KR20160111591A

KR20160111591A - 파두 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20160111591A
Application number: KR1020150036164A
Authority: KR
Inventors: 권강범; 이영래; 김미성; 김하림; 이금산; 문형철; 조동찬
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2016-09-27

Abstract

본 발명은 파두(Croton tiglium Linne) 추출물을 함유하고 있는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 파두 추출물은 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자의 발현을 억제하여 세포내 지방 축적을 막으며 또한 지방세포 분화를 억제하는 등 지방세포 수의 증가를 막으며 아울러 지방분해를 촉진함을 확인함으로써, 상기 파두 추출물이 비만 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

파두 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention and treatment of obesity comprising extracts of Croton tiglium Linne as an active ingredient}

본 발명은 파두(Croton tiglium Linne) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 비만 인구가 꾸준히 증가하고 있으며, 우리나라의 비만 인구는 32.7 %이며 미국의 경우 2000년 현재 성인 인구의 약 65 %가 과체중에 해당되고 있다. WHO 보고에 의하면 향후 10년 동안 비만 인구가 지금보다 50 % 증가할 것으로 예측하고 있다.

비만은 음식물로 섭취한 에너지와 신체활동으로 소비한 에너지 간의 불균형에 의하여 과잉의 에너지가 체지방으로 축적되는 현상이다. 일반적으로 비만은 체내에 지방 조직이 과다한 상태를 의미하며, 이러한 비만 상태가 오랜 시간에 걸쳐 지속되면 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성질환과 성인병이 유발된다. 최근 과다한 열량 섭취와 운동 부족으로 인하여 서구 선진국뿐만 아니라 우리나라에서도 비만인구가 급증하고 있으며 이는 심각한 사회문제로 대두 되고 있다.

비만은 과잉의 에너지 공급이 지방세포 크기와 수의 증가를 유발하여 체내 지방으로 축적되는 것이 주된 발생원인으로 알려져 있으며, 이 외에도 유전적 요인, 서구화된 식생활에 의한 환경적 요인, 심리적 요인, 에너지 대사 이상 등 다양한 원인이 작용한다고 알려져 있다.

전 세계적으로 비만 치료제의 개발을 위한 다각적인 측면의 연구가 진행되고 있다. 비만치료용 약물은 크게 지방흡수 억제, 지방 분해 및 열 발생 촉진, 식욕 및 포만감의 조절, 단백질 대사 저해 그리고 음식물의 섭취와 관련된 정서 조절 기전으로 나눌 수 있다. 대표적인 비만 치료제로는 오리스타트(oristat)를 원료로 하여 지방흡수를 억제하는 제니칼™(Xenical™)과 시부트라민(sibutramine)을 주원료로 교감신경계를 자극하여 식욕을 억제 시키는 리덕틸™(Reductil™)이 있다. 그러나 제니칼™의 경우 지방변, 복부 통증, 구토, 가려움증, 간 손상 등의 부작용이 보고되어 있으며, 리덕틸™의 경우는 두통, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용뿐만 아니라 심각한 심혈관계 부작용을 일으킨다는 이유로 최근 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 일고 있다. 이러한 비만치료제를 통한 약물요법 이외에도 비만을 예방하고 치료하기 위한 방법으로 음식물의 섭취를 제한하는 식이요법, 에너지 소비를 증가시키는 운동요법이 있으며, 정신요법, 행동요법, 외과요법 등도 실시되고 있다.

바람직한 비만의 치료 방법으로는 운동을 통한 에너지 소비 촉진과 부작용이 적은 비만치료용 약제를 병행하는 것이 가장 안전하고 효과적인 방법으로 제시되고 있다. 그러나 비만치료용 약제의 경우, 상기의 제니칼™과 리덕틸™의 예처럼 심각한 부작용들이 보고되고 있으며 안전성에 대한 명확한 신뢰가 뒷받침되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 인체에 대해서 비만의 우수한 효능을 나타내면서도 100 % 안전성이 보장되는 천연물 및 소재에 대한 개발이 요구되고 있다.

파두(Tiglii Semen)는 대극과(euphorbiaceae)의 상록 활엽 관목인 파두나무(Croton tiglium Linne)의 씨를 말린 것으로, 씨에는 30-45 %의 기름(파두기름)을 포함하고 있고, 기름은 팔미틴산(0.9 %), 스테아린산(0.3 %), 리놀산(19 %), 아라킨산(15 %), 올레인산(37 %), 라우린산(0.05 %), 크로톤산, 티글린산의 글리세리드로 구성되며, 설사를 일으키는 성분은 포르볼이라는 알콜의 초산, 개미산, 버터산, 티그린산 에스테르인데 기름의 2-3 %를 이루는 것으로 알려져 있으며, 씨에는 또한 18 %의 단백질, 크로토노시드, 아르기닌, 크로틴(독성단백질)이 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 파두에 관한 선행기술로써, 국제공개번호 WO 2008/093902호에는 파두의 천식에 대한 효과를 개시하고 있고, 대한민국 공개번호 제10-2009-0036250호에는 파두의 감마허피스바이러스 재활성 유도 효과를 개시하고 있으며, 대한민국 공개 특허 제1991-0018035호에는 파두의 수용성 추출물 등의 간장 보호 효과를 개시하고 있으나, 파두의 항비만 효과에 대해서는 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 항비만 활성을 갖는 천연물을 개발하기 위해 노력한 결과, 파두 추출물이 세포 독성 없이 유의적인 지방세포 분화 억제 효과 및 지방분해 효과를 나타냄으로써, 상기 파두 추출물을 비만 예방 및 치료용 조성물 및 비만 예방 및 개선용 건강기능식품 등에 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 파두(Croton tiglium Linne) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파두(Croton tiglium Linne) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 파두 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 파두(Croton tiglium Linne) 추출물은 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자로 알려진 PPARγ, C/EBPα mRNA의 발현을 억제하여 세포내 지방 축적을 막으며 또한 지방세포 분화 초기 유사분열적 클론확장(mitotic clonal expansion) 과정에 관여하는 것으로 알려진 C/EBPβ mRNA의 발현을 억제하고 지방세포 분화와 관련된 aP2, FAS, LPL mRNA 발현양을 유의적으로 억제하는 등 지방세포 수의 증가를 막으며 아울러 지방분해를 촉진함으로써, 비만 예방, 치료 및 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 OP9 세포에 대한 파두(Croton tiglium Linne) 추출물의 세포 독성 여부를 측정한 결과를 나타내는 도이다:
SCE: 본 발명의 파두 추출물 처리군.
도 2는 지방세포로 분화가 끝난 OP9 세포의 지방축적에 대한 파두 추출물의 영향을 측정한 결과를 나타내는 도이다:
ND: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 미분화 세포군;
D: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 분화 세포군;
SCE: 본 발명의 파두 추출물 처리군; 및
SCE exposure day: 본 발명의 파두 추출물 처리기간(일).
도 3은 파두 추출물의 PPARγ and C/EBPα 발현에 대한 영향을 측정한 도이다:
ND: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 미분화 세포군;
D: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 분화 세포군;
SCE: 본 발명의 파두 추출물 처리군; 및
SCE exposure day: 본 발명의 파두 추출물 처리기간(일).
도 4는 파두 추출물이 C/EBPβ 발현과 OP9 세포 증식에 미치는 영향을 측정한 도이다:
ND: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 미분화 세포군;
D: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 분화 세포군;
SCE: 본 발명의 파두 추출물 처리군; 및
SCE exposure time: 본 발명의 파두 추출물 처리시간.
도 5는 파두 추출물이 aP2, FAS, LPL mRNA 발현에 미치는 영향을 측정한 도이다:
ND: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 미분화 세포군;
D: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 분화 세포군; 및
SCE exposure day: 본 발명의 파두 추출물 처리기간(일).
도 6은 파두 추출물이 OP9 세포의 지방분해에 미치는 영향을 측정한 도이다:
D: 본 발명의 파두 추출물을 미처리한 분화 세포군;
ISO: Isoproterenol을 처리한 세포군;
ISO+H89: Isoproterenol을 처리하기 전에 H89로 전처리한 세포군;
SCE: 본 발명의 파두 추출물 처리군; 및
SCE+H89: 본 발명의 파두 추출물을 처리하기 전에 H89로 전처리한 세포군.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 파두(Croton tiglium Linne) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 파두 추출물 또는 이의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

1) 파두에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하여 파두의 추출물을 제조하는 단계; 및

4) 단계 3)의 파두 추출물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 파두 분획물을 제조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 파두는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 파두는 성숙 여부와 관계없이 파두나무(Croton tinglium Linne)의 열매를 사용 가능하고 이에 한정하지 않으나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 성숙된 열매를 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 알코올로는 C₁ 내지 C₂ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 파두 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 4 내지 6배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 파두 분획물은 파도 추출물을 물에 현탁시킨 후 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물 또는 파두 추출물에 물을 첨가한 후 교반한 다음 원심분리하여 수득한 파두 비수용성 분획물인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 분획물은 상기 파두 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 파두 추출물을 제조한 다음, 파두 추출물의 세포독성 여부를 확인한 결과, 본 발명의 파두 추출물은 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명자들은 지방세포 분화 억제에 대한 파두 추출물의 효과를 확인하기 위하여, 지방에 특이 반응을 나타내는 Oil red O 염료를 이용하여 파두 추출물의 지방 축적량에 미치는 효과를 확인한 결과, 본 발명의 파두 추출물은 지방 축척량을 현저히 억제시키는 것을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 지방세포 분화과정에는 인슐린(insulin)을 비롯한 호르몬 자극과 함께 지방 세포 유전자의 조절에 관여하는 전사인자들이 활성화되어야 하고, 이러한 과정을 통해 생성된 지방세포는 지방을 합성·저장하는 기능 외에도 각종 호르몬과 사이토카인(cytokine) 및 성장인자들을 분비하여 당 대사 및 에너지의 항상성 유지 측면에서 내분비적으로 중요한 역할을 한다. 이 과정에 대하여 작용하는 주요 조절인자로 PPARγ와 C/EBPα, C/EBPβ 및 C/EBPδ 등의 전사인자들이 알려져 있는데, C/EBPβ는 분화 유도인자에 노출된 후, 수 시간 내에 발현되어 세포 분화를 시작시키며 동시에 insulin-sensitive glucose uptake와 같은 성숙한 지방세포의 작용에 관여하는 C/EBPα와 PPARγ의 발현을 촉진시킨다. 이후 분화 후기에 접어들어 C/EBPα 및 PPARγ의 작용에 의하여 aP2, FAS 및 LPL 등의 지방세포 표지유전자 발현이 활성화되고, 분화 과정을 촉진하여 최종 단계로 진행될 수 있게 한다. 최종적으로 분화된 세포는 지방방울(lipid droplet)을 생성하고 중성지방(triglyceride)을 축적함으로써 세포의 크기가 증대되는 형태학적 변화와 함께 표지유전자 발현에 지속적으로 관여하는 생화학적인 특성을 나타낸다. 이에, 본 발명자들은 파두 추출물이 지방전사인자(adipogenic transcription factor)들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 mRNA 및 단백질 수준을 확인한 결과, 지방세포 분화에 관여하는 전사 인자로 알려진 PPARγ, C/EBPα 및 C/EBPβ mRNA의 경우, 대조군에서는 지방세포로 분화가 끝난 5일째에 mRNA 발현이 모두 현저하게 증가하였으나, 파두 추출물은 상기 전사인자를 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 파두 추출물의 지방세포 분화 관련 유전자 발현에 미치는 효과를 확인한 결과, aP2, FAS, LPL mRNA의 경우, 분화한지 5일째에 대조군에서 큰 폭으로 증가하였으나 파두 추출물을 처리한 군에서는 상기 mRNA의 발현이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 5 참조).

아울러, 파두 추출물의 세포 내 글리세롤 배출량을 측정한 결과, 본 발명의 파두 추출물은 지방 분해를 유의적으로 촉진시키고, 중성지방(triglyceride)이 분해되어 유리지방산(free fatty acid)과 글리세롤이 생성되는 과정은 PKA(protain kinase A) 신호경로를 통해 Hormone-sensitive lipase(HSL)가 인산화되는 과정에 의한 것으로 알려져 있으며, 본 발명자들은 PKA inhibitor를 처리 후 실험을 통해, 본 발명의 파두 추출물이 PKA signal을 통해 HSL 인산화에 관여하여 지방분해를 증가시키는 것을 확인하였다(도 6 참조).

따라서, 본 발명의 파두 추출물은 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자로 알려진 PPARγ, C/EBPα mRNA의 발현을 억제하여 세포내 지방 축적을 막으며, 또한 지방세포 분화 초기 유사분열적클론확장(mitotic clonal expansion) 과정에 관여하는 것으로 알려진 C/EBPβ mRNA의 발현을 억제하고 지방세포 분화와 관련된 aP2, FAS, LPL mRNA 발현양을 유의적으로 억제하는 등 지방세포 수의 증가를 막으며 아울러 지방분해를 촉진함으로써, 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 파두 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 파두 추출물 또는 이의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 파두 추출물 또는 이의 분획물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 파두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 파두 추출물 또는 이의 분획물은 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자로 알려진 PPARγ, C/EBPα mRNA의 발현을 억제하여 세포내 지방 축적을 막으며 또한 지방세포 분화 초기 유사분열적 클론확장(mitotic clonal expansion) 과정에 관여하는 것으로 알려진 C/EBPβ mRNA의 발현을 억제하고 지방세포 분화와 관련된 aP2, FAS, LPL mRNA 발현양을 유의적으로 억제하는 등 지방세포 수의 증가를 막으며 아울러 지방분해를 촉진함을 확인함으로써, 비만 예방 및 개선을 위한 건강기능식품용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품으로 식품의약품안전처장이 정한 것을 의미하나, 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 배제하는 의미로 사용된 것이 아니다.

본 발명의 파두 추출물 또는 이의 분획물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 파두 추출물 또는 이의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 파두 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일 쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 파두 추출물 또는 이의 분획물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실험예 및 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실험예 및 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실험예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 파두 추출물의 제조

한국식물추출물은행 및 해외생물소재허브센터에서 구입한 파두를 형태학적 평가를 통해 동정한 뒤, 파두 50 g을 70 % 에탄올 수용액 300 ml로 2시간 동안 가열 환류 추출하고 여과한 다음 여액을 감압 농축하여 파두의 70 % 에탄올추출물 10.64 g을 수득하였다.

< 실시예 2> 파두 분획물의 제조

<2-1> 파두 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 얻어진 파두 추출물에 증류수 100 ml를 넣고 교반하여 현탁시킨 후 24시간 동안 실온에서 방치하고, 3000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 취함으로써 파두 70 % 에탄올추출물의 비수용성 분획물 3.29 g을 제조하였다.

<2-2> 함유성분의 패턴 분석을 통한 확인

상기 실시예 <2-1>에서 얻은 분획물은 박층크로마토그래프(TLC)법 (MERCK, Silica gel 60 F₂₅₄plate)으로 함유 성분 패턴 분석을 하였다. 시료를 2.5 mg/ml의 농도로 메탄올에 용해시켜 검액을 만들고, 10 μl씩 TLC판에 점적하여 헥산(hexane) 2 : 아세톤(acetone) 1 의 용매 조건으로 전개시키고 이를 UV 254 nm에서 검출한 다음, 10 % 황산에 발색하였다. 그 결과, UV 254 nm에서 R _f 값이 0.27인 1개의 반점이 검출되었으며, 10 % 황산 발색에서는 R _f 값이 각각 0.27, 0.53, 0.63, 0.73인 네 개의 반점이 확인되었으며, 이 중 R _f 값이 0.27의 반점이 주성분임을 확인하였다.

< 실시예 3> 세포배양

OP9 세포주는 미국 세포주 은행 (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA; catalog no. CRL-2749)에서 구입해서 사용하였으며, 20 % 소태아혈청(FBS), 2 mM L-글루타민(L-glutamine), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 알파 최소필수배지(MEM-α 배지)에서 5 % 이산화탄소(CO₂₎를 함유하며, 37℃를 유지하는 세포배양기에서 배양하였다.

< 실시예 4> 지방세포 분화 유도

상기 <실시예 3>에서 배양된 OP9 세포에 대하여 지방세포로 분화를 유도하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 배양된 1.5 x 10⁵cells/ml의 OP9 세포를 2일 동안 20 % 소태아혈청(FBS), 2 mM L-글루타민(L-glutamine), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 g/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 알파 최소필수배지(MEM-α) 배지에서 배양한 후 분화를 유도하였다. 배양된 세포를 10 % 소태아혈청(FBS), 175 nM 인슐린(insulin), 0.25 μM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 2 mM L-글루타민(L-glutamine), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 알파 최소필수배지(MEM-α)에서 3일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.

< 실험예 1> 세포 독성 여부 확인

상기 <실시예 1>에서 수득한 파두 추출물의 세포 독성 여부를 조사하였다.

구체적으로, OP9 세포를 2 x 10⁵cells/ml의 농도로 96 홈판(96 well plate)에 이식한 후 10, 20, 30, 40 μg/ml 농도의 파두 추출물을 각각 처리하여 세포독성을 조사하였다. 정해진 시간 동안 파두 추출물을 노출 시킨 후 10 μl의 이지-사이톡스(EZ-CyTox) 용액(Daeil Lab Service Co., Ltd, Seoul, Korea)을 각 홈(well)에 첨가한 후 3시간 동안 37℃를 유지하는 세포배양기에 배양한 후 엘라이자 해독기(ELISA reader)( Molecular Device, USA)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 네 가지 농도로 처리한 파두 추출물은 실험개시일부터 0-2일간 및 실험개시일부터 3-5일간 부분 처리를 시행한 군과, 실험개시일부터 0-5일간 전체 처리한 군에서 모두 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 1).

< 실험예 2> 지방세포 분화에 대한 파두 추출물의 효과 확인

본 발명의 파두 추출물이 지방세포 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Oil red O 염료를 활용한 ELISA 분석으로 세포내 지방 축적량을 조사하였다.

구체적으로, 1.5 x 10⁵cells/ml의 OP9 세포를 6-홈(well) 플레이트에 이식한 후 다양한 농도의 파두 추출물을 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 0-2일간, 3-5일간 부분 처리 및 0-5일간 전체 처리한 후 지방세포로 분화를 유도하였다. 5일 동안 분화를 유도한 후 세포를 10 % 포르말린으로 20분 동안 고정시킨 후 PBS로 3번 세척하였다. 1 ml Oil red O 용액(Sigma, O0625)를 첨가한 후 60분 동안 염색시킨 후 PBS를 이용하여 3번 세척하고 건조시킨 후 이소프로판올로 지방을 염색한 Oil red O 용액을 추출하여 ELISA 분석기로 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 파두 추출물을 처리하지 않은 군은 분화가 끝난 후 세포내 지방 축적 정도가 증가하였으나, 본 발명의 파두 추출물을 부분(0-2일 또는 3-5일) 및 전체(0-5일) 처리한 세 군에서 모두 지방 축적이 억제되는 것을 확인하였다(도 2).

< 실험예 3> 파두 추출물의 지방세포 분화 조절 효과 확인

본 발명의 파두 추출물이 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자로 알려진 PPARγ, C/EBPa mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시간 역전사 효소 중합반응과 웨스턴블롯(Western blot assay)을 통해 m-RNA와 단백질 면에서 비교 확인하였다.

구체적으로, 분화가 된 OP9 cells (4.5 x 10⁵/ml)을 혈청고갈(serum starvation) 4시간 시킨 후 인슐린 100 nM, 파두 추출물 20 μg/ml을 30분 처리 후에 37℃ 배양기에서 배양하였다. 세포내 단백질은 M-PER(Mammalian Protein Extraction Reagent) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분리하였다. 단백질의 농도는 Bradford method을 사용하여 조사하였다. 샘플(20 μg)은 12 % 아크릴아마이드와 함께 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 사용하여 분리하였고, Hybond TM-polyvinylidene fluoride membranes(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 이동하였다. 각각의 멤브레인(membrane)은 2 % 소혈청 알부민 또는 5 % 탈지유를 사용하여 2시간 동안 블록킹 하였고, 일차항체는 1:2000 희석한 1 μg/ml를 4℃ 냉장고에서 오버나이트(overnight) 처리하였다. 이차항체는 HRP-conjugated IgG (1:2000 희석)를 사용하였다. 단백질 발현양은 이미지 분석기(Fuji-Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.

OP9 세포로부터 총RNA의 분리는 트리졸 시약(Trizol reagent) (Life Technologies, UK)를 이용하여 제조회사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 각각의 세포를 원심분리하여 모은 후 1000 μl RNAzol B로 용해시킨 후 200 μl 클로로포름을 첨가하여 얼음 속에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 13,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상층액 500 μl을 새로운 튜브에 옮겼다. 위 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 섞은 후 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 13,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 침전물을 75% 에탄올로 2번 세척하였다. 세척된 RNA를 건조시킨 후 DEPC가 처리된 20 μl로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

아울러, 역전사 반응(reverse transcription reaction)은 2 μg total RNA와 Prime Script TM reagent kit(perfect realtime)(TaKaRa BIOINC.)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 역전사 반응은 총RNA (2 μg), oligo d(T)primer(25 pmol), PrimeScript RT enzyme Mix I, 5X primeScript Buffer가 함유된 반응액으로 37℃에서 15분, 85℃에서 5초 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 Power SYBY Green PCR Master Mix를 이용하여 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA양은 LightCycler System software(Roche)를 이용하여 GAPDH에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다. 사용된 primer의 시퀀스는 하기 표 1에 기록하였다.

Gene	Sequence for Primers	Accession no.
GAPDH	Forward: CGTCCCGTAGACAAAATGGT(서열번호: 1) Reverse: TTGATGGCAACAATCTCCAC(서열번호: 2)	NM_008084
FAS	Forward: TGATGTGGAACACAGCAAGG(서열번호: 3) Reverse: GGCTGTGGTGACTCTTAGTGATAA(서열번호: 4)	NM_007988
aP2	Forward: AGCCTTTCTCACCTGGAAGA(서열번호: 5) Reverse: TTGTGGCAAAGCCCACTC(서열번호: 6)	NM_024406
LPL	Forward: GGACGGTAACGGGAATGTATGA(서열번호: 7) Reverse: TGACATTGGAGTCAGGTTCTCTCT(서열번호: 8)	NM 008509
PPARγ	Forward: GAAAGACAACGGACAAATCACC(서열번호: 9) Reverse: GGGGGTGATATGTTTGAACTTG(서열번호: 10)	NM_011146
C/EBPα	Forward: TTGTTTGGCTTTATCTCGGC(서열번호: 11) Reverse: CCAAGAAGTCGGTGGACAAG(서열번호: 12)	NM_007678

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 PPARγ, C/EBPα mRNA 발현 상태가 본 발명의 파두 추출물의 부분 및 전체 처리 실험군에서 파두 추출물 비처리 대조군에 비해 모두 억제되는 것을 확인하였다(도 3).

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화 초기 유사분열적 클론 확장(mitotic clonal expansion, MCE) 과정에 관여하는 것으로 알려진 C/EBPβ mRNA의 발현 및 세포 증식 상태를 조사하여, 파두 추출물에 의해 C/EBPβ mRNA 발현이 억제된 것으로 확인되었으며, 특히 C/EBPβ가 작용하는 분화 초기에 현저한 효과를 나타냈다(도 4).

따라서, 본 발명의 파두 추출물이 지방세포 분화 과정 중 세포 수의 증가를 억제하는 것을 확인하였다(도 4).

< 실험예 4> 파두 추출물의 지방세포 분화 관련 유전자 발현에 미치는 효과 확인

본 발명의 파두 추출물이 지방세포 분화와 관련된 aP2, FAS, LPL 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상기 <실험예 3>과 동일한 방법으로, OP9 세포를 수집하여 총 RNA를 분리한 후 실시간 역전사 효소 중합반응을 이용하여 상기 각 유전자의 mRNA 발현 정도를 조사하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>와 같이 분화유도된 세포에서는 지방세포 분화와 관련된 aP2, FAS, LPL mRNA 발현양이 세포 분화 후에 증가하였으나, 본 발명의 파두 추출물을 세포분화 과정 중 부분 및 전체 처리한 군에서는 상기 mRNA발현양이 모두 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 5).

< 실험예 5> 파두 추출물이 지방 분해 기전에 미치는 영향 확인

본 발명의 파두 추출물이 지방세포 내 지방 분해에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험이 끝난 OP9 세포를 수집하여 글리세롤 배출량을 조사하였고, 또한, 50 ㎛ H9(PKA inhibitor)를 3시간 전처리 한 후, 실험을 진행하여, 파두 추출물의 작용기전을 확인하였다.

구체적으로, OP9 지방 세포를 5일간 분화 후 50 uM H89(PKA inhibitor)를 3시간 전처리 한 후 이소프로테레놀 200 nM(positive control)과 파두 추출물을 각각 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml을 처리하여 12시간 후에 프리 글리세롤 시약(SIGMA) 200 ul 에 세포 배양액 50 ul를 첨가한 후 30분 동안 빛을 차단한 상태의 실온에 방치한 후, 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 상기 동일한 방법으로 파두 추출물을 각각 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml을 처리한 실험군과 이소프로테레놀 200 nM을 처리한 양성대조군을 비교하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 파두 추출물은 네 가지 농도별 실험군에서 모두 양성대조군과 대등한 수준으로 지방 분해가 촉진된 것을 확인할 수 있었으며, 지방세포 내 지방분해(lipolysis) 과정 중의 cAMP-PKA signal pathway를 통한 HSL의 인산화 과정을 방해하는 H89를 전처리하여 실험을 수행하였을 때 파두 추출물의 지방 분해 효과가 억제되는 것을 확인하였다(도 6).

<110> Industry acedemic cooperation foundation Wonkwang university <120> Pharmaceutical composition for prevention and treatment of obesity comprising extracts of Croton tiglium Linne as an active ingredient <130> 2014P-10-045 <160> 12 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 1 cgtcccgtag acaaaatggt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 2 ttgatggcaa caatctccac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS_F <400> 3 tgatgtggaa cacagcaagg 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS_R <400> 4 ggctgtggtg actcttagtg ataa 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2_F <400> 5 agcctttctc acctggaaga 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2_R <400> 6 ttgtggcaaa gcccactc 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL_F <400> 7 ggacggtaac gggaatgtat ga 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL_R <400> 8 tgacattgga gtcaggttct ctct 24 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARg_F <400> 9 gaaagacaac ggacaaatca cc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARg_R <400> 10 gggggtgata tgtttgaact tg 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPa_F <400> 11 ttgtttggct ttatctcggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPa_R <400> 12 ccaagaagtc ggtggacaag 20

Claims

파두(Croton tiglium Linne) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 파두 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 파두 추출물은 지방세포 분화 및 지방 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 파두 추출물은 cAMP-PKA signal 경로를 통해 HSL(Hormone-sensitive lipase)를 인산화시키는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
파두 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서, 상기 파두 추출물은 물, C₁ 내지 C₂ 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.