KR20160120752A - 시험관내 시험 시스템에서의 보툴리눔 신경독소에 대한 세포의 감수성을 표준화 및 증가시키기 위한 갱글리오사이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 표준화 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 본 발명은 추가로, 하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성이 표준화된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 생성 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계, 이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 추가로, 본 발명에는 하기 단계를 포함하는 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 결정하는 방법이 포함된다: a)유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 을 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및 d) 신경독소 폴리펩티드의 상기 세포에서의 생물학적 활성을 결정하는 단계. 최종적으로 본 발명은 이하 기재된 것을 목적으로 하는 GT1b 의 용도에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성 결정; 또는 b) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소.
Description
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하는 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 표준화된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런의 생성 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계, 이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 추가로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 방법을 포함한다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 동안 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및 d) 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 상기 세포에서 결정하는 단계. 최종적으로, 본 발명은 하기에 기재된 것을 목적으로 하는 GT1b 의 용도에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 표준화; 또는 b) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소.
클로스트리둠 보툴리눔 (
Clostridium botulinum) 및 클로스트리둠 테타니 (Clostridium tetani) 는 각각 매우 강력한 신경독소, 즉 보툴리눔 독소 (Botulinum toxins) (BoNTs) 및 테타누스 독소 (Tetanus toxin) (TeNT) 을 생산한다. 그러한, 클로스트리듐성 신경독소 (CNTs) 는 신경 세포에 특이적으로 결합하여 신경전달물질 방출을 교란한다. 각 독소는 불활성 미가공된 약 150 kDa 단일쇄 단백질로서 합성된다. 번역 후 가공은 디설파이드 다리 형성 및 박테리아 프로테아제(들)에 의한 제한된 단백질가수분해 (니킹; nicking) 를 수반한다. 활성 신경독소는 디설파이드 결합에 의해 연결되는 약 50 kDa 의 N-말단 경쇄 및 약 100 kDa 의 중쇄인 두 사슬로 이루어진다. CNT 는 구조적으로 그리고 기능적으로 3 개의 도메인, 즉 촉매 경쇄, 위치변경 도메인 (N-말단 절반) 및 수용체 결합 도메인 (C-말단 절반) 을 포함하는 중쇄로 이루어진다; 참고문헌은, 예를 들어 Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. 보툴리눔 신경독소는 150 kDa 신경독소 단백질 및 회합된 무독성 단백질을 함유하는 분자 복합체로서 합성된다. 복합체 크기는 클로스트리듐 균주 및 300 kDa 내지, 500 kDa 초과, 및 900 kDa 범위의 구분되는 신경독소 항원형에 따라 상이하다. 그러한 복합체들 중 무독성 단백질은 신경독소를 안정화하며, 그들을 분해로부터 보호한다; 참고문헌은, Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26.
클로스트리듐 보툴리눔은 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 의 A 내지 G 로 지정된 항원상 구분되는 7 가지 항원형을 분비한다. 클로스트리둠 테타니에 의해 분비되는 관련된 테타누스 신경독소 (TeNT) 와 함께 모든 항원형이 SNARE 단백질을 절단함에 의해 시냅스 토세포현상을 차단하는 Zn2 +-엔도프로테아제이다; 참고문헌은, Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. CNT 은 보툴리눔 및 테타누스에서 나타나는 무탄력 근육 마비를 초래한다; 참고문헌은, Fischer 2007, PNAS 104, 10447.
그의 독성 효과에도 불구하고, 보툴리눔 독소 복합체는 수많은 질환의 치료제로서 이용되어 왔다. 보툴리눔 독소 항원형 A 는 사시증, 안검경련, 및 여타 장애 치료용으로 1989 년 미국에서 인체용으로 승인받았다. 보툴리눔 독소 A (BoNT/A) 단백질 제제로서 시판되어 이용가능한 것은 예를 들어 상표명 BOTOX (Allergan, Inc. 사 제조) 또는 상표명 DYSPORT/RELOXIN (Ipsen, Ltd. 사 제조) 인 것이 있다. 개선된, 복합체-유리 보툴리눔 독소 A 제제는 상표명 XEOMIN (Merz Pharmaceuticals, LLC 사 제조) 로 시판되어 입수가능하다. 치료 적용을 위해서는, 제제는 치료할 근육에 직접 주사된다. 생리학적 pH 에서, 상기 독소는 단백질 복합체로부터 방출되며, 원하는 약학적 유효성을 발휘한다. 보툴리눔 독소의 유효성은 오직 일시적인데, 이는 치료 유효성 유지를 위해서는 보툴리눔 독소의 반복적 투여가 필요한 이유이다.
클로스트리듐성 신경독소는 자발적 근력을 약화하며, 사시증, 경부 근긴장이상증을 포함하는 국소 근긴장이상증, 및 양성 본태성 안검경련에 대한 유효한 치료요법이다. 이들은 반축안면경련 및 국소 경련을 경감시키고, 나아가 위장관 장애, 다한증 및 미용 주름 정정과 같은 광범위한 여타 징후에 유효한 것으로 나타났다; 참고문헌은 Jost 2007, Drugs 67, 669.
클로스트리듐성 신경독소의 제조 공정 동안, 상기 신경 독소의 정성적 및 정량적 결정 뿐 아니라 생물학적 활성 신경독소 폴리펩티드의 품질 관리는 특별히 중요하다. 추가로, 정부 기관들은 오직 강건하며, 명확하고, 정밀하며, 신뢰성있으며 평가를 마친 보툴리눔 독소 효능 검정만을 수용한다. 현재, 마우스 LD50 생물검정, 치사율 시험이 그들의 제제의 효능을 분석할 약제학적 제조사에 의해 이용되는 "금본위제" 로 있다; 참고문헌은 Arnon 등 (2001), JAMA 285, 1059-1070. 그러나, 근년에, 상기 유형의 동물-기반의 검정과 관련되어 있는 동물 실험의 필요성 및 모든 단점들, 비용 및 윤리적 염려를 줄이고자 대안적 접근법을 찾는 상당한 노력이 기울여지고 있다. 추가로, 규제 기관들은 보툴리눔 신경독소의 효능 시험에 "줄이고 (Reduce), 재정비하고 (Refine), 대체함 (Replace)" 의 세가지 "R" 원칙을 적용하고자 제약사의 관심을 유도하고 있다: 참고문헌은, Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313. 귀결로서, 살아있는 동물을 이용하는 방법에 대한 합리적인 대안이 될 세포-기반의 시험 시스템이 개발되었다. 그러나, 신경독소 생물학적 활성 결정에는 세가지 세포 시험 시스템만이 이용가능하며, 따라서 신경독소 폴리펩티드에 대해 충분히 감수성인 것으로 나타난 것으로 보기엔 요원하다. 그러한 세포-기반의 시험 시스템에는, 시험관내에서 분화된 설치류 태아로부터 단리된 초대 뉴런 (primary neuron) (Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388392), 신경 분화된 유도된 다능성 줄기 세포 (Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), 및 SiMa 세포주로부터 유도된 클론 (WO 2010/105234 A1) 의 이용을 포함한다.
그러나, 초대 뉴런의 단리는 동물의 살상이 필요하고, 번잡하며 시간소모적이고, 그러한 검정의 평가는 이의제기의 여지가 있는 것으로 나타났다. 나아가, 상이한 초대 뉴런을 이용한 시험 시스템은 큰 변동을 나타낸다. 유사하게, 뉴런으로 분화된 유도된 다능성 줄기 세포의 생성은 난해하며 시간 소모적이다. 추가로, 그러한 세포의 저장은 매우 까다롭다. 종양 세포주를 이용하는 검정에는 흔히 BoNT 에 대해 충분한 감수성이 없다. 나아가, 종양 세포주를 이용하면 검정의 큰 변동 및/또는 높은 실패율을 제공하게 되어, 상기 종양 세포주에는 복잡한 분화 프로토콜이 필요하다.
그러한 맥락에서, 신경독소 폴리펩티드 활성 결정용의 추가적인 시험 시스템이 절실히 필요하다.
따라서, 본 발명의 근저를 이루는 기술적 과제는 상기 언급된 요구에 응하는 수단 및 방법의 제공이라고 볼 수 있다. 기술적 과제는 하기의 청구범위 및 기재된 사항을 특징으로 하는 구현예로 해결된다.
제 1 국면에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 표준화된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도된 뉴런의 생성 방법에 관한 것이다:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계,
이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 감수성을 신경독소 폴리펩티드에 대해 표준화하게 됨.
상기 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들이 제 1 단계에서 제공된다. 회분은 예를 들어 계대배양의 수 및/또는 냉동/해동 순환 횟수 및/또는 본원의 다른 곳에서 언급된 여타 특성에 있어서 상이할 수 있다. 후속하여, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들은 GT1b 를 함유하는 적절한 세포 배양 배지에서 3 시간 이상, 4 시간 이상, 5 시간 이상, 6 시간 이상, 12 시간 이상, 또는 24 시간 (1 일) 이상, 36 시간 이상, 48 시간 (2 일) 이상, 72 시간 (3 일) 이상, 4 일 이상, 5 일 이상 또는 더 길게 배양된다. 바람직하게는, 상기 배양은 수 시간, 예를 들어 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 또는 12 시간 동안이다. 적절한 세포 배양 배지로서, 예를 들어 B27 보충물을 함유하는 Neurobasal® 배지, iCell® Neuron 배지 (Cellular Dynamics international 사 제조; CDI) 또는 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 제조사 또는 공급사에 의해 제공되는 여타 세포 배양 배지가 사용될 수 있다. 이로써, 본 발명의 발명자들은, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성이 하기에 더욱 상세히 제시되는 바와 같이 GT1b 처리 부재 하의 대조군 회분들의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런에 비해 현저히 감소될 수 있음을 발견했다.
또다른 국면에서, 상기 제시된 본 발명의 방법은 하기의 단계들을 추가로 포함한다:
c)
단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
d)
단계 c) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 동안 배양하는 단계.
유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양 후, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 우선 접촉시킨 후, 신경독소 폴리펩티드를 이용해 24 시간 (1 일) 이상, 36 시간 이상, 48 시간 (2 일) 이상, 60 시간 이상, 72 시간 (3 일) 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 (1 주) 이상, 2 주 이상, 3 주 이상, 5 주 이상, 6 주 이상 후속 단계에서 중독화시킬 수 있다. 바람직하게는, 중독은 72 시간 이상이다. 신경독소 폴리펩티드는 예를 들어 본원의 다른 부분에서 더욱 상세히 정의되는 바와 같은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT, 또는 그의 아형일 수 있다. 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들은 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발회하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 상기 표기된 기간 동안 배양된다. 그러한 처리에 의해, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 상기 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성은 GT1b 처리 부재 하에 중독된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 대조군 회분들에 비해 더욱 감소될 수 있다.
추가 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하는 방법에 관한 것이다:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계;
b)
단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
c)
단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계;
이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨.
추가 국면에서, 상기 언급된 본 발명의 방법은 하나 이상의 추가적인 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적인 단계들은 상기 정의된 바와 같은 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 단계를 포함할 수 있다. 그러한 목적을 위해, 본원에 기재된 바와 같이 GTb1 의 존재 하에 배양된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런을 본원에 정의된 바와 같이 신경독소 폴리펩티드와 접촉시킨다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 용어 "접촉" 은 물리적 및/또는 화학적 및/또는 생물학적 상호작용을 허용하도록 예를 들어 시료 중에 물리적 접근성이 있도록 포함될 수 있는 상기 언급된 세포 및 신경독소 폴리펩티드를 함께 두는 것을 지칭한다. 특이적 상호작용을 허용하는 적합한 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 조건은 본 발명의 방법에 적용되는 세포 및 신경독소에 좌우되며, 지체없이 당업자에 의해 채택될 수 있다. 나아가, 상호작용을 허용하기에 충분한 시간은 또한 지체없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 특별한 양의 본원에 정의된 단리되거나 또는 재조합 신경독소 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 신경독소 폴리펩티드를 함유하는 시료가 GT1b-처리된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런에 첨가될 수 있다. 이후, 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 다시금 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 세포를 신경독소와 인큐베이션한다. 본원에 사용된 "신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건" 은 당업계에 공지되어 있다. 후속하여, 생물학적 활성의 발휘는 예를 들어 용균 완충액의 세포에 대한 첨가에 의해 중단되며, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성은 예를 들어, 절단된 신경독소 기질을 특이적으로 검출하는 웨스턴 블랏 검정 또는 특이적 ELISA 기법에 의해 결정된다. 예를 들어, SNAP-25 는 BoNT/A, BoNT/C1 및 BoNT/E 의 공지된 기질이며 그들에 의해 절단된다. VAMP/시냅토브레빈은 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G 및 TeNT 의 기질이며 그들에 의해 절단되고, Syntaxin 은 BoNT/C1 의 기질이며 그에 의해 절단된다.
클로스트리듐성 신경독소는 시냅스 앞부분 신경 말단으로부터의 신경전달물질의 분비를 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 한다. 말초 뉴런에 대한 선별성은 2 개의 상이한 수용체, SV2 및 GT1b 의 인식에 의해 중재된다. 신경독소의 생리학적 유효성은 소위 SNARE 복합체의 단백질의 절단 및 후속하는 수용체의 결합 및 신경독소들의 경쇄의 위치변경을 기반으로 한다. BoNT 의 생물학적 활성의 결정은 상기 신경독소 단백질의 특징분석시 중요한 국면이며, 특히 BoNT-포함 제품의 상업적 출시 규제 기관에서 요구하는 것이다. 따라서, BoNT 의 생물학적 활성 측정을 위한 신뢰할 만한 시험은 BoNT 포함 제품의 연구, 개발 및 마케팅의 근간이다. 나아가, 세포-기반 시험 시스템은 지금까지 우세했던 동물 시험들을 윤리적인 이유들로 대체하게 될 것이다. 그러한 세포-기반 시험 시스템 확립을 위해서는, 신경 세포 또는 세포주의 보툴리눔 신경독소에 대한 충분히 높은 감수성이 필수적이다.
약제학적 제품에서 보툴리눔 독소의 생물학적 활성을 결정하기 위해서는, 신경 세포 또는 세포주가 하기의 특성을 갖춰야 한다: 우선, 세포는 표적, 즉 인간 환자에 가능한 가깝게 닮아야 하므로 인간 신경 기원이어야 한다. 둘째, 세포 시스템은 최종 제품 중의 부형제들에 대해, 그리고 바람직하게는 제조 공정의 중간 단계들에서 불순물에 대해 강건해야 한다 (공정 제어). 셋째, 세포-기반 시험 시스템은 바이알에서의 BoNT 의 생물학적 활성 (예를 들어, 50LD50U BoNT/A) 의 정확한 결정을 허용하는 동적인 측정 범위를 나타내야 한다. 부형제의 용해도, 세포 배양 배지의 부피 등과 같은 기술적인 요인들을 고려하면, 1 pM 미만의 BoNT 농도가 정확하게 결정되어야만 한다.
BoNT 에 대한 충분히 높은 감수성을 가진 이용가능한 세포-기반 시험 시스템 중 하나는 신경 분화된 유도된 다능성 줄기 세포를 이용한다. 본 발명의 발명자들은 시판하여 이용가능한 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 (Cellular Dynamics International, Inc. 사 제조, Madison) 을 이용하여 시험 시스템을 평가했다. 상기 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런은 냉동보존된 세포로서 입수되어, 제조사의 매뉴얼에 따라 해동시키고 4 일 동안 배양했다. 상기 세포는 더이상 분화하지 않고 최종적으로 분화된 뉴런의 표현형을 나타내어 더이상 변경되지 않는 것을 특징으로 하는 최종 분화된 신경 세포이다. 형성된 상기 표현형을 가진 후에는, 세포를 신경독소 폴리펩티드와 72 시간 동안 인큐베이션했다. 이후, 신경독소 폴리펩티드 BoNT/A, 및 그의 기질 SNAP-25 에 대해 예시된 바와 같이, 신경독소 기질 절단 생성물을 세포 용해물의 면역-웨스턴 블랏 분석 또는 ELISA 방법으로 정량했다. 언급된 공급사의 동일한 세포 회분을 이용해 시험이 실시되는 한, 상기 시험의 평가 결과, 높은 감수성, 상기 시험 시스템의 재현성 및 중간 정밀성이 확인될 수 있다. 그러나, 상기 공급사의 상이한 세포 회분들 이용시, 세포 수, 생존가능성, 표현형 등과 관련하여 공급사에 의한 상기 세포의 특징분석이 해당 변동성과 관련한 임의의 단서를 제공하지 않았음에도, 신경독소 폴리펩티드에 대한 상기 세포의 감수성에 있어서 설명불가한 높은 변동성을 발견했다. 구체적으로, 공급사의 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 세포 회분들의 감수성 (EC50) 은 1.7 내지 10 U/ml 초과의 범위로 변동한다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 GT1b 와 같은 갱글리오사이드의 외부에서의 적용이 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 세포 회분들 사이의 감수성의 변동성의 급격한 감소를 제공한다는 것을 발견했다. 이러한 발견사실은 다음과 같은 이유로 이례적인 것이다: 우선, 신경 표현형을 나타내는 세포는 내생적으로 충분한 GT1b 을 자체로 생산한다. 이는 예를 들어 초대 뉴런에 대해 발견된 바 있다. 나아가, 초대 뉴런 세포 배양의 상이한 제제들 조차 본 발명자들의 경험 상 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성에 있어서 그러한 변동성을 나타내지 않았다. 추가로, 그러한 유효성들이, 예를 들어 SiMa 세포가 사용된 신경아세포종 세포주-기반 시험에서는, 상이한 계대배양 수에 대해서도 상이한 냉동보존 회분들 시험시에도 관찰된 바 없었다. 둘째, Cellular Dynamics International 사에서 제공하는 제조사의 매뉴얼은 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 세포 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 그러한 변동성과 관련한 임의의 정보를 포함하지 않았다. 본 발명의 방법 이용시, 상기 변동성은 유리하게는 세포 배양 배지에 첨가되는 30 μM GT1b 의 존재 하의 배양 및 신경독소 인큐베이션에 의해 약 30% 내지 약 15% (표준 편차) 로 본 발명의 발명자에 의해 감소될 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법은 신경독소의 생물학적 활성을 결정할 민감하고, 정확하며 재현가능한 세포-기반의 시험 시스템을 제공한다. 상기 방법은 통상적인 동물-기반 시험 시스템에 대한 대안으로 이용될 수 있다. 나아가, 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하기 위한 본 발명의 비교적 단순한 방법이 상기 세포의 개선된 감수성을 제공한다: 167 fM 에 해당하는 약 5 U/ml 의 EC50 이 GT1b 의 첨가 부재시 세포에서 발견되는 반면, 25 fM 에 해당하는 약 0.75 U/ml 의 EC50 이 GT1b 이 세포 배양 배지에 첨가된 세포에 대해 발견되어, 감수성의 약 7 배 증가에 해당한다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 GT1b 의 부재 하에 배양된 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런에 비해, GT1b 의 첨가에 의해 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성이 증가될 수 있음을 발견했다. 구체적으로, 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 각 단일 회분의 감수성은 상기 갱글리오사이드와의 인큐베이션에 의해 개선될 수 있다. 흥미롭게도, 부모 SiMa 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성도 GT1b 의 첨가에 의해 강화될 수 있다. 상기의 경우, GT1b 를 처리하지 않은 SiMa 세포에 비해 상기 신경아세포종 세포의 감수성을 10 배나 증가시킬 수 있다. 그러한 결과는 여타 신경아세포종 세포, 예컨대 Neuro2a 가 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이 SH-SY5Y (DSMZ 및 ECACC), PC12, 또는 NG108-15 세포와 마찬가지로 GT1b 와의 인큐베이션 시 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성에 있어서 필적할 증가를 나타내지 않거나, 또는 약간의 증가만을 나타내기 때문에, 하찮은 과업이나 자명한 발견사실이 아니다.
따라서, 또다른 국면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 증가된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포의 생성 방법에 관한 것이다:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계,
이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 추가 국면에서, 신경독소 폴리펩티드에 대해 증가된 감수성을 가진 SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포가 상기 방법으로 제공될 수 있다.
또다른 국면에서, 상기 제시된 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
d) 단계 c) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계.
대안적으로, SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포가 상기 제시된 바와 같이 본 발명의 방법의 상기 국면에서 사용될 수 있다.
추가 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성의 결정 방법에 관한 것이다:
a)
유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 동안 배양하는 단계;
b)
단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
c)
단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및
d) 신경독소 폴리펩티드의 상기 생물학적 활성을 상기 세포에서 결정하는 단계.
SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포가 상기 본 발명의 방법의 타 국면에서 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정에 대안적으로 이용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런, SiMa 세포, SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포의 단일한 회분들이 신경독소 폴리펩티드에 대해 증가된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런, SiMa 세포, SH-SY5Y 세포, PC12 세포, 또는 NG108-15 세포 생성을 위한 본 발명의 방법, 또는 본 발명의 언급된 세포의 감수성 증가를 위한 본 발명의 방법에 이용된다. SiMa 세포가 부모 SiMa 세포인 것이 바람직하다 (DSMZ no. ACC164). 바람직하게는, GT1b 의 농도는 10 내지 50 μM, 더욱 바람직하게는 30 μM 이다. 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런, SiMa 세포, SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포의 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서의 배양은 바람직하게는 12 시간 이상, 24 시간 이상, 36 시간 이상, 48 시간 이상, 60 시간 이상, 72 시간 이상, 96 시간 이상, 또는 그 이상 동안이다. 신경독소 폴리펩티드를 이용한 중독화는 바람직하게는 36 시간 이상, 48 시간 이상, 60 시간 이상, 72 시간 이상, 96 시간 이상 또는 그 이상 실시된다. 바람직하게는, 신경독소 폴리펩티드가 BoNT/A 이다. GT1b-처리된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런에 비해 2-배 이상, 3-배 이상, 4-배 이상, 5-배 이상, 6-배 이상, 또는 6.7-배 이상이다. 나아가, GT1b-처리된 SiMa 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 SiM 에 비해 2-배 이상, 3-배 이상, 4-배 이상, 5-배 이상, 6-배 이상, 7-배 이상, 8-배 이상, 9-배, 또는 10-배 이상이다. GT1b-처리된 SH-SY5Y 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 SY5Y 세포에 비해 1.2-배 이상, 1.4-배 이상, 1.6-배 이상, 1.8-배, 또는 2-배 이상이다. GT1b-처리된 PC12 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 PC12 세포에 비해 1.1-배 이상, 1.2-배 이상, 1.3-배, 또는 1.4-배 이상이다. 더욱이, GT1b-처리된 NG108-15 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 NG108-15 세포에 비해 1.1-배 이상, 1.2-배 이상, 1.3-배 이상, 1.4-배 이상, 1.5-배, 또는 1.6-배 이상이다.
본 발명의 방법은 분석할 신경독소 함유 시료의 높은 수준의 희석을 허용한다. 나아가, 본 발명의 방법은, 분석될 시료 중의 부형제 및 불순물에 대해 강건하여, 상기 시료의 높은 수준의 희석을 허용한다. 그렇게 높은 수준의 시료 희석은 상기 잠재적 교란 물질을 가능한 낮은 농도로 적용하기 위해 시료 중 부형제 및 불순물과 관련하여 중요하다.
본원에 사용된 "유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런(들)" 은 신경독소 폴리펩티드에 대한 생물학적 특성, 즉 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도좀 막을 통과하는 세포질로의 위치변경 및/또는 (d) 시냅스 액포막 융합에 관여되는 단백질의 단백질내가수분해 절단을 나타내는 신경독소 폴리펩티드에 취약한, 광범위한 의미의 세포를 의미한다. 따라서, 본원에서 언급되는 "유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런" 은 신경독소 중독화에 취약하다. 더욱 구체적으로, 본원에 언급되는 "신경독소 중독화에 취약함" 은 전반적인 세포 메커니즘 하에 있을 수 있어서, 신경독소 폴리펩티드 (예를 들어, BoNT/A) 가 신경독소 기질 (예를 들어, BoNT/A 기질 SNAP-25) 을 절단하고, 신경독소의 상응하는 수용체에 대한 결합 (예를 들어, BoNT/A 의 BoNT/A 수용체에 대한 결합), 신경독소/수용체 복합체의 내재화, 세포내 액포 유래의 신경독소 경쇄의 세포질로의 위치변경 및 신경독소 기질의 단백질가수분해 절단을 포함함을 의미한다. 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 검정법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원의 다른 곳에도 기재되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Pellett 등, Withemarsh 등, 인용한 텍스트에서). 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 신경독소-감수성 세포는 바람직하게는 가장 먼저 신경독소를 흡수할 수 있고, 이어서 상기 열거한 전반적인 메커니즘 하에 있게 된다. 본원에 사용된 신경독소-감수성 세포는 예를 들어 약 100 나노몰 (nM), 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 피코몰 (pM), 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 9 pM, 약 8 pM, 약 7 pM, 약 6 pM, 약 5 pM, 약 4 pM, 약 3 pM, 약 2 pM, 약 1 pM, 약 0.5 pM, 약 0.1 pM, 약 50 fM, 약 40 fM, 약 30 fM, 약 20 fM, 약 10 fM, 약 5 fM, 약 4 fM, 약 3 fM, 약 2 fM, 또는 약 1 fM, 또는 상기 표기된 것 미만의 신경독소 폴리펩티드를 흡수할 수 있다. 100 pM 를 초과하는 EC50 값이 문헌에 보고된 바 있다. 정의에 의하면, 신경독소 중독에 취약한 세포는 하나 이상의 신경독소 수용체 및 하나 이상의 신경독소 기질을 발현하거나 또는 발현하도록 조작되어야 한다. 신경독소에 대한 수용체 및 기질은 당업계에서 기재되어 있다. 따라서, 상기 세포는 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 생물학적 활성 또는 성숙형 신경독소 폴리펩티드에 취약하다. 바람직하게는, 본원에 사용된 신경독소-감수성 세포는 예를 들어 약 1 nM 이하, 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 90 pM 이하, 약 80 pM 이하, 약 70 pM 이하, 약 60 pM 이하, 약 50 pM 이하, 약 40 pM 이하, 약 30 pM 이하, 약 20 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 9 pM 이하, 약 8 pM 이하, 약 7 pM 이하, 약 6 pM 이하, 약 5 pM 이하, 약 4 pM 이하, 약 3 pM 이하, 약 2 pM 이하, 약 1 pM 이하, 약 0.9 pM 이하, 약 0.8 pM 이하, 약 0.7 pM 이하, 약 0.6 pM 이하, 약 0.5 pM 이하, 약 0.4 pM 이하, 약 0.3 pM 이하, 약 0.2 pM 이하, 약 0.1 pM, 약 50 fM 이하, 약 40 fM 이하, 약 30 fM 이하, 약 20 fM 이하, 약 10 fM 이하, 약 5 fM 이하, 약 4 fM 이하, 약 3 fM 이하, 약 2 fM 이하, 또는 심지어 약 1 fM 이하의 신경독소 폴리펩티드에 의한 신경독소 중독화에 취약하다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 GT1b 가 외부에서 세포 배양 배지로 첨가된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런에 대해 약 3fM 의 극히 낮은 EC50 값이 본 발명의 발명자들에 의해 발견되었다. 당업계에 공지된 바와 같이, "절반 최대 유효 농도 (EC50)" 는 기준선 및 약간의 특정 노출 시간 후의 최대값 사이의 절반에서 응답을 유도하는 약물, 항체 또는 독소의 농도를 지칭한다. 이는 보통 약물의 강도 측정으로 이용된다. 따라서, 등급을 나눈 투여량 응답 곡선의 EC50 는 그의 최대 유효성이 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 계수적 투여량 응답 곡선의 EC50 는 노출 기간 후 모집단의 50% 가 응답을 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다. 신경독소 중독에 취약하고/하거나 신경독소 흡수 용량을 가진 세포 또는 세포주, 즉 본원에 정의된 신경독소-감수성 세포의 식별 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다; 참고문헌은, 예를 들어 US 2012/0122128 A1. 한 국면에서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성은 전부 상기 언급된 생물학적 특징으로부터 초래된 것이다. 본원의 다른 부분에 나타난 바와 같이, 신경독소의 생물학적 활성의 결정에 이용될 수 있는 신경독소에 대한 충분한 높은 감수성을 가진 몇가지 세포-기반 검정법만이 이제까지의 선행기술에 기재되었다. 신경독소의 생물학적 활성을 평가하기 위한 생체내 검정법은 예를 들어, 이미 언급된 마우스 LD50 검정법 및 Pearce 등 및 Dressier 등이 기재한 바와 같은 생체외 마우스 편측횡격막 검정법을 포함한다; 참고문헌은, Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77 and Dressier 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619. 당업자에게 공지된 바와 같이, 신경독소의 생물학적 활성은 보통 마우스 LD50 단위 (Mouse LD50 Units (MU)) 로 나타내어진다. 1 MU 은, 복막내 주사 후 특정 마우스 모집단의 50% 를 살상하는 양의 신경독소 구성성분이다.
더욱 구체적으로, 본원에 사용된 "유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런" 은 예를 들어 Whitemarsh 등의 인용한 텍스트; WO 2012/135621; US 2010/0279403 및 US 2010/0216181 의 문헌에 기재되어 있다. 특히, 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 는 시험관내 독성 시험을 위한 다양한 분화 세포 모델을 제공할 큰 유망성을 갖고 있다. hiPSC-유도성 뉴런은 예를 들어 Cellular Dynamics International (Madison, WI) 사에 의해 분화 및 저온보존되어, 주로 감마 아미노이소부티르산성 및 글루탐산성 뉴런의 순수한 전체신경 집단으로 이루어진다. 상기 hiPSC-유도성 뉴런은 iCell® 뉴런으로 공지되어 있다. 웨스턴 블랏 및 정량 PCR 데이터는 그러한 뉴런이 전부 제조사에 의해 BoNT 중독에 대한 필요한 수용체 및 기질을 발현함을 나타냈다. BoNT/A 중독 연구는 hiPSC-유도성 뉴런이 생물학적 활성 BoNT/A 을 높은 감수성으로 재현성있게 정량적으로 검출함을 입증했다. 추가적으로, BoNT 항원형 B, C, E, 및 BoNT/A 복합체의 정량적 검출이 입증되었으며, BoNT/A 특이성은 항체 보호 연구를 통해 확인되었다. 초대 래트 척수 세포 및 hiPSC-유도성 뉴런을 이용한 BoNT 검출의 직접 비교는 동등하거나 또는 증가된 감수성, 가파른 투여량-응답 곡선 및 더욱 완전한 hiPSC-유도성 뉴런에 대한 더욱 완전한 SNARE 단백질 표적 절단을 보여줬다; 참고문헌은 Whitemarsh 등의 인용된 텍스트. 그러한 데이터는 hiPSC 로부터 유도된 뉴런이 BoNT 강도 결정, 항체 검출 중립화 및 메커니즘 연구를 위한 이상적이며 매우 감수성인 플랫폼을 제공함을 제안한다. 본 발명의 방법의 한 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런은 포유류의 (예컨대, 설치류, 사이노몰구스, 마카크 또는 침팬지) 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런, 바람직하게는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런이다. 바람직하게는, 상기 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런은 iCell® 뉴런 (Cellular Dynamics International, Inc. (CDI) 사 제조) 이다. 제조사에 따르면, iCell® 뉴런은 인간 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 유도되며, 전임상용 약물 발견, 신경독성 시험 및 질환 연구를 위한 독특한 시험관내 시스템을 제공한다. 나아가, iCell® 뉴런은 성숙형 뉴런의 전형적 표현형 특징 및 기능을 보유하는 고품질의 매우 순수한 인간 신경 세포를 제공한다. 역사적으로, 시험관내 모델은 조기 단계 질환 모델링 및 후보자 식별 뿐 아니라 약동학적 및 안전성 시험 동안의 이용을 포함해 약물 발견 프로세스에서의 중요한 역할을 한다. 인간 뇌의 복잡성 때문에, 과학자들은 현재 설치류 조직으로부터 단리된 초대 세포 및 형질전환된 세포주와 같은 단순화된 모델을 이용한다. 생물학적 관련성, 재현성 및 확장성의 문제제기가 야기될 수 있으며, 졸렬한 모델에 의존하면 신경독소 분야에서의 후반기 임상 시험 또는 시판 도입시까지 약물-유도성 신경독성이 관찰되지 않을 수도 있다. iCell® 뉴런은 전임상 신경독소 안전성 시험에 대한 강건하며, 특징분석이 잘 되어 있는 고도의 재현가능한 시험관내 모델을 제공하여 그러한 한계를 극복한다. iCell® 뉴런은 인간 iPS 세포로부터 끝까지 분화되며, 신경의 특징 및 기능을 나타낸다. iCell® 뉴런은 매우 순수하여, 생물학적 관련성 및 재현가능한 결과를 제공한다. iCell® 뉴런은 배양에서 수 주 동안 살아있고 순수하게 남아있어서, 급성 및 아만성 응답의 평가를 가능케 한다. 나아가, iCell® 뉴런은 최적의 세포 성능을 위해 특이적으로 제형화된 세포 배양 배지와 함께 저온보존되어 수송된다. 이들은 제조사의 매뉴얼에 따른 해동 및 이용이 단순한다. 그러나, 상이한 회분의 iCell® 뉴런의 상이한 회분들이 본 발명의 발명자에 의해 신경독소 폴리펩티드에 대한 상기 회분들의 감수성에 대해서는 완전히 상이한 것으로 나타났다. 그 결과, 신경독소의 생물학적 활성의 측정된 값들에서의 강력한 일탈이 상이한 회분들에서 수득되었다. 상이한 회분들의 iPS-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성을 줄이기 위해, GT1b 의 세포 배양 배지에 대한 외부에서의 첨가가 유리하게는 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 대표 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 표시하지 않는 한 단수 및 복수 언급을 모두 포함한다. 예시로서, "세포" 는 하나의 세포 또는 그보다 더 많은 세포도 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 언급되는 항목, 수, 백분율 또는 용어의 값들의 정량시 용어 "약" 은 언급되는 항목, 수, 백분율 또는 용어의 값들의 ±10 퍼센트, 9 퍼센트, 8 퍼센트, 7 퍼센트, 6 퍼센트, 5 퍼센트, 4 퍼센트, 3 퍼센트, 2 퍼센트 또는 1 퍼센트의 범위를 지칭한다. ±10 퍼센트의 범위가 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "함유함", "함유하다" 및 "를 함유하여 이루어진" 은 "포함함", "포함하다" 와 동의어이며, 한계값을 포함하고 있거나 또는 양끝값에 개방적이며, 추가적인 언급되지 않은 구성원, 구성요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 분명하게, 용어 "함유함" 은 용어 "로 이루어짐" 을 포함한다. 더욱 구체적으로, 본원에 사용된 용어 "함유하다" 는 청구한 사항이 모든 열거된 구성요소 및 방법 단계를 전부 포함하지만, 또한 추가적인, 언급되지 않은 구성요소 또는 방법 단계를 포함할 수도 있음을 의미한다. 예를 들어, 단계 a), b) 및 c) 를 포함하는 방법은 그의 가장 좁은 의미에서는 단계 a), b) 및 c) 로 이루어진 방법을 포함한다. 어구 "로 이루어진" 은 해당 조성물 (또는 기기 또는 방법) 에는 언급한 구성요소 (또는 단계들) 가 있으며, 그 이상은 없음을 의미한다. 대조적으로, "포함하다" 는 예를 들어 단계 d) 및 e) 의 추가적인 단계를, 단계 a), b) 및 c) 에 추가하여 포함하는 방법도 포함할 수 있다.
"10 내지 50μM 의 농도의 GT1b" 와 같이 숫자 범위가 본원에 사용된 경우, 그 범위는 10 내지 50 μM 의 임의의 수치 값, 예를 들어 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM 및 45 μ의 MGT1b 도 포함한다.
본원에 사용된 용어 "시험관내" 는 동물 또는 신체의 외부 또는 바깥을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "시험관내" 는 "생체외" 를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "생체외" 는 일반적으로 동물 또는 인체로부터 제거되어, 신체 외부 예를 들어 배양 용기에 유지 또는 번식된 조직 또는 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "생체내" 는 동물 또는 인체 내부 또는 안쪽을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "분화", "분화함" 또는 "분화된" 은 미분화 또는 상대적으로 덜 분화된 세포가 상대적으로 더욱 분화되는 프로세스를 지칭한다. 세포 개체발생의 맥락에서, 형용사형 "분화된" 은 상대적인 용어이다. 따라서, "분화된 세포" 는 그것과 비교되는 세포에 비해 특정 발생 경로로 더욱 진행이 된 세포이다. 분화된 세포는 예를 들어 최종까지 분화된 세포, 즉 유기체의 다양한 조직 및 장기에서의 특화된 기능을 습득한 완전히 특화된 세포일 수 있으며, 유사분열 후의 일이 아닐 수 있다. 예를 들어, iCell® 뉴런은 인간 iPS 세포로부터 끝까지 분화되어, 신경 특징 및 기능을 나타낸다. 또다른 예시에서, 분화된 세포는 또한 분화 계대 내의 간세포일 수도 있어서, 추가로 더 증식 및/또는 분화할 수 있다. 유사하게, 비교되는 해당 세포보다 특정 발생 경로를 따라 더 진행되는 경우, 그 세포는 "상대적으로 더욱 특화" 되어 존재하는데, 여기서 상기 비교되는 해당 세포는 이에 따라 "특화되지 않음" 또는 "상대적으로 덜 특화됨" 으로 간주된다. 상대적으로 더 많이 특화된 세포는, 예를 들어 특별한 세포 구성성분 또는 생성물, 예를 들어 RNA, 단백질, 특별한 세포 마커 또는 여타 물질, 특정 생화학적 경로의 활성, 형태적 외관, 증식 용량 및/또는 동역학, 분화 잠재성 및/또는 분화 신호에 대한 응답성 등의 존재, 부재 또는 발현 수준과 같은 하나 이상의 입증가능한 표현형 특징에 있어서 특화되지 않거나 또는 상대적으로 덜 특화된 세포와는 상이할 수 있으며, 여기서 상기 특징들은 상기 발생 경로를 따라 상대적으로 더 많이 특화된 세포의 진행을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "신경독소 폴리펩티드" 는 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 및 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani) 신경독소 (클로스트리듐성 신경독소), 즉 보툴리눔 독소 (BoNTs) 및 테타누스 독소 (TeNT) 를 지칭한다. 최근, 신규한 보툴리눔 독소 유형, 즉 BoNT/H 이 동정되었다; 참고문헌은, Barash 및 Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 183191. 더욱 구체적으로, 상기 용어는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 및 테타누스 신경독소 (TeNT), 또는 그의 아형을 포함한다. 예를 들어, BoNT/A 의 아형은 BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5 을 포함한다. BoNT/B아형은, 예를 들어, BoNT/Bl, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/B6 및 BoNT/B7 을 포함한다. BoNT/C 아형은 예를 들어 BoNT/Cl-1 및 BoNT/Cl-2 을 포함한다. 또한 BoNT/D-C 아형도 포함한다. BoNT/E 아형은 예를 들어, BoNT/El, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/E6, BoNT/E7 및 BoNT/E8 을 포함한다. 나아가, BoNT/F 아형은, 예를 들어, BoNT/Fl, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, BoNT/F6 및 BoNT/F7 을 포함한다. 신경독소 폴리펩티드 및, 특별하게는 그의 경쇄 및 중쇄가 상기 언급된 보툴리눔 신경독소의 항원적으로 상이한 항원형 중 하나로부터 유도가능하다. 한 국면에서, 신경독소 폴리펩티드의 상기 경쇄 및 중쇄는 이하의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경독소의 경쇄 및 중쇄이다: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT. 또다른 국면에서, 상기 신경독소 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) 또는 SEQ ID NO: 15 (TeNT) 에서 제시되는 핵산 서열을 포함한다. 나아가, 한 국면에서 SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) 또는 SEQ ID NO: 16 (TeNT) 의 임의의 것에서 제시되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 추가로, 하기의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함거나 또는 그것으로 이루어진 신경독소 폴리펩티드가 본 발명의 수단 및 방법의 한 국면에 포함된다: SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) 및 SEQ ID NO: 16 (TeNT). BoNT/H 의 해당하는 서열은 문헌 [Dover 등, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 192-202] 에 제시되어 있다. 상기 BoNT/H 서열은 또한 본 발명의 수단 및 방법의 특정 국면에 포함되어 있다.
또다른 국면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 또다른 구현예에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 가진 폴리펩티드를 제공할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하는 상기 언급된 폴리뉴클레오티드의 변이체이다. 나아가, 변이체 폴리뉴클레오티드는 또다른 국면에서 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 제시된 (바람직하게는 완전한) 핵산 서열 또는 BoNT/H 의 핵산에 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열 변이체, 또는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 임의의 하나에 제시된 (바람직하게는 완전한) 아미노산 서열 또는 BoNT/H 의 아미노산 서열에 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "동일한" 은 두 핵산 서열 또는 두 아미노산 서열 사이에서 동일한 아미노산의 갯수를 결정하는 것을 특징으로 하는 서열 동일성을 지칭하며, 여기서 서열들은 최고 수준의 맷치가 수득되도록 정렬된다. 이는 예를 들어 BLASTP, BLASTN 또는 FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403) 와 같은 컴퓨터 프로그램에서 코드화된 공개된 기법 또는 방법을 이용해 산출될 수 있다. 한 국면에서, 백분율 동일성은 전체 아미노산 서열 상에서 산출된다. 다양한 알고리즘을 기반으로 한 일련의 프로그램은 상이한 서열을 비교하고자 하는 숙련가가 이용가능하다. 그러한 맥락에서, Needleman 및 Wunsch 의 알고리즘 또는 Smith 및 Waterman 의 알고리즘이 특히 신뢰할 만한 결과를 제공한다. 서열 정렬 수행을 위해, GCG 소프트웨어 팩킷 (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) 의 일부분인 프로그램 PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) 또는 프로그램 Gap and BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482) 을 이용할 수 있다. 백분율 (%) 로 상기에서 언급한 서열 동일성 값은 본 발명의 또다른 국면에서는 다음과 같은 설정으로 전체 서열 상에서 결정되었다: Gap Weight: 50, Length Weight: Average Match: 10.000 및 Average Mismatch: 0.000, 이는 달리 언급되지 않으면, 서열 정렬을 위한 표준 설정으로서 항상 이용. 본원에 언급된 클로스트리듐성 신경독소의 변이체는, 예를 들어, 이에 제한됨 없이 예를 들어 무작위적 돌연변이유발 또는 합리적인 디자인을 이용한 유전자 조작 또는 재조합 방법으로 생산되는 클로스트리듐성 신경독소, 내부- 또는 외부단백질가수분해 효소와 같은 효소의 활성에 의해 변경되는 클로스트리듐성 신경독소의 효소 변경 변이체, 또는 화학 합성에 의해 제공되는 클로스트리듐성 신경독소를 포함하는, 인간의 조작에 힘입어 제조되는 클로스트리듐성 신경독소를 포함한다. "유전자 조작" 은 DNA 또는 mRNA 와 같은 각 핵산 또는 클로스트리듐성 신경독소를 인코딩하는 유전자 변경을 수단으로 임의의 혈청형/아형의 본연의 클로스트리듐성 신경독소를 변경하는 당업계 공지된 방법을 지칭한다. 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자적 조작을 위한 재조합 방법은 당업계에 널리 기재되어 있다; 참고문헌은, 예를 들어 Sambrook, J. & Russell, D. (2001). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. 본원에 사용되는 신경독소 폴리펩티드 변이체는 화학적으로 개질된 신경독소 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "화학적 개질" 은 일반적으로 화학 반응 등을 수단으로 임의의 혈청형 또는 아형의 본연의 또는 재조합 클로스트리듐성 신경독소를 개질하기 위한 당업계에 공지된 방법을 지칭하며; 특별하게는 클로스트리듐성 신경독소의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 번역후 개질을 지칭한다. 화학적으로 개질된 신경독소 폴리펩티드는 예를 들어 약 2 개 내지 약 500 개의 아미노산을 포함하는 아미노산 또는 폴리펩티드의 피루베이트화, 인산화, 설페이트화, 지질첨가, peg 화, 글리코실화 및/또는 화학적 부가에 의해 개질된 것일 수 있다. 예를 들어, 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물의 신경독소 폴리펩티드로의 혼입에 의해, 클로스트리듐성 신경독소 또는 화학적 개질 또는 유전자 조작에 의해 클로스트리듐성 독소로부터 유도된 독소가 안정화될 수 있다. 한 국면에서, 각각의 상기 언급된 변이체 폴리뉴클레오티드는 각 신경독소 폴리펩티드, 즉 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/Hor 테타누스 신경독소 (TeNT) 의 생물학적 특성 중 하나 이상 및 또다른 국면에서는 그의 전부를 보유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 당업자는 모든 생물학적 활성이 단백질가수분해 활성화 후에만 유지된다는 것을 알 것이며, 가공되지 않은 전구체는 일부의 생물학적 기능만 발휘할 수 있거나 또는 부분적으로만 활성임을 상상할 수 있다. 본원에 사용된 "생물학적 특성" 은 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도좀 막을 가로지르는 세포질로의 위치변경, 및/또는 (d) 시냅스 액포막 융합에 관여되는 단백질의 단백질내가수분해 절단을 지칭한다. 더욱 구체적으로, 신경독소 (예를 들어, BoNT/A) 가 신경독소 기질 (예를 들어, SNAP-25) 을 절단하는 전반적인 세포 메커니즘은, 신경독소의 상응하는 수용체로의 결합 (예를 들어, BoNT/A 의 BoNT/A 수용체로의 결합), 신경독소/수용체 복합체의 내재화, 세포내 액포 유래의 신경독소 경쇄의 세포질로의 위치변동 및 신경독소 기질의 단백질가수분해성 절단을 포함한다. 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정을 위한 시험관내 및 생체내 검정은 당업계에 널리 공지되어 있다. 생물학적 활성 평가를 위한 생체내 검정은, Pearce 등의 문헌 (Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) 및 Dressler 등의 문헌 (Dressler 2005, Mov Disord 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637) 에 기재된 바와 같은 마우스 LD50 검정 및 생체외 마우스 편측횡격막 검정을 포함한다. 생물학적 활성은 보통 마우스 유닛 (Mouse Units) (MU) 으로 표현된다. 본원에 사용된 바와 같이, 1 MU 은 복강내 주사 후 특정 마우스 모집단의 50% 를 살상하는, 즉 마우스 i.p. LD50 의 신경독소 구성성분의 양을 지칭한다. 추가 국면에서, 변이체 폴리뉴클레오티드는 개선되거나 또는 변경된 생물학적 특성을 가진 신경독소를 인코딩할 수 있는데, 예를 들어 그들은 효소 인식에 있어 개선되거나 또는 수용체 결합, 또는 상기 언급된 임의의 여타 특성에 있어 개선된 절단 부위를 포함할 수 있다. 일부 국면에서, 신경독소 폴리펩티드가 시료 중에 포함되어 있을 수 있다. 시료는 예를 들어 임상 시료, 생물학적 시료, 식품 시료, 약제학적 또는 독성학적 시료, 항체 시료 등일 수 있다.
따라서, 본원에 사용된 용어 "신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정" 은 신경독소 단백질의 생물학적 활성, 즉 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도좀 막을 가로지르는 세포질로의 위치변경, 및/또는 (d) 시냅스 액포막 융합에 관여되는 단백질의 단백질내가수분해 절단의 측정을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "양" 은 예를 들어 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 절대량, 상기 폴리펩티드의 상대적 양 또는 농도 뿐만 아니라 그들에 상관되거나 또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 값 또는 파라미터를 포함한다.
예를 들어 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의, 용어 "양을 결정" 함은 정량적 또는 반정량적 방식으로, 예를 들어 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 절대량, 상대량 또는 농도 측정에 관한 것이다. 적합한 검출 측정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 양의 결정이, 한 국면에서, 표준 용액을 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 예비규정된 양 적용에 의한 방법의 보정을 필요로 한다는 것도 이해될 것이다. 그러한 보정을 실시하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 방법의 한 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런가 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 배양된다. 갱글리오사이드 GT1b 는 신경독소 폴리펩티드에 결합하며, 잠재적으로는 뉴런의 신경독소의 선별성을 중재한다. 따라서, GT1b 는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성 표준화에 이용될 수 있다. 본 발명에 의하면 GT1b 의 iPS-유도성 뉴런에 대한 외부에서의 첨가가 상기 iPS-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성을, GT1b 부재 하에 처리된 대조군 회분의 iPS-유도성 뉴런에 비해 급작스럽게 감소시키는 것으로 나타났다. 바람직하게는, 상기 GT1b 는 약 10 내지 약 50 μM 의 농도, 즉 약 10 μM, 약 15 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 35 μM, 약 40 μM, 약 45 μM, 또는 약 50 μM 의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 30 μM 의 농도로 존재한다.
추가 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 방법에 관한 것이다:
a)
유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계;
b)
단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
c)
단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 의 존재 하에 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
d)
상기 세포에서의 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 결정하는 단계.
본 발명의 상기 방법의 한가지 특별한 국면에서, 본원의 다른 부분에서 정의된 바와 같은 상이한 회분의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런이 사용된다.
본 발명의 방법의 한 국면에서, (유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한) "감수성의 표준화" 는 동일 조건 하에 GT1b 부재 하에 처리된 대조군 회분의 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런과 비교한, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성에서의 감소이다.
또다른 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성에서의 감소는, 동일 조건 하에 GT1b 의 부재 하에 처리되는 대조군 회분의 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런에 비해 1.1-배 이상, 1.2-배 이상, 1.3-배 이상, 1.4-배 이상, 1.5-배 이상, 1.6-배 이상, 1.7-배 이상, 1.8-배 이상, 1.9-배 이상, 2-배 이상, 2.1-배 이상, 2.2-배 이상, 2.3-배 이상, 2.4-배 이상, 2.5-배 이상, 또는 심지어 3-배 이상 감소이다.
본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런은 인간의 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런이다. 바람직하게는, 상기 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런은 iCell® 뉴런 (Cellular Dynamics International; 인용된 텍스트) 이다.
본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들은 계대배양 횟수, 냉동/해동 순환 횐수, 배양 조건, 저장 시간, 성장 시간, 분화 농도 또는 이들의 조합에 있어서 상이다.
본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 세포 배양 배지는 Neurobasal 배지, B27 보충물 (2%), 및 글루타민 또는 글루타맥스 (1%) 를 함유한다. 임의로는, 세포 배양 배지가 항생제 (1%), N2 보충물 (1%) 및/또는 혈청 알부민 (0.2%) 을 함유할 수 있다.
본 발명의 방법의 또다른 국면에서, GT1b 는 1 내지 300 μM, 바람직하게는 30 μM 의 농도로 첨가된다.
본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 신경독소 폴리펩티드는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/G, BoNT/F, BoNT/H 또는 TeNT, 그의 아형이다.
본 발명의 또다른 국면에서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성은 면역-웨스턴 블랏 분석 (Immuno-Western blot analysis), SDS-PAGE 면역블랏 분석 또는 ELISA (참고문헌은, 예를 들어 Pellet 등 (2010), J. Pharmacol. Toxicol. Methods 61, 304-310) 에 의한 신경독소-절단 기질의 정량으로 결정된다.
추가 국면에서, 본 발명은 하기의 것을 위한 GT1b 의 용도에 관한 것이다:
a)
유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성 표준화; 또는
b)
유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소.
본 발명의 방법 및 용도의 특별한 국면은 하기 실시예에 제시된다.
도면은 다음과 같다:
도 1: SiMa 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 SiMa 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 SiMa 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 10-배의 증가를 유도했다.
도 2: SH-SY5Y 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 SH-SY5Y 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 SH-SY5Y 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.4-배의 증가를 유도했다.
도 3: PC12 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 PC12 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 PC12 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.4-배의 증가를 유도했다.
도 4: Neuro2A-세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 Neuro2A-세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 Neuro2A-세포를 나타낸다. 주어진 신경독소 농도에서, 완전한 투여량 응답 곡선이 관찰되지도 않았고, GT1b 를 이용해도 감수성 증가가 없었다.
도 5: NG108-15-세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고, 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 NG108-15-세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 NG108-15-세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.6-배의 증가를 유도했다.
본 발명은 하기의 실시예로 더욱 상세히 설명될 것이나, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1: SiMa 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 SiMa 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 SiMa 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 10-배의 증가를 유도했다.
도 2: SH-SY5Y 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 SH-SY5Y 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 SH-SY5Y 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.4-배의 증가를 유도했다.
도 3: PC12 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 PC12 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 PC12 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.4-배의 증가를 유도했다.
도 4: Neuro2A-세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 Neuro2A-세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 Neuro2A-세포를 나타낸다. 주어진 신경독소 농도에서, 완전한 투여량 응답 곡선이 관찰되지도 않았고, GT1b 를 이용해도 감수성 증가가 없었다.
도 5: NG108-15-세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고, 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 NG108-15-세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 NG108-15-세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.6-배의 증가를 유도했다.
본 발명은 하기의 실시예로 더욱 상세히 설명될 것이나, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
:
실시예 1:
Cellular Dynamics International (CDI) 사용자 매뉴얼에 따라 iCell® 뉴런을 해동시키고, 4 개의 상이한 세포 회분들로부터 96 웰 플레이트 상에 플레이팅했다. 플레이팅 24 시간 후, 배지를 사용자 매뉴얼에 기재되어 있는 신선한 유지 배지로 또는 30 μM GT1b 이 보충된 동일 배지로 교체했다.
72 시간의 인큐베이션 시간 후, 배지를 제거하고, 농도를 다양하게 한 BoNT/A 를 함유하는 신선한 배지로 교체했다. 세포가 GT1b 함유 배지 상에서 성장한 경우, 신선한 배지도 역시 30 μM GT1b 를 포함했다.
중독화 개시 72 시간 후, 배지를 흡출시키고, 25㎕ SDS 시료 완충액 첨가로 세포를 용균시켰다.
절단 SNAP-25 의 백분율을 문헌 [Pellett 등, 2010 (인용한 텍스트에서)] 에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 면역블랏 분석으로 결정했다.
EC50 (SNAP-25 의 최대 절단의 절반을 제공하는 BoNT/A 의 농도) 는 백분율 절단 SNAP-25 을 BoNT/A 농도에 대해 그래프를 그려 산출했다.
결과로서 수득한, GT1b 의 존재 또는 부재 하의 상이한 세포 회분들의 EC50 값을 표 1 에 제시한다.
표 1:
EC50 를 약 5.0 에서 약 0.75 U/mL 로 감소시킨 GT1b 의 첨가 결과로 인한 더 높은 감수성에도 불구하고, 회분들의 EC50 값의 상대적인 표준 편차는 약 30% 에서 약 15% 로 감소했다.
실시예 2:
SiMa 세포의 배양 및 분화 (도 1 참조): SiMa-세포를 포함하고 있는 바이알을 해동시키고, 배양 배지 (90% RPMI 1640 + 10% h.i. FBS + 2 mM L-글루타민 +/- 30 μM GT1b) 중에 최종 밀도 30,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트 상에 3,000 세포/웰로 시딩하고, 72 시간 동안 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O2/5% CO2 중에 인큐베이션했다. 72 시간 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10-9 내지 5.65*10-15 M 의 농도 범위로 함유하는 무혈청 배지 (MEM + 2% B27 + 1% N2 + 2% 불필수 아미노산 + 2 mM L-글루타민 +/- 30 μM GT1b) 로 교환했다. 상기 표기된 바와 같이 72 시간 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜, 문헌 [Whitemarsh 등, (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생성된 항체 (Synaptic Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.
SH-SY5Y 세포의 배양 및 분화 (도 2 참조): SH-SY5Y-세포를 포함하는 바이알을 해동시키기고, 배양 배지 (85% MEM:F12 + 15% h.i. FBS +/-30 μM GT1b) 에 최종 밀도 60,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 코팅되지 않은 96-웰 미세역가 플레이트에 6,000 세포/웰로 시딩하고, 24 시간 동안 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O2/ 5% CO2 에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 배지에 신경 성장 인자 (Nerve Growth factor) (100 ng/ml) 및 아피디콜린 (Aphidicoline) (0.3 mM) +/- 30 μM GT1b 을 보충했다. 배지를 2 내지 3 일 마다 교환했다. 인큐베이션 17 일 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10-9 내지 5.65*10-15 M 의 농도 범위로 포함하는 신선한 배지로 교환했다. 상기 표시된 바와 같은 인큐베이션 72 시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20 mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜, 문헌 [Whitemarsh 등, (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생산된 항체 (Synaptic Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.
PC12 세포 의 배양 및 분화 (도 3 참조): PC12 세포를 포함하는 바이알을 해동시키고, 배양 배지 (85% RPMI 1640 + 10% 말 혈청 + 5% h.i. FBS +/- 30 μM GT1b) 에 최종 밀도 25,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 콜라겐 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트에 2,500 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O2/ 5% CO2 에서 72 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 배지에 신경 성장 인자 (100 ng/ml) +/- 30 μM GT1b 을 보충했다. 상기 배지를 매 2 내지 3 일마다 교환했다. 인큐베이션 11 일 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10-9 내지 5.65*10-15 M 범위의 농도로 포함하는 신선한 배지로 교환했다. 상기 제시된 바와 같이 인큐베이션 72 시간 후, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,55% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜, 문헌 [Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생성된 항체 (SYNAPTIC Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.
Neuro2A 세포의 배양 및 분화 (도 4 참조): Neuro2A 세포를 포함하는 바이알을 해동하고, 배양 배지 (90% DMEM + 10% h.i. FBS +/- 30 μM GT1b) 에 최종 밀도 20,000 세포/ mL 로 재현탁시켰다. 세포를 96-웰 미세역가 플레이트에 2,000 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O2/ 5% CO2 에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 배지를 무혈청 DMEM +/- 30 μM GT1b 로 교환 후 3 일간 37℃ 에서 인큐베이션했다. 이어서 배지를 0.2% BSA +/- 30 μM GT1b 및 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10-9 내지 5.65*10-15 M 의 농도 범위로 포함하는 신선한 무혈청 배지로 교환했다. 상기 제시된 바와 같은 72 시간의 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜 문헌 [Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생산된 항체 (SYNAPTIC Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.
NG108-15 세포 (도 5 참조) 의 배양 및 분화: SH-SY5Y 세포를 포함하는 바이알을 해동시키고, 배양 배지 (90% DMEM + 10% h.i. FBS +/- 30 μM GT1b) 에 최종 밀도 60,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 96-웰 미세역가 플레이트에 6,000 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O2/ 5% CO2 에서 72 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 배지에 디부티릴-cAMP (1 mM) +/- 30 μM GT1b 를 보충했다. 상기 배지를 매 2 내지 3 일마다 교환했다. 5 일의 인큐베이션 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10-9 내지 5.65*10- 15M 의 범위의 농도로 포함하는 신선한 배지로 교환했다. 상기 제시된 바와 같은 인큐베이션의 72 시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0 에서) 에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용하고, 문헌 [Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생성된 항체 (Synaptic Systems SySy111111) 를 이용해 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.
SEQUENCE LISTING
<110> Merz Pharma GmbH & Co.KGaA
<120> Gangliosides for standardizing and increasing the sensitivity of cells to Botulinum neurotoxins in in vitro test systems
<130> MP11612pc
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3891
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<400> 1
atgccatttg ttaataaaca atttaattat aaagatcctg taaatggtgt tgatattgct 60
tatataaaaa ttccaaatgc aggacaaatg caaccagtaa aagcttttaa aattcataat 120
aaaatatggg ttattccaga aagagataca tttacaaatc ctgaagaagg agatttaaat 180
ccaccaccag aagcaaaaca agttccagtt tcatattatg attcaacata tttaagtaca 240
gataatgaaa aagataatta tttaaaggga gttacaaaat tatttgagag aatttattca 300
actgatcttg gaagaatgtt gttaacatca atagtaaggg gaataccatt ttggggtgga 360
agtacaatag atacagaatt aaaagttatt gatactaatt gtattaatgt gatacaacca 420
gatggtagtt atagatcaga agaacttaat ctagtaataa taggaccctc agctgatatt 480
atacagtttg aatgtaaaag ctttggacat gaagttttga atcttacgcg aaatggttat 540
ggctctactc aatacattag atttagccca gattttacat ttggttttga ggagtcactt 600
gaagttgata caaatcctct tttaggtgca ggcaaatttg ctacagatcc agcagtaaca 660
ttagcacatg aacttataca tgctggacat agattatatg gaatagcaat taatccaaat 720
agggttttta aagtaaatac taatgcctat tatgaaatga gtgggttaga agtaagcttt 780
gaggaactta gaacatttgg gggacatgat gcaaagttta tagatagttt acaggaaaac 840
gaatttcgtc tatattatta taataagttt aaagatatag caagtacact taataaagct 900
aaatcaatag taggtactac tgcttcatta cagtatatga aaaatgtttt taaagagaaa 960
tatctcctat ctgaagatac atctggaaaa ttttcggtag ataaattaaa atttgataag 1020
ttatacaaaa tgttaacaga gatttacaca gaggataatt ttgttaagtt ttttaaagta 1080
cttaacagaa aaacatattt gaattttgat aaagccgtat ttaagataaa tatagtacct 1140
aaggtaaatt acacaatata tgatggattt aatttaagaa atacaaattt agcagcaaac 1200
tttaatggtc aaaatacaga aattaataat atgaatttta ctaaactaaa aaattttact 1260
ggattgtttg aattttataa gttgctatgt gtaagaggga taataacttc taaaactaaa 1320
tcattagata aaggatacaa taaggcatta aatgatttat gtatcaaagt taataattgg 1380
gacttgtttt ttagtccttc agaagataat tttactaatg atctaaataa aggagaagaa 1440
attacatctg atactaatat agaagcagca gaagaaaata ttagtttaga tttaatacaa 1500
caatattatt taacctttaa ttttgataat gaacctgaaa atatttcaat agaaaatctt 1560
tcaagtgaca ttataggcca attagaactt atgcctaata tagaaagatt tcctaatgga 1620
aaaaagtatg agttagataa atatactatg ttccattatc ttcgtgctca agaatttgaa 1680
catggtaaat ctaggattgc tttaacaaat tctgttaacg aagcattatt aaatcctagt 1740
cgtgtttata catttttttc ttcagactat gtaaagaaag ttaataaagc tacggaggca 1800
gctatgtttt taggctgggt agaacaatta gtatatgatt ttaccgatga aactagcgaa 1860
gtaagtacta cggataaaat tgcggatata actataatta ttccatatat aggacctgct 1920
ttaaatatag gtaatatgtt atataaagat gattttgtag gtgctttaat attttcagga 1980
gctgttattc tgttagaatt tataccagag attgcaatac ctgtattagg tacttttgca 2040
cttgtatcat atattgcgaa taaggttcta accgttcaaa caatagataa tgctttaagt 2100
aaaagaaatg aaaaatggga tgaggtctat aaatatatag taacaaattg gttagcaaag 2160
gttaatacac agattgatct aataagaaaa aaaatgaaag aagctttaga aaatcaagca 2220
gaagcaacaa aggctataat aaactatcag tataatcaat atactgagga agagaaaaat 2280
aatattaatt ttaatattga tgatttaagt tcgaaactta atgagtctat aaataaagct 2340
atgattaata taaataaatt tttgaatcaa tgctctgttt catatttaat gaattctatg 2400
atcccttatg gtgttaaacg gttagaagat tttgatgcta gtcttaaaga tgcattatta 2460
aagtatatat atgataatag aggaacttta attggtcaag tagatagatt aaaagataaa 2520
gttaataata cacttagtac agatatacct tttcagcttt ccaaatacgt agataatcaa 2580
agattattat ctacatttac tgaatatatt aagaatatta ttaatacttc tatattgaat 2640
ttaagatatg aaagtaatca tttaatagac ttatctaggt atgcatcaaa aataaatatt 2700
ggtagtaaag taaattttga tccaatagat aaaaatcaaa ttcaattatt taatttagaa 2760
agtagtaaaa ttgaggtaat tttaaaaaat gctattgtat ataatagtat gtatgaaaat 2820
tttagtacta gcttttggat aagaattcct aagtatttta acagtataag tctaaataat 2880
gaatatacaa taataaattg tatggaaaat aattcaggat ggaaagtatc acttaattat 2940
ggtgaaataa tctggacttt acaggatact caggaaataa aacaaagagt agtttttaaa 3000
tacagtcaaa tgattaatat atcagattat ataaacagat ggatttttgt aactatcact 3060
aataatagat taaataactc taaaatttat ataaatggaa gattaataga tcaaaaacca 3120
atttcaaatt taggtaatat tcatgctagt aataatataa tgtttaaatt agatggttgt 3180
agagatacac atagatatat ttggataaaa tattttaatc tttttgataa ggaattaaat 3240
gaaaaagaaa tcaaagattt atatgataat caatcaaatt caggtatttt aaaagacttt 3300
tggggtgatt atttacaata tgataaacca tactatatgt taaatttata tgatccaaat 3360
aaatatgtcg atgtaaataa tgtaggtatt agaggttata tgtatcttaa agggcctaga 3420
ggtagcgtaa tgactacaaa catttattta aattcaagtt tgtatagggg gacaaaattt 3480
attataaaaa aatatgcttc tggaaataaa gataatattg ttagaaataa tgatcgtgta 3540
tatattaatg tagtagttaa aaataaagaa tataggttag ctactaatgc atcacaggca 3600
ggcgtagaaa aaatactaag tgcattagaa atacctgatg taggaaatct aagtcaagta 3660
gtagtaatga agtcaaaaaa tgatcaagga ataacaaata aatgcaaaat gaatttacaa 3720
gataataatg ggaatgatat aggctttata ggatttcatc agtttaataa tatagctaaa 3780
ctagtagcaa gtaattggta taatagacaa atagaaagat ctagtaggac tttgggttgc 3840
tcatgggaat ttattcctgt agatgatgga tggggagaaa ggccactgta a 3891
<210> 2
<211> 1296
<212> PRT
<213> Clostridium botulinum
<400> 2
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
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<212> DNA
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tttgcatcaa gggaaggctt cgggggtata atgcaaatga agttttgccc agaatatgta 600
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100 105 110
Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp
115 120 125
Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn
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Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly
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Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr
165 170 175
Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile
180 185 190
Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asn
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<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
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caaaatattt gggtaatacc agaaagattt tcatcagata ctaatccaag tttaagtaaa 180
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gagcaaaaag atacattttt aaaagggatt ataaaattat ttaaaagaat taatgaaaga 300
gatataggaa aaaaattaat aaattattta gtagttggtt caccttttat gggagattca 360
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tttgaaaatg gtagttggaa agtaacaaat attataacac caagtgtatt gatatttgga 480
ccacttccta atatattaga ctatacagca tcccttacat tgcaaggaca acaatcaaat 540
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gttgtaaata ttgataaatt caatagctta tattcagact tgactaatgt tatgtcagaa 1080
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gtatcagcca taattccata tataggacct gccttaaata taggaaattc agcattaagg 1920
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tatcaatgga tggtatcaaa ttggttgtca agaattacta ctcgatttaa tcatataagt 2160
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<213> Clostridium botulinum
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cctggacttt cagatgaaaa attaaattta actatccaaa atgatgctta tataccaaaa 1500
tatgattcta atggaacaag tgatatagaa caacatgatg ttaatgaact taatgtattt 1560
ttctatttag atgcacagaa agtgcccgaa ggtgaaaata atgtcaatct cacctcttca 1620
attgatacag cattattaga acaacctaaa atatatacat ttttttcatc agaatttatt 1680
aataatgtca ataaacctgt gcaagcagca ttatttgtaa gctggataca acaagtgtta 1740
gtagatttta ctactgaagc taaccaaaaa agtactgttg ataaaattgc agatatttct 1800
atagttgttc catatatagg tcttgcttta aatataggaa atgaagcaca aaaaggaaat 1860
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aataaagtta ttaaagcaat aaataatgca ttgaaagaaa gagatgaaaa atggaaagaa 2040
gtatatagtt ttatagtatc gaattggatg actaaaatta atacacaatt taataaaaga 2100
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tctaagtata atagttatac tttagaggaa aaaaatgagc ttacaaataa atatgatatt 2220
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ttcttaactg aaagttctat atcctattta atgaaaataa taaatgaagt aaaaattaat 2340
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<213> Clostridium botulinum
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995 1000 1005
Asn Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile
1025 1030 1035
Ser Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys
1040 1045 1050
Ile Val Gly Cys Asp Asp Glu Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe
1055 1060 1065
Lys Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu
1070 1075 1080
Tyr Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asp Tyr Trp Gly
1085 1090 1095
Asn Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu
1100 1105 1110
Arg Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Arg Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile
1115 1120 1125
Asn Gln Gln Arg Gly Val Thr Gly Gly Ile Ser Val Phe Leu Asn
1130 1135 1140
Tyr Lys Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala
1145 1150 1155
Pro Ile Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp
1160 1165 1170
Leu Ala Tyr Ile Asn Val Val Asp His Gly Val Glu Tyr Arg Leu
1175 1180 1185
Tyr Ala Asp Ile Ser Ile Thr Lys Ser Glu Lys Ile Ile Lys Leu
1190 1195 1200
Ile Arg Thr Ser Asn Pro Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val
1205 1210 1215
Met Asp Ser Ile Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn
1220 1225 1230
Asp Gly Ser Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe His Ser Asp Asp Leu
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Val Ala Ser Ser Trp Tyr Tyr Asn His Ile Arg Arg Asn Thr Ser
1250 1255 1260
Ser Asn Gly Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu His Gly Trp
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Lys Glu
1280
<210> 13
<211> 3894
<212> DNA
<213> Clostridium botulinum
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
atgccagtta atataaaaan ctttaattat aatgacccta ttaataatga tgacattatt 60
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gatcgtattt ggatagtacc agaaaggttt acttatggat ttcaacctga ccaatttaat 180
gccagtacag gagtttttag taaagatgtc tacgaatatt acgatccaac ttatttaaaa 240
accgatgctg aaaaagataa atttttaaaa acaatgatta aattatttaa tagaattaat 300
tcaaaaccat caggacagag attactggat atgatagtag atgctatacc ttatcttgga 360
aatgcatcta caccgcccga caaatttgca gcaaatgttg caaatgtatc tattaataaa 420
aaaattatcc aacctggagc tgaagatcaa ataaaaggtt taatgacaaa tttaataata 480
tttggaccag gaccagttct aagtgataat tttactgata gtatgattat gaatggccat 540
tccccaatat cagaaggatt tggtgcaaga atgatgataa gattttgtcc tagttgttta 600
aatgtattta ataatgttca ggaaaataaa gatacatcta tatttagtag acgcgcgtat 660
tttgcagatc cagctctaac gttaatgcat gaacttatac atgtgttaca tggattatat 720
ggaattaaga taagtaattt accaattact ccaaatacaa aagaattttt catgcaacat 780
agcgatcctg tacaagcaga agaactatat acattcggag gacatgatcc tagtgttata 840
agtccttcta cggatatgaa tatttataat aaagcgttac aaaattttca agatatagct 900
aataggctta atattgtttc aagtgcccaa gggagtggaa ttgatatttc cttatataaa 960
caaatatata aaaataaata tgattttgtt gaagatccta atggaaaata tagtgtagat 1020
aaggataagt ttgataaatt atataaggcc ttaatgtttg gctttactga aactaatcta 1080
gctggtgaat atggaataaa aactaggtat tcttatttta gtgaatattt gccaccgata 1140
aaaactgaaa aattgttaga caatacaatt tatactcaaa atgaaggctt taacatagct 1200
agtaaaaatc tcaaaacgga atttaatggt cagaataagg cggtaaataa agaggcttat 1260
gaagaaatca gcctagaaca tctcgttata tatagaatag caatgtgcaa gcctgtaatg 1320
tacaaaaata ccggtaaatc tgaacagtgt attattgtta ataatgagga tttatttttc 1380
atagctaata aagatagttt ttcaaaagat ttagctaaag cagaaactat agcatataat 1440
acacaaaata atactataga aaataatttt tctatagatc agttgatttt agataatgat 1500
ttaagcagtg gcatagactt accaaatgaa aacacagaac catttacaaa ttttgacgac 1560
atagatatcc ctgtgtatat taaacaatct gctttaaaaa aaatttttgt ggatggagat 1620
agcctttttg aatatttaca tgctcaaaca tttccttcta atatagaaaa tctacaacta 1680
acgaattcat taaatgatgc tttaagaaat aataataaag tctatacttt tttttctaca 1740
aaccttgttg aaaaagctaa tacagttgta ggtgcttcac tttttgtaaa ctgggtaaaa 1800
ggagtaatag atgattttac atctgaatcc acacaaaaaa gtactataga taaagtttca 1860
gatgtatcca taattattcc ctatatagga cctgctttga atgtaggaaa tgaaacagct 1920
aaagaaaatt ttaaaaatgc ttttgaaata ggtggagccg ctatcttaat ggagtttatt 1980
ccagaactta ttgtacctat agttggattt tttacattag aatcatatgt aggaaataaa 2040
gggcatatta ttatgacgat atccaatgct ttaaagaaaa gggatcaaaa atggacagat 2100
atgtatggtt tgatagtatc gcagtggctc tcaacggtta atactcaatt ttatacaata 2160
aaagaaagaa tgtacaatgc tttaaataat caatcacaag caatagaaaa aataatagaa 2220
gatcaatata atagatatag tgaagaagat aaaatgaata ttaacattga ttttaatgat 2280
atagatttta aacttaatca aagtataaat ttagcaataa acaatataga tgattttata 2340
aaccaatgtt ctatatcata tctaatgaat agaatgattc cattagctgt aaaaaagtta 2400
aaagactttg atgataatct taagagagat ttattggagt atatagatac aaatgaacta 2460
tatttacttg atgaagtaaa tattctaaaa tcaaaagtaa atagacacct aaaagacagt 2520
ataccatttg atctttcact atataccaag gacacaattt taatacaagt ttttaataat 2580
tatattagta atattagtag taatgctatt ttaagtttaa gttatagagg tgggcgttta 2640
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ataggaaatg gtcaatttaa attaaataat tctgaaaata gtaatattac ggcacatcaa 2760
agtaaattcg ttgtatatga tagtatgttt gataatttta gcattaactt ttgggtaagg 2820
actcctaaat ataataataa tgatatacaa acttatcttc aaaatgagta tacaataatt 2880
agttgtataa aaaatgactc aggatggaaa gtatctatta agggaaatag aataatatgg 2940
acattaatag atgttaatgc aaaatctaaa tcaatatttt tcgaatatag tataaaagat 3000
aatatatcag attatataaa taaatggttt tccataacta ttactaatga tagattaggt 3060
aacgcaaata tttatataaa tggaagtttg aaaaaaagtg aaaaaatttt aaacttagat 3120
agaattaatt ctagtaatga tatagacttc aaattaatta attgtacaga tactactaaa 3180
tttgtttgga ttaaggattt taatattttt ggtagagaat taaatgctac agaagtatct 3240
tcactatatt ggattcaatc atctacaaat actttaaaag atttttgggg gaatccttta 3300
agatacgata cacaatacta tctgtttaat caaggtatgc aaaatatcta tataaagtat 3360
tttagtaaag cttctatggg ggaaactgca ccacgtacaa actttaataa tgcagcaata 3420
aattatcaaa atttatatct tggtttacga tttattataa aaaaagcatc aaattctcgg 3480
aatataaata atgataatat agtcagagaa ggagattata tatatcttaa tattgataat 3540
atttctgatg aatcttacag agtatatgtt ttggtgaatt ctaaagaaat tcaaactcaa 3600
ttatttttag cacccataaa tgatgatcct acgttctatg atgtactaca aataaaaaaa 3660
tattatgaaa aaacaacata taattgtcag atactttgcg aaaaagatac taaaacattt 3720
gggctgtttg gaattggtaa atttgttaaa gattatggat atgtttggga tacctatgat 3780
aattattttt gcataagtca gtggtatctc agaagaatat ctgaaaatat aaataaatta 3840
aggttgggat gtaattggca attcattccc gtggatgaag gatggacaga ataa 3894
<210> 14
<211> 1297
<212> PRT
<213> Clostridium botulinum
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 14
Met Pro Val Asn Ile Lys Xaa Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn
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Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr
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Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu
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Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly
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Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys
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Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe
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Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile
100 105 110
Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys
115 120 125
Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln
130 135 140
Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile
165 170 175
Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met
180 185 190
Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro
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Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe
245 250 255
Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile
275 280 285
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305 310 315 320
Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys
325 330 335
Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met
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Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr
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Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu
435 440 445
Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys
450 455 460
Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn
465 470 475 480
Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile
485 490 495
Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr
500 505 510
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515 520 525
Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu
530 535 540
Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu
545 550 555 560
Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr
565 570 575
Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala
580 585 590
Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser
595 600 605
Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile
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Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala
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Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr
660 665 670
Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser
675 680 685
Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu
690 695 700
Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile
705 710 715 720
Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu
725 730 735
Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met
740 745 750
Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser
755 760 765
Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser
770 775 780
Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu
785 790 795 800
Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp
805 810 815
Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys
820 825 830
Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr
835 840 845
Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn
850 855 860
Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu
865 870 875 880
Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val
885 890 895
Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu
900 905 910
Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser
915 920 925
Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr
930 935 940
Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
945 950 955 960
Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn
965 970 975
Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile
980 985 990
Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys
995 1000 1005
Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn
1010 1015 1020
Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn
1025 1030 1035
Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile
1040 1045 1050
Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn
1055 1060 1065
Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr
1070 1075 1080
Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn
1085 1090 1095
Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met
1100 1105 1110
Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu
1115 1120 1125
Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln
1130 1135 1140
Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn
1145 1150 1155
Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr
1160 1165 1170
Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val
1175 1180 1185
Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu
1190 1195 1200
Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile
1205 1210 1215
Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys
1220 1225 1230
Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe
1235 1240 1245
Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe
1250 1255 1260
Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn
1265 1270 1275
Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu
1280 1285 1290
Gly Trp Thr Glu
1295
<210> 15
<211> 4400
<212> DNA
<213> Clostridium tetani
<400> 15
tagcattaaa aaaattagaa cctatagtaa ataaattaat taatatatag tttttataat 60
ttaattatga ataatattct taagataaaa agtaaatttt taaaaattta aattttcagt 120
ttacaaaaaa taacctgatt atgttatatg taattgtaaa aaacatataa aaaatcagaa 180
aaatttagga ggtatattat taatggatta aataataatt ttttaattta cttttgatta 240
ataaatatta aatgtttatt ttaattagga gatgatacgt atgccaataa ccataaataa 300
ttttagatat agtgatcctg ttaataatga tacaattatt atgatggagc caccatactg 360
taagggtcta gatatctatt ataaggcttt caaaataaca gatcgtattt ggatagtgcc 420
ggaaaggtat gaatttggga caaaacctga agattttaac ccaccatctt cattaataga 480
aggtgcatct gagtattacg atccaaatta tttaaggact gattctgata aagatagatt 540
tttacaaacc atggtaaaac tgtttaacag aattaaaaac aatgtagcag gtgaagcctt 600
attagataag ataataaatg ccatacctta ccttggaaat tcatattcct tactagacaa 660
gtttgataca aactctaatt cagtatcttt taatttatta gaacaagacc ccagtggagc 720
aactacaaaa tcagcaatgc tgacaaattt aataatattt ggacctgggc ctgttttaaa 780
taaaaatgag gttagaggta ttgtattgag ggtagataat aaaaattact tcccatgtag 840
agatggtttt ggctcaataa tgcaaatggc attttgccca gaatatgtac ctacctttga 900
taatgtaata gaaaatatta cgtcactcac tattggcaaa agcaaatatt ttcaagatcc 960
agcattacta ttaatgcacg aacttataca tgtactacat ggtttatacg gaatgcaggt 1020
atcaagccat gaaattattc catccaaaca agaaatttat atgcagcata catatccaat 1080
aagtgctgaa gaactattca cttttggcgg acaggatgct aatcttataa gtattgatat 1140
aaaaaacgat ttatatgaaa aaactttaaa tgattataaa gctatagcta acaaacttag 1200
tcaagtcact agctgcaatg atcccaacat tgatattgat agctacaaac aaatatatca 1260
acaaaaatat caattcgata aagatagcaa tggacaatat attgtaaatg aggataaatt 1320
tcagatacta tataatagca taatgtatgg ttttacagag attgaattgg gaaaaaaatt 1380
taatataaaa actagacttt cttattttag tatgaatcat gaccctgtaa aaattccaaa 1440
tttattagat gatacaattt acaatgatac agaaggattt aatatagaaa gcaaagatct 1500
gaaatctgaa tataaaggac aaaatatgag ggtaaataca aatgctttta gaaatgttga 1560
tggatcaggc ctagtttcaa aacttattgg cttatgtaaa aaaattatac caccaacaaa 1620
tataagagaa aatttatata atagaactgc atcattaaca gatttaggag gagaattatg 1680
tataaaaatt aaaaatgaag atttaacttt tatagctgaa aaaaatagct tttcagaaga 1740
accatttcaa gatgaaatag ttagttataa tacaaaaaat aaaccattaa attttaatta 1800
ttcgctagat aaaattattg tagattataa tctacaaagt aaaattacat tacctaatga 1860
taggacaacc ccagttacaa aaggaattcc atatgctcca gaatataaaa gtaatgctgc 1920
aagtacaata gaaatacata atattgatga caatacaata tatcaatatt tgtatgctca 1980
aaaatctcct acaactctac aaagaataac tatgactaat tctgttgatg acgcattaat 2040
aaattccacc aaaatatatt catattttcc atctgtaatc agtaaagtta accaaggtgc 2100
acaaggaatt ttattcttac agtgggtgag agatataatt gatgatttta ccaatgaatc 2160
ttcacaaaaa actactattg ataaaatttc agatgtatcc actattgttc cttatatagg 2220
acccgcatta aacattgtaa aacaaggcta tgagggaaac tttataggcg ctttagaaac 2280
taccggagtg gttttattat tagaatatat tccagaaatt actttaccag taattgcagc 2340
tttatctata gcagaaagta gcacacaaaa agaaaagata ataaaaacaa tagataactt 2400
tttagaaaaa agatatgaaa aatggattga agtatataaa ctagtaaaag caaaatggtt 2460
aggcacagtt aatacgcaat tccaaaaaag aagttatcaa atgtatagat ctttagaata 2520
tcaagtagat gcaataaaaa aaataataga ctatgaatat aaaatatatt caggacctga 2580
taaggaacaa attgccgacg aaattaataa tctgaaaaac aaacttgaag aaaaggctaa 2640
taaagcaatg ataaacataa atatatttat gagggaaagt tctagatcat ttttagttaa 2700
tcaaatgatt aacgaagcta aaaagcagtt attagagttt gatactcaaa gcaaaaatat 2760
tttaatgcag tatataaaag caaattctaa atttataggt ataactgaac taaaaaaatt 2820
agaatcaaaa ataaacaaag ttttttcaac accaattcca ttttcttatt ctaaaaatct 2880
ggattgttgg gttgataatg aagaagatat agatgttata ttaaaaaaga gtacaatttt 2940
aaatttagat attaataatg atattatatc agatatatct gggtttaatt catctgtaat 3000
aacatatcca gatgctcaat tggtgcccgg aataaatggc aaagcaatac atttagtaaa 3060
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taataatttt accgttagct tttggttgag ggttcctaaa gtatctgcta gtcatttaga 3180
acaatatggc acaaatgagt attcaataat tagctctatg aaaaaacata gtctatcaat 3240
aggatctggt tggagtgtat cacttaaagg taataactta atatggactt taaaagattc 3300
cgcgggagaa gttagacaaa taacttttag ggatttacct gataaattta atgcttattt 3360
agcaaataaa tgggttttta taactattac taatgataga ttatcttctg ctaatttgta 3420
tataaatgga gtacttatgg gaagtgcaga aattactggt ttaggagcta ttagagagga 3480
taataatata acattaaaac tagatagatg taataataat aatcaatacg tttctattga 3540
taaatttagg atattttgca aagcattaaa tccaaaagag attgaaaaat tatacacaag 3600
ttatttatct ataacctttt taagagactt ctggggaaac cctttacgat atgatacaga 3660
atattattta ataccagtag cttctagttc taaagatgtt caattgaaaa atataacaga 3720
ttatatgtat ttgacaaatg cgccatcgta tactaacgga aaattgaata tatattatag 3780
aaggttatat aatggactaa aatttattat aaaaagatat acacctaata atgaaataga 3840
ttcttttgtt aaatcaggtg attttattaa attatatgta tcatataaca ataatgagca 3900
cattgtaggt tatccgaaag atggaaatgc ctttaataat cttgatagaa ttctaagagt 3960
aggttataat gccccaggta tccctcttta taaaaaaatg gaagcagtaa aattgcgtga 4020
tttaaaaacc tattctgtac aacttaaatt atatgatgat aaaaatgcat ctttaggact 4080
agtaggtacc cataatggtc aaataggcaa cgatccaaat agggatatat taattgcaag 4140
caactggtac tttaatcatt taaaagataa aattttagga tgtgattggt actttgtacc 4200
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aaaaattaaa taatataaca atctagctat attatttttg attattttct taatatatac 4320
taataaaata atcaaaatag agcctatctt aaattactga agggctgtgt caaaataaga 4380
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<213> Clostridium tetani
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1 5 10 15
Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser
50 55 60
Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr
65 70 75 80
Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn
85 90 95
Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile
100 105 110
Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro
130 135 140
Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe
145 150 155 160
Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu
165 170 175
Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser
180 185 190
Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn
195 200 205
Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe
210 215 220
Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His
225 230 235 240
Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys
245 250 255
Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys
275 280 285
Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn
290 295 300
Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp
305 310 315 320
Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser
325 330 335
Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn
340 345 350
Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn
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Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys
370 375 380
Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe
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Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met
405 410 415
Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val
420 425 430
Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile
435 440 445
Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly
450 455 460
Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu
465 470 475 480
Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr
485 490 495
Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile
500 505 510
Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg
515 520 525
Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser
530 535 540
Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile
545 550 555 560
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565 570 575
Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile
580 585 590
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595 600 605
Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr
610 615 620
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Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly
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Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys
755 760 765
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770 775 780
Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser
785 790 795 800
Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln
805 810 815
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Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile
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885 890 895
Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala
900 905 910
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala
995 1000 1005
Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe
1010 1015 1020
Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn
1025 1030 1035
Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr
1070 1075 1080
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Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe
1100 1105 1110
Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr
1115 1120 1125
Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys
1130 1135 1140
Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr
1145 1150 1155
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1175 1180 1185
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly
1220 1225 1230
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1235 1240 1245
Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala
1250 1255 1260
Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp
1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr
1295 1300 1305
Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp
1310 1315
Claims (15)
- 하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하는 방법:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계;
이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. - 하기의 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 표준화된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런의 생성 방법:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계,
이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. - 제 2 항에 있어서, 추가로 하기 단계를 포함하는 방법:
c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
d) 단계 c) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 방법:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 동안 배양하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및
d) 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 상기 세포에서 결정하는 단계. - 제 4 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들이 사용되는 방법.
- 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들에서 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 감수성의 표준화가, GT1b 의 부재 하에 처리된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 대조군 회분과 비교하여 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성의 감소인 방법.
- 제 7 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소가 1.5-배 이상 또는 2-배 이상의 감소인 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런이 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런, 바람직하게는 iCell® 뉴런 (Cellular Dynamics International 사 제조) 인 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들이 계대배양의 수, 냉동/해동 순환 횟수, 배양 조건, 저장 시간, 성장 시간, 분화 조건 또는 이들의 조합에 있어서 상이한 방법.
- 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 Neurobasal 배지, B27 보충물 (2%), 및 글루타민 또는 글루타맥스 (1%) 를 함유하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, GT1b 가 1 내지 300 μM, 바람직하게는 30 μM 의 농도로 첨가되는 방법.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 신경독소 폴리펩티드가 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT, 또는 이들의 아형인 방법.
- 제 4 항 또는 제 6 항에 있어서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성이 면역-웨스턴 블랏 (Immuno-Western blot) 분석, SDS-PAGE 면역블랏 (Immunoblot) 분석 또는 ELISA 에 의한 신경독소-절단된 기질의 정량에 의해 결정되는 방법.
- 하기에 기재된 것을 목적으로 하는 GT1b 의 용도:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 표준화; 또는
b) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소.
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