KR20160094831A

KR20160094831A - 연산호의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물

Info

Publication number: KR20160094831A
Application number: KR1020150049558A
Authority: KR
Inventors: 안용석
Original assignee: 안용석
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2016-08-10
Also published as: KR101721944B1

Abstract

본 발명은 연산호(Soft coral)의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 상기 성분을 유효성분으로 포함하는 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 갖는 기능성 화장품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 연산호의 효소적 가수분해물은 항산화 활성, 주름 개선 및 미백에 우수한 효과를 나타내며, 천연 재료로서 인체에 무해하여 기능성 화장품 조성물의 용도로서 사용하기에 적합하다.

Description

연산호의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물{A COSMETIC COMPOSITION COMPRISING ENZYMATIC EXTRACTS FROM SOFT CORAL}

본 발명은 연산호(Soft coral)의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 상기 성분을 유효성분으로 포함하는 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 갖는 기능성 화장품 조성물에 관한 것이다.

화장품이란 크림, 로션 등 화장하는데 쓰이는 모든 물건을 지칭하는 것으로서 약사법에서 정해진 화장품은 "인체를 청결 또는 미화하기 위하여 도찰(塗擦), 살포 기타 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 적은 것을 말한다."라고 정의되어 있으며, 그와 동시에 제조, 판매, 그에 따르는 광고 등 모든 면에 규제를 받는 상품이다.

최근 피부에 대한 관심이 높아짐에 따라 다양한 기능을 갖는 기능성 화장품에 대한 연구가 계속되고 있다. 피부에 수분을 공급하기 위한 화장품, 모공의 크기를 줄이기 위한 화장품, 피부 각질을 제거하기 위한 화장품, 주름을 완화시키기 위한 화장품, 미백기능을 갖는 화장품 등 다양한 기능을 가진 화장품들이 출시되고 있으며, 앞으로도 이와 같은 기능성 화장품의 수요는 계속 증가할 것으로 예측된다.

한편, 기후 변화에 따라 제주도가 열대 지역으로 들어서면서 점차 제주 해양의 생물종이 변화하고 있으며, 특히 열대종인 산호의 유입이 증가하여 서식지를 점차 넓혀가고 있는 실정이다. 기존의 연구 결과에 의하면, 돌산호 또는 연산호가 우수한 항염 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있으며, 특히 연산호로부터 분리된 슈돕테로신(Pseudoteropsin)은 우수한 항염 화합물로서 화장품 첨가제로 사용되고 있다.

하지만, 아직까지 연산호의 생리 활성을 구체적으로 연구한 결과는 없으며, 연산호 유래의 가수분해물 제조에 대한 연구도 부족한 실정이다. 이와 같은 점에서, 제주에서 그 서식이 증가되고 있는 연산호를 이용하여 유용 성분을 추출하고 이를 기능성 화장품의 소재로서 사용하고자 하는 것은 매우 유용한 것이라 할 수 있다.

KR

10-1136742

B

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하려는 과제는 연산호로부터 추출된 효소적 가수분해물을 포함하는 기능성 화장품 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 연산호(soft coral) 추출물의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.

상기 효소적 가수분해물은 (S1) 연산호를 수세 후 건조시키는 단계; (S2) 건조된 연산호를 열수 추출하는 단계; (S3) 열수 추출된 연산호를 효소적 가수분해시키는 단계; (S4) 연산호 추출물의 효소적 가수분해물을 활성탄 여과시키는 단계; (S5) 활성탄 여과물을 0.4~0.5μm의 여과막으로 여과시키는 단계; (S6) 0.4~0.5μm의 여과막에 의한 여과물을 이온교환수지막으로 여과시키는 단계; (S7) 이온교환수지막 여과물을 한외여과막으로 분획하는 단계; 및 (S8) 분획물을 농축 후 동결건조 및 분쇄하는 단계를 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

상기 효소적 가수분해는 α-키모트립신(α-chymotrypsin), 알칼라아제(alcalase), 뉴트라아제(Neutrase) 및 트립신(Trypsin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 분획물은 분자량 5kDa 이하인 것이 바람직하다.

상기 화장품 조성물은 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 나타내는 것이 바람직하다.

본 발명의 유효성분인 연산호의 효소적 가수분해물은 항산화 활성, 주름 개선 및 미백에 우수한 효과를 나타내며, 천연 재료로서 인체에 무해하여 기능성 화장품 조성물의 용도로서 사용하기에 적합하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 연산호로부터 얻어진 효소적 가수분해물이 항산화 활성, 주름개선 효과 및 미백 활성을 가진다는 점을 확인하고, 이러한 활성을 가진 연산호의 효소적 가수분해물을 기능성 화장품 조성물의 용도로 개발하였다.

따라서, 본 발명은 연산호(Soft coral) 추출물의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.

산호류는 연산호류와 부채산호류로 나누어 볼 수 있는데, 이 중 연산호류는 산호충강에 속하는 팔방산호 아강 중에서 해세 목을 지칭하는 것으로서, 국내에는 큰수지맨드라미, 분홍바다맨드라미 등 약 18여종이 알려져 있다. 연산호류들은 뼈대가 없어 물렁물렁한 몸체에 8개의 촉수를 단위로 수많은 폴립들이 서로 붙어 자라는 것이 특징이다. 본 발명의 연산호는 상기 연산호류를 포함하는 의미이며, 분류상 특정 아강, 목으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 연산호의 효소적 가수분해물은 (S1) 연산호를 수세 후 건조시키는 단계; (S2) 건조된 연산호를 열수 추출하는 단계; (S3) 열수 추출된 연산호를 효소적 가수분해시키는 단계; (S4) 연산호의 효소적 가수분해물을 활성탄 여과시키는 단계; (S5) 활성탄 여과물을 0.4~0.5μm의 여과막으로 여과시키는 단계; (S6) 0.4~0.5μm의 여과막에 의한 여과물을 이온교환수지막으로 여과시키는 단계; (S7) 이온교환수지막 여과물을 한외여과막으로 분획하는 단계; 및 (S8) 분획물을 농축 후 동결건조 및 분쇄하는 단계를 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

본 발명의 연산호는 제주 지역에서 용이하게 입수할 수 있으며, 입수 후 담수로 세척하여 건조시킨 후, 효소적 가수분해물을 얻는데 사용하는 것이 바람직하다. 상기 건조는 원적외선을 이용하는 것이 효과적이다.

상기 효소적 가수분해물은 연산호를 먼저 열수 추출하고, 열수 추출물에 단백질 분해 효소를 처리하여 얻을 수 있다. 열수 추출의 조건은 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 100℃에서 1~5시간, 더욱 바람직하게는 100℃에서 3시간 동안 추출한다.

본 발명에 사용될 수 있는 단백질 분해 효소는 예를 들어, α-키모트립신(α-chymotrypsin), 알칼라아제(alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 트립신(trypsin) 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 α-키모트립신 또는 알칼라아제이다. 가수분해 조건은 특별히 제한되지는 않으나, 각 효소의 최적 pH 및 온도에서 3~24시간 동안 가수분해 반응을 시킬 수 있다.

가수분해물은 활성탄을 사용하여 여과시키는데, 이는 가수분해 후에 생기는 이취와 특유의 색을 제거하기 위함이다. 활성탄을 사용하는 여과 방법은 공지의 것이라면 어떠한 것이라도 무방하다.

활성탄 여과 후에는 다시 직경 0.4~0.5μm의 여과막을 통하여 이물질 등을 제거하는 공정을 거치고, 가수분해물 내에 잔존할지도 모르는 중금속이나 기타 이물질들을 완전히 제거하기 위하여 이온교환수지막을 이용한 여과를 수행한다.

이와 같은 다단계의 여과 과정을 거친 가수분해물은 한외여과막을 사용하여 분자량에 따라 분획하는데, 5kDa, 10kDa 및 30kDa의 분자량을 갖는 분획물을 한외여과막을 통하여 얻는 것이 바람직하다. 항산화 활성, 주름개선, 미백 활성을 나타내는 연산호의 효소적 가수분해물의 분자량 분포는 5kDa 이하로부터 30kDa까지 다양한데, 본 발명의 화장품 조성물로 적합한 효소적 가수분해물의 분자량은 5kDa이하인 것이 가장 바람직하다.

위와 같은 공정을 거쳐 얻어진 분획물은 농축과정을 거쳐 건조되며, 이후 분쇄하여 사용될 때까지 보관한다.

본 발명의 화장품 조성물은 예를 들어, 에센스, 영양크림, 바디로션, 린스, 샴푸, 바디클렌저, 로션, 스킨, 마스크팩 등의 형태로 제조될 수 있으며, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 형태로의 제조는 당업자에게 알려진 다양한 제조 공정에 따라 용이하게 수행될 수 있을 것이다.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

1. 재료

연산호의 효소적 가수분해물을 얻기 위하여, 본 발명에서 사용한 연산호는 제주도 서귀포시에서 입수하였으며, 담수를 이용하여 수세 후 원적외선 하에서 건조하여 사용하였다.

2. 연산호의 일반 성분 측정

건조된 연산호의 수분, 조단백질, 조지방 및 회분을 측정하였다. AOAC 방법에 준하여 수분 함량은 0.002g 이하의 유의차를 항량으로 하여 105℃ 상압가열건조법으로 측정하였고, 조단백질 함량은 Micro Kjeldahl법으로 측정하였으며, 회분 함량은 건식법으로 측정하였고, 조지방 함량은 Soxhlet 추출법으로 측정하였다.

성분	측정값(%)
조단백질	39.55±0.02
수분	15.51±0.01
회분	45.01±1.32
기타	0.45±0.01

표 1에 제시된 바와 같이, 수분 함량은 15.51±0.01, 회분 함량은 45.01±1.32이고, 조단백질 함량은 39.55±0.02이었고, 나머지 성분이 0.45±0.01이었다. 이러한 결과는 본 발명의 연산호는 다른 성분에 비하여 단백질 함량이 높아 열수 추출에 있어서 유용한 원료가 될 수 있음을 확인할 수 있었다.

3. 연산호의 효소적 가수분해물의 제조

건조된 연산호를 분말화한 후 다음 표 2에 나타낸 4종의 단백질 가수분해 효소를 이용하여 시간대별로 가수분해하였다. 가수분해물은 다시 원심분리(12000rpm, 15분) 과정을 거쳐 상층액을 분리한 후 가수분해도를 측정하였다.

효소	pH	온도(℃)	기원
α-키모트립신 (α-chymotrypsin)	7.8	25	Bovine Pancreas
알칼라아제 (alcalase)	8.0	50	Bacillus licheniformis
뉴트라아제 (neutrase)	6.0	50	Bacillus amyloliquefaciens
트립신 (trypsin)	7.6	25	Procine Pancreas

4. 연산호의 효소적 가수분해물의 가수분해도 측정

연산호의 효소적 가수분해물의 가수분해도를 TCA(trichloroacetic acid)법으로 측정하였다. 즉, 반응이 종료된 반응 혼합물을 원심분리(12000rpm, 15분)하여 상층액으로부터 2ml를 취하고, 여기에 20% TCA를 동량 첨가하여 원심분리(3500rpm, 10분)한 다음, 상층액의 일정량을 취하여 Lowry법으로 10% TCA 가용성 질소량을 측정하여 다음의 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.

가수분해도(%)=(10% TCA 가용성 질소량/총질소량)×100

	2hr	4hr	6hr	8hr	10hr
α-키모트립신 (α-chymotrypsin)	30.33±0.03	41.28±1.10	46.62±0.07	51.61±1.30	55.45±1.13
알칼라아제 (alcalase)	34.15±0.87	55.75±0.67	68.60±0.32	69.32±1.21	70.64±0.95
뉴트라아제 (neutrase)	31.16±1.21	43.85±0.43	45.74±0.56	46.48±0.85	51.17±0.74
트립신 (trypsin)	33.37±0.45	46.49±0.33	51.35±0.21	54.16±0.89	59.15±1.35

표 3에 나타난 바와 같이, 4종의 단백질 가수분해 효소를 이용하여 추출한 시간대별 가수분해물의 가수분해도는 4종의 효소 모두에서 가수분해반응 6시간까지 급격하게 가수분해도의 증가를 보였으나, 그 후에는 거의 일정하였다. 또한, 4종의 가수분해물 중에서도 알칼라아제가 가장 효과적으로 연산호를 가수분해하였으며, 가수분해 반응 6시간 후에 약 68% 이상의 가수분해도를 나타내었다.

5. 연산호의 효소적 가수분해물의 최적 가수분해 조건

알칼라아제 가수분해물의 최적 가수분해 조건을 결정하기 위하여, 효소적 가수분해물의 기질 대 효소비와 기질 농도에 따라 가수분해를 수행하였다.

기질 대 효소비는 10, 20, 50, 100, 200, 500(중량/중량)이었고, 기질인 연산호의 효소적 가수분해물 농도는 1%, 3%, 5%, 10%, 20%이다.

가수분해는 위에서 제시된 방법과 동일하게 수행하였고, 모든 가수분해 조건의 검토를 위하여 가수분해물의 가수분해도를 측정하였다.

S/E(중량/중량)	가수분해도(%)
10	75.56±0.43
20	71.44±0.78
50	68.32±1.34
100	65.93±1.21
200	43.11±0.65
500	37.71±0.21

표 4에 나타낸 바와 같이, 연산호 대 효소의 비가 감소할수록 높은 가수분해도를 나타내었다. 또한, 연산호 대 효소의 비율이 10~100으로 증가하면서 가수분해도가 60% 이상을 보이며, 200부터는 가수분해도가 급격히 떨어지는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 다양한 기질 대 효소비 중 100인 경우가 가수분해도에 대한 가장 우수한 효율을 나타냄을 확인할 수 있다.

농도(중량%)	가수분해도(%)
1	71.48±0.32
3	73.93±0.85
5	72.22±1.14
10	64.45±0.52
20	55.18±0.45

상기 표 4의 기질 대 효소비 100인 경우에서 기질 농도별로 가수분해도를 측정한 결과는 표 5에 나타내었으며, 기질의 농도가 낮을수록 가수분해도가 증가하였지만, 기질 농도가 5% 이하일 때는 거의 유사한 가수분해도를 보여 대량 생산 측면에서 볼 때 기질 농도 5%가 가장 적당한 것으로 판단된다.

6. 연산호의 효소적 가수분해물의 여과

연산호의 알칼라아제 가수분해물은 활성탄 여과막을 통하여 1차로 여과하고, 다음으로 0.45μm 직경의 여과막으로 2차 여과하였다. 다음으로, 이온교환수지막을 통하여 3차로 여과하여 최종적인 여과물을 얻었다.

7. 연산호의 효소적 가수분해물로부터 분자량별 분획물의 제조

분자량별 분획물을 제조하기 위하여, 알칼라아제로 처리된 연산호 효소적 가수분해물의 여과물은 5kDa, 10kDa, 30kDa의 막을 사용하여 한외여과막 분리 시스템(ultrafiltration membrane)을 이용하여 5kDa 이하, 10kDa 이하, 30kDa 이하 분획물들을 각각 제조하였다.

8. 항산화 활성 측정

DPPH는 free radical의 안정된 모델로 반응 중 DPPH의 감소는 free radical의 소거반응이 진행됨을 알 수 있고, 지질과산화의 초기반응의 억제정도를 예측할 수 있다. 유해산소라 불려지는 활성산소는 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 지질과산화 반응을 일으켜 체내 과산화 지질을 축적함으로 인해 생체 기능이 저하되고 동시에 노화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있으며 다양한 종류의 식물성분 및 추출물에 의한 항산화 작용이 보고되고 있다. 또한, H₂O₂ 역시 대표적인 활성산소로 H₂O₂의 감소 정도로 항산화 반응의 정도를 측정할 수 있다.

시료	DPPH 라디칼 소거능(%)
연산호 열수추출물(500μg/ml)	10.14±1.31
알칼라아제 가수분해물(500μg/ml)	45.56±0.34
분자량 5KDa 이하 분획물(500μg/ml)	67.77±0.25
분자량 10KDa 이하 분획물(500μg/ml)	51.41±2.14
분자량 30KDa 이하 분획물(500μg/ml)	53.86±0.26

시료	H₂O₂ 라디칼 소거능(%)
연산호 열수추출물(500μg/ml)	5.14±0.12
알칼라아제 가수분해물(500μg/ml)	20.33±2.24
분자량 5KDa 이하 분획물(500μg/ml)	68.52±1.65
분자량 10KDa 이하 분획물(500μg/ml)	54.15±1.04
분자량 30KDa 이하 분획물(500μg/ml)	50.06±2.11

표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 연산호 효소적 가수분해물 및 각 한외여과 분획물들은 우수한 DPPH radical 소거 기능이 있음을 확인할 수 있다.

9. 주름 개선 효과

피부의 진피 조직 속에는 콜라겐과 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하면서 피부의 탄력성을 유지시켜 주는데 나이, 자외선과 같은 내외적 스트레스로 인하여 탄력성, 윤택성이 감소하고, 과다 발현된 엘라스티나아제에 의하여 엘라스틴의 그물망 구조가 깨지게 되면 피부가 처지고 주름이 생기므로 피부노화가 발생하게 된다. 따라서, 피부노화의 주원인 중 하나인 엘라스틴의 분해효소인 엘라스티나아제의 활성을 저해시킴으로써 피부 노화를 억제할 수 있다.

연산호 효소적 가수분해물 및 3종의 한외 여과 분획물의 주름개선효과를 시험하기 위하여 Cannell 등의 방법을 이용하여 elastinase의 저해활성을 측정하였다. Elastinase 저해 활성 측정은 기질로서 elastinase substrate VIII를 사용하여 실온에서 15분간 반응시켜 p-nitoanilide의 생성량을 측정하였다. 0.2M tris-HCl(pH 8.0) buffer로 희석한 각 시험용액 160μl와 5mM elastinase substrate VIII(CALBIOCHEM) 용액 20μl 그리고 10μl/ml elastinase(sigma) 효소 20μl를 순서대로 넣은 후 25℃에서 15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader(TECAN, AT/sunrise R/C, Switzerland)를 이용하여 410nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료	Elastinase inhibition(%)
연산호 열수추출물(500μg/ml)	12.43±0.64
알칼라아제 가수분해물(500μg/ml)	32.12±0.24
분자량 5KDa 이하 분획물(500μg/ml)	55.43±2.18
분자량 10KDa 이하 분획물(500μg/ml)	39.13±0.64
분자량 30KDa 이하 분획물(500μg/ml)	34.07±0.46

표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 연산호 효소적 가수분해물 및 각 한외여과 분획물들은 우수한 엘라스티나아제 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

10. 미백 효과

연산호의 알칼라아제 가수분해물 및 한외여과 분획물의 미백효과를 시험하기 위하여, Fuller 등의 방법을 이용하여 tyrosinase의 저해활성을 측정하였다. 0.1M 인산염완충액(pH 6.5) 220μl와 시료액 20μl 그리고 tyrosinase(sigma)(1500U/ml~2000U/ml)액 20μl를 순서대로 넣는다. 이 용액에 1.5mM trysine(sigma) 액 40μl를 넣고 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader(TECAN, AT/sunrise R/C, Switzerland)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH 6.5)을 사용하였다.

멜라닌 합성은 아미노산의 하나인 tyrosine을 기질로 하여 tyrosinase에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanin(DOPA)와 DOPA quinone 이후의 반응은 크게 적갈색이나 황색을 결정하는 pheomelanin과 흑갈색에서 갈색을 결정하는 eumelanin 생성의 2가지로 나뉘어지며, 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase의 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시켜 미백효과를 기대할 수 있다.

이에 본 실험에서는 alcalase를 이용하여 제조한 연산호 가수분해물 및 이로부터 얻은 3종의 한외 여과 분획물의 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 연산호 효소적 가수분해물 및 각 한외여과 분획물들은 우수한 티로시나아제 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

시료	Tyrosinase inhibition(%)
연산호 열수추출물(500μg/ml)	14.87±1.44
알칼라아제 가수분해물(500μg/ml)	38.87±0.72
분자량 5KDa 이하 분획물(500μg/ml)	52.32±0.21
분자량 10KDa 이하 분획물(500μg/ml)	40.45±1.14
분자량 30KDa 이하 분획물(500μg/ml)	43.65±0.31

11. 연산호 가수분해물의 한외 여과 분획물(단백질펩타이드)의 독성검사

연산호 단백질 펩타이드의 독성검사를 바이오톡스텍 전문기관에 의뢰하였으며, 자세한 결과는 다음과 같다.

11-1. 연산호 효소가수분해물의 렛드를 이용한 단회 경구투여 독성시험

시험목적 : 암수 Sprague-Dawley 랫드를 이용하여 시험물질인 연산호 효소 가수분해물을 단회 경구투여시 나타나는 독성반응을 관찰하고, 개략의 치사량을 구하기 위하여 실시하였다.

요약 및 결론 : 군구성은 시험물질 2,000 mg/kg의 용량 및 대조군 (주사용수)의 2군으로 하고, 암수 각각 5 마리씩 단회 경구투여 하였다. 투여 후 14일 동안, 일반증상의 관찰 및 체중측정을 실시하였고, 관찰기간 종료 시에 안락사시켜 부검하였다. 암수 2,000 mg/kg 투여군에서 사망례는 관찰되지 않았다. 또한, 일반증상, 체중 및 부검에서 시험물질 투여에 의한 영향은 인정되지 않았다. 본 시험의 조건 하에서 연산호 효소 가수분해물을 랫드에 단회 경구투여한 결과, 개략의 치사량은 암수 각 2,000 mg/kg을 상회하는 것으로 판단된다.

11-2. 연산호 효소가수분해물의 토끼를 이용한 피부자극시험

시험목적 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물을 토끼의 피부에 1회 처치한 후, 피부자극성의 유무 및 그 정도를 평가하기 위해 실시하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 피부자극시험을 16주령의 수컷 NZW 토끼 3마리를 사용해서 검토하였다. 토끼의 등부위에 좌우 각 2부위, 합 4부위의 투여부위를 설정하고, 그 중 2부위를 비찰과부위, 그 외 2부위를 찰과부위로 하였다. 시험물질원말 0.5 g을 각 1개의 비찰과 및 찰과부위의 투여부위에 적용하여 24시간 폐색첩포하였다. 투여 후 24, 48 및 72시간에 Draize의 피부반응 평가표에 따라서 피부반응을 평가하고, 투여 후 24 및 72시간에 대한 1차피부자극지수 (Primary Skin Irritation Index, P.I.I.)를 구하여 피부자극성을 판정하였다. 시험물질투여부위및 무처치대조부위의 비찰과 및 찰과부위에서 투여 후 24, 48 및 72시간에 홍반 및 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 시험물질의 1차피부자극지수 (P.I.I.)는 0이었다. 관찰기간 중, 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 연산호 효소 가수분해물은 토끼의 피부에 대해서 자극이 없는 것으로 판단된다.

11-3. 연산호 효소 가수분해물의 토끼를 이용한 안점막자극시험

시험목적 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물을 토끼의 안점막에 1회 처치한 후, 안자극성의 유무 및 그 정도를 평가하기 위해 실시하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 안자극시험을 16주령의 수컷 NZW 토끼 6마리를 사용해서 검토하였다. 비세안군은 토끼 3마리의 우안 결막낭 내에 시험물질원말 0.1 g을 투여하고, 투여 후 1, 24, 48 및 72시간에 각막, 홍채 및 결막등의 안구병변을 관찰하였다. 세안군은 추가로 3마리를 사용해서 비세안군과 동일하게 투여하고, 투여 30초 후에 세척한 후 세안효과를 확인하였다. Draize의 안구병변의 등급에 따라서 시험물질의 안점막자극을 평가하고, Guillot의 안점막자극 평가표를 참조해서 안점막자극의 정도를 분류하였다. 비세안군에서는, 시험물질 투여 후 1시간 이후에 결막발적 (평점 1) 및 결막부종 (평점 1)이 관찰되었으나, 투여 후 48시간에 모두 소실되었다. 비세안군의 I.A.O.I. (Index of Acute Ocular Irritation)는 4.0으로 최종평가는 무자극물로 분류되었다. 세안군에서는, 시험물질 투여 후 1시간에 결막발적 (평점 1) 및 결막부종 (평점 1)이 관찰되었으나, 투여후 24시간에 모두 소실되었다. 세안군의 I.A.O.I.는 4.0으로, 비세안군과 비교해서 자극정도는 차이가 없지만, 안자극성의 소실시간에서 차이가 있기 때문에 세안효과가 확인되었다. 관찰기간 중, 각군의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 연산호 효소 가수분해물은 토끼의 안점막에 대해서 무자극물로 판단된다.

11-4. 연산호 효소 가수분해물의 기니픽을 이용한 피부감작성시험 (Maximization법)

시험목적 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 안전성 시험의 일환으로, 기니픽을 이용한 피부감작성시험 (Maximization법)을 실시하여 인체 피부에 대한 알레르기 유발가능성을 검토하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 피부감작성시험을 Hartley계 기니픽을 사용하여 Maximization법으로 검토하였다. 시험군은 시험물질군 (5마리), 음성대조군 (5마리) 및 양성대조군 (5마리)의 합 3군으로 하였다. 또한, 예비시험의 경피투여 부위에서 홍반, 부종등의 피부반응이 확인되지 않았기 때문에, 2차감작 24시간 전에 양성대조군을 제외한 각 군의 감작부위에 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)를 도포하였다. 시험물질군은 50% 시험물질을 피내투여해서 1차감작하고, 100% 시험물질을 48시간 폐색첩포하여 2차감작하였다. 100% 시험물질 및 주사용수로 24시간 폐색첩포하여 야기한 결과, 야기 패취제거 후 24 및 48시간에 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 음성대조군은 주사용수로 1차 및 2차감작하고, 100% 시험물질 및 주사용수로 야기한 결과, 야기 패취제거 후 24 및 48시간에 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 양성대조군은 0.1 및 1.0% 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)으로 각각 1차 및 2차감작하고, 0.1% CDNB 및 olive oil로 야기한 결과, 야기패취 제거 후 24 및 48시간에 0.1% CDNB의 야기부위에서 평점 3의 강한홍반 및 부종이 모든 동물에서 관찰되었다. Olive oil의 야기부위에서는 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 관찰기간 중, 각 군의 모든 동물의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 연산호 효소 가수분해물은 피부감작성이 없는 물질로 판단된다.

11-5. 연산호 효소 가수분해물의 기니픽을 이용한 광독성시험

시험목적 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 안전성 시험의 일환으로, 기니픽의 피부를 이용해서 광독성 유발 가능성을 검토하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 피부에 대한 광독성 유무 및 그 정도를 Hartley계 기니픽을 이용해서 검토하였다. 시험군은 시험물질군 (5마리), 음성대조군 (5마리) 및 양성대조군 (5마리)의 합 3군으로 하였다. 시험물질군, 음성대조군 및 양성대조군의 제모한 기니픽의 등부 피부에 좌우 각 1부위, 합 2부위의 22 cm의 투여부위를 설정하였다. 시험물질군에는 90% 시험물질을, 음성대조군에는 주사용수를, 양성대조군에는 0.1% 8-Methoxypsoralen (8-MOP)을 0.05 mL씩 각 투여부위에 개방도포하였다. 도포 약 30분 후 좌측을 광조사부위, 우측을 비광조사부위로해서 최종에너지가 약 10 J/cm2이 되도록 UV-A를 조사하였다. 광조사 후 24, 48 및 72 시간에 피부반응을 평가하고, 광독성 유무를 판정하였다. 시험물질군의90% 시험물질의 투여부위에서 광조사 후 24, 48 및 72 시간에, 광조사 유무에 관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 음성대조군의 주사용수의 투여부위에서 모든 관찰시간에, 광조사 유무에 관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 양성대조군의0.1% 8-MOP의 투여부위에서는 모든 관찰시간에, 광조사부위에서 홍반 (평점 3) 및 부종 (평점 4)이 모든 동물에서 관찰되었으나, 비광조사부위에서는 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 관찰기간 중, 각 군의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 연산호 효소 가수분해물은 광독성이 없는 물질로 판단된다.

11-6. 연산호 효소 가수분해물의 기니픽을 이용한 광감작성시험 ( Adjuvant & Strip법)

시험목적 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 피부에 대한 안전성 시험으로, 기니픽을 이용한 Adjuvant & Strip법을 실시하여 광감작성의 유발 가능성을 검토하였다.

요약 및 결론 : 시험물질 연산호 효소 가수분해물의 광감작성을 Hartley계, 수컷 기니픽을 이용해서 Adjuvant & Strip법으로 검토하였다. 군구성은 시험물질군 (5마리), 음성대조군 (5마리) 및 양성대조군 (5마리)의 합 3군으로 하였다. 투여 0일에 감작부위 네 모서리에 주사용수-FCA 유화액을 피내주사한 후, 감작부위를 stripping 하였다. 시험물질군, 음성대조군 및 양성대조군의 감작부위에 각각 90% 시험물질, 주사용수 및 1.0% chlorpromazine (CP)을 0.1 mL씩 개방도포한 후, UV-A를 조사하였다. Stripping, 투여물질의 개방도포 및 UV-A 조사를 1일 1회, 5일간 연속해서 실시하였다. 야기는 투여 21일에 시험물질군 및 음성대조군에는 90% 시험물질 및 주사용수를, 양성대조군에는 0.1% CP 및 ethanol을 야기부위에 개방도포한 후, UV-A를 조사하여 야기하였다. 야기 광조사 후 24 및 48시간에 피부반응을 평가하였다. 시험물질군 및 음성대조군은 야기 광조사 후 24 및 48시간에, 90% 시험물질 및 주사용수의 야기부위에서 광조사 유무에관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 양성대조군은 모든 관찰시간에, 0.1% CP의 광조사부위에서 평점 3의 홍반 및 평점 3의 부종이 모든 동물에서 관찰되었다. 비광조사부위에서는 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. Ethanol의 야기부위에서는 광조사 유무에 관계없이 홍반, 부종등의 피부반응은 모든 동물에서 관찰되지 않았다. 관찰기간 중, 각 군의 일반증상 및 체중에 대해서 이상은 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본시험 조건하에서 시험물질 연산호 효소 가수분해물은 광감작성이 없는 물질로 판단된다.

12. 통계 처리

본 실시예의 실험 및 분석 결과의 통계 처리는 SPSS program(SPSS Inc., Version 12.0)을 사용하여 One-way ANOVA-test를 실시하여 Duncan's multiple range test(Duncan, 1955, P<0.05)로 평균간의 유의성을 검정하였다.

Claims

연산호(soft coral) 추출물의 효소적 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 효소적 가수분해물은 다음의 단계들을 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물:
(S1) 연산호를 수세 후 건조시키는 단계;
(S2) 건조된 연산호를 열수 추출하는 단계;
(S3) 열수 추출된 연산호를 효소적 가수분해시키는 단계;
(S4) 연산호 추출물의 효소적 가수분해물을 활성탄 여과시키는 단계;
(S5) 활성탄 여과물을 0.4~0.5μm의 여과막으로 여과시키는 단계;
(S6) 0.4~0.5μm의 여과막에 의한 여과물을 이온교환수지막으로 여과시키는 단계;
(S7) 이온교환수지막 여과물을 한외여과막으로 분획하는 단계; 및
(S8) 분획물을 농축 후 동결건조 및 분쇄하는 단계.
제 2항에 있어서,
상기 효소적 가수분해는 α-키모트립신(α-chymotrypsin), 알칼라아제(alcalase), 뉴트라아제(Neutrase) 및 트립신(Trypsin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 분획물은 분자량 5kDa 이하인 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화장품 조성물은 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.