CN109511259B - 通过适体调节的聚腺苷酸化来调控基因表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于通过基于适体的U1小核核糖核蛋白(snRNP)介导的多腺苷酸化抑制的调节来调控基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。在包含效应区和适体的核糖开关的情形中，多核苷酸构建体含有U1结合位点，使得当适体结合配体时，发生靶基因表达。

Description

通过适体调节的聚腺苷酸化来调控基因表达

发明领域

本发明提供了用于通过基于适体的U1 snRNP介导的多腺苷酸化抑制的调节来调控基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。在包含效应区和适体的核糖开关的背景中，多核苷酸构建体含有U1结合位点，使得当适体结合配体时，发生靶基因表达。

发明背景

真核细胞中的信使RNA(mRNA)通过广泛的转录后加工从前mRNA转录物产生，包括5'末端加帽，通过剪接去除内含子，以及3'末端切割和多腺苷酸化。通过剪接体进行剪接，剪接体是主要由核内小核糖核蛋白(snRNP)组成的大RNA-蛋白质复合物。主要的(U2型)剪接体含有U1、U2、U4、U6和U5snRNP，而丰度低得多的U12型剪接体由U11、U12、U4atac、U6atac和U5 snRNP组成。

几乎所有真核mRNA的3'末端包含聚(A)尾-具有20至250个腺苷残基的均聚物。通过切割和多腺苷酸化将聚(A)尾添加到细胞核中的前mRNA中，该过程是由大的蛋白质复合物催化的过程。在脊椎动物中，添加聚(A)尾部取决于两个顺式作用RNA元件，在聚腺苷酸化位点上游发现的高度保守的AAUAAA多腺苷酸化序列和在下游发现的保守性较差的富含GU的元件。向mRNA添加聚(A)尾部可保护其免于降解，以及其他功能。

已显示U1 snRNP通过抑制前mRNA的3'末端加工，抑制异常内含子多腺苷酸化信号，并确保启动子方向性，在前mRNA加工中具有剪接独立功能。例如，Fortes等人。(PNAS，100：8264-69，通过引用并入本文)，在3'UTR中放置一至三个U1结合位点，导致报告基因表达降低。

发明概述

在一个方面，本发明提供用于调节靶基因表达的多核苷酸盒，其包含核糖开关，其中核糖开关包含效应区和适体，其中效应区包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合位点互补的序列。在一个实施方案中，适体结合小分子配体。

在一个实施方案中，效应子序列除了包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合互补的序列之外还包括当适体结合配体时能够形成茎的额外序列。在一个实施方案中，效应区包含9至11个碱基对的茎形成序列。在一个实施方案中，效应区包含茎形成序列，其中茎中具有一个或多个错配碱基。

在一个实施方案中，U1 snRNP结合位点为8至10个核苷酸。在一个实施方案中，U1snRNP结合位点包含序列CAGGTAAG。在一个实施方案中，U1 snRNP结合位点选自CAGGTAAGTA、CAGGTAAGT和CAGGTAAG。

在一个实施方案中，多核苷酸盒包含两个或更多个核糖开关，其中每个核糖开关包含效应区和适体，其中效应区包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合位点互补的序列。在一个实施方案中，两个或更多个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。在一个实施方案中，两个或更多个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。

另一方面，本发明提供了一种调节靶基因表达的方法，包括：

(a)将一个或多个上述多核苷酸盒插入靶基因的3'UTR中，

(b)将包含多核苷酸盒的靶基因导入细胞，和

(c)将细胞暴露于配体，所述配体以有效增加靶基因表达的量特异性结合适体。

在一个实施方案中，配体是小分子。

在一个实施方案中，多核苷酸盒插入多腺苷酸化信号5'的约87和/或约140个核苷酸处。在一个实施方案中，多核苷酸盒插入多腺苷酸化信号5'的约74、约110或约149个核苷酸处。

在一个实施方案中，将两个或更多个多核苷酸盒插入靶基因的3'UTR中。在一个实施方案中，两个或更多个多核苷酸盒包含特异性结合于不同小分子配体的不同适体。在一个实施方案中，两个或更多个多核苷酸盒包含相同的适体。在一个实施方案中，将两个或更多个多核苷酸盒插入靶基因的3'UTR的不同位置。

另一方面，本发明提供了包含上述多核苷酸盒的靶基因，其合并至用于表达靶基因的载体中。在一个实施方案中，载体为病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体以及慢病毒载体。

另一方面，本发明提供了包含靶基因的载体，所述靶基因含有本文所述的多核苷酸盒。在一个实施方案中，载体为病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体以及慢病毒载体。

附图简述

图1a-1b.3'UTR中的U1结合位点抑制靶基因(荧光素酶)表达。

图1a.在pRL-SV40载体中不同位置的3'UTR中插入U1结合序列的示意图。列出了野生型和突变体U1共有结合序列。

图1b.海肾荧光素酶测定结果。用指定的构建体转染HEK 293细胞，所述构建体含有在3'UTR中的不同位置的共有U1结合序列或突变序列。结果表示为平均值±SD(n＝3)，并且减少倍数计算为来自突变体构建体的荧光素酶活性与来自野生型构建体的荧光素酶活性的比率。

图2a-2b.3'UTR中U1结合序列长度对基因表达抑制的影响。

图2a.插入3'UTR中-87位的U1结合位点的全长和截短序列。

图2b.用指定的构建体转染HEK 293细胞，所述构建体含有在-87插入的全长或截短的U1结合序列，并测定荧光素酶活性。

图3a-3b.3'UTR中U1位点的茎环结构对基因表达的影响。

图3a.茎环结构的序列，其在茎中嵌入U1结合位点。进行突变以产生断茎(如右图所示)。

图3b.荧光素酶活性测定的结果表明，截存U1结合位点的茎-环结构完全消除了U1干扰对基因表达的抑制作用。

图4a-4c.使用茶碱适体调节靶基因的3'UTR中的U1干扰。

图4a.示意图显示3'UTR中适体调节的U1干扰和基因表达。在没有适体配体(上图)的情况下，插入3'UTR的U1位点可用于U1 snRNP结合和U1介导的多腺苷酸化干扰，从而抑制靶基因表达。在适体配体存在下(下图)，适体/配体结合导致茎的形成，其截存U1结合位点以避免U1 snRNP结合。U1介导的多腺苷酸化干扰被消除，导致靶基因表达。

图4b.截存U1结合位点并连接茶碱适体的效应区茎的序列，通过茶碱适体的发夹茎和下茎的连续截短产生。显示了构建体U1 theo_1、8和9的茎序列。茶碱显示为

图4c.用指定的构建体转染HEK 293细胞，并用或不用3mM茶碱处理。诱导倍数计算为从茶碱处理的细胞获得的荧光素酶活性值与从未处理的细胞获得的荧光素酶活性的比率。

图5a-5c.优化效应区茎序列，增强U1位点可及性的可调节性。

图5a.U1_theo_8和U1_theo_9的茎序列，其中连续突变在相应的核苷酸旁边列出。连续突变在效应区域茎中产生错配。

图5b.通过U1_theo_8的连续突变产生总共9种构建体，并各自转染到HEK 293细胞中。用或不用3mM茶碱处理转染的细胞并测量荧光素酶活性。结果表示为平均值±SD，并且针对构建体U1_theo_8至U1_8_5指示诱导倍数。

图5c.通过U1_theo_9的连续突变产生总共8个构建体，并各自转染到HEK 293细胞中。用或不用3mM茶碱处理转染的细胞并测量荧光素酶活性。结果表示为平均值±SD。

图6a-6b.3'UTR中多个U1_theo核糖开关对靶基因表达调控的影响。

图6a.示意图显示靶基因(荧光素酶)的3'UTR中的4个拷贝的U1_theo_8_1。

图6b.用指定的构建体转染HEK 293，并用不同浓度的茶碱处理。3'UTR中的4个拷贝的U1_theo_8_1在6mM浓度下产生4.3倍的荧光素酶活性诱导。

图7a-7c.使用鸟嘌呤适体调节U1干扰。

图7a.示意图表示在包含SV40早期聚(A)信号的3'UTR中的不同位置处的U1_Gua序列。

图7b.示意图显示U1_Gua开关中的效应区域茎序列，其截存U1位点(在鸟嘌呤配体存在下)并连接鸟嘌呤适体。鸟嘌呤被显示为

图7c.响应于鸟嘌呤处理，鸟嘌呤适体调节U1对聚腺苷酸化的干扰。用指定的构建体转染HEK 293细胞。含有突变体U1位点及其互补序列的构建体用作对照。结果表示为平均值±SD，显示每种构建体的诱导倍数。

图8.U1_Gua核糖开关在人β珠蛋白polyA序列的背景下起作用。

发明详述

本发明提供了用于通过基于适体的U1 snRNP介导的多腺苷酸化抑制的调节来调控基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。多核苷酸构建体含有至少一个核糖开关，其包含效应区和传感器区。效应区含有U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合位点互补的序列，使得这两个序列能够形成截存U1 snRNP结合位点的茎，从而阻止U1 snRNP的结合。效应区可含有额外的序列及其互补序列，使得效应区茎长于U1 snRNP结合位点及其互补序列。传感器区域包含结合配体的RNA序列，并且响应于该结合，改变效应区域的构象。在一个实施方案中，传感器区域包含适体。当不存在适体配体时，效应区不形成茎。U1 snRNP结合位点是可用的并且由U1snRNP结合，其抑制mRNA的多腺苷酸化。当存在适体配体时，它结合适体，导致效应区形成茎，这阻止U1 snRNP结合U1结合位点。U1 snRNP不被募集到靶基因mRNA的3'UTR，并且信使的多腺苷酸化发生。

基因调控多核苷酸盒是指重组DNA构建体，当其合并至靶基因的DNA的3'UTR中时，提供通过适体/配体介导的U1 snRNP对多腺苷酸化的抑制来调控靶基因表达的能力。如本文所用，多核苷酸盒或构建体是包含衍生自不同来源(例如，不同生物、来自相同生物的不同基因等)的元件的核酸(例如，DNA或RNA)。多核苷酸盒包含核糖开关。在本发明的上下文中的核糖开关包含传感器区域(例如，适体)和效应区域，它们一起负责感测配体的存在，所述配体结合传感器区域并改变包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合位点互补的序列的效应区域的构象。在一个实施方案中，靶基因的表达在适体配体存在时增加，而在配体不存在时降低。

核糖开关

如本文中所用的术语“核糖开关”是指RNA多核苷酸的调控区段。在本发明的上下文中的核糖开关包含传感器区域(例如，适体)和效应区域，它们一起负责感测配体(例如，小分子)的存在并调节位于效应区域的U1 snRNP结合位点的可及性。在一个实施方案中，核糖开关为利用来自两个或更多个来源的多核苷酸重组的。如本文中所用的术语“合成”在核糖开关的背景下是指不天然存在的核糖开关。在一个实施方案中，感应区和效应区是通过多核苷酸接头连接。在一个实施方案中，多核苷酸接头形成RNA茎(即，RNA多核苷酸的双链区域)。

效应区

核糖开关的效应区包含RNA序列，其响应于配体结合传感器区域(例如，适体)，形成茎结构(双链区)，其降低U1 snRNP结合位点对U1 snRNP的可及性。效应区包含U1 snRNP结合位点和与U1 snRNP结合位点互补的序列。当适体结合其配体时，效应区形成茎并因此截存U1 snRNP结合位点以避免结合U1 snRNP。在某些条件下(例如，当适体不与其配体结合时)，效应区域处于提供对于U1 snRNP结合位点的可及性的环境中，允许U1 snRNP结合mRNA并抑制多腺苷酸化，导致信使降解。

U1 snRNP结合位点可以是能够结合U1 snRNP的任何多核苷酸序列，从而将U1snRNP募集到靶基因的3'UTR并抑制靶基因信使的多腺苷酸化。在一个实施方案中，U1snRNP结合位点(在本文中也称为“U1结合位点”或“U1位点”)是共有位点CAGGTAAGTA(当在mRNA中时为CAGGUAAGUA)。在一些实施方案中，U1 snRNP结合位点是该共有序列的变体，包括例如较短或具有从共有序列改变的一个或多个核苷酸的序列。在一个实施方案中，U1snRNP结合位点含有序列CAGGTAAG。在一些实施方案中，结合位点由选自CAGGTAAGTA，CAGGTAAGT和CAGGTAAG的序列编码。U1 snRNP结合位点可以是来自基因的任何5'剪接位点，例如来自人DHFR外显子2的5'剪接位点(参看实施例7和8)。

效应区的茎部应具有足够的长度(和GC含量)以在配体结合适体时抑制U1 snRNP结合U1 snRNP结合位点，同时还允许在配体不以足够数量存在时接近U1 snRNP结合位点。在本发明的实施方案中，效应区的茎部分除了U1 snRNP结合位点及其互补序列外还包含茎序列。在本发明的实施方案中，此额外茎部序列包含来自适体茎部的序列。茎的长度和序列可使用已知技术修饰，以便鉴定茎，所述茎在配体不存在时允许靶基因可接受的背景表达并且在配体存在时允许靶基因可接受的表达水平。例如，如果茎太长，则可能在配体存在或不存在的情况下隐藏进入U1 snRNP结合位点的途径。如果茎太短，它可能不会形成能够截存U1 snRNP结合位点的稳定茎，在这种情况下，U1 snRNP将在存在或没有配体时结合并抑制信使的多腺苷酸化(导致靶基因mRNA降解)。在一个实施方案中，效应区茎部的总长度在约7个碱基对至约20个碱基对之间。在一些实施方案中，茎部的长度在约8个碱基对至约11个碱基对之间。在一些实施方案中，茎部的长度为8个碱基对至11个碱基对。除了茎部的长度之外，可改变茎部的GC碱基对含量以改变茎部的稳定性。

在一些实施方案中，效应区茎含有一个或多个错配的核苷酸，其不与效应区茎的互补部分碱基配对。

适体/配体

在一个实施方案中，传感器区域包含适体。如本文中所用的术语“适体”是指特异性结合于配体的RNA多核苷酸。术语“配体”是指由适体特异性结合的分子。在一个实施方案中，配体为低分子量(小于约1,000道尔顿)分子，包括例如脂质、单糖、第二信使、辅助因子、金属离子、其他天然产物和代谢物、核酸以及大多数治疗性药物。在一个实施方案中，配体是具有两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸。

在一个实施方案中，配体选自由以下组成的组：8-氮杂鸟嘌呤、5'-单磷酸腺苷一水合物、两性霉素B、阿维菌素B1、硫唑嘌呤、醋酸氯地孕酮、巯嘌呤、盐酸莫雷西嗪、N6-甲基腺苷、辅酶I(nadide)、黄体酮、盐酸丙嗪、双羟萘酸吡维氯铵(pyrvinium pamoate)、磺胺胍、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、泰洛沙泊和伏立诺他。

适体配体还可为在特定生理/病理条件下显著增加的细胞内源性组分，诸如致癌转化—这些可包括第二信使分子，诸如GTP或GDP、钙；脂肪酸或在乳腺癌中不正确代谢的脂肪酸，诸如13-HODE(Flaherty,JT等人,Plos One,第8卷,e63076,2013，所述文献以引用方式并入本文)；氨基酸或氨基酸代谢物；糖酵解途径中的代谢物，其通常在癌细胞或代谢疾病中的正常细胞中具有较高水平；以及癌症相关分子，诸如Ras或突变Ras蛋白、肺癌中的突变EGFR、许多类型的癌症中的吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)。如JPWiebe所公开，内源性配体包括乳腺癌中的孕酮代谢物(Endocrine-Related Cancer(2006)13:717–738，所述文献以引用方式并入本文)。如由Minton,DR和Nanus,DM(Nature Reviews,Urology,第12卷,2005，所述文献以引用方式并入本文)所公开，内源性配体还包括由肾癌中的关键代谢酶突变引起的具有增加水平的代谢物，诸如乳酸、谷胱甘肽、犬尿氨酸。

适体具有能够与预期的靶分子(即配体)形成复合物的结合区。结合的特异性可根据与适体对不相关分子的解离常数相比，适体对其配体的比较解离常数(Kd)来定义。因此，配体为相较于不相关材料以更高的亲和力结合于适体的分子。通常，适体关于其配体的Kd将比适体与不相关分子的Kd小至少约10倍。在其他实施方案中，Kd将小至少约20倍、小至少约50倍、小至少约100倍以及小至少约200倍。适体的长度将通常在约15与约200个核苷酸之间。更常见地，适体的长度将在约30与约100个核苷酸之间。

可被合并作为核糖开关的一部分的适体可为天然存在的适体或其修饰型式，或被从头设计和/或通过指数式富集的配体系统进化(SELEX)或其他筛选方法筛选的适体。结合小分子配体的适体的实例包括但不限于茶碱、多巴胺、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B)、纤维二糖、卡那霉素A、利维霉素(lividomycin)、妥布霉素(tobramycin)、新霉素B、紫霉素、氯霉素、链霉素、细胞因子、细胞表面分子以及代谢物。关于识别小分子的适体的综述，参见，例如Famulok,Science 9:324-9(1999)and McKeague,M.和DeRosa,M.C.J.Nuc.Aci.2012(两个所述文献均以引用方式并入本文)。在另一个实施方案中，适体为互补多核苷酸。

鉴定适体/配体的方法

在一个实施方案中，适体被设计成结合特定小分子配体。用于设计和选择结合特定配体的适体的方法在62/370,599中公开，所述文献以引用方式并入。用于筛选适体的其他方法包括例如SELEX。例如美国专利号5,475,096、5,270,163以及Abdullah Ozer等人Nuc.Aci.2014中公开了使用SELEX设计选择性结合小分子的适体的方法，这些参考文献以引用的方式并入本文中。美国专利号5,580,737和5,567,588中描述了对SELEX方法的改良，这些专利以引用的方式并入本文中。

用于识别适体的选择技术通常涉及制备大的含有被随机化或诱变的区域的所需长度的DNA或RNA分子的汇集物。举例来说，用于适体选择的寡核苷酸汇集物可含有具有20-100个随机化核苷酸的区，该区侧接约15-25个核苷酸长并且可用于结合PCR引物的规定序列的区。使用标准PCR技术或允许扩增所选核酸序列的其他手段来扩增寡核苷酸汇集物。当需要RNA适体时可在体外对DNA汇集物进行转录，以产生RNA转录物的汇集物。然后基于特异性结合于所需配体的能力对RNA或DNA寡核苷酸的汇集物进行选择。选择技术包括例如亲和色谱法，不过可使用将允许基于特异性结合于另一分子的能力来选择核酸的任何方案。用于识别结合小分子并且在细胞内发挥功能的适体的选择技术可能涉及基于细胞的筛选方法。在亲和色谱法的情况下，使寡核苷酸与被固定于柱中或磁珠上的基质上的靶配体接触。优选在模拟正常生理条件的盐浓度、温度以及其他条件存在的情况下针对配体结合来对寡核苷酸进行选择。汇集物中结合于配体的寡核苷酸保留在柱或珠粒上，而非结合序列被洗掉。然后通过PCR(通常在洗脱后)对结合配体的寡核苷酸进行扩增(如果利用RNA转录物，那么在逆转录之后进行)。对所选序列重复选择过程，进行总计约三至十轮的迭代选择程序。然后使用标准程序对所得寡核苷酸进行扩增、克隆以及测序以识别能够结合靶配体的寡核苷酸序列。一旦已识别适体序列，即可通过从包含诱变适体序列的寡核苷酸汇集物开始进行额外轮的选择来对适体进行进一步优化。

可在一轮或多轮体外选择(例如，SELEX)后使用体内适体筛选。举例来说，Konig,J.等人(RNA.2007,13(4):614–622，其以引用方式并入本文)描述了用于适体的体内选择的SELEX和酵母三杂交系统的组合。

靶基因

本发明的基因调控盒为可用于调控可在靶细胞、组织或有机体中表达的任何靶基因的表达的平台。术语“靶基因”是指被引入细胞中并且能够被转录至RNA中并且在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。可替代地，靶基因对靶细胞是内源的，并且本发明的基因调控盒被定位到靶基因中(例如定位到内源靶基因的5′或3′UTR中)。靶基因的一个实例为编码治疗性多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，靶基因编码RNA，例如miRNA，rRNA，小或长非编码RNA，短发夹RNA(shRNA)和任何其他调节RNA。在一个实施方案中，靶基因对要在其中转录重组DNA构建体的细胞来说为外源性的。在另一个实施方案中，靶基因为对要在其中转录重组DNA构建体的细胞来说内源性的。

根据本发明的靶基因可为编码蛋白质的基因，或编码非蛋白质编码RNA的序列。靶基因可为例如编码结构蛋白、酶、细胞信号传导蛋白、线粒体蛋白、锌指蛋白、激素、转运蛋白、生长因子、细胞因子、细胞内蛋白、细胞外蛋白、跨膜蛋白、细胞质蛋白、核蛋白、受体分子、RNA结合蛋白、DNA结合蛋白、转录因子、翻译机构、通道蛋白、运动蛋白、细胞粘附分子、线粒体蛋白、代谢酶、激酶、磷酸酶、交换因子、伴侣蛋白以及这些中任一者的调节剂的基因。在实施方案中，靶基因编码促红细胞生成素(Epo)、人类生长激素(hGH)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、人类胰岛素、CRISPR相关蛋白9(cas9)或免疫球蛋白(或其部分)，包括例如治疗性抗体。

表达构建体

本发明涵盖使用重组载体以将编码靶基因并且含有本文所述的基因调控盒的多核苷酸引入靶细胞中。在许多实施方案中，本发明的重组DNA构建体包括额外DNA元件，所述额外DNA元件包括提供DNA在宿主细胞中的复制以及靶基因在所述细胞中的适当水平的表达的DNA区段。普通技术人员了解基于促进靶基因在靶细胞中的表达的能力来选择表达控制序列(启动子、增强子等)。“载体”意指包含要在体外或体内递送至宿主细胞中的多核苷酸的重组质粒、酵母人工染色体(YAC)、微型染色体、DNA微环或病毒(包括病毒衍生的序列)。在一个实施方案中，重组载体为病毒载体或多个病毒载体的组合。

用于靶基因在靶细胞、组织或有机体中的适体介导的表达的病毒载体为本领域中已知的，并且包括腺病毒(AV)载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒和慢病毒载体以及1型单纯疱疹(HSV1)载体。

腺病毒载体包括例如基于人类2型腺病毒和人类5型腺病毒的那些，其已通过E1和E3区中的缺失而变为复制缺陷型。可将转录盒插入E1区中，从而产生重组E1/E3缺失AV载体。腺病毒载体还包括辅助物依赖性高容量腺病毒载体(也称为高容量“无内脏”或“去内脏”载体)，所述载体不含病毒编码序列。这些载体含有病毒DNA复制和包装所需的顺式作用元件，主要为反向末端重复序列(ITR)和包装信号(Ψ)。这些辅助物依赖性AV载体基因组具有携带从几百个碱基对至约36kb的外来DNA的潜力。

重组腺相关病毒“rAAV”载体包括衍生自任何腺相关病毒血清型的任何载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7和AAV-8、AAV-9、AAV-10等。rAAV载体可具有全部或部分缺失缺失的AAV野生型基因中的一个或多个，优选为Rep和/或Cap基因，但保留功能性侧接ITR序列。功能性ITR序列被保留用于AAV基因组的拯救、复制、包装以及潜在染色体整合。ITR无需为野生型核苷酸序列，并且可改变(例如通过核苷酸的插入、缺失或取代)，只要序列提供功能性拯救、复制以及包装即可。

或者，可将诸如慢病毒载体等其他系统用于本发明的实施方案中。基于慢病毒的系统可转导非分裂以及分裂细胞，使它们可用于靶向例如CNS的非分裂细胞的应用。慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒，并且像所述病毒一样，整合至宿主基因组中，从而提供长期的基因表达的潜力。

还可使用例如阳离子脂质、聚合物或两者作为载体通过非病毒载体系统将携带含有基因调控盒的靶基因的包括质粒、YAC、微型染色体以及微环的多核苷酸引入细胞或有机体中。还可使用共轭聚L-赖氨酸(PLL)聚合物和聚乙烯亚胺(PEI)聚合物系统来将载体递送至细胞。针对细胞培养物与有机体，用于将载体递送至细胞的其他方法包括流体力学注射和电穿孔以及使用超声波。关于用于基因递送的病毒和非病毒递送系统的评述参见以引用的方式并入本文中的Nayerossadat,N.等人(Adv Biomed Res.2012；1:27)。

调节靶基因的表达的方法

在一个方面，本发明提供通过以下来调节靶基因(例如，治疗性基因)表达的方法：(a)将本发明的基因调控盒插入靶基因的3′UTR中；(b)将包含基因调控盒的靶基因引入细胞中；以及(c)将细胞暴露于结合适体的配体。在一个实施方案中，配体为小分子。在多个方面中，靶基因在靶细胞中的表达赋予将其引入其中的细胞所需性质，或以其他方式产生所需治疗性结果。

在一个实施方案中，将一个或多个基因调节盒插入靶基因的3'非翻译区。在一个实施方案中，将单个基因调控盒插入靶基因的3′UTR中。在其他实施方案中，将2、3、4或更多个基因调控盒插入靶基因中。在一个实施方案中，将两个基因调控盒插入靶基因中。当多个基因调控盒插入靶基因时，它们各自可含有相同的适体，使得单个配体可用于调节多个盒的核糖核酸酶切割，从而调节靶基因表达。在其他实施方案中，将多个基因调控盒插入靶基因中，所述多个基因调控盒各自可含有不同适体，使得暴露于多个不同小分子配体来调节靶基因表达。在其他实施方案中，将多个基因调控盒插入靶基因中，所述多个基因调控盒各自含有不同的核糖核酸酶底物序列。这在减少重组和改善合并至病毒载体中的容易性方面可为有用的。

当多核苷酸盒位于多腺苷酸化信号(例如AATAAA)上游(5')的任何位置的靶基因的3'UTR中时，本发明的多核苷酸盒可有效调节靶基因表达。当存在不同的聚(A)信号序列时，多核苷酸盒还通过阻断多腺苷酸化来调节靶基因表达，例如SV40早期与晚期聚(A)信号(参看，例如，实施例4-6,8)。在一个实施方案中，将本发明的至少一个多核苷酸盒插入聚腺苷酸化序列5'的约87或约140个核苷酸处。在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸盒插入两个位置或附近。在其他实施方案中，多核苷酸盒插入多腺苷酸化信号5'的约74，约110或约149个核苷酸中的一个或多个。

本发明的多核苷酸盒可以与其他调节靶基因表达的机制组合使用。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸盒与基因调节盒组合使用，所述基因调节盒通过适体介导的选择性剪接调节调节靶基因表达，如WO 2016/126747中所述，其通过引用并入本文。

处理方法和药物组合物

本发明的一个方面提供一种调控通过基因治疗递送的治疗性蛋白质的水平的方法。在此实施方案中，“靶基因”可编码治疗性蛋白质。“靶基因”可编码对细胞来说内源或外源的蛋白质。

含有具有适体驱动的核糖开关的调控盒的治疗性基因序列例如通过载体递送至体外或离体的靶细胞。“靶基因”的细胞特异性可受启动子或载体内的其他元件控制。含有靶基因和多核苷酸盒的载体构建体的递送以及对靶组织进行转染从而产生被调控靶基因的稳定转染通常是产生治疗性蛋白质的第一步。

然而，由于靶基因序列内存在调控盒，靶基因不以显著水平表达，即在不存在结合于调控盒核糖开关内所含的适体的特异性配体的情况下它处于“关闭状态”。仅当施用适体特异性配体(或以其他方式以足够量存在)时，才活化靶基因表达。

含有靶基因的载体构建体的递送和激活配体的递送通常在时间上是隔开的。激活配体的递送将控制靶基因何时被表达以及蛋白质表达的水平。可通过许多途径来递送配体，包括但不限于经口、肌肉内(IM)、静脉内(IV)、眼内或局部。

配体的递送时间将取决于激活靶基因的要求。举例来说，如果持续需要由靶基因编码的治疗性蛋白质，那么可每天或一天多次递送经口小分子配体，以确保靶基因的持续激活，并且因此确保治疗性蛋白质的持续表达。如果靶基因具有长效作用，那么可较不频繁地给予诱导配体。

本发明允许以由对调控多核苷酸盒的核糖开关内的适体具特异性的配体的按时给药决定的方式在时间上控制治疗性转基因的表达。仅在配体施用时增加的治疗性转基因表达通过允许靶基因在不存在配体的情况下关闭而增加基因疗法治疗的安全性。

可使用不同的适体使不同的配体激活靶基因。在本发明的某些实施方案中，含有调控盒的各治疗性基因将在盒内具有特异性适体，所述特异性适体将由特异性小分子激活。这意味着各治疗性基因仅能被对其中所容纳的适体具特异性的配体激活。在这些实施方案中，各配体将仅激活一种治疗性基因。这使得有可能可将若干不同的“靶基因”递送至一个个体，并且各自将在递送对各靶基因中所容纳的调控盒内所含的适体具特异性的配体后被激活。

本发明允许任何其基因可以递送至身体的治疗性蛋白质(例如促红细胞生成素(EPO)或治疗性抗体)在递送活化配体时由身体产生。此治疗性蛋白质递送方法可代替在身体外部制造此类治疗性蛋白质然后注射或输注所述治疗性蛋白质，例如用于癌症中或用于阻断炎性或自身免疫疾病的抗体。含有受调控的靶基因的身体变成生物制剂制造工厂，当施用基因特异性配体时，所述生物制剂制造工厂开启。

治疗性蛋白质的给药水平和给药时间对治疗效果来说可为重要的。例如，在用于癌症的阿瓦斯汀(抗VEGF抗体)的递送中。本发明增加了响应于对治疗性蛋白质水平和效果的监测进行给药的容易性。

在一个实施方案中，靶基因可编码可靶向和编辑特定DNA序列的核酸酶。此类核酸酶包括Cas9、含锌指核酸酶或TALEN。在这些核酸酶的情况下，可能仅在足以编辑靶内源性基因的短的时间段内需要核酸酶蛋白质。然而，如果将未调控的核酸酶基因递送至体内，那么在细胞的剩余寿命中此蛋白质可能都存在。在核酸酶的情况下，核酸酶存在的时间越长，存在脱靶编辑的风险越高。此类蛋白质的表达的调控具有显著的安全性优点。在此情况下，可将含有含调控盒的核酸酶靶基因的载体递送至体内适当的细胞。在不存在盒特异性配体的情况下，靶基因处于“关闭”状态，因此不产生核酸酶。仅在施用激活配体时，才产生核酸酶。当经过足够的时间，允许发生足够的编辑时，将配体撤出并且不再施用。因此，核酸酶基因因而处于“关闭”状态，并且不再产生核酸酶，并且编辑停止。可使用此方法来克服遗传病状，包括许多遗传性视网膜病变，诸如由CEP290的突变引起的LCA10以及由ABCA4的突变引起的斯特格氏病(Stargardt’s Disease)。

可利用仅在特异性配体施用后被激活的编码治疗性蛋白质的受调控靶基因的施用来调控治疗性基因以治疗许多不同类型的疾病，例如用治疗性抗体治疗癌症，用免疫调节蛋白或抗体治疗免疫病症、代谢疾病、用抗C5抗体或抗体片段作为受调控基因治疗诸如PNH等罕见疾病或用治疗性抗体治疗眼血管生成，以及用免疫调节蛋白治疗干性AMD。

允许治疗多种特定疾病和病状的多种特异性靶基因适合用于本发明中。举例来说，可使用胰岛素或胰岛素类似物(优选人类胰岛素或人类胰岛素类似物)作为治疗I型糖尿病、II型糖尿病或代谢综合征的靶基因；可使用人类生长激素作为治疗具有生长障碍的儿童或缺乏生长激素的年人的靶基因；可使用促红细胞生成素(优选人类促红细胞生成素)作为治疗因慢性肾病引起的贫血、因脊髓发育不良引起的贫血或因癌症化疗引起的贫血的靶基因。

本发明可特别适合用于治疗由单一基因缺陷引起的疾病，诸如囊性纤维化、血友病、肌肉萎缩症、地中海贫血或镰状细胞性贫血。因此，可使用人类β-球蛋白、γ-球蛋白、δ-球蛋白或ζ-球蛋白作为治疗β-地中海贫血或镰状细胞性贫血的靶基因；可使用人类因子VIII或因子IX作为治疗血友病A或血友病B的靶基因。

通常将本发明中所用的配体与一种或多种药学上可接受的载体组合以形成适合向患者施用的药物组合物。药学上可接受的载体包括通常用于制药领域中的溶剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物组合物可呈片剂、丸剂、胶囊、锭剂等形式，并且被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、真皮内、鼻内、皮下、经口、吸入、经真皮(局部)、经粘膜以及经直肠。

以一种给药方案向患者施用包含配体的药物组合物，使得足以适当调控靶基因的量的配体被递送至患者。当配体为小分子并且剂型为片剂、胶囊等时，优选地，药物组合物包含0.1mg至10g的配体；0.5mg至5g的配体；1mg至1g的配体；2mg至750mg的配体；5mg至500mg的配体；或10mg至250mg的配体。

可每天一次或每天多次(例如每天2、3、4、5或更多次)给予药物组合物。或者，可少于每天一次给予药物组合物，例如每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天一次或每月一次或每几个月一次。在本发明的一些实施方案中，可仅少数的几次向患者施用药物组合物，例如一次、两次、三次等。

本发明提供一种治疗需要增加由靶基因编码的治疗性蛋白质的表达的患者的方法，所述方法包括向患者施用包含针对适体的配体的药物组合物，其中先前已为患者施用了包含靶基因的重组DNA，其中靶基因含有本发明的基因调控盒，所述本发明基因调控盒提供由适体的配体通过靶基因的前mRNA的选择性剪接调控靶基因的表达，从而增加治疗性蛋白质的表达的能力。

制品和试剂盒

还提供用于本文中所描述的方法中的试剂盒和制品。在多个方面中，试剂盒包含在适合的包装中的本文中所描述的组合物(例如用于递送包含含有基因调控盒的靶基因的载体的组合物)。适合于本文中所描述的组合物(诸如注射用眼用组合物)的包装为本领域中已知的，并且包括例如小瓶(诸如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如密封的麦拉(Mylar)或塑料袋)等。可进一步对这些制品进行灭菌和/或密封。

本发明还提供包含本文中所描述的组合物的试剂盒，并且可进一步包含关于使用组合物的方法，诸如本文中所描述的用途的说明。本文中所描述的试剂盒可进一步包括从商业和用户观点来看理想的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及带有用于进行施用(包括例如本文中所描述的任何方法)的说明的包装插页。举例来说，在一些实施方案中，试剂盒包括用于包含本发明的基因调控盒的靶基因的表达的rAAV、适合于注射的药学上可接受的载体以及以下中的一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及带有用于进行注射的说明的包装插页。在一些实施方案中，试剂盒适用于眼内注射、肌肉内注射、静脉内注射等。

如本文中所用的“同源性”和“同源的”是指在两个多核苷酸序列之间或在两个多肽序列之间的同一性百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可通过本领域中已知的技术来确定。举例来说，可通过比对序列信息并且使用可轻易获得的计算机程序直接比较两个多肽分子来确定同源性。当在最佳比对而具有适当插入或缺失之后，如使用上述方法所确定，在确定长度的分子上分别至少约80％、至少约85％、至少约90％以及至少约95％的核苷酸或氨基酸匹配时，两个多核苷酸或两个多肽序列为彼此“基本上同源的”。

相对于参考多肽或核酸序列的“序列同一性百分比”定义为在比对序列并且引入空隙(如果有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。出于确定氨基酸或核酸序列同一性百分比的目的而进行的比对可以普通技术技工已知的方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件程序，包括BLAST、BLAST-2、ALIGN以及Megalign(DNASTAR)软件。

如本文中所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)聚合形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生核苷酸碱基的聚合物。

“异源的”或“外源的”意指衍生自基因型不同于相比较或引入或合并至其中的实体的其余部分的实体。举例来说，通过基因工程技术引入不同细胞类型的多核苷酸为异源多核苷酸(并且当被表达时可编码异源多肽)。类似地，合并至病毒载体中的细胞序列(例如基因或其部分)相对于载体为异源核苷酸序列。

下表包含本文所述构建体的DNA序列以及所述的其他序列。U1结合位点及其突变序列以灰色突出显示小写字母；茎环结构(SL)采用带下划线的小写字母；适体序列采用波浪加下划线的小写字母；聚(A)信号序列采用粗加下划线的小写字母；荧光素酶基因的编码序列是大写字母。

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应了解并且预期，本领域技术人员可对本文中所公开的本发明原理作出改变，并且此类修改旨在被包括在本发明范围内。以下实施例进一步说明本发明，但不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。本文中所引用的所有参考文献以全文引用的方式并入本文中。

实施例1

3'UTR中U1结合位点的位点和拷贝数对靶基因表达的影响

实验步骤：

质粒构建体：合成含有野生型共有U1结合序列或其突变序列的寡核苷酸(寡核苷酸)(IDT)。使用Gibson组装克隆试剂盒(NEB)将合成的寡核苷酸克隆到pRL-SV40荧光素酶表达载体(Promega)的3'UTR中。纯化构建体(Qiagen)并通过DNA测序(Genewiz)验证。

转染：将3.5x10⁴个HEK 293细胞在转染前一天铺在96孔平底板中。将质粒DNA(500ng)添加至管或96孔U形底板中。单独地，将TransIT-293试剂(Mirus；1.4μl)添加到50μl Opti-mem I培养基(Life Technologies)中，并使其在室温(“RT”)下静置5分钟。然后，将50μl此稀释的转染试剂添加到DNA中，混合并在室温下孵育20min。最后，将7μl此溶液添加到96孔板中的细胞孔中。

所培养细胞的海肾萤光素酶分析：培养基更换后24小时，将板从孵育器中移除，在实验台上平衡至室温若干分钟，然后抽吸培养基。添加glo-lysis缓冲液(Promega，100μL，室温)，并使板在室温下保持至少5分钟。然后，通过50μl研磨混合孔内容物，并将20μl每孔与20μl Renilla-glo试剂在固体白色384孔板中混合。十分钟后，以500毫秒读取时间使用Tecan机器测量发光。以平均相对光单位(RLU)±标准偏差表示萤光素酶活性。

结果:

为了构建基于U1-聚腺苷酸化的基因调控平台，将U1结合序列插入靶报告基因的3'UTR中。在pRL-SV40载体中荧光素酶基因的3'UTR中，将10个核苷酸(“nt”)共有序列U1结合序列(本文称为野生型或wt)置于AATAAA聚(A)序列上游的87nt(U1-87)或140nt(U1-140)中，如图1a所示。如图1b所示，与来自未修饰的pRL-SV40构建体的表达相比，在-87位置插入10-nt突变体U1结合序列(U1-87mut)对荧光素酶基因表达没有任何抑制作用。然而，与来自pRL-SV40对照载体的荧光素酶活性相比，在-87位置插入10-nt野生型U1结合序列(U1-87wt)抑制了海肾荧光素酶表达的98％。当与U1-87mut构建体比较时，U1-87wt产生荧光素酶活性降低50倍。类似地，-140处的突变体U1位点(U1-140mut)不引起荧光素酶基因表达的抑制。然而，-140位置的野生型U1结合序列(U1-140wt)导致荧光素酶活性的91％抑制，与U1-140mut相比产生12倍的荧光素酶活性抑制。

还测试了插入3'UTR中-140处的2个拷贝或3个拷贝的U1结合序列的抑制作用。如图1b所示，与同一位置的单拷贝U1位点(U1-140wt)相比，野生型U1结合序列的2个拷贝(2xU1-140wt)或3个拷贝(3xU1-140wt)导致荧光素酶活性进一步降低，与其相应的突变构建体相比，分别产生272倍和462倍的抑制。因此，这些结果表明U1结合序列的多个拷贝在抑制基因表达方面具有协同功能。

实施例2

3'UTR中U1结合序列长度对靶基因表达的影响。

实验步骤：如实施例1中所述。

结果:

基于实施例1中描述的结果，进一步表征在SV40晚期polyA信号序列上游插入87nt(U1-87)的U1结合位点的抑制作用。为了确定当置于3'时抑制靶基因表达的U1结合序列的最小长度，一系列含有3'顺序截短的U1位点的构建体，如图2a所示。如图2b所示，9-nt U1位点(87-9)和10-nt U1位点(U1-87)一样起作用。然而，当U1结合序列被截短至8nt时，U1位点的抑制作用稍微降低，导致效率降低3倍。当U1位点序列为7nt或更短时，抑制作用的效率显着降低。这些结果表明，插入3'UTR中的SV40晚期聚(A)信号上游87nt的U1结合位点在至少8nt长时更有效地抑制靶基因表达，以便有效地募集U1 snRNP以抑制多腺苷酸化。选择插入在SV40晚期polyA信号序列上游87nt的9nt U1结合序列用于进一步表征。

实施例3

3'UTR中U1位点的茎环二级结构形成对基因表达的影响

实验程序：

合成含有野生型9nt U1结合序列的茎环序列(IDT)并克隆到pRL-SV40载体中。通过DNA测序(Genewiz)验证构建体序列。转染HEK 293细胞，并如实施例1中所述进行海肾荧光素酶测定。

结果：

为了确定发夹或茎环结构对U1位点介导的基因表达抑制的影响，将9nt U1位点嵌入茎环(SL)结构中。在这种茎-环结构中，如图3a所示，U1位点及其互补序列形成茎。制备突变序列作为对照，其中不形成茎(SL破坏)。如图3b所示，将9nt U1位点嵌入茎环结构(U187-9SL)中完全消除了3'UTR中U1位点的抑制作用，而不形成茎-环结构的对照序列(U187-9SL破坏)对U1位点的抑制作用几乎没有影响。这些结果支持嵌入在茎环结构中的U1位点不易能被U1 snRNP结合所接近，因此基因表达不受U1 snRNP介导的多腺苷酸化抑制所抑制。

实施例4

使用茶碱适体通过调控U1对多腺苷酸化的干扰来调控靶基因表达

实验程序：

合成含有来自茎-环结构的茎的全长序列和茶碱适体或茎的截短序列的寡核苷酸(IDT)，并使用Gibson组装克隆试剂盒(NEB)克隆到pRL-SV40载体中。通过DNA测序(Genewiz)验证构建体序列。

转染和适体配体处理：如实施例1中所述转染HEK 293细胞。转染后4小时，吸出培养基，加入含有或不含3mM茶碱的新培养基。如实施例1中所述，在茶碱处理后20至24小时进行海肾荧光素酶测定。诱导倍数表示为在适体配体存在下获得的荧光素酶活性除以在不存在适体配体的情况下获得的值的商。

结果:

为了调控靶基因的3'UTR中U1位点的可及性，从而调控靶基因表达，将适体结构的茎序列直接与实施例3中测试的茎-环结构的茎连接。在该构型中，如图4a所示，适体序列的插入破坏了茎结构的形成，因此，3'UTR中的U1位点易被U1 snRNP结合所接近。然而，在适体配体存在下，适体/配体结合导致RNA结构构象改变，促进茎形成，并且将在3'UTR中的U1位点截存(sequestering)以避免U1 snRNP结合。

在该构型中通过以下方式测试合成的茶碱适体：将茶碱适体结构的下部茎序列连接至茎-环结构的茎，其产生19个碱基对的茎，如图4b所示。我们合理地认为，如果茎太长，茎的形成可能与适体序列的存在无关，并且在没有适体配体的情况下发生。相反，如果茎太短，即使在适体配体存在下，也不能实现稳定的适体结构。因此，为了确定茎的最佳长度(包括来自适体的任何茎和含有U1结合位点的茎)，对茎进行连续截短，产生9个构建体，茎的长度为19-11bp。如图4c所示，在不存在茶碱的情况下，与构建体U187-9相比，对于构建体U1_theo_1至U1_theo_6，荧光素酶活性未显著抑制，表明由于茎形成而截存U1位点。此外，茶碱处理后荧光素酶活性没有增加。然而，在构建体8和9中，茶碱处理后荧光素酶活性增加，表明适体/配体结合进一步阻断U1位点可及性，导致靶基因表达增加。

实施例5

优化茎序列以增强由适体/配体结合引起的U1可及性的可调控性

实验程序：如实施例4中所述。

结果:

构建体U1_theo_8和9显示茶碱处理后荧光素酶活性的小幅增加。为了在适体不被配体结合时进一步增强U1位点可接近性的可调调控性，通过顺序突变茎碱基减弱茎结构，如图5a所示。尽管如此，该策略没有改善来自构建体U1_theo_9的荧光素酶活性的诱导，如图5c所示，但它改善了构建体U1_theo_8的可调控性。如图5b所示,在由U1_theo_8制备的一系列9个构建体中，与不存在适体配体时的荧光素酶活性相比，构建体U1_theo_8_1至5在茶碱处理后产生增加的荧光素酶活性。当与U1_theo_8构建体的诱导倍数(1.3倍)相比时，诱导倍数增加，范围为1.8至2.6倍。因此，我们已经建立了一种合成核糖开关，其通过适体/配体结合调控U1对多腺苷酸化的干扰。

实施例6

多个U1_theo核糖开关对调控靶基因表达的影响

实验程序：

合成含有4个拷贝的U1_theo_8_1序列的寡核苷酸(IDT)并使用Gibson策略和克隆试剂盒(NEB)克隆。转染HEK 293细胞并如实施例4中所述进行海肾荧光素酶测定。

结果：

由于荧光素酶基因的基础水平表达相对较高，构建体U1_theo_8-1在茶碱处理后产生1.8倍诱导。为了降低靶基因的基础水平表达，将4个拷贝的U1_theo_8_1序列串联放置在3'UTR中，如图6a所示。实际上，如图6b所示，与U1_theo_8_1的单拷贝相比，4个拷贝的U1-theo_8_1确实将基础水平表达降低了83％。在茶碱处理后，4拷贝构建体以剂量依赖性方式增加荧光素酶活性，在6mM茶碱下产生40％的87-9SL对照载体的荧光素酶活性和最大4.3倍诱导。这些结果表明，U1位点核糖开关的多个拷贝串联可以降低靶基因的基础表达水平，改善靶基因的调控性。在目前的构建体配置中，在所有4个调控盒拷贝中使用相同的适体序列。可以在核糖开关的每个拷贝中使用不同的适体序列。

实施例7

使用xpt-鸟嘌呤适体通过调控U1干扰来调控靶基因表达

实验程序：

质粒构建体：用萤火虫荧光素酶基因编码序列替换pEGFP-C1载体中的EGFP基因，以产生含有SV40早期多腺苷酸化信号序列的pFLuc载体。合成含有来自人DHFR外显子2的5'剪接位点的野生型或突变U1结合位点和xpt-鸟嘌呤适体序列，随后为U1位点序列的最后7个核苷酸的互补序列的寡核苷酸(IDT)并使用Gibson克隆策略和试剂盒(NEB)克隆到pFLuc载体。

转染和适体配体处理：如实施例1中所述转染HEK 293细胞。转染后4小时，吸出培养基，加入含有或不含500μM鸟嘌呤的新培养基。

所培养细胞的萤火虫萤光素酶测定：培养基更换后24小时，将板从孵育器中移除，在实验台上平衡至室温若干分钟，然后抽吸。添加Glo-lysis缓冲液(Promega，100uL，室温)，并使板在室温下保持至少5分钟。然后，通过50uL研磨物混合孔内容物，并将20uL的每种样品与已在glo-lysis缓冲液中稀释至10％的20μL bright-glo试剂(Promega)混合。使96个孔在不透明白色384孔板上间隔开。在RT下孵育5分钟之后，以500毫秒读取时间使用Tecan机器测量发光。以平均相对光单位(RLU)±标准偏差表示萤光素酶活性。

结果：

在这个基于U1干扰的基因调控平台中，通过在pRLuc载体中不同位置插入与xpt-鸟嘌呤适体连接的10nt U1位点(来自DHFR外显子2的5'剪接位点)来测试额外的适体/配体对(合成或天然适体)的使用，如图7a所示。在这个10nt的U1位点中，只有最后7个核苷酸被设计成与位于xpt-鸟嘌呤适体序列的3'末端的互补序列碱基配对，如图7b所示。该序列构型通过连接适体P1茎和由U1位点及其互补序列形成的茎的茎序列的连续截短产生，并且在基于可变剪接的适体核糖开关中显示出高动态范围。在本研究中，我们将该序列构型置于3'UTR区域中SV40早期聚(A)信号序列上游149nt、110nt或74nt处，产生U1_Guan_1、2和3构建体。另外，产生突变体U1位点作为对照序列。如图7c所示，在鸟嘌呤处理后，分别来自U1_Gua_1、2和3构建体的荧光素酶活性增加2.4、2.0和1.7倍。

实施例8

适体调节的U1干扰不是polyA序列特异性的

实验程序：

质粒构建体：在pFLuc载体中用人β珠蛋白polyA序列替换SV40早期多腺苷酸化序列以产生pFLuc_HBGPA。合成含有来自人DHFR外显子2的5'ss的野生型或突变体U1结合位点和xpt-鸟嘌呤适体序列，随后为U1位点序列的最后7nt的互补序列的寡核苷酸(IDT)，并使用Gibson克隆策略和试剂盒(NEB)将其克隆到pFLuc_HBGPA载体中。

转染和荧光素酶测定如实施例7中所述。

结果：

我们已经在SV40晚期polyA序列或SV40早期polyA序列的情形中证明了适体调节的U1对多腺苷酸化的干扰，如实施例4-6所示。此外，为了证明适体调节的U1干扰，因此靶基因表达不限于SV40polyA序列，我们在来自人β珠蛋白基因的polyA序列的情形中测试了鸟嘌呤适体调节的U1干扰。如图8所示，在鸟嘌呤处理后，来自wtU1_Gua_HBGPA构建体的荧光素酶活性增加2.1倍。相反，与未处理的样品相比，mutU1_Gua_HBGPA不诱导荧光素酶活性。这些结果表明适体调节的U1干扰不是polyA序列特异性的。

Claims (25)

1.一种用于响应于配体的存在或不存在来调节靶基因表达的多核苷酸构建体，其包含多核苷酸序列和核糖开关，所述多核苷酸序列包含靶基因编码区和包含多腺苷酸化信号的3'非翻译区(UTR)，其中所述核糖开关包含效应区和适体，其中所述效应区包含茎形成序列，所述茎形成序列包含U1snRNP结合位点和与所述U1snRNP结合位点互补的序列，其中所述核糖开关位于多腺苷酸化信号5'的靶基因的3'UTR中，其中在结合适体的配体存在的情况下靶基因表达增加，并且其中当配体撤回时靶基因表达降低。

2.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述适体结合小分子配体。

3.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中所述效应区包含当所述适体结合配体时能够形成茎的额外序列。

4.如权利要求3所述的多核苷酸构建体，其中所述效应区包含9至11个碱基对的茎形成序列。

5.如权利要求4所述的多核苷酸构建体，其中所述效应区包含茎形成序列，所述茎形成序列在所述茎中具有一个或多个错配碱基。

6.如权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述U1snRNP结合位点为8至10个核苷酸。

7.如权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述U1snRNP结合位点包含序列CAGGTAAG。

8.如权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述U1snRNP结合位点选自由以下组成的组：CAGGTAAGTA、CAGGTAAGT和CAGGTAAG。

9.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含两个或更多个位于靶基因的3'UTR中的核糖开关，其中每个核糖开关包含效应区和适体，其中所述效应区包含U1snRNP结合位点和与所述U1snRNP结合位点互补的序列。

10.如权利要求9所述的多核苷酸构建体，其中所述两个或更多个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。

11.如权利要求9所述的多核苷酸构建体，其中所述两个或更多个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。

12.一种响应于配体的存在或不存在来调节靶基因的表达的方法，所述方法包括：

a.将权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸构建体引入细胞中，以及

b.将所述细胞暴露于配体，所述配体以有效增加所述靶基因表达的量特异性结合所述适体。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述配体是小分子。

14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述核糖开关插入所述多腺苷酸化信号5'的约87或约140个核苷酸处。

15.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述核糖开关插入所述多腺苷酸化信号5'的约74、约110或约149个核苷酸处。

16.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含两个或更多个位于靶基因的3'UTR中的核糖开关，其中每个核糖开关包含效应区和适体，其中所述效应区包含U1snRNP结合位点和与所述U1snRNP结合位点互补的序列。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述两个或更多个核糖开关包含特异性结合至不同小分子配体的不同适体。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述两个或更多个核糖开关包含相同的适体。

19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个核糖开关插入所述靶基因的3'UTR的不同位置处。

20.如权利要求12至19中任一项所述的方法，其中将包含所述核糖开关的靶基因合并于用于表达所述靶基因的载体中。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述载体是病毒载体。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体以及慢病毒载体。

23.一种载体，其包含权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸构建体。

24.如权利要求23所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

25.如权利要求24所述的载体，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体以及慢病毒载体。