KR20160087688A - 새로운 파이계 확장 아세단 유도체, 이의 생체 영상화 응용, 및 알츠하이머병 동물 모델에서의 아밀로이드-베타 플라크의 이광자 현미경 영상화에의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 파이-결합이 확장된 신규 아세단 유사체, 이를 제조하는 방법, 및 이를 이용한 아밀로이드-베타 플라크(amyloid-beta plaque)의 이광자 전자현미경 영상화 방법 등에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 종래의 이광자 흡수 형광체인 아세단 및 아세단 유사체에 비해 더 긴 흡수 파장 및 방출 파장을 가진 새로운 이광자 흡수 형광체 화합물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 세포 또는 조직을 영상화(imaging)함으로써 생체 내 영상화 연구에 유용하게 이용할 수 있고, 아밀로이드-베타 플라크를 영상화함으로써 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 진단에도 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 새로운 이광자 흡수 형광체 화합물인 파이-결합이 확장된 아세단 유사체, 이를 제조하는 방법, 이를 이용한 생체 영상화 응용, 및 알츠하이머병 동물 모델에서의 아밀로이드-베타 플라크의 이광자 전자현미경 영상화에의 응용 등에 관한 것이다.
형광(fluorescence)신호를 바탕으로 한 생체 영상화(bio-imaging) 기술은 세포 소기관(organelle)을 비롯하여 동물 모델에서의 조직(tissue) 등을 시각화할 수 있는 방법으로 널리 활용되고 있으며, 이 중 형광 프로브(fluorescent probe)의 개발은 생체 내 특정 물질 분석 및 영상화에 있어 그 활용범위를 확장시킨다[Nagano, T. et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2008, 12, 515; Kikuchi, K. Chem, Soc. Rev. 2010, 39, 2048; Chang, C. et al. Nat. Chem. 2012, 4, 973].
현재까지 보고된 대부분의 형광 프로브는 일광자 흡수(one-photon absorption) 형광체를 기반으로 하고, 일광자 전자현미경(one-photon microscopy, OPM)에 의한 영상화 과정을 거친다. 하지만, 일반적인 일광자 전자현미경의 사용은 조직(tissue) 영상화에 있어 강한 빛 산란(light scattering)으로 인한 영상 화질의 감소 및 100 μm이내의 얕은 조직 영상화 등의 단점을 가진다[Weissleder, R. et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14, 71; Nie, S. et al. Nat. Nanotechnol. 2009, 4, 710].
비선형 광학 전자현미경(nonlinear optical microscopy)은 이러한 빛 산란의 영향에 민감하지 않으면서, 보다 깊은 조직에서의 고해상도 영상화에 적합한 특성을 가진다. 이광자 전자현미경(two-photon microscopy, TPM)은 비선형 광학 전자현미경의 한 종류로서, 일광자 전자현미경(one-photon microscopy, OPM)에서 사용되는 광자(photon) 에너지의 절반에 해당하는 에너지를 가지는 두 개의 광자를 동시에 형광체(fluorophore)에 조사하여 줌으로써 형광체를 여기(excitation) 시키는 특징을 가진다. 따라서, 생체 영상화(bio-imaging) 응용에 있어 높은 조직 투과성, 향상된 광자 침투 깊이, 생체 조직에 대한 낮은 광-손상(photo-damage)과 낮은 광-퇴색(photobleaching) 등의 장점을 나타낸다. 또한, 생체 내 자가형광(auto-fluorescence) 물질에 의한 간섭 영향이 적으며, 초점 부위(focal point)만 형광체가 여기되기 때문에 고해상도 영상을 구현할 수 있는 장점을 가진다[Zipfel, W. R. et al. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 1369; Helmchen, F. et al. Nat. Methods, 2005, 2, 932; Willams, W. R. et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 603].
생체 영상화를 위해서 요구되는 특성을 가진 이광자 흡수(two-photon absorption, TPA) 형광체는 그 수가 한정되어 있다. 이광자 흡수 형광체의 대표적인 예로써, 하기 화학식 10으로 표현되는 아세단(Acedan, 1-(6-dimethylaminonaphthalen-2-yl) ethanone)은 방향족 고리(π-system)에 전자 공여체(D)와 전자 수용체(A)를 가지는 D-π-A 형태의 쌍극성 형광체(dipolar dye)이며, 높은 광-안정성(photo-stablity) 및 꽤 큰 이광자 흡수 단면 값을 가지기 때문에 살아있는 세포 및 조직에서의 이광자 전자현미경 영상화 연구에 활용되고 있다[Kim, H. M. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2007. 46, 3460; Kim, H. M. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 5167; Kim, H. M. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 7445].
[화학식 10]
하지만 아세단은 최대 흡수 파장(<400 nm) 및 최대 방출 파장(<550 nm)이 다소 짧아 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 레티놀(retinol), 리보플라빈(riboflavin), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide)와 같은 생체 내 형광체의 자가형광에 의한 영향을 많이 받는다는 단점을 가지고 있다[Zipefel, W. R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 7075].
이에 더하여, 일반적인 아세단 유사체는 자가형광을 피하고 선명한 이광자 형광 전자현미경 영상을 얻기 위해 저출력(low-power) 레이저(laser)를 사용하거나, 신호처리과정을 거쳐 자가형광 신호를 제거해주는 과정을 거치는 문제점을 가진다. 따라서 자가형광을 피하면서 선명한 영상을 얻기 위해서는, 생물학적 광학 윈도우 (biological optical windows)에 적합하도록 900 nm 근처의 장파장에서 여기 시킬 수 있는 새로운 이광자 흡수 형광체가 확보되어야 한다.
아세단 유사체의 다른 예로는, 하기 화학식 2로 표현되는 GCTPOC은 하기 화학식 3으로 표현되는 녹색 형광 단백질 발색단(green fluorescent protein chromophore, GFP chromophore, p-HOBDI)을 기반으로 한 D-π-A 형태의 쌍극성 형광체가 있다[Yuan, L. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 10018]. 하지만, 이러한 형광체 역시 아세단과 같이 짧은 파장 영역(<400 nm)에서 최대 흡수 띠(maximum absorption band)를 나타내기 때문에 이광자 여기 조건(<800 nm)에서 생체 내 형광체의 의한 자가형광을 보인다는 문제점을 나타낸다.
[화학식 2]
[화학식 3]
이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 극복하기 위하여, 900 nm 근처의 장파장에서 이광자 여기(two-photon excitation)를 할 수 있는 새로운 이광자 흡수 형광체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 새로운 이광자 흡수 형광체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 화합물을 이용한 세포 및 조직의 영상화 방법과 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 개체에서 아밀로이드-베타 플라크(amyloid-beta plaque, Aβ plaque)의 영상화 방법을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명은 상기 화합물을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 수소(H), 메틸(Me), 알릴(allyl), 또는 C2-C12의 비치환된 알킬(alkyl)기일 수 있고;
R3는 
, 
, 
, 또는 R4와 환(ring)으로 연결된 시클로알킬(cycloalkyl)기일 수 있고;
R4는 수소 또는 R3와 환(ring)으로 연결된 시클로알킬기일 수 있으며;
상기 환으로 연결된 시클로알킬기는 
또는 
일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 화학식 4 내지 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 이광자 흡수 형광체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 이용한 세포 또는 조직의 영상화(imaging) 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 영상화 방법은 세포 또는 조직에서 아밀로이드-베타 플라크(amyloid-beta plaque) 영상화 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 영상화 방법은 세포 또는 조직에 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 처리한 후 형광 전자현미경으로 관측하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 형광 전자현미경은 일광자 형광 전자현미경 또는 이광자 형광 전자현미경일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 개체에 처리하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 방법은 세포 또는 조직에 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 처리한 후 형광 전자현미경으로 관측하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이에 더하여, 본 발명은 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 4로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 2-시클로헥센-1-온과 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄을 첨가하여 8-(디메틸아미노)-2,3,4아-테트라히드로-1H-벤조[비]잔텐-1-온을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 4]
또한, 본 발명은 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 5로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 2-시클로펜텐-1-온과 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄을 첨가하여 7-(디메틸아미노)-3,3아-디히드로벤조[지]시클로펜타[비]크로멘-1(2H)-온을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 5]
또한, 본 발명은 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 6으로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 3-부텐-2-온, 마그네슘 아이오다이드, 테트라메틸에틸렌디아민, 및 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하여 1-(8-(디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)에탄온을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 6]
또한, 본 발명은 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 7로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 프로파질 브로마이드와 포타슘 카보네이트를 첨가하여 6-(디메틸아미노)-3-(프로피닐-2-옥시)-2-나프탈알데히드를 합성한 후, 말로노나이트릴과 아이오딘화 구리를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 7]
또한, 본 발명은 6-(디메틸아미노)-3-(프로피닐-2-옥시)-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 8로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 말로노나이트릴, 아이오딘화 구리, 및 트리에틸아민을 첨가하여 2-((8-디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)메틸렌)말로노나이트릴을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
[화학식 8]
본 발명의 이광자 흡수 형광체는 종래의 이광자 흡수 형광제인 아세단 및 아세단 유사체에 비해 더 긴 흡수 파장 및 방출 파장을 가지고 있어 자가형광에 의한 영향을 최소화 할 수 있으며, 고해상도의 선명한 영상을 얻을 수 있으므로 영상화 연구에 유용하게 이용 가능할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 이광자 흡수 형광체를 이용하면 깊은 조직에서의 고해상도 영상화에 적합할 것으로 기대되며, 주변 환경에 민감한 형광 프로브로써 살아있는 알츠하이머병 동물 모델에서의 아밀로이드-베타 플라크의 영상화 등 생체 내 영상화 연구에 다양하게 응용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 10 μM 농도의 아세단(◆), 화합물 4a(R1=R2=Me) (■), 화합물 5a(R1=R2=Me) (□), 화합물 6a(R1=R2=Me) (●), 및 화합물 7a(R1=R2=Me) (○)의 에탄올(ethanol, EtOH) 용액에서의 흡수 스펙트럼(a)과 정규화된(normalized) 형광 방출 스펙트럼(b)을 나타낸 것이다.
도 2는 1 μM 농도의 아세단(a)과 화합물 4a(R1=R2=Me) (b)의 디클로로메탄(■, dichlroromethane, CH2Cl2), 아세토니트릴(□, acetonitrile, CH3CN), 에탄올(●, ethanol, EtOH), PBS(○, phosphate buffer saline) 완충(buffer) 용액(10 mM, pH 7.4, 0.1% 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 포함)에서의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 10 μM 농도의 아세단으로 처리된 쥐의 뇌, 간, 신장, 비장, 폐 조직을 780 nm에서 여기 시켰을 때의 이광자 형광 전자현미경 영상(a)과 10 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)로 처리된 쥐의 뇌, 간, 신장, 비장, 폐 조직을 900 nm에서 여기 시켰을 때의 이광자 형광 전자현미경 영상(b)을 나타낸 것이고, 10 μM 농도의 아세단과 10 μM 농도의 화합물 4a의 전자현미경 영상에서 형광의 상대적인 세기(각각 c, d)를 나타낸 것이다.
도 4는 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 0.1% DMSO 포함) 또는 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, aCSF, 1% DMSO 포함)에서 아밀로이드-베타 42(Aβ42, 20 μM)와 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA, 20 μg/mL)의 존재 유무에 따른 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 30 mg/kg의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 알츠하이머병이 발현된 생후 13개월의 쥐(5XFAD mice)에 복강 주사 후, 1000 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때 전두 피질에서의 이광자 형광 전자현미경 영상(a)과 60배 확대한 영상(b), 3차원(3-dimension, 3-D)으로 재구성된 이광자 형광 전자현미경 영상(c, d)을 나타낸 것이다.
도 6은 10 μM 농도의 아세단 및 화합물 4a-8a(R1=R2=Me)의 에탄올 용액에서의 최대 흡수 파장(maximum absorption wavelength, λabs), 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient, ε), 최대 발광 파장(maximum emission wavelength, λem), 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield, ΦF)을 나타낸 것이다.
도 7은 10 μM 농도의 아세단(◆), 화합물 4a(R1=R2=Me) (■), 화합물 5a(R1=R2=Me) (□), 화합물 6a(R1=R2=Me) (●), 및 화합물 7a(R1=R2=Me) (○)의 에탄올 용액에서의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 톨루엔(toluene), 디옥산(dioxane), 에틸 아세테이드(ethyl acetate), 디클로로메탄, 에탄올, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드(dimethylformamide), DMSO, PBS 완충 용액, 90% 에탄올/PBS 완충용액에서 화합물 4a(R1=R2=Me), 5a(R1=R2=Me), 6a(R1=R2=Me), 7a(R1=R2=Me)의 형광 방출 스펙트럼(각각 a, b, c, d)을 나타낸 것이다.
도 9는 톨루엔, 디옥산, 에틸 아세테이드, 디클로로메탄, 에탄올, 디메틸포름아미드, DMSO, PBS 완충 용액에서 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 흡수 스펙트럼(a)과 형광 방출 스펙트럼(b)을 나타낸 것이다.
도 10은 30 mg/kg의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 알츠하이머병이 발현된 생후 13개월의 쥐(5XFAD mice)에 복강 주사 후, 1000 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때 전두 피질에서의 이광자 형광 전자현미경 영상(a)과 10 mg/kg의 화합물 MeO-X04을 복강 주사 후, 780 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때 전두 피질에서의 이광자 형광 전자현미경 영상(b), (a)와 (b)를 융합한 영상(c)를 나타낸 것이다.
도 11은 1, 2, 5, 10 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me), 화합물 5a(R1=R2=Me), 화합물 6a(R1=R2=Me), 화합물 7a(R1=R2=Me)의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 1% 미만의 DMSO 포함)에서의 흡수 스펙트럼(각각 a, b, c, d)을 나타낸 것이다.
도 12는 1, 5, 10, 15, 20 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 2% 미만의 DMSO 포함)에서의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 10 μM 농도의 아세단(a) 및 화합물 4a(R1=R2=Me)(b)의 디클로로메탄 (■), 아세토니트릴(□), 에탄올(●) 용액에서의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14는 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 아밀로이드-베타 42(Aβ 42)의 농도에 따라(0-50 μM) 500 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때, 최대 방출 파장에서의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 15는 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 pH에 따라(pH 4-10) 500 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때, 최대 방출 파장에서의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 16은 10 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)의 톨루엔(■), 디메틸포름아미드(□), 에탄올(●)에서 150 mW(초점에서) 레이저 출력(laser power) 하에 이광자 작동 스펙트럼(two-photon action spectra)을 나타낸 것이다.
도 17은 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 에탄올에서 150 mW(초점에서) 레이저 출력 하에 이광자 작동 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 18은 50 μm 깊이의 알츠하이머병 동물 모델 조직에서 이광자 광원 조사 전/후에 따른 화합물 8a(R1=R2=Me)와 아밀로이드-베타 플라크 착화합물에 대한 광-퇴색 과정 영상(a)과 전자현미경 영상에서 형광의 상대적인 세기(b)를 나타낸 것이다.
도 19는 1, 20, 50 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)(a)와 화합물 8a(R1=R2=Me)(b)로 처리된 SHSY5Y 세포의 세포 생존 능력(cell viability)을 나타낸 것이다.
도 2는 1 μM 농도의 아세단(a)과 화합물 4a(R1=R2=Me) (b)의 디클로로메탄(■, dichlroromethane, CH2Cl2), 아세토니트릴(□, acetonitrile, CH3CN), 에탄올(●, ethanol, EtOH), PBS(○, phosphate buffer saline) 완충(buffer) 용액(10 mM, pH 7.4, 0.1% 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 포함)에서의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 10 μM 농도의 아세단으로 처리된 쥐의 뇌, 간, 신장, 비장, 폐 조직을 780 nm에서 여기 시켰을 때의 이광자 형광 전자현미경 영상(a)과 10 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)로 처리된 쥐의 뇌, 간, 신장, 비장, 폐 조직을 900 nm에서 여기 시켰을 때의 이광자 형광 전자현미경 영상(b)을 나타낸 것이고, 10 μM 농도의 아세단과 10 μM 농도의 화합물 4a의 전자현미경 영상에서 형광의 상대적인 세기(각각 c, d)를 나타낸 것이다.
도 4는 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 0.1% DMSO 포함) 또는 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, aCSF, 1% DMSO 포함)에서 아밀로이드-베타 42(Aβ42, 20 μM)와 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA, 20 μg/mL)의 존재 유무에 따른 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 30 mg/kg의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 알츠하이머병이 발현된 생후 13개월의 쥐(5XFAD mice)에 복강 주사 후, 1000 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때 전두 피질에서의 이광자 형광 전자현미경 영상(a)과 60배 확대한 영상(b), 3차원(3-dimension, 3-D)으로 재구성된 이광자 형광 전자현미경 영상(c, d)을 나타낸 것이다.
도 6은 10 μM 농도의 아세단 및 화합물 4a-8a(R1=R2=Me)의 에탄올 용액에서의 최대 흡수 파장(maximum absorption wavelength, λabs), 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient, ε), 최대 발광 파장(maximum emission wavelength, λem), 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield, ΦF)을 나타낸 것이다.
도 7은 10 μM 농도의 아세단(◆), 화합물 4a(R1=R2=Me) (■), 화합물 5a(R1=R2=Me) (□), 화합물 6a(R1=R2=Me) (●), 및 화합물 7a(R1=R2=Me) (○)의 에탄올 용액에서의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 톨루엔(toluene), 디옥산(dioxane), 에틸 아세테이드(ethyl acetate), 디클로로메탄, 에탄올, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드(dimethylformamide), DMSO, PBS 완충 용액, 90% 에탄올/PBS 완충용액에서 화합물 4a(R1=R2=Me), 5a(R1=R2=Me), 6a(R1=R2=Me), 7a(R1=R2=Me)의 형광 방출 스펙트럼(각각 a, b, c, d)을 나타낸 것이다.
도 9는 톨루엔, 디옥산, 에틸 아세테이드, 디클로로메탄, 에탄올, 디메틸포름아미드, DMSO, PBS 완충 용액에서 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 흡수 스펙트럼(a)과 형광 방출 스펙트럼(b)을 나타낸 것이다.
도 10은 30 mg/kg의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 알츠하이머병이 발현된 생후 13개월의 쥐(5XFAD mice)에 복강 주사 후, 1000 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때 전두 피질에서의 이광자 형광 전자현미경 영상(a)과 10 mg/kg의 화합물 MeO-X04을 복강 주사 후, 780 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때 전두 피질에서의 이광자 형광 전자현미경 영상(b), (a)와 (b)를 융합한 영상(c)를 나타낸 것이다.
도 11은 1, 2, 5, 10 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me), 화합물 5a(R1=R2=Me), 화합물 6a(R1=R2=Me), 화합물 7a(R1=R2=Me)의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 1% 미만의 DMSO 포함)에서의 흡수 스펙트럼(각각 a, b, c, d)을 나타낸 것이다.
도 12는 1, 5, 10, 15, 20 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 2% 미만의 DMSO 포함)에서의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 10 μM 농도의 아세단(a) 및 화합물 4a(R1=R2=Me)(b)의 디클로로메탄 (■), 아세토니트릴(□), 에탄올(●) 용액에서의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14는 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 아밀로이드-베타 42(Aβ 42)의 농도에 따라(0-50 μM) 500 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때, 최대 방출 파장에서의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 15는 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 pH에 따라(pH 4-10) 500 nm 파장의 빛으로 여기 시켰을 때, 최대 방출 파장에서의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 16은 10 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)의 톨루엔(■), 디메틸포름아미드(□), 에탄올(●)에서 150 mW(초점에서) 레이저 출력(laser power) 하에 이광자 작동 스펙트럼(two-photon action spectra)을 나타낸 것이다.
도 17은 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)의 에탄올에서 150 mW(초점에서) 레이저 출력 하에 이광자 작동 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 18은 50 μm 깊이의 알츠하이머병 동물 모델 조직에서 이광자 광원 조사 전/후에 따른 화합물 8a(R1=R2=Me)와 아밀로이드-베타 플라크 착화합물에 대한 광-퇴색 과정 영상(a)과 전자현미경 영상에서 형광의 상대적인 세기(b)를 나타낸 것이다.
도 19는 1, 20, 50 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)(a)와 화합물 8a(R1=R2=Me)(b)로 처리된 SHSY5Y 세포의 세포 생존 능력(cell viability)을 나타낸 것이다.
본 발명은 새로운 이광자 흡수 형광체인 하기 화학식 1로 표시되는 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공함에 그 특징이 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 수소(H), 메틸(Me), 알릴(allyl), 또는 C2-C12의 비치환된 알킬(alkyl)기일 수 있고;
R3는 
, 
,
, 또는 R4와 환(ring)으로 연결된 시클로알킬(cycloalkyl)기일 수 있고;
R4는 수소 또는 R3와 환(ring)으로 연결된 시클로알킬기일 수 있으며;
상기 환으로 연결된 시클로알킬기는 
또는 
일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 아세단 유사체 화합물은 하기 화학식 4a 내지 8a로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물일 수 있고, 하기 화합물 4a 내지 8a에서 R1 및 R2는 수소(H), 메틸(Me), 알릴(allyl), 또는 C2-C12의 비치환된 알킬기일 수 있다.
[화학식 4a]
[화학식 5a]
[화학식 6a]
[화학식 7a]
[화학식 8a]
더욱 바람직하게, 상기 아세단 유사체 화합물은 R1 및 R2가 메틸기로 치환된 하기 화학식 4내지 8의 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
본 발명의 일실시예에서는 세포 또는 동물 모델의 조직에 본 발명의 아세단 유사체 화합물을 처리한 결과 종래 이광자 흡수 형광체에 비해 우수한 형광 영상을 제공할 수 있음을 확인하였다(실시예 6 내지 10).
따라서, 본 발명은 상기 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 이용한 세포 또는 조직의 영상화(imaging) 방법과 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
8-(디메틸아미노)-2,3,4아-테트라히드로-1H-벤조[비]잔텐-1-온(8-(dimethylamino)-2,3,4,4a-tetrahydro-1H-benzo[b]xanthen-1-one), 화합물 4a(R
1
=R
2
=Me)의 합성
화합물 4a(R1=R2=Me)의 일반적인 합성 경로는 하기 반응식 1에 나타내었다.
[반응식 1]
본 발명자들은 화합물 4a(R1=R2=Me)인 8-(디메틸아미노)-2,3,4아-테트라히드로-1H-벤조[비]잔텐-1-온(8-(dimethylamino)-2,3,4,4a-tetrahydro-1H-benzo[b]xanthen-1-one)의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 알려진 합성 출발 물질인 화합물 9(Kim, I. Asian J. Org. Chem. 2012, 1, 60) (110 mg, 0.50 mmol), 2-시클로헥센-1-온(2-cyclohexen-1-one) (97 μL, 1.0 mmol), 및 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) (28 mg, 0.25 mmol)이 들어있는 밀폐 용기에 H2O/1,4-dioxane(3.0 mL, 1:2, v/v)을 넣고 용기를 막았다. 이 혼합물을 45-50℃에서 초음파처리 하에 48시간 교반하였다. 혼합물의 온도를 상온(25℃)으로 낮춘 후, 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(Merk-silicagel 60, 230-400 mesh)을 통과하는 관 크로마토그래피(column chromatograph)로 정제하여(전개액은 10% EtOAc/hexane을 사용) 주황색의 고체 화합물 4a(R1=R2=Me)(56 mg, 38%; 40%의 화합물 9는 복구됨)를 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 297 K, δ): 7.61-7.54 (m, 3H), 6.99-6.95 (m, 2H), 6.69 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.04-4.97 (m, 1H), 3.07 (s, 6H), 2.64-2.35 (m, 3H), 2.14-1.95 (m, 2H), 1.81-1.66 (m, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 298 K, δ): 197.36, 153.22, 149.88, 137.86, 132.14, 130.69, 130.30, 129.59, 122.74, 119.19, 114.35, 109.11, 104.80, 74.84, 40.47 (2 carbons), 38.82, 29.86, 18.12; HRMS: m/z calcd for C19H19NO2, 293.3597; found, 293.1417.
7-(디메틸아미노)-3,3아-디히드로벤조[지]시클로펜타[비]크로멘-1(2H)-온(7-(dimethylamino)-3,3a-dihydrobenzo[g]cyclopenta[b]chromen-1(2H)-one), 화합물 5a(R
1
=R
2
=Me)의 합성
화합물 5a(R1=R2=Me)의 일반적인 합성 경로는 하기 반응식 2에 나타내었다.
[반응식 2]
본 발명자들은 화합물 5a(R1=R2=Me)인 7-(디메틸아미노)-3,3아-디히드로벤조[지]시클로펜타[비]크로멘-1(2H)-온(7-(dimethylamino)-3,3a-dihydrobenzo[g]cyclopenta[b]chromen-1(2H)-one)의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 알려진 합성 출발 물질인 화합물 9 (20 mg, 0.093 mmol), 2-시클로펜텐-1-온(2-cyclopenten-1-one) (48 μL, 0.56 mmol) 및 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) (11 mg, 0.095 mmol)이 들어있는 밀폐 용기에 H2O/1,4-dioxane(1.8 mL, 1:1, v/v)을 넣고 용기를 막았다. 이 혼합물을 45-50℃에서 초음파처리 하에 48시간 교반하였다. 혼합물의 온도를 상온으로 낮춘 후, 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(Merk-silicagel 60, 230-400 mesh)을 통과하는 관 크로마토그래피로 정제하여(전개액은 5% EtOAc/hexane을 사용) 노란색의 고체 화합물 5a(R1=R2=Me)(5.7 mg, 22%; 70%의 화합물 9는 복구됨)를 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 296 K, δ): 7.60 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.37 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.98 (dd, J = 9.02. 4 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.31-5.25 (m, 1H), 3.08 (s, 6H), 2.76-2.56 (m, 2H), 2.44-2.31 (m, 1H), 2.22-2.11 (m, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 297 K δ): 201.35, 152.77, 150.02, 138.02, 131.93, 131.20, 129.56, 128.45, 122.72, 118.81, 114.46, 109.76, 104.82, 76.05, 40.45 (2 carbons), 37.12, 28.17; HRMS: m/z calcd. for C18H17NO2, 279.3331; found, 279.1260.
1-(8-(디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)에탄온(1-(8-(dimethylamino)-2H-benzo[g]chromen-3-yl)ethanone), 화합물 6a(R
1
=R
2
=Me)의 합성
화합물 6a(R1=R2=Me)의 일반적인 합성 경로는 하기 반응식 3에 나타내었다.
[반응식 3]
본 발명자들은 화합물 6a(R1=R2=Me)인 1-(8-(디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)에탄온(1-(8-(dimethylamino)-2H-benzo[g]chromen-3-yl)ethanone)의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 알려진 합성 출발 물질인 화합물 9 (150 mg, 0.70 mmol)과 3-부텐-2-온(3-buten-2-one) (170 μL, 2.1 mmol)을 메탄올(MeOH, 1.0 mL)에 녹인 후 플라스크를 상온에서 아르곤(Argon) 기체로 충전해주었다. 마그네슘 아이오다이드(magnesium iodide, MgI) (20 mg, 0.0070 mmol)와 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine, TMEDA) (11 μL, 0.070 mmol)을 메탄올(MeOH, 1.0 mL)에 녹여 이 용액을 넣어주었다. 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, DMAP) (8.6 mg, 0.070 mmol)을 메탄올(MeOH, 0.50 mL)에 녹여 이 용액을 넣어주었다. 이 혼합물을 상온에서 24시간 교반한 후, 포화 염화 암모늄(ammonium chloride, NH4Cl) 수용액(2.0 mL) 넣어주었다. 이 혼합물을 디클로로메탄(2 x 20 mL)으로 추출한 후, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조하였다. 40 mbar 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(Merk-silicagel 60, 230-400 mesh)을 통과하는 관 크로마토그래피로 정제하여(전개액은 10% EtOAc/hexane을 사용) 노란색의 고체 화합물 6a(R1=R2=Me)(70 mg, 28%; 37%의 화합물 9 복구됨)을 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 297 K, δ): 7.59 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 6.98-6.94 (m, 2H), 6.69 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 3.07 (s, 6H), 2.42 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 298 K, δ): 195.86, 152.79, 149.87, 138.21, 134.60, 130.95, 129.51, 129.48, 122.50, 117.87, 114.26, 109.24, 104.79, 64.53, 40.47 (2 carbons), 24.96; HRMS: m/z calcd for C17H17NO2, 267.3224; found, 267.1257.
화합물 7a(R
1
=R
2
=Me)의 합성
화합물 7a(R1=R2=Me)의 일반적인 합성 경로는 하기 반응식 4에 나타내었다.
[반응식 4]
<4-1> 6-(디메틸아미노)-3-(프로피닐-2-옥시)-2-나프탈알데히드(6-(dimethylamino)-3-(prop-2-ynyloxy)-2-naphthaldehyde), 화합물 10의 합성
본 발명자들은 화합물 10인 6-(디메틸아미노)-3-(프로피닐-2-옥시)-2-나프탈알데히드(6-(dimethylamino)-3-(prop-2-ynyloxy)-2-naphthaldehyde)의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 알려진 합성 출발 물질인 화합물 9 (200 mg, 0.93 mmol)과 탄산 칼륨(potassium carbonate, K2CO3) (390 mg, 2.8 mmol)을 상온에서 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF, 6.5 mL)에 녹인 후, 80% 프로파질 브로마이드(propargyl bromide, 0.20 mL, 1.4 mmol)를 넣어주었다. 이 혼합물을 상온에서 12시간 교반한 후, 에틸 아세테이트(2 x 10 mL)로 추출하였다. 유기층을 물(10 mL), 포화 소금물(10 mL)로 씻고 무수황산나트륨으로 건조하였다. 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 별도의 정제과정 없이 다음 단계를 진행하였다.
<4-2> 8-(디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로메네-3-카발데히드(8-(dimethylamino)-2H-benzo[g]chromene-3-carbaldehyde), 화합물 7a(R
1
=R
2
=Me)의 합성
본 발명자들은 화합물 7a(R1=R2=Me)인 8-(디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로메네-3-카발데히드(8-(dimethylamino)-2H-benzo[g]chromene-3-carbaldehyde)의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4-1을 통해 얻어진 화합물 10(37 mg, 0.15 mmol)과 아이오딘화 구리(copper iodide, CuI)를 아세토니트릴(acetonitrile, CH3CN, 3.7 mL)에 녹인 후, 이 혼합물을 실리콘 오일 용기를 이용하여 82 ℃에서 48시간 교반하였다. 혼합물의 온도를 상온으로 낮춘 후, 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 통과하는 관 크로마토그래피로 정제하여(전개액은 5% EtOAc/Hexane을 사용) 주황색의 고체 화합물 7a(R1=R2=Me)(70mg, 71%)을 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 298 K, δ): 10.39 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.69 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.05-6.98 (m, 2H), 6.78 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.96-5.90 (m, 1H), 4.91 (dd, J = 3.9, 1.8 Hz, 2H), 3.13 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 298 K, δ): 189.47, 153.62, 150.81, 135.13, 132.14, 130.22, 121.18, 121.11, 120.63, 119.32, 114.32, 113.84, 98.92, 65.18, 40.36 (2 carbons); HRMS: m/z calcd for C16H15NO2, 253.2958; found, 253.1100.
2-((8-디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)메틸렌)말로노나이트릴(2-((8-dimethylamino)-2H-benzo[g]chromen-3-yl)methylene)malononitrile, 화합물 8a(R
1
=R
2
=Me)의 합성
화합물 8a(R1=R2=Me)의 일반적인 합성 경로는 하기 반응식 5에 나타내었다.
[반응식 5]
본 발명자들은 화합물 8a(R1=R2=Me)인 2-((8-디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)메틸렌)말로노나이트릴(2-((8-dimethylamino)-2H-benzo[g]chromen-3-yl)methylene)malononitrile의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4-1을 통해 얻어진 화합물 10 (220 mg, 0.93 mmol), 말로노나이트릴(malononitrile, 62 mg, 0.93 mmol), 및 아이오딘화 구리(copper iodide, CuI, 53 mg, 0.28 mmol)를 아세토니트릴(acetonitrile, CH3CN, 6.0 mL)에 녹인 후, 트리에틸아민(triethylamine, Et3N, 0.10 mL, 0.090 mmol)을 넣어주었다. 이 혼합물을 실리콘 오일 용기를 이용하여 75 ℃에서 4시간 교반하였다. 혼합물의 온도를 상온으로 낮춘 후, 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거하고, 실리카겔(Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 통과하는 관 크로마토그래피로 정제하여(전개액은 CH2Cl2을 사용) 붉은색의 고체 화합물 8a(R1=R2=Me)(200mg, 70%)를 었다.
1H NMR (CDCl3, 600 MHz, 293K, δ): 7.61 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.99 (dd, J = 9.3, 2.7 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.69 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.39 (s, 2H), 3.14 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz, 293 K, δ): 155.49, 152.41, 150.66, 142.52, 139.46, 131.42, 130.37, 126.80, 122.67, 117.91, 114.88, 114.51, 113.72, 109.32, 104.52, 64.47, 40.31 (2 carbons). HRMS: m/z calcd for C19H15ON3, 301.1215; found, 301.1215.
이광자 흡수 형광체의 흡수 특성 확인
본 발명자들은 본 발명의 이광자 흡수 형광체인 화합물 4a-8a(R1=R2=Me)의 흡수 특성을 확인하고, 그 결과를 도 1(a), 도 6, 도 9(a), 도 11, 및 도 12에 나타내었다.
구체적으로, 본 발명자들은 이광자 흡수 형광체의 흡수 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 4a-7a(R1=R2=Me)를 포함하는 에탄올 용액(1% DMSO 포함)을 1 cm 통과 길이의 석영 셀(114F-QS, Hellma Analytics)에 채워 흡수 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 흡광도(y축)를 도 1(a)에 나타내었다. 도 1(a)를 보면, 화합물 4a-7a(R1=R2=Me)의 최대 흡수 파장(maximum absorption wavelength, λabc(nm))이 종래의 아세단(화합물 1)의 최대 흡수 파장보다 긴 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이광자 흡수 형광체인 화합물 8a(R1=R2=Me)의 흡수 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 포함하는 톨루엔(toluene), 디옥산(dioxane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 디클로로메탄 (dichloromethane), 에탄올(ethanol), 디메틸포름아미드(dimethylforamide), 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 및 PBS 완충 용액(1% DMSO 포함)을 1 cm 통과 길이의 석영 셀에 채워 흡수 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 흡광도(y축)를 도 9(a)에 나타내었다. 흡수 스펙트럼은 HP 8453 UV/Vis 분광 광도계(spectrophotometer)를 사용하여 측정하였다.
1, 2, 5, 10 μM 농도의 화합물 4a-7a(R1=R2=Me)를 포함하는 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 1% 미만의 DMSO 포함)을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 흡수 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 흡광도(y축)를 도 11(a, b, c, d)에 나타내었다. 도 11을 보면, 1, 2, 5 μM 농도의 화합물 4a-7a(R1=R2=Me)는 PBS 완충 용액에서 충분한 용해도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
1, 5, 10, 15, 20 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 포함하는 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 1% 미만의 DMSO 포함)을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 흡수 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 흡광도(y축)를 도 12에 나타내었다. 도 12를 보면, 1, 5, 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)는 PBS 완충 용액에서 충분한 용해도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
그리고 10 μM 농도의 화합물 4a-8a(R1=R2=Me)를 포함하는 에탄올 용액(1% DMSO 포함)에서의 최대 흡수 파장에서의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient, ε(Lmol-1cm-1))를 계산하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6을 통하여, 본 발명의 이광자 흡수 형광체(특히 화합물 4a-8a(R1=R2=Me))에서의 몰 흡광 계수(ε>11,500)가 종래의 이광자 흡수 형광체로 알려진 아세단(ε=10,700)과 비교하여 보다 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
이광자 흡수 형광체의 형광 특성 확인
본 발명자들은 본 발명의 이광자 흡수 형광체인 화합물 4a-8a(R1=R2=Me)의 형광 특성을 확인하고, 그 결과를 도 1(b), 도 2, 도 4, 도 6-8, 도 9(b), 및 도 13-15에 나타내었다.
구체적으로, 본 발명자들은 이광자 흡수 형광체의 형광 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 4a-7a(R1=R2=Me)를 포함하는 에탄올 용액(1% DMSO 포함)과 에탄올 용액을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 형광 스펙트럼(형광 스펙트럼은 Photon Technical International Fluorescence System을 사용하여 측정됨)을 측정하고, 파장(x축)에 따른 정규화 된 형광 세기(y축)를 도 1(b)과 파장(x축)에 따른 형광 세기(y축)를 도 7에 나타내었다. 도 7을 통하여, 본 발명의 이광자 흡수 형광체인 화합물 4a-7a(R1=R2=Me)의 최대 방출 파장(maximum emission wavelength, λem(nm))이 종래의 이광자 흡수 형광체로 알려진 아세단(화합물 1)의 최대 방출 파장보다 긴 것을 확인할 수 있었다.
1 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)와 아세단을 포함하는 디클로로메탄, 아세토니트릴, 에탄올(1% DMSO 포함), PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 0.1%의 DMSO 포함)을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 형광 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 형광 세기(y축)를 도 2(b)와 도 13에 나타내었다. 도 2(b)와 도 13을 통하여, 본 발명의 이광자 흡수 형광체인 화합물 4a(R1=R2=Me)의 최대 방출 파장이 종래의 이광자 흡수 형광체로 알려진 아세단(화합물 1)의 최대 방출 파장보다 긴 것을 확인할 수 있었다.
10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 포함하는 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 0.1% DMSO 포함) 또는 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid-NaCl(124 mM), KCl(3 mM), NaH2PO4(1.25 mM), MgCl2(1 mM), NaHCO3(36 mM), D-gluocose (10 mM), CaCl2(2 mM), 95% O2, 5% CO2(by bubbler), aCSF, 1% DMSO 포함)에서 아밀로이드-베타 42(Aβ 42)와 소혈청알부민(BSA, 20 μg/mL)의 존재 유무에 따라 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 형광 스펙트럼을 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 보면, 아밀로이드-베타 플라크가 존재하지 않을 때에는 화합물 8a(R1=R2=Me)의 형광의 세기가 약하다가 아밀로이드-베타 플라크가 존재하면 화합물 8a(R1=R2=Me)의 형광의 세기가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 화합물 8a(R1=R2=Me)가 아밀로이드-베타 플라크를 선택적으로 감지할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 10 μM 농도의 화합물 4a-8a(R1=R2=Me)를 포함하는 에탄올 용액에서의 형광 양자 수율을 측정하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 비교 화합물로는 형광 프로브로 주로 쓰이는 아세단을 사용하였다(형광 양자 수율, ΦF = 0.52, 에탄올 용액에서 측정).
화합물 4a-7a(R1=R2=Me)의 형광 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 4a-7a(R1=R2=Me)를 포함하는 톨루엔, 디옥산, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 에탄올, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, DMSO, PBS 완충 용액, 및 90% 에탄올/PBS 완충 용액(1% DMSO 포함)을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 형광 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 형광 세기(y축)를 도 8에 나타내었다. 또한 화합물 8a(R1=R2=Me)의 형광 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 포함하는 톨루엔, 디옥산, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 에탄올, 디메틸포름아미드, DMSO, PBS 완충 용액을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 형광 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 형광 세기(y축)를 도 9에 나타내었다.
화합물 8a(R1=R2=Me)의 아밀로이드-베타 플라크의 농도(x축)에 따른 형광 세기(y축) 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)와 아밀로이드-베타 플라크(0-50 μM)를 포함하는 PBS 완충 용액(1% DMSO 포함)을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 형광 스펙트럼을 측정하고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
화합물 8a(R1=R2=Me)의 pH(x축)에 따른 형광 세기(y축)를 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)와 pH 4-10의 수용액(1% DMSO 포함)을 1 cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 형광 스펙트럼을 측정하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15를 보면, 수용액에서 pH에 관계없이 화합물 8a(R1=R2=Me)의 형광의 세기가 약하고, pH에 따른 화합물 8a(R1=R2=Me)의 형광 변화가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다.
화합물 4a(R
1
=R
2
=Me)와 화합물 8a(R
1
=R
2
=Me)의 이광자 흡수 특성 확인
본 발명자들은 본 발명의 이광자 흡수 형광체인 화합물 4a(R1=R2=Me)와 화합물 8a(R1=R2=Me)의 이광자 여기에 의한 이광자 흡수 특성을 확인하고, 그 결과를 도 16-17에 나타내었다.
구체적으로, 본 발명자들은 이광자 흡수 형광체인 화합물 4a(R1=R2=Me)의 이광자 흡수 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)를 포함하는 톨루엔(■), 디메틸포름아미드(□), 에탄올 용액(1% DMSO 포함)(●)에서의 이광자 발광율(two-photon action cross section, Φδ)을 측정하고, 이광자 작동 스펙트럼을 도 16에 나타내었다. 또한, 화합물 8a(R1=R2=Me)의 이광자 흡수 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 8a(R1=R2=Me)를 포함하는 에탄올 용액에서의 이광자 흡수 효율을 측정하고, 이 스펙트럼을 도 17에 나타내었다. 이광자 흡수 효율은 이광자 유발 형광(two-photon induced fluorescence) 방법에 의해 측정하였고[Fischer, A. et al. Applied Optics 1995, 34, 1989], 1 GM은 10-50 cm4 s photon-1 molecule-1를 의미한다. 도 16에서 화합물 4a(R1=R2=Me)의 장파장(>850 nm)에서의 이광자 흡수 효율 값과 도 17에서 화합물 8a(R1=R2=Me)의 장파장(>900 nm)에서의 이광자 흡수 효율 값은 종래의 아세단의 이광자 흡수 효율 값(~100 GM)보다 작다는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 도 3과 도 5를 통해, 화합물 4a(R1=R2=Me)의 장파장(>850 nm)에서의 이광자 흡수 효율 값과 도 17에서 화합물 8a(R1=R2=Me)의 장파장(>900 nm)에서의 이광자 흡수 효율 값이 선명한 이광자 전자현미경 영상을 얻기에 적합하다는 것을 알 수 있었다. 이는 생체 내 형광체의 자가 형광에 의한 영향을 충분히 배제시킬 수 있음을 의미한다.
화합물 4a(R
1
=R
2
=Me)와 화합물 8a(R
1
=R
2
=Me)을 처리한 쥐 조직의 이광자 형광 전자현미경 영상 관측
본 발명자들은 본 발명의 화합물 4a(R1=R2=Me)와 화합물 8a(R1=R2=Me)를 쥐 조직에 처리한 후 형광 변화를 이광자 전자현미경을 통해 관측하고, 그 결과를 도 3, 도 5, 도 10, 및 도 18에 나타내었다.
구체적으로, 화합물 4a(R1=R2=Me)를 처리한 쥐 조직의 이광자 형광 전자현미경 영상을 관측하기 위해 C57BL6 쥐(생후 5주, 수컷, SAMTAKO Co.)를 사용하였고, 빛으로 보호된 조건(암실)에서 실험을 진행하였다. 쥐의 뇌, 간, 신장, 비장, 폐 조직을 해부하고 PBS 완충 용액으로 씻어준 후, 각각의 장기들을 드라이아이스(dry-ice)로 5분간 얼렸다. 얼린 장기들을 망치로 부수고, 절단기(Cryostat machine, Leica, CM3000 model)를 이용하여 16 μm 두께로 조직 슬라이스 샘플(tissue slice sample)을 준비하였다. 절단기에 장기를 고정하기 위해서 OCT(optical cutting temperature compound, 10% 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 25% 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 85.5% inactive species)를 사용했다. 조직 슬라이스 샘플을 specimen block(Paul Marienfeld GMbH & Co.) 위에 두었고, specimen block을 4% 파라포름알데히드에 10분간 담근 후, PBS 완충 용액으로 씻어주고 Mount 용액(Gel Mount, BIOMEDA)을 사용하여 조직을 다시 고정하였다. 준비된 조직 슬라이스 샘플을 10 μM의 화합물 4a(R1=R2=Me)와 아세단를 포함하는 PBS 완충 용액에 10분간 담그고 PBS 완충 용액으로 3번 씻어준 후, 4% 파라포름알데히드에 고정하고 형광을 관측하였다. 이광자 전자현미경은 Upright microscope(BX51, Olympus)와 20배 및 40배 대물렌즈(XLUMPLEN, NA 1.0, Olympus)로 구성되어있으며, 타이타늄:사파이어 레이저(Ti:Sapphire laser; Chameleon Ultra II, Coherent)를 사용하였고, 10 mW의 레이저 출력과 780 nm(아세단), 900 nm(화합물 4a(R1=R2=Me))의 이광자 여기파장으로 관측되었다. 도 3을 보면, 적정한 생체 관찰(biological optical window) 영역(800-1000 nm)에서 본 발명의 화합물 4a(R1=R2=Me)의 이광자 형광 전자현미경 영상이 종래의 아세단의 이광자 형광 전자현미경 영상과 비교하여 보다 선명한 고대비 영상을 제공하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 아세단을 이용하여 얻은 영상(도 3(a))과 달리 화합물 4a(R1=R2=Me)를 이용하여 얻은 영상(도 3(b))이 자가 형광에 의한 영향이 충분히 배제되었음을 알 수 있다.
화합물 8a(R1=R2=Me)를 처리한 살아있는 쥐 조직의 이광자 형광 전자현미경 영상을 관측하기 위해, 알츠하이머병이 발현된 5XFAD 쥐(생후 13개월, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA; stock no. 006554, Tg6799)를 사용하였다. 아밀로이드-베타 플라크는 알츠하이머병의 전형적인 특징으로 나타난다.
모든 동물 실험은 동물 실험 윤리 위원회로부터 승인 후 진행되었다. 두개골 개두술(open-skull craniotomy surgery)은 화합물 8a(R1=R2=Me)와 잘 알려진 아밀로이드-베타 플라크 형광체인 MeO-X04를 처리한 후 영상화가 진행되었다. 졸레틸 50(zoletil 50; virbac; 근육내 주사, 0.03 mL)을 마취제로 사용하여, 정위고정성의 전열면에 고정하였다(서울, 대한민국, 37℃). 두피(scalp)와 골막(periosteum)을 제거한 후 두개골의 브레그마(bregma)로부터 1 mm, 시상봉합(sagittal)으로부터 1 mm, 직경 3 mm의 구멍을 내고, 뼈를 제거한 다음, 3 mm 둥근 커버슬립을 록타이트 454로 접합했다. 두개골의 드러난 부위는 치과용의 아크릴(dentyl acryl)로 덮었고, 수술 전후에 소염제 덱사메타손 (dexamethasone, 0.2 mg/kg)과 카르프로펜 (carprofen, 5 mg/kg)을 처방했다.
이광자 전자현미경은 Carl Zeiss Microscopy GmbH(Oberkochen, Germany; model no. LSM 7 MP two-photon laser scanning microscope system)을 사용하였다. 아밀로이드-베타 플라크를 시각화하고 화합물 8a(R1=R2=Me)를 시험하기 위해, 화합물 8a(R1=R2=Me)(30 mg/kg; 저장액(50 mg/mL DMSO)의 10%, 45%의 프로필렌 글리콜 , 45%의 PBS)와 MeO-X04(10 mg/kg; 저장액(50 mg/mL DMSO)의 10%, 45%의 프로필렌 글리콜 , 45%의 PBS)를 영상화 24시간 전에 복강 주입하였다. 50 mW의 레이저 출력과 780 nm(MeO-X04) (도10(b)), 1000 nm(화합물 8a(R1=R2=Me))(도 10(a))의 이광자 여기파장으로 이광자 전자 현미경 영상이 관측되었다. 융합된 영상(도 10(c))을 통해, 아밀로이드-베타 플라크의 감지체로 알려진 MeO-X04로 처리한 영상 결과(도 10(b))와 화합물 8a(R1=R2=Me)로 처리한 영상 결과(도 10(a))의 일치도가 상당히 높다는 것을 알 수 있었고, 따라서 화합물 8a(R1=R2=Me)는 아밀로이드-베타 플라크를 선택적으로 시각화할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 3차원 영상을 얻기 위해, z축에 대해 1 μm 간격으로 300 μm 깊이까지의 영상 수집을 진행하였고, 영상 처리는 Volocity 소프트웨어(PerkinElmer Inc., MA, USA)로 진행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5를 보면, 화합물 8a(R1=R2=Me)는 알츠하이머병 동물 모델에서의 아밀로이드-베타 플라크를 선택적으로 시각화할 수 있다는 것(도 5(a), 도 5(b))과 아밀로이드-베타 플라크를 3차원 영상으로 시각화할 수 있다는 것 (도 5(c), 도 5(d))을 확인할 수 있다. 또한, 이광자 광원의 조사 전/후에 따른 화합물 8a(R1=R2=Me)과 아밀로이드-베타 플라크 착화합물에 대한 광퇴색 과정 영상과 전자현미경 영상에서 형광의 상대적인 세기를 도 18에 나타내었다. 도 18을 보면, 화합물 8a(R1=R2=Me)의 형광 세기가 이광자 광원을 35분 조사했을 때 40% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 화합물 8a(R1=R2=Me)는 알츠하이머병 동물 모델에서의 아밀로이드-베타 플라크를 장시간 동안 시각화할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
화합물 4a(R
1
=R
2
=Me)와 화합물 8a(R
1
=R
2
=Me)를 처리한 세포 독성 확인
본 발명자들은 본 발명의 화합물 4a(R1=R2=Me)와 화합물 8a(R1=R2=Me)를 SHSY5Y 세포에 처리하여 세포독성을 확인하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
화합물 4a(R1=R2=Me)와 화합물 8a(R1=R2=Me)로 처리된 세포독성을 확인하기 위해, SHSY5Y 세포의 포르마잔(formazan)의 3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)를 대사 작용 시키는 능력을 평가하였다.
구체적으로, 세포 (100 μL/well)는 96-웰 플레이트(96-well plate)에 웰 당 약 5 ㅧ 103 세포의 밀도로 준비하였다. 1, 20, 50 μM 농도의 화합물 4a(R1=R2=Me)와 화합물 8a(R1=R2=Me)를 세포에 각각 처리하고 1시간 배양 후, PBS 완충 용액으로 씻어주고 5 mg/mL의 MTT 용액 25 μL를 각 웰에 넣어주었다. 37℃에서 2시간 배양 후 미디어를 제거하고 포르마잔 결정은 DMSO에 의해 용해되며, 플레이트 판독기를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 도 19(a)를 보면, 화합물 4a(R1=R2=Me)는 20 μM의 농도까지 세포 독성이 낮다는 것을 확인할 수 있다 (20% 세포 소멸). 도 19(b)를 보면, 화합물 8a(R1=R2=Me)는 50 μM의 농도까지 세포 독성이 낮다는 것을 확인할 수 있다(20% 세포 소멸). 이를 통해 화합물 4a(R1=R2=Me)와 화합물 8a(R1=R2=Me)의 세포 독성이 낮고, 조직 및 동물 모델에서 이광자 전자현미경 영상을 얻는데 적합하다는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
Claims (13)
- 하기 화학식 1로 표시되는 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 수소(H), 메틸(Me), 알릴(allyl), 또는 C2-C12의 비치환된 알킬(alkyl)기이고;
R3는,
,
, 또는 R4와 환(ring)으로 연결된 시클로알킬(cycloalkyl)기이고;
R4는 수소 또는 R3와 환(ring)으로 연결된 시클로알킬기이며;
상기 환으로 연결된 시클로알킬기는또는
이다.
- 제1항에 있어서,
상기 아세단 유사체 화합물은 하기 화학식 4 내지 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
- 제1항에 있어서,
상기 아세단 유사체 화합물은 이광자 흡수 형광체인 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
- 제1항의 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 이용한, 세포 또는 조직의 영상화(imaging) 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 영상화 방법은 조직에서 아밀로이드-베타 플라크(amyloid-beta plaque)의 영상화 방법인 것을 특징으로 하는, 영상화 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 영상화 방법은 세포 또는 조직에 상기 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 처리한 후 형광 전자현미경으로 관측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 영상화 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 형광 전자현미경은 일광자 형광 전자현미경 또는 이광자 형광 전자현미경인 것을 특징으로 하는, 영상화 방법.
- 제1항의 아세단 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 진단용 조성물.
- 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 4로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 2-시클로헥센-1-온과 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄을 첨가하여 8-(디메틸아미노)-2,3,4아-테트라히드로-1H-벤조[비]잔텐-1-온을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[화학식 4]
- 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 5로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 2-시클로펜텐-1-온과 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄을 첨가하여 7-(디메틸아미노)-3,3아-디히드로벤조[지]시클로펜타[비]크로멘-1(2H)-온을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[화학식 5]
- 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 6으로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 3-부텐-2-온, 마그네슘 아이오다이드, 테트라메틸에틸렌디아민, 및 4-디메틸아미노피리딘을 첨가하여 1-(8-(디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)에탄온을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[화학식 6]
- 6-(디메틸아미노)-3-히드록시-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 7로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 프로파질 브로마이드와 포타슘 카보네이트를 첨가하여 6-(디메틸아미노)-3-(프로피닐-2-옥시)-2-나프탈알데히드를 합성한 후, 말로노나이트릴과 아이오딘화 구리를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[화학식 7]
- 6-(디메틸아미노)-3-(프로피닐-2-옥시)-2-나프탈알데히드로부터 하기 화학식 8로 표시되는 아세단 유사체 화합물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 말로노나이트릴, 아이오딘화 구리, 및 트리에틸아민을 첨가하여 2-((8-디메틸아미노)-2H-벤조[지]크로멘-3-일)메틸렌)말로노나이트릴을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[화학식 8]
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