KR20160099179A - 국화 흰녹병 저항성 검출용 스카마커 및 이의 용도 - Google Patents

국화 흰녹병 저항성 검출용 스카마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana) 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana)을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

국화 흰녹병 저항성 검출용 스카마커 및 이의 용도{SCAR markers for detecting White Rust Resistance in Chrysanthemum and uses thereof}
본 발명은 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana)을 진단하기 위한 스카마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전체를 추출하는 과정을 거치지 않고 직접 핵산 증폭 과정을 통해 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana)을 진단할 수 있는 스카마커 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
국화 흰녹병은 주로 4～7월, 9～10월 중 상대습도가 90%이상 일때 발병되며 피해 증상으로는 잎 뒷면에 융기한 작은 반점이 담갈색으로 변하면서 병무늬 주위가 담황색을 띤 점무늬로 오래되면 잎이 고사하여 상품성이 떨어지는 것이 특징이다.
방제 대책으로는 시설하우스 내 모주포와 본포의 한낮에 습도가 높지 않게 환기를 시켜주어야 하며, 병 발생 전에 적용약제를 살포하여 미리 예방하여야 한다. 농약은 오전에 살포하고 물기가 빨리 마르도록 환기팬을 가동하거나 측창을 열어 가능한 빨리 건조시켜준다. 발생이 된 포장에서는 더 이상 전염이 되지 않게 적용약제를 3～5일 간격으로 살포하고 병든 포기는 포장에서 완전히 제거해 주어야 한다.
현재 기술로는 국화 흰녹병에 대하여 사전에 미리 예방할 수 있는 방법에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으나 아직 미비한 상태이고, 이미 흰녹병이 발발한 뒤에 방제하는 방법에 대한 연구만 이루어지고 있는 상태이다. 만약 국화 흰녹병에 대한 저항성을 가지는 국화를 미연에 판별할 수 있다면 이 병에 의한 농가의 피해를 최소화 하면서 생산성을 극대화 할 수 있을 것으로 보인다. 따라서 이와 관련된 기술의 연구 개발이 시급한 실정이다.
학술논문-BSA를 이용한 국화 흰녹병 저항성 연관 분자표지 개발(박상근 외 4명)
본 발명은 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana)의 유전체를 추출하지 않고 직접 핵산 증폭에 의해 국화 흰녹병원균을 진단할 수 있는 프라이머 및 이의 용도를 제공함으로써, 보다 신속하고 정확한 국화 흰녹병을 진단할 수 있도록 하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출용 SCAR(Sequence Characterized Amplified Region) 마커를 제공할 수 있다.
또한, 상기 SCAR 마커는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석으로부터 얻어진 것인 국화 흰녹병 저항성 검출용 SCAR 마커를 제공할 수 있다.
또한, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출용 SCAR 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 SCAR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 검출용 조성물을 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출용 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 국화 시료로부터 유래한 주형 DNA와 제3항의 SCAR 프라이머 세트를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합 결과물을 PCR(polymerase chain reaction) 증폭시키는 단계를 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 PCR(polymerase chain reaction) 방법은 Direct PCR(polymerase chain reaction) 방법인 것인 국화 흰녹병 저항성 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana) 진단용 프라이머는 genomic DNA 추출에 필요한 시간과 비용이 필요하지 않고, 핵산증폭과정이 고속의 빠른 주기로 실험할 수 있기 때문에 분석 시간을 크게 단축시킬 수 있으며, 상기의 프라이머의 개발을 통하여 식물체 및 토양에서 국화 흰녹병의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
도 1은
본 명세서에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 하기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열은 본 발명의 일측면에 따른 실시예로서 제시되는 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana)을 진단할 수 있는 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 서열번호 1은 정방향(forward) 프라이머를 나타내며, 서열번호 2는 역방향(reverse) 프라이머를 나타낸다.
본 발명의 일측면에 따른 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana) 특이 프라이머는 genomic DNA 추출 과정이 없이 직접핵산증폭과정(direct polymerase chain reaction)에서 사용되는 polymerase와 이를 반응하기 위한 98℃의 고온과 온도를 변화시키는 빠른 주기의 핵산증폭과정 조건에서 안정적으로 반응할 수 있는 프라이머이다.
이하 본 발명의 일측면에 따른 국화 흰녹병원균(Puccinia horiana)의 진단을 할 수 있는 프라이머를 제작하기 위한 구체적인 실시예를 서술한다.
실시예 1 : 국화 흰녹병 저항성 유전자원 탐색 및 후대 분리집단 작성
국화 흰녹병 저항성 유전자원 탐색을 위하여 기존의 병 저항성 및 감수성으로 보고된 품종들을 포장에 공시하고 포자비산법으로 병 저항성 정도를 평가하였다. 국화 흰녹병 저항성 관련 유전분석 및 마커 개발을 위한 분리집단 작성을 위하여 국화 흰녹병에 저항성인 '를 부본으로 하고 감수성인 White' 품종을 모본으로 하여 상호 교배하고 188개체의 후대 분리집단(Pseudo-F1 분리세대)을 작성하고 3차례에 걸쳐 포자비산법을 이용한 흰녹병 저항성 검정을 수행하였다. 그 결과를 도 1, 2 및 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머명 프라이머1 염기서열(5'-3') 서열번호
OPI-13seq F1 GGCTGAATAATCCGGTGAAA 1
OPI-13seq R1 GGGGCTGATCTAGCTATGTTG 2
실시예 2 : Bulked Segregant Analysis (BSA)-RAPD를 이용한 국화 흰녹병 저항성 마커 개발
Whitex 후대 분리집단에서 극도의 저항성과 감수성 각 10개체를 선발하여 R-bulk와 S-bulk를 작성하였다. 저항성 부본 와 감수성 모본 White, R-bulk, S-bulk를 이용하여 BSA 방법으로 Operon primer 380개(OPA1~OPN20)에 대한 프라이머 스크리닝을 수행한 결과, 21개 프라이머 조합에서 25개의 Dancer, R-bulk 특이 밴드와 18개 프라이머 조합에서 22개의 Puma White, S-bulk 특이밴드를 선발하였다. 선발된 25개의 Dancer, R-bulk 특이 밴드와 22개의 Puma White, S-bulk 특이 밴드에 대하여 individual PCR을 수행한 결과, 국화 흰녹병 저항성과 가깝게 연관된 것으로 예측되는 OPI-13520 RAPD 마커를 탐색할 수 있었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
BSA-RAPD를 수행하여 최종 선발된 OPI-13 프라이머를 전체 분리집단에서 확인한 결과, OPI-13 프라이머의 520bp에 위치한 OPI-13520마커는 총 188개 후대 개체들 가운데 6개의 recombinant가 출현하여 OPI-13520은 국화 흰녹병 저항성 유전자에서 약 4.0cM 정도 떨어져 있는 것으로 추정되었다. 도 4는 이에 대한 결과를 나타낸 것이다.
실시예 3 : 유전자 클로닝 및 염기서열 분석
OPI-13520 마커를 PCR 기반 SCAR 마커로 전환하기 위하여 증폭된 밴드를 클로닝한 후, 염기서열을 분석하여 총길이 523bp의 염기서열 정보를 획득하고 이를 기반으로 한 SCAR 프라이머를 제작하였다. 도 5는 염기서열 정보 및 스카 프라이머 영역을 나타낸 것이다.
제작된 SCAR 프라이머에 대하여 188개체의 후대 분리집단에서 적용성 검정을 수행한 결과, OPI-13520 마커와 개체별 증폭양상에서는 약간의 차이를 보였으나 특이성은 매우 높았고, 기존 마커와 마찬가지로 SCAR 마커도 후대분리집단 중 6개체의 재조합 식물체만이 출현하여 국화 흰녹병 저항성 유전자와 4.0cM 정도로 연관되어 있는 것을 확인하였고, 본 SCAR 마커를 활용하여 국화 흰녹병 저항성 계통을 선발할 때 96.8%의 일치도를 보일 수 있을 것으로 기대된다. 도 6은 188개 후대분리집단에 대한 스카 마커의 증폭 양상 및 흰녹병 저항성과의 상관관계를 나타낸 것이다.
실시예 4 : 를 모본으로 하는 다른 후대집단에서의 마커 유용성 검정
개발된 흰녹병 저항성 SCAR 마커에 대하여 스프레이 국화인 와 를 모본으로 하여 육성된 흰녹병 저항성 품종 기백을 스탠다드 국화 품종 신마II와 육성계통과 교잡한 후대 분리집단에서 마커 유용성 검정을 수행하였다. 후대분리집단 x 14계통, 신마IIx 25계통, x 기백27계통 등 총 3조합 66계통에 대하여 포자비산법으로 흰녹병 저항성을 검정한 후 개체별 저항성 정도와 SCAR 마커의 증폭 양상과의 상관관계를 분석한 결과, x 조합에서는 14계통 중 2계통의 재조합 식물체가 출현하였고, 신마IIx 에서는 25계통 중 2계통, x 기백에서는 27계통 중 5계통의 재조합 식물체가 출현하였다. 이는 Whitex 교배조합의 96.8%에 비해서는 선발효율이 떨어지나 혹은 를 모본으로 육성된 흰녹병 저항성 품종의 후대 집단에서 본 마커를 활용하여 국화의 흰녹병 저항성 계통을 선발할 때 평균 86.3%의 일치도를 보임으로써, 국화 흰녹병 저항성 품종육종의 육종효율을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
<110> Republic of Korea <120> SCAR markers for detecting White Rust Resistance in Chrysanthemum and uses thereof <130> 14-0154 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPI-13seq F1 <400> 1 ggctgaataa tccggtgaaa 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPI-13seq R1 <400> 2 ggggctgatc tagctatgtt g 21

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출용 SCAR(Sequence Characterized Amplified Region) 마커.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 SCAR 마커는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석으로부터 얻어진 것인 국화 흰녹병 저항성 검출용 SCAR 마커.
  3. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출용 SCAR 프라이머 세트.
  4. 제3항의 SCAR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 검출용 조성물을 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출용 키트.
  5. 국화 시료로부터 유래한 주형 DNA와 제3항의 SCAR 프라이머 세트를 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합 결과물을 PCR(polymerase chain reaction) 증폭시키는 단계를 포함하는 국화 흰녹병 저항성 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 PCR(polymerase chain reaction) 방법은 Direct PCR(polymerase chain reaction) 방법인 것인 국화 흰녹병 저항성 검출하는 방법.
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