CN106133522A - 在体外试验系统中用于使细胞对肉毒神经毒素的敏感性标准化和增加的神经节苷脂 - Google Patents

在体外试验系统中用于使细胞对肉毒神经毒素的敏感性标准化和增加的神经节苷脂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于使诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化的方法，其包括以下步骤：a)在包含GT1b的细胞培养基中培养不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；b)使步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时，从而使诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。本发明还涉及用于生成对神经毒素多肽具有标准化敏感性的诱导多能干细胞衍生的神经元的方法，其包括以下步骤：a)提供不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元；b)在包含GT1b的细胞培养基中培养步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时，从而使诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。此外，本发明包括用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法，其包括以下步骤：a)在包含GT1b的细胞培养基中培养诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；b)使步骤a)的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时；d)测定所述细胞中神经毒素多肽的生物活性。最后，本发明涉及GT1b用于a)使不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化；或b)减小不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性的用途。

Description

在体外试验系统中用于使细胞对肉毒神经毒素的敏感性标准 化和增加的神经节苷脂
本发明涉及用于使诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化的方法，其包括以下步骤：a)在包含GT1b的细胞培养基中培养不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；b)使步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时，从而使诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。本发明还涉及用于生成对神经毒素多肽具有标准化敏感性的诱导多能干细胞衍生的神经元的方法，其包括以下步骤：a)提供不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元；b)在包含GT1b的细胞培养基中培养步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时，从而使诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。此外，本发明包括用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法，其包括以下步骤：a)在包含GT1b的细胞培养基中培养诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；b)使步骤a)的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时；d)测定所述细胞中神经毒素多肽的生物活性。最后，本发明涉及GT1b用于a)使不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化；或b)减小不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性的用途。
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)分别产生强效的神经毒素，即肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)特异性地结合至神经元细胞并干扰神经递质释放。每种毒素都作为无活性未加工的约150kDa的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫桥的形成，和通过细菌蛋白酶的限制性蛋白水解(产生切口)。活性神经毒素由两条链组成，即通过二硫键连接的约50kDa的N端轻链和约100kDa的重链。CNT在结构和功能上由三个结构域组成，即催化轻链、包含易位结构域(N端半部)的重链和受体结合结构域(C端半部)；参见，例如Krieglstein 1990，Eur.J.Biochem.188，39；Krieglstein 1991，Eur.J.Biochem.202，41；Krieglstein 1994，J.Protein Chem.13，49。肉毒神经毒素作为包含150kDa神经毒素蛋白质和相关无毒蛋白质的分子络合物合成。络合物的大小根据梭菌菌株和不同神经毒素血清型而为300kDa、大于500kDa、和900kDa不等。这些络合物中的无毒蛋白质使神经毒素稳定并保护其免于降解；参见Silberstein 2004，Pain Practice 4，S19-S26。
肉毒梭菌分泌七种抗原性不同的血清型，命名为肉毒神经毒素(BoNT)A至G。所有血清型以及由破伤风梭菌分泌的相关破伤风毒素(TeNT)都是Zn2+-内切蛋白酶，其通过切割SNARE蛋白质来阻断突触的胞外分泌；参见Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNT导致见于肉毒中毒和破伤风的弛缓性肌肉麻痹；参见Fischer 2007，PNAS 104，10447。
尽管有毒性作用，肉毒毒素络合物已经被用作许多疾病的治疗剂。肉毒毒素血清型A在美国于1989年被批准供人类使用，用于治疗斜视、眼睑痉挛和其他病症。它作为肉毒毒素A(BoNT/A)蛋白质制剂可以例如以商品名BOTOX(Allergan，Inc)或以商品名DYSPORT/RELOXIN(Ipsen，Ltd)商购获得。改进的无络合物的肉毒毒素A制剂可以以商品名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals，LLC)商购获得。对于治疗应用，将制剂直接注射到要治疗的肌肉中。在生理pH下，毒素从蛋白质络合物释放并产生期望的药理学作用。肉毒毒素的作用只是暂时的，这是可能需要肉毒毒素的重复施用以保持治疗作用的原因。
梭菌神经毒素使随意肌力量减弱，且对于斜视、包括颈肌张力障碍的局部肌张力障碍、和良性原发性眼睑痉挛是有效的疗法。已进一步显示它们减轻偏侧面肌痉挛和局部痉挛，此外，其对于广范围的其他适应症是有效的，例如胃肠紊乱、多汗症和美容除皱；参见Jost 2007，Drugs 67，669。
在梭菌神经毒素的生产过程中，所述神经毒素的定性和定量测定以及有生物活性的神经毒素多肽的质量控制是特别重要的。此外，政府机构只接受稳健、准确、精确、可靠和经过验证的肉毒毒素效价检测。目前小鼠LD50生物测定，一种致死率试验，仍然是制药商用来分析其制剂的效价的“金标准”；参见Arnon等人(2001)，JAMA 285，1059-1070。然而，在近几年中，已经进行大量努力来寻找替代途径以减少对动物试验的需要以及与这种基于动物的试验相关的全部缺点、成本和伦理问题。另外，监管机构要求制药公司对肉毒神经毒素的效价试验应用三“R”原则：“减少、优化、替代(Reduce，Refine，Replace)”；参见Straughan，Altern.Lab.Anim.(2006)，34，305-313。因此，已经开发了基于细胞的试验系统以提供对使用活体动物的方法的合理替代方案。然而，迄今只有三种已表现出对神经毒素多肽足够敏感的细胞试验系统可用于测定神经毒素的生物活性。这些基于细胞的试验系统包括使用从啮齿动物胚胎分离的在体外分化的原代神经元(Pellett等人(2011)，Biochem.Biophys.Res.Commun.404，388-392)、神经元分化的诱导多能干细胞(Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35)和衍生自SiMa细胞系的克隆(WO 2010/105234A1)。
然而，原代神经元的分离需要杀害动物并且是费力、费时的，且这些检测的验证似乎是个挑战。此外，使用不同原代神经元的试验系统表现出大的变化。相似地，神经元分化的诱导多能干细胞的生成是困难的且费时的。此外，这种细胞的储存是很成问题的。使用肿瘤细胞系的检测通常对BoNT不够敏感。此外，所述肿瘤细胞系需要复杂的分化方案，这导致使用所述细胞系的检测的大的变化和/或高失败率。
根据上文，非常期望用于测定神经毒素多肽活性的其他试验系统。
因此，本发明的技术问题可被认为是提供满足前述需求的手段和方法。通过在权利要求和下文中表征的实施方案解决了该技术问题。
在第一个方面，本发明涉及用于生成对神经毒素多肽具有标准化敏感性的诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元的方法，其包括以下步骤：
a)提供不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元；
b)在包含GT1b的细胞培养基中培养步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；
由此使诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。
在该方面，在第一个步骤中提供不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元。这些批次可以在例如传代数和/或冷冻/解冻循环的次数和/或在本文其他地方提到的其他特性上有所不同。然后，将不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元在包含GT1b的合适的细胞培养基中培养至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时(1天)、至少36小时、至少48小时(2天)、至少72小时(3天)、至少4天、至少5天或甚至更长。优选地，所述培养持续几小时，例如3小时、4小时、5小时、6小时或12小时。可以使用例如包含B27添加物的培养基、神经元培养基(Cellular Dynamicsinternational；CDI)或由诱导多能干细胞衍生的神经元的制造商或供应商提供的其他细胞培养基作为合适的细胞培养基。由此，本发明人已发现，如下文更详细阐述的，与未经GT1b处理的对照批次的诱导多能干细胞衍生的神经元相比，不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性可以显著减小。
在另一个方面，本发明的上述方法还包括
c)使步骤b)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；
d)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤c)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时。
在包含GT1b的细胞培养基中培养不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时后，在下个步骤中可以先使不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触再用神经毒素多肽使其中毒至少24小时(1天)、至少36小时、至少48小时(2天)、至少60小时、至少72小时(3天)、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天(1周)、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周或甚至更长时间。优选地，中毒持续至少72小时或更长时间。如在本文其它地方更详细定义的，神经毒素多肽可以是，例如，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT或其亚型。在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下将不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元培养上述时间。允许神经毒素多肽发挥其生物活性的合适细胞培养条件和神经毒素多肽的生物活性是如本文其它地方所定义的。通过该处理，与未经GT1b处理的对照批次的中毒诱导多能干细胞衍生的神经元相比，该不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对所述神经毒素多肽的敏感性的变异性可以进一步减小。
在进一步的方面，本发明涉及用于使诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化的方法，其包括以下步骤：
a)在包含GT1b的细胞培养基中培养不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；
b)使步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；
c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时；
从而使诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。
在进一步的方面，本发明的前述方法可以包括一个或更多个另外的步骤。例如，所述另外的步骤可以包括用于测定如本文定义的神经毒素多肽的生物活性的步骤。为此，使如本文描述的已在GT1b存在下培养的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元与如本文定义的神经毒素多肽接触。根据本发明的方法使用的术语“接触”是指使前述细胞和可能包含在例如样品中的神经毒素多肽物理接近以允许物理和/或化学和/或生物相互作用。允许特异性相互作用的合适条件是本领域技术人员所熟知的。所述条件将取决于在本发明方法中应用的细胞和神经毒素，且可以由技术人员不用再费周折地调整。此外，允许相互作用的足够时间也可以由技术人员不用再费周折地确定。例如，可以将具体量的如本文定义的分离的或重组的神经毒素多肽或其变体或者包含神经毒素多肽的样品添加到经GT1b处理的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元。此后，在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，还在GT1b存在下将细胞与神经毒素多肽孵育至少24小时。本文使用的“允许神经毒素多肽发挥其生物学活性的条件”是本领域已知的。然后，例如通过向细胞添加裂解缓冲液停止生物活性的发挥，并通过例如特异性检测切割的神经毒素底物的Western印迹分析或特异性ELISA技术测定神经毒素多肽的生物活性。例如，SNAP-25是BoNT/A、BoNT/C1和BoNT/E的已知底物且被其切割。VAMP/小突触泡蛋白是BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G和TeNT的底物且被其切割，而突触融合蛋白是BoNT/C1的底物且被其切割。
梭菌神经毒素的特征在于其特异性抑制神经递质从突触前神经末梢分泌。通过识别两种不同受体SV2和GT1b来调节对周围神经元的选择性。神经毒素的生理作用是基于在受体结合和神经毒素的轻链易位之后被称为SNARE络合物的蛋白质的切割。测定BoNT生物活性是在所述神经毒素蛋白质的表征中的重要方面，并且尤其地是监管机构对含有BoNT的产品的商业发布的要求。因此，用于测量BoNT生物活性的可靠试验是含有BoNT的产品的研究、开发和上市的基础。此外，由于伦理原因，基于细胞的试验系统会取代目前占主导地位的动物试验。为了建立这种基于细胞的试验系统，对肉毒神经毒素有足够高敏感性的神经元细胞或细胞系是必要的。
为了测定药物产品中肉毒毒素的生物活性，神经元细胞或神经元细胞系应该具有以下特性：第一，细胞应该是人类、神经元来源的以与目标即人类患者尽可能相似。第二，细胞系统对最终产品中的赋形剂应该是稳健的，优选地对生产过程的中间阶段的杂质也是稳健的(过程控制)。第三，基于细胞的试验系统应该表现出允许准确测定小瓶中BoNT(例如，50LD50U BoNT/A)的生物活性的动态测量范围。考虑到技术因素如赋形剂的溶解性、细胞培养基的体积等，小于1pM的BoNT浓度必须被准确地测定。
对BoNT具有足够高的敏感性的可用的基于细胞的试验系统之一使用神经元分化的诱导多能干细胞。本发明人已经对使用市售的人类诱导多能干细胞衍生的神经元(Cellular Dynamics International，Inc.，麦迪逊)的试验系统进行评估。所述人类诱导多能干细胞衍生的神经元已经以冷冻保存的细胞的形式获得，并根据制造商手册解冻和培养4天。所述细胞最终分化为神经元细胞，该神经元细胞的特征在于它们不再增殖且表现出不能再被改变的、终末分化的神经元表型。在已形成所述表型后，将细胞与神经毒素多肽孵育72小时。此后，通过如对神经毒素多肽BoNT/A和其底物SNAP-25所例举的细胞裂解物的Immuno-Western印迹分析或ELISA法对神经毒素底物切割产物进行定量。作为评估所述试验的结果，只要使用所述供应商的相同细胞批次来进行试验，则可以确定所述试验系统的高敏感性、高再现性和高中间精密度。然而，当使用所述供应商的不同细胞批次时，发现所述细胞对神经毒素多肽的敏感性的无法解释的高变异性，然而供应商的所述细胞批次关于细胞数量、生命力、表型等的特征不能给出关于提及的变异性的任何线索。具体地，供应商的不同细胞批次的人类诱导多能干细胞衍生的神经元的敏感性(EC50)在1.7U/ml至大于10U/ml变化。
本发明人已经出人意料地发现神经节苷脂如GT1b的外部应用导致不同细胞批次的人类诱导多能干细胞衍生的神经元之间敏感性的变异性大幅减小。这个发现是非同寻常的，原因如下：首先，表现出神经元表型的细胞自身内源性地产生足够的GT1b。例如，已经发现原代神经元是这样。此外，在本发明人的经验中，甚至原代神经元细胞培养物的不同制剂也没有表现出对神经毒素多肽的敏感性的这种变异性。此外，在其中例如已使用SiMa细胞的基于神经母细胞瘤细胞系的试验中未能观察到这种作用，对于不同传代数或测试不同冷冻保存批次时都未能观察到。其次，Cellular Dynamics International的供应商手册不含关于不同细胞批次的人类诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的这种变异性的任何信息。当使用本发明的方法时，通过在已被添加到细胞培养基的30μM的GT1b存在下进行培养和神经毒素孵育，本发明人可以有利地使所述变异性从约30％减小至约15％(标准偏差)。因此，本发明的方法提供敏感的、准确的、可再现的基于细胞的试验系统，用以测定神经毒素的生物活性。所述方法可以用作常规基于动物的试验系统的替代方案。另外，本发明的用于使人类诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化的相对简单的方法导致所述细胞的提高的敏感性：然而对于未添加GT1b的细胞已发现相当于167fM的约5U/ml的EC50，对于已向细胞培养基添加GT1b的细胞已发现相当于25fM的约0.75U/ml的EC50，这相当于敏感性增加到约7倍。因此，本发明人已发现与在GT1b不存在下培养的人类诱导多能干细胞衍生的神经元相比，人类诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性可以通过GT1b的添加而增加。具体地，每个单批次的人类诱导多能干细胞衍生的神经元的敏感性可以通过用所述神经节苷脂孵育而得到提高。令人关注地，亲代SiMa细胞对神经毒素多肽的敏感性也可以通过GT1b的添加而得到增强。在这种情况下，与未经GT1b处理的SiMa细胞相比，可以使所述神经母细胞瘤细胞的敏感性增加到10倍。这些结果不是无关紧要的工作或不证自明的发现，因为如在以下实施例中证明的，其他神经母细胞瘤细胞如Neuro2a在用GT1b孵育后没有表现出对神经毒素多肽的敏感性的可比较的增加，或仅略有增加，例如SH-SY5Y(DSMZ和ECACC)、PC12、或NG108-15细胞。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于生成对神经毒素多肽具有增加的敏感性的诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元或SiMa细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞；
b)在包含GT1b的细胞培养基中培养步骤a)的诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞至少3小时，
从而增加诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞对所述神经毒素多肽的敏感性。在进一步的方面，通过该方法，可以产生对神经毒素多肽具有增加的敏感性的SH-SY5Y细胞、PC12细胞或NG108-15细胞。
在又一个方面，本发明的上述方法还包括
c)使步骤b)的诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞与神经毒素多肽接触；
d)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞至少24小时。
或者，如上文所述，SH-SY5Y细胞、PC12细胞或NG108-15细胞可以用于本发明的方法的这个方面。
在另一个方面，本发明涉及用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法，其包括以下步骤：
a)在包含GT1b的细胞培养基中培养诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞至少3小时；
b)使步骤a)的诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞与神经毒素多肽接触；
c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的诱导多能干细胞衍生的神经元或SiMa细胞至少24小时；
d)测定所述细胞中神经毒素多肽的生物活性。
或者，在本发明该方法的其他方面，SH-SY5Y细胞、PC12细胞或NG108-15细胞可以用于测定神经毒素多肽的生物活性。
优选地，单批次的所述诱导多能干细胞衍生的神经元、SiMa细胞、SH-SY5Y细胞、PC12细胞或NG108-15细胞在本发明的方法中用于生成对神经毒素多肽具有增加的敏感性的诱导多能干细胞衍生的神经元、SiMa细胞、SH-SY5Y细胞、PC12细胞或NG108-15细胞，或在本发明的方法中用于增加本发明中所述细胞的敏感性。优选地，SiMa细胞是亲代SiMa细胞(DSMZ号ACC164)。优选地，GT1b的浓度是10至50μM，更优选30μM。在包含GT1b的细胞培养基中将诱导多能干细胞衍生的神经元、SiMa细胞、SH-SY5Y细胞、PC12细胞或NG108-15细胞培养优选地至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时或至少96小时、或甚至更长时间。用神经毒素多肽中毒优选地进行至少36小时、48小时、60小时、72小时、96小时或甚至更长时间。优选地，神经毒素多肽是BoNT/A。与未经GT1b处理的诱导多能干细胞衍生的神经元相比，经GT1b处理的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的增加优选为至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、或至少6.7倍。进一步地，与未经GT1b处理的SiMa相比，经GT1b处理的SiMa细胞对神经毒素多肽的敏感性的增加优选地为至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。与未经GT1b处理的SH-SY5Y细胞相比，经GT1b处理的SH-SY5Y细胞对神经毒素多肽的敏感性的增加优选地为至少1.2倍、至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍、或至少2倍。与未经GT1b处理的PC12细胞相比，经GT1b处理的PC12细胞对神经毒素多肽的敏感性的增加优选地为至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、或至少1.4倍。此外，与未经GT1b处理的NG108-15细胞相比，经GT1b处理的NG108-15细胞对神经毒素多肽的敏感性的增加优选地为至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、或至少1.6倍。
本发明的方法允许待分析的含有神经毒素的样品的高度稀释。进一步地，本发明的方法对待分析样品中的赋形剂和杂质是稳健的，其允许所述样品的高度稀释。样品的这种高度稀释对于样品中的赋形剂和杂质是重要的，以便以尽可能低的浓度应用所述潜在干扰物质。
本文使用的“诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元”在广义上意思是对神经毒素多肽易感的细胞，所述神经毒素多肽表现出显示神经毒素多肽特征的生物特性，即，(a)受体结合，(b)内化，(c)跨核内体膜进入胞质溶胶的易位，和/或(d)对突触泡膜融合中涉及的蛋白质的内切蛋白水解切割。因此，本文提到的“诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元”对神经毒素中毒易感。更具体地，本文所指的“对神经毒素中毒易感”意思是可以经受神经毒素多肽(例如BoNT/A)切割神经毒素底物(例如BoNT/A底物SNAP-25)的全部细胞机制的细胞，全部细胞机制涵盖神经毒素与其相应受体的结合(例如BoNT/A与BoNT/A受体结合)、神经毒素/受体络合物的内化、神经毒素轻链从细胞内囊泡进入细胞质的易位和神经毒素底物的蛋白水解切割。用于测定神经毒素多肽的生物活性的试验是本领域熟知的，并且也在本文其他地方进行描述(参见，例如Pellett等人，Withemarsh等人，同上文引用的)。如本领域技术人员理解的，神经毒素敏感的细胞优选地能够首先摄取神经毒素，然后经受上文列出的全部细胞机制。本文使用的神经毒素敏感的细胞可以摄取，例如约100纳摩尔(nM)、约10nM、约1nM、约500皮摩尔(pM)、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约20pM、约10pM、约9pM、约8pM、约7pM、约6pM、约5pM、约4pM、约3pM、约2pM、约1pM、约0.5pM、约0.1pM、约50fM、约40fM、约30fM、约20fM、约10fM、约5fM、约4fM、约3fM、约2fM或约1fM的神经毒素多肽，或甚至小于所示出的值之一。文献中已报道100pM以上的EC50值。根据定义，对神经毒素中毒易感的细胞必须表达、或被改造为表达至少一种神经毒素受体和至少一种神经毒素底物。本领域已描述了神经毒素的受体和底物。因此，所述细胞优选地对如本文定义的生物活性的或成熟的神经毒素多肽易感。优选地，本文使用的神经毒素敏感的细胞通过例如约1nM或更少、500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少、约100pM或更少、约90pM或更少、约80pM或更少、约70pM或更少、约60pM或更少、约50pM或更少、约40pM或更少、约30pM或更少、约20pM或更少、约10pM或更少、约9pM或更少、约8pM或更少、约7pM或更少、约6pM或更少、约5pM或更少、约4pM或更少、约3pM或更少、约2pM或更少、约1pM或更少、约0.9pM或更少、约0.8pM或更少、约0.7pM或更少、约0.6pM或更少、约0.5pM或更少、约0.4pM或更少、约0.3pM或更少、约0.2pM或更少、约0.1pM或更少、约50fM或更少、约40fM或更少、约30fM或更少、约20fM或更少、约10fM或更少、约5fM或更少、约4fM或更少、约3fM或更少、约2fM或更少、或甚至约1fM或更少的神经毒素多肽而对神经毒素中毒易感。例如，在本发明的方法中，对于已外部添加GT1b到细胞培养基的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元，本发明人已发现约3fM的极低EC50值。如本领域已知的，“半最大效应浓度(EC50)”是指在一段确定的暴露时间后在诱导基线和最大值之间一半的应答的药物、抗体或有毒物的浓度。其通常用作药物效价的量度。因此剂量-量反应曲线的EC50表示观察到化合物最大效应的50％的情况下的化合物浓度。剂量-质反应曲线的EC50表示在暴露期间之后群体的50％表现出应答的情况下的化合物浓度。鉴定对神经毒素中毒易感的和/或具有神经毒素摄取能力的细胞或细胞系，即如本文定义的神经毒素敏感的细胞的方法是本领域已知的；参见US 2012/0122128A1。在一个方面，神经毒素多肽的生物活性是因所有前述生物特性而产生。如本文其他地方指出的，现有技术至今已描述了仅几种可用于测定神经毒素的生物活性的、对神经毒素具有足够高的敏感性的基于细胞的试验。用于评价神经毒素的生物活性的体内(in vivo)试验包括，例如，已经提到的小鼠LD50试验和半体内(ex vivo)小鼠偏侧膈试验，如Pearce等人描述的；参见Pearce 1994，Toxicol.Appl.Pharmacol.128:69-77和Dressier 2005，Mov.Disord.20:1617-1619。如本领域技术人员已知的，神经毒素的生物活性通常用小鼠LD50单位(MU)表达。1MU是在腹腔内注射后杀死确定小鼠群体的50％的神经毒性组分的量。
更具体地，文献中描述了本文使用的“诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元”；参见，例如Whitemarsh等人，同上文引用的；WO 2012/135621；US 2010/0279403和US 2010/0216181。特别地，人类诱导多能干细胞(hiPSC)对于为体外(in vitro)产毒性试验提供各种分化的细胞模型具有很好的前景。hiPSC衍生的神经元被分化并例如由CellularDynamics International(麦迪逊，威斯康星州)冷冻保存，其由主要为γ氨基异丁酸能神经元和谷氨酸能神经元的几乎纯的泛神经元群体组成。所述hiPSC衍生的神经元被称为神经元。根据供应商，Western印迹和定量PCR数据表明这些神经元表达关于BoNT中毒的所有必要的受体和底物。BoNT/A中毒研究证明hiPSC衍生的神经元以高的敏感性可再现地和定量地检测有生物活性的BoNT/A。此外，证明了BoNT血清型B、C、E和BoNT/A络合物的定量检测，并通过抗体保护研究确认了BoNT/A特异性。使用原代大鼠脊髓细胞和hiPSC衍生的神经元的BoNT检测的直接比较显示hiPSC衍生的神经元的相同或增加的敏感性、更陡的剂量反应曲线和更完整的SNARE蛋白质靶向切割；参见Whitemarsh等人，同上文引用的。这些数据表明，衍生自hiPSCs的神经元为BoNT效价测定、中和抗体检测和为机制研究提供理想的且高度敏感的平台。在本发明方法的一方面，诱导多能干细胞衍生的神经元是哺乳动物(如啮齿动物、食蟹猴、猕猴或者黑猩猩)诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元，优选人类诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元。优选地，所述诱导多能干细胞衍生的神经元是神经元(Cellular Dynamics International,Inc.(CDI))。根据供应商，神经元衍生自人类诱导多能干细胞(iPS)，且为临床前药物发现、神经毒性试验和疾病研究提供独特的体外系统。此外，神经元提供高质量和高纯度的人类神经元细胞，其具有成熟神经元的典型表型特征和功能。历史上，体外模型在药物发现过程已起到重要作用，包括在早期疾病建模期间使用和在鉴定以及药代动力学和安全性试验中作为候选。由于人类大脑的复杂性，科学家目前使用简化的模型，例如从啮齿动物组织分离的原代细胞和转化的细胞系。在神经毒素领域，生物相关性、再现性和可扩展性的问题会出现，对劣质模型的依赖可能导致直到后期临床试验或在市场引入之后才观察到药物诱导的神经毒性。神经元克服这些限制，为临床前神经毒素安全性试验提供稳健、良好表征的高度可再现的体外模型。神经元是由人类iPS终末分化的，并表现出神经元特征和功能。神经元是高纯的，其提供生物相关且可再现的结果。神经元在培养基中保持活力和纯度数周，这使得能够评估急性和亚慢性应答两者。进一步地，神经元用特别为最佳细胞性能配制的细胞培养基冷冻保藏运输。根据供应商手册，它们的解冻和使用是简单的。然而，本发明人已发现不同批次的神经元在所述批次对神经毒素多肽的敏感性方面有极大不同。因此，对于不同批次，已得到神经毒素生物活性测量值的极大差异。为了减小不同批次的iPS衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性，根据本发明的方法可以有利地使用向细胞培养基外部添加GT1b。
除非本文另外明确指出，否则本文使用的指示物前没有数量词的情况包括单个和更多个指示物。例如，“细胞”指一个或多于一个细胞。
本文使用的术语“约”在对陈述的项目、数、百分比或术语的值进行定量时，是指陈述的项目、数、百分比或术语的值的正负10％、正负9％、正负8％、正负7％、正负6％、正负5％、正负4％、正负3％、正负2％或正负1％的范围。优选正负10％的范围。
本文使用的术语“包括”是“包含”或“含有”的同义词，是包括性的或开放式的且不排除另外的、未列举的成员、元素或方法步骤。显然，术语“包括”涵盖术语“由……组成”。更具体地，本文使用的术语“包括”意思是权利要求涵盖全部列出的元素或方法步骤，但可以还包含另外的、未提及的元素或方法步骤。例如，包括步骤a)、b)和c)的方法在其最狭义的意义上涵盖由步骤a)、b)和c)组成的方法。短语“由……组成”意思是组合物(或装置，或方法)具有所列举的元素(或步骤)且没有其他。相比之下，术语“包括”还可以涵盖除了步骤a)、b)和c)还包括其他步骤例如步骤d)和e)的方法。
在本文使用的数值范围情况下如“浓度为10至50μM的GT1b”，范围不仅包括10μM和50μM，还包括10至50μM间的任何数值，例如，15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM和45μM的GT1b。
本文使用的术语“体外”表示在动物或人体外面或外部。本文使用的术语“体外”应理解为包括“半体内”。术语“半体内”通常是指从动物或人体移出并在体外例如培养容器中保持或增殖的组织或细胞。本文使用的术语“体内”表示在动物或人体里面或内部。
本文使用的术语“分化”或“分化的”表示未特化的或相对较低特化的细胞变得相对更加特化的过程。在细胞个体发生的情况下，形容词“分化的”是相对的概念。因此，“分化的细胞”是较之与其相比较的细胞为已沿着某个发育途径进一步发展的细胞。例如，分化的细胞可以是例如终末分化的细胞，即在有机体的各种组织和器官中发挥特化功能的完全特化的细胞，但其并不必是有丝分裂后的。例如，神经元是从人类iPS细胞终末分化的并表现出神经元的特征和功能。在另一个实例中，分化的细胞也可以是分化谱系内的祖细胞，其可以进一步增殖和/或分化。相似地，如果细胞较之与其相比较的细胞已沿着某个发育途径进一步发展，则该细胞是“相对更加特化的”，其中，与其相比较的细胞因此被认为是“未特化的”或“相对较低特化的”。相对更加特化的细胞与未特化的或相对较低特化的细胞可以在一个或多个可论证的表型特征上有所不同，例如特殊的细胞组分或产物例如RNA、蛋白质、特异性细胞标记物或其他物质的存在、不存在或表达水平，某些生化途径的活性、形态学外观、增殖能力和/或动力学、分化潜力和/或对分化信号的应答等，其中这些特征意味着相对更加特化的细胞进一步沿着所述发育途径的发展。
本文使用的术语“神经毒素多肽”表示肉毒梭菌和破伤风梭菌神经毒素(或梭菌神经毒素)，即肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。最近，已鉴定了新的肉毒毒素类型，即BoNT/H；参见Barash和Arnon,J.Infect.Dis.(2014)，209(2)：183-191。更具体地，所述术语涵盖BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H和破伤风毒素(TeNT)或其亚型。例如，BoNT/A的亚型包括BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5。BoNT/B亚型涵盖例如BoNT/Bl、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6和BoNT/B7。BoNT/C亚型包括例如BoNT/Cl-1和BoNT/Cl-2。还涵盖BoNT/D-C亚型。BoNT/E亚型包括例如BoNT/El、BoNT/E2、BoNT/E3、BoNT/E4、BoNT/E5、BoNT/E6、BoNT/E7和BoNT/E8。进一步地，BoNT/F亚型包括例如，BoNT/Fl、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6和BoNT/F7。神经毒素多肽和，特别地，其轻链和重链是衍生自上述肉毒神经毒素的抗原性不同的血清型中的一种。在一个方面，神经毒素多肽的所述轻链和重链是选自以下神经毒素的轻链和重链：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT。在另一个方面，编码所述神经毒素多肽的多核苷酸包括如SEQ ID NO:1(BoNT/A)、SEQ ID NO:3(BoNT/B)、SEQ ID NO:5(BoNT/C1)、SEQ ID NO:7(BoNT/D)、SEQ ID NO:9(BoNT/E)、SEQ IDNO:11(BoNT/F)、SEQ ID NO:13(BoNT/G)或SEQ ID NO:15(TeNT)中所示的核酸序列。此外，在一个方面涵盖包含编码如SEQ ID NO:2(BoNT/A)、SEQ ID NO:4(BoNT/B)、SEQ ID NO:6(BoNT/C1)、SEQ ID NO:8(BoNT/D)、SEQ ID NO:10(BoNT/E)、SEQ ID NO:12(BoNT/F)、SEQID NO:14(BoNT/G)或SEQ ID NO:16(TeNT)中任一个所示的氨基酸序列的核酸序列的多核苷酸。在本发明的手段和方法的一个方面，进一步涵盖包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的神经毒素多肽：SEQ ID NO:2(BoNT/A)、SEQ ID NO:4(BoNT/B)、SEQ ID NO:6(BoNT/C1)、SEQ ID NO:8(BoNT/D)、SEQ ID NO:10(BoNT/E)、SEQ ID NO:12(BoNT/F)、SEQ ID NO:14(BoNT/G)和SEQ ID NO:16(TeNT)。在Dover等人的出版物，J.Infect.Dis.(2014),209(2):192-202中示出了BoNT/H的相应序列。在本发明的方法和手段的具体方面还涵盖所述BoNT/H序列。
在另一个方面，所述多核苷酸是包含一个或更多个核苷酸替换、缺失和/或添加的前述多核苷酸的变体，其在又一个方面可能导致具有一个或更多个氨基酸替换、缺失和添加的多肽。此外，在另一个方面，变体多核苷酸应包括与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15中任一个所示的(优选完整的)核酸序列或BoNT/H的核酸至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核酸序列变体，或编码与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16中任一个所示的(优选完整的)氨基酸序列或BoNT/H的氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列的核酸序列变体。本文使用的术语“一致的”是指通过测定两个核酸序列或两个氨基酸序列之间一致的氨基酸的数量来表征的序列一致性，其中对所述序列进行比对，从而获得最高的顺序匹配。其可以使用编入计算机程序的公开的技术或方法来计算，例如，BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschul 1990，J Mol Biol 215，403)。在一个方面，一致性百分比值是以整个氨基酸序列计算的。本领域技术人员可获得基于各种算法的一系列程序以用于比较不同的序列。在本文的情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出特别可靠的结果。为了进行序列比对，可以使用程序PileUp(Higgins1989，CABIOS 5，151)或程序Gap和BestFit(Needleman 1970，J Mol Biol 48；443；Smith1981，Adv Appl Math 2，482)，其是GCG软件包(Genetics，Computer Group 1991，575Science Drive，麦迪逊，威斯康星州，美国，53711)的一部分。在本发明的另一个方面，使用GAP程序利用以下设置以整个序列区域测定以百分比(％)计的上文列举的序列一致性值：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000，除非另有说明，否则这应始终用作序列比对的标准设置。本文所指的梭菌神经毒素的变体包括例如在人操纵帮助下产生的梭菌神经毒素或通过化学合成产生的梭菌神经毒素，在人操纵帮助下产生的梭菌神经毒素包括但不限于通过基因工程或重组方法产生的梭菌神经毒素，例如使用随机诱变或理性设计，通过酶例如内蛋白水解酶或外蛋白水解酶的活性进行修饰的梭菌神经毒素的酶修饰变体。“基因操纵”指的是本领域中已知的借助于修饰梭菌神经毒素的基因编码或各自的核酸如DNA或mRNA来用于修饰任意血清型/亚型的天然梭菌神经毒素的方法。用于编码神经毒素多肽的多核苷酸或神经毒素多肽的基因工程的重组方法在本领域中有充分描述；参见例如Sambrook,J.&Russell,D.(2001).Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第三版.Cold Spring Harbor，NY:Cold Spring Harbor Laboratory。本文使用的神经毒素多肽变体还涵盖化学修饰的神经毒素多肽。本文使用的“化学修饰”通常指的是本领域已知的借助于化学反应或类似方法用于修饰任何血清型或亚型的天然或重组的梭菌神经毒素的方法；其特别是指梭菌神经毒素的氨基酸的替换、缺失、插入、添加或翻译后修饰。化学修饰的神经毒素多肽是一种通过丙酮酸化、磷酸化、硫酸化、脂化、聚乙二醇化、糖基化和/或化学添加氨基酸或包含例如约两个至约500个氨基酸的多肽来修饰的神经毒素多肽。例如，通过将透明质酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或其混合物引入到神经毒素多肽，可以使梭菌神经毒素或通过化学修饰或基因操纵从梭菌毒素衍生的毒素稳定化。在一个方面，前述变体多核苷酸的每一个编码保留各个神经毒素多肽即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破伤风神经毒素(TeNT)的生物特性的一种或更多种以及在另一个方面保留其全部生物特性的多肽。本领域技术人员会理解完整的生物活性只在蛋白水解激活后保持，即使可以想到未经加工的前体可以发挥一些生物功能或是部分活性的。本文使用的“生物特性”指(a)受体结合，(b)内化，(c)跨核内体膜进入胞质溶胶的易位，和/或(d)对突触泡膜融合中涉及的蛋白质的内切蛋白水解切割。更具体地，神经毒素(如BoNT/A)切割神经毒素底物(如SNAP-25)所凭借的全部细胞机制涵盖神经毒素与其相应受体的结合(例如BoNT/A与BoNT/A受体的结合)、神经毒素/受体络合物的内化、神经毒素轻链从细胞内囊泡进入细胞质的易位和神经毒素底物的蛋白水解切割。用于测定神经毒素多肽生物活性体外和体内试验是本领域熟知的。用于评估生物活性的体内试验包括小鼠LD50试验和半体内小鼠偏侧膈试验，如Pearce等人(Pearce 1994，Toxicol Appl Pharmacol 128:69-77)和Dressler等人(Dressler 2005，Mov Disord 20:1617-1619，Keller 2006，Neuroscience139：629-637)所描述的。生物活性通常用小鼠单位(MU)表达。如本文使用的，1MU是在腹膜内注射后杀死确定小鼠群体的50％的神经毒素组分的量，即小鼠i.p.LD50。在另一方面，变体多核苷酸可以编码具有改善的或改变的生物特性的神经毒素，例如，它们可能包含得到改善以用于酶识别的切割位点或可能为受体结合或上述任何其他特性而得到改善。在一些方面，神经毒素多肽可以被包含在样品中。样品可以是例如临床样品、生物样品、食物样品、药物或毒理样品、抗体样品或诸如此类。
因此，本文使用的术语“测定神经毒素多肽的生物活性”意思是测量神经毒素蛋白质的生物活性，即，(a)受体结合，(b)内化，(c)跨核内体膜进入胞质溶胶的易位，和/或(d)对突触泡膜融合中涉及的蛋白质的内切蛋白水解切割。
本文使用的术语“量”涵盖例如神经毒素多肽或神经毒素底物多肽的绝对量，所述多肽的相对量或者浓度，以及与其相关的或从其衍生的任何值或参数。
术语“测定……的量”，例如测定神经毒素多肽或神经毒素底物多肽的量，涉及以定量或半定量的方式测量例如神经毒素多肽或神经毒素底物多肽的绝对量、相对量或浓度。用于检测的合适测量方法是本领域技术人员熟知的。应理解的是神经毒素多肽或神经毒素底物多肽的量的测定，在一个方面，还需要通过使用具有预先确定的量的神经毒素多肽或神经毒素底物多肽的标准溶液来校准方法。如何进行这种校准是本领域技术人员熟知的。
在本发明的方法的一个方面，在包含GT1b的细胞培养基中培养诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元。神经节苷脂GT1b与神经毒素多肽结合并潜在地调节神经毒素对神经元的选择性。因此，GT1b可以用于使诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。本发明人已经证明，与未经GT1b处理的对照批次的iPS衍生的神经元相比，外部添加GT1b至iPS衍生的神经元使不同批次的所述iPS衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性大幅减小。优选地，所述GT1b以约10μM至约50μM的浓度，即以约10μM、约15μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM、约45μM、或约50μM的浓度，更优选以约30μM的浓度存在。
在另一个方面，本发明涉及用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法，其包括以下步骤：
a)在包含GT1b的细胞培养基中培养诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；
b)使步骤a)的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；
c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时；
d)测定所述细胞中神经毒素多肽的生物活性。
在本发明的该方法的具体方面，如本文其它地方定义的，使用不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元。
在本发明的方法的一个方面，(诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的)“敏感性的标准化”是与在相同条件下但没用GT1b处理的对照批次的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元相比，不同批次的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性的减小。
在另一个方面，与在相同条件下但没用GT1b处理的对照批次的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元相比，不同批次的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性的减小是减小到至少10/11、至少5/6、至少10/13、至少5/7、至少2/3、至少5/8、至少10/17、至少5/9、至少10/19、至少1/2、至少10/21、至少5/11、至少10/23、至少5/12、至少2/5、或甚至至少1/3。
在本发明的方法的其他方面，诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元是人类诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元。优选地，所述诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元是神经元(Cellular Dynamics International；同上文引用的)。
在本发明的方法的一个方面，不同批次的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元在传代数、冷冻/解冻循环的次数、培养条件、储存时间、生长时间、分化条件或其组合上有所不同。
在本发明的方法的另一个方面，细胞培养基包含Neurobasal培养基、B27添加物(2％)、以及谷氨酰胺或Glutamax(1％)。任选地，细胞培养基可以包含抗生素(1％)、N2添加物(1％)和/或血清白蛋白(0.2％)。
在本发明的方法的其他方面，以1μM至300μM，优选30μM的浓度添加GT1b。
在本发明的方法的另一个方面，神经毒素多肽是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/G、BoNT/F、BoNT/H或TeNT、或其亚型。
在本发明的方法的又一方面，用Immuno-Western印迹分析、SDS-PAGE免疫印迹分析或ELISA(参见，例如，Pellet等人(2010)，J.Pharmacol.Toxicol.Methods 61，304-310)通过神经毒素切割底物的定量来测定神经毒素多肽的生物活性。
在另一个方面，本发明涉及GT1b的以下用途：
a)用于使不同批次的诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化；或
b)用于减小不同批次的诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性。
本发明的方法和用途的特殊方面在以下实施例中示出。
附图示出：
图1：如实施例2中所描述的，培养SiMa细胞并使其中毒，通过Western印迹分析测定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X轴上给出肉毒神经毒素类型的浓度，而在Y轴上绘制切割的SNAP-25的相对量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圆形代表没有GT1b的情况下培养的SiMa细胞，方形代表用30μM的GT1b培养的SiMa细胞。用GT1b的培养导致敏感性增加到约10倍。
图2：如实施例2中所描述的，培养SH-SY5Y细胞并使其中毒，通过Western印迹分析测定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X轴上给出肉毒神经毒素类型的浓度，而在Y轴上绘制切割的SNAP-25的相对量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圆形代表没有GT1b的情况下培养的SH-SY5Y细胞，方形代表用30μM的GT1b培养的SH-SY5细胞。用GT1b的培养导致敏感性增加到约2倍。
图3：如实施例2中所描述的，培养PC12细胞并使其中毒，通过Western印迹分析测定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X轴上给出肉毒神经毒素类型的浓度，而在Y轴上绘制切割的SNAP-25的相对量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圆形代表没有GT1b的情况下培养的PC12细胞，方形代表用30μM的GT1b培养的PC12细胞。用GT1b的培养导致敏感性增加到约1.4倍。
图4：如实施例2中所描述的，培养Neuro2A细胞并使其中毒，通过Western印迹分析测定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X轴上给出肉毒神经毒素类型的浓度，而在Y轴上绘制切割的SNAP-25的相对量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圆形代表没有GT1b的情况下培养的Neuro2A细胞，方形代表用30μM的GT1b培养的Neuro2A细胞。在给定的神经毒素浓度下，没能观察到完整的剂量反应曲线以及在GT1b存在下敏感性的增加。
图5：如实施例2中所描述的，培养NG108-15细胞并使其中毒，通过Western印迹分析测定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X轴上给出肉毒神经毒素类型的浓度，而在Y轴上绘制切割的SNAP-25的相对量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圆形代表没有GT1b的情况下培养的NG108-15细胞，方形代表用30μM的GT1b培养的NG108-15细胞。用GT1b的培养导致敏感性增加到约1.6倍。
实施例：
实施例1：
根据Cellular Dynamics International(CDI)的用户手册，解冻来自4个不同细胞批次的神经元并涂布在96孔板上。涂布后24小时，用用户手册中描述的保鲜培养基或用添加有30μM GT1b的相同培养基替换培养基。
在另外的72小时孵育时间后，去除培养基并用含有不同浓度的BoNT/A的新鲜培养基替换。如果细胞在含有GT1b的培养基上生长，新鲜培养基也含有30μM的GT1b。
中毒开始后72小时，吸出培养基，通过添加25μl SDS样品缓冲液裂解细胞。
如Pellett等人，2010(同上文引用的)描述的，通过SDS-PAGE免疫印迹分析测定切割的SNAP-25的百分比。
通过绘制切割的SNAP-25相对BoNT/A浓度的的百分比计算EC50(产生SNAP-25最大切割的一半的BoNT/A浓度)。
得到的添加GT1b和不添加GT1b的不同细胞批次的EC50值在表1中示出。
表1：
不添加GT1b的EC50 添加GT1b的EC50
批次02 2.84U/ml 0.65U/ml
批次03 5.37U/ml 0.89U/ml
批次04 6.40U/ml 0.77U/ml
批次05 5.47U/ml 0.68U/ml
均值 5.02U/ml 0.75U/ml
RSD 30.3％ 14.6％
尽管添加GT1b得到的更高的敏感性使EC50从约5.0U/mL降低至约0.75U/mL，但是这些批次的EC50值的相对标准偏差从约30％减小至约15％。
实施例2
SiMa细胞的培养和分化(参见图1)：解冻含有SiMa细胞的小瓶，并再悬浮于培养基(90％RPMI 1640+10％h.i.FBS+2mM的L-谷氨酰胺+/-30μM的GT1b)中至每毫升30000个细胞的终密度。将细胞以每孔3000个细胞接种在聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在饱和水蒸气气氛下孵育72小时。72小时后，将培养基更换为含有浓度为1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神经毒素的无血清培养基(MEM+2％B27+1％N2+2％非必需氨基酸+2mM的L-谷氨酰胺+/-30μM的GT1b)。在如上述孵育72小时后，去除培养基，将细胞再悬浮于裂解缓冲液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％Triton X-100，5U/mL的benzonase，pH 8.0)，与RotiLoad 1SDS样品缓冲液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中产生的抗体(Synaptic SystemsSySy111111)，进行Western印迹分析以测定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。
SH-SY5Y细胞的培养和分化(参见图2)：解冻含有SH-SY5Y细胞的小瓶，并再悬浮于培养基(85％MEM:F12+15％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升60000个细胞的终密度。将细胞以每孔6000个细胞接种在未包被的96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在饱和水蒸气气氛下孵育24小时。然后向培养基添加神经生长因子(100ng/ml)和Aphidicoline(0.3mM)+/-30μM的GT1b。每2-3天更换该培养基。孵育17天后，将培养基更换为含有浓度为1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神经毒素的新鲜培养基。在如上述孵育72小时后，去除培养基，将细胞再悬浮于裂解缓冲液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％Triton X-100，5U/mL的benzonase，pH 8.0)，与RotiLoad 1SDS样品缓冲液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中产生的抗体(Synaptic Systems SySy111111)，进行Western印迹分析以测定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。
PC12细胞的培养和分化(参见图3)：解冻含有PC12细胞的小瓶，并再悬浮于培养基(85％RPMI 1640+10％马血清+5％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升25000个细胞的终密度。将细胞以每孔2500个细胞接种在胶原包被的96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在饱和水蒸气气氛下孵育72小时。然后向培养基添加神经生长因子(100ng/ml)+/-30μM的GT1b。每2-3天更换该培养基。孵育11天后，将培养基更换为含有浓度为1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神经毒素的新鲜培养基。在如上述孵育72小时后，去除培养基，将细胞再悬浮于裂解缓冲液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.55％Triton X-100，5U/mL的benzonase，pH 8.0)，与RotiLoad 1SDS样品缓冲液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中产生的抗体(Synaptic SystemsSySy111111)，进行Western印迹分析以测定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。
Neuro2A细胞的培养和分化(参见图4)：解冻含有Neuro2A细胞的小瓶，并再悬浮于培养基(90％DMEM+10％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升20000个细胞的终密度。将细胞以每孔2000个细胞接种在96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在饱和水蒸气气氛下孵育24小时。用无血清DMEM+/-30μM的GT1b更换培养基，然后在37℃孵育3天。然后将培养基更换为含有0.2％BSA+/-30μM的GT1b和浓度为1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神经毒素的新鲜无血清培养基。在如上述孵育72小时后，去除培养基，将细胞再悬浮于裂解缓冲液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％Triton X-100，5U/mL的benzonase，pH8.0)，与RotiLoad 1SDS样品缓冲液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中产生的抗体(SYNAPTIC Systems SySy111111)，进行Western印迹分析以测定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。
NG108-15细胞的培养和分化(参见图5)：解冻含有SH-SY5Y细胞的小瓶，并再悬浮于培养基(90％DMEM+10％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升60000个细胞的终密度。将细胞以每孔6000个细胞接种在96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2在饱和水蒸气气氛下孵育72小时。然后向培养基添加双丁酰-cAMP(1mM)+/-30μM的GT1b。每2-3天更换该培养基。孵育5天后，将培养更换为含有浓度为1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神经毒素的新鲜培养基。在如上述孵育72小时后，去除培养基，将细胞再悬浮于裂解缓冲液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％Triton X-100，5U/mL的benzonase，pH 8.0)，与RotiLoad 1SDS样品缓冲液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中产生的抗体(Synaptic Systems SySy111111)，进行Western印迹分析以测定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。

Claims (15)

1.一种用于使诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化的方法，其包括以下步骤：
a)在包含GT1b的细胞培养基中培养不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；
b)使步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；
c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时；
从而使所述诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。
2.一种用于生成对神经毒素多肽具有标准化敏感性的诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元的方法，其包括以下步骤：
a)提供不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元；
b)在包含GT1b的细胞培养基中培养步骤a)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；
从而使所述诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化。
3.根据权利要求2所述的方法，其还包括：
c)使步骤b)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；
d)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤c)的不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时。
4.一种用于测定神经毒素多肽的生物活性的方法，其包括以下步骤：
a)在包含GT1b的细胞培养基中培养诱导多能干细胞衍生的神经元至少3小时；
b)使步骤a)的诱导多能干细胞衍生的神经元与神经毒素多肽接触；
c)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，在GT1b存在下培养步骤b)的诱导多能干细胞衍生的神经元至少24小时；
d)测定所述细胞中神经毒素多肽的生物活性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中使用不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其还包括测定所述不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元中的神经毒素多肽的生物活性。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使敏感性标准化是与未经GT1b处理的对照批次的诱导多能干细胞衍生的神经元相比，所述不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性的减小。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性减小是减小到至少2/3或至少1/2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述诱导多能干细胞衍生的神经元是人类诱导多能干细胞衍生的神经元，优选神经元(Cellular DynamicsInternational)。
10.根据权利要求1至3和5至9中任一项所述的方法，其中所述不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元在传代数、冷冻/解冻循环的次数、培养条件、储存时间、生长时间、分化条件、或其组合上有所不同。
11.根据权利要求1、2或4所述的方法，其中所述细胞培养基包含Neurobasal培养基、B27添加物(2％)、以及谷氨酰胺或Glutamax(1％)。
12.根据要求1至11中任一项所述的方法，其中以1至300μM，优选30μM的浓度添加GT1b。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述神经毒素多肽是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT、或其亚型。
14.根据权利要求4或6所述的方法，其中用Immuno-Western印迹分析、SDS-PAGE免疫印迹分析或ELISA通过神经毒素切割底物的定量来测定神经毒素多肽的生物活性。
15.GT1b的以下用途
a)用于使不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性标准化；或
b)用于减小不同批次的诱导多能干细胞衍生的神经元对神经毒素多肽的敏感性的变异性。
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