KR102282266B1

KR102282266B1 - 시험관내 시험 시스템에서의 보툴리눔 신경독소에 대한 세포의 감수성을 표준화 및 증가시키기 위한 갱글리오사이드

Info

Publication number: KR102282266B1
Application number: KR1020167024793A
Authority: KR
Inventors: 칼-하인츠 아이젤레; 게르트 만더
Original assignee: 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아
Priority date: 2014-02-19
Filing date: 2015-02-18
Publication date: 2021-07-27
Also published as: BR112016019104A2; RU2016131408A; CN106133522A; US10921312B2; HK1226481B; CN106133522B; RU2016131408A3; US20170059558A1; KR20160120752A; AU2015220915B2; ES2812769T3; CA2940082A1; EP3108243B1; RU2694191C2; EP3108243A1; JP6549599B2; IL247162A0; CA2940082C; MX2016010144A; JP2017506892A

Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 표준화 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 본 발명은 추가로, 하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성이 표준화된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 생성 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계, 이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 추가로, 본 발명에는 하기 단계를 포함하는 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 결정하는 방법이 포함된다: a)유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 을 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및 d) 신경독소 폴리펩티드의 상기 세포에서의 생물학적 활성을 결정하는 단계. 최종적으로 본 발명은 이하 기재된 것을 목적으로 하는 GT1b 의 용도에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성 결정; 또는 b) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소.

Description

시험관내 시험 시스템에서의 보툴리눔 신경독소에 대한 세포의 감수성을 표준화 및 증가시키기 위한 갱글리오사이드 {GANGLIOSIDES FOR STANDARDIZING AND INCREASING THE SENSITIVITY OF CELLS TO BOTULINUM NEUROTOXINS IN IN VITRO TEST SYSTEMS}

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하는 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 표준화된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런의 생성 방법에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계, 이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 추가로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 방법을 포함한다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 동안 배양하는 단계; b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및 d) 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 상기 세포에서 결정하는 단계. 최종적으로, 본 발명은 하기에 기재된 것을 목적으로 하는 GT1b 의 용도에 관한 것이다: a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 표준화; 또는 b) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소.

클로스트리둠 보툴리눔 ( Clostridium botulinum) 및 클로스트리둠 테타니 (Clostridium tetani) 는 각각 매우 강력한 신경독소, 즉 보툴리눔 독소 (Botulinum toxins) (BoNTs) 및 테타누스 독소 (Tetanus toxin) (TeNT) 을 생산한다. 그러한, 클로스트리듐성 신경독소 (CNTs) 는 신경 세포에 특이적으로 결합하여 신경전달물질 방출을 교란한다. 각 독소는 불활성 미가공된 약 150 kDa 단일쇄 단백질로서 합성된다. 번역 후 가공은 디설파이드 다리 형성 및 박테리아 프로테아제(들)에 의한 제한된 단백질가수분해 (니킹; nicking) 를 수반한다. 활성 신경독소는 디설파이드 결합에 의해 연결되는 약 50 kDa 의 N-말단 경쇄 및 약 100 kDa 의 중쇄인 두 사슬로 이루어진다. CNT 는 구조적으로 그리고 기능적으로 3 개의 도메인, 즉 촉매 경쇄, 위치변경 도메인 (N-말단 절반) 및 수용체 결합 도메인 (C-말단 절반) 을 포함하는 중쇄로 이루어진다; 참고문헌은, 예를 들어 Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. 보툴리눔 신경독소는 150 kDa 신경독소 단백질 및 회합된 무독성 단백질을 함유하는 분자 복합체로서 합성된다. 복합체 크기는 클로스트리듐 균주 및 300 kDa 내지, 500 kDa 초과, 및 900 kDa 범위의 구분되는 신경독소 항원형에 따라 상이하다. 그러한 복합체들 중 무독성 단백질은 신경독소를 안정화하며, 그들을 분해로부터 보호한다; 참고문헌은, Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26.

클로스트리듐 보툴리눔은 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 의 A 내지 G 로 지정된 항원상 구분되는 7 가지 항원형을 분비한다. 클로스트리둠 테타니에 의해 분비되는 관련된 테타누스 신경독소 (TeNT) 와 함께 모든 항원형이 SNARE 단백질을 절단함에 의해 시냅스 토세포현상을 차단하는 Zn² ⁺-엔도프로테아제이다; 참고문헌은, Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. CNT 은 보툴리눔 및 테타누스에서 나타나는 무탄력 근육 마비를 초래한다; 참고문헌은, Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

그의 독성 효과에도 불구하고, 보툴리눔 독소 복합체는 수많은 질환의 치료제로서 이용되어 왔다. 보툴리눔 독소 항원형 A 는 사시증, 안검경련, 및 여타 장애 치료용으로 1989 년 미국에서 인체용으로 승인받았다. 보툴리눔 독소 A (BoNT/A) 단백질 제제로서 시판되어 이용가능한 것은 예를 들어 상표명 BOTOX (Allergan, Inc. 사 제조) 또는 상표명 DYSPORT/RELOXIN (Ipsen, Ltd. 사 제조) 인 것이 있다. 개선된, 복합체-유리 보툴리눔 독소 A 제제는 상표명 XEOMIN (Merz Pharmaceuticals, LLC 사 제조) 로 시판되어 입수가능하다. 치료 적용을 위해서는, 제제는 치료할 근육에 직접 주사된다. 생리학적 pH 에서, 상기 독소는 단백질 복합체로부터 방출되며, 원하는 약학적 유효성을 발휘한다. 보툴리눔 독소의 유효성은 오직 일시적인데, 이는 치료 유효성 유지를 위해서는 보툴리눔 독소의 반복적 투여가 필요한 이유이다.

클로스트리듐성 신경독소는 자발적 근력을 약화하며, 사시증, 경부 근긴장이상증을 포함하는 국소 근긴장이상증, 및 양성 본태성 안검경련에 대한 유효한 치료요법이다. 이들은 반축안면경련 및 국소 경련을 경감시키고, 나아가 위장관 장애, 다한증 및 미용 주름 정정과 같은 광범위한 여타 징후에 유효한 것으로 나타났다; 참고문헌은 Jost 2007, Drugs 67, 669.

클로스트리듐성 신경독소의 제조 공정 동안, 상기 신경 독소의 정성적 및 정량적 결정 뿐 아니라 생물학적 활성 신경독소 폴리펩티드의 품질 관리는 특별히 중요하다. 추가로, 정부 기관들은 오직 강건하며, 명확하고, 정밀하며, 신뢰성있으며 평가를 마친 보툴리눔 독소 효능 검정만을 수용한다. 현재, 마우스 LD₅₀ 생물검정, 치사율 시험이 그들의 제제의 효능을 분석할 약제학적 제조사에 의해 이용되는 "금본위제" 로 있다; 참고문헌은 Arnon 등 (2001), JAMA 285, 1059-1070. 그러나, 근년에, 상기 유형의 동물-기반의 검정과 관련되어 있는 동물 실험의 필요성 및 모든 단점들, 비용 및 윤리적 염려를 줄이고자 대안적 접근법을 찾는 상당한 노력이 기울여지고 있다. 추가로, 규제 기관들은 보툴리눔 신경독소의 효능 시험에 "줄이고 (Reduce), 재정비하고 (Refine), 대체함 (Replace)" 의 세가지 "R" 원칙을 적용하고자 제약사의 관심을 유도하고 있다: 참고문헌은, Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313. 귀결로서, 살아있는 동물을 이용하는 방법에 대한 합리적인 대안이 될 세포-기반의 시험 시스템이 개발되었다. 그러나, 신경독소 생물학적 활성 결정에는 세가지 세포 시험 시스템만이 이용가능하며, 따라서 신경독소 폴리펩티드에 대해 충분히 감수성인 것으로 나타난 것으로 보기엔 요원하다. 그러한 세포-기반의 시험 시스템에는, 시험관내에서 분화된 설치류 태아로부터 단리된 초대 뉴런 (primary neuron) (Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388392), 신경 분화된 유도된 다능성 줄기 세포 (Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), 및 SiMa 세포주로부터 유도된 클론 (WO 2010/105234 A1) 의 이용을 포함한다.

그러나, 초대 뉴런의 단리는 동물의 살상이 필요하고, 번잡하며 시간소모적이고, 그러한 검정의 평가는 이의제기의 여지가 있는 것으로 나타났다. 나아가, 상이한 초대 뉴런을 이용한 시험 시스템은 큰 변동을 나타낸다. 유사하게, 뉴런으로 분화된 유도된 다능성 줄기 세포의 생성은 난해하며 시간 소모적이다. 추가로, 그러한 세포의 저장은 매우 까다롭다. 종양 세포주를 이용하는 검정에는 흔히 BoNT 에 대해 충분한 감수성이 없다. 나아가, 종양 세포주를 이용하면 검정의 큰 변동 및/또는 높은 실패율을 제공하게 되어, 상기 종양 세포주에는 복잡한 분화 프로토콜이 필요하다.

그러한 맥락에서, 신경독소 폴리펩티드 활성 결정용의 추가적인 시험 시스템이 절실히 필요하다.

따라서, 본 발명의 근저를 이루는 기술적 과제는 상기 언급된 요구에 응하는 수단 및 방법의 제공이라고 볼 수 있다. 기술적 과제는 하기의 청구범위 및 기재된 사항을 특징으로 하는 구현예로 해결된다.

제 1 국면에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 표준화된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도된 뉴런의 생성 방법에 관한 것이다:

a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계;

b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계,

이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 감수성을 신경독소 폴리펩티드에 대해 표준화하게 됨.

상기 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들이 제 1 단계에서 제공된다. 회분은 예를 들어 계대배양의 수 및/또는 냉동/해동 순환 횟수 및/또는 본원의 다른 곳에서 언급된 여타 특성에 있어서 상이할 수 있다. 후속하여, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들은 GT1b 를 함유하는 적절한 세포 배양 배지에서 3 시간 이상, 4 시간 이상, 5 시간 이상, 6 시간 이상, 12 시간 이상, 또는 24 시간 (1 일) 이상, 36 시간 이상, 48 시간 (2 일) 이상, 72 시간 (3 일) 이상, 4 일 이상, 5 일 이상 또는 더 길게 배양된다. 바람직하게는, 상기 배양은 수 시간, 예를 들어 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 또는 12 시간 동안이다. 적절한 세포 배양 배지로서, 예를 들어 B27 보충물을 함유하는 Neurobasal^® 배지, iCell^® Neuron 배지 (Cellular Dynamics international 사 제조; CDI) 또는 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 제조사 또는 공급사에 의해 제공되는 여타 세포 배양 배지가 사용될 수 있다. 이로써, 본 발명의 발명자들은, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성이 하기에 더욱 상세히 제시되는 바와 같이 GT1b 처리 부재 하의 대조군 회분들의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런에 비해 현저히 감소될 수 있음을 발견했다.

또다른 국면에서, 상기 제시된 본 발명의 방법은 하기의 단계들을 추가로 포함한다:

c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및

d) 단계 c) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 동안 배양하는 단계.

유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양 후, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 우선 접촉시킨 후, 신경독소 폴리펩티드를 이용해 24 시간 (1 일) 이상, 36 시간 이상, 48 시간 (2 일) 이상, 60 시간 이상, 72 시간 (3 일) 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 (1 주) 이상, 2 주 이상, 3 주 이상, 5 주 이상, 6 주 이상 후속 단계에서 중독화시킬 수 있다. 바람직하게는, 중독은 72 시간 이상이다. 신경독소 폴리펩티드는 예를 들어 본원의 다른 부분에서 더욱 상세히 정의되는 바와 같은 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT, 또는 그의 아형일 수 있다. 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들은 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발회하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 상기 표기된 기간 동안 배양된다. 그러한 처리에 의해, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 상기 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성은 GT1b 처리 부재 하에 중독된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 대조군 회분들에 비해 더욱 감소될 수 있다.

추가 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하는 방법에 관한 것이다:

a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계;

b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;

c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계;

이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨.

추가 국면에서, 상기 언급된 본 발명의 방법은 하나 이상의 추가적인 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적인 단계들은 상기 정의된 바와 같은 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 단계를 포함할 수 있다. 그러한 목적을 위해, 본원에 기재된 바와 같이 GTb1 의 존재 하에 배양된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런을 본원에 정의된 바와 같이 신경독소 폴리펩티드와 접촉시킨다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 용어 "접촉" 은 물리적 및/또는 화학적 및/또는 생물학적 상호작용을 허용하도록 예를 들어 시료 중에 물리적 접근성이 있도록 포함될 수 있는 상기 언급된 세포 및 신경독소 폴리펩티드를 함께 두는 것을 지칭한다. 특이적 상호작용을 허용하는 적합한 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 조건은 본 발명의 방법에 적용되는 세포 및 신경독소에 좌우되며, 지체없이 당업자에 의해 채택될 수 있다. 나아가, 상호작용을 허용하기에 충분한 시간은 또한 지체없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 특별한 양의 본원에 정의된 단리되거나 또는 재조합 신경독소 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 신경독소 폴리펩티드를 함유하는 시료가 GT1b-처리된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런에 첨가될 수 있다. 이후, 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 다시금 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 세포를 신경독소와 인큐베이션한다. 본원에 사용된 "신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건" 은 당업계에 공지되어 있다. 후속하여, 생물학적 활성의 발휘는 예를 들어 용균 완충액의 세포에 대한 첨가에 의해 중단되며, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성은 예를 들어, 절단된 신경독소 기질을 특이적으로 검출하는 웨스턴 블랏 검정 또는 특이적 ELISA 기법에 의해 결정된다. 예를 들어, SNAP-25 는 BoNT/A, BoNT/C1 및 BoNT/E 의 공지된 기질이며 그들에 의해 절단된다. VAMP/시냅토브레빈은 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G 및 TeNT 의 기질이며 그들에 의해 절단되고, Syntaxin 은 BoNT/C1 의 기질이며 그에 의해 절단된다.

클로스트리듐성 신경독소는 시냅스 앞부분 신경 말단으로부터의 신경전달물질의 분비를 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 한다. 말초 뉴런에 대한 선별성은 2 개의 상이한 수용체, SV2 및 GT1b 의 인식에 의해 중재된다. 신경독소의 생리학적 유효성은 소위 SNARE 복합체의 단백질의 절단 및 후속하는 수용체의 결합 및 신경독소들의 경쇄의 위치변경을 기반으로 한다. BoNT 의 생물학적 활성의 결정은 상기 신경독소 단백질의 특징분석시 중요한 국면이며, 특히 BoNT-포함 제품의 상업적 출시 규제 기관에서 요구하는 것이다. 따라서, BoNT 의 생물학적 활성 측정을 위한 신뢰할 만한 시험은 BoNT 포함 제품의 연구, 개발 및 마케팅의 근간이다. 나아가, 세포-기반 시험 시스템은 지금까지 우세했던 동물 시험들을 윤리적인 이유들로 대체하게 될 것이다. 그러한 세포-기반 시험 시스템 확립을 위해서는, 신경 세포 또는 세포주의 보툴리눔 신경독소에 대한 충분히 높은 감수성이 필수적이다.

약제학적 제품에서 보툴리눔 독소의 생물학적 활성을 결정하기 위해서는, 신경 세포 또는 세포주가 하기의 특성을 갖춰야 한다: 우선, 세포는 표적, 즉 인간 환자에 가능한 가깝게 닮아야 하므로 인간 신경 기원이어야 한다. 둘째, 세포 시스템은 최종 제품 중의 부형제들에 대해, 그리고 바람직하게는 제조 공정의 중간 단계들에서 불순물에 대해 강건해야 한다 (공정 제어). 셋째, 세포-기반 시험 시스템은 바이알에서의 BoNT 의 생물학적 활성 (예를 들어, 50LD₅₀U BoNT/A) 의 정확한 결정을 허용하는 동적인 측정 범위를 나타내야 한다. 부형제의 용해도, 세포 배양 배지의 부피 등과 같은 기술적인 요인들을 고려하면, 1 pM 미만의 BoNT 농도가 정확하게 결정되어야만 한다.

BoNT 에 대한 충분히 높은 감수성을 가진 이용가능한 세포-기반 시험 시스템 중 하나는 신경 분화된 유도된 다능성 줄기 세포를 이용한다. 본 발명의 발명자들은 시판하여 이용가능한 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 (Cellular Dynamics International, Inc. 사 제조, Madison) 을 이용하여 시험 시스템을 평가했다. 상기 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런은 냉동보존된 세포로서 입수되어, 제조사의 매뉴얼에 따라 해동시키고 4 일 동안 배양했다. 상기 세포는 더이상 분화하지 않고 최종적으로 분화된 뉴런의 표현형을 나타내어 더이상 변경되지 않는 것을 특징으로 하는 최종 분화된 신경 세포이다. 형성된 상기 표현형을 가진 후에는, 세포를 신경독소 폴리펩티드와 72 시간 동안 인큐베이션했다. 이후, 신경독소 폴리펩티드 BoNT/A, 및 그의 기질 SNAP-25 에 대해 예시된 바와 같이, 신경독소 기질 절단 생성물을 세포 용해물의 면역-웨스턴 블랏 분석 또는 ELISA 방법으로 정량했다. 언급된 공급사의 동일한 세포 회분을 이용해 시험이 실시되는 한, 상기 시험의 평가 결과, 높은 감수성, 상기 시험 시스템의 재현성 및 중간 정밀성이 확인될 수 있다. 그러나, 상기 공급사의 상이한 세포 회분들 이용시, 세포 수, 생존가능성, 표현형 등과 관련하여 공급사에 의한 상기 세포의 특징분석이 해당 변동성과 관련한 임의의 단서를 제공하지 않았음에도, 신경독소 폴리펩티드에 대한 상기 세포의 감수성에 있어서 설명불가한 높은 변동성을 발견했다. 구체적으로, 공급사의 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 세포 회분들의 감수성 (EC50) 은 1.7 내지 10 U/ml 초과의 범위로 변동한다.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도 GT1b 와 같은 갱글리오사이드의 외부에서의 적용이 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 세포 회분들 사이의 감수성의 변동성의 급격한 감소를 제공한다는 것을 발견했다. 이러한 발견사실은 다음과 같은 이유로 이례적인 것이다: 우선, 신경 표현형을 나타내는 세포는 내생적으로 충분한 GT1b 을 자체로 생산한다. 이는 예를 들어 초대 뉴런에 대해 발견된 바 있다. 나아가, 초대 뉴런 세포 배양의 상이한 제제들 조차 본 발명자들의 경험 상 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성에 있어서 그러한 변동성을 나타내지 않았다. 추가로, 그러한 유효성들이, 예를 들어 SiMa 세포가 사용된 신경아세포종 세포주-기반 시험에서는, 상이한 계대배양 수에 대해서도 상이한 냉동보존 회분들 시험시에도 관찰된 바 없었다. 둘째, Cellular Dynamics International 사에서 제공하는 제조사의 매뉴얼은 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 세포 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 그러한 변동성과 관련한 임의의 정보를 포함하지 않았다. 본 발명의 방법 이용시, 상기 변동성은 유리하게는 세포 배양 배지에 첨가되는 30 μM GT1b 의 존재 하의 배양 및 신경독소 인큐베이션에 의해 약 30% 내지 약 15% (표준 편차) 로 본 발명의 발명자에 의해 감소될 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법은 신경독소의 생물학적 활성을 결정할 민감하고, 정확하며 재현가능한 세포-기반의 시험 시스템을 제공한다. 상기 방법은 통상적인 동물-기반 시험 시스템에 대한 대안으로 이용될 수 있다. 나아가, 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하기 위한 본 발명의 비교적 단순한 방법이 상기 세포의 개선된 감수성을 제공한다: 167 fM 에 해당하는 약 5 U/ml 의 EC50 이 GT1b 의 첨가 부재시 세포에서 발견되는 반면, 25 fM 에 해당하는 약 0.75 U/ml 의 EC50 이 GT1b 이 세포 배양 배지에 첨가된 세포에 대해 발견되어, 감수성의 약 7 배 증가에 해당한다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 GT1b 의 부재 하에 배양된 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런에 비해, GT1b 의 첨가에 의해 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성이 증가될 수 있음을 발견했다. 구체적으로, 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 각 단일 회분의 감수성은 상기 갱글리오사이드와의 인큐베이션에 의해 개선될 수 있다. 흥미롭게도, 부모 SiMa 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성도 GT1b 의 첨가에 의해 강화될 수 있다. 상기의 경우, GT1b 를 처리하지 않은 SiMa 세포에 비해 상기 신경아세포종 세포의 감수성을 10 배나 증가시킬 수 있다. 그러한 결과는 여타 신경아세포종 세포, 예컨대 Neuro2a 가 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이 SH-SY5Y (DSMZ 및 ECACC), PC12, 또는 NG108-15 세포와 마찬가지로 GT1b 와의 인큐베이션 시 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성에 있어서 필적할 증가를 나타내지 않거나, 또는 약간의 증가만을 나타내기 때문에, 하찮은 과업이나 자명한 발견사실이 아니다.

따라서, 또다른 국면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 증가된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포의 생성 방법에 관한 것이다:

a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 제공하는 단계;

b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계,

이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 됨. 추가 국면에서, 신경독소 폴리펩티드에 대해 증가된 감수성을 가진 SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포가 상기 방법으로 제공될 수 있다.

또다른 국면에서, 상기 제시된 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:

c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및

d) 단계 c) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계.

대안적으로, SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포가 상기 제시된 바와 같이 본 발명의 방법의 상기 국면에서 사용될 수 있다.

추가 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성의 결정 방법에 관한 것이다:

a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 동안 배양하는 단계;

b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;

c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런 또는 SiMa 세포를 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및

d) 신경독소 폴리펩티드의 상기 생물학적 활성을 상기 세포에서 결정하는 단계.

SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포가 상기 본 발명의 방법의 타 국면에서 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정에 대안적으로 이용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런, SiMa 세포, SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포의 단일한 회분들이 신경독소 폴리펩티드에 대해 증가된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런, SiMa 세포, SH-SY5Y 세포, PC12 세포, 또는 NG108-15 세포 생성을 위한 본 발명의 방법, 또는 본 발명의 언급된 세포의 감수성 증가를 위한 본 발명의 방법에 이용된다. SiMa 세포가 부모 SiMa 세포인 것이 바람직하다 (DSMZ no. ACC164). 바람직하게는, GT1b 의 농도는 10 내지 50 μM, 더욱 바람직하게는 30 μM 이다. 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런, SiMa 세포, SH-SY5Y 세포, PC12 세포 또는 NG108-15 세포의 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서의 배양은 바람직하게는 12 시간 이상, 24 시간 이상, 36 시간 이상, 48 시간 이상, 60 시간 이상, 72 시간 이상, 96 시간 이상, 또는 그 이상 동안이다. 신경독소 폴리펩티드를 이용한 중독화는 바람직하게는 36 시간 이상, 48 시간 이상, 60 시간 이상, 72 시간 이상, 96 시간 이상 또는 그 이상 실시된다. 바람직하게는, 신경독소 폴리펩티드가 BoNT/A 이다. GT1b-처리된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런에 비해 2-배 이상, 3-배 이상, 4-배 이상, 5-배 이상, 6-배 이상, 또는 6.7-배 이상이다. 나아가, GT1b-처리된 SiMa 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 SiM 에 비해 2-배 이상, 3-배 이상, 4-배 이상, 5-배 이상, 6-배 이상, 7-배 이상, 8-배 이상, 9-배, 또는 10-배 이상이다. GT1b-처리된 SH-SY5Y 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 SY5Y 세포에 비해 1.2-배 이상, 1.4-배 이상, 1.6-배 이상, 1.8-배, 또는 2-배 이상이다. GT1b-처리된 PC12 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 PC12 세포에 비해 1.1-배 이상, 1.2-배 이상, 1.3-배, 또는 1.4-배 이상이다. 더욱이, GT1b-처리된 NG108-15 세포의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 증가는 바람직하게는 GT1b 로 처리되지 않은 NG108-15 세포에 비해 1.1-배 이상, 1.2-배 이상, 1.3-배 이상, 1.4-배 이상, 1.5-배, 또는 1.6-배 이상이다.

본 발명의 방법은 분석할 신경독소 함유 시료의 높은 수준의 희석을 허용한다. 나아가, 본 발명의 방법은, 분석될 시료 중의 부형제 및 불순물에 대해 강건하여, 상기 시료의 높은 수준의 희석을 허용한다. 그렇게 높은 수준의 시료 희석은 상기 잠재적 교란 물질을 가능한 낮은 농도로 적용하기 위해 시료 중 부형제 및 불순물과 관련하여 중요하다.

본원에 사용된 "유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런(들)" 은 신경독소 폴리펩티드에 대한 생물학적 특성, 즉 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도좀 막을 통과하는 세포질로의 위치변경 및/또는 (d) 시냅스 액포막 융합에 관여되는 단백질의 단백질내가수분해 절단을 나타내는 신경독소 폴리펩티드에 취약한, 광범위한 의미의 세포를 의미한다. 따라서, 본원에서 언급되는 "유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런" 은 신경독소 중독화에 취약하다. 더욱 구체적으로, 본원에 언급되는 "신경독소 중독화에 취약함" 은 전반적인 세포 메커니즘 하에 있을 수 있어서, 신경독소 폴리펩티드 (예를 들어, BoNT/A) 가 신경독소 기질 (예를 들어, BoNT/A 기질 SNAP-25) 을 절단하고, 신경독소의 상응하는 수용체에 대한 결합 (예를 들어, BoNT/A 의 BoNT/A 수용체에 대한 결합), 신경독소/수용체 복합체의 내재화, 세포내 액포 유래의 신경독소 경쇄의 세포질로의 위치변경 및 신경독소 기질의 단백질가수분해 절단을 포함함을 의미한다. 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 검정법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원의 다른 곳에도 기재되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Pellett 등, Withemarsh 등, 인용한 텍스트에서). 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 신경독소-감수성 세포는 바람직하게는 가장 먼저 신경독소를 흡수할 수 있고, 이어서 상기 열거한 전반적인 메커니즘 하에 있게 된다. 본원에 사용된 신경독소-감수성 세포는 예를 들어 약 100 나노몰 (nM), 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 피코몰 (pM), 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 9 pM, 약 8 pM, 약 7 pM, 약 6 pM, 약 5 pM, 약 4 pM, 약 3 pM, 약 2 pM, 약 1 pM, 약 0.5 pM, 약 0.1 pM, 약 50 fM, 약 40 fM, 약 30 fM, 약 20 fM, 약 10 fM, 약 5 fM, 약 4 fM, 약 3 fM, 약 2 fM, 또는 약 1 fM, 또는 상기 표기된 것 미만의 신경독소 폴리펩티드를 흡수할 수 있다. 100 pM 를 초과하는 EC50 값이 문헌에 보고된 바 있다. 정의에 의하면, 신경독소 중독에 취약한 세포는 하나 이상의 신경독소 수용체 및 하나 이상의 신경독소 기질을 발현하거나 또는 발현하도록 조작되어야 한다. 신경독소에 대한 수용체 및 기질은 당업계에서 기재되어 있다. 따라서, 상기 세포는 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 생물학적 활성 또는 성숙형 신경독소 폴리펩티드에 취약하다. 바람직하게는, 본원에 사용된 신경독소-감수성 세포는 예를 들어 약 1 nM 이하, 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 90 pM 이하, 약 80 pM 이하, 약 70 pM 이하, 약 60 pM 이하, 약 50 pM 이하, 약 40 pM 이하, 약 30 pM 이하, 약 20 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 9 pM 이하, 약 8 pM 이하, 약 7 pM 이하, 약 6 pM 이하, 약 5 pM 이하, 약 4 pM 이하, 약 3 pM 이하, 약 2 pM 이하, 약 1 pM 이하, 약 0.9 pM 이하, 약 0.8 pM 이하, 약 0.7 pM 이하, 약 0.6 pM 이하, 약 0.5 pM 이하, 약 0.4 pM 이하, 약 0.3 pM 이하, 약 0.2 pM 이하, 약 0.1 pM, 약 50 fM 이하, 약 40 fM 이하, 약 30 fM 이하, 약 20 fM 이하, 약 10 fM 이하, 약 5 fM 이하, 약 4 fM 이하, 약 3 fM 이하, 약 2 fM 이하, 또는 심지어 약 1 fM 이하의 신경독소 폴리펩티드에 의한 신경독소 중독화에 취약하다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 GT1b 가 외부에서 세포 배양 배지로 첨가된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런에 대해 약 3fM 의 극히 낮은 EC50 값이 본 발명의 발명자들에 의해 발견되었다. 당업계에 공지된 바와 같이, "절반 최대 유효 농도 (EC50)" 는 기준선 및 약간의 특정 노출 시간 후의 최대값 사이의 절반에서 응답을 유도하는 약물, 항체 또는 독소의 농도를 지칭한다. 이는 보통 약물의 강도 측정으로 이용된다. 따라서, 등급을 나눈 투여량 응답 곡선의 EC50 는 그의 최대 유효성이 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 계수적 투여량 응답 곡선의 EC50 는 노출 기간 후 모집단의 50% 가 응답을 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다. 신경독소 중독에 취약하고/하거나 신경독소 흡수 용량을 가진 세포 또는 세포주, 즉 본원에 정의된 신경독소-감수성 세포의 식별 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다; 참고문헌은, 예를 들어 US 2012/0122128 A1. 한 국면에서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성은 전부 상기 언급된 생물학적 특징으로부터 초래된 것이다. 본원의 다른 부분에 나타난 바와 같이, 신경독소의 생물학적 활성의 결정에 이용될 수 있는 신경독소에 대한 충분한 높은 감수성을 가진 몇가지 세포-기반 검정법만이 이제까지의 선행기술에 기재되었다. 신경독소의 생물학적 활성을 평가하기 위한 생체내 검정법은 예를 들어, 이미 언급된 마우스 LD₅₀ 검정법 및 Pearce 등 및 Dressier 등이 기재한 바와 같은 생체외 마우스 편측횡격막 검정법을 포함한다; 참고문헌은, Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77 and Dressier 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619. 당업자에게 공지된 바와 같이, 신경독소의 생물학적 활성은 보통 마우스 LD₅₀ 단위 (Mouse LD₅₀ Units (MU)) 로 나타내어진다. 1 MU 은, 복막내 주사 후 특정 마우스 모집단의 50% 를 살상하는 양의 신경독소 구성성분이다.

더욱 구체적으로, 본원에 사용된 "유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런" 은 예를 들어 Whitemarsh 등의 인용한 텍스트; WO 2012/135621; US 2010/0279403 및 US 2010/0216181 의 문헌에 기재되어 있다. 특히, 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 는 시험관내 독성 시험을 위한 다양한 분화 세포 모델을 제공할 큰 유망성을 갖고 있다. hiPSC-유도성 뉴런은 예를 들어 Cellular Dynamics International (Madison, WI) 사에 의해 분화 및 저온보존되어, 주로 감마 아미노이소부티르산성 및 글루탐산성 뉴런의 순수한 전체신경 집단으로 이루어진다. 상기 hiPSC-유도성 뉴런은 iCell^® 뉴런으로 공지되어 있다. 웨스턴 블랏 및 정량 PCR 데이터는 그러한 뉴런이 전부 제조사에 의해 BoNT 중독에 대한 필요한 수용체 및 기질을 발현함을 나타냈다. BoNT/A 중독 연구는 hiPSC-유도성 뉴런이 생물학적 활성 BoNT/A 을 높은 감수성으로 재현성있게 정량적으로 검출함을 입증했다. 추가적으로, BoNT 항원형 B, C, E, 및 BoNT/A 복합체의 정량적 검출이 입증되었으며, BoNT/A 특이성은 항체 보호 연구를 통해 확인되었다. 초대 래트 척수 세포 및 hiPSC-유도성 뉴런을 이용한 BoNT 검출의 직접 비교는 동등하거나 또는 증가된 감수성, 가파른 투여량-응답 곡선 및 더욱 완전한 hiPSC-유도성 뉴런에 대한 더욱 완전한 SNARE 단백질 표적 절단을 보여줬다; 참고문헌은 Whitemarsh 등의 인용된 텍스트. 그러한 데이터는 hiPSC 로부터 유도된 뉴런이 BoNT 강도 결정, 항체 검출 중립화 및 메커니즘 연구를 위한 이상적이며 매우 감수성인 플랫폼을 제공함을 제안한다. 본 발명의 방법의 한 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런은 포유류의 (예컨대, 설치류, 사이노몰구스, 마카크 또는 침팬지) 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런, 바람직하게는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런이다. 바람직하게는, 상기 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런은 iCell^® 뉴런 (Cellular Dynamics International, Inc. (CDI) 사 제조) 이다. 제조사에 따르면, iCell^® 뉴런은 인간 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 유도되며, 전임상용 약물 발견, 신경독성 시험 및 질환 연구를 위한 독특한 시험관내 시스템을 제공한다. 나아가, iCell^® 뉴런은 성숙형 뉴런의 전형적 표현형 특징 및 기능을 보유하는 고품질의 매우 순수한 인간 신경 세포를 제공한다. 역사적으로, 시험관내 모델은 조기 단계 질환 모델링 및 후보자 식별 뿐 아니라 약동학적 및 안전성 시험 동안의 이용을 포함해 약물 발견 프로세스에서의 중요한 역할을 한다. 인간 뇌의 복잡성 때문에, 과학자들은 현재 설치류 조직으로부터 단리된 초대 세포 및 형질전환된 세포주와 같은 단순화된 모델을 이용한다. 생물학적 관련성, 재현성 및 확장성의 문제제기가 야기될 수 있으며, 졸렬한 모델에 의존하면 신경독소 분야에서의 후반기 임상 시험 또는 시판 도입시까지 약물-유도성 신경독성이 관찰되지 않을 수도 있다. iCell^® 뉴런은 전임상 신경독소 안전성 시험에 대한 강건하며, 특징분석이 잘 되어 있는 고도의 재현가능한 시험관내 모델을 제공하여 그러한 한계를 극복한다. iCell^® 뉴런은 인간 iPS 세포로부터 끝까지 분화되며, 신경의 특징 및 기능을 나타낸다. iCell^® 뉴런은 매우 순수하여, 생물학적 관련성 및 재현가능한 결과를 제공한다. iCell^® 뉴런은 배양에서 수 주 동안 살아있고 순수하게 남아있어서, 급성 및 아만성 응답의 평가를 가능케 한다. 나아가, iCell^® 뉴런은 최적의 세포 성능을 위해 특이적으로 제형화된 세포 배양 배지와 함께 저온보존되어 수송된다. 이들은 제조사의 매뉴얼에 따른 해동 및 이용이 단순한다. 그러나, 상이한 회분의 iCell^® 뉴런의 상이한 회분들이 본 발명의 발명자에 의해 신경독소 폴리펩티드에 대한 상기 회분들의 감수성에 대해서는 완전히 상이한 것으로 나타났다. 그 결과, 신경독소의 생물학적 활성의 측정된 값들에서의 강력한 일탈이 상이한 회분들에서 수득되었다. 상이한 회분들의 iPS-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성을 줄이기 위해, GT1b 의 세포 배양 배지에 대한 외부에서의 첨가가 유리하게는 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 대표 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 표시하지 않는 한 단수 및 복수 언급을 모두 포함한다. 예시로서, "세포" 는 하나의 세포 또는 그보다 더 많은 세포도 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 언급되는 항목, 수, 백분율 또는 용어의 값들의 정량시 용어 "약" 은 언급되는 항목, 수, 백분율 또는 용어의 값들의 ±10 퍼센트, 9 퍼센트, 8 퍼센트, 7 퍼센트, 6 퍼센트, 5 퍼센트, 4 퍼센트, 3 퍼센트, 2 퍼센트 또는 1 퍼센트의 범위를 지칭한다. ±10 퍼센트의 범위가 바람직하다.

본원에 사용된 용어 "함유함", "함유하다" 및 "를 함유하여 이루어진" 은 "포함함", "포함하다" 와 동의어이며, 한계값을 포함하고 있거나 또는 양끝값에 개방적이며, 추가적인 언급되지 않은 구성원, 구성요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 분명하게, 용어 "함유함" 은 용어 "로 이루어짐" 을 포함한다. 더욱 구체적으로, 본원에 사용된 용어 "함유하다" 는 청구한 사항이 모든 열거된 구성요소 및 방법 단계를 전부 포함하지만, 또한 추가적인, 언급되지 않은 구성요소 또는 방법 단계를 포함할 수도 있음을 의미한다. 예를 들어, 단계 a), b) 및 c) 를 포함하는 방법은 그의 가장 좁은 의미에서는 단계 a), b) 및 c) 로 이루어진 방법을 포함한다. 어구 "로 이루어진" 은 해당 조성물 (또는 기기 또는 방법) 에는 언급한 구성요소 (또는 단계들) 가 있으며, 그 이상은 없음을 의미한다. 대조적으로, "포함하다" 는 예를 들어 단계 d) 및 e) 의 추가적인 단계를, 단계 a), b) 및 c) 에 추가하여 포함하는 방법도 포함할 수 있다.

"10 내지 50μM 의 농도의 GT1b" 와 같이 숫자 범위가 본원에 사용된 경우, 그 범위는 10 내지 50 μM 의 임의의 수치 값, 예를 들어 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM 및 45 μ의 MGT1b 도 포함한다.

본원에 사용된 용어 "시험관내" 는 동물 또는 신체의 외부 또는 바깥을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "시험관내" 는 "생체외" 를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "생체외" 는 일반적으로 동물 또는 인체로부터 제거되어, 신체 외부 예를 들어 배양 용기에 유지 또는 번식된 조직 또는 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "생체내" 는 동물 또는 인체 내부 또는 안쪽을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "분화", "분화함" 또는 "분화된" 은 미분화 또는 상대적으로 덜 분화된 세포가 상대적으로 더욱 분화되는 프로세스를 지칭한다. 세포 개체발생의 맥락에서, 형용사형 "분화된" 은 상대적인 용어이다. 따라서, "분화된 세포" 는 그것과 비교되는 세포에 비해 특정 발생 경로로 더욱 진행이 된 세포이다. 분화된 세포는 예를 들어 최종까지 분화된 세포, 즉 유기체의 다양한 조직 및 장기에서의 특화된 기능을 습득한 완전히 특화된 세포일 수 있으며, 유사분열 후의 일이 아닐 수 있다. 예를 들어, iCell^® 뉴런은 인간 iPS 세포로부터 끝까지 분화되어, 신경 특징 및 기능을 나타낸다. 또다른 예시에서, 분화된 세포는 또한 분화 계대 내의 간세포일 수도 있어서, 추가로 더 증식 및/또는 분화할 수 있다. 유사하게, 비교되는 해당 세포보다 특정 발생 경로를 따라 더 진행되는 경우, 그 세포는 "상대적으로 더욱 특화" 되어 존재하는데, 여기서 상기 비교되는 해당 세포는 이에 따라 "특화되지 않음" 또는 "상대적으로 덜 특화됨" 으로 간주된다. 상대적으로 더 많이 특화된 세포는, 예를 들어 특별한 세포 구성성분 또는 생성물, 예를 들어 RNA, 단백질, 특별한 세포 마커 또는 여타 물질, 특정 생화학적 경로의 활성, 형태적 외관, 증식 용량 및/또는 동역학, 분화 잠재성 및/또는 분화 신호에 대한 응답성 등의 존재, 부재 또는 발현 수준과 같은 하나 이상의 입증가능한 표현형 특징에 있어서 특화되지 않거나 또는 상대적으로 덜 특화된 세포와는 상이할 수 있으며, 여기서 상기 특징들은 상기 발생 경로를 따라 상대적으로 더 많이 특화된 세포의 진행을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "신경독소 폴리펩티드" 는 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 및 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani) 신경독소 (클로스트리듐성 신경독소), 즉 보툴리눔 독소 (BoNTs) 및 테타누스 독소 (TeNT) 를 지칭한다. 최근, 신규한 보툴리눔 독소 유형, 즉 BoNT/H 이 동정되었다; 참고문헌은, Barash 및 Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 183191. 더욱 구체적으로, 상기 용어는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 및 테타누스 신경독소 (TeNT), 또는 그의 아형을 포함한다. 예를 들어, BoNT/A 의 아형은 BoNT/Al, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5 을 포함한다. BoNT/B아형은, 예를 들어, BoNT/Bl, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/B6 및 BoNT/B7 을 포함한다. BoNT/C 아형은 예를 들어 BoNT/Cl-1 및 BoNT/Cl-2 을 포함한다. 또한 BoNT/D-C 아형도 포함한다. BoNT/E 아형은 예를 들어, BoNT/El, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/E6, BoNT/E7 및 BoNT/E8 을 포함한다. 나아가, BoNT/F 아형은, 예를 들어, BoNT/Fl, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, BoNT/F6 및 BoNT/F7 을 포함한다. 신경독소 폴리펩티드 및, 특별하게는 그의 경쇄 및 중쇄가 상기 언급된 보툴리눔 신경독소의 항원적으로 상이한 항원형 중 하나로부터 유도가능하다. 한 국면에서, 신경독소 폴리펩티드의 상기 경쇄 및 중쇄는 이하의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경독소의 경쇄 및 중쇄이다: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT. 또다른 국면에서, 상기 신경독소 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) 또는 SEQ ID NO: 15 (TeNT) 에서 제시되는 핵산 서열을 포함한다. 나아가, 한 국면에서 SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) 또는 SEQ ID NO: 16 (TeNT) 의 임의의 것에서 제시되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 추가로, 하기의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함거나 또는 그것으로 이루어진 신경독소 폴리펩티드가 본 발명의 수단 및 방법의 한 국면에 포함된다: SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) 및 SEQ ID NO: 16 (TeNT). BoNT/H 의 해당하는 서열은 문헌 [Dover 등, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 192-202] 에 제시되어 있다. 상기 BoNT/H 서열은 또한 본 발명의 수단 및 방법의 특정 국면에 포함되어 있다.

또다른 국면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 또다른 구현예에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 가진 폴리펩티드를 제공할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하는 상기 언급된 폴리뉴클레오티드의 변이체이다. 나아가, 변이체 폴리뉴클레오티드는 또다른 국면에서 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15 중 임의의 하나에 제시된 (바람직하게는 완전한) 핵산 서열 또는 BoNT/H 의 핵산에 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열 변이체, 또는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16 중 임의의 하나에 제시된 (바람직하게는 완전한) 아미노산 서열 또는 BoNT/H 의 아미노산 서열에 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "동일한" 은 두 핵산 서열 또는 두 아미노산 서열 사이에서 동일한 아미노산의 갯수를 결정하는 것을 특징으로 하는 서열 동일성을 지칭하며, 여기서 서열들은 최고 수준의 맷치가 수득되도록 정렬된다. 이는 예를 들어 BLASTP, BLASTN 또는 FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403) 와 같은 컴퓨터 프로그램에서 코드화된 공개된 기법 또는 방법을 이용해 산출될 수 있다. 한 국면에서, 백분율 동일성은 전체 아미노산 서열 상에서 산출된다. 다양한 알고리즘을 기반으로 한 일련의 프로그램은 상이한 서열을 비교하고자 하는 숙련가가 이용가능하다. 그러한 맥락에서, Needleman 및 Wunsch 의 알고리즘 또는 Smith 및 Waterman 의 알고리즘이 특히 신뢰할 만한 결과를 제공한다. 서열 정렬 수행을 위해, GCG 소프트웨어 팩킷 (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) 의 일부분인 프로그램 PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) 또는 프로그램 Gap and BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482) 을 이용할 수 있다. 백분율 (%) 로 상기에서 언급한 서열 동일성 값은 본 발명의 또다른 국면에서는 다음과 같은 설정으로 전체 서열 상에서 결정되었다: Gap Weight: 50, Length Weight: Average Match: 10.000 및 Average Mismatch: 0.000, 이는 달리 언급되지 않으면, 서열 정렬을 위한 표준 설정으로서 항상 이용. 본원에 언급된 클로스트리듐성 신경독소의 변이체는, 예를 들어, 이에 제한됨 없이 예를 들어 무작위적 돌연변이유발 또는 합리적인 디자인을 이용한 유전자 조작 또는 재조합 방법으로 생산되는 클로스트리듐성 신경독소, 내부- 또는 외부단백질가수분해 효소와 같은 효소의 활성에 의해 변경되는 클로스트리듐성 신경독소의 효소 변경 변이체, 또는 화학 합성에 의해 제공되는 클로스트리듐성 신경독소를 포함하는, 인간의 조작에 힘입어 제조되는 클로스트리듐성 신경독소를 포함한다. "유전자 조작" 은 DNA 또는 mRNA 와 같은 각 핵산 또는 클로스트리듐성 신경독소를 인코딩하는 유전자 변경을 수단으로 임의의 혈청형/아형의 본연의 클로스트리듐성 신경독소를 변경하는 당업계 공지된 방법을 지칭한다. 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자적 조작을 위한 재조합 방법은 당업계에 널리 기재되어 있다; 참고문헌은, 예를 들어 Sambrook, J. & Russell, D. (2001). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. 본원에 사용되는 신경독소 폴리펩티드 변이체는 화학적으로 개질된 신경독소 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "화학적 개질" 은 일반적으로 화학 반응 등을 수단으로 임의의 혈청형 또는 아형의 본연의 또는 재조합 클로스트리듐성 신경독소를 개질하기 위한 당업계에 공지된 방법을 지칭하며; 특별하게는 클로스트리듐성 신경독소의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 번역후 개질을 지칭한다. 화학적으로 개질된 신경독소 폴리펩티드는 예를 들어 약 2 개 내지 약 500 개의 아미노산을 포함하는 아미노산 또는 폴리펩티드의 피루베이트화, 인산화, 설페이트화, 지질첨가, peg 화, 글리코실화 및/또는 화학적 부가에 의해 개질된 것일 수 있다. 예를 들어, 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물의 신경독소 폴리펩티드로의 혼입에 의해, 클로스트리듐성 신경독소 또는 화학적 개질 또는 유전자 조작에 의해 클로스트리듐성 독소로부터 유도된 독소가 안정화될 수 있다. 한 국면에서, 각각의 상기 언급된 변이체 폴리뉴클레오티드는 각 신경독소 폴리펩티드, 즉 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/Hor 테타누스 신경독소 (TeNT) 의 생물학적 특성 중 하나 이상 및 또다른 국면에서는 그의 전부를 보유하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 당업자는 모든 생물학적 활성이 단백질가수분해 활성화 후에만 유지된다는 것을 알 것이며, 가공되지 않은 전구체는 일부의 생물학적 기능만 발휘할 수 있거나 또는 부분적으로만 활성임을 상상할 수 있다. 본원에 사용된 "생물학적 특성" 은 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도좀 막을 가로지르는 세포질로의 위치변경, 및/또는 (d) 시냅스 액포막 융합에 관여되는 단백질의 단백질내가수분해 절단을 지칭한다. 더욱 구체적으로, 신경독소 (예를 들어, BoNT/A) 가 신경독소 기질 (예를 들어, SNAP-25) 을 절단하는 전반적인 세포 메커니즘은, 신경독소의 상응하는 수용체로의 결합 (예를 들어, BoNT/A 의 BoNT/A 수용체로의 결합), 신경독소/수용체 복합체의 내재화, 세포내 액포 유래의 신경독소 경쇄의 세포질로의 위치변동 및 신경독소 기질의 단백질가수분해성 절단을 포함한다. 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정을 위한 시험관내 및 생체내 검정은 당업계에 널리 공지되어 있다. 생물학적 활성 평가를 위한 생체내 검정은, Pearce 등의 문헌 (Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) 및 Dressler 등의 문헌 (Dressler 2005, Mov Disord 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637) 에 기재된 바와 같은 마우스 LD50 검정 및 생체외 마우스 편측횡격막 검정을 포함한다. 생물학적 활성은 보통 마우스 유닛 (Mouse Units) (MU) 으로 표현된다. 본원에 사용된 바와 같이, 1 MU 은 복강내 주사 후 특정 마우스 모집단의 50% 를 살상하는, 즉 마우스 i.p. LD50 의 신경독소 구성성분의 양을 지칭한다. 추가 국면에서, 변이체 폴리뉴클레오티드는 개선되거나 또는 변경된 생물학적 특성을 가진 신경독소를 인코딩할 수 있는데, 예를 들어 그들은 효소 인식에 있어 개선되거나 또는 수용체 결합, 또는 상기 언급된 임의의 여타 특성에 있어 개선된 절단 부위를 포함할 수 있다. 일부 국면에서, 신경독소 폴리펩티드가 시료 중에 포함되어 있을 수 있다. 시료는 예를 들어 임상 시료, 생물학적 시료, 식품 시료, 약제학적 또는 독성학적 시료, 항체 시료 등일 수 있다.

따라서, 본원에 사용된 용어 "신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정" 은 신경독소 단백질의 생물학적 활성, 즉 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도좀 막을 가로지르는 세포질로의 위치변경, 및/또는 (d) 시냅스 액포막 융합에 관여되는 단백질의 단백질내가수분해 절단의 측정을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "양" 은 예를 들어 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 절대량, 상기 폴리펩티드의 상대적 양 또는 농도 뿐만 아니라 그들에 상관되거나 또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 값 또는 파라미터를 포함한다.

예를 들어 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의, 용어 "양을 결정" 함은 정량적 또는 반정량적 방식으로, 예를 들어 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 절대량, 상대량 또는 농도 측정에 관한 것이다. 적합한 검출 측정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 양의 결정이, 한 국면에서, 표준 용액을 신경독소 폴리펩티드 또는 신경독소 기질 폴리펩티드의 예비규정된 양 적용에 의한 방법의 보정을 필요로 한다는 것도 이해될 것이다. 그러한 보정을 실시하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 방법의 한 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런가 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 배양된다. 갱글리오사이드 GT1b 는 신경독소 폴리펩티드에 결합하며, 잠재적으로는 뉴런의 신경독소의 선별성을 중재한다. 따라서, GT1b 는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성 표준화에 이용될 수 있다. 본 발명에 의하면 GT1b 의 iPS-유도성 뉴런에 대한 외부에서의 첨가가 상기 iPS-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성을, GT1b 부재 하에 처리된 대조군 회분의 iPS-유도성 뉴런에 비해 급작스럽게 감소시키는 것으로 나타났다. 바람직하게는, 상기 GT1b 는 약 10 내지 약 50 μM 의 농도, 즉 약 10 μM, 약 15 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 35 μM, 약 40 μM, 약 45 μM, 또는 약 50 μM 의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 30 μM 의 농도로 존재한다.

추가 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 방법에 관한 것이다:

a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계;

b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;

c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 의 존재 하에 신경독소 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및

d) 상기 세포에서의 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 결정하는 단계.

본 발명의 상기 방법의 한가지 특별한 국면에서, 본원의 다른 부분에서 정의된 바와 같은 상이한 회분의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런이 사용된다.

본 발명의 방법의 한 국면에서, (유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한) "감수성의 표준화" 는 동일 조건 하에 GT1b 부재 하에 처리된 대조군 회분의 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런과 비교한, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성에서의 감소이다.

또다른 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성에서의 감소는, 동일 조건 하에 GT1b 의 부재 하에 처리되는 대조군 회분의 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런에 비해 1.1-배 이상, 1.2-배 이상, 1.3-배 이상, 1.4-배 이상, 1.5-배 이상, 1.6-배 이상, 1.7-배 이상, 1.8-배 이상, 1.9-배 이상, 2-배 이상, 2.1-배 이상, 2.2-배 이상, 2.3-배 이상, 2.4-배 이상, 2.5-배 이상, 또는 심지어 3-배 이상 감소이다.

본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런은 인간의 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런이다. 바람직하게는, 상기 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런은 iCell^® 뉴런 (Cellular Dynamics International; 인용된 텍스트) 이다.

본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들은 계대배양 횟수, 냉동/해동 순환 횐수, 배양 조건, 저장 시간, 성장 시간, 분화 농도 또는 이들의 조합에 있어서 상이다.

본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 세포 배양 배지는 Neurobasal 배지, B27 보충물 (2%), 및 글루타민 또는 글루타맥스 (1%) 를 함유한다. 임의로는, 세포 배양 배지가 항생제 (1%), N2 보충물 (1%) 및/또는 혈청 알부민 (0.2%) 을 함유할 수 있다.

본 발명의 방법의 또다른 국면에서, GT1b 는 1 내지 300 μM, 바람직하게는 30 μM 의 농도로 첨가된다.

본 발명의 방법의 또다른 국면에서, 신경독소 폴리펩티드는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/G, BoNT/F, BoNT/H 또는 TeNT, 그의 아형이다.

본 발명의 또다른 국면에서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성은 면역-웨스턴 블랏 분석 (Immuno-Western blot analysis), SDS-PAGE 면역블랏 분석 또는 ELISA (참고문헌은, 예를 들어 Pellet 등 (2010), J. Pharmacol. Toxicol. Methods 61, 304-310) 에 의한 신경독소-절단 기질의 정량으로 결정된다.

추가 국면에서, 본 발명은 하기의 것을 위한 GT1b 의 용도에 관한 것이다:

a) 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성 표준화; 또는

b) 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소.

본 발명의 방법 및 용도의 특별한 국면은 하기 실시예에 제시된다.

도면은 다음과 같다:
도 1: SiMa 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 SiMa 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 SiMa 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 10-배의 증가를 유도했다.
도 2: SH-SY5Y 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 SH-SY5Y 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 SH-SY5Y 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.4-배의 증가를 유도했다.
도 3: PC12 세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 PC12 세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 PC12 세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.4-배의 증가를 유도했다.
도 4: Neuro2A-세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고,절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 Neuro2A-세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 Neuro2A-세포를 나타낸다. 주어진 신경독소 농도에서, 완전한 투여량 응답 곡선이 관찰되지도 않았고, GT1b 를 이용해도 감수성 증가가 없었다.
도 5: NG108-15-세포를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 배양 및 중독화시키고, 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 웨스턴 블랏 분석으로 결정했다. X-축 상에는 보툴리눔 신경독소 유형의 농도를, Y-축 상에는 절단 SNAP-25 의 상대적 양, 즉 절단 대 비절단 SNAP-25 의 비율을 두어 그래프로 그렸다. 원은 GT1b 부재 하에 배양된 NG108-15-세포를 나타내며, 사각형은 30 μM GT1b 존재 하에 배양된 NG108-15-세포를 나타낸다. GT1b 존재 하의 배양은 감수성에 있어서 약 1.6-배의 증가를 유도했다.
본 발명은 하기의 실시예로 더욱 상세히 설명될 것이나, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 :

실시예 1:

Cellular Dynamics International (CDI) 사용자 매뉴얼에 따라 iCell^® 뉴런을 해동시키고, 4 개의 상이한 세포 회분들로부터 96 웰 플레이트 상에 플레이팅했다. 플레이팅 24 시간 후, 배지를 사용자 매뉴얼에 기재되어 있는 신선한 유지 배지로 또는 30 μM GT1b 이 보충된 동일 배지로 교체했다.

72 시간의 인큐베이션 시간 후, 배지를 제거하고, 농도를 다양하게 한 BoNT/A 를 함유하는 신선한 배지로 교체했다. 세포가 GT1b 함유 배지 상에서 성장한 경우, 신선한 배지도 역시 30 μM GT1b 를 포함했다.

중독화 개시 72 시간 후, 배지를 흡출시키고, 25㎕ SDS 시료 완충액 첨가로 세포를 용균시켰다.

절단 SNAP-25 의 백분율을 문헌 [Pellett 등, 2010 (인용한 텍스트에서)] 에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 면역블랏 분석으로 결정했다.

EC50 (SNAP-25 의 최대 절단의 절반을 제공하는 BoNT/A 의 농도) 는 백분율 절단 SNAP-25 을 BoNT/A 농도에 대해 그래프를 그려 산출했다.

결과로서 수득한, GT1b 의 존재 또는 부재 하의 상이한 세포 회분들의 EC50 값을 표 1 에 제시한다.

표 1:

EC50 를 약 5.0 에서 약 0.75 U/mL 로 감소시킨 GT1b 의 첨가 결과로 인한 더 높은 감수성에도 불구하고, 회분들의 EC50 값의 상대적인 표준 편차는 약 30% 에서 약 15% 로 감소했다.

실시예 2:

SiMa 세포의 배양 및 분화 (도 1 참조): SiMa-세포를 포함하고 있는 바이알을 해동시키고, 배양 배지 (90% RPMI 1640 + 10% h.i. FBS + 2 mM L-글루타민 +/- 30 μM GT1b) 중에 최종 밀도 30,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 폴리-D-라이신 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트 상에 3,000 세포/웰로 시딩하고, 72 시간 동안 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O₂/5% CO₂ 중에 인큐베이션했다. 72 시간 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10^-9 내지 5.65*10^-15 M 의 농도 범위로 함유하는 무혈청 배지 (MEM + 2% B27 + 1% N2 + 2% 불필수 아미노산 + 2 mM L-글루타민 +/- 30 μM GT1b) 로 교환했다. 상기 표기된 바와 같이 72 시간 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 0.5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜, 문헌 [Whitemarsh 등, (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생성된 항체 (Synaptic Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.

SH-SY5Y 세포의 배양 및 분화 (도 2 참조): SH-SY5Y-세포를 포함하는 바이알을 해동시키기고, 배양 배지 (85% MEM:F12 + 15% h.i. FBS +/-30 μM GT1b) 에 최종 밀도 60,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 코팅되지 않은 96-웰 미세역가 플레이트에 6,000 세포/웰로 시딩하고, 24 시간 동안 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O₂/ 5% CO₂ 에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 배지에 신경 성장 인자 (Nerve Growth factor) (100 ng/ml) 및 아피디콜린 (Aphidicoline) (0.3 mM) +/- 30 μM GT1b 을 보충했다. 배지를 2 내지 3 일 마다 교환했다. 인큐베이션 17 일 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10^-9 내지 5.65*10^-15 M 의 농도 범위로 포함하는 신선한 배지로 교환했다. 상기 표시된 바와 같은 인큐베이션 72 시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20 mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜, 문헌 [Whitemarsh 등, (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생산된 항체 (Synaptic Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.

PC12 세포 의 배양 및 분화 (도 3 참조): PC12 세포를 포함하는 바이알을 해동시키고, 배양 배지 (85% RPMI 1640 + 10% 말 혈청 + 5% h.i. FBS +/- 30 μM GT1b) 에 최종 밀도 25,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 콜라겐 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트에 2,500 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O₂/ 5% CO₂ 에서 72 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 배지에 신경 성장 인자 (100 ng/ml) +/- 30 μM GT1b 을 보충했다. 상기 배지를 매 2 내지 3 일마다 교환했다. 인큐베이션 11 일 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10^-9 내지 5.65*10^-15 M 범위의 농도로 포함하는 신선한 배지로 교환했다. 상기 제시된 바와 같이 인큐베이션 72 시간 후, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 0,55% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜, 문헌 [Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생성된 항체 (SYNAPTIC Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.

Neuro2A 세포의 배양 및 분화 (도 4 참조): Neuro2A 세포를 포함하는 바이알을 해동하고, 배양 배지 (90% DMEM + 10% h.i. FBS +/- 30 μM GT1b) 에 최종 밀도 20,000 세포/ mL 로 재현탁시켰다. 세포를 96-웰 미세역가 플레이트에 2,000 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O₂/ 5% CO₂ 에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 배지를 무혈청 DMEM +/- 30 μM GT1b 로 교환 후 3 일간 37℃ 에서 인큐베이션했다. 이어서 배지를 0.2% BSA +/- 30 μM GT1b 및 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10^-9 내지 5.65*10^-15 M 의 농도 범위로 포함하는 신선한 무혈청 배지로 교환했다. 상기 제시된 바와 같은 72 시간의 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0) 에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜 문헌 [Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생산된 항체 (SYNAPTIC Systems SySy111111) 를 이용하여 절단 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.

NG108-15 세포 (도 5 참조) 의 배양 및 분화: SH-SY5Y 세포를 포함하는 바이알을 해동시키고, 배양 배지 (90% DMEM + 10% h.i. FBS +/- 30 μM GT1b) 에 최종 밀도 60,000 세포/mL 로 재현탁시켰다. 세포를 96-웰 미세역가 플레이트에 6,000 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 포화 수증기 분위기 하의 95% O₂/ 5% CO₂ 에서 72 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 배지에 디부티릴-cAMP (1 mM) +/- 30 μM GT1b 를 보충했다. 상기 배지를 매 2 내지 3 일마다 교환했다. 5 일의 인큐베이션 후, 배지를 보툴리눔 신경독소 유형 A 를 1.0*10^-9 내지 5.65*10^- ¹⁵M 의 범위의 농도로 포함하는 신선한 배지로 교환했다. 상기 제시된 바와 같은 인큐베이션의 72 시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 용균 완충액 (20mM Tris/HCl, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 5 U/mL 벤조나아제, pH 8.0 에서) 에 재현탁시키고, RotiLoad 1 SDS 시료 완충액과 혼합하고, 웨스턴 블랏 분석에 적용하고, 문헌 [Whitemarsh 등 (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35] 에 기재된 바와 같이 마우스에서 생성된 항체 (Synaptic Systems SySy111111) 를 이용해 SNAP-25/비절단 SNAP-25 의 비율을 결정했다.

SEQUENCE LISTING <110> Merz Pharma GmbH & Co.KGaA <120> Gangliosides for standardizing and increasing the sensitivity of cells to Botulinum neurotoxins in in vitro test systems <130> MP11612pc <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3891 <212> DNA <213> Clostridium botulinum <400> 1 atgccatttg ttaataaaca atttaattat aaagatcctg taaatggtgt tgatattgct 60 tatataaaaa ttccaaatgc aggacaaatg caaccagtaa aagcttttaa aattcataat 120 aaaatatggg ttattccaga aagagataca tttacaaatc ctgaagaagg agatttaaat 180 ccaccaccag aagcaaaaca agttccagtt tcatattatg attcaacata tttaagtaca 240 gataatgaaa aagataatta tttaaaggga gttacaaaat tatttgagag aatttattca 300 actgatcttg gaagaatgtt gttaacatca atagtaaggg gaataccatt ttggggtgga 360 agtacaatag atacagaatt aaaagttatt gatactaatt gtattaatgt gatacaacca 420 gatggtagtt atagatcaga agaacttaat ctagtaataa taggaccctc agctgatatt 480 atacagtttg aatgtaaaag ctttggacat gaagttttga atcttacgcg aaatggttat 540 ggctctactc aatacattag atttagccca gattttacat ttggttttga ggagtcactt 600 gaagttgata caaatcctct tttaggtgca ggcaaatttg ctacagatcc agcagtaaca 660 ttagcacatg aacttataca tgctggacat agattatatg gaatagcaat taatccaaat 720 agggttttta aagtaaatac taatgcctat tatgaaatga gtgggttaga agtaagcttt 780 gaggaactta gaacatttgg gggacatgat gcaaagttta tagatagttt acaggaaaac 840 gaatttcgtc tatattatta taataagttt aaagatatag caagtacact taataaagct 900 aaatcaatag taggtactac tgcttcatta cagtatatga aaaatgtttt taaagagaaa 960 tatctcctat ctgaagatac atctggaaaa ttttcggtag ataaattaaa atttgataag 1020 ttatacaaaa tgttaacaga gatttacaca gaggataatt ttgttaagtt ttttaaagta 1080 cttaacagaa aaacatattt gaattttgat aaagccgtat ttaagataaa tatagtacct 1140 aaggtaaatt acacaatata tgatggattt aatttaagaa atacaaattt agcagcaaac 1200 tttaatggtc aaaatacaga aattaataat atgaatttta ctaaactaaa aaattttact 1260 ggattgtttg aattttataa gttgctatgt gtaagaggga taataacttc taaaactaaa 1320 tcattagata aaggatacaa taaggcatta aatgatttat gtatcaaagt taataattgg 1380 gacttgtttt ttagtccttc agaagataat tttactaatg atctaaataa aggagaagaa 1440 attacatctg atactaatat agaagcagca gaagaaaata ttagtttaga tttaatacaa 1500 caatattatt taacctttaa ttttgataat gaacctgaaa atatttcaat agaaaatctt 1560 tcaagtgaca ttataggcca attagaactt atgcctaata tagaaagatt tcctaatgga 1620 aaaaagtatg agttagataa atatactatg ttccattatc ttcgtgctca agaatttgaa 1680 catggtaaat ctaggattgc tttaacaaat tctgttaacg aagcattatt aaatcctagt 1740 cgtgtttata catttttttc ttcagactat gtaaagaaag ttaataaagc tacggaggca 1800 gctatgtttt taggctgggt agaacaatta gtatatgatt ttaccgatga aactagcgaa 1860 gtaagtacta cggataaaat tgcggatata actataatta ttccatatat aggacctgct 1920 ttaaatatag gtaatatgtt atataaagat gattttgtag gtgctttaat attttcagga 1980 gctgttattc tgttagaatt tataccagag attgcaatac ctgtattagg tacttttgca 2040 cttgtatcat atattgcgaa taaggttcta accgttcaaa caatagataa tgctttaagt 2100 aaaagaaatg aaaaatggga tgaggtctat aaatatatag taacaaattg gttagcaaag 2160 gttaatacac agattgatct aataagaaaa aaaatgaaag aagctttaga aaatcaagca 2220 gaagcaacaa aggctataat aaactatcag tataatcaat atactgagga agagaaaaat 2280 aatattaatt ttaatattga tgatttaagt tcgaaactta atgagtctat aaataaagct 2340 atgattaata taaataaatt tttgaatcaa tgctctgttt catatttaat gaattctatg 2400 atcccttatg gtgttaaacg gttagaagat tttgatgcta gtcttaaaga tgcattatta 2460 aagtatatat atgataatag aggaacttta attggtcaag tagatagatt aaaagataaa 2520 gttaataata cacttagtac agatatacct tttcagcttt ccaaatacgt agataatcaa 2580 agattattat ctacatttac tgaatatatt aagaatatta ttaatacttc tatattgaat 2640 ttaagatatg aaagtaatca tttaatagac ttatctaggt atgcatcaaa aataaatatt 2700 ggtagtaaag taaattttga tccaatagat aaaaatcaaa ttcaattatt taatttagaa 2760 agtagtaaaa ttgaggtaat tttaaaaaat gctattgtat ataatagtat gtatgaaaat 2820 tttagtacta gcttttggat aagaattcct aagtatttta acagtataag tctaaataat 2880 gaatatacaa taataaattg tatggaaaat aattcaggat ggaaagtatc acttaattat 2940 ggtgaaataa tctggacttt acaggatact caggaaataa aacaaagagt agtttttaaa 3000 tacagtcaaa tgattaatat atcagattat ataaacagat ggatttttgt aactatcact 3060 aataatagat taaataactc taaaatttat ataaatggaa gattaataga tcaaaaacca 3120 atttcaaatt taggtaatat tcatgctagt aataatataa tgtttaaatt agatggttgt 3180 agagatacac atagatatat ttggataaaa tattttaatc tttttgataa ggaattaaat 3240 gaaaaagaaa tcaaagattt atatgataat caatcaaatt caggtatttt aaaagacttt 3300 tggggtgatt atttacaata tgataaacca tactatatgt taaatttata tgatccaaat 3360 aaatatgtcg atgtaaataa tgtaggtatt agaggttata tgtatcttaa agggcctaga 3420 ggtagcgtaa tgactacaaa catttattta aattcaagtt tgtatagggg gacaaaattt 3480 attataaaaa aatatgcttc tggaaataaa gataatattg ttagaaataa tgatcgtgta 3540 tatattaatg tagtagttaa aaataaagaa tataggttag ctactaatgc atcacaggca 3600 ggcgtagaaa aaatactaag tgcattagaa atacctgatg taggaaatct aagtcaagta 3660 gtagtaatga agtcaaaaaa tgatcaagga ataacaaata aatgcaaaat gaatttacaa 3720 gataataatg ggaatgatat aggctttata ggatttcatc agtttaataa tatagctaaa 3780 ctagtagcaa gtaattggta taatagacaa atagaaagat ctagtaggac tttgggttgc 3840 tcatgggaat ttattcctgt agatgatgga tggggagaaa ggccactgta a 3891 <210> 2 <211> 1296 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 2 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 580 585 590 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 595 600 605 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 610 615 620 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 625 630 635 640 Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 645 650 655 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 660 665 670 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 675 680 685 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 690 695 700 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 705 710 715 720 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 725 730 735 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 740 745 750 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 755 760 765 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 770 775 780 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 785 790 795 800 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg 1010 1015 1020 Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1025 1030 1035 Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile 1040 1045 1050 Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp 1055 1060 1065 Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu 1070 1075 1080 Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys 1085 1090 1095 Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met 1100 1105 1110 Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val 1115 1120 1125 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val 1130 1135 1140 Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr 1145 1150 1155 Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile 1160 1165 1170 Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn 1175 1180 1185 Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu 1190 1195 1200 Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser 1205 1210 1215 Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn 1220 1225 1230 Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245 Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala 1250 1255 1260 Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu 1265 1270 1275 Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu 1280 1285 1290 Arg Pro Leu 1295 <210> 3 <211> 3876 <212> DNA <213> Clostridium botulinum <400> 3 atgccagtta caataaataa ttttaattat aatgatccta ttgataataa taatattatt 60 atgatggagc ctccatttgc gagaggtacg gggagatatt ataaagcttt taaaatcaca 120 gatcgtattt ggataatacc ggaaagatat acttttggat ataaacctga ggattttaat 180 aaaagttccg gtatttttaa tagagatgtt tgtgaatatt atgatccaga ttacttaaat 240 actaatgata aaaagaatat atttttacaa acaatgatca agttatttaa tagaatcaaa 300 tcaaaaccat tgggtgaaaa gttattagag atgattataa atggtatacc ttatcttgga 360 gatagacgtg ttccactcga agagtttaac acaaacattg ctagtgtaac tgttaataaa 420 ttaatcagta atccaggaga agtggagcga aaaaaaggta ttttcgcaaa tttaataata 480 tttggacctg ggccagtttt aaatgaaaat gagactatag atataggtat acaaaatcat 540 tttgcatcaa gggaaggctt cgggggtata atgcaaatga agttttgccc agaatatgta 600 agcgtattta ataatgttca agaaaacaaa ggcgcaagta tatttaatag acgtggatat 660 ttttcagatc cagccttgat attaatgcat gaacttatac atgttttaca tggattatat 720 ggcattaaag tagatgattt accaattgta ccaaatgaaa aaaaattttt tatgcaatct 780 acagatgcta tacaggcaga agaactatat acatttggag gacaagatcc cagcatcata 840 actccttcta cggataaaag tatctatgat aaagttttgc aaaattttag agggatagtt 900 gatagactta acaaggtttt agtttgcata tcagatccta acattaatat taatatatat 960 aaaaataaat ttaaagataa atataaattc gttgaagatt ctgagggaaa atatagtata 1020 gatgtagaaa gttttgataa attatataaa agcttaatgt ttggttttac agaaactaat 1080 atagcagaaa attataaaat aaaaactaga gcttcttatt ttagtgattc cttaccacca 1140 gtaaaaataa aaaatttatt agataatgaa atctatacta tagaggaagg gtttaatata 1200 tctgataaag atatggaaaa agaatataga ggtcagaata aagctataaa taaacaagct 1260 tatgaagaaa ttagcaagga gcatttggct gtatataaga tacaaatgtg taaaagtgtt 1320 aaagctccag gaatatgtat tgatgttgat aatgaagatt tgttctttat agctgataaa 1380 aatagttttt cagatgattt atctaaaaac gaaagaatag aatataatac acagagtaat 1440 tatatagaaa atgacttccc tataaatgaa ttaattttag atactgattt aataagtaaa 1500 atagaattac caagtgaaaa tacagaatca cttactgatt ttaatgtaga tgttccagta 1560 tatgaaaaac aacccgctat aaaaaaaatt tttacagatg aaaataccat ctttcaatat 1620 ttatactctc agacatttcc tctagatata agagatataa gtttaacatc ttcatttgat 1680 gatgcattat tattttctaa caaagtttat tcattttttt ctatggatta tattaaaact 1740 gctaataaag tggtagaagc aggattattt gcaggttggg tgaaacagat agtaaatgat 1800 tttgtaatcg aagctaataa aagcaatact atggataaaa ttgcagatat atctctaatt 1860 gttccttata taggattagc tttaaatgta ggaaatgaaa cagctaaagg aaattttgaa 1920 aatgcttttg agattgcagg agccagtatt ctactagaat ttataccaga acttttaata 1980 cctgtagttg gagccttttt attagaatca tatattgaca ataaaaataa aattattaaa 2040 acaatagata atgctttaac taaaagaaat gaaaaatgga gtgatatgta cggattaata 2100 gtagcgcaat ggctctcaac agttaatact caattttata caataaaaga gggaatgtat 2160 aaggctttaa attatcaagc acaagcattg gaagaaataa taaaatacag atataatata 2220 tattctgaaa aagaaaagtc aaatattaac atcgatttta atgatataaa ttctaaactt 2280 aatgagggta ttaaccaagc tatagataat ataaataatt ttataaatgg atgttctgta 2340 tcatatttaa tgaaaaaaat gattccatta gctgtagaaa aattactaga ctttgataat 2400 actctcaaaa aaaatttgtt aaattatata gatgaaaata aattatattt gattggaagt 2460 gcagaatatg aaaaatcaaa agtaaataaa tacttgaaaa ccattatgcc gtttgatctt 2520 tcaatatata ccaatgatac aatactaata gaaatgttta ataaatataa tagcgaaatt 2580 ttaaataata ttatcttaaa tttaagatat aaggataata atttaataga tttatcagga 2640 tatggggcaa aggtagaggt atatgatgga gtcgagctta atgataaaaa tcaatttaaa 2700 ttaactagtt cagcaaatag taagattaga gtgactcaaa atcagaatat catatttaat 2760 agtgtgttcc ttgattttag cgttagcttt tggataagaa tacctaaata taagaatgat 2820 ggtatacaaa attatattca taatgaatat acaataatta attgtatgaa aaataattcg 2880 ggctggaaaa tatctattag gggtaatagg ataatatgga ctttaattga tataaatgga 2940 aaaaccaaat cggtattttt tgaatataac ataagagaag atatatcaga gtatataaat 3000 agatggtttt ttgtaactat tactaataat ttgaataacg ctaaaattta tattaatggt 3060 aagctagaat caaatacaga tattaaagat ataagagaag ttattgctaa tggtgaaata 3120 atatttaaat tagatggtga tatagataga acacaattta tttggatgaa atatttcagt 3180 atttttaata cggaattaag tcaatcaaat attgaagaaa gatataaaat tcaatcatat 3240 agcgaatatt taaaagattt ttggggaaat cctttaatgt acaataaaga atattatatg 3300 tttaatgcgg ggaataaaaa ttcatatatt aaactaaaga aagattcacc tgtaggtgaa 3360 attttaacac gtagcaaata taatcaaaat tctaaatata taaattatag agatttatat 3420 attggagaaa aatttattat aagaagaaag tcaaattctc aatctataaa tgatgatata 3480 gttagaaaag aagattatat atatctagat ttttttaatt taaatcaaga gtggagagta 3540 tatacctata aatattttaa gaaagaggaa gaaaaattgt ttttagctcc tataagtgat 3600 tctgatgagt tttacaatac tatacaaata aaagaatatg atgaacagcc aacatatagt 3660 tgtcagttgc tttttaaaaa agatgaagaa agtactgatg agataggatt gattggtatt 3720 catcgtttct acgaatctgg aattgtattt gaagagtata aagattattt ttgtataagt 3780 aaatggtact taaaagaggt aaaaaggaaa ccatataatt taaaattggg atgtaattgg 3840 cagtttattc ctaaagatga agggtggact gaataa 3876 <210> 4 <211> 1291 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 4 Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp 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gatgctttgg 3180 attagagatt ttaatatttt ttctaaagaa ttaagcaatg aagatattaa tattgtatat 3240 gagggacaaa tattaagaaa tgttattaaa gattattggg gaaatccttt gaagtttgat 3300 acagaatatt atattattaa tgataattat atagataggt atatagcacc taaaagtaat 3360 atacttgtac ttgttcagta tccagataga tctaaattat atactggaaa tcctattact 3420 attaaatcag tatctgataa gaatccttat agtagaattt taaatggaga taatataatg 3480 tttcatatgt tatataatag tgggaaatat atgataataa gagatactga tacaatatat 3540 gcaatagaag gaagagagtg ttcaaaaaat tgtgtatatg cattaaaatt acagagtaat 3600 ttaggtaatt atggtatagg tatatttagt ataaaaaata ttgtatctca aaataaatat 3660 tgtagtcaaa ttttctctag ttttatgaaa aatacaatgc ttctagcaga tatatataaa 3720 ccttggagat tttcttttga aaatgcatac acgccagttg cagtaactaa ttatgagaca 3780 aaactattat caacttcatc tttttggaaa tttatttcta gggatccagg atgggtagag 3840 taa 3843 <210> 6 <211> 1280 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 6 Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn 1 5 10 15 Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala 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ctaaagatgt tgattattta 1620 aactcttatt attatttgga agcccaaaaa ttaagtaata atgttgaaaa tattactctt 1680 acaacttcag ttgaagaagc attaggttat agcaataaga tatacacatt tttacctagc 1740 ttagctgaaa aagtgaataa aggtgttcaa gcaggtttat tcttaaattg ggcgaatgaa 1800 gtagttgagg attttactac aaatattatg aaaaaagata cattggataa aatatcagat 1860 gtatcagcca taattccata tataggacct gccttaaata taggaaattc agcattaagg 1920 ggaaacttta agcaagcatt tgcaacagct ggtgtagctt ttttgttaga aggatttcca 1980 gagtttacaa tacctgcact cggtgtattt accttttata gttctattca agaaagagag 2040 aaaattatta aaactataga aaattgttta gaacaaagag ttaagagatg gaaagattca 2100 tatcaatgga tggtatcaaa ttggttgtca agaattacta ctcgatttaa tcatataagt 2160 tatcaaatgt atgattcttt gagttatcag gcagatgcaa tcaaagctaa aatagattta 2220 gaatataaaa aatactcagg aagtgataaa gaaaatataa aaagtcaagt tgaaaattta 2280 aaaaatagtt tagatgtaaa aatctcggaa gcaatgaata atataaataa atttatacga 2340 gaatgttctg taacatactt atttaaaaat atgctcccta aagtaattga tgaattaaat 2400 aagtttgatt taaaaactaa aacagaatta attaatctta 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Clostridium botulinum <400> 9 atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat 60 attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg 120 ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca 180 ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag 240 gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga 300 gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca 360 gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc 420 caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact 480 aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcaccg ttttggatca 540 atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa ttgtatgaat 600 gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga 660 ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta 720 ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta 780 aacattatta ctagtgctca gtccaatgat atctatacta atcttctagc 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ttcatatttt 2520 aataaattct ttaagagaat taaaagtagt tcagttttaa atatgagata taaaaatgat 2580 aaatacgtag atacttcagg atatgattca aatataaata ttaatggaga tgtatataaa 2640 tatccaacta ataaaaatca atttggaata tataatgata aacttagtga agttaatata 2700 tctcaaaatg attacattat atatgataat aaatataaaa attttagtat tagtttttgg 2760 gtaagaattc ctaactatga taataagata gtaaatgtta ataatgaata cactataata 2820 aattgtatga gagataataa ttcaggatgg aaagtatctc ttaatcataa tgaaataatt 2880 tggacattcg aagataatcg aggaattaat caaaaattag catttaacta tggtaacgca 2940 aatggtattt ctgattatat aaataagtgg atttttgtaa ctataactaa tgatagatta 3000 ggagattcta aactttatat taatggaaat ttaatagatc aaaaatcaat tttaaattta 3060 ggtaatattc atgttagtga caatatatta tttaaaatag ttaattgtag ttatacaaga 3120 tatattggta ttagatattt taatattttt gataaagaat tagatgaaac agaaattcaa 3180 actttatata gcaatgaacc taatacaaat attttgaagg atttttgggg aaattatttg 3240 ctttatgaca aagaatacta tttattaaat gtgttaaaac caaataactt tattgatagg 3300 agaaaagatt ctactttaag cattaataat ataagaagca ctattctttt 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Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val 420 425 430 Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile 435 440 445 Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly 450 455 460 Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu 465 470 475 480 Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr 485 490 495 Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile 500 505 510 Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg 515 520 525 Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser 530 535 540 Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile 545 550 555 560 Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile 565 570 575 Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile 580 585 590 Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln 595 600 605 Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr 610 615 620 Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser 625 630 635 640 Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly 645 650 655 Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu 660 665 670 Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu 675 680 685 Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile 690 695 700 Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys 705 710 715 720 Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys 725 730 735 Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile 740 745 750 Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys 755 760 765 Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu 770 775 780 Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser 785 790 795 800 Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln 805 810 815 Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile 820 825 830 Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu 835 840 845 Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser 850 855 860 Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile 865 870 875 880 Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile 885 890 895 Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala 900 905 910 Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn 915 920 925 Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn 930 935 940 Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 945 950 955 960 Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile 965 970 975 Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser 980 985 990 Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala 995 1000 1005 Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe 1010 1015 1020 Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn 1025 1030 1035 Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met 1040 1045 1050 Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn 1055 1060 1065 Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr 1070 1075 1080 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro 1085 1090 1095 Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe 1100 1105 1110 Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr 1115 1120 1125 Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys 1130 1135 1140 Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr 1145 1150 1155 Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly Leu 1160 1165 1170 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser 1175 1180 1185 Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn 1190 1195 1200 Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe 1205 1210 1215 Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly 1220 1225 1230 Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu 1235 1240 1245 Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala 1250 1255 1260 Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp 1265 1270 1275 Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His 1280 1285 1290 Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr 1295 1300 1305 Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp 1310 1315

Claims

하기 단계를 포함하는, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하는 방법:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계;
이로써, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 되고,
여기서, 신경독소 폴리펩티드는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT, 또는 이들의 아형임.
하기의 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드에 대한 표준화된 감수성을 가진 유도된 다능성 줄기 세포 (IPS)-유도성 뉴런의 생성 방법:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 제공하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 배양하는 단계,
이로써 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성을 표준화하게 되고,
여기서, 신경독소 폴리펩티드는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT, 또는 이들의 아형임.
제 2 항에 있어서, 추가로 하기 단계를 포함하는 방법:
c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
d) 단계 c) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성 결정 방법:
a) 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 GT1b 를 함유하는 세포 배양 배지에서 3 시간 이상 동안 배양하는 단계;
b) 단계 a) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
c) 단계 b) 의 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런을 신경독소 폴리펩티드로 하여금 그의 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 조건 하에 GT1b 의 존재 하에 24 시간 이상 동안 배양하는 단계; 및
d) 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 상기 세포에서 결정하는 단계,
여기서, 신경독소 폴리펩티드는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H 또는 TeNT, 또는 이들의 아형임.
제 4 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들이 사용되는 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들에서 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 감수성의 표준화가, GT1b 의 부재 하에 처리된 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 대조군 회분과 비교하여 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성의 감소인 방법.
제 7 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들의 신경독소 폴리펩티드에 대한 감수성의 변동성 감소가 1.5-배 이상 또는 2-배 이상의 감소인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런이 인간 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런의 상이한 회분들이 계대배양의 수, 냉동/해동 순환 횟수, 배양 조건, 저장 시간, 성장 시간, 분화 조건 또는 이들의 조합에 있어서 상이한 방법.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 Neurobasal 배지, B27 보충물 (2%), 및 글루타민 또는 글루타맥스 (1%) 를 함유하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, GT1b 가 1 내지 300 μM 의 농도로 첨가되는 방법.
제 4 항에 있어서, 신경독소 폴리펩티드의 생물학적 활성이 면역-웨스턴 블랏 (Immuno-Western blot) 분석, SDS-PAGE 면역블랏 (Immunoblot) 분석 또는 ELISA 에 의한 신경독소-절단된 기질의 정량에 의해 결정되는 방법.
제 9 항에 있어서, 유도된 다능성 줄기 세포-유도성 뉴런이 iCell^® 뉴런 (Cellular Dynamics International 사 제조) 인 방법.
제 12 항에 있어서, GT1b 가 30 μM 의 농도로 첨가되는 방법.