KR20160132117A - 새로운 이중 기능성의 재조합 융합 단백질, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, VEGF 수용체 (VEGFR)의 세포외 도메인의 Ig 영역과, Ig의 Fc 단편을 통해 연결된, 신호-조절자 단백질 (SIRP)의 세포외 도메인의 Ig 영역을 포함하며, 단백질이 CD47과 VEGF에 동시에 결합하여, 대식 세포의 세포 표면 상의 SIRP에 대한 CD47의 결합을 차단함으로써, 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 자극하고, VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 생장을 저해할 수 있는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 이 단백질을 발현하는 발현 벡터, 단백질의 제조 방법 및 CD47 또는 VEGF를 과다 발현하는 질환의 치료 방법을 제공한다.

Description

새로운 이중 기능성의 재조합 융합 단백질, 이의 제조 방법 및 용도 {NOVEL RECOMBINANT BI-FUNCTIONAL FUSION PROTEINS, PREPARATION AND USE THEREOF}
본 발명은 이중 기능성의 재조합 융합 단백질, 이의 제조 방법 및 용도, 특히 종양 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
암 세포는 숙주의 면역 감시를 피하기 위해 3가지 이상의 기전을 발전시켜 왔다: 1) T 세포의 표면 상의 PD-1에 결합하여 T 세포의 세포자살을 유도하는 막 단백질 PD-L1 및 PD-L2를 다량 발현함으로써, T-림프구에 의한 면역 감시 회피. 2) 자연살상 (NK) 세포에 의한 면역 감시 회피. NK 세포의 표면 상의 NKG2D 단백질은, 암 세포 표면의 MICA/MICB 단백질에 결합하게 되면, NK 세포를 활성화할 수 있으며, 그로 인해 암 세포를 죽일 수 있다. 그러나, 암 세포는 암 세포로부터 MICA/MICB의 탈착 과정을 촉매하는 기전을 발전시키게 되었다. 탈착된 MICA/MICB는 NKG2D에 결합하여, NK 세포의 활성화를 차단한다. 3) 대식 세포 (Mφ)의 면역 감시 회피. 대부분의 모든 암 세포들은 자신의 표면에 CD47을 다량 발현하는데[1], 이것이 Mφ 표면의 신호 조절 단백질 α (SIRPα)에 결합하여, Mφ의 식균 작용을 저해하는 저해 신호가 형성되게 유도한다[2]. 이들 기전을 표적으로 하는 효과적인 항암 약물의 개발이 필요한 실정이다 [1].
또한, 암 세포의 증식은 충분한 영양분 공급에 의존한다. 암 세포는 스스로 혈관 상피 성장 인자 (VEGF) 등의 혈관 증식을 촉진시키는 인자들을 방출할 수 있다. VEGF의 활성이 저해되면 종양으로의 혈액의 공급이 중단되어, 암 증식은 저해될 것이다. 예를 들어, FDA로부터 승인받은 약물인 아바스틴 (AVASTIN)은, VEGF의 생물학적 활성을 저해함으로써 암 (대장암, 폐암)을 치료하도록 작용한다. 대장암 치료 용도로 2012년 8월에 시판 승인된 또 다른 단백질 약물인 잘트랍 (Zaltrap) 역시 VEGF를 표적으로 한다. 그러나, 이들 약물은 단지 암 세포의 증식을 어느 정도 저해하는 것일 뿐, 암 세포를 완전히 제거하는 것은 아니다.
신호 조절 단백질은 막 관통 단백질의 한 유형으로서, 3가지가 있다: SIRPα (CD172a), SIRPβ (CD172b), SIRPγ (CD172g). 이들 3종은 유사한 세포외 영역을 포함하고 있지만, 세포내 도메인은 서로 상이하다. 세포외 도메인은 3개의 Ig-유사 영역을 포함하고 있는데, 첫번째 Ig-유사 영역이 Ig-V 영역이고, 두번째와 세번째 영역은 Ig-C 영역이다.
SIRPα (CD172a)의 세포내 도메인은 신호 전이와 이에 대응되는 세포 기능을 저해할 수 있는 저해성 신호전달 영역 2개를 포함하고 있다. SIRPβ (CD172b) 및 SIRPγ (CD172g)의 막내 도메인 (intra-membrane domain)은 매우 짧고, 신호 전이 영역은 없지만, SIRPβ (CD172b)는 신호 전이를 위해 어댑터 단백질, 예를 들어, DAP12를 통해 기능할 수 있다 (도 1 참조). SIRP는 주로 대식 세포 (Mφ), 수지상 세포 (DC) 및 뉴론 상에서 발현된다.
CD47 역시 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 막관통 당단백질로서, 이는 적색 혈액 세포 등의 모든 세포 타입들의 표면에서 발현된다. CD47에 대한 리간드로는 인테그린, 트롬보스폰딘-1 및 SIRP가 있다. CD47은, 세포 이동, T 세포와 DC의 활성화 및 뉴론 발생 등의, 수많은 생물학적 기능을 담당한다. 또한, CD47은, SIRPα와의 상호작용을 통해, 대식 세포의 식균작용을 저해할 수 있다. 신호를 "공격하지 못하게" 함으로써, CD47은 혈액 세포와 같은 정상 세포를 대식 세포에 의한 공격으로부터 보호한다.
전술한 바와 같이, 많은 수의 종양 또는 암 세포들이 CD47을 과다 발현하는데, 대식 세포의 세포 표면 상의 SIRPα에 결합함으로써, 대식 세포에 의한 암 세포의 식균작용을 방지한다. CD47을 과다 발현하는 암 세포로는 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 (MM), 방광암, 난소암, 전립선 암, 폐암, 대장암, 유방암 및 췌장암이 있다. CD47 특이 항체를 종양을 가지고 있는 마우스에 주사하면, 종양의 생체내 증식을 현저하게 저해할 수 있다 [3-4]. 인간 백혈병 세포를 가진 마우스의 경우, 동일 항체를 이 마우스에 주사하였을 때, 암 세포가 완전하게 제거되었다 [5].
VEGF는 분비되는 당단백질의 한 유형로서, 분자량이 약 40 kDa이다. 이 유형에 속하는 것으로는 5종, 즉 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PIGF가 있다. VEGF 수용체 (VEGFR)로는 3종, 즉, VEGFR1, VEGFR 및 VEGFR3이 있으며, 이들 각각이 서로 다른 리간드와 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, VEGFR1은 VEGF-A, VEGF-B 및 PIGF와 결합하며, VEGFR2는 VEGF-A, VEGF-C 및 VEGF-D와 결합하지만 PIGF와는 결합하지 않으며; VEGFR3는 오직 VEGF-C 및 VEGF-D와 결합한다. 이들 수용체는 서로 다른 기능을 가지고 잇다. VEGFR1은 VEGFR2 보다 10배 높은, 고 친화성으로 VEGF-A와 결합하므로, VEGFR2를 네거티브하게 조절하는 기능을 한다. VEGFR2는 혈관 내피세포의 증식을 유도하여, 혈관 생장을 촉진시킨다. 반면, VEGFR3는 림프관의 발생 및 생장과 관련있다. 모든 VEGF와 이들의 수용체들 중에서, VEGF-A와 VEGFR2가 가장 중요하다고 할 수 있는데, 특정 질환 상태 (예, 암 및 노인성 황반 변성)에서와 같이 VEGF-A는 과다 분비된 다음 VEGFR2에 결합하여, 비정상적인 혈관 생장을 야기하게 될 것이며, 그 결과 질환이 발생 또는 악화될 것이다. 따라서, VEGF-A와 VEGFR2 둘다 중요한 약물 타겟이다.
항-VEGF 단일클론 항체인 베박시주맵 (bevacizumab)은 2004년에 시판 승인받았으며, 전이성 대장암, 폐암 및 신장암에 대해 처방된다. Zaltra는 또한, VEGF-Trap으로도 알려져 있는, 재조합 단백질 약물로서, 이 역시 VEGF를 표적으로 하며, 2012년에 전이성 대장암 치료용으로 시판 승인받았다. VEGFR2를 표적으로 하는 라무시루맵 (Ramucirumab)은 III상 임상 시험 중에 있다. 항-CD46 약물은 현재 시판되어 있지 않으며, 모두 전-임상 단계이다.
지금까지 CD47과 VEGF 둘다를 표적으로 하는 어떠한 단일 분자 약물도 보고된 바 없으며, 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
Chao MP, Weissman IL, and Majeti R.The CD47-SIRPα Pathway in Cancer Immune Evasion and Potential Therapeutic Implications. Curr Opin Immunol. 2012, 24: 225-232. Chao MP, Tang C, Pachynski RK, Chin R, Majeti R, Weissman IL. Extranodal dissemination of non-hodgkin lymphoma requires cd47 and is inhibited by anti-cd47 antibody therapy. Blood. 2011, 118:4890-4901. Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, Myklebust JH, Varghese B, Gill S, Jan M, Cha AC, Chan CK, Tan BT, Park CY, et al. Anti-cd47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-hodgkin lymphoma. Cell. 2010, 142:699-713. Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, Pang WW, Jaiswal S, Gibbs KD, Jr, van Rooijen N, Weissman IL. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009, 138:286-299. Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, Jan M, Weissman-Tsukamoto R, Zhao F, Park CY, Weissman IL, Majeti R. Therapeutic antibody targeting of cd47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 2011, 71:1374-1384. Collins SJ. The HL60 promyelocytic leukemia cell line: proliferation, differentiation, and cellular oncogene expression. Blood. 1987, 70:1233-1244. Xu Y and Scheinberg DA. Elimination of human leukemia by monoclonal antibodies in an athymic nude mouse leukemia model. Clin Cancer Res. 1995, 1:1179-1187. Lin JJ, Hsu HY, et al. Molecular evidence of anti-leukemia activity of gypenosides on human myeloid leukemia HL-60 cells in vitro and in vivo using a HL-60 cells murine xenograft model. Phytomedicine. 2011, 18:1075-1085 Sun Y, Xu HJ., et al. Crocin Exhibits Antitumor Effects on Human Leukemia HL-60 Cells In Vitro and In Vivo. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2013, 2013:1-7. Thomas LH, Friedland JS, Sharland M, Becker S. Respiratory Syncytial Virus-Induced RANTES Production from Human Bronchial Epithelial Cells Is Dependent on Nuclear Factor-κB Nuclear Binding and Is Inhibited by Adenovirus-Mediated Expression of Inhibitor of κBα. Journal of Immunology. 1998, 161: 1007-16. Lin Y, Zhang M, Barnes PF. Chemokine production by a human alveolar epithelial cell line in response to Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 1998, 66: 1121-6. Xu X and Prestwich GD. Inhibition of Tumor Growth and Angiogenesis by a Lysophosphatidic Acid Antagonist in a Engineered Three-dimensional Lung Cancer Xenograft Model. Cancer. 2010, 116: 1739-1750. Coxon A, Ziegler B, et al. Antitumor activity of motesanib alone and in combination with cisplatin or docetaxel in multiple human non-small-cell lung cancer xenograft models. Mol Cancer. 2012, 11: 70. Naumov GN, Nilsson MB, et al. Combined Vascular Endothelial Growth Factor Receptor and Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Blockade Inhibits Tumor Growth in Xenograft Models of EGFR Inhibitor Resistance. Clin Cancer Res. 2009, 15: 3484-3494. Magda D, Lecane P, et al. mtDNA depletion confers specific gene expression profiles in human cells grown in culture and in xenograft. BMC Genomics. 2008, 9: 521.
본 발명은, VEGF 수용체 (VEGFR)의 세포외 도메인의 Ig 영역과, Ig의 Fc 단편을 통해 연결된, 신호-조절자 단백질 (SIRP)의 세포외 도메인의 Ig 영역을 포함하며, 단백질이 CD47과 VEGF에 동시에 결합하여, 대식 세포의 세포 표면 상의 SIRP에 대한 CD47의 결합을 차단함으로써, 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 자극하고, VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 생장을 저해할 수 있는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 개시한다. 또한, 본 발명은 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자와 이 단백질을 발현하는 발현 벡터, 단백질의 제조 방법 및 CD47 또는 VEGF를 과다 발현하는 질환의 치료 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질은, VEGF 수용체 (VEGFR)의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역과, 링커를 통해 연결된, 신호-조절자 단백질 (SIRP)의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역을 포함하며, 본 단백질은 CD47과 VEGF에 결합하여, 대식 세포의 세포 표면 상의 SIRP에 대한 CD47의 결합을 차단함으로써, 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 자극하고, VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 생장을 저해할 수 있다.
일 구현예에서, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질에서 신호-조절자 단백질은 SIRPα이고, 신호-조절자 단백질의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역은 SIRPαD1이다.
일 구현예에서, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질에서 VEGFR은 VEGFR1이고, VEGFR1의 Ig-유사 영역은 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig 영역 (VEGFR1D2)이다.
일 구현예에서, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질의 링커는 Ig의 Fc 단편이다. 일 구현예에서, Fc 단편은 IgG1의 Fc 단편이다.
일 구현예에서, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질은 SIRPα의 세포외 도메인의 첫번째 Ig 영역 (SIRPαD1)과, 인간 IgG1의 Fc 단편을 통해 연결된, 인간 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig 영역 (SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2)을 포함한다. 일 특정 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질은 서열번호 8에 나타낸 서열과 95& 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 서열번호 8 간의 아미노산 서열 동일성은 적어도 98%이다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 서열번호 8 간의 아미노산 서열 동일성은 적어도 99%이다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 VEGF 수용체 (VEGFR)의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역과 링커를 통해 연결된 신호-조절자 단백질 (SIRP)의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역을 포함하는 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는데, 상기 단백질은 CD47과 VEGF에 결합하여, 대식 세포의 세포 표면 상의 SIRP에 대한 CD47의 결합을 차단함으로써 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 자극하고, VEGF에 의해 유발되는 혈관 내피 세포의 생장을 저해할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는, SIRPα, 바람직하게는 SIRPαD1을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩한다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는, VEGFR1, 바람직하게는 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig 영역 (VEGFR1D2)을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩한다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는, 링커로서 Ig의 Fc 단편, 바람직하게는 링커로서 IgG1의 Fc 단편을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩한다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는, SIRPα의 세포외 도메인의 첫번째 Ig 영역 (SIRPαD1)과 인간 IgG1의 Fc 단편을 통해 연결된 인간 VEGFR1의 세포외 도메인의 두번째 Ig 영역 (SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2)을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩한다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는, 서열번호 8에 나타낸 서열과 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩한다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 서열번호 8 간의 아미노산 서열 동일성은 적어도 98%이다. 일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 서열번호 8 간의 아미노산 서열 동일성은 적어도 99%이다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 하나 이상의 보강제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 본 발명의 약학적 조성물을 치료학적인 유효량으로 환자 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD47의 과다 발현 또는 VEGF의 과다 발현에 의해 또는 이 둘다에 의해 유발되는 질환의 치료 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, CD47의 과다 발현 또는 VEGF의 과다 발현에 의해 또는 이 둘다에 의해 유발되는 질환 치료용 약학적 조성물의 제조에 있어, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질의 용도를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 (MM), 방광암, 난소암, 전립선 암, 폐암, 대장암, 유방암, 췌장암 및 신장 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 크론 질환, 알레르기성 천식 및 류마티스 관절염을 치료하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VEGF의 기능 및 활성 강화에 의해 유발되는 질환의 치료 방법은 노인성 황반 변성, AMD, 당뇨병성 망막증, 간 섬유증 및 혈관육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 것이다.
도 1은 SIRP의 구조를 도식적으로 도시한 것이다.
도 2는 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 구조와 작용 기전을 도시한 것이다.
도 3은 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 핵산 서열 (서열번호 7)과 아미노산 서열 (서열번호 8)을 나타낸 것이다.
도 4는 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 단백질 전기영동 분석을 도시한 것이다.
도 5는 타겟-결합 활성 분석 결과를 도시한 것이다.
도 6은 타겟 저해 분석 결과를 도시한 것이다.
도 7은 생체내 항-종양 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8은 A549 s.c. 이종이식 모델에서 MAC-01의 치료 효능을 도시한 것이다. MAC-01로 치료받은 군 (n = 6/군)을 분석하여, SIRPAD1-Fc, VEGFR1D2-Fc, 및 SIRPAD1-Fc + VEGFR1D2-Fc 조합의 분석 결과와 비교하였다. 각 분자의 투여량은 다음과 같다: MAC-01: 5 mg/kg; SIRPAD1-Fc 및 VEGFR1D2-Fc: 2.5mg/kg 단일제로서 또는 복합제로서. 치료는, 4주가 주당 2회로 i.p. 주사하여 종양의 크기가 100-200 mm3에 도달하였을 때 개시하였다.
종양 증식에 대해 2가지 이상의 약물들을 타겟팅하기 위한 기본적으로 다른 접근 방식으로는 3가지 방법이 있다. 가장 일반적으로는, 환자에게 2종 이상의 약물들의 칵테일을 제공할 수 있다. 이 옵션은 가능한 약물 조합과 여러가지 투여량 측면에서 유연성이 가장 높지만, (a) 복용 부담 (pill burden) 증가 및 개개 약물에 대한 서로 다른 복용 스케줄로 인해 환자의 치료 지속 가능성이 낮고, (b) 약물-약물 상호작용으로 인한 배합 금기 가능성, 및 (c) 약물 부작용 위험성 증가 문제가 있다. 이러한 문제들은 치료 효능을 저하시킬 수 있으며, 특히 암과 같은 만성 질환을 관리하는 경우 치료 목료 달성에 좋지 않을 수 있다.
2번째 방식은 약물들의 고정 용량 복합제 (fixed-dose combinations of drugs)를 단일 투약 형태로 사용하는 것이다. 이 방식은 복용 부담을 낮추어, 환자 순응도를 개선시킨다. 고정 용량 복합제의 단점은 대개 활성 성분들 간의 가능한 용량 비율 선정이 제한적이어서, 부작용은 최소화하면서 효능을 최대화하기 위해 개개 환자에 맞게 적정하기가 다소 어렵다. 또한, 조합되는 성분들의 서로 다른 약동학적 특성으로 인해 각 타겟에 대한 약력학적 효과 측면에서 복합적인 시간적 불일치가 발생할 수 있으며, 따라서 전체적인 효능이 감소될 수 있다.
3번째 방식은 하나의 화합물이 2가지 이상의 약리학적 기능을 겸비한 다기능성 약물을 사용하는 것이다. 이러한 다기능성 약물의 설계와 검증은 보다 복잡하며, 분자에서 타겟 활성들의 최적 비율을 구하는데 상당한 연구를 필요로 하지만, 통합된 약동성이 분자 타겟에 일치되는 약력학 활성들을 발휘할 수 있다. 다기능성 분자는 또한 다른 약물과의 고정 용량 복합제로 만들어, 3종 또는 심지어 4종의 약물을 하나의 알약으로 조합함으로써, 효능을 추가적으로 향상시킬 수 있다.
부단한 실험을 통해, 본 발명자들은, 종양 조직으로의 혈액 공급을 방해하는 방식과 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 유도하는 2가지 작용 기전을 통해 종양을 공격할 수 있는, 새로운 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 발명하게 되었다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질은, VEGFR의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역과 펩타이드 링커를 통해 연결된 신호-조절자 단백질 (SIRP)의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역을 포함한다. 이 단백질은 CD47과 VEGF에 동시 결합하여, 대식 세포의 표면 상의 SIRP에 CD47이 결합하는 것을 차단함으로써 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 자극할 수 있으며, VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 생장을 저해할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 2개의 타겟-결합 단편 (예, SIRPαD1 및 VEGFR1D2)과 링커 (예, Fc 단편)를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이들 3가지 성분들 중 임의의 것을 선택하기 위한 다수의 설계 옵션이 존재한다는 것을 인지할 것이다.
링커는 주로 폴리펩타이드와 2번째 이종의 폴리펩타이드 또는 다른 타입의 융합 폴리펩타이드 사이의 스페이서로서 이용된다. 일 구현예에서, 링커는 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산들로, 바람직하게는 펩타이드 결합으로 연결된 1 - 20개의 아미노산으로 만들어지면, 이때 아미노산은 20종의 천연 아미노산들로부터 선택된다. 이들 아미노산들 중 하나 이상은, 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 당화될 수 있다. 일 구현예에서, 아미노산 1 - 20개가 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 라이신으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 링커는 글리신 및 알라닌과 같이 입체적인 방해를 나타내지 않는 아미노산들로 대부분 구성된다. 링커의 예로는 폴리글리신 (특히 (Gly5, (Gly)8), 폴리(Gly-Ala) 및 폴리알라닌이 있다. 아래 실시예에 나타낸 바와 같이 적절한 링커의 일예는 (Gly)4Ser (서열번호 X)이다. 추가적인 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 융합 단백질은 "힌지 링커", 즉 IgG의 힌지부 또는 일부 힌지부에 인접하게 제공된 링커 서열을 포함할 수 있다. 또한, 링커 서열은 본 발명의 이중 기능성 융합 단백질의 제조성과 안정성을 향상시키도록 설계될 수 있다.
또한, 링커는 비-펩타이드성 링커일 수도 있다. 예를 들어, -NH-, -(CH2)s-C(O)- (s = 2-20)와 같은 알킬 링커를 사용할 수 있다. 이들 알킬 링커는 저급 알킬 (예, C1-6) 저급 아실, 할로겐 (예, Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등과 같이 입체 간섭이 없는 기들로 추가로 치환될 수 있다.
본 발명의 이중 기능성 융합 단백질은 또한 변성 저하 및/또는 반감기 증가, 독성 감소, 면역원성 감소 및/또는 생물학적 활성 증가와 같은 원하는 특징을 부여하기 위한 목적으로 비-폴리펩타이드 분자가 부착될 수 있다. 이러한 분자의 예로는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리라이신, 덱스트란과 같은 선형 폴리머; 지질; 콜레스테롤 기 (예, 스테로이드); 탄수화물 또는 올리고당 분자를 포함한다.
예를 들어, 연결 순서에 대해 디자인 옵션이 있을 경우, 한 성분의 공간 배치에 대한 다른 성분의 작용을 최소화하여, 둘다 각각의 해당 타겟에 대해 높은 결합 친화성을 보유하는 것이, 바람직하다. 연결 순서는 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2, SIRPαD1-VEGFR1D2-Fc 또는 VEGFR1D2-SIRPαD1-Fc일 수 있다. 또한, 당해 기술 분야의 통상의 당업자라면, 타겟-결합 친화성을 손상시키지 않은 한, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질의 분자량은 융합 단백질을 용이하게 제조하도록 최소화되어야 함을 인지할 것이다.
예를 들어, 링커 단백질 단편은 FC 단편이거나 또는 기타 적합한 링커 단백질일 수 있다. Fc 단편은 크기가 아미노산 232개일 수 있으며, 힌지부에 시스틴을, CH2 영역에 시스틴 2개, 그리고 CH3 영역에는 시스틴 2개를 포함할 수 있다. 힌지부의 시스틴은 모노머 2개 사이에 이황화 결합을 형성하는데 기여하여, 동형이형체를 제조하는 반면, CH2 영역과 CH3 영역의 시스틴은 체인내 이황화 결합을 형성하여, 단백질을 안정시킬 수 있다.
면역글로불린은 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgA를 포함하는데, 특히 IgG가 가장 많고, 상대적으로 안정적이다. 이의 Fc 단편은 스타필로코커스 단백질 A과 최대 결합 활성을 나타내어 쉽게 정제할 수 있어, 본 발명에서 바람직하다.
예를 들어, CD47과 결합할 수 있는 SIRP의 세포외 영역의 IG 영역들 모두 (SIRPα, SIRPγ) 융합 단백질에 사용될 수 있다. 이는 VEGFR의 세포외 영역의 Ig-유사 영역에도 해당된다. VEGFR1의 D2가 VEGF에 대한 결합성이 가장 높은 것으로 알려져 있으며, 따라서 본 발명에서 바람직하다.
바람직하게는, 인간을 제외한 동물로부터 유래된 단백질 또는 펩타이드의 강력한 면역원성이 알레르기와 기타 부작용을 야기할 수 있어, 인간-유래 서열이 인간 암 치료에 사용된다. 그러나, 다른 동물 단백질 또는 펩타이드 역시 여러가지 활용 목적에 따라 본 발명에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질에서 신호-조절자 단백질은 SIRPα이다. 상기 신호-조절자 단백질의 세포외 도메인의 Ig-유사 영역은 SIRPαD1이다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질에서 VEGFR은 VEGFR1이고, VEGFR1의 Ig-유사 영역은 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig-유사 영역 (VEGFR1D2)이다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질에서 Fc 단편은 IgG1의 Fc 단편이다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질은 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig-유사 영역 (VEGFR1D2)과 인간 IgG1의 Fc 영역을 통해 연결된 인간 SIRPα의 세포외 도메인의 첫번재 Ig-유사 영역을 포함하는, SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2로 제작된다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열은 도 3B에 도시된다 (서열번호 8). 일 구현예에서, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질은 서열번호 8로 기술된 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 전술한 폴리펩타이드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 이 폴리펩타이드는 CD47과 VEGF 둘다에 결합할 수 있으며, 종양 세포의 증식을 저해할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 서열번호 8로 나타낸 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함하는 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 전술한 폴리펩타이드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 이 폴리펩타이드는 CD47과 VEGF 둘다에 결합할 수 있으며, 종양 세포의 증식을 저해할 수 있다.
또한, 본 발명은, 전술한 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 필요에 따라서, 한가지 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제가 약학적 조성물이 포함될 수 있다. 담체로는 희석제, 비히클, 벌킹제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 흡수 강화제, 계면활성제, 흡착 담체, 윤활제 등의 약제학에 통상적인 것일 수 있다.
이러한 조성물은, 폴리펩타이드 또는 단백질의 치료학적 또는 예방학적 유효량을, 약제학적으로 허용가능한 물질 및 생리학적으로 허용가능한 제형 물질과 혼합물 형태로 포함한다. 약학적 조성물은, 조성물의, 예를 들어, pH, 삼투성, 점성, 투명성, 색, 흡수성 또는 침투성을 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형화 물질을 포함할 수 있다. 적합한 제형화 물질로는, 비제한적으로, 아미노산 (예, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제 (예, 아스코르브산, 소듐 설파이트 또는 소듐 하이드로겐-설파이트); 완충제 (예, 보레이트, 바이카보네이트, Tris-HCl, 사이트레이트, 포스페이트, 기타 유기 산); 벌킹제 (예, 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제 (예, 에틸렌다이아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (complexing agent) (예, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, beta-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-beta-사이클로덱스트린); 충진제; 단당류; 이당류 및 기타 탄수화물 (예, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질 (예, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제; 착향제 및 희석제; 유화제; 친수성 폴리머 (예, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염-형성 반대이온 (예, 소듐); 보존제 (예, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (예, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올 (예, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제 (예, pluronics, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸로사팔 (tyloxapal)); 안정성 강화제 (슈크로스 또는 소르비톨); 긴장성 강화제 (tonicity enhancing agent) (예, 알칼리 금속 할라이드 (바람직하게는 소듐 또는 포타슘 클로라이드, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 보강제가 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).
최적의 약학적 조성물은, 예를 들어, 의도한 투여 경로, 전달 포맷과 바람직한 투여량에 따라 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 전술한 Remington's Pharmaceutical Sciences를 참조한다. 이러한 조성물은 폴리펩타이드의 물리적인 상태, 안정성, 생체내 방출율 및 생체내 소거율에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 적절한 조성물은 주사용수, 비경구 투여를 위한 생리학적 염수 용액일 있다.
약학적 조성물의 주된 비히클 또는 담체는 특성 상 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 적정 비히클 또는 담체는, 비경구 투여용 조성물에 통상적인 다른 물질이 아마도 첨가된, 주사용수, 생리학적 염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성의 완충화된 염수 또는 혈청 알부민이 혼합된 염수 역시 또다른 비히클의 예이다. 다른 예시적인 약학적 조성물은 Tris 완충제 또는 아세테이트 완충제를 포함하며, 이들 완충제는 소르비톨 또는 이의 적절한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 바람직한 수준의 순도를 가진 선택 조성물을 선택적인 제형화 시약 (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra)과 동결건조된 케이크 또는 수성 용액의 형태로 혼합함으로써, 보관용으로 제조할 수 있다. 또한, 치료학적 조성물은 슈크로스와 같은 적절한 부형제를 이용해 동결건조물로서 제형화할 수 있다.
제형은 다양한 방법으로, 예를 들어, 흡입 요법에 의해, 경구로 또는 주입에 의해 전달할 수 있다. 비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에 사용하기 위한 치료학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 비히클 중에 바람직한 폴리펩타이드를 포함하는 발열원-결핍된, 비경구로 허용가능한 수용액 형태일 수 있다. 특히 적합한 비경구 주입용 비히클은 멸균 증류수로서, 증류수 중에서 폴리펩타이드를 무균, 등장성 용액으로 제형화하고, 적절하게 보존처리한다. 또 다른 조제법은, 데포 (depot) 주입을 통해 전달시킬 수 있는, 조절 방출형 또는 서방형 제품을 제공하는, 주입가능한 미소구, 생분해성 입자, 폴리머성 화합물 (폴리락트산, 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀 등의 물질을 사용해 원하는 분자를 제형화하는 과정을 수반할 수 있다. 또한, 히알루론산도 사용할 수 있으며, 이 물질은 순환계에서의 체류 기간을 연장하는 효과를 가질 수 있다. 원하는 분자를 도입하기 위한 또 다른 적합한 수단은 이식가능한 약물 전달 디바이스를 포함한다.
다른 측면에서, 주입 투여에 적합한 약제 제형은 수용액 중에서, 바람직하게는 생리학적으로 적절한 완충제, 예를 들어 행크 용액, 링거액 또는 생리학적으로 완충화된 염수 중에서 제형화될 수 있다. 수성 주사용 현탁제는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁물의 점성을 높이는 소정의 물질을 포함할 수 있다. 아울러, 활성 화합물의 현탁제는 적절한 오일성 주입 현탁제로서 조제할 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예로 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀을 포함한다. 비-지질성의 다가양이온성 아미노 폴리모 역시 전달을 위해 사용할 수 있다. 선택적으로, 현탁제는 안정화제 또는 화합물의 용해성을 높이기 위한 물질을 포함할 수 있으며, 고도로 농축된 용액으로 제조 가능하다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 흡입용으로 조제될 수 있다. 또한, 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진제를 사용해 조제될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 PCT 출원번호 PCT/US94/001875에 더욱 기술되어 있는데, 이 문헌은 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달법을 기술하고 있다.
또한, 소정의 제형은 경구로 투여될 수 있는 것으로도 고려된다. 본 발명의 일 구현예에서, 이런 방식으로 투여되는 분자는 정제 및 캡슐제 등의 고체 제형의 컴파운딩에 통상적으로 사용되는 담체를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 제형화할 수 있다. 예를 들어, 캡슐제는, 생체이용성이 극대화되고 전신 순환되기 전의 분해가 최소화되는 경우, 위장관내 소정의 위치에서 제형의 활성 파트를 방출하도록 설계될 수 있다. 치료학적 분자의 흡수를 촉진시키기 위해 부가적인 물질을 포함시킬 수 있다. 희석제, 착향제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제도 사용할 수 있다. 경구 투여용 약학적 조성물은 또한 당해 기술 분야에서 널리 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체를 이용해 경구 투여용으로 적합한 투여량 (dosages)으로 제형화할 수 있다. 이러한 담체들은 약학적 조성물을 환자가 복용하기 위한 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액체, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등으로 제형화할 수 있다.
경구용 약학적 조제물은 활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 제조되는 과립 혼합물을 (선택적으로, 분쇄한 후) 가공하여 정제 또는 당의정제 코어를 만듬으로써, 수득할 수 있다. 필요에 따라서는 적정 보조제를 첨가할 수 있다. 적정 부형제로는 락토스, 슈크로스, 만니톨 및 소르비톨 등의 당; 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 기타 식물 유래 전분; 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로스 등의 셀룰로스; 아라비아 검 및 트라가칸트 등의 검; 및 젤라틴 및 콜라겐 등의 단백질과 같은, 탄수화물 또는 단백질 충진제가 있다. 필요에 따라서는, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 소듐 알기네이트와 같은, 붕해제 또는 가용화제를 첨가할 수 있다.
당의정제 코어는 농축 당 용액과 같은 적정 코팅제와 조합하여 사용할 수 있는데, 당 용액제는 또한 아라비아검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 티타늄 다이옥사이드, 래커 용액 (lacquer solution) 및 적정 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수도 있다. 제품 식별을 위해 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량을 특정하기 위해, 정제 또는 당의정 코팅제에 염료 또는 안료를 첨가할 수 있다.
또한, 경구로 사용될 수 있는 약학적 조제물은 또한 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐제 뿐만 아니라, 젤라틴과 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코딩제로 제조된 연질의 밀봉된 캡슐제를 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐제는 활성 성분을 락토스 또는 전분과 같은 충진제 또는 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 그리고 선택적으로 안정화제와 혼합된 상태로 포함한다. 연질 캡슐제의 경우, 활성 화합물은 지방 오일, 액체 또는 액상 폴리에틸렌글리콜과 같은 적정 액체에 용해 또는 현탁될 수 있으며, 여기에 안정화제가 가미되거나 가미되지 않을 수 있다.
서방형 또는 조절-전달형 제형으로 폴리펩타이드를 포함하는 제형 등의 부가적인 약학적 조성물들도 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 리포좀 담체, 생분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 주입제와 같은, 그외 다양한 서방형 또는 조절-전달 수단을 제형화하는 기법들 역시 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다. 예를 들어, 약학적 조성물을 전달하기 다공성 폴리머 미세입자의 조절 방출을 개시한 PCT/US93/00829를 참조한다. 서방형 조제물의 추가적인 예로는 형상화된 아티클 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캅셀 형태의 반투과성 폴리머 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머 (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., supra) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산 (EP 133,988)을 포함할 수 있다. 또한, 서방형 조성물은 리포좀을 포함하며, 이는 당해 기술 분야에 공지된 여러 방법들 중 임의의 방법을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949를 참조한다.
생체내 사용될 약학적 조성물은 전형적으로 무균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 조성물을 동결건조하는 경우, 이 방법을 이용한 멸균 처리를 동결건조 및 재구성 전 또는 이후에 수행할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액 형태로 보관할 수 있다. 또한, 비경구 조성물은 일반적으로 무균성 접근 포트 (sterile access port)를 구비한 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스톱퍼를 구비한 바이얼 안으로 배치된다.
약학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 건조되거나 또는 동결건조된 분말로서 무균 바이얼에 넣어 보관할 수 있다. 이러한 제형들은 레디 투 유즈 형태로 또는 투여 직전에 재구성하는 (예, 동결건조된) 형태로 보관할 수 있다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 1회-투여량 투여 단위 (single-dose administration unit)를 제작하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 건조된 단백질을 구비한 제1 용기와 수성 제형을 구비한 제2 용기 둘다를 각각 포함할 수 있다. 또한, 단일 챔버 및 다중-챔버형의 사전 충진된 주사기 (예, 액체 주사기 및 리소시린지 (lyosyringes)를 포함하는 키트도 본 발명의 범위에 포함된다.
치료학적으로 사용될 약학적 조성물의 유효량은, 예를 들어, 치료학적 상황과 목적에 따라 달라질 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 치료를 위한 적절한 투여량 수준이, 부분적으로는, 전달되는 분자, 폴리펩타이드가 사용되는 증상, 투여 경로 및 환자의 신체 크기 (체중, 체표면적 또는 장기의 크기) 및 상태 (연령과 전반적인 건강 상태)에 따라 달라짐을 인지할 것이다. 따라서, 임상의는 최적화된 치료 효과를 달성하기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 바꿀 수 있다. 전형적인 투여량은, 전술한 인자들에 따라, 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위이거나 또는 그 이상일 수 있다. 폴리펩타이드 조성물은 바람직하게는 정맥내로 주입 또는 투여될 수 있다. 장기간 작용하는 약학적 조성물은 구체적인 체형의 반감기와 소거율에 따라 3일 내지 4일마다, 매주 또는 격주로 투여할 수 있다. 투여 빈도는 사용된 제형내 폴리펩타이드의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 조성물은 바람직한 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 투여한다. 따라서, 조성물은 1회 투여하거나 또는 시간 경과에 따라 여러번 (동일한 또는 서로 다른 농도/투여량으로) 투여할 수 있거나, 또는 연속 주입으로서 투여할 수 있다. 적절한 투여량에 대한 추가적인 정밀화는 통례적으로 수행한다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이타를 이용함으로써 정할 수 있다.
약학적 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따라, 예를 들어 경구로, 정맥내, 복막내, 뇌내 (실질내), 뇌실내 (intracerebroventricular), 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내, 병소내 경로, 수질내 (intramedullary), 경막내, 심실내 (intraventricular), 경피, 피하 또는 복막내 주입을 통한 것이며, 또한 비강내, 장내, 국소, 설하, 요도, 질 또는 직장 경로로, 서방형 시스템에 의한 또는 이식 디바이스에 의한 것이다. 적절한 경우, 조성물은 볼루스 주입 (bolus injection)에 의해 투여하거나, 또는 주입에 의해 또는 이식 디바이스에 의해 연속적으로 투여할 수 있다. 다른 예로, 또는 아울러, 조성물은 원하는 분자가 흡착 또는 캡슐화된 막, 스폰지 또는 기타 적절한 물질을 이식함으로써 국소 투여할 수 있다. 이식 디바이스를 사용하는 경우, 이 디바이스는 임의의 적정 조직 또는 장기로 이식할 수 있으며, 원하는 분자의 전달은 확산을 통해, 시간-방출형 볼루스를 통해 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.
몇몇 경우에, 본 발명의 이중 기능성의 융합 단백질은, 본원에 기술된 방법 등의 방법을 이용해, 폴리펩타이드를 발현 및 분비하도록 유전자 조작된 특정 세포를 이식함으로써, 전달할 수 있다. 이 세포는 동물 세포 또는 인간 세포일 수 있으며, 자가 유래이거나, 동종 또는 이종의 것일 수 있다. 선택적으로, 세포는 불멸화될 수 있다. 면역학적 반응 기회를 낮추기 위해, 세포를 캡슐화시켜, 주변 조직의 침윤을 방지할 수 있다. 캡슐화 물질은 전형적으로 폴리펩타이드 제품(들)을 방출시킬 수 있지만 환자의 면역계 또는 주변 조직으로부터 유래된 기타 유해 인자에 의한 세포의 파괴를 방지할 수 있는, 생체적합한 반-투과성의 폴리머 봉입체 (enclosure) 또는 막이다.
또한, 본 발명의 이중 기능성의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 또는 이의 유도체를 개체로 직접 도입하는, 생체내 유전자 요법도 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 이중 기능성의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 아데노-연관 바이러스 벡터 등의 적절한 전달 벡터를 사용하거나 또는 사용하지 않고 핵산 구조체를 국소 주입함으로써 타겟 세포로 도입한다. 대안적인 바이러스 벡터로는, 비-제한적으로, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 파필로마 바이러스 벡터 등이 있다. 바이러스 벡터의 체내 전달은 바람직한 핵산 구조체 또는 바람직한 핵산 서열을 포함하는 기타 적절한 전달 벡터의 국소 주입에 의해, 리포좀-매개 전달에 의해, 직접 주입 (네이키드 DNA)에 의해 또는 미세입자 충격 (유전자-총)에 의해 생채내에서 달성할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 치료학적 효능을 강화하거나 잠재적인 부작용을 낮추기 위해 다른 치료학적 제제와 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 과제는 전술한 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 이를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 일 구현예에서, 제조 방법은, (1) 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계; (2) (1)의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 구축하는 단계; (3) (2)의 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 형질감염 또는 형질전환하고, 배양하여 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 단계; 및 (4) 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 제조 방법은 당해 기술 분야의 통상적인 당업자에게 입증되고 널리 공지된 기법을 이용해 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 과제는, 전술한 약학적 조성물을 유효량으로 치료가 필요한 환자나 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물을 이용해 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은, 비제한적인 예로, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 (MM), 방광암, 난소암, 전립선 암, 폐암, 대장암, 유방암, 췌장암 및 신장암 등의 CD46-과다발현성 종양 또는 암을 치료하는데 사용된다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 비제한적인 예로 크론 질환, 알레르기성 천식, 류마티스 관절염 등의 CD47 과다 발현과 관련된 기타 병태들을 치료하는데 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은, 비제한적인 예로, 노인성 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막증 (DR), 간 섬유증, 혈관육종 등의, VEGF의 기능 또는 활성을 저해하는 것이 바람직한 질환에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자와 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 제공한다. 벡터의 예로는, 비제한적으로, 플라스미드, 바이러스 벡터, 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 형질전환-컴피턴트 염색체 (TAC), 포유류 인공 염색체 (MAC) 및 인간 인공 에피좀 염색체 (HAEC)가 있다.
본 발명은 상기한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 발현 벡터에 의해 형질전환되거나 또는 형질감염될 수 있다. 적정 숙주 세포로는 원핵생물, 효모 및 기타 진핵 생물을 포함한다. 바람직하게는, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 효모 또는 포유류 세포주 (예, COS 또는 CHO)가 사용된다.
본 발명의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질 (SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2)은 인간 신호-조절자 단백질의 세포외 도메인의 첫번째 Ig-유사 영역 (SIRPαD1), 인간 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig-유사 영역 (VEGFR1D2) 및 인간 IgG1의 Fc 단편을 포함한다. 단백질은 동형이량체이고, 분자량이 100kDa이다. 스크리닝을 통해 안정적으로 발현하는 CHO (Chinese hamster ovary7) 세포주가 수득되었으며, 융합 단백질 100 mg이 수득되었다. 이 단백질은 CD47과 VEGF에 동시에 결합하여, 대식 세포의 표면 상의 SIRP와 CD47의 결합을 차단함으로써 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 촉진시키고, VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 생장을 저해할 수 있는 것으로, 시험관내에서 확인되었다. SIRPα D1-Fc- VEGFR1D2는 생체내 검사에서 CD47-양성 종양 세포인 HL60에 강력한 효능을 발휘하였으며, 종양을 완전히 제거할 수 있다. 이는, 종양 조직에서 혈관신생을 저해하고 대식 세포에 의한 식균 작용을 자극함으로써, 달성된다.
본 발명은 2가지 주요 암 타겟, SIRPα와 VEGF에 관한 것이다. SIRPα를 차단하면 대식 세포 (Mφ)에 의한 종양 세포의 식균 작용을 촉진시킬 수 있지만, 거대 종양은 충분한 혈액 공급으로 인해 효과적으로 식균되지 않을 것이다. 또한, VEGF만 차단하는 것은 종양 제거에까지 이르지 못한다. SIRPα와 VEGF가 동시에 차단되면, 종양은 증식은 저해되면서 대식 세포 (Mφ)에 의한 식균 작용에 보다 취약해지게 되고, 완전히 제거될 수 있다.
이제, 본 발명을 후술한 비-제한적인 실시예를 들어 더욱 설명한다.
실시예
실시예 1: SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2는 CD47과 VEGF에 결합하고, HL60 종양 증식을 저해한다.
1. SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2 발현 벡터의 구축
Plg-Tail (R&D Systems)을 사용하였다. 클로닝하기 전에, 프라이머 1과 2를 사용해 Fc 코딩 서열을 증폭하고, Fc의 카르복시 말단에 정지 코돈은 제거하고, PCR 산물을 plg-Tail의 EcoRI/XhoI 사이트에 클로닝함으로써, Plg-Tail을 인공 제조하였다. SIRPαD1의 코딩 서열은 THP-1 (ATCC ® TIB-202™) 세포로부터 프라이머 3과 4를 사용해 증폭시켰고, VEGFR1D2의 코딩 서열은 HUVEC(ATCC® PCS-100-010 ™) 세포로부터 프라이머 5와 6을 사용해 증폭시켰다. PCR 산물 2개를 제조한 plg-Tail 벡터의 HindIII/EcoRI 사이트와 XhoI/XbaI 사이트에 각각 클로닝하여, 벡터 pSIRPαD1-Fc-VEGFR1D2를 제조하였다.
표 1 PCR 프라이머
번호 프라이머 서열 (5'-3') 타겟 엔도뉴클레아제
프라이머 1: CGGAATTC GAGCCCAAATCTTGTG
(서열번호 1)		 인간 IgG1 EcoRI
프라이머 2: CATGCTCGAG TTTACCCGGAGACAGGGAG
(서열번호 2)		 인간 IgG1 XhoI
프라이머 3: CCCAAGCTTGGGGCCACCATGGAGCCCGCCGGCCCGGCCC
(서열번호 3)		 SIRPα HindIII
프라이머 4: CGGAATTC GTGCTGAGGTGTGGCCCTCGCC
(서열번호 4)		 SIRPα EcoRI
프라이머 5: CATGCTCGAG AATAGTGATACAGGTAGACCTTTC
(서열번호 5)		 VEGFR1 XhoI
프라이머 6: GCATCTAGAGGGTTAGATTGTATTGGTTTGTCGATG
(서열번호 6)		 VEGFR1 XbaI
주석: 유전자 특이 서열은 진하게 기재하고, 엔도뉴클레아제 인지 사이트는 밑줄로 표시된다.
2. 단백질 발현 및 정제
CHO 세포가 함유된 완전 세포 배양 배지 DMEM (10% FBS)를 24웰 플레이트에 웰 당 0.5 ml씩 넣고, 플레이트를 24시간 동안 인큐베이터에 두었다. 형질감염을 위해, 플라스미드 0.5 ㎍과 리포펙타민 2000 (Cat#11668-027, Invitrogen) 2 ㎕를 각각 무혈청 배양 배지 50 ㎕에 용해시킨 후, 합쳐 실온에서 20분간 둔 다음 천천히 웰에 넣고, 다시 인큐베이터에 넣어 24시간 두었다. 다음날, 세럼 100 ㎕를 취하여, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA)으로 단백질 발현 검사에 사용하였다.
3. 단백질 발현 검사
단백질 발현 검사는 다음과 같은 단계로 ELISA에 의해 수행하였다: 항-인간 IgG 염소 항체 F(ab')2 단편 (Biosource International Inc)을 PBS 포스페이트 완충제에 용해한 다음, 96웰 ELISA 플레이트에 웰 당 20 ng 씩 넣었다. ELISA 플레이트를 4℃ 냉장고에 넣어 밤새 두었다. 검사를 위해, 차단 용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 3% skim milk)으로 1시간 동안 플레이트를 블롯킹한 다음, 희석한 혈청을 첨가하여 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이를 세척 용액 (PBS, 0.05% Tween-20)으로 5번 세척한 다음, 호스라디쉬 퍼옥시다제 (HRP)로 표지된 항-인간 IgG 토끼 항체 (Jackson ImmunoResearch Lab)를 첨가하여 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 5회 세척한 후, HRP에 대한 기질을 첨가하고, 정지 용액 (1N H2SO4)을 사용해 2분 후 발색 반응을 중단시켰다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다.
4. 안정적인 발현 세포주 스크리닝
형질감염된 세포를 대상으로 농도-증가식 항생제 압박 스크리닝 (concentration-increasing antibiotic compression screening) (Geneticin, Cat#10131035, Invitrogen)을 수행하였다. 불안정한 세포들은 점차적으로 사멸하였으며, 생존한 세포를 웰 당 0.5-1 세포로 희석하여 96웰 플레이트 5개에 주입하였다. 플레이트를 10-15일간 인큐베이터에 두었다. 단일 클론을 가진 웰을 ELISA로 검사한 다음, 양성 세포를 증폭시키고, 무혈청성 Ex-CELL CD CHO 배양 배지 (Cat#14361C-1000ML, SIGMA)를 사용해 상시 배양하였다. 추가로 스크리닝한 후, 발현율이 가장 높은 세포를 선별하여, 사용을 위해 냉동시켰다.
5. 단백질 생산 및 정제
안정적으로 발현하는 세포주 (3x105/ml)를 무혈청 배양 배지 300 ml이 담긴 2L 교반 플라스크에 접종하고, 교반 플라스크를 배양을 위해 교반 베드에 두었다. 세포 밀도가 5 x 106/ml에 도달하면, 상층액을 수득하였다. 상층액을 단백질 A 컬럼으로 정제하였다. 정제된 단백질을 투석 (pH 7.0)하여 PBS로 교체하였다. 단백질 전기영동 분석을 수행하여, 순도가 98% 이상임을 확인하였다.
6. 타겟 결합 친화성
타겟 CD47과 VEGF에 대한 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 결합 친화성을 유세포 측정과 ELISA 방법을 이용해 검사하였다.
SEM-K2 세포와 HL60 세포를 결합 친화성 검사에 사용하였다 (전자는 급성 림프모구성 백혈병 세포이고, 후자는 전골수성 백혈병 세포임). 세포를 PBS로 헹군 후, PBS에 농도 1 x 106/ml로 현탁하였다. hlgG (1 ㎍/ml)를 세포 현탁물에 첨가하고, 현탁물을 4℃ 냉장고에 넣어 1시간 두었다. PBS (웰 당 100 ㎕)로 헹군 후, U자형의 96웰 세포 배양 플레이트 (Cat#163320, NuncTM)로 세포를 옮겼다. 그런 후, SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2를 다양한 농도로 첨가하고, 세포를 4℃ 냉장고에 넣어 1시간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 헹군 후 현탁하고, FITC 표지된 항-인간 IgG-Fc 항체 (Cat#F9512, Sigma)와 함께 인큐베이션하였다. 1시간 후, 세포를 유세포 측정에 의해 검사하였다 (Guava easyCyte 6HT-2L, Millipore).
VEGF-A에 대한 결합 친화성을 다음과 같은 단계로 ELISA로 검사하였다:
VEGF-165를 코팅 완충제 CBS (Sigma-Aldrich Co., Product code: 1001329288 C3041-100CAP)를 사용해 1000 ng/ml로 희석하고; ELISA 플레이트 (Cat#442404, NuncTM)에 용액 100 ㎕ (웰 당 100 ng)를 첨가하고; 코팅된 플레이트를 4℃ 냉장고에 넣어 밤새 두고; 검사시, 코팅된 플레이트를 0.05% PBS-T로 한번 헹군 후, 코팅된 플레이트를 3% 탈지유로 1시간 동안 실링하고; 희석한 SIRPD1-Fc-VEGFR1D2 (20, 10, 5,..... 0.01nM)을 코팅 플레이트 (100 ㎕/웰)에 넣고; 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 샘플을 버리고, 0.05% PBS-T 용액으로 5회 헹구고; 희석한 HRP-Rabbit Anti-Human IgG Fc 100 ㎕ (1:20000) (Cat#:309-036-008,Jackson ImmunoResearch Lab)을 넣고; 실온에서 1시간 인큐베이션하고; 플레이트를 세척 용액으로 5번 헹구고; HRP 기질을 첨가하고; 차광 조건 하에 10-20분간 발색 반응을 수행하고 1N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시킨 후; 마이크로플레이트 리더에서 OD450 흡광도를 측정한다.
7. 타겟 활성에 대한 차단 분석
SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2가 CD47-SIRPα의 결합에 의해 유도되는 식균 작용 저해 활성을 차단할 수 있는 지를 조사하기 위해, FITCCFSE 표지된 SEM-K2 세포를RAW264.7 세포와 RAW264.7:SEM-K2 2:1의 비율로 혼합하고; 이 혼합물을 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2, SIRPαD1-Fc 및 인간 IgG-Fc와 서로 다른 농도로 함께 6개의 새로운 세포 배양 플레이트에서 배양한 다음; 4시간 후, 플레이트를 조심하면서 흔들고, 현탁된 SEM-K2 세포를 뽑아내고, 플레이트를 PBS로 2번 헹구어 현탁된 세포들은 모두 제거하였으며; 플레이트 웰에 고정된 RAW264.7 세포를 트립신-EDTA로 분해하고; 플레이트를 PBS로 2번 헹군 다음; 유세포 측정을 통해 SEM-K2 세포 대 RAW264.7 세포의 식균 비율을 정량적으로 분석하였다.
8. 항종양 분석
SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 생체내 항종양 활성을 HL-60 피하 종양 모델에서 평가하였다. HL-60 세포주는 특성이 규명된 시험관내 인간 백혈병 모델로서, 급성 전골수성 백혈병 환자 1명으로부터 유래되었으며[6], 약물의 치료학적 효능을 위해 이종 마우스 모델에서 널리 사용되고 있다[7-9]. Balb/c 누드 마우스 스물 (20)마리에 백혈병 (HL60) 세포 (4x106 세포/마우스)를 피하 주사하였다. 종양이 최대 100-150mm3로 증식되면, 마우스들을 4개의 군으로 나누었다: 제1 군에는 PBS를 복막내 주사하였고; 제2 군에는 VEGFR1D2-Fc를 복막내 주사하였고; 제3 군에는 SIRPαD1-Fc를 복막내 주사하였으며; 제4 군에는 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2를 복막내 주사하였다. 각 군에 대한 투여량은 3 mg/kg이었으며, 주당 2회로 6번 연속 투여하였다. 종양의 부피와 무게를 매주 2회 측정하였다.
실험 결과
1. 발현 벡터 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2 구축
SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2는 SIRPα의 첫번째 세포외 도메인 (D1), VEGF1의 2번째 세포외 도메인 (D2) 및 이 둘을 연결하는 인간 IgG1의 Fc 단편으로 구성되며, MAC-01로 지칭된다. 이것은 도 2A에 나타낸 구조를 가진다. SIRPαD1과 VEGFR1D2를 각각 분자 클로닝에 의해 N-말단과 C-말단에 연결한다. SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 서열은 뉴클레오티드 1503 (도 3A)를 포함하며, 여기서 신호 펩타이드 코딩 서열은 뉴클레오티드 63개 (적색)이고, SIRPαD1은 뉴클레오티드 426개 (청색)이고, IgG1-Fc는 뉴클레오티드 696개 (검정색)이고, VEGFR1D2는 뉴클레오티드 306개 (녹색)이며, EcoRI 서열은 뉴클레오티드 6개, XhoI 서열은 뉴클레오티드 6개로 이루어진다. 도 3B는 해당 아미노산 서열을 나타낸다.
2. 단백질 발현 분석
단백질 전기영동 (SDS-PAGE)을 통해, 단백질 분자량이 비-환원 조건에서 170kDa 보다 크며 (도 4), 이는 이론값 (100kDa)과 상당한 차이가 있다는 것을 확인하였다. 이는 단백질의 당화로 인한 것으로 보인다.
3. SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 타겟 결합 친화성
유세포 측정과 ELISA를 이용하여, VEGF-A에 대한 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 결합 친화성을 분석하였다. 그 결과, SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2는 CD47 (도 5A)와 VEGF-A (도 5B) 둘다에 결합하였으며, 각각의 EC50는 0.1-1.0nM (CD47)과 0.08-0.15nM (VEGF-A)이었다.
4. SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2는 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 촉진한다
표지된 급성 림프모구성 백혈병 세포 SEM-K2와 마우스의 대식 세포 (RAW264.7)를 이용하여, 종양 세포의 식균 작용에 대한 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2의 효과를 분석하였다. 그 결과 (도 6), SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2는 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 현저하게 강화하는 것으로 나타났다. 그 효과는 용량 의존적이었다.
5. SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2 단백질의 항종양 활성
HL60 피하 종양 모델을 이용하여, SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2 단백질의 생체내 항종양 활성을 조사하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, VEGFR1D2-Fc 치료군은 종양 증식에 대해 매우 제한적인 저해 효과를 발휘하였고, SIRPαD1-Fc 치료군은 종양 증식에 대해 명백한 저해 효과를 나타내었지만 종양을 제거하기에는 충분하지 않았다. 반면, SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2로 치료한 후에는, 마우스에서 치료 개시시 종양의 크기가 100mm3에서 줄어들기 시작해, 치료 종료시에는 종양이 거의 없어졌다. 음성 대조군의 경우, 마우스의 종양 체적은 시간 경과에 따라 점차적으로 증가하여, 종료 시점에는 1000 mm3에 이르렀다. 실험 결과, VEGF의 저해 활성만으로는 HL 종양에 유의한 치료 효과를 발휘하지 못하는 것으로 나타났는데, 이는 HL60 종양의 증식이 VEGF에 크게 의존하지 않는다는 것을 의미한다. 대식 세포에 의한 식균 작용의, 종양에 의해 유도되는, 저해가 차단되었을 때, 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용이 강화되어, 종양 세포의 증식이 현저하게 저해되었다. 그러나, VEGF와 CD47-SIRP 둘다의 작용을 저해하면, 종양은 완전히 제거될 것이다.
상기한 데이타는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질 SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2가 듀얼-타겟 결합 친화성이 우수한 새로운 재조합 단백질임을 시사해준다. 생체내 실험에서는, SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2 단백질이 유의한 항종양 활성을 가지는 것으로 확인된다. HL60 모델에서, 종양을 완전히 제거할 수 있다. 이 단백질은 기본적으로 종양을 제거하기 위한 2가지 기전을 가진다: 종양에서 혈관 생장을 저해함으로써 종양 증식에 필요한 영양분 공급을 중단시키고; 종양 세포 표면의 CD47이 식균세포 표면의 SIRPα에 결합함으로써, 종양에 의해 유도되는 자가-보호 기전을 파괴하고, 따라서 대식 세포에 의한 종양 세포의 강력한 식균 작용을 유도한다. 이러한 2가지 기전은 상승적으로 작용하며, 즉, 종양의 체적이 영양분 부족으로 인해 줄어들고, 따라서 종양이 보다 쉽게 대식 세포에 의해 식균되며, 그 결과 종양이 제거된다.
실시예 2 MAC-01은 폐암 (A549)의 증식을 저해한다.
전술한 재조합 Fc-융합 단백질 SIRPAD1-Fc-VEGFR1D2 (MAC-01)를 A549 폐암 이종이식 모델에서 검사하였다. A549 세포주는, 58세 백인 남성의 외식 종양에서 암성 폐 조직의 적출 및 배양을 통해, 1972년에 D. J. Giard 등에 의해 최초로 개발되었다[10] [11]. A549 이종이식 마우스 모델은 수많은 약물 후보에 대한 효능 평가에 널리 사용되어 왔다 [12-15]. 실험 데이타에 따르면, MAC-01은 VEGF와 CD47 둘다에 동시에 결합할 수 있어, 각각의 분자-매개 신호들을 차단할 수 있는 것으로 확인되었다. 생체내 폐암 이종이식 모델에서 조사한 바, MAC-01은 단일 분자들의 조합한 경우 보다 명백하게 우수한 강력한 항종양 활성을 발휘하였다.
5 x 106 A549 세포를 무혈청 배지/matrigel (50:50 v/v) 200 ㎕에 현탁하여, Balb/c 누드 마우스에 피하 주사하였다. 평균 종양 체적이 100 - 200 mm3에 도달하면, 적정 크기의 종양을 가진 마우스 30마리를 종양 체적에 따라 5개의 군으로 무작위 배치하였다 (6마리/군). 마우스에 4주간 주당 2회로 5 mg/kg MAC-01, 2.5 mg/kg SIRPAD1-Fc, 2.5 mg/kg VEGFR1D2-Fc 또는 2.5 mg/kg SIRPAD1-Fc + 2.5mg/kg VEGFR1D2-Fc를 i.p. 처리하였다. PBS 치료는 음성 대조군으로 사용하였다. 항종양 효과는, 치료군의 종양 체적을 대조군의 종양 체적으로 나눈 다음 100을 곱한 %T/C (대조군 대비 치료군)로 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, SIRPAD1-Fc 단독 치료시 종양 증식 저해 효과가 가장 낮았으며, 종양 증식 저해율은 93% T/C에 불과하였다. 반면, VEGFR1D2-Fc 치료는 종양 증식의 상당한 저해 (32% T/C)를 유도하였고, VEGFR1D2-Fc 치료에 SIRPAD1-Fc를 첨가한 경우 VEGFR1D2-Fc-매개 종양 증식 저해가 추가로 증가되진 않았다 (33% T/C). 그러나, 이중 기능성의 재조한 단백질 MAC-01을 이용한 치료시, 급격한 종양 증식 저해가 나타났으며 (25% T/C), 이는 VEGFR1D2-Fc 단독 또는 단일 분자들의 조합한 군들과 비교해 훨씬 강력하였다 (P = 0.05). 통계학적 분석 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2. A549 s.c. 이종이식 모델에서 종양 증식 저해
약물 증식 저해율
(%T/C)		 PBS 대비 P 값 MAC-01 대비 P 값
MAC-01, 5 mg/kg 25 0.001
SIRPAD1-Fc, 2.5 mg/kg 93 0.47
VEGFR1D2-Fc, 2.5 mg/kg 32 0.001 0.05
SIRPAD1-Fc+VEGFR1D2-Fc 33 0.001 0.05
상기한 결과들은, 이중 기능성의 재조합 단백질 MAC-01이 아마 틀림없이 VEGF와 SIRP를 동시에 차단함으로써, 현저한 생체내 항-종양 활성을 가짐을 보여준다.
본 발명은 상기에서 하나 이상의 구현예를 기술되어 있지만, 본 발명이 이들 구현예들로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 하며, 상세한 설명은 첨부된 청구항의 사상과 범위내에 포함될 수 있는 바와 같이 모든 대안, 수정 및 등가를 포괄하는 것으로 의도된다. 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Jing, Deqiang <120> NOVEL RECOMBINANT BI-FUNCTIONAL FUSION PROTEINS, PREPARATION AND USE THEREOF <130> 154040-00001 <150> US61/969,276 <151> 2014-03-24 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 1 cggaattcga gcccaaatct tgtg 24 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 2 catgctcgag tttacccgga gacagggag 29 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 3 cccaagcttg gggccaccat ggagcccgcc ggcccggccc 40 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 4 cggaattcgt gctgaggtgt ggccctcgcc 30 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 5 catgctcgag aatagtgata caggtagacc tttc 34 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 6 gcatctagag ggttagattg tattggtttg tcgatg 36 <210> 7 <211> 1506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRPaD1-Fc-VEGFR1D2 <400> 7 atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60 gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120 aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg gccattctgc actgcactgt gacctccctg 180 atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac cagcccggga attaatctac 240 aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagagtccac aaagagagaa 300 aacatggact tttccatcag catcagtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360 tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac acggagttta agtctggagc aggcactgag 420 ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca 480 cctcagcacg aattcgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 540 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 600 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 660 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 720 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 780 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc 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Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser 85 90 95 Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg 130 135 140 Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr 145 150 155 160 Pro Gln His Glu Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 165 170 175 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 180 185 190 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 195 200 205 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 210 215 220 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 225 230 235 240 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 245 250 255 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 260 265 270 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 275 280 285 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 290 295 300 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 305 310 315 320 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 325 330 335 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 340 345 350 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 355 360 365 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 370 375 380 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu Ile 385 390 395 400 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 405 410 415 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 420 425 430 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 435 440 445 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 450 455 460 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 465 470 475 480 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 485 490 495 Gln Thr Asn Thr Ile 500

Claims (21)

  1. 이중 기능성의 재조합 융합 단백질 (recombinant bi-functional fusion protein)로서,
    VEGF 수용체 (VEGFR)의 세포외 도메인의 Ig 영역과, 링커를 통해 연결된, 신호-조절자 단백질 (SIRP)의 세포외 도메인의 Ig 영역을 포함하며,
    상기 단백질은 CD47과 VEGF에 결합하여, 대식 세포의 세포 표면 상의 SIRP에 CD47이 결합하는 것을 차단함으로써, 대식 세포에 의한 종양 세포의 식균 작용을 자극하고, VEGF에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 생장을 저해할 수 있는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신호-조절자 단백질이 SIRPα인, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 신호-조절자 단백질의 세포외 도메인의 Ig 영역이 SIRPαD1인, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 VEGFR이 VEGFR1인, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 VEGFR1의 Ig 영역이 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig 영역 (VEGFR1D2)인, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 링커가 Ig의 Fc 단편인, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, Fc 단편이 IgG1의 Fc 단편인, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, SIRPα의 세포외 도메인의 첫번째 Ig 영역 (SIRPαD1)에, 인간 IgG1의 Fc 단편을 통해 연결된, 인간 VEGFR1의 세포외 도메인의 2번째 Ig 영역 (SIRPαD1-Fc-VEGFR1D2)을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 서열번호 8과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 이중 기능성의 재조합 융합 단백질.
  11. 제9항에 따른 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제10항에 따른 이중 기능성의 재조합 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  15. 제13항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제1항의 이중 기능성의 재조합 융합 단백질과 하나 이상의 약제학적 보강제를 포함하는, 약학적 조성물.
  17. 환자 또는 개체에게 제16항의 약학적 조성물을 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, CD47의 과다 발현에 의해 유발되는 질환의 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 질환이 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 (MM), 방광암, 난소암, 전립선 암, 폐암, 대장암, 유방암, 췌장암 및 신장 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 질환이 크론 질환, 알레르기성 천식 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  20. 환자 또는 개체에게 제16항의 약학적 조성물을 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, VEGF의 기능 및 활성 강화에 의해 유발되는 질환의 치료 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 질환이 노인성 황반 변성, AMD, 당뇨병성 망막증, 간 섬유증 및 혈관육종으로부터 선택되는, 치료 방법.
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