KR20240011314A

KR20240011314A - 과라나 추출물을 포함하는 지방 분화 유도 억제, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물, 약학 조성물 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR20240011314A
Application number: KR1020220088612A
Authority: KR
Inventors: 이세중; 민인선
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2022-07-19
Filing date: 2022-07-19
Publication date: 2024-01-26

Abstract

본 발명은 과라나 추출물을 포함하는 지방 분화 유도 억제, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물, 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명의 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물은 과라나 추출물을 유효성분으로 하고, 상기 과라나 추출물은 지방산 합성 효소(FAS)의 발현과 활성산소종(ROS) 발생을 감소시켜 지방 세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물, 약학 조성물 및 건강기능식품은 지방 전구 세포의 분화를 억제하고 혈중 지질의 농도를 낮추며, 지방 세포의 크기를 유의적으로 감소시켜 체중의 증가를 막는 항비만 효과가 있다.

Description

과라나 추출물을 포함하는 지방 분화 유도 억제, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물, 약학 조성물 및 건강기능식품 {Composition containing guarana extract for inhibiting fat synthesis and plasma cholesterol production and Phamaceutical composition and health functional food containing the same}

본 발명은 과라나 추출물을 포함하는 지방 분화 유도 억제, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물, 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

비만은 만성적으로 섭취하는 영양분에 비해 에너지 소비가 적어 지방조직이 과잉 축적된 상태를 말하며 단순한 미용상의 문제가 아닌 하나의 질병으로 인식되고 있다. 특히 비만의 위험성은 용모 손상 (Disfigurement), 불편 (Discomfort), 장애 (Disability), 질병 (Disease), 죽음 (Death) 5D로 표현되며 당뇨병, 지방간, 심혈관질환, 고지혈증, 호흡곤란 등 다양한 합병증이 수반되고 있다.

최근 과다한 열량 섭취와 운동 부족으로 인하여 서구 선진국뿐만 아니라 우리나라에서도 상기 질병의 위험성이 높은 비만인구가 급증하고 있으며 이는 심각한 사회문제가 되고 있다. 또한 비만은 과잉의 에너지 공급이 지방세포 크기와 수의 증가를 유발하여 체내 지방으로 축적되는 것이 주된 발생원인으로 알려져 있으며, 이 외에도 유전적 요인, 서구화된 식생활에 의한 환경적 요인, 심리적 요인, 에너지 대사 이상 등 다양한 원인이 작용한다고 알려져 있다.

이에 따라 유기농 및 천연물을 기반으로 하여 지방 흡수와 생성을 조절하는 다이어트 식품의 개발이 증가하는 추세지만 대부분 지방의 생화학적 대사를 고려하지 않고 단순히 배설을 촉진 시킴으로써 체중을 감소시키는 제품이며 복부팽만, 설사, 갈증 등 부작용을 수반하고 신체 에너지 발생 대사를 떨어뜨릴 뿐만 아니라 오히려 위장관 건강에 있어 장애를 일으킬 수 있는 한계점이 있다. 따라서 지방 전구 세포의 분화와 지방 합성의 신호 전달 기작을 규명하고 이를 제어함으로써 새로운 지방의 생화학적 대사를 조절할 뿐만 아니라 에너지를 함께 공급해줄 수 있는 식품 소재를 개발하는 것이 근본적인 다이어트 제품개발이 필요한 상황이다. 종래에는 가르시니아 캄보지아 등 기능성 원료로 인정 받은 원료를 이용하여 식품 개발 업체들이 다양한 제품들을 선보이고 있다.

한편 과라나(Guarana, 학명: Paullinia cupana) 또는 구아라나는 브라질 아마존 분지 원산의 무환자나무과 폴리니아 속의 덩굴식물이다. 과라나는 피로회복, 혈액순환, 뇌 활동을 촉진시키는 식물의 열매이며, 커피의 약 3배에 달하는 카페인을 함유하고 있지만 과라나에 함유된 식물성 카페인은 일반 커피나 홍차와는 달리 신경을 자극하지 않는 것이 특징이다. 그러나 지방 전구 세포 분화 및 지질 합성에 있어서 과라나의 효과는 보고된 바 없고, 과라나가 지방 전구 세포 분화를 조절하는 작용 기작에 대해서는 연구되지 않았다.

과라나를 소재로 하는 선행 기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허 제10-0826863호에는 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 함유하는 녹차 추출물, 콜레우스 포르스콜리이 추출물, 베툴라알바 추출물 및 구아라나 또는 예르바 마테 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관하여 기재되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2011-0098271호에는 나문재, 작설차, 백출, 감초, 홍경천, 하수오, 산사자, 토사자, 오미자, 알로에 아보레센스 분말, 과라나 추출 분말, 대두단백펩타이드 분말, 곡물효소 분말 및 자몽종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 조성물에 관하여 기재되어 있다.

그러나 상기 선행 문헌들을 살펴보면, 제10-0826863호에는 체중 변화, 체지방 감소, 트리글리세라이드 감소 등 주로 비만에 초점을 둔 실험만을 수행하였으며, 제10-2011-0143224호 역시 체중 변화 등 비만에 초점을 둔 실험만을 수행하였음을 알 수 있다.

이에 본 발명자들은 지방 전구 세포 분화 및 지질 합성에 있어서 과라나의 효과, 지방 전구 세포 분화와 관련한 과라나의 체중감량 및 비만 개선 효과에 따른 다이어트 보조제의 가능성을 연구하여 지방 합성과 혈장 콜레스테롤 생성을 억제하는 과라나 추출물, 이를 포함하는 조성물을 개발하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0826863호 대한민국 공개특허 제10-2011-0098271호

본 발명은 과라나 추출물을 포함하는 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물을 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.

본 발명은 과라나 추출물을 포함하는 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것을 다른 기술적 해결과제로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여,

과라나 추출물을 유효성분으로 하고, 상기 과라나 추출물은 지방산 합성 효소(FAS)의 발현과 활성산소종(ROS) 발생을 감소시켜 지방 세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서,

상기 과라나 추출물은 지방 세포 분화 기전에 있어서, AKT(ser/thr kinase AKT), mTOR(mechanistic target of rapamycin) 및 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 중 어느 하나 이상의 경로를 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서,

상기 과라나 추출물은 카페산(caffeic acid), 테오필린(theophylline), 테오브로민(theobromine) 및 프로시아니딘(procyanidin)을 유효물질로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서,

상기 과라나 추출물의 농도는 10 ~ 100 μg/mL인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서,

상기 조성물은 콜레스테롤 및 중성지질을 감소시켜 혈중 지질의 농도를 낮추는 것을 특징으로 한다.

상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여,

상기 조성물에 약학적으로 허용가능한 첨가제를 첨가한 약학 조성물을 제공한다.

상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여,

상기 조성물을 포함하는, 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물, 약학 조성물 및 건강기능식품은 지방 전구 세포의 분화를 억제하고 혈중 지질의 농도를 낮추며, 지방 세포의 크기를 유의적으로 감소시켜 체중의 증가를 막는 항비만 효과가 있다.

도 1은 과라나의 유효 성분을 규명해낸 도이다.
도 2는 지방분화제가 유도한 지방 전구 세포 분화에 대한 과라나의 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 3은 지방분화제가 유도한 활성산소종(ROS) 생산에 대한 과라나의 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 4는 지방분화제가 유도한 지방 전구 세포 분화 기전에 있어서 신호전달자들 (AKT, mTOR, PPARγ)의 활성에 대한 과라나의 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 5는 고지방식이로 유도한 동물비만모델에서 과라나의 항비만 효과를 나타내는 도이다.
도 6은 고지방식이로 유도한 동물비만모델에서 혈장 지질 농도에 대한 과라나의 혈액학적 조절 효과를 나타내는 도이다.
도 7은 고지방식이로 유도한 동물비만모델에서 지방 세포 분화 기전에 있어서 신호전달자들(AKT, mTOR, PPARγ, FAS)의 활성에 대한 과라나의 억제 효과를 나타내는 도이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise,comprises, comprising)이라는 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 반응, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 반응, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물"은 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 과라나 추출물은 추출 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제 과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유효성분으로 하는"이란, 상기 과라나 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 과라나 추출물을 유효성분으로 하고, 상기 과라나 추출물은 지방산 합성 효소(FAS)의 발현과 활성산소종(ROS) 발생을 감소시켜 지방 세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 과라나 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 과라나 추출시, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류추출법, 상온 추출법, 또는 초음파 추출법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한 과라나 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 이용될 수도 있다.

지방 합성과 관련하여 본 발명의 과라나 추출물은 지방산 합성 효소의 발현과 활성산소종의 발생을 감소시켜 지방 세포 분화를 억제한다.

지방산 합성 효소의 발현 억제와 관련하여, 지방산 합성 효소(fatty acid synthesis)는 지질 대사 효소의 발현을 활성화 시키는데, 본 발명의 과라나 추출물은 지질 분화 대사 효소의 발현을 억제함으로써 지방 세포와 지질 반응 형성을 제어할 수 있다.

또한 활성산소종 발생 억제와 관련하여, 지방 세포 분화에 따라 활성산소종이 증가하게 되는데, 본 발명의 과라나 추출물은 지방 세포 분화에 의한 활성산소종의 발생을 유의적으로 억제할 수 있다.

즉, 과라나 추출물이 지방산 합성 효소(FAS)의 발현과 활성산소종(ROS) 발생을 감소시켜 지방 세포 분화를 억제함에 따라 본 발명의 과라나 추출물을 유효성분으로 하는 조성물은 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용으로 작용할 수 있다.

또한 본 발명의 과라나 추출물은 지방 세포 분화 기전에 있어서, AKT(ser/thr kinase AKT), mTOR(mechanistic target of rapamycin) 및 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 중 어느 하나 이상의 경로를 억제하는 것을 특징으로 한다.

지방 세포는 전구 세포에서 지방 세포로 분화되고, 지방 세포에서 지방 합성이 증가하면서 지방 조직이 증가하게 된다. 따라서 지방 전구 세포에서 지방 세포로 분화를 촉진하는 인자들의 발현이나 작용을 억제하거나 지방 전구 세포 분화 기전의 신호전달체계를 조절하여 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤의 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 조성물은 과라나 추출물을 유효성분으로 하되, 과라나 추출물은 AKT, mTOR, PPARγ가 관여된 경로를 억제할 수 있다.

AKT는 지방 세포 분화 주기에 세포 증식에 관여하는 인자이며, mTOR은 지방 세포 대사과정의 중심적인 조절자로 신호전달물질인 AKT의 인산화 및 활성화를 조절한다. PPARγ는 지방 세포에서 나타나는 특이적인 전사인자로서 전구 지방 세포에서 지방 세포로 분화 시 adipogenic protein 발현을 유도한다. 상기 경로의 발현을 제어하여 지방 세포 분화를 억제함에 따라 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤의 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 과라나 추출물은 카페산(caffeic acid), 테오필린(theophylline), 테오브로민(theobromine) 및 프로시아니딘(procyanidin)을 유효물질로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 유효물질은 식물성 폴리페놀 성분으로 항산화 효과를 가지거나 에너지 소비를 증가시키거나 지방 분해를 자극하고 지방 생성을 억제시키는 효과를 가진다.

본 발명의 조성물에 포함된 과라나 추출물의 농도는 10 ~ 100 μg/mL인 것을 특징으로 한다. 과라나 추출물의 농도가 10 μg/mL 미만인 경우 지방 전구 세포 분화 억제 효과가 미미하고, 100 μg/mL 초과인 경우 예기치 못한 세포 손상이 유도될 수 있어 바람직하지 못하다.

또한 본 발명의 조성물은 콜레스테롤 및 중성지질을 감소시켜 혈중 지질의 농도를 낮추는 것을 특징으로 한다.

혈중 콜레스테롤은 총콜레스테롤, 유리 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 등이 있고, 중성 지방은 트리글리세라이드, 유리 지방산 등으로 확인할 수 있다. 고지방식이를 진행할 경우 상기 혈중 콜레스테롤과 중성지방은 증가하게 되는데, 본 발명의 과라나 추출물은 콜레스테롤 및 중성 지방의 수준을 감소시킬 수 있다.

나아가 본 발명의 조성물은 간 독성과 관련된 아미노전이효소(ALT)와 아스파테이트 아미노전이효소(AST)의 수치도 낮추며 간 독성을 개선할 수도 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 조성물에 약학적으로 허용가능한 첨가제를 첨가한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 담체, 부형제 또는 매질(medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

여기서, 본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥, 복강, 근육, 국소도포, 첩포 및 이온토포레시스(iontophoresis)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 유효성분으로서 상기 과라나 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.

상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수있다.

본 발명의 건강기능식품이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 과라나 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이하의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 이에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다.

1. 실험 재료

1) 과라나 에탄올 추출물 제조

본 발명의 과라나 에탄올 추출물은 과라나 분말 무게의 10 배수에 해당하는 에탄올을 첨가하여 48 시간 실온에서 침지하였다. 추출액을 No 2.여과지(Adventec Co.Ltd,Tokyo,Japan)로 여과하여 농축한 후 농축액을 동결건조기 FD8518(IlshinBioBase Co.Ltd. korea)을 이용하여 동결건조하여 분말화시킨 후 -20 ℃ 이하에서 냉동보관하면서 실험에 사용하였다.

2) 세포배양

마우스 유래 지방전구세포(preadipocyte, 3T3-L1)는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, GE Healthcare, Logan, UT, USA) 배지에 10 % Bovine calf serum (BCS), 1 % penicillin 및 streptomycin을 혼합한 후 37 ℃와 5 %의 CO₂ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.

3T3-L1 세포의 분화는 1 % penicillin 및 streptomycin과 10 % fetal bovine serum (FBS)가 함유된 DMEM에서 IBMX(500 μM), DEX(1 μM), 인슐린(1.5 μg/mL) 및 Rosiglitazone(1 μM)가 혼합된 배지에 의해 유도되었다. 1 % penicillin/streptomycin과 10 % FBS 및 인슐린(1 μM)이 첨가된 유지 배지는 2 일마다 교체되었으며 세포는 8 일째에 성숙한 지방세포로 완전히 분화되었다.

2. 실험 방법

1) 고성능 액체크로마토그래피(UPLC)

고성능 액체크로마토그래피(UPLC)는 Waters ACQUITYTM ultra performance LC system (USA)을 사용하였으며, Waters ACQUITYTM photodiode array detector(PDA)와 HPLC 컬럼은 Waters ACQUITYTM BEH C18 column (1.7 ㎛, 2.1×100)을 사용하였고, software는 Empower를 사용하였다. Column의 온도는 실온에서 분석하였다.

PDA의 분석 파장은 Caffeic acid은 254 nm, Theophylline은 285 nm, Procyanidin A2은 310 nm, Theobromine은 330 nm에서 분석하였다. 이동상으로는 0.1 % Formic acid를 함유한 아세토니트릴과 물의 혼합액을 사용하였으며, 아래의 조건으로 분석하였다. 시료는 2 ㎕를 주입하였으며, 유속은 0.4 ㎖/min이었다. 분석결과로, 머무름 시간에 의해 정성확인을 하였으며, 피크 면적법으로 정량하였다.

실험에 사용된 표준품은 ChemFaces사(China)의 제품을 구입하여 사용하였다. 표준품(Theophylline, Theobromine, Procyanidin A2, Caffeic acid)들을 적당량 정밀하게 달아, 각각 Methanol 녹여서 ㎖당 1 mg을 함유하는 표준원액을 만들고 위 표준원액 적당량을 정확하게 취하고, Methanol로 ㎖ 당 12.5, 25, 50, 100 ㎍의 함유되도록 희석하여, 표준액으로 하였다. 표준곡선의 결정계수(R2) 값은 위 표준물질 모두에서 0.999 이상이었다. 정량용 검액은 시료를 균질하게 혼합하여 0.5 g을 정밀하게 달아, 70 % Methanol 10 ㎖을 첨가하여 1시간 초음파 추출하였다. 위 검액을 공경 0.2 ㎛이하의 멤브레인 필터로 여과해 검액으로 하였다.

2) 세포 독성

과라나 추출물을 처리한 3T3-L1 세포의 생존율은 EZ-CYTOX 세포 생존율 키트(Dail-Lab Service, Seoul, Korea)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 세포를 96 well cell culture plate에서 배양하고 과라나와 함께 배양하였다. EZ-CYTOX 마스터 믹스를 10 μL/well 추가하고 30분 동안 배양하였다. 세포 생존율은 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기(SPARK, Seestrasse, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 분석되었다.

3) 면역 형광 분석

면역형광 분석을 위해 3T3-L1 세포를 차가운 PBS로 2 회 세척하고 4 % Paraformaldehyde에 10 분 동안 고정하였다. 그 다음 0.1 % Triton X-100에서 5 분 동안 투과화하고 실온에서 5 % normal goat serum(NGS)에서 30 분 동안 차단한 뒤 세포를 4 ℃에서 밤새 1차 항체로 염색하였다. 10 분마다 PBS로 3번 헹군 후, 세포를 Alexa 488-conjugated goat anti-rabbit 및 anti-mouse IgM(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)과 함께 배양하였고 5 % NGS 내 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용하여 2 시간 동안 대조염색을 하였다. 10 분마다 PBS로 3 회 세척한 후, 샘플을 슬라이드에 장착하고 400x 대물렌즈가 있는 Olympus FluoView™ 300 공초점 현미경으로 시각화하였다(UPLXAPO40X, Olympus).

4) 웨스턴 블롯 분석

세포내 신호전달 경로와 관련된 단백질의 발현 및 인산화는 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. RIPA 용해 완충액(ATTO Corp., Tokyo, Japan)으로 추출된 3T3-L1 세포의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 결정되었다. 동일한 양의 단백질(20 μg)을 6-12 % sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)으로 분해하고 polyvinylidene fluoride(PVDF) 막으로 옮겨 멤브레인을 TBST 용액[Tween-20(0.05 %), 10 mM Tris-HCl(pH 7.6) 및 150 mM NaCl]으로 세척하고 탈지유(5 %)로 30분 동안 차단한 다음 4 ℃에서 밤새 1차 항체로 배양하였다. 그런 다음 각 멤브레인을 horseradish peroxidase(HRP)가 결합된 이차 항체와 함께 2 시간 동안 배양하였다. 단백질 밴드를 polyvinylidene fluoride 막으로 옮기고 Chemi Doc™ XRS + System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 통해 검출하였다 밴드 강도는 Scion 이미징 소프트웨어(Scion Image Beta 4.02, Frederick, MD, USA)를 사용하여 정량화되었다.

5) mRNA추출 및 실시간 유전자 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-Time RT-PCR)

mRNA의 분석을 위해 세포 내의 RNA를 NucleoSpin® RNA Plus kit 21 (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA)를 사용하여 추출하였다. ReverTra Ace qPCR RT Master Mix kit (TOYOBO, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.

하기 표 1(PCR primer sequences)에 기재된 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시킨 후 뒤 LightCycler 96 System(Roche, Basel, Switzerland)과 AccuPower 2×Greenstar qPCR Master mix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 mRNA 발현 수준을 정량화하였다.

PCR 열 순환 조건은 95 ℃에서 5 분 동안 pre-denaturation을 하고, 45 cycle 동안 95 ℃에서 15 초 denaturation, 60 ℃에서 30 초 annealing, 72 ℃에서 30 초간 extension을 진행하는 것이다. 결과는 β-actin의 발현량에 대한 상대적인 발현량으로 계산하였다.

Gene	Identification	Primer sequence, 5`-3`
FAS	Forward	AGCACTGCCTTCGGTTCAGTC
FAS	Reverse	AAGAGCTGTGGAGGCCACTTG
β-actin	Forward	AGCCATGTACGTAGCCATCC
β-actin	Reverse	CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA

6) 오일레드오 염색

지방 생성 과정에서 과라나 추출물이 지질 축적에 미치는 영향을 알아보기 위해 3T3-L1 세포를 8 일간 배양하면서 과라나 추출물을 1 μg/mL 농도로 처리하였다. 상온에서 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 후 1 시간 동안 4 % Formaldehyde로 고정하였다. 오일레드오 용액(BioVision, Mountain View, CA, USA)으로 염색한 후 과량의 염색 시약을 인산염 완충 식염수로 세척한 후 완전히 건조하였다. 염색된 지질 방울을 공초점 현미경(Olympus America Inc., Center Valley, PA, USA)으로 관찰한 후 Isopropanol로 추출하여 정량화하였다.

7) 세포 내 활성 산소량 측정

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate(CM-H₂DCFDA)를 사용하여 세포 내 활성 산소량을 측정하였다. 지방 전구세포에 지방 분화 배지와 과라나 추출물을 동시에 처리한 후 10 mM의 CM-H₂DCFDA를 30 분 동안 처리하고 차광 된 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 fluorescent microplate reader (SPARK, Seestrasse, Mannedorf, Switzerland)로 방출 파장(485 및 535 nm)을 측정하였다.

8) 비만 마우스 모델

모든 동물 시술은 국립보건원의 동물 인도적 처우 지침에 따라 대구한의대학교 동물연구소 동물관리위원회의 승인을 받아 진행되었으며, 모든 실험 절차는 대구한의대학교로부터 승인을 받았다. 4주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다.

C57BL/6J 마우스는 5주 동안 개별 케이지에서 12/12시간 인공 명암 주기 및 23 ± 2℃온도로 유지되었다. 1주일 동안 순응시킨 후, C57BL/6J 마우스를 정상 식이 단독군, 고지방식이군, 고지방식이 + 과라나군, 정상 식이 + 과라나군으로 무작위로 나누었다. 과라나(10 mg/kg)는 피딩 니들 카테터를 사용하여 격일로 투여되었고, 생쥐의 음식 섭취량과 체중을 격일로 측정하였다.

9) 혈청 내 생화학적 지표 분석

지방 생성 과정 헤파린 혈액 튜브에 수집된 혈액을 원심분리기를 사용하여 4 ℃에서 15 분 동안 5000xg에서 원심분리하였다. 분리된 상층액(혈청)은 사용하기 전까지 -70 ℃에서 보관되었다.

T-CHO(Total cholesterol), CHO-Ester(Cholesteryl ester), Free-CHO(Free cholesterol), TG(Triglyceride), LDL(Low-density lipoprotein), HDL(High-density lipoprotein), FFA(Free fatty acid) 혈청 수준은 DoGen (Seoul, Korea)에서 구매한 키트를 사용해서 측정하였다. 혈청 효소 글루타메이트 옥살로 아세테이트 트랜스아미나제/글루타메이트 피루브산 트랜스아미나제(GOT/GPT)는 비색 분석 키트(Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였다.

10) 조직학적 분석

생쥐의 간 조직과 백색 지방 조직을 절개하여 10 % Paraformaldehyde에 고정하고 O.C.T. 화합물(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)에 넣어 -70 ℃에서 보관한 후, 냉동절편기를 사용하여 샘플을 간 조직의 경우 4 μm, 백색 지방 조직의 경우 10 μm의 두께로 동결 절편으로 절단하고 장착했다.

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 SuperFrost Plus 슬라이드(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)로 덮은 염색된 조직을 Olympus FluoView™ 300 공초점 현미경(UPLXAPO40X, Olympus)으로 시각화하였다.

11) 통계 분석

데이터는 평균값 ± 표준 오차 (SE)로 표현하였다. 통계적 유의성은 ANOVA에 의해 결정되었으며, 일부 경우에는 SPSS에서 Bonferroni Dunn 테스트를 사용하여 대조군과 치료 수단을 비교하였다.

이하, 각 실험에 대한 내용을 각 도면을 참고하여 설명하고자 한다.

3. 실험 결과

<실험예 1> 과라나의 유효 성분 규명

도 1의 A 및 B는 과라나(Guarana) 추출물의 항산화제 함량 및 구성을 조사한 결과이다.

결과에 따르면, 과라나 추출물이 다량의 식물성 폴리페놀 성분인 카페산(caffeic acid), 테오필린(theophylline), 테오브로민(theobromine), 및 프로시아니딘(procyanidin)이 각각 17.96±0.518, 19.391±0.326, 9.85±0.869, 그리고 38.373±0.305 mg/kg이 함유함을 알 수 있었다. 각 화합물의 함유량을 하기 표 2에 기재하였다.

	unit:mg/kg
화합물	Guarana Ethanol extract
화합물	Area(mV×sec)	Height(mm)	Content(mg/L)
Caffeic acid	125766	62544	17.960±0.518
Theophylline	35949	12278	19.391±0.326
Theobromine	46059	15359	9.856±0.869
Procyanidin A2	20131	6160	38.373±0.305

도 1 및 표 2의 결과를 참고하면, 카페산은 에너지 소비를 증가시키는 물질로, 테오필린, 테오브로민, 및 프로시아니딘은 지방 분해를 자극하고 지방 생성을 억제시키는 유효물질로 작용하며, 상기 물질을 포함하는 과라나 추출물은 비만을 개선, 예방, 개선에 영향을 줄 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 지방 전구 세포 분화 억제

지방분화제를 3T3-L1 지방 전구 세포 (Preadipocyte)에 처리한 후 지방 분화 및 과라나의 지방 분화 억제 효과를 분석하였다.

도 2의 A에서는 지방분화제가 3T3-L1 세포에서 6 일 이후부터 지방 분화를 유도함을 확인하였다. 과라나의 지방 분화 억제 효과를 분석하기 위해 과라나를 1, 10, 100 μg/mL의 농도로 24 시간 동안 처리하였고, 과라나 10 μg/mL 이상의 농도부터 지방분화제에 의해 유도된 세포내 지질 방울 생성이 억제되는 효과가 있음을 확인했다(도 2B 및 도 2C). 세포 손상도 유도되지 않았다.

한편, 지방산 합성 효소(FAS, fatty acid synthesis)는 지방 생성을 조절하며 지질 대사 효소의 발현을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 도 2의 D와 E를 참고하면, FAS는 지방분화제 처리후 6 일부터 활성되었으며 과라나 처리에 의해 그 활성이 억제됨을 알 수 있다. 또한 FAS의 mRNA 발현 수준도 과라나 처리에 의해 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다(도 2F).

즉, 본 발명의 과라나 추출물은 지방분화제로 인한 지질 분화 대사 효소의 발현을 억제함으로써 지방 세포와 지질 반응 형성을 제어하는 물질이라는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> 활성산소종(ROS) 생산 억제

도 3은 지방분화제가 유도한 활성산소종(ROS) 생산에 대한 과라나의 억제 효과를 나타내는 도이다.

도 3을 참고하면, 3T3-L1 세포를 지방분화제에 노출시키고, 활성산소종(ROS) 표지 시약인 형광 염색제, 2′, 7-dichlorofluorescein diacetate(CM-H₂DCFDA)를 처리함에 따라 15분 이후부터 활성산소종(ROS)이 유의적으로 증가하는데(도 3의 A), 상기 세포에 10 μg/mL의 과라나 추출물을 처리하는 경우 지방분화제에 의한 활성산소종(ROS) 발생이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 3의 B와 C).

상기 과라나 추출물의 지방분해 억제 효과가 항산화 효과와 매개됨을 확인하기 위하여, 활성산소가 지방 전구 세포의 분화 기전에 어떤 영향을 주는지 확인하였다. 항산화제 표준품인 N-acetylcysteine(NAC)를 10μM 전처리하고 지방분화제를 처리한 결과와 비교하였다. 도 3의 D를 참고하면, 오일레드오 염색 결과 지방분화제가 유도한 지방 분화는 항산화제(NAC)에 의해 억제되었고, 도 3의 E를 참고하면, FAS의 mRNA 발현 수준도 항산화제(NAC)에 의해 감소되었다.

이를 통해 활성산소 발생을 억제하면서 지방 분화를 억제할 수 있고, 과라나 추출물 또한 세포적 항산화 효과에 매개하여 지방분화를 억제하는 효과를 가짐을 확인하였다.

<실험예 4> 신호전달자(AKT, mTOR, PPARγ) 활성 억제

활성산소종(ROS)의 하위 신호전달기전을 알아보기 위해 추가적으로 실험을 진행했다. 도 4는 지방분화제가 유도한 지방 전구 세포 분화 기전에 있어서 신호전달자들(AKT, mTOR, PPARγ)의 활성에 대한 과라나의 억제 효과를 나타내는 도이다.

도 4a의 A 및 B를 참고하면, 30분간 지방 분화제를 처리함에 따라 지방 분화 기전 신호전달자인 ser/thr kinase AKT(AKT) 및 mechanistic target of rapamycin(mTOR)의 인산화는 증가하였다. 이 때 과라나 추출물을 처리하면 AKT와 mTOR의 인산화는 억제됨을 확인하였다.

또한 도 4a의 C 및 D를 참고하면, 지방분화제의 처리가 지방 분화 전사인자 단백질인 peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)의 인산화를 2시간 동안 증가시켰으나, 과라나 추출물의 처리에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. 과라나에 의해 억제되는 PPARγ의 발현 변화를 형광현미경으로 관찰한 결과를 도 4a의 E에서 나타내었다.

상기 AKT, mTOR, PPARγ의 활성이 지방 세포 분화 기전에 포함되는지를 확인하기 위해서 상기 세포를 10 μM의 AKT 억제자(MK-2206), mTOR 억제자(Rapamycin) 및 PPARγ 억제자(GW9662)에 노출시켰다. 도 4b의 F, G, H를 참고하면, 지방분화제가 유도한 세포내 지질 방울 형성은 위 억제자들에 의해 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있다. 이를 통해 지방분화제가 유도한 지방 전구 세포 분화는 AKT, mTOR 및 PPARγ의 활성을 통해 유도됨을 알 수 있다.

즉, AKT, mTOR 및 PPARγ의 활성을 통해 지방 전구 세포는 분화가 유도되는데, 본 발명의 과라나 추출물은 AKT, mTOR 및 PPARγ의 활성을 억제하여 지방 전구 세포와 지방 분화를 억제하는 효과를 가짐을 확인하였다.

<실험예 5> 고지방식이 동물비만모델의 항비만 효과

과라나의 항비만 효과를 규명하기 위해 5주 동안 동물비만모델 쥐(C57BL/6J)의 몸무게와 먹이 섭취량을 측정하였다. 5주 동안 고지방식이(High fat diet, HFD)를 섭취하였을 때 쥐 체중(Body weght)이 3주 부터 정상식이(Normal diet, ND)군에 비해 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

도 5는 고지방식이로 유도한 동물비만모델에서 과라나의 항비만 효과를 나타내는 도이다.

도 5의 A를 참고하면, 10 mg/kg의 과라나 추출물을 처리함에 따라 HFD에 의해 유도된 체중 증가가 억제되었다. 한편 도 5의 B를 참고하면, 식이섭취율(Food intake)에 있어서는 HFD군과 HFD+Guarana군의 유의적인 차이가 발견되지 않았다. 이와 같은 결과는 식이섭취율은 비슷하지만 과라나 추출물이 고지방식이로부터 유도된 체중의 증가를 막는다는 것을 의미하며, 이를 통해 과라나 추출물의 항비만 효과를 확인할 수 있었다.

또한 도 5의 C, D, E를 참고하면, 간(Liver)의 무게는 HFD와 HFD+Guarana군의 차이가 보이지 않았지만(C), 과라나 추출물의 섭취에 따라 후복막 백색 지방 (Retroperitoneal WAT)(D) 및 부고환 지방(Epididymal WAT)(E)의 무게는 유의적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

종합적으로 이와 같은 결과를 통해 5주간의 10 mg/kg의 과라나 추출물의 섭취에 따라 체중 및 백색지방의 무게를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 6> 고지방식이 유도 동물비만모델의 혈장 지질 농도 조절

과라나 추출물의 혈중 지질 개선 효과를 규명하기 위해 동물비만모델의 혈장을 분석하였다. 도 6은 고지방식이로 유도한 동물비만모델에서 혈장 지질 농도에 대한 과라나의 혈액학적 조절 효과를 나타내는 도이다.

도 6의 A 내지 E를 참고하면, 고지방식이만 섭취한 HFD군은 총콜레스테롤 (Total cholesterol,T-CHO)(A), 유리 콜레스테롤 (Free cholesterol, Free-CHO)(B), 콜레스테롤 에스테르(Cholesteryl ester, CHO-Ester)(C), 트리글리세라이드(Triglyceride, TG)(D), 유리 지방산(Free fatty acid, FFA)(E) 수준이 모두 증가했으나 10 mg/kg 과라나 추출물을 섭취한 경우 혈중 콜레스테롤 수준의 증가가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

마찬가지로 도 6의 F, G를 참고하면, HFD군에서 증가한 저밀도 지단백 콜레스테롤(Low-density lipoprotein, LDL) 수준(F)은 과라나 추출물의 섭취로 감소되었고, HFD군에서 감소된 고밀도 지단백 콜레스테롤(High-density lipoprotein, HDL) 수준(G)은 과라나 추출물의 섭취로 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.

이와 같은 결과는 과라나의 섭취가 비만의 원인이 되는 콜레스테롤 및 중성 지방의 수준을 감소시킨다는 것을 시사하며, 이것은 과라나 추출물의 항고지혈증 효과를 뒷받침한다.

또한 도 6의 H, I를 참고하면, 간 질환의 유무 및 간 독성을 추측하는 아미노전이효소(Alanine aminotransferse, ALT)와 아스파테이트 아미노전이효소(Aspartate aminotransferase, AST)의 수치 모두 과라나 추출물을 섭취하는 경우 HFD군에서 증가된 수치가 유의적으로 감소됨을 확인하였다.

즉, 본 발명의 과라나 추출물은 총콜레스테롤, 유리 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 트리글리세라이드, 유리 지방산 등 혈중 지질의 농도를 낮출뿐만 아니라 간 독성의 수치도 낮출 수 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 7> 고지방식이 동물비만모델의 조직 단백질 상 지방세포 분화 신호전달자 활성 억제

과라나 추출물의 지방세포 분화 신호전달기전 제어 비만억제 효과를 규명하기 위해 동물비만모델의 조직 단백질에서 신호전달기전을 분석했다. 도 7은 고지방식이로 유도한 동물비만모델의 지방 세포 분화 기전에서 신호전달자들(AKT, mTOR, PPARγ, FAS)의 활성에 대한 과라나 추출물의 억제 효과를 나타내는 도이다.

도 7의 A 내지 D를 참고하면, 고지방식이만 섭취한 HFD군의 조직에서 ser/thr kinase AKT(AKT)(A), mechanistic target of rapamycin(mTOR)(B), peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)(C), 그리고 fatty acid synthesis(FAS)(D)의 인산화가 증가했다. 이에 대하여 10 mg/kg의 과라나 추출물을 섭취한 HFD+Guarana군에서는 유의적으로 상기 지방 세포 분화 신호 전달자들의 인산화가 억제되는것을 확인했다.

또한 도 7의 E, F를 참고하면, 과라나 추출물의 처리는 FAS의 mRNA 발현 수준(E)과 간 및 백색지방의 지방세포 크기(F)를 유의적으로 감소시킴을 확인했다.

즉, 세포와 동물에서 동일한 지방 분화 신호 전달 기전을 가지고 있으며, 본 발명의 과라나 추출물은 AKT/mTOR/PPARγ의 활성을 제어하여 지방 분화를 억제하고 항비만 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 본 발명의 본직적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능 할 것이다. 따라서 본 발명에 개신된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라, 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것도 아니다. 본 발명의 보호 범위는 특허청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

과라나 추출물을 유효성분으로 하고, 상기 과라나 추출물은 지방산 합성 효소(FAS)의 발현과 활성산소종(ROS) 발생을 감소시켜 지방 세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 과라나 추출물은 지방 세포 분화 기전에 있어서, AKT(ser/thr kinase AKT), mTOR(mechanistic target of rapamycin) 및 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 중 어느 하나 이상의 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 과라나 추출물은 카페산(caffeic acid), 테오필린(theophylline), 테오브로민(theobromine) 및 프로시아니딘(procyanidin)을 유효물질로 포함하는 것을 특징으로 하는, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 과라나 추출물의 농도는 10 ~ 100 μg/mL인 것을 특징으로 하는, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 콜레스테롤 및 중성지질을 감소시켜 혈중 지질의 농도를 낮추는 것을 특징으로 하는, 지방 합성 억제 및 혈장 콜레스테롤 생성 억제용 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물에 약학적으로 허용가능한 첨가제를 첨가한 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 건강기능식품.