KR20110135976A

KR20110135976A - 산호 유래의 염증, 알레르기성 질환 치료약

Info

Publication number: KR20110135976A
Application number: KR1020117025001A
Authority: KR
Inventors: 도모후미 미야모토
Original assignee: 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2009-08-03
Publication date: 2011-12-20
Also published as: WO2010109687A1; JP2010222307A

Abstract

본 발명의 목적은 일산화질소(NO)의 과잉 생산을 저해하는 약물, 및 NO의 과잉 생산 또는 발현이 관여하는 질환(염증, 알레르기성 질환 등)의 치료약을 제공하는 것이다. 산호로부터 단리된 화학식 (A)로 표시되는 셈브란 디테르펜은 세포에 의한 일산화탄소 생산을 억제할 수 있고, 염증 및 알레르기성 질환의 예방 또는 치료약으로서 유효하다.

Description

산호 유래의 염증, 알레르기성 질환 치료약{CORAL-DERIVED THERAPEUTIC AGENT FOR INFLAMMATIONS AND ALLERGIC DISEASES}

본 발명은 염증, 알레르기성 질환 치료약에 관한 것으로서, 특히 해양생물 유래의 디테르페노이드를 유효 성분으로 하는 신규한 염증, 알레르기성 질환 치료약 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

1986년에 일산화질소(NO)가 생체 내에서 내피 유래 이완 인자(endothelium derived relaxing factor: EDRF)로서 발견되고, NO는 순환 조절상 중요한 역할을 담당하고 있다고 생각되었다(R.M.J. Palmer 등[Nature, 327, 524 (1986)], L.J. Ignarro 등[Pro. Natl. Acad.Sci., 84, 96254(1987)]). 그 후 NO가 다방면에 걸쳐 생리학적 또는 병리학적으로 동맥 경화, 허혈후 재관류 시의 장애, 패혈증이나 엔도톡신 쇼크, 사이토카인 유도 NO 과잉 생산에 따른 혈압 저하, 관절염을 포함하는 염증성 조직 장애 등에 관여하고 있는 것으로 알려졌고, 추가로 최근의 연구에 있어서 NO 과잉 생산이 암의 혈관 신생, 증식 속도나 무산소혈증의 악화에 깊이 관여하고 있는 것도 보고되어 있다(T.M. Dawson 등[Ann. Neurol., 32, 297 (1992)], P.L. Feldman 등[Chem. Eng. News, 20, 26 (1993)], J.F. Kerwin 등[J. Med. Chem., 38, 4342 (1995)], S. Moncada 등[Pharmacol Rev., 43, 109 (1991)], J.B. Hibbs 등[J. Immunol., 138, 550 (1987)], A.K. Nussler 등[J. Leukocyte. Biol., 54, 171 (1993)], L. Salerno 등[Curr. Pharm. Des., 8, 1774 (2002)]). 이 때문에, NO가 관여하는 질환의 치료나 병태 개선을 위해 다양한 NO 저해제의 개발이 활발히 행해져 왔다. NO는 L-아르기닌과 산소 분자로부터 일산화질소 합성 효소(NOS)가 촉매로서 기능하고, 반응 중간체로서 N^ω-히드록시-L-아르기닌을 거쳐 L-시트룰린과 함께 생성된다. NOS는 전자 공여체로서 NADPH(환원형 nicotinamide adenine dinucleotide phospate)를 필요로 한다. NOS에는 NOS-1: 신경형(nNOS), NOS-2: 유도형(iNOS), NOS-3: 내피형(eNOS)으로 구성되는 3종의 아이소폼이 존재하는 것으로 알려졌고, 또한 NOS-1과 NOS-3은 각각 신경 세포, 혈관 내피 세포, 혈소판 등의 세포 중에 상존하여, Ca+/칼모듈린에 의해 활성화되어 NO를 구성적(constitutive)으로 발현하기 때문에, cNOS로서도 인지된다. 또한, iNOS는 마크로파지, 호중구, 간실질세포에 있어서 Ca+/칼모듈린에 비의존적으로 다양한 사이토카인(IFN-γ, IL-1, TNF-α)이나 세균성 독소의 리포폴리사카라이드(LPS) 등의 엔도톡신에 의해 NF-κB를 활성화하여 iNOS의 전사를 촉진하여 유도적으로 생산되는 것으로 알려져 있다.

NO의 과잉 생산에 의해 세포 장애가 생기는 경우, NOS 저해제는 장애 억제적으로 작용하여 임상적으로 유용한 가능성이 시사된다. 특히 iNOS는 엔도톡신 쇼크 시에 유도되고, NO를 대량으로 생산하여 세포 장애성으로 기능하는 것으로 알려졌고, 한편 eNOS는 혈류의 유지에 관여하고, 세포 보호적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, eNOS보다 iNOS에 선택적으로 작용하는 NOS 저해제가 기대되는 등, 그 저해제의 선택성이 중요하다고 생각된다. 이상의 점으로부터, iNOS의 특이적 저해제는 염증 등에 기인하는 다양한 병태에 대한 개선 효과를 기대할 수 있다(Y. Hirata 등[계간화학총설; NO 화학과 생물, 30, 161 (1996), 학회출판센터]).

최근 들어, 증가 일로를 걷는 아토피성 피부염, 천식, 화분증 발병 등의 알레르기 질환이 큰 사회 문제가 되고 있다. 알레르기 반응에는, 관여하는 면역 담당 세포나 면역 글로불린에 의해 I형부터 IV형까지 분류되어 있다. 알레르기성 접촉 피부염 등의 질환은 IV형 알레르기에 속하며, T 세포가 관여하는 지연형의 반응으로, 랑게르한스 세포나 마크로파지 등의 항원 제시 세포를 통해 항원 정보가 전달된 감작 T 세포가 다양한 사이토카인을 방출하고, 이에 따라 호산구나 마크로파지의 집적에 의해 지연형의 염증 반응이 발생한다. IV형 알레르기성 질환에는 스테로이드제도 이용한 외용 요법 등이 이용되고, T 세포나 마크로파지에 기능하여 사이토카인의 생산을 억제하는 작용을 갖고, 습진의 치료에 특효적인 효과를 발휘한다. 그러나, 스테로이드제는 대량 또는 장기간 사용하는 경우, 전신적으로는 부신 피질 기능 저하, 국소적으로는 피부 위축, 조홍, 모세 혈관 확장 등의 중증의 부작용을 야기할 가능성이 높아 안전성에 문제가 있다. 따라서, 이들 스테로이드제 등을 대체하는 부작용이 적고 안전한 신규 약제의 개발이 요망되고 있다.

R.M.J. Palmer 등[Nature, 327, 524 (1986)] L.J. Ignarro 등[Pro. Natl. Acad.Sci., 84, 96254 (1987)] T.M. Dawson 등[Ann. Neurol., 32, 297 (1992)] P.L. Feldman 등[Chem. Eng. News, 20, 26 (1993)] J.F. Kerwin 등[J. Med. Chem., 38, 4342 (1995)] S. Moncada 등[Pharmacol Rev., 43, 109 (1991)] J.B. Hibbs 등[J. Immunol., 138, 550 (1987)] A.K. Nussler 등[J. Leukocyte. Biol., 54, 171 (1993)] L. Salerno 등[Curr. Pharm. Des., 8, 1774 (2002)] Y. Hirata 등[계간화학총설; NO 화학과 생물, 30, 161 (1996), 학회출판센터] S. Cheng 등[Tetrahedron, 64, 9698-9704 (2008)] B.F. Bowden 등[Aust.J.Chem. 31, 1303 (1978)] Y. Yamada 등[Chem.Pharm.Bull. 27, 2394 (1979)] Y. Yamada 등[Tetrahedron Lett. 21, 3911 (1980)] K. Iguchi 등[Chem.Lett., 319 (1991)] B.F. Bowden 등[Aust.J.Chem. 31, 1303 (1978)] M. Kobayashi 등[Chem.Pharm.Bull. 35, 2314 (1987)] T. Kusumi 등[Tetrahedron Lett. 29, 4731 (1988)] Y. Uchio 등[Tetrahedron Lett. 26, 4487 (1985)] T. Kusumi 등[Tetrahedron Lett. 29, 4731 (1988)]

본 발명의 목적은 일산화질소(NO)의 과잉 생산을 저해하는 약물, 및 NO의 과잉 생산 또는 발현이 관여하는 질환(염증, 알레르기성 질환 등)의 치료약을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해, 리포폴리사카라이드(LPS) 자극에 의해 야기되는 마크로파지 유사 세포주(RAW264.7)에서의 NO 생산을 억제하는 활성을 지표로서 이용하고, 일본 근해에 생식하는 해양 생물을 대상으로 화합물의 탐색과 평가를 행하였다. 그 결과, 오키나와 근해에 생식하는 연산호(Lobophytum crassum)로부터 3종의 셈브란형 디테르페노이드를 단리하여 그의 화학 구조를 해명하고, 또한 이들 3종의 화합물 및 그의 유도체가 우수한 NO 생산 억제 활성 및 옥사졸론 유발 이개(耳介) 부종 억제 활성을 가짐을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 하기 화학식 (A)로 표시되는 셈브란 디테르펜 또는 그의 약리학상 허용되는 염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 염증의 예방 또는 치료약, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료약, 및 일산화질소 생산 억제제가 제공된다.

[식 중, A는

이고;

#1 및 #2는 각각, 화학식 (A)에서의 #1로 지시되는 탄소와의 결합 위치 및 #2로 지시되는 탄소와의 결합 위치를 나타내고;

X₁ 및 X₂는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 -(C=O)-R로 표시되는 기이고, -R은 탄소수 1 내지 20의 알킬기임]

화학식 (A)로 표시되는 화합물에는,

로보피톨 아세테이트 (X₁=아세틸기):

셈브라노이드 C:

덴티쿨라톨라이드(X₂=아세틸기):

로서 알려진 공지 화합물이 포함된다.

본 발명에 따르면, 천연물에서 유래하는 화합물을 유효 성분으로 하는, 염증의 예방 또는 치료약, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료약, 및 일산화질소(NO)의 세포에 의한 생산의 억제제가 제공된다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2009-072548호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1a는 로보피톨 아세테이트를 작용시킨 경우의, 대조구와 비교한 NO 생산율을 나타낸다.
도 1b는 셈브라노이드 C를 작용시킨 경우의, 대조구와 비교한 NO 생산율을 나타낸다.
도 1c는 덴티쿨라톨라이드를 작용시킨 경우의, 대조구와 비교한 NO 생산율을 나타낸다.
도 1d는 노르말 헥산 추출 농축액을 작용시킨 경우의, 대조구와 비교한 NO 생산율을 나타낸다.
도 2a는 로보피톨 아세테이트 존재 조건에서의 세포 생존율을 나타낸다.
도 2b는 셈브라노이드 C 존재 조건에서의 세포 생존율을 나타낸다.
도 2c는 덴티쿨라톨라이드 존재 조건에서의 세포 생존율을 나타낸다.
도 2d는 노르말 헥산 추출 농축액 존재 조건에서의 세포 생존율을 나타낸다.
도 3은 각 약물의 iNOS 단백질 발현 억제 활성을 나타낸다.
도 4는 LPS 투여에 의한 GCSF, IL-12, MCP-1의 증가에 대한, 각 약물에 의한 억제 효과를 나타낸다.
도 5는 각 약물을 투여했을 때의 GCSF, IL-12, MCP-1의 양을, 약물을 투여하지 않은 경우와 비교한 비율을 나타낸다.
도 6a는 각 약물을 피부에 도포한 경우의, 이개 중량에 기초하여 산출된 이개 부종율을 나타낸다.
도 6b는 각 약물을 피부에 도포한 경우의, 이개 두께에 기초하여 산출된 이개 부종율을 나타낸다.
도 7a는 각 약물을 복강내 투여한 경우의, 이개 중량에 기초하여 산출된 이개 부종율을 나타낸다.
도 7b는 각 약물을 복강내 투여한 경우의, 이개 두께에 기초하여 산출된 이개 부종율을 나타낸다.

1. 활성 성분

로보피톨 아세테이트(lobophytol acetate: 화학식 1)는 B.F. Bowden 등[Aust.J.Chem. 31, 1303 (1978)], Y. Yamada 등[Chem.Pharm.Bull. 27, 2394 (1979)], Y. Yamada 등[Tetrahedron Lett. 21, 3911 (1980)], K. Iguchi 등[Chem.Lett., 319 (1991)]에 의한 보고예가 있지만, 현재까지 본 발명의 물질이 NO 생산 억제 작용을 갖는다는 보고는 없다. 또한, 셈브라노이드 C(cembranoid C: 화학식 2)는 B.F. Bowden 등[Aust.J.Chem. 31, 1303 (1978)], M. Kobayashi 등[Chem.Pharm.Bull. 35, 2314 (1987)], T. Kusumi 등[Tetrahedron Lett. 29, 4731 (1988)]에 의한 보고예가 있지만, 현재까지 본 발명의 물질이 NO 생산 억제 작용을 갖는다는 보고는 없다. 또한, 덴티쿨라톨라이드(denticulatolide: 화학식 3)는 Y. Uchio 등[Tetrahedron Lett. 26, 4487 (1985)], T. Kusumi 등[Tetrahedron Lett. 29, 4731 (1988)]에 의한 보고예가 있지만, 현재까지 본 발명의 물질이 NO 생산 억제 작용을 갖는다는 보고는 없다.

한편, S. Cheng 등[Tetrahedron, 64, 9698-9704 (2008)]에는 연산호(Lobophytum drum) 추출물에 포함되는 복수의 화합물이 항염증 작용을 갖는 것이 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌에서는 상기 화학식 (A)로 표시되는 골격을 갖는 3 종류의 화합물이 NO 생산 억제 작용, 항염증 작용, 알레르기 증상 억제 작용을 갖는 것은 일절 시사되어 있지 않다.

본 발명에서 이용되는 로보피톨 아세테이트, 셈브라노이드 C, 및 덴티쿨라톨라이드는 연산호(Lobophytum carssum, Lobophytum pauciflorum, Lobophytum denticulatum, Sinularia mayi)로부터 고수량으로 얻어지기 때문에, 탁솔을 비롯한 많은 천연물 유래의 의약품 개발에 있어서 장벽이 되는 원료 공급에 관한 문제도 극복할 수 있다.

추출 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 로보피텀 카르섬(Lobophytum carssum) 등의 연산호를 한 변이 10 내지 20 cm 정도의 크기가 되도록 절단하고, 단편을 유기 용매에 의해 추출하여 추출액을 얻는다. 얻어진 추출액을 컬럼 크로마토그래피에 제공하고, 로보피톨 아세테이트, 셈브라노이드 C 및 덴티쿨라톨라이드를 정제물로서 얻을 수 있다. 추출용의 유기 용매로서는 노르말 헥산 등의 비극성 유기 용매가 특히 바람직하지만, 디에틸에테르, 에탄올, 메탄올, 아세톤 등의 극성 유기 용매를 사용할 수도 있다. 비극성 유기 용매에 의한 추출물은 후술하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제가 용이하다. 컬럼 크로마토그래피로서는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피가 특히 바람직하지만, 고분해능 유기 용매계 겔 침투 크로마토그래피(GPC)도 사용할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제를 행하지 않은, 로보피텀 카르섬 등의 연산호의 상기 유기 용매에 의한 추출물 자체도 본 발명이 목적으로 하는 활성을 갖는다.

또한, 로보피톨 아세테이트(화학식 (1))를 유도체화하여 화학식 (A)의 A가

[X₁은 수소 원자 또는 -(C=O)-R로 표시되는 기이고, -R은 탄소수 1 내지 20, 바람직하게는 탄소수 1 내지 12, 보다 바람직하게는 탄소수 1 내지 8, 특히 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬기임]

인 화합물을 제조할 수 있다. 유도체화의 방법으로서는, 로보피톨 아세테이트를 K₂CO₃/EtOH 또는 0.1M NaOMe/MeOH로 실온 하에서 교반함으로써 탈아세틸화하여 X₁이 수소 원자인 탈아세틸화체를 얻고, 추가로 필요에 따라, 상기 탈아세틸화체의 수산기를 지방족 카르복실산(R-C(=O)-OH)에 의해 에스테르화함으로써, X₁이 -(C=O)-R인 에스테르화체를 제조하는 방법을 들 수 있다.

또한, 덴티쿨라톨라이드(화학식 (3))를 유도체화하여, 화학식 (A)의 A가

[X₂는 수소 원자 또는 -(C=O)-R로 표시되는 기이고, -R은 탄소수 1 내지 20, 바람직하게는 탄소수 1 내지 12, 보다 바람직하게는 탄소수 1 내지 8, 특히 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬기임]

인 화합물을 제조할 수 있다. 유도체화의 방법은 로보피톨 아세테이트의 유도체화와 동일한 방법을 들 수 있다.

로보피톨 아세테이트 또는 상기 로보피톨 아세테이트 유도체, 셈브라노이드 C, 또는 덴티쿨라톨라이드 또는 상기 덴티쿨라톨라이드 유도체는 약리학상 허용되는 염의 형태로 사용될 수도 있다. 적용 가능한 염으로서는 나트륨, 칼륨, 마그네슘 등의 금속과의 염을 들 수 있다.

로보피톨 아세테이트, 상기 로보피톨 아세테이트 유도체, 셈브라노이드 C, 덴티쿨라톨라이드, 및 상기 덴티쿨라톨라이드 유도체는 각각 단독으로 본 발명의 용도에 사용할 수도 있고, 2종 이상 조합하여 본 발명의 용도에 사용할 수도 있다.

2. 용도

로보피톨 아세테이트 또는 상기 로보피톨 아세테이트 유도체, 셈브라노이드 C, 또는 덴티쿨라톨라이드 또는 상기 덴티쿨라톨라이드 유도체는 세포에 있어서 리포다당(LPS)에 의해 야기되는 일산화질소(NO)의 생산을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 NO 생산 억제제는 NO의 과잉 생산이 관여하는 각종 질환의 치료 또는 예방의 용도에 사용할 수 있다. 이러한 질환으로서는, 예를 들면 알레르기성 질환, 염증, 패혈증성 쇼크, SLE(전신성 에리테마토데스), RA(만성 관절 류마티스) 등의 교원병, 동맥경화, 인슐린 저항성 당뇨병 등의 대사성 질환이나 다발성 경화증, 이식, 바이러스성 간염, HIV 감염 등의 각종 감염증을 들 수 있다. 이하에 나타내는 실시예에서는 특히, 로보피톨 아세테이트, 셈브라노이드 C, 및 덴티쿨라톨라이드가, 염증 및 알레르기성 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 것이 확인된다.

본 발명의 용도에서는 로보피톨 아세테이트 또는 상기 로보피톨 아세테이트 유도체, 셈브라노이드 C, 또는 덴티쿨라톨라이드 또는 상기 덴티쿨라톨라이드 유도체는 각각, 조정제물 또는 정제물의 형태로 그대로 사용될 수도 있고, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 조합한 의약 조성물로서 사용될 수도 있다. 의약 조성물에 포함되는 담체, 부형제는 공지된 것을 사용할 수 있다. 의약 조성물의 형태로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 정제, 캡슐제(연질캡슐, 마이크로캡슐을 포함함), 액제 등의 경구 투여용 제제일 수도 있고, 주사제, 좌제, 피부 외용제(예를 들면 경피 흡수제, 첩부제, 연고제) 등의 비경구 투여용 제제일 수도 있다.

투여 방법은 경구 투여일 수도 있고 비경구 투여일 수도 있지만, 특히 경구 투여, 경피 투여, 정맥내 투여가 바람직하고, 경구 투여 및 경피 투여가 가장 바람직하다.

투여 대상은 인간 등의 포유동물인 것이 바람직하다.

투여량은 투여 대상, 투여 경로, 증상 등에 따라서도 다르지만, 예를 들면, 성인에는 1일당 통상 0.1 mg/kg 내지 40 mg/kg 체중 정도, 바람직하게는 0.5 mg/kg 내지 20 mg/kg 체중 정도이다.

본 발명의 NO 생산 억제제는 또한, 세포에 의한 NO의 생산을 시험관 내(in vitro)에서 억제하기 위한 시약으로서 이용할 수도 있다. 이 경우에 본 발명의 NO 생산 억제제가 제공되는 세포는 특별히 한정되지 않으며, 시험 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

<실시예>

이하에 본 발명에 따른 염증, 알레르기성 질환 치료약의 특징을 더욱 구체적으로 밝히기 위해 실시예를 나타낸다.

제조예 1: 셈브란 디테르펜의 제조

오키나와켕 모토부쵸 세소코섬의 수심 1 내지 2 m에서 채취한 연산호(Lobophytum crassum) 15 kg을 10 내지 20센티미터변(角)으로 절단하고 그대로 노르말 헥산 15 L로 12시간 실온에서 추출하고, 여과 후, 잔사를 추가로 노르말 헥산 15 L로 2회 추출하고, 여과한 후, 여과액을 합치고, 감압하에 용매를 증류 제거하여 노르말 헥산 추출 농축액 90.38 g을 얻었다. 이 노르말 헥산 추출 농축액 1.47 g을 실리카겔(Silica gel 60, 머크사, 2.5×55 cm, 150 g)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 행하고, 노르말 헥산/아세트산에틸(4:1→ 0:1)로 용출하여 얻어진 분획(각 10 mL)을 박층 크로마토그래피(실리카겔 60 F254, 머크사)에 의해 검토하고, 10개의 분획물 Fr.1(200.3 mg), Fr.2(61.5 mg), Fr.3(234.0 mg), Fr.4(89.8 mg), Fr.5(72.1 mg), Fr.6(78.2 mg), Fr.7(422.9 mg), Fr.8(43.7 mg), Fr.9(23.5 mg), Fr.10(148.6 mg)으로 분획하였다. 이 중 Fr.7을 로보피톨 아세테이트 화학식 (1)이라 동정하였다. 또한, Fr.3(170.0 mg)을 클로로포름에 용해시키고, 고분해능 유기 용매계 GPC 컬럼(JAIGEL-1H+JAIGEL-2H, 내경 20 mm, 길이 600 mm, 니혼 분세끼 고교)을 이용한 재순환 분취 HPLC(LC-9201, 니혼 분세끼 고교)로 클로로포름을 용매로 이용하여 10회 재순환을 행하여, Fr.3-1(28.8 mg)과 Fr.3-2(112.6 mg)로 분리하였다. Fr.3-2는 셈브라노이드 C 화학식 (2), Fr.3-1은 덴티쿨라톨라이드 화학식 (3)이라 동정하였다. 동정 데이터는 이하와 같다.

로보피톨 아세테이트 화학식 (1)

셈브라노이드 C 화학식 (2)

덴티쿨라톨라이드 화학식 (3)

시험예 1: NO 생산 억제 시험

RAW264.7(RCB0535, 리켄 사이보 뱅크)은 10％ FBS(IWAKI), 2％ 페니실린-스트렙토마이신(GibcoBRL) 및 1％ NEAA(비필수 아미노산)(GibcoBRL.)을 첨가한 DMEM(GibcoBRL) 배지에서 5％ CO₂ 중 37℃의 인큐베이터(Thermo Bio Analysis)에서 계대(繼代) 배양하였다.

96 구멍 마이크로플레이트(NALGE NUNC)의 각 웰에 RAW264.7 cell(1.0×10⁶ cell/well)을 160 μl씩 가하고 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 페놀레드를 포함하지 않는 DMEM(GibcoBRL)으로 제조한 배지 160 μl로 교체하고, 1 μg/ml LPS(리포다당)(Wako) 20 μl를 첨가하여 자극을 주었다. 3 시간 배양 후, 각 농도로 희석한 약물 또는 각 농도로 희석한 제조예 1의 노르말 헥산 추출 농축액(20 μl)으로 처리하고, 추가로 20 시간 배양 후, 상청 100 μl를 새로운 96 구멍 마이크로플레이트에 옮기고, 그리스(Griess) 시약(Wako) 1％ 수용액(100 μl)을 가하여 10분 정관한 후, 플레이트 리더(Immuno Mini NJ-2300, Nunc)를 이용하여 540 nm의 흡광도를 측정하였다.

도 1a 내지 도 1d에는 각 약물 또는 노르말 헥산 추출 농축액을 소정 농도로 첨가한 경우의, LPS 자극에 대한 RAW264.7로부터의 NO 생산량을 약물 무첨가시와 비교한 비율(NO 생산율)을 나타낸다. 각 약물의 샘플에 대하여 n=6으로 시험하였다. 도 1a 내지 1d에 있어서, 각각 표준편차를 산출하여 에러 바(error bar)로서 표시하였다. 또한, NO 생산율은 이하의 식에 의해 산출하였다. 각 약물의 50％ NO 생산 억제 농도(NO 생산율이 50％가 될 때의 약물 농도)를 표 1에 나타낸다.

NO 생산율(％)=[OD₅₄₀]₍ _LPS _+약물)/[OD₅₄₀]_LPS×100

시험예 2: 세포 독성 시험

세포 독성 시험은 시험예 1의 상청액을 제거한 후의 세포 함유 배지(100 μl)에 10 μl의 MTS 시약(CellTiter 96, Promega)을 첨가하고, 추가로 2 시간 배양 후 플레이트 리더를 이용하여 490 nm의 흡광도를 측정하였다. 각 약물 또는 노르말 헥산 추출 농축액으로 처리한 RAW264.7의 세포 생존율을 도 2a 내지 2d에 나타낸다.

시험예 3: iNOS 단백질의 발현 억제 시험

10 cm 페트리 접시(NALGE NUNC, NY, U.S.A.)에 RAW264.7 cell(1.0×10⁶ cell/well)을 4 ml씩 가하고, 24 시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 페놀레드를 포함하지 않는 DMEM(GibcoBRL, GrandIsland, NY, U.S.A.)으로 제조한 배지 4 ml로 교체하고, 0.4 mg/ml LPS(리포다당)(Wako, Osaka, Japan) 10 μl를 첨가하여 자극을 주었다. LPS 첨가 3 시간 후에 DMSO로 각 농도로 희석한 약물(10 μl)로 처리하고, 추가로 9시간 배양 후, 세포를 회수하고 100 μl의 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(Mammalian Protein Extraction Reagent)(PIERCE, Rockford, U.S.A.)로 단백질의 추출을 행하였다. 램리 샘플 완충액(Laemmli Sample Buffer)(BIO-RAD, CA, U.S.A.)에 β-머캅토에탄올 19:1의 비율로 제조한 샘플 완충액에 단백질 추출 용액을 1:2의 비율로 혼합 제조하였다. 조정 후, 95℃, 5분간의 열 처리에 의해 디술피드 결합의 해열을 행하고, 그 후 5-20％ 구배 겔(ATTO, Tokyo, Japan)에 약물을 15 μl/레인 적용 후, 250V, 20 mA/겔, 75분의 조건으로 영동하였다. 전기영동조에는 AE-6530P(ATTO, Tokyo, Japan), 전원 장치로는 AE-8130(ATTO, Tokyo, Japan), 영동 완충액(Tris: 3.0 g, 글리신: 14.4 g, SDS: 1L dH₂O 내 1.0 g), 분자량 마커로는 프래시죤 플러스 블루 스텐다드(BIO-RAD, CA, U.S.A.)를 이용하였다. PVDF: AE-6665 클리어블롯 P막 8.5×9 cm(ATTO, Tokyo, Japan)를 MeOH에 20초간 침지한 후, B액(Tris: 0.6 g, MeOH: 40 ml, dH₂O: 160 ml)에 30분간 침지한다. 동시에, 흡수 페이퍼: CB09A8.5×9 cm(ATTO, Tokyo, Japan)를 A액(Tris: 3.64 g, MeOH: 20 ml, dH₂O: 80 ml)에 2장, B액에 1장, C액(Tris: 0.6 g, MeOH: 40 ml, dH₂O: 160 ml, H₃BO₃로 pH9.5로 제조)에 3장 침지한다. SDS-PAGE 종료 후, 겔을 플레이트로부터 박리하여 C액에 침지하고, 그 후 전극을 A액으로 적셔 양극(하측)으로부터 흡수 페이퍼(A액) 2장, 흡수 페이퍼(B액) 1장, PVDF막, 겔, 흡수 페이퍼(C액) 3장의 순으로 중첩한다. 기포가 들어가지 않도록 음극(상측)의 전극을 내린다. 블로팅 장치로는 AE-6677S (ATTO, Tokyo, Japan)를 이용하고, 전원 장치로는 AE-8130(ATTO, Tokyo, Japan)을 이용하고, 150 mA, 25V, 45분의 조건으로 행하였다. 블로팅 종료 후의 PVDF막을 1 mL의 TPBS[트윈 20(ICN, Ohio, U.S.A.)을 가한 PBS(NaCl: 137 mM, Na₂HPO₄ 무수: 8.1 mM, KCl: 2.68 mM, KH₂PO₄: 1.47 mM, dH₂O: 1L)] 중에서 실온에서 5분간 침탕을 3회 반복한다. 그 후, PVDF막을 5％ 스킴 밀크 파우더(WAKO, Osaka, Japan)로 1시간 실온 침탕에 의해 블록킹을 행한다. 블록킹 후, TPBS(5 분×3)에 의해 블록킹액을 씻어낸다. 또한, 1차 항체에 의한 결합 반응을 2시간 실온 침탕에 의해 행하고, TPBS(5 분×3)에 의해 씻어낸다. 그 후, 항마우스 IgG, HRP 결합 전항체(HRP linked whole antibody)(아머샴(Amersham))에 의한 2차 항체 반응을 행하고, TPBS(5 분×3)에 의해 세정한 후, ECL 플러스 웨스턴 블로팅 디텍션 시스템(아머샴)에 의한 발색 반응을 행한다. iNOS 단백질의 1차 항체로는 정제된 마우스(purified Mouse) 항-iNOS/NOS 타입II Mab(BD transduction laboratories, U.S.A)를 이용하였다. PVDF막은 발색 기질 첨가 후 하이퍼 필름(등록상표)ECL(아머샴)을 하이퍼 카세트(아머샴) 내에서 노광하고, 현상제(developer) 및 보충제(replenisher)(Kodak), 빙초산(Kishida chemical, Osaka, Japan), 정착제(fixer) 및 보충제(Kodak)의 순으로 적셔 현상을 행하였다. 각 약물로 처리했을 때의 RAW264.7에서의 iNOS 단백질 발현 억제 효과를 도 3에 나타낸다. 또한, 각 약물의 50％ iNOS 발현 억제 농도(iNOS 발현율이 50％가 될 때의 약물 농도)를 표 2에 나타낸다.

시험예 4: 항체 어레이에 의한 혈중 사이토카인의 변동 해석

생후 5 주령의 마우스(CH3/HeNJcl, ♀, 구레아)를 6주령까지 사육하고, 25 μg/kg LPS를 복강 내 투여하고, 1시간 후에 로보피톨 아세테이트(화학식 1) 및 셈브라노이드 C(화학식 2)를 0.5％ 카르복시메틸셀룰로오스 용액에 용해시켜 50 mg/kg 및 100 mg/kg 복강 내 및 경구 투여하였다. 투여 2 시간 후, 안와정맥총으로부터 약 0.1 mL의 채혈을 행하고, 레이바이오(RayBio)사 제조의 마우스 사이토카인 항체 어레이(Mouse Cytokine Antibody Array)에 부속된 취급 설명서에 따라 조작을 행하였다. 항체 어레이의 해석에는 이미지(Image)J 1.33u(National Institute of Health, U.S.A)를 이용하여 해석을 행하였다. LPS 투여에 의해 혈중 농도가 증가한 GCSF(과립구 콜로니 자극 인자), IL-12(인터루킨 12), MCP-1(단구 주화성 인자)에 대한 각 약물에 의한 억제 효과를 도 4에 나타낸다. 또한, 각 약물을 투여했을 때의 상기 사이토카인류의 양을, 약물을 투여하지 않은 경우와 비교한 비율을 도 5에 나타낸다.

시험예 5: 옥사졸론 유발 이개 부종 억제 활성(피부 도포)

생후 5 주령의 마우스(ICR계, ♂, 구레아) 1군 8 마리를 6 주령까지 사육하고, 0.5％ 옥사졸론의 에탄올 용액(100 μL)을 복강 내 투여하여 감작하였다. 감작 5일 후에 마우스의 오른쪽 귀의 피부에 다양한 농도로 제조한 로보피톨 아세테이트(화학식 1)의 아세톤 용액 10 μL와 0.5％ 옥사졸론의 아세톤 용액 10 μL를 혼합하고, 이개 피부 전체에 퍼지도록 도포하였다. 또한, 왼쪽 귀에는 아세톤 용액 10 μL만 도포하였다. 또한, 양성 대조구로서 기존의 스테로이드제인 덱사메타손을 비교 대상으로 하였다. 1일 후 이개의 두께와 절제한 이개의 중량을 측정하였다.

부종율은 이하의 식에 의해 산출하였다.

이개 부종율=[오른쪽 귀_{(중량·두께)}-왼쪽 귀_{(중량·두께)}]/왼쪽 귀_{(중량·두께)}×100

또한, 옥사졸론 유발 이개 부종 모델은 합텐 항원의 하나인 옥사졸론을 마우스의 복부 피부에 도포하여 감작하고, 그 일정 시간 후에 옥사졸론을 이개 피부에 도포(챌린지)하여 이개 부종을 유발하는 지속성의 알레르기성 염증 모델이다. 이 이개 부종은 도포한 옥사졸론이 피부의 단백질과 결합하여 항원이 되고, 그 항원 정보를 T-림프구가 획득하고, 여기에 재도포된 옥사졸론과 단백질의 결합물이 접촉함으로써, 류코트리엔류, 프로스타글란딘류, 히스타민, 사이토카인류 등의 화학적 매개체가 유리·생산되어 야기된다.

각 약물을 적용한 경우의 이개 부종 억제 활성(부종율의 저하)를 도 6a 및 6b에 나타낸다.

시험예 6: 옥사졸론 유발 이개 부종 억제 활성(복강 내 투여)

생후 5 주령의 마우스(ICR계, ♂, 구레아) 1군 2 마리를 6 주령까지 사육하고, 0.5％ 옥사졸론의 에탄올 용액(100 μL)을 복강 내 투여하여 감작하였다. 감작 5일 후에 마우스의 양 이개의 내측 및 외측의 피부에 0.5％ 옥사졸론의 아세톤 용액 10 μL를 혼합하고, 이개 피부 전체에 퍼지도록 도포하였다. 도포 1 시간 전에 로보피톨 아세테이트(화학식 1) 및 셈브라노이드 C(화학식 2)를 각 100 mg/kg 복강 내 투여하였다. 또한, 비교 대상으로서 프렉시빌리드[미야모토 토모후미 등, 일본 특허 공개 제2004-262849]를 이용하였다. 1일 후 이개의 두께와 절제한 이개의 중량을 측정하였다. 각 약물을 투여한 경우의 이개 부종율을 도 7a 및 7b에 나타낸다.

Claims

화학식 (A)로 표시되는 셈브란 디테르펜 또는 그의 약리학상 허용되는 염을 유효 성분으로서 함유하는 염증의 예방 또는 치료약.

[식 중, A는

이고 ;
#1 및 #2는 각각 화학식 (A)에서의 #1로 지시되는 탄소와의 결합 위치 및 #2로 지시되는 탄소와의 결합 위치를 나타내고;
X₁ 및 X₂는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 -(C=O)-R로 표시되는 기이고, -R은 탄소수 1 내지 20의 알킬기임]
화학식 (A)로 표시되는 셈브란 디테르펜 또는 그의 약리학상 허용되는 염을 유효 성분으로서 함유하는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료약.

[식 중, A는

이고;
#1 및 #2는 각각, 화학식 (A)에서의 #1로 지시되는 탄소와의 결합 위치 및 #2로 지시되는 탄소와의 결합 위치를 나타내고;
X₁ 및 X₂는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 -(C=O)-R로 표시되는 기이고, -R은 탄소수 1 내지 20의 알킬기임]
화학식 (A)로 표시되는 셈브란 디테르펜 또는 그의 약리학상 허용되는 염을 유효 성분으로서 함유하는 일산화질소 생산 억제제.

[식 중, A는

이고;
#1 및 #2는 각각 화학식 (A)에서의 #1로 지시되는 탄소와의 결합 위치 및 #2로 지시되는 탄소와의 결합 위치를 나타내고;
X₁ 및 X₂는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 -(C=O)-R로 표시되는 기이고, -R은 탄소수 1 내지 20의 알킬기임]
로보피텀 카르섬(Lobophytum carssum), 로보피텀 포시플로럼(Lobophytum pauciflorum), 로보피텀 덴티큘라텀(Lobophytum denticulatum), 또는 시뉼라리아 마이(Sinularia mayi)인 연산호의 유기 용매에 의한 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 염증의 예방 또는 치료약.
로보피텀 카르섬(Lobophytum carssum), 로보피텀 포시플로럼(Lobophytum pauciflorum), 로보피텀 덴티큘라텀(Lobophytum denticulatum), 또는 시뉼라리아 마이(Sinularia mayi)인 연산호의 유기 용매에 의한 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료약.
로보피텀 카르섬(Lobophytum carssum), 로보피텀 포시플로럼(Lobophytum pauciflorum), 로보피텀 덴티큘라텀(Lobophytum denticulatum), 또는 시뉼라리아 마이(Sinularia mayi)인 연산호의 유기 용매에 의한 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 일산화질소 생산 억제제.