JP2017506892A - in vitro試験系におけるボツリヌス神経毒に対する細胞の感度を標準化し且つ増加させるためのガングリオシド - Google Patents
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Abstract
Description
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを提供するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ
を含み、これにより神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の感度を標準化する、上記方法に関する。
c) ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;および
d) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、ステップc)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ
をさらに含む。
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;
c) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ;
を含み、これにより神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の感度を標準化する、上記方法に関する。
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞を提供するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞を、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ、
を含み、これにより前記神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞の感度を増加させる、上記方法に関する。さらなる態様において、この方法により、神経毒ポリペプチドに対して増加した感度を有するSH-SY5Y細胞、PC12細胞、またはNG108-15細胞を製造することができる。
c) ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞を、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;および
d) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞を、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ
をさらに含む。
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞を、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞を、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;
c) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞またはSiMa細胞を、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ;および
d) 前記細胞中の神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップ
を含む、上記方法に関する。
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞を、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞を、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;
c) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞を、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ;および
d) 前記細胞中の神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップ
を含む、上記方法に関する。
a) 神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞(iPS)由来神経細胞の異なるバッチの感度を標準化するため;または
b) 神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞(iPS)由来神経細胞の異なるバッチの感度の変動を低下させるための、
GT1bの使用に関する。
Cellular Dynamics International社(CDI)の使用者の取扱説明書に従い、iCell(登録商標)神経細胞を解凍し、4つの異なる細胞バッチから、96ウェルプレート上にプレーティングした。プレーティングの24時間(h)後、培地を、使用者の取扱説明書に記載される新たな維持培地、または30μM GT1bを添加した同培地のいずれかによって置換した。
SiMa細胞の培養および分化(図1を参照):SiMa細胞を含むバイアルを解凍し、培養培地(90%RPMI 1640+10%熱不活性化(h.i.)FBS+2mM L-グルタミン+/−30μM GT1b)中で30,000細胞/mLの最終密度まで再懸濁した。上記の細胞を、ポリ-D-リシン被覆96ウェルマイクロタイタープレート上に3,000細胞/ウェルで播種し、37℃、95%O2/5%CO2で飽和水蒸気雰囲気下、72時間インキュベートした。72時間後、培地を、1.0*10-9〜5.65*10-15Mの濃度のボツリヌス神経毒A型を含む無血清培地(MEM+2%B27+1%N2+2%非必須アミノ酸+2mM L-グルタミン+/−30μM GT1b)に交換した。上記の72時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を溶解緩衝液(20mM Tris/HCl、20mM NaCl、2mM MgCl2、0.5%Triton X-100、5U/mLベンゾナーゼ、pH8.0)中で再懸濁し、RotiLoad 1 SDSサンプル緩衝液と混合し、マウスで産生した抗体(Synaptic Systems社、SySy111111)を用いて、Whitemarshら(2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35に記載されるような、切断SNAP-25/非切断SNAP-25の比を決定するためのウェスタンブロット解析に供した。
Claims (15)
- 神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞(iPS)由来神経細胞の感度を標準化する方法であって、以下のステップ:
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;
c) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ;
を含み、これにより神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の感度を標準化する、前記方法。 - 神経毒ポリペプチドに対して標準化された感度を有する人工多能性幹細胞(IPS)由来神経細胞の作製方法であって、以下のステップ:
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを提供するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ
を含み、これにより神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の感度を標準化する、前記方法。 - 以下のステップ:
c) ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;および
d) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、ステップc)の人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ
をさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定する方法であって、以下のステップ:
a) 人工多能性幹細胞由来神経細胞を、GT1bを含む細胞培養培地中で少なくとも3時間培養するステップ;
b) ステップa)の人工多能性幹細胞由来神経細胞を、神経毒ポリペプチドと接触させるステップ;
c) 神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を発揮することを可能とする条件下で、ステップb)の人工多能性幹細胞由来神経細胞を、GT1bの存在下で少なくとも24時間培養するステップ;および
d) 前記細胞中の神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップ
を含む、前記方法。 - 人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチを使用する、請求項4に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチ中の神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップをさらに含む、請求項1または3に記載の方法。
- 感度の標準化が、GT1bを伴わずに処理された人工多能性幹細胞由来神経細胞の対照バッチと比較した、神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチの感度の変動の低下である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチの感度の変動の低下が、少なくとも1.5倍または少なくとも2倍の低下である、請求項7に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞由来神経細胞が、ヒト人工多能性幹細胞由来神経細胞、好ましくはiCell(登録商標)神経細胞(Cellular Dynamics International社製)である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチが、継代の数、凍結/解凍サイクルの数、培養条件、保存時間、増殖時間、分化条件、またはそれらの組み合わせにおいて異なる、請求項1〜3および5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、Neurobasal培地、B27添加物(2%)、およびグルタミンまたはGlutamax(1%)を含む、請求項1、2または4に記載の方法。
- GT1bが、1〜300μM、好ましくは30μMの濃度で添加される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 神経毒ポリペプチドが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/HもしくはTeNT、またはこれらのサブタイプである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 神経毒ポリペプチドの生物学的活性が、免疫ウェスタンブロット解析、SDS-PAGE免疫ブロット解析またはELISAによる、神経毒で切断された基質の定量化によって決定される、請求項4または6に記載の方法。
- a) 神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチの感度を標準化するための;または
b) 神経毒ポリペプチドに対する人工多能性幹細胞由来神経細胞の異なるバッチの感度の変動を低下させるための、
GT1bの使用。
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