, 이것은 본 발명에 따른 AAV 벡터의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 AAV 벡터를 생성하기 위해 임의의 적절한 기술이 사용될 수 있다. 당업계에 표준 기술이 공지되어 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 타겟 세포 또는 타겟 세포들로의 전달 및 발현을 위해서 임의의 치료적 폴리뉴클레오티드를 운반하도록 설계될 수 있다. 치료적 폴리뉴클레오티드는, 당업자에게 잘 공지된 기술(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., Wiley and Sons, New York, 1995)을 사용해서, 이에 제한되는 것은 아니나, E1 부위, E2 부위, E3 부위 및 E4 부위를 포함하는 AAV 벡터 내의 다양한 위치로 설계될 수 있다. AAV 벡터 내로 클로닝된 치료적 폴리뉴클레오티드는 적절한 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 완전한 전사 단위로서 설계될 수 있다.
따라서, 본 발명의 AAV 벡터는 치료적 폴리뉴클레오티드 유전자 및 AAV-유래된 말단 반복 쌍 사이의 프로모터를 포함할 수 있다. 또한 본원에서 프로모터 및 치료적 폴리뉴클레오티드의 조합은 카세트(cassette)로 지칭된다.
프로모터 서열은 유전자의 발현 효과를 나타내기 위한 방식으로 치료적 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결되어 있다. 따라서, 프로모터 서열은 치료적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양 말단에 있을 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 프로모터 및 치료적 폴리뉴클레오티드가 하나의 AAV 벡터 내에 존재할 수 있다, 즉 말단 반복 사이에 두 개 또는 그 이상의 카세트가 존재할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 비상동(heterologous) 유전자가 하나의 벡터에 의해서 발현될 수 있다.
임의의 프로모터가 본 발명의 AAV 벡터에 사용될 수 있고, 그들이 작동적으로 연결된 경우 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 프로모터가 제공된다. 이러한 프로모터는 당업계에 공지되어 있으며, AAV E1 포로모터 또는 E4 프로모터를 포함하고, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 다른 프로모터인 CMV 프로모터 및 PGK 프로모터를 포함한다. 프로모터는 조직 또는 세포에 적합하거나 특이적일 수 있고, 이는 그것이 특정 조직 또는 관심의 세포 유형에서 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도함을 의미한다. 반복하여, 이러한 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.
적합한 폴리아데닐화 서열은, 이에 제한되는 것은 아니나, AAV 폴리아데닐화 신호를 포함하는 치료적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한다. AAV 게놈의 E3 부위는 벡터의 클로닝 능력의 향상을 위해서 제거될 수 있고, 또는 벡터 구조 내에 남아있을 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 일반적으로: 1) 안정한, 처리될 개체의 세포 게놈으로의 위치-특이적 삽입을 매개하는 말단 반복; 및 2) 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 매개하는 프로모터, 또는 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 안티센스 RNA 또는 센스 RNA의 전사를 매개하는 프로모터를 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터는 당업계에 공지된 다양한 표준 방법에 의해서 구조화될 수 있고, 구성요소의 연결 순서는 다양할 수 있다. 프로모터 및 치료적 폴리뉴클레오티드는 2개의 AAV ITR(inverted terminal repeats) 사이로 삽입될 수 있는 카세트를 제공하기 위해 함께 연결될 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터의 구조를 위한 표준 기술은 당업계에 공지되어 있고 예컨대 Sambrook et al. (1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.), 또는 널리 이용가능한 임의의 myriad of laboratory manuals on recombinant DNA technology의 참고문헌에서 찾을 수 있다. DNA의 절편을 연결하기 위해서 다양한 전략이 사용가능하고, 이 중에서 선택은 DNA 절편 말단의 특성에 의존하며 미리 결정되어 있을 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 AAV 벡터의 제조를 위한 표준 기술은 AAV 캡시드 및 Rep 단백질을 발현시키기 위한 DNA 플라스미드(들)의 생산자 세포로의 형질감염; 단일 가닥 DNA 또는 자가-상보적 DNA의 형태이며 받는 세포 또는 환자에서 생물학적 또는 치료적 기능을 가하기 위한 치료적 및/또는 레포터 유전자(들)을 플랭킹하는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래한 두 개의 AAV ITR을 포함하는 AAV 벡터 게놈을 발현시키기 위한 DNA 플라스미드의 공동-형질감염; 및 플라스미드 DNA 공동-형질감염 또는 바이러스 감염을 통해서, AAV 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스로부터 유래한 AAV 헬퍼 구성요소(들)의 도입과 함께 또는 도입을 포함한다.
DNA의 염색체로의 삽입, DNA의 발현, 및 벡터의 클로닝을 가능하게 하기 위한 다른 뉴클레오티드 서열 구성요소는 본 발명의 AAV 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 프로모터의 상류 또는 치료적 폴리뉴클레오티드 하류의 인핸서의 존재는 발현을 가능하게 할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 AAV 벡터는 또한 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일반적으로, 이러한 AAV 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및 VP3으로 지정되어 있다. 이러한 AAV 캡시드 단백질은 전형적으로 AAV DNA 게놈 상에서 암호화되고, 조립된 AAV 바이러스 입자의 제조를 가능하게 한다.
생산자 세포주
본 발명에 따르면, 생산자 세포주는 AAV 벡터의 복제 및 패키징(packaging)이 가능한 세포주로 정의될 수 있다. 임의의 적절한 생산자 세포주는 변형될 수 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 생산자 세포주는 진핵 세포주이고, 일반적으로 포유동물 세포주이다. 본 발명에 의해 제조되는 AAV 벡터는 보통 인간에서의 치료를 위해 의도된다. 따라서, 바람직하게 본 발명의 생산자 세포주는 인간 세포주이다. 본 발명의 생산자 세포주는 NIH3T3, HT1080, A549, HeLa 세포, 및 HEK 293T 세포주로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 생산자 세포주는 부착되거나 현탁된 형태일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 생산자 세포주는 인간 배아 신장(HEK) 293T 세포주이다. HEK293T 세포주는 Rous sarcoma virus long terminal repeat 프로모터의 전사적 조절 하에서 SV40 초기 부위를 발현한다.
본원에 지칭된 바와 같이, 대조군 생산자 세포주는 본 발명에 따라 변형되거나 적용되지 않은 세포주이다.
치료적 적용
본 발명의 AAV 벡터는 유전자 치료 벡터로 사용될 수 있다. 유전자 치료는 새로운 유전 정보를 세포로 이동 또는 삽입하는 것을 수반한다. 유전 정보는 일시적으로 또는 안정적으로 세포 내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 세포 치료에 대해 안전하다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터는 상당한 세포독성 없이 포유동물 염색체로의 위치-특이적 삽입을 가능하게 하고, 치료적 폴리뉴클레오티드의 숙주세포-특이적 발현과 연관될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 AAV 벡터는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간에서 유전자 치료에 사용된다.
본 발명의 AAV 벡터는 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 치료적 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일반적으로 치료적 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 치료적 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 치료될 개체 내에서 기능이 없고/없거나 돌연변이된 유전자를 타겟(대체)하는 생물학적으로 기능이 있는 유전자이다. 바람직한 구현예에서, 치료되는 개체가 인간인 경우, 치료적 폴리뉴클레오티드 또한 인간이다.
치료적 폴리뉴클레오티드는 생물학적으로 기능이 있는 단백질, 즉 생물학적으로 기능이 있는 단백질이 발현되는 세포의 세포적 메커니즘에 영향을 주는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 기능이 있는 단백질은 세포의 정상적인 성장 또는 개체의 건강을 유지하기 위해 필수적인 단백질일 수 있다. 또한 생물학적으로 기능이 있는 단백질은 없어진 단백질을 제공, 개체 내에서 덜 제조되는 단백질의 증가된 양을 제공, 또는 개체 내에 존재할 수 있는 바람직하지 않은 분자를 억제하거나 반대 작용을 하는 단백질을 제공함으로써 개체의 건강을 향상시키는 단백질일 수 있다. 또한 생물학적으로 기능이 있는 단백질은 새로운 유전자 치료제를 개발하거나 세포적 메커니즘을 연구하기 위한 조사 연구에 유용한 단백질일 수 있다.
생물학적으로 기능이 있는 단백질은 체내의 정상적인 성장 또는 회복에 필수적인 단백질일 수 있다. 또한 생물학적으로 기능이 있는 단백질은 암과 같은 질환을 이기기 위해 유용한 것일 수 있다. 또한 생물학적으로 기능이 있는 단백질은 진핵생물에서 네오마이신 저항성을 위한 선택 마커와 같은 항생제 저항성에 대한 선택 마커일 수 있다. 다른 유형의 선택 마커 또한 사용될 수 있다. 이러한 단백질을 암호화하는 치료적 폴리뉴클레오티드는 임의의 다양한 방법, 예컨대 일반적인 클로닝 공정(Sambrook et al.), 관심의 유전자를 포함하는 벡터로부터의 삭제, 또는 발표된 서열 정보에 기반한 화학적 또는 효소적 합성에 의해서 제공될 수 있다. 관심의 단백질을 암호화하는 DNA의 많은 예는 상업적으로 이용가능하다.
생물학적으로 기능이 있는 단백질은 세포에 새롭거나 변형된 기능을 제공함으로써 세포적 메커니즘에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 치료적 폴리뉴클레오티드는 P-당단백질을 암호화하는 다중약물 내성 유전자(mdr)일 수 있다. P-당단백질은 세포내 약물 축적에 영향을 주고 다중약물 내성 현상에 책임이 있는 세포 막 당단백질이다.
치료적 폴리뉴클레오티드는 비-생물학적 기능이 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 다양한 기원에서 유래한 다양한 도메인과 기능을 포함하는 하이브리드 유전자가 설계될 수 있고 재조합 기술 또는 효소적 또는 화학적 합성에 의해서 제조될 수 있다.
치료적 폴리뉴클레오티드는 관심의 mRNA 또는 DNA에 혼성하기에 충분한 상보성이 있는 RNA 분자, 즉 센스 또는 안티센스 RNA로 전사될 수 있다. 이러한 RNA 분자는 과생성된, 결함이 있는, 또는 다른 필요하지 않는 분자들의 발현을 예방하거나 제한하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 치료적 폴리뉴클레오티드로서, 타겟 서열에 결합할 수 있도록 타겟 서열에 충분히 상보적인 안티센스 RNA를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 타겟 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA에 결합하고 번역을 예방하도록 하는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA의 부분일 수 있다. 타겟 서열은 안티센스 RNA가 부분(예컨대 프로모터 또는 암호화 영역)에 결합하고 전사를 예방 또는 제한하도록 전사에 필수적인 유전자의 부분일 수 있다. 따라서, 안티센스 RNA는 그것의 타겟 mRNA의 번역 또는 그것의 타겟 DNA의 전사를 예방하기에 충분한 길이와 상보성을 가져야 한다. 안티센스 RNA가 타겟에 결합하고 따라서 번역 또는 전사를 저해할 수 있도록 타겟 서열에 대해 충분한 상보성을 갖는 안티센스 RNA는 표준 기술을 사용해서 결정될 수 있다. 예를 들어 치료적 폴리뉴클레오티드는 화학적 또는 효소적 합성, 또는 상업적 공급원으로부터 제공될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터의 기능, 즉 치료적 폴리뉴클레오티드의 이동 및 발현을 매개할 수 있는 기능은, 형질도입된 세포 내에서 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 AAV 벡터로 형질감염되거나 상기 AAV 벡터를 포함하는 다양한 농도의 비리온으로 감염될 수 있고 그 후 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 측정할 수 있다.
발현에 대한 분석법은 치료적 폴리뉴클레오티드의 특성에 의존한다. 발현은 면역학적, 조직-화학적 또는 활성 분석법을 포함하는 다양한 방법에 의해서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 노던 분석법은 적절한 DNA 또는 RNA 프로브를 사용하여 전사를 측정하는 데 사용될 수 있다. 치료적 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 대한 항체가 이용가능하다면, 폴리펩티드의 생성을 측정하기 위해 웨스턴 블롯 분석법, 면역조직화학법 또는 다른 면역학적 기술이 사용될 수 있다. 또한 치료적 폴레뉴클레오티드가 효소인 경우 적절한 생화학적 분석법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료적 폴리뉴클레오티드가 항생제 저항성을 암호화하는 경우, 항생제 저항성 유전자의 발현을 측정하기 위해 감염된 세포의 항생제에 대한 저항성의 결정이 사용될 수 있다.
비상동 유전자의 적절한 세포 내 발현의 측정에 더하여, AAV 벡터의 바람직한 프로모터 특이성은 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 모니터링함으로써, 또는 발현이 결핍된 경우, 프로모터가 활성인 것으로 예상되지 않는 세포 내에서 측정될 수 있다.
본 발명의 치료적 폴리뉴클레오티드는 CF를 위한 CFTR, 기종을 위한 α1-안티트립신, AIDS를 위한 수용성 CD4, 아데노신 디아미나제 결핍을 위한 ADA 및 유전자 치료에 있어 잠재적으로 유용한 것으로 인식된 임의의 다른 유전자로부터 선택된 유전자일 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 생체 외(ex vivo) 및 시험관 내(in vitro) 유전자 치료 적용에 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 AAV 벡터는 다른 치료제를 운반하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 소분자, 펩티드 및/또는 단백질 치료제를 운반하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 다른 치료제 및/또는 치료적 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 AAV 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나, 암을 포함하는 질환의 치료에서 표준 치료제 및/또는 방법과 조합하여 사용될 수 있다. AAV에 의해 유도된 면역은 항체 기능을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치료적 사용의 일 예는 본 발명의 AVV의 치료적 항체 전달 용도, 또는 본 발명의 AAV 벡터의 치료적 항체와의 조합 용도이다.
따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 치료방법에 있어서 AAV의 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 유전자 치료를 위한 약의 제조에 있어서 AAV의 용도를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
실시예 1- 벡터 제조
벡터 입자의 두 가지 형태, 즉 세 가지의 AAV 혈청형, 즉 AAV2, AAV5 및 AAV8 각각에서 유래한 완전한 및 빈(임의의 이식유전자 서열이 없는) 입자를 제조하고 조사하였다. 완전한 벡터 입자는 GFP를 암호화하는 벡터 서열을 포함하고 빈 벡터 입자는 벡터 서열이 없는 캡시드이다.
완전한 AAV 입자를 3가지 플라스미드 pHelper(Stratagene, USA), AAV Rep-Cap을 암호화하는 pAAV-RC 및 pAAV-hrGFP (Stratagene, USA)로부터 발현시켰고 빈 AAV 캡시드를 pHelper 및 pAAV-RC로부터만 발현시켰다. 플라스미드 pAAV2/2 Rep-Cap을 Stratagene(USA)으로부터 구입하였고, 플라스미드 pAAV-2/5-RC 및 AAV-2/8-RC를 James Wilson (NIDCR /Pennsylvania, USA) 교수로부터 제공받았다.
모든 벡터를 칼슘 포스페이트-BBS 방법(Chen et al., (1988) Biotechniques 6:632-638)을 사용하여 인간 배아 신장 293T 세포(Stratagene, USA)의 일시적 형질감염에 의해서 제조하였다. 벡터 생산자 세포를 수확하고 벡터 입자에 대해 동결 후 해동을 5 사이클 수행하였고 세포 잔여물을 원심분리(2000g)에 의해서 제거하였다.
이후 벡터 입자를 포함하는 상등액을 0.45μm 필터(Millipore, UK)를 통해서 여과하였고 크로마토그래피 전에 20mM Bis-Tris 프로판 완충액으로 희석하였다. 크로마토그래피를 위해 Gilson HPLC 시스템(Anachem, UK)을 사용하였고, 이는 수냉식 컬럼을 냉각시키는 냉장된 순환식 수조(Grant, SLS)에 연결된 온도가 조절된 랙으로 모두 맞추어진 UV-디텍터(Gilson, 119), 펌프(Gilson 306), 자동견본기(Gilson 231XL) 및 분별 수집기(Gilson FC203B)를 구비한다. 시스템은 Gilson Unipoint software를 이용해서 조절하였다. XK 16/26 컬럼(Amersham, UK)을 5ml AVB Sepharose High Performance medium (GE Healthcare, Sweden)의 충진 부피를 포함하기 위해 패킹하였고, 다음을 제조업자의 프로토콜에 의해서 수행하였다.
본 연구에 사용된 AVB 세파로오스 부착 크로마토그래피는 아데노-부속 바이러스의 정제를 위해서 설계하였다. 도 1a는 AAV 항체와 결합한 AVB 세파로오스를 포함하는 5ml 컬럼을 사용한 일반적인 단백질 분리를 나타내고 대부분의 단백질은 AAV 항체에 결합하지 않았고 따라서 용출 완충액(50mM 글라이신, pH2.7)을 적용하기 전에 관을 따라 흐른다(도 1a). 빈 캡시드와 완전한 벡터 모두 25-35분의 이동 시간에 용출되었다(도 1a). 이후 용출된 시료의 단백질 프로파일을 SDS-PAGE 및 은 염색을 이용해서 시각화하였고(도 1b), 크로마토그래피 이후 AAV 시료의 상당한 정제를 나타낸다. 예상한 바와 같이, 세 개의 우세한 AAV 캡시드 단백질 VP1(81kDa), VP2(72kDa) 및 VP3(62kDa)을 발견하였다. 조 비-정제된 AAV 시료는 많은 단백질 밴드를 나타내었다.
실시예 2- LC-MS/MS를 이용한 AAV 벡터로부터 단백질의 동정
실시예 1로부터 정제된 벡터 입자를 모으고 PBS로 평형화하기 위해 10K MWCO Slide-A-Lyzer dialysis cassette (Thermo scientific, USA) 내에서 투석하였고 벡터를 정량하기 전에 Ultra 5K MWCO centrifugal filter devices (Millipore, UK)를 사용해서 초기 부피의 1/20으로 농축하였다.
AAV2 ITR 프라이머 GAACCCCTAGTGATGGAGTT (서열번호 24) 및 CGGCCTCAGTGAGCGA (서열번호 25) 및, 5'말단에 6-FAM(6-carboxyfluoescein)로 표시되고 3'말단에 TAMRA(carboxytetramethylrhodamine)로 표시된 프로브 CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG (서열번호 26)로 SYBR green 염색 실시간 qPCR을 사용하여 정제된 벡터의 벡터 정량 게놈 역가를 결정하였다. 플라스미드 pAAV2-hr-GFP로 표준 곡선을 생성하였다. Pierce BCA protein assay kit (Thermo scientific, USA)를 이용해서 전체 단백질을 측정하였고 제조업자의 프로토콜에 따랐다. 제조업자의 프로토콜에 따라 SilverXpress staining kit (Invitrogen, USA)를 사용해서 캡시드 단백질의 동정 및 예측된 양을 시각화하였다.
1%의 Rapigest와 50 mM의 암모늄 바이카보네이트(ABC) pH8.5의 존재 하에서 3시간 동안 37℃에서 정제되고 농축된 벡터 시료를 트립신으로 소화시켰다. 이후 시료를 MS 분석하기 전에 HCl을 첨가함으로써 소화를 종결하였다.
용매 탈기기, 로딩 펌프, 나노-펌프, 및 온도 조절 장치가 있는 자동 견본기를 포함하는, Ultimate 3000 nano-LC system과 연결된, 나노-전자분무 이온 소스 및 두 개의 질량 측정기, 즉 선형 트랩(LTG) 및 오르비트랩(orbitrap)을 구비한 질량분석 시스템(Thermo Fisher, UK)을 사용하여 LC-MS/MS를 수행하였다. 자동화된 주입 후에, 각각의 소화에서 유래한 추출된 펩티드를 트래핑 카트리지(PepMap reversed phase C18, 5 μm 100
Figure pct00002
, 300μid x 5 mm 길이) (Thermo)에서 탈염하고 C18 역상 나노-컬럼(3 μm 100
Figure pct00003
, 5 cm 길이) (Thermo)상에서 용출한 후, 5-70% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산으로부터의 선형 구배를 이용해서 0.3 μL/분 유속의 컬럼에서 60분 동안 분리하였다. LTQ에서의 첫 번째 조사 MS 스캔(m/z 400-2000) 이후, 5개의 가장 강한 이온을 순차적으로 분리하고 정확한 질량 측정을 위해서 30,000ppm의 해상도로 오르비-트랩에 통과시켰다. 이후 35%의 에너지 충돌 유도로 선형 이온 트랩 내에서 절편화하였다. 전체 사이클 시간을 약 30 밀리세컨드(millisecond)로 하였다. 2 카운트로 세팅된 동적 배제(dynamic exclusion)로 MS/MS 모드 의존성 데이터 내에서 데이터를 모았다.
내장된 Sequest로 Thermo Proteome Discoverer 1.2를 사용하여 질량분석 과정을 포함하는 데이터 분석 및 데이터베이스 검색을 수행했다. MS에 의해서 단백질을 동정하기 위한 초기의 질량 허용 오차를 10 ppm으로 세팅하였다. 2개 까지의 손실된 트립신 절단이 고려되었고 메티오닌 산화를 동적 변형으로 세팅하였다. MS/MS에 의한 펩티드 서열은 단지 충전 상태 1, 2 및 3에 대하여 각각 Xcorrelation score가 1.5, 2 또는 2.2보다 큰 경우에 포함되었다. 2개 이상의 펩티드가 단백질에 매치될 때 명백한 동정으로 고려되었다. 2012-03에 발간되고, Homo sapiens (분류군 식별 9606) Bos taurus (9913), 녹색 형광 단백질 (P42212) 및 AAV2 (648242), AAV5 (82300) 및 AAV8 (202813)에서 유래한 완전한 항목을 포함하는 단백질 FASTA 데이터베이스를 www.uniprt.org로부터 다운로드하였다.
6개의 상이한 유형의 정제된 AAV 벡터 시료, 즉 AAV2-GFP, AAV2-빈, AAV5-GFP, AAV5-빈, AAV8-GFP 및 AAV8-빈에서 유래한 동일한 양의 전체 단백질에 대해 LC-MS/MS 분석법을 수행하였다. 데이터 편차를 최소화하기 위해서, 40개의 조직 배양 플레이트(150mm 지름)으로부터 모아진 각각의 집단으로 각각의 유형의 벡터에 대해서 시료의 3개 집단을 준비하였다. 각각의 시료 집단에 대해 3번의 MS 런을 수행하였다. 결과는 시료의 3개 집단의 2/3 런(run) 이상에서 66 개의 단백질이 검출되었음을 나타냈고 따라서 중요한 것으로 고려되었으며 추가적인 연구를 수행하였다. 이러한 단백질을 표 2에 열거하였다.
중요한 단백질 중:
Figure pct00004
4개의 단백질, 즉 GapDH, 열충격 70 kDa 단백질 1A/1B, 히스톤 H2A유형 1H 및 히스톤 H2B는 혈청형 및 입자 형태에 관계 없이 모든 6개 유형의 AAV 벡터에 대해 공통적이다;
Figure pct00005
6개의 단백질은 5개의 벡터 유형에 의해 공유된다;
Figure pct00006
4가지 형태의 시료에 의해 공유되는 10개의 단백질 중, 6개의 단백질이 AAV2 및 AAV5의 빈 형태 및 완전한 형태 모두에 의해 공유되며, 이는 AAV2 및 AAV5 벡터 사이의 상대적인 유사성을 나타낸다;
Figure pct00007
20개의 단백질은 2개 유형의 벡터에 대해 공통적이고, 이들 중 대부분은 동일한 혈청형의 빈 형태 및 완전한 형태에 대해 공통적이며;
Figure pct00008
21개의 단백질은 각각의 유형의 벡터에 대해 고유하다.
단백질 ID AAV2E AAV2G AAV5E AAV5G AAV8E AAV8G
6종에서 공유 (4 단백질) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Fragment) OS=Homo sapiens GN=GAPD PE=2 SV=1 - [Q5ZEY3_HUMAN] + + + + + +
Heat shock 70 kDa protein 1A/1B OS=Homo sapiens GN=HSPA1A PE=1 SV=5 - [HSP71_HUMAN] + + + + + +
Histone H2A type 1-H OS=Homo sapiens GN=HIST1H2AH PE=1 SV=3 - [H2A1H_HUMAN] + + + + + +
Histone H2B OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [A8K9J7_HUMAN] + + + + + +
5종에서 공유 (6 단백질) 60S acidic ribosomal protein P2 OS=Homo sapiens GN=RPLP2 PE=1 SV=1 - [RLA2_HUMAN] + + + + +
Alpha-enolase OS=Homo sapiens GN=ENO1 PE=1 SV=2 - [ENOA_HUMAN] + + + + +
Nucleolin, isoform CRA_c OS=Homo sapiens GN=NCL PE=2 SV=1 - [B3KM80_HUMAN] + + + + +
Nucleophosmin OS=Homo sapiens GN=NPM1 PE=1 SV=2 - [NPM_HUMAN] + + + + +
YBX1 protein (Fragment) OS=Homo sapiens GN=YBX1 PE=2 SV=1 - [Q6PKI6_HUMAN] + + + + +
RuvB-like 2 OS=Homo sapiens GN=RUVBL2 PE=1 SV=3 - [RUVB2_HUMAN] + + + + +
4종에서 공유 (10 단백질) Annexin A5 OS=Homo sapiens GN=ANXA5 PE=1 SV=2 - [ANXA5_HUMAN] + + + +
Brain acid soluble protein 1 OS=Homo sapiens GN=BASP1 PE=1 SV=2 - [BASP1_HUMAN] + + + +
Histone H2A.x OS=Homo sapiens GN=H2AFX PE=1 SV=2 - [H2AX_HUMAN] + + + +
MARCKS protein (Fragment) OS=Homo sapiens GN=MARCKS PE=2 SV=1 - [Q6NVI1_HUMAN] + + + +
MYL6 protein OS=Homo sapiens GN=MYL6 PE=2 SV=1 - [Q6IBG5_HUMAN] + + + +
Nascent polypeptide-associated complex alpha subunit (CypA) (Fragment) OS=Homo sapiens GN=NACA PE=4 SV=1 - [F8W1N5_HUMAN] + + + +
Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (Fragment) OS=Homo sapiens GN=PPIH PE=3 SV=1 - [C9JQD4_HUMAN]
+ 		+ + +
Putative uncharacterized protein (Fragment) OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [Q8WVW5_HUMAN] + + + +
RuvB-like 1 (Fragment) OS=Homo sapiens GN=RUVBL1 PE=2 SV=1 - [B5BUB1_HUMAN] + + + +
Triosephosphate isomerase (Fragment) OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [Q53HE2_HUMAN] + + + +
3종에서 공유 (5 단백질) 78 kDa glucose-regulated protein OS=Homo sapiens GN=HSPA5 PE=1 SV=2 - [GRP78_HUMAN] + + +
ATP synthase subunit beta (Fragment) OS=Homo sapiens GN=ATP5B PE=2 SV=1 - [Q0QEN7_HUMAN] + + +
Chaperonin 10-related protein (Fragment) OS=Homo sapiens GN=EPFP1 PE=2 SV=1 - [Q9UNM1_HUMAN] + + +
L-lactate dehydrogenase B chain OS=Homo sapiens GN=LDHB PE=1 SV=2 - [LDHB_HUMAN] + + +
Synaptic vesicle membrane protein VAT-1 homolog OS=Homo sapiens GN=VAT1 PE=1 SV=2 - [VAT1_HUMAN] + + +
2종에서 공유(20 단백질) Actin, gamma 1 OS=Homo sapiens GN=ACTG1 PE=3 SV=1 - [F5H0N0_HUMAN] + +
Annexin A2 (Fragment) OS=Homo sapiens GN=ANXA2 PE=4 SV=1 - [H0YKZ7_HUMAN] + +
ATP synthase subunit alpha OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [B4DY56_HUMAN] + +
ATP synthase-coupling factor 6, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5J PE=1 SV=1 - [ATP5J_HUMAN] + +
Capsid protein VP1 OS=Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) PE=1 SV=2 - [CAPSD_AAV2S] + +
Capsid protein OS=Adeno-associated virus - 5 GN=cap PE=1 SV=1 - [Q9YIJ1_9VIRU] + +
Capsid protein OS=Adeno-associated virus - 8 PE=1 SV=1 - [Q8JQF8_9VIRU] + +
Cofilin 1 (non-muscle) (Fragment) OS=Homo sapiens GN=CFL1 PE=4 SV=1 - [E9PLJ3_HUMAN] + +
Complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=C1QBP PE=1 SV=1 - [C1QBP_HUMAN] + +
Erythrocyte membrane protein band 4.1-like 3 OS=Homo sapiens GN=EPB41L3 PE=2 SV=1 - [A8K968_HUMAN] + +
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (Fragment) OS=Homo sapiens GN=HNRNPA1 PE=4 SV=1 - [F8VTQ5_HUMAN] + +
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K (hnRNPK) OS=Homo sapiens GN=HNRNPK PE=2 SV=1 - [Q5T6W5_HUMAN] + +
Myosin-10 OS=Homo sapiens GN=MYH10 PE=1 SV=3 - [MYH10_HUMAN] + +
Myosin-9 OS=Homo sapiens GN=MYH9 PE=1 SV=4 - [MYH9_HUMAN] + +
Pyruvate kinase OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [B4DNK4_HUMAN] + +
Ribosomal protein L5, isoform CRA_b OS=Homo sapiens GN=RPL5 PE=2 SV=1 - [B3KTM6_HUMAN] + +
Serine/arginine repetitive matrix protein 1 OS=Homo sapiens GN=SRRM1 PE=1 SV=2 - [SRRM1_HUMAN] + +
Single-stranded DNA binding protein 1 (Fragment) OS=Homo sapiens GN=SSBP1 PE=4 SV=1 - [C9K0U8_HUMAN] + +
Tubulin, alpha 1b (Fragment) OS=Homo sapiens GN=TUBA1B PE=4 SV=1 - [F8VRK0_HUMAN] + +
Uncharacterized protein OS=Homo sapiens GN=SLC1A5 PE=2 SV=1 - [B4DWS4_HUMAN] + +
고유 (21 단백질) Adenylyl cyclase-associated protein OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [B4DI38_HUMAN] +
ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta polypeptide (Fragment) OS=Homo sapiens GN=ATP5B PE=4 SV=1 - [H0YH81_HUMAN] +
DNA-binding protein A OS=Homo sapiens GN=CSDA PE=1 SV=4 - [DBPA_HUMAN] +
Elongation factor Tu, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=TUFM PE=1 SV=2 - [EFTU_HUMAN] +
Enolase (Fragment) OS=Homo sapiens GN=ENO1 PE=2 SV=1 - [Q9BT62_HUMAN] +
EPB41 protein (Fragment) OS=Homo sapiens GN=EPB41 PE=2 SV=1 - [Q4VB87_HUMAN]
+
HSP90AB1 protein (Fragment) OS=Homo sapiens GN=HSP90AB1 PE=2 SV=1 - [Q6PK50_HUMAN] +
IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2 (Fragment) OS=Homo sapiens GN=IMPDH2 PE=4 SV=1 - [H0Y4R1_HUMAN] +
Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1, isoform CRA_a OS=Homo sapiens GN=IGF2BP1 PE=4 SV=1 - [D3DTW3_HUMAN] +
Liver histone H1e OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [A3R0T7_HUMAN] +
Major coat protein Aa OS=Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) PE=4 SV=1 - [Q89269_AAV2S] +
Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+ dependent) 1, methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase, formyltetrahydrofolate synthetase OS=Homo sapiens GN=MTHFD1 PE=3 SV=1 - [G3V2B8_HUMAN] +
Nucleolar RNA helicase 2 OS=Homo sapiens GN=DDX21 PE=1 SV=5 - [DDX21_HUMAN] +
Ornithine aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=OAT PE=1 SV=1 - [OAT_HUMAN] +
Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, ATPase, 3 OS=Homo sapiens GN=PSMC3 PE=3 SV=1 - [E9PM69_HUMAN] +
Rep78 OS=Adeno-associated virus-Go.1 PE=4 SV=1 - [Q2LD61_9VIRU] +
SFPQ protein (Fragment) OS=Homo sapiens GN=SFPQ PE=2 SV=2 - [Q9BSV4_HUMAN] +
Signal recognition particle 72kDa, isoform CRA_c OS=Homo sapiens GN=SRP72 PE=4 SV=1 - [G5E9Z8_HUMAN] +
Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide B OS=Homo sapiens PE=2 SV=1 - [Q5XPV6_HUMAN] +
THO complex subunit 4 OS=Homo sapiens GN=ALYREF PE=1 SV=3 - [THOC4_HUMAN] +
TUBA1B protein OS=Homo sapiens GN=TUBA1B PE=2 SV=1 - [Q8WU19_HUMAN] +
실시예 3- MS 데이터의 확인
실시예 2에서 얻은 질량분석 데이터를 확인하기 위해서, 면역블롯팅을 위해서 MS를 사용하여 동정한 2 개의 카테고리의 단백질을 선택하였다: (i) AAV 생활사에서 입증된 역할을 갖는 단백질 NPM1, NCL 및 ATP5A; 및 (ⅱ) AAV와 연관성에 대해 보고된 바가 없지만 MS 분석에서 상대적으로 높은 점수 및 신뢰를 갖는 단백질 아넥신 V, RuvB, CypA, hnRNPK 및 YB1.
단백질 시료를 분리하기 위해서 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 사용하였고 이후 겔을 면역블롯팅하였다. 면역블롯팅을 위한 시료를 전기영동하고 Hybond ECL 멤브레인(Amercham, UK)에 일렉트로블롯팅하였다. 다음의 일차 항체를 사용하였다: 마우스 항 AAV2, 마우스 항 아넥신 V (Abcam, UK), 항 뉴클레오린 (Abcam, UK), 항 뉴클레오포스민(nucleophosmin) (Abcam, UK), 항 EF1β2 (Abcam, UK), 항 CypA (Abnova, UK), 항 RuBV2 (Abcam, UK), 항 hnRNP K (Abcam, UK), 항 ATP5A (Abcam, UK 및 항 YB1 (Abcam, UK). 추가적으로 면역블롯을 염소 항-마우스, 항-토끼 및 토끼 항-염소 겨자무과산화효소 접합(Sigma, US)과 배양하였다. ECL 화학발광시약 (Amercham, UK)을 사용해서 면역-반응성 단백질을 검출하였다.
각각의 시료에 대해서, 면역블롯팅 전에 SDS/PAGE를 사용해서 MS/MS를 위해 사용된 동일한 시료에서 유래한 10 μg의 전체 단백질을 분리하였다. SDS/PAGE 및 은 염색을 사용해서 전체 단백질을 시각화하였고(도 1b), 시료 정제 및 AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 비슷한 양을 확인하였다.
면역블롯팅은 RuvB2, CypA 및 아넥신 A5가 시험된 모든 시료에서 검출됨을 나타내었다(도 2a 및 b). YB1은 그들이 조 또는 정제에 상관 없이 AAV8 빈 캡시드를 제외한 모든 시료에서 검출되었다(도 2c). AAV 벡터에 융합된 세포 단백질과 공동-정제되었으나 포함되지 않은 세포 단백질을 구별하기 위해서, 정제된 벡터에 남아있고 벡터 캡시드에 의해서 보호되지 않은 미량의 융합되지 않은 세포 단백질을 제거하기 위해서 프로테나제 K(PK)를 사용하였다. 도 2d는 PK 처리 전과 후의 정제된 AAV 벡터 내에서 YB1 단백질의 비슷한 검출을 나타내고, 이는 YB1이 AAV 벡터에 포함됨을 나타낸다. 또한, AAV 벡터와 병행하여 처리하고 HPLC-정제된 정제된 대조군 293T 세포 내에서 YB1 단백질의 검출이 발견되지 않았고(레인 unpurified, 도 2d), 이는 AAV 벡터 정제를 위해 채택된 AVB 컬럼의 특이성을 강조하고 추가적으로 AAV 벡터 내 YB1 단백질의 융합을 증명한다. hnRNPK는 시험된 어떠한 시료에서도 검출되지 않았다(데이터 미도시).
표 3에 면역블롯팅 및 MS 연구로부터 얻은 결과를 추가적으로 요약하고 비교하였고, 두 개의 상이한 방법 사이에서 단백질 검출은 22.9%(시험된 시료의 11/48, 동그라미로 강조됨)의 차이 및 77.1%의 일치를 나타내었다.
Figure pct00009
실시예 4- 생산자 세포 내 단백질 발현에 대한 AAV 제조의 영향
생산자 세포에서 바이러스성 및 세포성 단백질 모두의 발현에 대한 AAV 제조의 잠재적인 영향을 조사하기 위해서, 벡터 제조 과정이 종결되고 AAV 벡터를 수확할 때 AAV 제조의 하나의 완전한 사이클, 즉 AAV 및 헬퍼 플라스미드의 형질감염 0 시간 전부터, 형질감염하고 4, 6, 24, 30, 48, 및 72시간 후까지 동안에 AAV 캡시드 단백질, 아넥신 A5, CypA 및 YB1의 발현에 있어서의 차이를 분석하였다. AAV 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3) 및 Rep 단백질은 AAV2 생산자 세포에서 형질감염하고 24시간 후에 검출될 수 있다(도 3a 및 3b). 형질감염하고 24시간 내지 72시간부터 생산자 세포 내 캡시드 단백질에 있어 약간의 증가가 관찰되었다. AAV 제조의 완전한 사이클 동안, YB1 및 CypA 발현에 있어서 유의적 차이가 발견되지 않았고(도 3c); 세 개의 모든 혈청형에서 아넥신 A5 발현에 있어서 시간에 따른 증가가 발견되었다(도 3d).
실시예 5- NPM1, NCL 및 YB1의 shRNA 넉다운
타겟 유전자를 특이적으로 인식하는 기능적 shRNA는 그 유전자 발현의 하향조절을 야기한다. 배양시 NCL 및 NPM1을 과발현시키기 위한 세포를 확립하는 것이 불가능하기 때문에(데이터 미도시), AAV 조립에 있어서 이러한 전략을 세포성 단백질의 역할을 연구하기 위한 대안으로서 선택하였다.
생산자 세포에서 NPM1, NCL, 아넥신 V 및/또는 YB1의 shRNA 넉다운이 (MS/MS 및 면역블롯 동정된) NPM1, NCL, 아넥신 V 및/또는 YB1과 AAV 바이러스의 연관성을 손상시키고 이어서 유전자가 넉다운된 세포 내에서 AAV 제조에 영향을 줄 수 있다는 가정 하에서, shRNA 서열을 스크리닝하기 위해 렌티바이러스 벡터 전달 시스템을 사용하였다.
타겟 유전자를 특이적으로 인식하는 기능적 shRNA는 타겟된 유전자 발현의 하향조절을 유발한다. AAV 제조에 있어서, YB1 및 아넥신 A5의 역할 및 중요성을 확인하기 위해서, 생산자 세포에서 shRNA를 사용하여 YB1 또는 아넥신 A5의 넉다운 실험을 설계하였고, 가설은 이러한 넉다운이 YB1 또는 아넥신 A5와 AAV 바이러스의 연관성(MS/MS 및 면역블롯팅 연구로부터 확인된 바와 같은)을 손상시키고 이후 유전자가 넉다운된 세포에서 AAV 조립에 영향을 준다는 것이다.
그들의 아넥신 A5와 YB1을 각각 하향조절하는 능력에 대해 아넥신 A5 및 YB1을 타겟으로 하는 10 개의 shRNA 서열(A1 내지 A5, 서열번호 19 내지 서열번호 23 및 Y1 내지 Y5, 서열번호 14 내지 서열번호 18)을 스크리닝하기 위해서 렌티바이러스 전달 시스템을 사용하였다.
더욱 구체적으로, 렌티바이러스 발현 시스템을 사용해서 플라스미드 pLKO.1-puro (Sigma, USA)로부터 shRNA를 발현시시켰다. CaCl2 형질감염 방법을 사용해서 shRNA 및 렌티바이러스 벡터 패키징 플라스미드를 293T 세포로 형질감염시켰다. 대조군 세포를 shRNA 서열이 없는 빈 캡시드(mock) 또는 비-포유동물 유전자 서열을 타겟으로 하는 스크램블 shRNA 서열(scramble)로 형질감염시켰다. 293T 세포를 LV-shRNA 벡터로 형질도입하고, 형질도입하고 48시간 후에 퓨로마이신 선별을 하였다.
CMV 프로모터 또는 AAV2 ITR 서열을 타겟으로 하는 프라이머 또는 프로브로 한 q-PCR에 의해서 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하였다. CMV 프라이머: TTC CTA CTT GGC AGT ACA TCT ACG (서열번호 30) 및 GTC AAT GGG GTG GAG ACT TGG (서열번호 31); 및 CMV 프로브: TGA GTC AAA CCG CTA TCC ACG CCC A (서열번호 32). AAV2 ITR 프라이머 GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (서열번호: 24) 및 CGGCCTCAGTGAGCGA (서열번호 25) 및 프로브 CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG (서열번호 26). 반복하여, 5' 6-FAM 및 3' TAMRA 표시를 사용하였다. 102 내지 108 카피 범위의 10배 연속적 희석에 있어서의 기준 표준으로서 플라스미드 DNA pAAV-hrGFP (Stratagene, USA)를 사용하였다. LightCycler480 (Roche, USA)을 사용해서 95℃에서 10분 1 사이클, 이후 95℃에서 15초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 5초의 45 사이클의 조건 하에서 qPCR을 수행하였다. shRNA 바이러스가 형질도입된 세포에서 유래한 10μg의 전체 단백질 상에서 유전자 넉다운 수준을 측정한 후 상기 기술된 바와 같이 면역블롯팅 방법을 수행하였다.
LV shRNA 시스템에는 shRNA 바이러스 역가에 대한 관습적인 방법을 수행하기 위한 레포터 유전자가 없기 때문에, 유전자 넉다운 연구는 동일한 조건 하에서 모든 시료 및 대조군 shRNA 바이러스를 동시에 제조하고 이후 동일한 수의 세포를 처리하기 위해 동일한 부피의 shRNA 바이러스를 사용함으로써 직접적인 비교를 사용하여 조절되고 입증되어야 한다. 도 4는 shRNA 서열 A2 및 A5가 유의적으로 아넥신 A5 발현을 하향조절하였음을 나타낸다(도 4a). 이와 같이, 비-포유동물 유전자를 타겟팅하는 서열로 한 대조군(scramble) 또는 shRA 서열이 없는 것(293T)에 비하여 Y3, Y4 또는 Y5의 세포로의 도입은 YB1의 유의적인 하향 조절을 야기했다(도 4b). 따라서, 이러한 4 개의 shRNA 서열, 즉 A2, A5, Y4 및 Y5를 후속 연구에 사용하였다.
AAV 제조를 위해, 퓨로마이신으로 표지되지 않은 shRNA를 갖는 세포를 제거하기 위해서 퓨로마이신의 존재 하에서 10일 이상 동안 배양함으로써 shRNA 서열, 즉 A2, A5, Y4, Y5 또는 스크램블을 운반하는 생산자 세포를 확립하였다. 각각의 shRNA 서열에 대해서 최대 7개의 독립한 넉다운 세포주를 생성하였고 AAV 벡터 제조에 사용하였다. 편차를 최소화 하기 위해서, AAV 벡터를 5천만 이상의 세포를 포함하는 15cm 지름의 플레이트로부터 그리고 동일한 조건 하에서 넉다운 및 대조군 세포주로부터 동시에 제조하였고 이후 실시간 PCR을 이용하여 AAV 게놈 역가를 정량하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, shRNA 서열 YB1_Y4의 생산자 세포로의 도입은 AAV의 50배까지의 증가를 야기하고(도 5a) 대조군 shRNA 스크램블과 비교하여 AAV8(도 5b) 벡터 게놈 역가에서 10배 증가를 야기하였으며 동일한 Y4 shRNA 서열은 AAV5 제조에 있어 유의적인 영향을 주지 않았다(데이터 미도시). 이는 AAV의 세 가지 혈청형 사이의 고유한 차이점을 나타낸다. 넉다운 세포에서 80일 이상 지속된 YB1 발현의 감소에도 불구하고, 생산자 세포주에서 Y4의 최대 효과는 단지 20-40 일 동안의 배양에서 얻어졌다(도 5a). 또한 유사한 시간-의존성 패턴이 AAV8 생산자 세포에서 발견되었다(도 5b).
도 6은 냉동보존에서 회복되고 20 내지 80일 동안 배양된 넉다운 세포의 7 집단에서 YB1의 유의적인 하향 조절을 나타내고, 집단 사이에 공통점 및 YB1 넉다운 세포의 지속가능성을 증명한다.
도 7은 shRNA 바이러스를 5 내지 100ml/105 세포로 증가시킬 경우에 YB1 분해의 약간의 증가(도 7a)를 나타내고 사용된 shRNA를 포함하는 50ml 바이러스의 경우 벡터 게놈 역가에 대한 최대 효과가 관찰되었음을 나타내며(도 7b), shRNA를 포함하는 바이러스의 양이 증가할 때 벡터 제조에 대한 포화 및 잠재적 독성 효과를 나타낸다.
또한 렌티바이러스 벡터 전달 시스템을 10 shRNA 서열, 즉 NCL 및 NPM1 발현 각각에 영향을 주기 위해 NCL 및 NPM1 유전자를 타겟으로 하는 N1 내지 N5 및 N6 내지 N10을 스크리닝하기 위해서 사용하였다.
도 8a는 비-포유동물 유전자를 타겟으로 하는 스크램블 shRNA가 있는(scramble) 또는 어떠한 shRNA 서열도 없는(293T) 두 개의 대조군 세포와 비교하는 경우 shRNA 서열 NPM-N6 내지 NPM-N10(서열번호 4 내지 서열번호 8)의 세포로의 도입이 NPM1 발현의 유의적인 하향 조절을 달성하였음을 나타낸다. shRNA NPM-N6 및 NPM-N9(도 8a, 원)은 시험된 5개의 서열 중 가장 넉다운된 유전자로 나타났고 따라서 후속 조사를 위해 선택하였다. NPM1-N9 및 NPM1-N6 넉다운 세포에서 NPM1 발현의 감소는 퓨로마이신 선택 배지(도 8b)에서 배양 및 또한 냉동보존에서 회복된 넉다운 세포(도 8c)에서 배양한 후 80일 이상동안 지속되었다(도 8b).
NCL 유전자를 타겟으로 하는 4개의 shRNA 서열, NCL-N1 내지 NCL-N4(서열번호 9 내지 서열번호 12)는 NCL 발현의 부분적인 감소를 나타내었고, 이들 중 NCL-N1 및 NCL-N4가 큰 효과를 가졌고(도 9a, 원) 따라서 추가적인 연구를 위해 선택하였다. NCL 발현에 있어서 NCL-N1 및 NCL-N4의 넉다운 효과 또한 퓨로마이신 선택 배지(도 9b)에서 배양 및 또한 냉동보존 후(데이터 미도시)에서 배양한 후 80일 이상동안 지속되었다(도 8b).
도 10은 shRNA NPM1-N9로 NPM1의 하향조절이 AAV2/GFP의 벡터 게놈 역가에서 35배까지(도 10a), AAV8/GFP에서 30배까지(도 10b)의 증가를 유도하였음을 나타내고, 이는 AAV 제조에 있어서 NPM1 단백질의 중요한 역할을 나타낸다. 벡터 게놈 역가에 대한 NPM1의 상향조절 효과는, 약 40일 동안의 배양시 넉다운 생산자 세포에서 30배까지의 증가인 최대 효과를 나타내며, AAV2/GFP(도 10a) 및 AAV8/GFP(도 10b)에 대해서 발생순서대로(chronological)의 변화를 나타내고, 생산자 세포에서 유전자 넉다운 이후 90일 까지 유지된다.
NCL의 하향조절은 AAV2 게놈 역가에서 40배 까지의 증가로 AAV2 벡터 제조에 대해 유사한 상향조절 효과를 나타낸다. 그러나, 2-40배 범위로, 생산자 세포의 상이한 집단 사이에서, 유의적인 편차가 존재한다(도 11a). NCL의 유전자 넉다운은 AAV2와 비교하여 AAV5 및 AAV8 게놈 역가에 대해 더 낮은 상향조절 효과(10배까지의 증가)를 가진다(각각 도 11b 및 11c). NCL 넉다운 생산자 세포로부터 발생순서대로의 유의적 변화는 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
실시예 6- YB1의 CRISPR 넉다운
YB1 발현을 넉아웃 또는 넉다운하기 위해서 shRNA에 대한 대안으로서 CRISPR 게놈 편집을 사용하였다. YB1 유전자 서열을 포함하는 전체 Homo sapiens 염색체 1 서열(Accession number NC_000001.11))을 타겟으로 하는 본 연구에 사용된 gRNA 서열은 CRISPR/Cas9 프로그램(http://chopchop.re.fas.harvard.edu/)을 사용하여 설계하였다. 4쌍의 gRNA 서열(A, B, C 및 D)(표 4)를 선택하였고 GeneArt CRISPR nuclease vector kit(Life technology, cat number A21174)를 YB1 gRNA 넉아웃 생산자 세포를 생성하기 위해 사용하였다.
각각의 4 개의 CRISPR gRNA 서열 A, B, C 또는 D에 대해서 CRISPR gRNA 넉아웃 세포의 두 집단(B1 및 B2)을 제조하였다. 각각의 gRNA 쌍에 대한 모 B1 및 B2 gRNA 생산자 세포로부터 단일 세포 클론(C1 내지 C5)를 추가적으로 유도하였다. 어떠한 gRNA 서열도 없는 모 293T 세포(293T)를 대조군으로 사용하였고; 시료 로딩 표준화를 위해 추가적으로 하우스키핑 유전자 GAPDH를 사용하였다.
Figure pct00010
총 10 개의 단일세포 클론에서 YB1 유전자 넉아웃을 관찰하였다. 도 12는 이러한 세 가지 gRNA 쌍의 사용의 YB1 발현에 대한 효과를 나타낸다. 293으로 표시된 레인은 293 모세포주를 지칭한다. 단일 세포 클로닝 전에 생성된 B1 및 B2는 벌크 넉아웃 세포이다. C1 내지 C5는 벌크 넉아웃 세포로부터 생성된 단일 세포 클론이다.
도 12로부터 명백한 바는: gRNA 쌍 A는 클론성 세포주 C1에서 YB1 발현을 유의적으로 저해하고; gRNA 쌍 B는 벌크 넉아웃 세포 B1에서 YB1 발현을 식별할 수 있게 저해할 뿐만 아니라 벌크 넉아웃 세포 B2 및 클론성 세포주 C1 내지 C4에서 YB1 발현을 유의적으로 저해하며; gRNA 쌍 C는 클론성 세포주 C1 및 C5에서 YB1 발현을 식별할 수 있게 저해할 뿐만 아니라 벌크 넉아웃 세포 B2 및 클론성 세포주 C2 내지 C4에서 YB1 발현을 저해한다.
실시예 7- YB1 넉다운 생산자 세포주의 분자적 분석
AAV 제조에 대한 YB1의 분자적 메커니즘의 영향을 이해하기 위해서, YB1 넉다운 세포에서 AAV2 단백질(Rep 및 Cap) 발현 및 벡터 DNA 생성을 체계적으로 분석하였다. 도 13a는 각각 일시적 형질감염 24 및 72시간 후에, 스크램블 세포와 비교하여 YB1 넉다운 세포에서 rep 유전자 발현에 있어서 12 및 4배 증가를 나타내고, rep 유전자 발현에 대한 천연의 YB1의 좋지 않은 효과를 나타낸다. 이와 대조적으로, YB1 넉다운 세포(1.29±0.2×1012 캡시드/108 세포)에서 전체 AAV2 캡시드 단백질의 생성은 스크램블 세포(8.87±0.1×104 캡시드/108 세포)에서보다 ~7배 더 낮았고(도 13b), 이는 천연의 YB1의 존재가 cap 유전자 발현에 있어 유익함을 나타낸다. 또한, 수확한 벡터 시료 내 캡시드 단백질의 양은 YB1 넉다운 세포(6.27±0.2×1013 캡시드/108 세포) 및 스크램블(6.77±0.2×1013 캡시드/108 세포) 세포와 유사했고(도 13b), 벡터 캡시드 입자 형성이 세포 내에서 생성되는 캡시드 단백질의 양과 독립적일 수 있고, 세포 내에서 형성될 수 있는 입자의 수에 제한이 있음을 나타낸다.
각각 YB1 shRNA 삽입에 대한 U6 서열을 타겟으로 하고, AAV2 패키징 플라스미드 pRep/Cap 및 phrGFP 삽입에 대한 rep 및 CMV 프로모터 서열을 타겟으로하는 실시간 qPCR을 사용하여 DNA 삽입을 체계적으로 분석하였다. 모아진 YB1 넉다운 세포 내에서의 1 카피의 YB1 shRNA/세포의 평균과 동일한, 1.3±0.17×108 카피/108 세포의 YB1 shRNA 서열이 YB1 넉다운 세포에서 관찰되었다. AAV 패키징 플라스미드 pRep/Cap 및 phrGFP의 삽입은 스크램블 및 YB1 넉다운 세포에서, ~2×107 카피의 Rep/Cap 및 ~3×107 카피의 phrGFP/108 세포로 유사하였다.
AAV2 벡터 DNA의 생성에 대한 YB1 유전자 넉다운의 영향을 분석하기 위해서 AAV 패키징 플라스미드의 일시적 형질감염 72시간 후에 YB1 넉다운 세포에서 (1) 패키징되고 패키징되지 않은 벡터 DNA 모두를 포함하는 전체 벡터 DNA, (2) 패키징되지 않은 벡터 DNA, 및 (3) 패키징된 벡터 DNA의 카피를 벡터-특이적 CMV 서열을 타겟으로 하는 qPCR을 이용하여 체계적으로 정량하였다. 플라스미드 DNA를 벤제나제(benzenase)로 플라스미드 DNA를 제거, 시료 동결-해동 후에 세포막과 핵을 제거, 및 패키징된 벡터 DNA를 캡시드로부터 방출하기 위해 프로테나제 K로 AAV 캡시드를 분해함으로써 전체 벡터 DNA를 준비하였다. 세포질 내 비-융합된 벡터 플라스미드 DNA 또한 전체 벡터 DNA 카피에 기여할 수 있다; 그러나, 형질감염 및 제조 과정이 동시에 수행되며 YB1 및 스크램블 세포에 대해 동일함을 고려하면, 세포질 내 플라스미드 DNA의 양은 유사할 것이며 상대적인 전체 벡터 DNA 생성의 계산에 유의적인 변화가 없을 것이다. 도 13c는 전체 벡터 DNA(+PK)의 카피가 스크램블 세포(1.46±0.5×1012 카피/108 세포)에서 보다 YB1 넉다운 생산자 세포(1.93±0.08×1013 카피/108 세포)에서 ~13배 더 높음을 나타내고, YB1 유전자 넉다운이 벡터 DNA 생성을 촉진함을 나타낸다.
패키징된 벡터 DNA를 AAV 캡시드로부터 방출하기 위한 프로테나제 K 처리가 없는 것(-PK)을 제외하고 전체 DNA 시료와 유사한 방식으로 패키징되지 않은 AAV2 벡터 DNA를 제조하였다. 패키징되지 않은 벡터 DNA의 카피가 스크램블 세포(2.61±0.8×1011 카피/108 세포)에서 보다 YB1 넉다운 세포(2.02±0.5×1012 카피/108 세포)에서 ~8배 더 높았다(unpackaged DNA, 도 13c). 물리적인 벡터 게놈 역가를 나타내는, 패키징된 AAV2 벡터 DNA를 패키징되지 않은 벡터 DNA를 세포질 내에서 제거하기 위한 DNAse I 처리(+DNAse I) 후 패키징된 벡터 DNA를 캡시드로부터 방출하기 위한 프로테나제 K의 처리(+PK)에 의해서 준비하였다. 패키징된 벡터 DNA의 카피(+DNAse I/+PK, 도 13c)는 스크램블 세포(2.16±0.3×1010카피/108 세포)에서 보다 YB1 넉다운 세포(7.97±0.5×1010카피/108 세포)에서 4배 더 많았다(도 13c). 이러한 구체적인 분자적 연구 세트에서, 본 발명자들이 스크램블 세포에서와 비교하여 YB1 넉다운 세포에서 AAV2 벡터 게놈 역가에 있어서 4배(유의적임)의 증가를 발견했다는 것이 주목할만하다.
요약하면, 전체 벡터 DNA(13배 증가), 패키징되지 않은(8배 증가), 및 패키징된 벡터 DNA(4배 증가) 사이에서의 유의적인 차이가 발견되고 YB1 제조 시스템에서 AAV 벡터 DNA 패키징의 향상에 대한 잠재성을 강조한다. 더욱이, 캡시드 단백질의 양이 유사(도 13b)하지만 패키징된 DNA의 카피(도 13c)가 스크램블 세포에서보다 YB1 넉다운 세포로부터 유래한 동일한 집단의 수확된 벡터 시료에서 4배 더 높다는 점을 고려하면, 결과는 YB1 유전자 넉다운의 AAV 생성물 내에서의 빈 입자의 수 감소에 있어서 상당한 이점을 나타낸다.
검토
본 발명자들은 AAV 벡터 제조에 있어서 YB1의 중요한 역할을 최초로 증명하였다. YB1 유전자를 타겟으로 하고 하향조절하는 shRNA 서열 Y4를 AAV 생산자 세포로 도입시키는 것은 AAV2 및 AAV8 벡터 게놈 역가에 있어서 각각 50 및 10배 까지의 증가를 야기한다. 스크램블 세포와 비교하여 YB1 넉다운 세포 내에서 YB1 넉다운 세포의 분자적 특성은 rep 발현에 있어서 ~12배 증가, 벡터 DNA 생성에 있어서 ~13배 증가, 및 cap 발현에 있어서 ~7배 감소를 나타냈고, AAV 생물학에서 YB1 유전자의 중요한 역할을 밝혔다.
YB1은 거의 모든 DNA 및 mRNA-의존적 과정에 관여하는 DNA 및 RNA-결합 단백질이다. YB1은 다른 수준에서 유전자 조절을 매개하기 위해서 mRNA를 패키징하고 안정화한다. YB1은 이중가닥 DNA(dsDNA) 및 단일가닥 DNA(ssDNA) 모두에 결합하지만, ssDNA에 대해 훨씬 더 높은 결합 친화력을 갖는다. YB1이 서열-특이적 방식으로 프로모터 또는 인핸서 부위에서 ssDNA를 안정화시킴으로써 활성화 단백질의 결합을 예방하는 것으로 제안되었다. 특히, YB1은 ss-DNA 모티프 GGGG(TT)에 대해 가장 높은 결합 친화력을 갖는다. AAV2 ssDNA 게놈의 분석은 이러한 단일가닥 GGGG(TT) 모티프가 AAV2 게놈(NCBI 서열 NC_001401.2)의 뉴클레오티드 137로부터 142까지의 AAV2 ITR 부위 내에 존재함을 밝혔고, YB1 단백질에 대한 잠재적 AAV DNA 결합 부위를 나타낸다. ITR 결정 돌연변이유발은 125 뉴클레오티드 긴 헤어핀 바로 뒤이며 단일가닥 GGGG(TT) 모티프를 포함하는 20 뉴클레오티드 D 서열(126-146 뉴클레오티드에서부터)이 AAV DNA 게놈의 캡시드화에 필요하며 따라서 AAV에 대한 패키징 신호로 제안된다; 특히, AAV 캡시드 단백질의 N-말단 부분은 D 서열에 결합하여 AAV ssDNA의 조립된 AAV 캡시드로의 캡시드화를 야기한다. 따라서, ITR D 서열 부분에 결합하기 위한 YB1 및 AAV 캡시드 모두의 능력은 YB1 및 AAV 캡시드 사이의 경쟁을 부과하며 AAV 게놈의 캡시드화를 좋지 않게 한다.
본 발명에 의해서 AAV 혈청형 2 (AAV2)의 게놈 분석이 이러한 GGGG(TT) 모티프가 AAV 게놈(NCBI 서열 NC_001401, 버전 NC_001401.2 GI:110645916)의 137 부분부터 142까지의 ITR 부위 내에 존재함이 밝혀졌다. 이는 AAV2 게놈에 대한 YB1의 잠재적 결합 위치를 나타낸다. 본 발명자들은 AAV2 ITR(그러나 각각 AAV5 및 AAV8 캡시드 단백질과 함께)을 포함하는 AAV5 및 AAV8 혈청형의 키메라 형태를 생성하였다. 따라서, GGGG(TT) 모티프가 YB1의 유일한 결합 위치인 경우, AAV2 및 키메라 형태의 AAV5 및 AAB8에 있어서 YB1이 바이러스 입자 제조에 대해 유사한 효과를 가지는 것으로 예상된다. 그러나, 본 발명자들은 YB1 넉아웃 세포 내에서 제조된 AAV2, AAV5 및 AAV8 벡터 중에서 스크램블 대조군에 비하여 AAV 벡터 역가에서 유의적 차이를 증명했다. 구체적으로, 본 발명자들은 AAV5 역가에 있어서 유의적 차이가 없는 것과 AAV8 역가에 있어서의 10배 증가에 비교해서, YB1이 넉다운된 생산자 세포 내에서 AAV2 벡터 역가에 있어서의 50배의 증가를 발견하였다. 이는 DNA 서열 특이적 효과뿐만 아니라, AAV 벡터 제조에 대한 YB1 넉다운의 효과를 나타내는 일부 AAV 캡시드 단백질-특이적 구성요소가 또한 존재함을 시사한다.
A/P, CSD 및 CTD로 불리는, 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 3개의 YB1 도메인이 존재한다. 구체적으로, YB1 단백질은 중요한 조절 단백질, 예컨대 p53, Akt 키나아제, hnRNP K 및 TATA-결합 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져있다. 또한 YB1은 바이러스성 단백질, 예컨대 HIV TAT, 폴리마바이러스(polymavirus)의 거대 T 항원, HCV(Hepatitis C Virus) 단백질 NS3/4A 및 인플루엔자 리보핵산단백질(RNP)에 결합함으로써 많은 바이러스의 복제에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다. 사실, YB1의 shRNA 넉다운은 80% 까지의 HCV 역가의 감소를 야기하는 것으로 나타났다. 그 연구에서, YB1의 넉다운이 바이러스성 단백질의 발현에 영향을 주지 않으며, 바이러스성 RNA의 안정성 및 제조에도 영향을 주지 않음을 밝혔고, 이는 YB1의 넉다운이 바이러스 조립을 위해서 중심 단백질을 모집하는데 필요한 YB1-NS3/4A vRNA 상호작용체(interactome)의 형성을 파괴함을 나타낸다.
아데노바이러스 복제에 있어서 YB1의 역할은 특히 YB1의 하향조절이 50배만큼 AAV 제조를 향상시킨다는 발명자들의 발견의 이해와 연관된다. 아데노바이러스에 감염된 세포에서 아데노바이러스 단백질 E1B와 YB1의 상호작용은 핵 내에 YB1의 축적, E2A 유전자의 YB1 활성화, 및 이후의 아데노바이러스 DNA 복제의 시작을 야기하는 것으로 나타났다. YB1의 과발현이 조절된 아데노바이러스 E2 프로모터는 E1 의존적 방식으로 아데노바이러스 DNA 복제 뿐만 아니라 E1이 결실된 아데노바이러스 벡터로부터 유래한 감염성 입자의 제조에 있어서 2-3-log의 증가를 유도한다. 결과적으로, YB1 의 과발현은 아데노바이러스에 기반한 벡터 개발 및 바이로테라피에서 추가적으로 활용된다.
지금까지 AAV 바이러스와 YB1의 직접적인 연관성이 없는 것으로 보고되었다; 그러나 AAV 생활사에서 아데노바이러스의 역할은 잘 증명되어 왔고 이는 AAV 벡터 제조에 있어서 YB1 넉다운의 이후의 메커니즘 이해를 가능하게 할 수 있다. 본 실시예에서 사용된 AAV 제조 시스템은 4개의 아데노바이러스 구성요소, 즉 생산자 세포주에서 안정하게 발현되거나 AAV를 위한 헬퍼 기능을 가지고 플라스미드로부터 일시적으로 발현되는 E1, E2A, E4 및 VA 유전자를 제공한다. E4 부위의 ORF6은 단일 가닥의 AAV 게놈으로부터 DNA복제에 있어서 이후의 단계를 위한 기질인 이중 가닥의 형태로 전환에 있어 중요하다. 단백질 E2A는 AAV 바이러스 DNA에 대한 결합을 통해서 바이러스 DNA 복제에서 중요한 역할을 하고, DNA 신장 및 그것의 주형으로부터 유래한 신장하는 가닥의 이동을 촉진한다. YB1 및 E2A 모두 DNA 결합 단백질(DBP)이지만 이들은 그들의 세포성 및 바이러스성 기원에 의해서 각각 상이하다. YB1과 E2A는 단일 가닥 DNA에 대한 비슷한 결합 선호를 공유한다. 아데노바이러스 E2A가 AAV 생활사에서 세포성 DBP보다 뛰어난 조절 특성을 가지는 것이 가능하다; 따라서, YB1의 하향조절은 AAV DNA에 대한 YB1 결합의 경쟁을 감소시킬 수 있고, E2A-AAV DNA 상호작용의 향상을 야기하고, AAV DNA 복제의 효율 증가 및 궁극적으로 AAV 벡터 게놈 역가에 있어서의 증가를 야기한다. 이러한 추측은 E2A를 포함하는 AAV 헬퍼 구성요소가 결핍된 세포가 여전히 소량의 AAV 입자를 제조할 수 있음을 관찰함으로써 지지될 수 있고, 이는 낮은 수준의 세포 헬퍼가 풍부하지만 덜 효과적인 세포성 DBP 예컨대 AAV 생활사에서 YB1로부터 기능함을 나타낸다.
한편, 아데노바이러스 단백질 E1A-E1B 및 E2A는 AAV2 p5 프로모터를 활성화시키는 데 중요한 역할을 하고, AAV2 rep 유전자의 전사 및 발현을 야기한다. 혈관 내피 성장 인자 프로모터에 대한 YB1의 결합이 다른 전사 인자의 결합을 막고 전사 및 번역의 저해를 야기함이 이전에 입증되었다. 프로모터의 ssDNA 부위에 대한 YB1의 결합이 ssDNA의 안정 및 저해된 유전자 전사 및 번역을 야기함 또한 나타났다. 따라서, YB1의 하향조절은 상승적으로 본원에 보고된 실험에서 관찰된 AAV Rep 유전자 발현 및 벡터 역가에 있어서의 유의적인 증가에 기여하는 AAV2p5 프로모터에 대한 E2A 결합을 촉진하는 것이 가능하다.
본 발명의 실시예는 AAV 제조에 있어 YB1의 혈청형-특이적 역할을 나타낸다; 구체적으로, YB1의 넉다운은 AAV2 및 AAV8 제조를 각각 50 또는 10배 향상시켰으나 AAAV5 제조에 있어서는 유의적인 효과가 없었다. 조사된 AAV 벡터의 3개의 혈청형, 즉 AAV2, AAV5 및 AAV8은 잠재적 YB1 결합 모티프 GGGG(TT)를 공유하는 동일한 ITR 서열을 가지며 아데노바이러스에서 유래한 동일한 헬퍼 구성요소의 존재 하에서 제조된다. AAV2 및 키메라 AAV8 벡터는 Rep/Cap 패키징 플라스미드 내의 동일한 AAV2 rep 유전자 서열을 추가적으로 공유한다. AAV2, AAV5 및 AAV8 벡터의 3가지 혈청형 사이의 차이점의 관점에서, 혈청형-특이적 cap 유전자 서열이 그들 중 하나에 기여한다. AAV2 및 AAV8 캡시드 단백질은 그들의 일차 서열에 있어서 82% 이상의 상동성을 공유하고 캡시드 단백질의 구조에 있어서 더욱 유사한 전체적인 위상을 공유한다. AAV2 및 AAV8 캡시드 단백질 사이의 주목할만한 구조적 차이점은 캡시드 표면에 위치하고 캡시드 조립 및 게놈 패키징과 연관되기보다는 타겟 세포에 대한 AAV2와 AAV8의 결합 특성과 연관된 것으로 알려져 있고, 캡시드 조립 관점에서 AAV2 및 AAV8 사이의 유사성을 추가적으로 증명한다. 대조적으로, AAV5는 가장 다른 AAV 혈청형 중 하나로, AAV2 및 AAV8을 포함하는 다른 혈청형과 단지 ~55%의 서열 상동성을 공유한다. 더 작은 HI 및 VR-IV 루프 및 더 큰 VR-VII를 포함하는, AAV5 캡시드 단백질의 특이한 구조적 특징이 캡시드 조립, 게놈 패키징, 및 항원성 결정의 특이성을 조절하는 VP 부위에 위치하고, AAV2 및 AAV8 벡터 제조에 있어서의 관찰된 차이점을 설명할 수 있다. 본원에 개시된 결과는 또한 YB1 넉다운이 rep 유전자 발현 및 벡터 DNA 제조에 있어서 각각의 12 및 13배의 증가, 및 cap 유전자 발현에 있어서 ~7배 감소를 야기함을 나타내고, AAV 벡터 제조에 있어서 YB1의 분자적 메커니즘의 영향의 바탕이 된다.
또다른 중요한 차이점은 AAV5가 AAV2 및 AAV8 벡터에서 AAV2 rep 유전자와 단지 58%의 상동성을 공유하는 rep 유전자를 갖는 것이다. 추가적인 서열 분석은 AAV2 및 AAV5가 다른 프로모터, 즉 AAV2 및 AAV5의 rep 전사 및 번역에 대해 p5 및 p7을 사용함을 나타내었다. rep 유전자 발현에 있어서의 p7의 효율성 때문에, AAV2 p5와 비교하는 경우에 AAV5 p7 프로모터가 293 세포에서 Ad5 구성요소에 대해 덜 의존적임이 나타났다. 한편, 아데노바이러스 단백질 E1A-E1B 및 E2A가 AAV2 p5 프로모터를 활성화함에 중요한 역할을 하고, AAV2 rep 유전자의 전사 및 발현을 야기한다. 세포성 및 바이러스성 프로모터에 대한 YB1 조절의 메커니즘에 대한 상당히 많은 보고가 있다. 예를 들어, VEGF 프로모터에 대한 YB1의 결합이 다른 전사 인자의 결합을 막고 전사 및 번역의 저해를 야기한다. 프로모터의 ssDNA 부위에 대한 YB1의 결합이 ssDNA의 안정화를 야기하고 또한 유전자 전사 및 번역을 저해함이 나타났다. 따라서, YB1의 하향 조절이 본 발명자들이 관찰한 AAV2 및 AAV8 역가에 있어서의 유의적인 증가에 상승적으로 기여하는 AAV2 p5 프로모터에 대한 E2A 결합을 촉진하는 것이 가능하다.
DNA 복제, AAV 전사 및 번역에서 YB1의 잠재적 역할을 고려하면, YB1의 하향조절이 AAV2 ssDNA 예컨대 ITR 서열에 대한 E2A와 YB1의 경쟁 감소를 통한 AAV DNA 복제에 있어서의 증가 뿐만 아니라 AAV2p5 프로모터의 조절 하에서 Rep 및 Cap 발현에 있어서의 증가를 야기하는 것이 가능하다. 또한, AAV2/2 벡터에서 천연의 AAV2p5 프로모터가 Rep 및 Cap 단백질의 발현에 있어서 키메라 AAV2/8 Rep/Cap과 비교하여 더욱 효과적으로 수행할 수 있고, AAV2 및 AAV8 제조에 있어서 각각 관찰된 50배 및 10배의 증가를 야기한다. AAV5 벡터의 경우, 벡터 DNA 복제는 AAC2 및 AAV8에서와 같이 유사한 경쟁-기반 메커니즘을 통해서 유사하게 증가될 수 있다; 그러나, 조합된 YB1 및 아데노바이러스 헬퍼 기능에 덜 의존적인, AAV5p7 프로모터의 조절 하에서의 AAV5 Rep/Cap 발현의 낮은 수준은 과잉의 AAV 벡터 게놈이 완전한 AAV5 벡터로 패키징되는 것을 제한할 수 있고, 생산자 세포에서 AAV 벡터 DNA의 축적을 야기한다.
요약하면, 본 발명자들은 LC-MS/MS 및 면역블롯팅을 이용한 확인을 사용하여 YB1과 AAV 벡터의 연관성을 동정하였고, AAV 벡터 제조에 있어서 YB1 유전자 넉다운의 유의적인 향상을 최초로 밝혔다. AAV2 벡터 역가에 있어서의 유의적인 증가는 스크램블 세포와 비교하여 YB1 넉다운 세포에서 rep 유전자 발현 및 벡터 DNA 제조에 있어서의 유의적인 증가 때문일 수 있다. 비록 AAV 생활사에서 YB1의 직접적인 연관이 보고된 바 없지만, YB1가 AAV 제조에 있어 AAV 벡터 DNA 복제의 차단을 포함하는 부정적인 영향을 가할 것으로 추측된다. 이는, AAV2p5 프로모터에 대한 결합에 의해서 그리고 활성화 단백질 예컨대 E2A의 결합의 예방에 의해서 AAV 바이러스성 단백질(예컨대 AAV rep 단백질)의 전사 및 발현을 저해하는, ITR 서열 및 AAV2p5 프로모터에 대한 결합에 있어서 E2A와의 경쟁에 의해 매개될 수 있다. YB1의 AAV에 대한 효과가 아데노바이러스 헬퍼 바이러스 의존적인 것이 가능하다.
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Pro Pro Ala Ala Pro Pro Ala 1 5 10 15 Ala Pro Ala Leu Ser Ala Ala Asp Thr Lys Pro Gly Thr Thr Gly Ser 20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Leu Thr Ser Ala Ala Pro Ala 35 40 45 Gly Gly Asp Lys Lys Val Ile Ala Thr Lys Val Leu Gly Thr Val Lys 50 55 60 Trp Phe Asn Val Arg Asn Gly Tyr Gly Phe Ile Asn Arg Asn Asp Thr 65 70 75 80 Lys Glu Asp Val Phe Val His Gln Thr Ala Ile Lys Lys Asn Asn Pro 85 90 95 Arg Lys Tyr Leu Arg Ser Val Gly Asp Gly Glu Thr Val Glu Phe Asp 100 105 110 Val Val Glu Gly Glu Lys Gly Ala Glu Ala Ala Asn Val Thr Gly Pro 115 120 125 Gly Gly Val Pro Val Gln Gly Ser Lys Tyr Ala Ala Asp Arg Asn His 130 135 140 Tyr Arg Arg Tyr Pro Arg Arg Arg Gly Pro Pro Arg Asn Tyr Gln Gln 145 150 155 160 Asn Tyr Gln Asn Ser Glu Ser Gly Glu Lys Asn Glu Gly Ser Glu Ser 165 170 175 Ala Pro Glu Gly Gln Ala Gln Gln Arg Arg Pro Tyr Arg Arg Arg Arg 180 185 190 Phe Pro Pro Tyr Tyr Met Arg Arg Pro Tyr Gly Arg Arg Pro Gln Tyr 195 200 205 Ser Asn Pro Pro Val Gln Gly Glu Val Met Glu Gly Ala Asp Asn Gln 210 215 220 Gly Ala Gly Glu Gln Gly Arg Pro Val Arg Gln Asn Met Tyr Arg Gly 225 230 235 240 Tyr Arg Pro Arg Phe Arg Arg Gly Pro Pro Arg Gln Arg Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Asp Gly Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Gln Gly Asp Glu Thr Gln 260 265 270 Gly Gln Gln Pro Pro Gln Arg Arg Tyr Arg Arg Asn Phe Asn Tyr Arg 275 280 285 Arg Arg Arg Pro Glu Asn Pro Lys Pro Gln Asp Gly Lys Glu Thr Lys 290 295 300 Ala Ala Asp Pro Pro Ala Glu Asn Ser Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gln 305 310 315 320 Gly Gly Ala Glu <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ttcctacttg gcagtacatc tacg 24 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gtcaatgggg tggagacttg g 21 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 32 tgagtcaaac cgctatccac gccca 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 33 atcggcggcg cctgccggcg gtttt 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 34 cgccggcagg cgccgccgat cggtg 25 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 35 gtaatggctt ttgtagggtg gttt 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 36 caccctacaa aagccattac cggtg 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 37 ggaccatacc tgcggaatcg gtttt 25 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 38 cgattccgca ggtatggtcc cggtg 25 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 39 caaagacagc ctagaaggag tttt 24 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 40 tcctctctag gctgtctttg cggtg 25

Claims (24)

  1. 대조군 생산자 세포주와 비교하여 YB1, NPM1 및 NCL 중 하나 이상의 발현이 조절된 유전자 변형 생산자 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 대조군 생산자 세포주와 비교하여 (i) NPM1 및 NCL; (ⅱ) YB1 및 NPM1; (ⅲ) YB1 및 NCL; 또는 (ⅳ) YB1, NPM1 및 NCL;의 발현이 조절된, 유전자 변형 생산자 세포주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대조군 생산자 세포주와 비교하여 YB1, NPM1 및 NCL 중 하나 이상의 발현이 감소된 것인, 유전자 변형 생산자 세포주.
  4. 제3항에 있어서, YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 CRISPR 게놈 편집(CRISPR genome editing), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA 또는 안티센스 RNA를 사용하여 감소된 것인, 유전자 변형 생산자 세포주.
  5. 제4항에 있어서, YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 shRNA를 사용하여 감소된 것이고, 바람직하게:
    (a) YB1 발현은 서열번호 14 내지 서열번호 18(Y1 내지 Y5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고;
    (b) NPM1 발현은 서열번호 4 내지 서열번호 8(NPM-N6 내지 NPM-N10)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고/감소되거나;
    (c) NCL 발현은 서열번호 9 내지 서열번호 13(NCL-N1 내지 NCL-N5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소된 것인, 유전자 변형 생산자 세포주.
  6. 제4항에 있어서, YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 감소된 것인, 유전자 변형 생산자 세포주.
  7. 제6항에 있어서, YB1의 발현은 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 서열번호 37 및 서열번호 38; 및/또는 서열번호 39 및 서열번호 40:으로부터 선택된 gRNA 쌍을 사용하여 감소된 것인, 유전자 변형 생산자 세포주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 생산자 세포주와 비교하여 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 추가적인 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조절된, 유전자 변형 생산자 세포주.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 배아 신장 293T 세포주인, 유전자 변형 생산자 세포주.
  10. YB1, NPM1 및 NCL 중 하나 이상의 발현이 조절된 생산자 세포주 내에서 아데노-부속 바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 아데노-부속 바이러스(AAV) 벡터의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 생산자 세포주 내에서 (i) NPM1 및 NCL; (ⅱ) YB1 및 NPM1; (ⅲ) YB1 및 NCL; 또는 (ⅳ) YB1, NPM1 및 NCL의 발현이 조절된 것인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, YB1, NPM1 및/또는 NCL 발현의 조절은 YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현의 감소인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, YB1, NPM1 및/또는 NCL 발현은 CRISPR 게놈 편집(CRISPR genome editing), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA 또는 안티센스 RNA를 사용하여 감소된 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 shRNA를 사용하여 감소된 것이고, 바람직하게:
    (a) YB1 발현은 서열번호 14 내지 서열번호 18(Y1 내지 Y5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고;
    (b) NPM1 발현은 서열번호 4 내지 서열번호 8(NPM-N6 내지 NPM-N10)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소되고/감소되거나;
    (c) NCL 발현은 서열번호 9 내지 서열번호 13(NCL-N1 내지 NCL-N5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 shRNA를 사용하여 감소된 것인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, YB1, NPM1 및/또는 NCL의 발현은 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 감소된 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, YB1의 발현은 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 서열번호 37 및 서열번호 38; 및/또는 서열번호 39 및 서열번호 40으로부터 선택된 gRNA 쌍을 사용하여 감소된 것인, 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 생산자 세포주에서 표 2에 열거된 하나 또는 그 이상의 추가적인 유전자 및/또는 단백질의 발현이 조절된, 방법.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터의 역가가 대조군 방법에 의해서 제조된 AAV 벡터의 역가와 비교하여 2배 이상 증가된, 방법.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율이 대조군 방법에 의해서 제조된 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율과 비교하여 20% 이상 증가된, 방법.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 생산자 세포주는 인간 배아 신장 293T 세포주인, 방법.
  21. 제10향 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터의 혈청형이 AAV2, AAV5 또는 AAV8인, 방법.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 생산자 세포주로부터, 또는 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 얻을 수 있는 아데노-부속 바이러스(AAV) 벡터의 집단.
  23. 제22항에 있어서, 집단 내 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율이 대조군 방법에 의해서 제조된 집단 내 완전한 AAV 벡터:빈 AAV 벡터의 비율과 비교하여 20% 이상 증가된, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5 또는 AAV8 혈청형 벡터인, 방법.
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