KR20160086843A

KR20160086843A - 재조합 루브리신의 제조

Info

Publication number: KR20160086843A
Application number: KR1020167013154A
Authority: KR
Inventors: 탄닌 슈미트; 그레고리 디. 제이
Original assignee: 루브리스 엘엘씨
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2016-07-20
Also published as: CY1124861T1; US20160304572A1; PT3060577T; AU2019201478B2; CN105899527A; KR102488928B1; RU2016119532A; US20190270783A1; WO2015061488A1; JP2016535590A; PL3060577T3; IL283447A; MX2016005302A; US20210130427A1; AU2014340080B2; HRP20211497T1; RU2016119532A3; US20230234999A1; EP3060577B1; JP6970164B2

Abstract

우수한 윤활 특성 및 신규 글리코실화 패턴을 가지는 인간-유사 루브리신 또는 PRG4 당단백질의 새로운 재조합 이성체, 및 상업적으로 생산할 수 있는 높은 수준으로 이를 제조하는 제조 방법을 개시한다.

Description

재조합 루브리신의 제조{PRODUCTION OF RECOMBINANT LUBRICIN}

관련 출원간의 상호 참조

본원은, 전체가 본원에 참조로써 인용된 미국특허출원 제61/894,366호(2013년 10월 22일 제출됨)에 대해 우선권 및 이익을 주장한다.

기술분야

본원에 개시된 발명은 형질주입된 세포를 사용한 재조합 인간-유사 루브리신을 포함하는 조성물을 상업적인 양으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 우수한 윤활 특성을 가지고, 관절 통증 내지 안구 건조증과 같은 다양한 상태를 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위해 제형화하고 사용될 수 있는 루브리신의 신규 형태를 상업적인 규모로 생산하는 것에 관한 것이다.

프로테오글리칸 4(PRG4) 유전자는 루브리신이라 칭하는 고 글리코실화된 표면 윤활 단백질, 거핵세포 자극 인자(MSF) 또는 얕은 존 단백질(SZP)을 암호화한다. (문헌 [Jay, Curr. Opin. Orthop. 15, 355 (2004)]; 미국특허 제6,743,774호; 미국특허 제6,960,562호를 참조한다.) 루브리신은 자연적으로 발생하는 다수의 절단된(truncated) 버전이 보고되었지만, 전장 스패닝(spanning) 12 엑손의 PRG4 유전자(서열: 2)로부터 발현된다. 940개의 아미노산의 크기가 큰 "뮤신 유사" 중앙 도메인(엑손 6에 의해 암호화됨)은 일부 70+ KEPAPTT-유사 서열을 포함하고, 고도로 글리코실화된다. 당단백질은 코어 2 글리코실화 잔기(residue) 및 다수의 코어 1 글리칸(O-연결 β (1-3) Gal-GalNAc 올리고사카라이드)을 포함하고, 적어도 후자는 1차적인 생리적 기능인 경계 윤활을 중재하는 것으로 알려져 있다(문헌 [Jay et al., Glycoconj J 18, 807 (2001)] 참조). PRG4는 연골 표면, 활막, 힘줄, 및 반월상연골(meniscus) 눈물막과 다른 해부학상 부위에 존재한다고 알려져 있다. PRG4는 붙어있는 관절 연골 표면의 경계 윤활에 기여한다고 알려져 있다. PRG4는 단량체로 존재할 수도 있고 N- 및 C-말단 모두에서 보존된 시스테인-풍부 도메인을 통해 이황화-결합된 이량체 및 다량체로서 존재할 수도 있는 것으로 알려져 있다(문헌 [Schmidt et al., Biochim Biophys Acta. 1790(5):375-84 (2009)]; [ Kooyman et al., Paper No. 255, 56th Ann. Meet of Orthop. Res. Soc., 2010] 참조).

윤활 관절의 연골 계면에서 작용중인 2개 이상의 물리화학적 윤활 모드가 있다. 이들은 "유체막(fluid film)" 및 "경계(boundary)"로서 분류된다. 가동되는 윤활 모드는 관절 조직 상의 수직항력 및 접선력, 이러한 표면 간의 접선 운동의 상대적인 속도, 및 부하와 운동의 시간 히스토리에 의해 좌우된다. 마찰계수 μ(무차원 단위, 적용되는 수직항력에 대한 상대운동에서 2개의 접촉 표면 간의 측정된 마찰력의 비)은 윤활의 양적 측정값을 제공한다.

유체-중재된 윤활의 하나의 유형 또는 “유체막” 모드는 유체정역학적이다. 부하 개시 당시 및 전형적으로 연장된 기간 동안, 연골 내의 조직간질액은 조직의 이상(biphasic) 성질 때문에 가압되고, 유체는 또한 위핑(weeping) 메커니즘에 따라 관절 표면 사이의 돌기(asperity)로 들어가게 될 수 있다. 그러므로, 가압된 조직간질액 및 걸린(trapped) 히알루론산 함유 윤활제 풀(pool)은, 전단력에 대해 거의 저항성이 없는 수직 하중 부하에 상당히 기여하여 매우 낮은 마찰 계수를 가능케 할 수 있다. 또한, 부하 및/또는 운동의 개시 당시, 스퀴즈(squeeze) 막, 유체역학적 및 유체탄성역학적 유형의 유체 막 윤활이 감압, 운동 및 분해 작용과 함께 발생하여 상대 운동에서 2개의 표면 간의 간격(gap)으로부터 및/또는 이를 통해 점성 윤활제를 이동시킬 수 있다.

경계 윤활에서, 부하는 표면-대-표면 접촉에 의해 지지되고, 연관된 마찰 특성은 윤활제 표면 분자, 즉 루브리신 종에 의해 결정된다. 대향(opposing) 연골 층은 상호교합하는 편편한 돌기에 의해 총 면적의 +/- 10%에 걸쳐 접촉하고, 이곳이 마찰이 가장 많이 발생하는 곳이기 때문에 이러한 모드가 중요하다. 경계 윤활은 본질적으로, "스틱-슬립(stick-slip)", 즉 상호접속하는 체중 부하 연골(weight bearing cartilage) 표면이 서로 미끄러지는 동안 발생할 수 있는 자발적인 근반사 (jerking) 운동을 완화시키고(문헌 [Meyer et al., Nanoscience: Friction and Rheology on the Nanometer Scale, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, River Edge, N.J., (2002), pp. 373]), 따라서 정적 운동 및 스타트-업 운동 모두에 대한 저항이 감소하는 것이 명백하다. 전형적인 연골 표면의 마모 패턴은 관절 연골의 경계 윤활이 관절 표면 구조의 보호 및 유지에 중요하다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 루브리신 결핍 마우스는 마모가 나타나지만, 체중 부하가 없는 갓난 마우스는 그렇지 아니하다(문헌 [Jay et al., Arthritis and Rheumatism,56:3662-3669 (2007)]).

부하 시간 및 유체 정역학 압력의 소실의 증가로, 윤활제로 코팅된 표면은 가압된 유체에 비해 더 높은 비율의 부하를 견디고, 결과적으로 μ은 윤활의 경계 모드에 의해 상당히 영향을 받을 수 있다. 그러므로, 윤활의 경계 모드(boundary mode of lubrication)는, 슬라이딩의 상대 속도 및 축 부하와 같은 유체 막의 형성에 영향을 미치는 요인이 다양하지 않은 정상 슬라이딩(steady sliding) 중의 마찰 계수에 의해 확인된다. 관절 연골에 대해, 유체 가압화 및 다른 메커니즘에 의해 보상된다 하더라도 경계 윤활은 확실히 발생할 것이라고 결론지어졌다. 눈 깜빡임 중의 각막 및 눈꺼풀의 경계에서의 윤활 메커니즘은 큰 부하가 없기 때문에, 효과적인 윤활에 대한 물리화학적 요구가 손쉽고, 따라서 연골 윤활과 꽤 다를 수 있다. 그러나, 윤활의 경계 모드는 안구건조증에서와 같이 눈물막이 손상된 경우 우세할 수 있다고 제안되고 있다.

놀라운 윤활 특성에 관여한다고 여겨지는 관절 낭액의 2개의 기계적 성분은 루브리신 및 히알루론산(또는 히알루로네이트 또는 "HA", 이하 상호교환적으로 사용한다)이다. 루브리신은 관절에서 경계 윤활제로서 기능을 하고, 마찰력, 세포부착 및 단백질 소실로부터 연골 표면을 보호한다고 여겨진다. 예를 들어, 미국특허 제6,960,562호 및 제6,743,774호는 실질적으로 순수한 PRG4 동종형을 포함하는 윤활성 폴리펩타이드, 및 전신적으로 또는 조직에 직접적으로 투여하여 관절 또는 다른 조직을 윤활시키는 방법을 개시한다. HA 자체는, 경계 윤활 모드 하의 연골-연골 경계에서 염용액(saline)에 비해 μ을 감소시키고(3.3 mg/ml의 HA에서 0.12 대 PBS에서 약 0.24), 루브리신 단독은 여전히 낮은 수준으로 μ을 감소시키지만, 루브리신과 조합으로 HA를 포함하는 관절 낭액은 루브리신 단독에 의하거나 HA 및 루브리신의 합성 혼합물에 의해 달성되지 않는 마찰계수를 접합면에 제공할 수 있다. 어떠한 루브리신 및 HA의 합성 조성물도 아직 천연 형태의 관절 낭액에 의해 주어지는 것과 완전히 똑같은 낮은 마찰계수를 달성하지 못했다. 다양한 공급원으로부터의 다양한 분자량의 HA는, 활막세포로부터 시험관내 발현된 루브리신, 소 루브리신, 관절 낭액으로부터 추출되고 HA에서 "재-구성된(reconstituted)"된 루브리신, 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조하려는 초기 노력으로 마이크로그램의 양으로 발현된 루브리신과 혼합하여 실험하였다.

상업적인 이용에 적절한 규모로 전장 루브리신을 재조합 생산하기 위한 이전의 시도는 성공적이지 못했다. CHO 세포로부터 발현되는 인간 루브리신 종의 매우 낮은, 리터당 한자리 또는 두자리 수의 밀리그램의 생산율은 상업적으로 제품화하기에 너무 낮다고 여겨졌다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 하나의 접근법은 엑손 6에서의 반복체(repeat)의 수를 줄여서, 적어도 일부의 윤활능을 유지하면서 글리코실화 측쇄의 질량을 감소시키는 것이었다(예를 들어, 미국특허 제7,642,236호 및 제7,893,029호 참조). 이러한 접근법은 리터당 300 내지 400 밀리그램의 절단된 작제물의 총 생산성(정제 이전)을 나타내는 것으로 보고되었다.

신규의 고 글리코실화된 인간-유사 형태의 루브리신(이하, 간단하게 "루브리신"이라고 칭한다), 다량체 루브리신, rh루브리신 또는 rhPRG4를 다량으로, 상업적인 양으로 제조하는 데 인간 PRG4 유전자가 사용될 수 있다는 것이 본 발명에 이르러 밝혀졌다. 이는 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 발현된 단백질을 큰 규모로 번역후 글리코실화할 수 있는 것으로 밝혀진 특정 변형된 차이니즈 햄스터 오버리(Chinese hamster ovary, CHO) 세포로 인간 PRG4 유전자(hPRG4)를 형질주입(transfection)시키고, 이어서 이 세포를 상업적인 규모의 용적, 예를 들어 10 L 이상, 더욱 전형적으로는 50 L 이상, 바람직하게는 100 L 이상 또는 500 L 이상, 가장 바람직하게는 1,000 L 이상의 배지에서 배양시켜 달성된다.

본 발명의 루브리신은 이량체 및 다량체를 형성하는 다분산계 루브리신 단량체 유닛과 임의적으로 자유 단량체를 포함한다. 각각의 유닛은 분자량의 30 % 이상, 종종 35 % 또는 40 %, 및 가능하다면 45 % 이상을 차지하는 글리코실성 잔기 측쇄을 갖도록 고도로 그리고 다양하게 글리코실화된다.

천연 인간 루브리신에서, 글리코실화는 코어 1 O-연결된 GalNAc-Gal(N-아세틸갈락토사민-갈락토스) 다이사카라이드(이의 60 % 이상은 말단이 시알산으로 치환되어 있다), 및 또한 다양한 동종형 배치(configuration)의 GlcNac(N-아세틸글루코사민) 모노사카라이드의 코어 1로의 첨가와 연관된 코어 2 글리코실화로 구성된다(예를 들어, 문헌 [Estrella et al., Biochem J., 429(2):359-67 (2010)] 참조).

본원에 개시되어 있는 바에 따라 생산된 재조합 물질은 천연 형태 인간 루브리신에 비교하여 코어 1 글리칸이 풍부하다. 이의 글리코실화는 95 % 이상, 더욱 가능하게는 98 % 또는 99 % 초과의 코어 1 측쇄를 포함한다. 더욱이, 상기 측쇄는 종종 천연 인간 루브리신에서는 볼 수 없는 정도까지 황화된다. 이것이 본 발명의 rhPRG4을 천연 hPRG4로부터 구별시킨다. 증가된 황화 함량은, 점액성 당단백질에 추가적인 음전하를 첨가하여, 근방의 생체분자가 접근하지 못하게 하여 윤활성을 증가시키는 능력 및 분자 관점에서 더욱 경직되도록 분자 구조를 강화시키는 역할을 강화시킬 수 있고 이는 나노규모 및 중규모 마찰을 감소시키는 역할을 하는 능력을 보조할 수 있다고 여겨진다.

전장 (절단되지 않은) 루브리신 단량체 서열(서열:1)은 코어 단백질 내에 1404 개의 아미노산, 또는 대략 151 kDa을 포함한다. 인간 루브리신의 신호 서열은 서열:1의 잔기 1-24이다. 따라서, 인간 루브리신의 성숙 형태는 서열:1의 잔기 25-1404이다. 본원에 개시되어 있는 바와 같이 제조된 재조합 생성물의 완전한 환원으로, SDS 트리스-아세테이트 3-8% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 포함하는 다양한 분자량 측정 기술에서의 분자량 기준에 비교하여 측정시, 약 300 kDa-460 kDa의 겉보기(apparent) 분자량의 단량체성 종이 수득된다. 질량 분석법 기술 및 다른 기술과 조합에 의한 글리코실화 분석은, 글리코실화된 재조합 단량체의 실제 분자량이 (겔 운동성으로부터 추론된 것과 다르게) 220-280 kDa의 범위이고, 약 300kDa을 초과하지 않는 경향이라는 것을 제시하였다. 루브리신 단량체의 서열에서 O-연결된 글리코실화 지점으로 잠재적으로 사용가능한 총 약 329 개의 가능한 O-연결(이 중 284개는 트레오닌이다)로부터, 다양하고 공지되지 않은 (100 내지 150, 아마도 200 또는 220 만큼) 많은 수가 치환된다. 총 글리코실화 중에서, 약 절반은 2개의 당 유닛(GalNAc-Gal)을, 절반은 삼당 유닛(GalNAc-Gal-시알산)을 포함한다. 가장 풍부한 형태는 황화된 Gal-GalNac이고, 다음으로 풍부한 형태는 시알화된 Gal-GalNac이다.

루브리신 발현 생성물은 단량체성 또는 이량체 루브리신 종으로 분해되지 않지는 않지만 저항성이다. 완전한 환원의 결과가 이것이 단량체 유닛 간 및 내에 이황화 교차-연결을 포함한다는 것을 의미한다. 또한, 환원 없이 변성(denaturing) 완충액으로의 처리는 더 낮은 분자량의 생성물을 얻을 수 있고, 이는 더 높은 차수의 4차 구조를 암시하고, 쇄가 또한 소수성 상호작용, 수소 결합, 물리적 뒤엉킴(entanglement), 및/또는 자기조립(self-assembly)이 가능케 하는 다른 비공유결합 연관에 의해 함께 연결되어 있다. 이량체 및 다량체는 다분산계이다. 이의 분자 종은 전형적으로 약 450-600 kDa 이상의 분자량을 가지고, 다량체 종은 종종 2,000 kDa 이상이다. 전형적으로, 비-환원 복합물의 일부 종은 본질적으로 전기영동 실험에서 3-8% SDS-PAGE 겔에 들어가지 않는다. 복합물의 더 큰 종은 3 내지 5, 아마 20 단량체 유닛 정도를 포함한다고 여겨진다.

이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이처럼 더 큰 초분자 성분은 단량체/이량체 농도의 조절로 형성된다고 여겨진다. 최근에 약 0.5 mg/ml 이상의 단량체/이량체의 농도가 더 큰 복합물의 자발적인 형성에 최적화되어 있다고 여겨진다. 약 0.1 mg/ml 미만과 같이 이보다 훨씬 아래의 농도는 단량체 및 이량체를 포함하고 적은 양의 복합물만 포함하고, 이보다 훨씬 높은 농도는 탁하거나 흐린 용액으로서 육안으로 확인할 수 있는 응집체를 형성할 수 있다. 계면활성제, 바람직하게는 일반적으로 안전하다고 여겨지는 생리학적으로 양립가능한 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌-계 계면활성제, 또는 부형제가 사용되어, 복합물은 형성되면서 큰 응집체의 형성은 방지하는데 사용될 수 있고, 이는 언제나 이량체 종과 함께 존재하는 것으로 보인다.

본 발명의 루브리신을 포함하는 제제 시험은 본 발명의 루브리신의 부하 하의 윤활 및 조직 보호 특성이 지금까지 당업계에 공지된 재조합 루브리신을 능가할 수 있다는 것을 나타낸다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 부하 하의 윤활되지 않은 접합 조직의 이동 중 스틱-슬립(stick-slip) 현상이 발생될 수 있는 반면, 본 발명의 루브리신의 코팅은 기저 연골 표면으로부터 다분산계 루브리신의 코팅 내의 층으로 기저 이동할 수 있다고 가정한다. 이는, 코팅 내의 루브리신 분자가 서로 미끄러져가고, 이어서 부하가 제거될 때 재정렬되기 때문에, 본 발명자는, 부하 및 왕복 운동 하에 기저 표면에 그의 보전성(integrity)을 보전하면서 더 낮은 전단을 경험한다고 여긴다. (문헌 [Lee et al., PNAS, 110(7):E567-574 (2013)] 참조). 저자는 관절의 마모은 마찰 계수와 직접적인 관련이 없고 스틱-슬립 슬라이딩과 더 직접적으로 관련이 있으며, 관절의 다양한 분자 성분이 상호 상승작용으로 마모를 방지한다고 언급한다.

임의의 경우에서, 본 발명의 루브리신 생성물을 시험시, 우수한 윤활 특성을 나타내어 본원에 개시되어 있는 바와 같이 연골-대-연골 윤활 시험에 의해 측정시, (정적 및 동적 둘 다의) 마찰 계수가 종종 정제된 천연 소 루브리신의 150%, 120%, 110% 또는 본질적으로 동등한 범위 내이다. 이러한 시험에서, 본 발명의 인간 유사 당단백질은 (본원에 개시된 바와 같은 시험 조건에 따라) 0.5 이하 및 0.2 이하의 정적 마찰계수, 및 종종 약 0.1 이하의 동적 마찰계수를 달성하고, 이 둘은 모두 정상(stationary)면을 접촉하고 있는 감압된 시험관내 연골 대 연골 지지에 의해 측정된다. 히알루론산(HA)과 조합시, 이러한 수치는 (체류 시간에 따라) 관절 낭액에 받아들여지는 수치에 매우 근사한, 특정 정적 측정에 대해 약 0.3 미만 및 0.1 미만까지, 동적 측정에 대해 0.1 미만까지 개선된다. 따라서, 이러한 조성물은 관절 마모를 극적으로 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 하나의 양태는 루브리신의 상업적인 제조방법을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 방법은 인간 PRG4 유전자를 형질주입하여 이를 발현하고 발현 생성물을 번역후에 글리코실화시키는 차이니즈 햄스터 오버리(CHO) 세포를 루브리신 당단백질을 생산하는데 충분한 시간 및 배양 조건 하에 배지에서 배양시키는 단계, 및 상기 배지로부터 루브리신 당단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 예를 들어 일부 실시태양에서, 루브리신 당단백질을 숙주 세포 단백질 및 세포외 브라스(extracellular broth) 내의 다른 오염물로부터 분리하여 적어도 일부 정제한다. 본 발명의 방법의 목적상 정제되기 위해서는 재조합 단백질은 동질성(homogeneity)을 위해 정제한다기 보다는 배양 배지로부터 단지 농축되기만 하면된다. 본 발명은 글리코시드 잔기 30 중량% 이상을 가지는 루브리신 당단백질을 0.4g/L 이상의 배지내 농도에서 생성하기에 충분하다.

일부 실시태양에서, CHO 세포는 인간 PRG4 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO-M 세포이다. 또 다른 실시태양에서, CHO 세포는 염색질 요소(element)를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터로 형질주입되고, 인간 PRG4 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터로 형질주입된다. 염색질 요소는 경계요소, 기질부착부위, 유전자자리(locus) 조절부위 또는 유니버셜 염색질 개시 요소일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 염색질 요소는 기질부착부위이다.

여전히 또 다른 실시태양에서, CHO 세포는 염색질 요소를 암호화하고 인간 PRG4 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터로 형질주입되고, 염색질 요소를 암호화하고 인간 PRG4 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터로 형질주입된다. 바람직한 실시태양에서, 제1 및 제2 벡터의 염색질 요소는 기질부착부위이다.

일부 실시태양에서, 이량체 또는 다량체 루브리신 당단백질의 중량의 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상 또는 45% 이상은 글리코시드 잔기의 중량이다. 일부 실시태양에서, 이량체 또는 다량체 루브리신 당단백질의 중량의 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과는 글리코시드 잔기의 중량이다. 재조합 인간-유사 루브리신의 글리코실화는 90 중량% 이상, 95 중량% 이상, 또는 99 중량% 이상 코어 1 글리코실화이기 때문에 글리코실화된 잔기는 천연 인간 루브리신과 다를 수 있다. 또한, 일부 실시태양에서 글리코시드 잔기 천연 인간 루브리신에 비해 황화된 모노사카라이드가 풍부하다.

예상치 못하게 본 방법은 상업적으로 가능한 양의 전장 루브리신 당단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 세포는 배양시 배양 배지 리터당(예를 들어, 약 10, 50 또는 100 리터 이상) 재조합 루브리신을 약 0.4g 또는 0.5g 이상, 바람직하게는 0.8g 이상, 가장 바람직하게는 1.0 g 이상의 배양 배지 내 루브리신 당단백질 농축물을 생산하기에 충분한 시간 및 배양 조건 하에서 배양될 수 있다. 최적화된 경우 공정은 배양액 리터 당 루브리신을 2.0, 2.5 이상, 또는 3.0 g 이상 생산할 수 있다. 최적화된 정제 프로토콜의 개발에 따라, 리터당 정제된 재조합 루브리신을 약 200밀리그램 이상, 바람직하게는 300 mg/L 이상, 더욱 바람직하게는 500 mg/L 이상, 가장 바람직하게는 그보다 더욱 많이 얻을 수 있게 될 것이다. 출원인이 인식하고 있는 한에서, 이러한 수준의 생산성은 이전의 임의의 뮤신-유사 단백질, 또는 루브리신의 크기에 양립할 수 있는 단백질의 재조합 발현에서 달성된 적이 없고, PRG4의 발현의 어떠한 이전 시도에서도 본원에 기재된 생성물의 특성을 가진 물질의 생산을 성공한 적이 없다.

바람직한 실시태양에서, 단량체성 루브리신 종은 종종 다량체 단백질 종과의 혼합으로 배양 배지로부터 공-정제된다. 다량체 종은 이량체 루브리신 종이 풍부하다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 방법은 단량체성, 이량체 및 다량체 루브리신 종을 포함하는 재조합 루브리신의 혼합물을 생산한다. 일부 실시태양에서, 루브리신 당단백질은 이황화-결합되거나 비공유결합된 개개의 글리코실화된 아미노산 사슬을 5개 이상 포함하고, 1200 kDa 이상의 분자량을 가진다.

본 발명의 방법에 따라 생산된 당단백질은 하기 개요화된 프로토콜을 사용하여 시험하는 경우, 정제된 천연 포유류 루브리신에서 관찰된 가장 낮은 값에 도달하는 마찰계수를 생성한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 연골 대 연골 마찰 시험에서 측정시 재조합 루브리신 당단백질은 정제된 천연 소 루브리신의 정적 마찰계수의 150 % 이하의 정적 마찰계수를 나타내는 다량체 단백질이다. 다른 실시태양에서, 연골 대 연골 마찰 시험에서 측정시 재조합 루브리신 당단백질은 정제된 천연 소 루브리신의 정적 마찰계수의 120 % 이하의 정적 마찰계수를 나타내는 다량체 단백질이다. 여전히 또 다른 실시태양에서, 연골 대 연골 마찰 시험에서 측정시 재조합 루브리신 당단백질은 정제된 천연 소 루브리신의 정적 마찰계수의 110 % 이하의 정적 마찰계수를 나타내는 다량체 단백질이다.

본 발명의 또 다른 양태는 숙주 세포 배양에서 인간 PRG4 유전자로부터 발현되는 재조합된 다량체 루브리신 당단백질의 조성물에 관한 것이다. 상기 재조합된 루브리신 당단백질은 30중량% 이상이 글리코시드 잔기이고, 연골 대 연골 마찰 시험에서 측정시, 정제된 천연 소 루브리신의 동적 마찰계수의 150 % 이하의 동적 마찰계수을 가진다.

일부 실시태양에서, 재조합 루브리신 당단백질은 35 % 이상, 40 % 이상 또는 45 % 이상이 글리코시드 잔기이다.

일부 실시태양에서, 연골 대 연골 마찰 시험에서 측정시, 재조합 루브리신 당단백질은 정제된 천연 소 루브리신의 동적 마찰계수의 110 % 이하 또는 120 % 이하의 동적 마찰계수을 가진다.

일부 실시태양에서, 재조합 루브리신의 글리코실화는 90 중량% 이상, 95 중량% 이상 또는 99 중량% 이상 코어 1 글리코실화이기 때문에 재조합 루브리신의 글리코시드 잔기는 천연 인간 루브리신의 글리코시드 잔기와 다를 수 있다. 또한, 일부 실시태양에서, 천연 인간 루브리신에 비교하여 재조합 루브리신의 글리코시드 잔기는 황화된 모노사카라이드에 풍부하다.

일부 실시태양에서, 재조합 루브리신은 단량체성, 이량체 및 다량체 종의 혼합물이다. 일부 실시태양에서, 루브리신은 단량체성 종을 포함한다. 일부 실시태양에서, 루브리신은 이량체 종을 포함한다. 일부 실시태양에서, 루브리신은 다량체 종을 포함한다. 일부 실시태양에서, 루브리신은 다량체 및 단량체성 종의 혼합물을 포함한다

일부 실시태양에서, 루브리신 당단백질은 이황화-결합되거나 비공유결합된 개개의 글리코실화된 아미노산 사슬을 5개 이상 포함하고, 1200 kDa 이상의 분자량을 가진다.

일부 실시태양에서, 재조합 루브리신 당단백질의 조성물은 루브리신과 혼합으로 히알루론산 또는 이의 염을 추가적으로 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 루브리신의 글리코실화가 99 중량% 이상 코어 1 글리코실화인 100 g의 인간 루브리신을 포함하는 용액을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 루브리신은 재조합 인간 루브리신이다. 여전히 또 다른 실시태양에서, 용액 내의 루브리신의 농도는 0.5 g/L 이상이다. 여전히 또 다른 실시태양에서, 용액은 세포 배양 배지이다.

본 발명의 조성물은, 신체와 접촉되도록 설계된 다양한 장치의 코팅제를 포함하는 PRG4 당단백질의 임의의 공지된 약제의 제조 또는 이후에 발견될 의약적 또는 그 외 용도용(예를 들어, 미국 특허출원공보 제2009/0068247호 및 제2011/0142908호 참조); 관절의 윤활성을 강화하거나(미국 특허출원공보 제2004/0229804호 참조), 점성보충(viscosupplementation)으로(미국 특허출원공보 제2008/0287369호 참조) 인간 또는 동물에서 관절연골의 치료용; 예를 들어 외과 수술 중 응집 또는 섬유성 결합조직의 후천적인 형성을 방지하기 위해 조직 표면에 국부적 적용용(미국 특허출원공보 제2004/0229804호 참조); 안구 건조증 치료용(미국 특허출원공보 제2011/0059902호 참조); 구강 건조증 치료용(미국 특허출원공보 제2013/0039865호 참조); 간질성방광염 치료용(미국 특허출원공보 제2012/0321693호 참조); 질윤활제용(미국 특허출원공보 제2012/0052077호 참조); 콘텍트렌즈 및 저장 용액용(미국 특허출원공보 제2012/0321611호 참조) 또는 예를 들어 맥관구조 내의 세포-세포 간 응집 또는 운동성을 방지하기 위한 전신성 주사용(예를 들어, 2013년 11월 26일에 제출된 미국 국내 출원 제61/908,959호 참조)으로 사용될 수 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 방법에 사용되는 루브리신-발현 CHO-M 클론의 개발 및 hPRG4의 전장 서열을 암호화하는데 사용되는 벡터의 플라스미드 지도이다.
도 3 및 4는 본 발명의 rh루브리신의 구조를 평가하는데 유용한 폴리아크릴아미드 겔을 나타낸다.
도 5는 형질전환된 CHO-M 세포의 배양액 1L 당 시간에 따라 생성되는 루브리신의 마이크로그램을 측정하면서 진행된 루브리신 생산의 생산성에 관한 그래프이다. 배양 각각의 날짜에 따라 3개의 막대가 있다. 왼쪽의 막대는 “2014년 6월 24일의 표준 커브(Curve)"이다. 중간 막대는 “2014년 7월 24일의 표준 커브"이고 오른쪽 막대는 “2014년 7월 25일의 표준 커브”이다.
도 6은 본 발명의 rh루브리신의 코어 1 글리칸을 나타내는 다이어그램이다.
도 7은 본 발명의 rh루브리신에서 SER 및 THR로부터의 다양한 이- 및 삼-사카라이드 펜던트(pendent)의 상대적 풍부함(relative abundance)을 나타내는 표지화된 피크를 가진 크로마토그래피이다.
도 8은 인간의 관절액으로부터 추출된 천연 루브리신 상의 코어 2 구조 내로 확장되는 더 넓은 범위의 글리칸을 나타내는 다이어그램이다.
도 9는 천연 인간 루브리신에서 다양한 당 잔기의 상대적 풍부함을 나타내는 표지화된 피크를 가진 크로마토그래피이다.
도 10a, 10b 및 10c는 rhPRG4의 농도가 증가함에 따라 표면 장력이 감소하는 것을 나타내는 rhPRG4 및/또는 폴리옥시에틸렌 계면활성제 농도에 대한 표면 긴장의 플랏(plot)이다.
도 11A 및 11B는 정제된 소 PRG4, 염용액(PBS) 및 소 관절 낭액에 대해 rhPRG4 용액의 정적(도 11A) 및 동적(도 11B) 마찰계수를 포함하는 데이타를 나타낸다(PRG4 제조액 둘 모두 450 μg/mL이다). a, b 및 c의 표시는 결과에서 통계학적으로 중요한 차이를 나타낸다(p < 0.05), n = 7. 도 11B에서 각각의 막대 상의 "b"로 지적되는 바와 같이 rh-PRG4(재조합) 및 nPRG4(천연)에 대한 결과에서 통계학적으로 의미있는 차이가 없다.
도 12A-B는 염용액, rhPRG4 단독, 및 소 관절 낭액에 대한 HA+rhPRG4 용액(rhPRG4 450 μg/mL 및 HA(1.5 MDa) 3.33 mg/mL)의 정적(도 12A) 및 동적(도 12B) 마찰계수를 포함하는 데이타를 나타낸다. 도 12B의 각 막대 상의 a, b, c 및 d의 표시는 결과에서 통계학적으로 상당한 차이를 나타낸다(p < 0.05), n = 4.
도 13은 천연 소 PRG4의 분해 및 rhPRG4의 적용 후 접합 소 조직 표면에서 윤활성의 재성립을 나타낸다.
도 14A-D는 염용액 내 천연 소 PRG4 및 rhPRG4 300 μg/ml, 및 염용액 단독의 인간 각막-눈꺼풀 경계(도 14A-정적, 도 14B-동적), 인간 각막-PDMS(도 14C-정적, 도 14D-동적) 경계에서 경계 윤활에 대해 rhPRG4의 효과를 나타내는 데이타를 나타낸다. 수치는, 각막-눈꺼플(AB) 및 각막-PDMS(CD) 경계 각각에 대해 14.1±2.2 및 16.9±5.3의 평균 일반 긴장(평균± SD)을 가진 평균 ± SEM (n=6)이다. 이러한 데이타는 저부하 윤활 일(task)에서 rhPRG4 및 정제된 천연 PRG4의 시각적으로 동일한 윤활 특성을 나타낸다.
도 15는 1404개의 아미노산인 전장 인간 루브리신의 아미노산 서열이다. 신호 서열 잔기(1-24)는 볼드체로 나타나 있다.
도 16a-c는 전장 인간 루브리신을 암호화하는 핵산 서열이다.

본 발명자는 무혈청 성장 배지에서 포유류 세포를 이용한 현탁액 배양을 포함하는 생산 방법을 만드는 것을 목표로, 재조합 DNA 기술을 사용하여 공지된 인간 루브리신 당단백질의 생산에 대해 연구하였다. 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질을 생산하는 출원인에게 알려진 이전의 노력들과는 달리, 이의 생화학적 특성과 다르게 나노규모의 기계적 특성에 가치가 있는 복잡하고 크기가 큰 생체중합체를 상업적인 양으로 제조하는 것은 어렵고, 이의 물리적 특성은 이전에 조작된 세포에서 전혀 관찰된 바 없는 규모에서 번역 후 글리코실화 사건의 유용한 개발에 있다.

전장의 루브리신의 재조합 생성물에 대한 이전의 시도는 단지 리터 당 낮은 밀리그램의 양만 생산하였을 뿐이고, 적어도 약 1 내지 2 g/L를 생산하는 방법이 요구되었다. 문헌을 검토한 결과 전장의 상업적인 규모로서 성공적인 재조합 생성물, 적당하게 글리코실화된 루브리신에 대한 보고가 없었을 뿐만 아니라, 또한 임의의 뮤신 또는 뮤신-유사 단백질의 상업적 규모의 발현에 대한 보고도 없었다는 것이 밝혀졌다. 연구는 루브리신과 같이 고 글리코실화된 당단백질은 발현시키기 매우 어렵다는 점을 제시하는 보고를 개시한다. 예를 들어 미국특허 제7,642,236호는 "발현 변수를 최적화하고 대략 76-78의 KEPAPTT 유사 서열 모두의 기능적인 요구를 연구하기 위해, 루브리신 발현 작제물을 O-연결된 올리고사카라이드 치환기를 다양한 정도로 가진 재조합 루브리신 단백질의 합성이 가능하도록 설계하였다"고 언급하고 있다. 절단된 루브리신 작제물을 발현하는 재조합 세포주의 생산성 데이타는 상기 특허에 개시되어 있지 않았다.

본원 발명자는 유전자 외적 요인(epigenetic) 조절자의 발현이 수반된 세렉시스(Selexis) 기술의 보고된 능력에 부분적으로 기반하여, 발현이 어려운 단백질 생산을 강화해 루브리신-발현 클로닝 배양물을 생산하기 위해 스위스 제네바 소재의 세렉시스 에스에이(Selexis S.A.)를 찾아내어 결국 소유하였다. (세렉시스의 특허 제7,129,062호 및 제8,252,917호, 및 미국특허출원공보 제2011/0061117호, 제2012/0231449호 및 제2013/0143264호, 본원에 참조로서 인용된 개시; 문헌[Girod et al., Nat Methods 4(9):747-53 (2007)]; 문헌 [Harraghy et al., Curr Gene Ther. 8(5):353-66 (2008)] 참조).

세렉시스 기술의 적용은 루브리신을 성공적으로 발현하는 클론의 개발을 야기했다. 분석, 스케일업(scale up) 및 정제 후에, 신규로 개발된 재조합 생산 절차로 이전에 전혀 언급된 바 없는 다량체의, 고도로 그리고 다양하게 글리코실화된 형태의 인간-유사 루브리신을 얻었고, 이러한 고도로 글리코실화된 고분자량의 뮤신-유사 당단백질을 예상치 못한 수준의 수율로 얻었다는 것이 발견되었다. 신규의 재조합 루브리신 형태로 풍부한 제제 시험은 생리학적으로 양립가능한 개선된 조직 윤활성 조성물의 예상치못한 특성 및 생산 가능성을 나타내었다.

rh 루브리신 제조 방법

숙주 세포

세렉시스 클론 생산의 성공은 염색질의 동적 정렬을 조정하는 DNA-기초 요소, 이른바 기질부착부위를 포함하는 당해 소유의 CHO M 세포주를 사용하여 행해졌다. CHO M 세포주는 CHO-K1 세포로부터 유도된, 무혈청 배양 조건에 적합하고 재조합 단백질의 생산에 사용되는 차이니즈 햄스터 오버리 세포주(ATCC, Cat. # CCL-61, Lot. 4765275)이다. 문헌 [Girod et al., Nat Methods 4(9):747-53 (2007)] 및 세렉시스의 미국 특허 및 공보를 참조하며, 이는 안정한 고발현 진핵세포주 예컨대 CHO를 개발하기 위한 기질부착부위(MAR)의 사용 방법에 관한 MAR, 및 ER막을 가로지르는 발현 생성물의 자리이동 및/또는 세포질막을 가로지르는 분비와 관련된 단백질을 발현시키기 위한 형질주입된 세포와 관련된 상기를 증명한다. CHO-M은 치료적 재조합 단백질의 생산에 사용되고, 더 높고 더 안정한 발현이 가능하게 한다. 이의 사용은 재조합 단백질의 생산에 사용되는 바람직한 고-수준 발현이 나타나는 클론의 분리가 가능하게 하였다.

기질부착부위(“MAR”)는 생체외에서 높은 친화력으로, 분리된 핵 스캐폴드(scaffold) 또는 핵 기질과 결합하는 DNA 서열이다(문헌 [Hart et al., Curr Opin Genet Dev, 8(5):519-25 (1998)]). 이와 같이, 이는 독립 염색질 도메인의 경계를 정의하여 둘러싸인 시스-조절 요소만이 도메인 내의 유전자의 발현을 조정할 수 있게 한다. MAR 서열은 인핸서와 상호작용하여 국부 염색질 접근성을 증가시키고(문헌 [Jenuwein et al., Nature, 385: 269-272 (1997)] 참조), 세포 배양 주에서 이종성 유전자의 발현을 강화시킬 수 있다. 하나 이상의 발현 벡터를 가진 치킨 리소자임 5’ MAR 요소를 가진 플라스미드의 공-형질주입은, 대조용 작제물에 비해 20-배의 발현 증가를 나타내어 안정한 전이유전자 발현을 증가시키는 결과를 나타낸다.

MAR은 본원에 인용된 세렉시스 출원 및 공보에 개시된“염색질 요소”(또한 본원에서 세렉시스 제네틱 엘레멘츠(Selexis Genetic Elements) 또는 SGE로 칭한다)의 하나의 유형이다. 염색질 요소 또는 SGE는 이종성 유전자가 숙주의 염색체로 통합되는 지점 주변의 염색질이 융합된 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 것을 방지하는데 사용된다. 염색질 요소는 경계 요소 또는 절연 요소(BE), 기질부착부위(MAR), 유전자자리 조절부위(LCR), 및 유니버설 또는 유비쿼터스 염색질 개시 요소(UCOE)를 포함한다. SGE는 일단 발현 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 융합되면 염색질을 형성하여 이식유전자(transgene)를 고도로 전사가 활성화된 상태로 유지시킨다.

CHO-M 숙주 세포는 8 mM의 L-글루타민, 하이포잔틴 및 티미딘(1xHT, 인비트로젠(Invitrogen))을 보충한 SFM4CHO 배지(하이클론(HyClone))에서 배양되었다. 세포는 37℃ 및 5%의 CO₂ 하의 습윤의 인큐베이터에서 교반 하에(120 rpm, 25 mm 스트로크(stroke)) 유지되었다.

벡터 작제

전장 1404 AA 인간 루브리신 단백질을 암호화하는 PRG4 유전자(서열:2)를 포유류 세포에서 유전자 발현을 강화시키기 위해 상업적으로 입수가능하고 세렉시스 에스에이(스위스 제네바 소재) 사의 플라스미드 벡터에 삽입하였다. 전장 인간 루브리신을 암호화하는 또 다른 서열은 젠뱅크 어세션 번호(GenBank Accession) 제NM_005807.3호로 입수가능하다.

2개의 발현 벡터를 작제하였다. 루브리신 유전자를 퓨로마이신 내성 및 히그로마이신 내성을 가진 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 퓨로마이신 내성을 포함하는 벡터는 pSV퓨로(puro)_C+_EF1알파(KOZAK-ext9) EGFP_BGH pA>X_S29(2*HindIII, SalI 충전됨) (Mw=9861)로 지정하였다. 히그로마이신 내성을 함유한 벡터는 pSV히그로(hygro)_C+_EF1알파(KOZAK-ext9) EGFP_BGH pA>X_29(2*HindIII, SalI 충전됨) (Mw=10299)로 지정하였다. 발현 벡터는 암피실린 내성을 주는 트랜스포손(Transposon) Tn3 (AmpR)으로부터의 박테리아 베타-락타마제 유전자, 및 박테리아 ColE1 복제 오리진(origin)을 포함하였다. pGL3컨트롤(Control)의 유도체(프로메가(Promega))로서 발현 벡터의 종결 부위는 BGH 폴리아데닐화 신호의 하류스트림(downstream)에 위치한 SV40 인헨서를 포함하였다. 각각의 벡터는 또한 발현 카세트(cassette)의 하나의 인간 X_29SGE 하류스트림 및 SV40 프로모터(promoter)의 조절 하에 융합된 퓨로마이신 또는 히그로마이신 내성 유전자를 포함하였다. X_29SGE는 세렉시스 제네틱 엘레멘트“SGE”, 본 사건에서 기질부착부위 (MAR)를 나타내고, 이는 본원에서 참조한 세렉시스 출원 및 공보에 개시되어 있다. 두 발현 벡터 모두 CMV 인핸서와 결합된 hEF-1-알파 프로모터의 조정 하에서 흥미있는 유전자(PRG4)를 암호화하였다. 플라스미드는 서열화에 의해 확인될 수 있다 .

퓨로마이신 내성 유전자 및 히그로마이신 내성 유전자 함유 벡터의 플라스미드 지도가 각각 도 1 및 도 2에 나타나 있다.

형질주입

세포를 CHO-M 세포의 펄스 조건을 조정하는 마이크로포레이터(MicroPorator^TM)(대한민국 소재의 나노엔테크 인코포레이티드)(NanoEnTek Inc.))를 사용하여 미세다공화(microporation)로 형질주입시켰다(1250V, 20 ms 및 3 펄스). 형질주입 효율은 GFP 발현 벡터를 사용하여 동등하게 조정하고 50 내지 70%의 형질주입 효율을 나타내었다. CHO-M 세포를 퓨로마이신 PRG4 발현 벡터로 먼저 형질주입시키고, 퓨로마이신 함유 배지 상에서 배양시켜 안정하게 형질주입된 세포를 먼저 선별하였다. 더욱 특히, 96-웰 플레이트 상에 희석시키고, 다음주 내에 모든 웰에 100μL의 신선 선별 배지(8 mM L-글루타민, 5μg/mL의 퓨로마이신을 포함하는 1x HT을 보충한 SFM4CHO 배지)를 첨가하였다. 27개의 미니풀(minipool)을 플레이팅 후 15일 후, 완전 세포 현탁액을 대응하는 96-웰로부터 동일 배지로 준비된 24-웰 플레이트의 하나의 웰에 이동시켜 24-웰 플레이트에 재세팅시켰다. 4일 내에 24-웰의 상층액을 분석하고 14 미니풀을 6-웰 플레이트(1 mL 세포 현탁액 + 2 mL 신선 성장 배지 함유 선별액)에 이동시켰다. 3일 후 8개의 가장 좋은 발현 미니풀을 현탁 및 스핀 튜브(5 mL의 실용적)로 수집하고, 3일 후에 쉐이크 플라스크(20 mL의 실용적) 내에서 배양시켰다. 뱅킹(banking) 전에 하나의 후속적인 계대배양(passage)을 수행하였다.

내성 세포의 풀은 쉐이크 플라스크 내에서 확장시켜 초기 연구를 위해 요구되는 물질을 생성시켰다(총 1-2 mg). 세포-미포함 배지 샘플을 5 분동안 800g에서 세포 배양물을 원심분리하여 얻을 수 있었다. 재조합 PRG4의 발현은 점 블럿(dot blot) 분석을 통해 검정하였다. 세포-미포함 배지(농축된 샘플) 10 ㎕를 PVDF 막(밀리포어(Millipore)) 상에 적용하였고, 샘플을 스팟(spot)하여 건조시켰다. PRG4 표준품을 80 μg/ml에서 2.5 μg/ml로 연쇄적 희석시켜 만들었다. PRG4의 루브리신 합성 펩타이드(피얼스(Pierce))에 결합하는 다중클론성 항체로 재조합 PRG4를 검출하였다.

가장 잘 수행된 미니풀로부터의 세포를 제2 선별 마커, 히그로마이신 내성 카세트를 이용하여 다음 슈퍼 형질주입시켰다(이미 선별된 미니풀 군의 추가적인 형질주입). 동일한 형질주입 프로토콜을 상기 기술한 바와 같이 사용하였다. 이러한 두번째㎕ 형질주입 후 1일 후에, 다시 8 mM L-글루타민 및 1x HT로 보충하지만 히그로마이신 1000 μg/mL을 포함한 SFM4CHO 배지로 선별을 개시하였다. 배지 교체 후에, 4일 이내에 3개의 풀을 6 웰 플레이트에 이동시키고, 4일 후 모든 3개의 풀을 스핀 튜브(5 mL의 실용적)로 확장시키고 3일 내 쉐이크 플라스크(20 mL의 실용적)로 확장시켰다.

클론 생성

슈퍼형질주입된 풀을 이어서 세포 특성을 최대화하기 위해 배양시키고 다중 및 연속 실험에서 성장 잠재력을 분석하였다.

첫번째 시험에서 8 mM L-글루타민, 1x HT 및 셀부스트5(CellBoost 5^TM)(하이클론)를 포함하는 세미-고형 배지(2x SFM4CHO 배지(하이클론) 및 클론매트릭스(CloneMatrix)(제네틱스(Genetics)))에서 100 세포/mL의 농도에서 배지 교체 후 3개의 수퍼 형질주입된 풀(설계된 P01ST, P05ST 및 P14ST)을 6-웰 플레이트로 이동시켰다(각각의 풀에 대해 2개의 플레이트)(선별 없음). 플레이팅된 세포를 16 일 후에 스크리닝하였고 (클론픽스(ClonePix^TM) 시스템(분자장치)) 및 22개의 후보군을 선택하여 상기 기재된 성장 배지와 96-웰 플레이트로 이동시켰다(선별 없음). 6일 후 대응되는 96-웰로부터 완전 세포 현탁액을 (1mL의 배지로 준비된) 24-웰 플레이트의 하나의 웰로 이동시켜 18개의 성장 후보군 모두를 24-웰 플레이트로 재세팅하였다. 3일 내 24-웰의 상층액을 분석하여 12개의 후보군을 6-웰 플레이트(1 mL 세포 현탁액 + 2 mL 신선 성장 배지 함유 선별액)로 이동시켰다. 5일 후 7개의 가장 좋은 발현 후보군을 배지에서 (선별 없이) 스핀 튜브(5 mL의 실용적)에서 현탁 배양으로 확장시키고 5일 내 쉐이크 플라스크(20 mL의 실용적)로 확장시켰다.

모든 세포주를 뱅킹시켰다. 3개의 가장 최적 후보의 성능을 유가배양(fed-batch cultivation)(공급 전략-CB5 용액의 초기 용적의 16%(하이클론), 52 mg/mL, 0, 3, 4, 5, 6, 7일째 공급함) 내 쉐이크 플라스크(3x10⁵세포/mL, 20 mL 배양 용적을 시딩(seeding)함)에서 비교하였다. 8일 째에 배양액은 4.22 x 10⁶내지 4.95 x 10⁶세포/mL를 함유하고 94% 내지 96%의 생존력을 보였다. 이러한 풀의 세포 군을 세고 단일 세포 플레이팅으로 희석하였다(농도 1 세포/웰, 2개의 플레이트). (선별 없이) 11일 후 단일 콜로니에 웰 당 100 μl의 성장 배지를 첨가하여 공급하였다. 17일 후, 99개의 클론을 대응되는 96-웰로부터 완전 세포 현탁액을 (1mL의 배지로 준비된) 24-웰 플레이트의 하나의 웰로 이동시켜 24-웰 플레이트로 재세팅하였다. 4일 내 24개를 6-웰 플레이트(3 mL의 신선 성장 배지 함유 선별액)으로 이동시켰다. 4일 후 8개의 클론을 스핀 튜브(5 mL의 실용적)에서 현탁 배양으로 확장시키고 1회의 배지 교환(SFM4CHO 배지, 8 mM L-글루타민 및 1x HT로 보충됨) 후 쉐이크 플라스크(20 mL의 실용적)로 확장시켰다. 모든 후보의 뱅킹 전에 한번의 후속적인 계대배양을 수행하였다.

5개의 가장 최적 후보의 성능을 유가배양(공급 전략 A CB5 용액의 초기 용적의 16%(하이클론), 52 mg/mL, 0, 3, 4, 5, 6, 7일째 공급함) 내 쉐이크 플라스크(3x10⁵ 세포/mL, 20 mL 배양 용적을 시딩함)에서 비교하였다. 3일째에 각각의 배양 내의 세포의 개수는 1.61 x 10⁶ 내지 3.46 x 10⁶세포/mL의 범위이고, 배가시간은 19.8 내지 30.7 시간이다. 8일째에 세포의 농도는 4.02 x 10⁶ 내지 9.48 x 10⁶ 세포/mL이고, 세포 생존력은 88.6% 내지 97.7%의 범위이다.

두번째 실험에서, 3개의 다른 슈퍼 형질주입된 풀(P14STcp08, P05ST11 및 P14ST33로 명명)을 상기 개요된 바와 같이 동일한 절차로 처리하였다. 이는 4개의 클론성 세포주를 형성했다. 다시 이러한 클론의 성능을 쉐이크 플라스크에서 비교하였고, 8일 후 세포의 농도는 3.5 x 10⁶ 내지 9.48 x 10⁶ 세포/mL이고 생존력은 75.3% 내지 88.1%였다.

8일째 6.03 x 10⁶세포/mL 및 95.5% 생존력을 나타내는, 상기 언급된 클론픽스(ClonePix^TM) 시스템 선별의 첫번째 회차로부터의 클론(P14ST15)을 쉐이크 플라스크 (20 mL 실용적)에 녹였다. 1회 후속 계대배양 후에, 선별 없이 8 mM의 L-글루타민, 1x HT 및 셀부스트 5(Cell Boost 5^TM)를 포함하는 클론매트릭스(CloneMatrix)+상기 기재된 세미-고형 배지에서 200 세포/mL의 농도(1 플레이트)로 후보군을 단일 플레이트로 이동시켰다. 12일 후 플레이팅된 세포를 클론픽스^TM 시스템을 이용하여 스크리닝하였고, 84 클론을 선택하여 (선별 없이) 96-웰 플레이트로 이동시켰다. 단일 콜로니에 웰 당 100 μl 성장 배지를 첨가하여 공급하였다. 플레이팅한 지 18일 후에 96 웰 상층액을 스크리닝하였다. 완전 세포 현탁액을 대응되는 96-웰로부터 (선별 없이) (1mL의 배지로 준비된) 24-웰 플레이트의 하나의 웰로 이동시킴으로써 가장 좋은 24개의 성장 클론을 24-웰 플레이트에 재세팅하였다. 3일 내에 24-웰 상층액을 분석하였고, 12개의 클론을 6-웰 플레이트(1 mL 세포 현탁액 + 2 mL 신선 성장 배지 선별액)로 이동시켰다. 4일 후 6개의 가장 좋은 발현 클론을 스핀 튜브(5 mL의 실용적)에서 현탁 배양으로 확장시키고, 4일 내 쉐이크 플라스크(20 mL의 실용적)로 확장시켰다. 2개의 후속 계대배양을 뱅킹 이전에 수행하였다. 6개의 클론성 세포주를 뱅킹하였다.

6개의 가장 좋은 후보군의 성능을 상기 기재된 바와 같이 쉐이크 플라스크에서 비교하였다. 8일째 세포의 밀집도는 9.04 x 10⁶내지 6.40 x 10⁶ 세포/mL이고, 생존력은 74.6% 내지 93.1%였다.

저온 저장 및 시험

클론성 풀의 다중 계대배양(6 내지 31) 후에, 풀을 바이알에서 6x10⁶세포/바이알로 저온저장하고, 액상 질소에서 저장시켰다. 모든 세포주에 대해 마이코플라스마(mycoplasma)가 없음을 베너(Venor^®)겜(Gem) 마이코플라스마 검출 키트(미네르바 바이오랩스(Minerva Biolabs))를 사용하여 확인하였다. 무균 시험을 제조자 프로토콜(헤이파(Heipha), 카소-뷰일론(Caso-Bouillon) TSB)에 따라 접종하고 배양시켰다. 모든 미니풀에 대한 무균 및 슈퍼형질주입된 미니풀이 확인되었다.

스케일업 배양

P05ST11-cp05로 명명된 세포주를 스케일업을 위해 선택하였다. 200 L 배양을 위해 하기 조건 및 프로토콜을 사용하였다:

rhPRG4의 발현은 200L 배양에서 1 내지 8일째 생세포 밀도(VCD)를 증가시킨다. 이어서 8일째 VCD 안정기는 떨어지기 시작하고, 이는 전형적으로 더이상 밀집 세포 배양 시스템의 대사적 요구에 조건이 적합하지 않게 되면 나타난다. 그럼에도 불구하고, rhPRG4의 발현은 줄지 않고 계속되고 12-14 x 10⁶세포/ml의 VCD를 가진 배양 시스템에서 이의 발현은 배양 13일째 최고 농도에 도달하였다. 도 5는 HPLC 플랏의 커브 아래 부분을 이용하고, 이 면적을 99% 이상의 순수 루브리신이라고 여겨지는 것을 연속적으로 희석한 샘플을 HPLC 정제에 의해 만들어진 3개의 다른 표준 커브와 비교하고 면적을 해석함으로써 측정된, 시간에 따른 재조합 루브리신의 누적량을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 이러한 절차로 재조합 루브리신 생산은 2.5 g/ml 근방인 것으로 추정된다. 추가적인 생산 진행(run)에서 다양한 기술로 측정시 겉보기 수율이 각기 다르게 나타났다. 하나의 진행은 경쟁적 ELISA로 측정시 1.5 g/L의 루브리신을 생성하였다. 또다른 진행은 1.4 g/L의 루브리신을 생성하였다.

재조합 PRG4 의 정제

정제 프로토콜의 개발 목표는 발현된 루브리신 생성물과 이의 다량체 복합물을 오염물로부터 분리시키고 응집을 방지하여 고수율을 유지하면서, 이들의 윤활 기능을 유지시키는 것이다. 이는 루브리신의 고 글리코실화, 이의 높은 분자량, 반-부착(anti-adhesion) 특성, 표면 윤활, 및 복합물을 형성하는 경향, 그리고 순도가 증가할 때 응집하여 불용성 마이크로입자를 형성하는 경향성 때문에 어렵다. 초기의 실험은 수확된 배지에서 루브리신의 역가(titer)가 높았기 때문에, 유체 통과(flow through) 모드 크로마토그래피가 정제 손실을 방지하기 위해서 필요하다고 제시하였다. 유체 통과에서 루브리신 생성물은 유지하면서 크로마토그래피 흡착에 의해 오염물을 추출시키는 전략이 개발되었다. 개발 과정에서 수율은 예를 들어 솔비탄 모노라우레이트의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 비이온성 계면화성제 성분을 사용하는 것에 민감하다는 것이 밝혀졌다. 루브리신 풀에서 이러한 계면활성제를 제거하는 것은 크로마토그래피 분리 단계 후 한외여과/투석여과(diafiltration) 및 0.2μm 여과중에 생성물의 상당한 손실을 일으켰다. 0.1 중량%만큼 적은 양의 계면활성제를 사용하는 것이 수율을 매우 개선시켰다. 더 적은 농도의 계면활성제가 기능을 유지시키면서 수율 개선을 가능케 한다는 것이 시행착오로 밝혀졌다.

정제 공정에 사용되는 비이온성 계면활성제 뿐만 아니라, [(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS) 및/또는 라이신과 같은 부형제의 생리학적으로 양립가능한 형태가 본 발명의 루브리신 용액에 혼합될 수 있고, 이는 용액을 안정화시켜, 예를 들어 0.4 또는 0.6 mg/ml 초과의 농도를 함유한 용액에서 루브리신의 응집을 방지하거나 감소시킬 수 있는 이점이 있을 수 있다.

반복 시험으로 하기 정제 공정을 개발하였다.

침전에 의해 정화된 배지(100 mL)를 5 mL의 200 mM 트리스(Tris), 40 mM MgCl₂(pH 8.2)로 희석시키고, 400 유닛의 벤조나아제(Benzonase)(250 유닛/μl, 노바겐(Novagen))와 혼합시켜 가용성 폴리뉴클레오타이드를 제거하였다. 용액을 4 시간동안 실온에서 혼합하고, 이어서 37.8 g의 우레아와 혼합시켜 우레아 농도를 6M까지 조정하고 120mL의 용액을 만들었다. 이에 1N의 NaOH를 첨가하여 pH 11로 조정하고 0.01% 트윈(Tween) 20(솔비탄 모노라우레이트, 시그마(Sigma))를 첨가하였다.

벤조나아제-첨가후 물질을 이어서, 오염물은 수지에 결합되고 생성물은 결합되지 않는 유체 통과(FT) 모드로 작동되는, GE Q 빅 비즈(GE Q Big Beads^TM) 음이온 교환수지를 사용하여 6M의 우레아 및 0.01%의 트윈(Tween) 20의 존재 하에 PH 11에서 처리하였다. 컬럼을 우선 0.1N의 NaOH로 위생처리하고; 이어서 100mM의 NaPO₄, 1.5M의 NaCl로 충전하여(pH 7.2); 200mM의 트리스-보레이트(Tris-Borate), 6M의 우레아로 재-평형시켰다(pH 10). 그 다음 30ml 용적의 컬럼(XK 26 x 6 cm)에 20 ml/분의 유속(240cm/hr)으로 4 ml/ml의 수지에 120 ml의 용액을 로딩시키고, 이어서 평형 완충액-100mM의 트리스-보레이트, 100mM의 NaCl, 6M의 우레아, 0.01%의 트윈 20으로 세정하였다(pH 11). 부하 후 잠시 후, 생성물을 박리액(strip solution) 0.1N NaOH+1M NaCl을 첨가시킬 때까지 세정을 통해 수집했다(총 용적 290mL).

이러한 부분적으로 정제된 유체 통과 루브리신 풀을 1M의 구연산염으로 pH를 조정하였고(pH 7.5), 하이드록시아파타이트 컬럼(바이오라드(BioRad) CHT)을 통과시켰다(컬럼 용적-14ml(XK 16 x 7 cm), 컬럼 부하량-21 ml의 로딩/ml 수지, 유속=10 ml/분(300 cm/hr)). 컬럼을 우선 0.1N의 NaOH 및 1 M의 NaCl로 위생처리하고, 500mM의 NaPO₄으로 충전하여(pH 6.5); 500mM의 NaPO₄/6M의 우레아로 재-평형시키고(pH 7.4); 상기 단계로부터의 290 mL의 유체 통과액을 로딩하였다. 다음으로 평형 완충액 15mM의 NaPO₄, 6M의 우레아, 0.01%의 트윈 20으로 세정시켜(pH 7.4) 생성물을 함유한 305 ml의 유체 통과액을 생성하였다.

하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 유체 통과액을 1M의 구연산염으로 pH 4.8까지 조정하고, 물로 희석시킨 다음, GE SP 빅 비드 수지를 통과시켰다(컬럼 용적-6ml(XK 1.6 x 3cm), 컬럼 부하량-58ml 로딩/ml 수지, 유속=6.7ml/분 (200cm/hr)). 컬럼을 먼저 0.5N의 NaOH로 위생처리하고, 100mM의 NaPO₄, 1.5M의 NaCl로 충전시켜(pH 7.4); 50mM의 구연산 나트륨염/6M의 우레아, 0.01%의 Tween 20으로 재-평형시키고(pH 4.8); 상기 단계로부터의 350 mL의 유체 통과액을 로딩하였다. 이어서 평형 완충액, 50mM의 구연산 나트륨염/6M의 우레아, 0.01%의 트윈 20으로 세정하여(pH 4.8) 생성물을 함유한 378 ml의 유체 통과액을 생성하였다. 이어서 유체 통과액을 10N의 NaOH로 중화시켰다(pH 7.2).

농축 및 완충액 교환을 위해, 양이온 교환 유체 통과 후 생성물 풀을 분자량 50 kDa의 컷-오프(cut-off) 탄젠X(TangenX) 0.01m² 판상 막(탄젠X 테크놀로지 코포레이션(TangenX Technology Corporation)), LP 스크린 채널을 사용하여 여과하였다. 투석여과 완충액은 10mM의 NaPO₄, 150mM의 NaCl(pH 7.2)(PBS) 및 0.1% 트윈 20이다. 0.1N의 NaOH로 위생처리 후; 밀리Q(MilliQ) 물로 헹구고; 10mM의 NaPO₄, 150mM의 NaCl로 평형을 만들고(pH 7.2) 막에 15,000 ml/m²를 로딩하고; 투과-속도 70 ml/min; 막투과 압력=6-7 psi; 침투 속도= 5-6 ml/min로 하여 용액을 대략 50 ml로 농축시켰다.

마지막으로, UFDF 후 생성물 풀을 사토리어스 사토포어 2(Sartorius Sartopore 2) 150-0.015m² 막에 약 17,000 ml/m²의 막 로딩 및 45-50 ml/분의 유속으로 0.2 μm 여과시켰다. 막을 먼저 10 mM의 NaPO₄, 150 mM의 NaCl(pH7.4)로 처리하고, 이어서 생성물을 여과한 다음, 약 40ml의 완충액으로 추적(chase) 여과하고 마지막으로 여과액을 배수하였다.

최종 정제 생성물의 UFDF 및 0.2μm 여과로부터의 회수율을 개선하기 위해 추가적인 부형제가 현재 시험 중에 있다. 이러한 공정으로 수확된 배지 1L 당 96% 이상의 순도라는 많은 양의 생성물을 수득할 수 있다. 대안적인 정제 전략이 당업계의 통상의 기술자에게 용이할 것이다.

루브리신 생성물의 특징화

전기 영동

전장 루브리신 아미노산 주쇄(backbone)의 분자량은 150,918 달톤(Dalton)이다. 글리코실화의 정도 및 유형은 분자-분자 간에 다양하다. 이량체 종으로서 본원에 개시되어 있는 바에 따라 제조된 재조합 PRG4는 약 450 kDa 초과의 평균 분자량을 가진다고 여겨진다. 단량체는 220-280 kDa, 약 300 kDa 이하의 중량을 가져야 한다.

도 3은 rhPRG4(정제시 비환원된 것 및 환원되고 알킬화된 것 둘다)의 쿠마시(Coomassie) 염색된 젤(트리스-Ac 3-8% 누페이지(NuPAGE^®) SDS-PAGE 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 시스템, 인비트로젠(Invitrogen))을 나타낸다. 숫자가 표시된 모든 밴드는 MS/MS에 의해 호모사피엔 PRG4(유니프로트 어세션 번호(UniProt Accession) 제Q92954호; 서열:1)에 대응하는 아미노산 서열을 가지는 루브리신으로 확인되었다. 도시된 바와 같이, 상기 기재된 바에 따라 제조된 재조합 루브리신(NR)은 분자량 표준과 비교하여 추측된 약 460kDa의 대략적인 분자량을 가진 주 밴드를 포함하고, 하나는 그보다 약간 높고, 하나는 젤 안으로 이동할 수 없어 젤의 위에 있다.

rhPRG4를 뉴라미니다아제(neuraminidase)(NaNase 1) 및 O-글리코시다아제 DS로 동시에 분해시켜 번역 후 처리로 생긴 성분의 동정을 수행하여, 도 4에서 L-NO로 라벨링된 레인에서 나타난 바와 같은 rhPRG4 아미노산 코어의 분자량을 밝혀냈다. 코어의 예견된 분자량은 151 kDa이고, 이는 4-12%의 SDS-PAGE에 의해 실험적으로 확인된다. 뉴라미니다아제 단독으로 분해하는 경우 분자량에서 감소 효과가 나타나는데, 이는 글리코실화가 뉴라민산으로 완전하게 캐핑(capping)되지 않았음을 의미한다. O-연결된 β(1-3) GalNAc-Gal 잔기 및 뉴라미니다아제를 제거하는 O-글리코시다아제 DS로의 분해는, 이러한 단백질 배치가 대략 30 중량% 글리코실화된다는 것을 내포한다. O-글리코시다아제 단독으로 분해하는 경우 일부 캐핑되지 않은 GalNAC-Gal 잔기를 제거하는데만 효과가 있다.

글리코실화 분석

단백질을 더욱 특징화하기 위해, 재조합 루브리신 및 정상 활액의 루브리신으로부터의 O-글리칸을 질량분석을 수행하여 비교하였다. 요약하여, DEAE 크로마토그래피를 사용하여 활액으로부터 활액 루브리신을 분리하였다. 재조합 및 활액 루브리신을 PVDF 막으로 이동시키기 전에 3-8%의 트리스-아세테이트 겔을 사용하는 SDS-PAGE로 분리하였다. 이어서 O-글리칸은 환원성 β-제거에 의한 루브리신 블랏(blot)으로 방출시키고, 이어서 LC-MS/MS 분석을 위해 클린-업(clean-up)하였다. 선형 이온 트랩 질량 분석기, LTQ(써모 싸이언티픽(Thermo Scientific)) 상에서 데이타-의존형 방법을 사용하는 음성 모드에서 MS/MS 분석 이전에 O-글리칸을 다공성 흑연화 탄소 크래마토그래피로 분리하였다.

재조합 루브리신 샘플의 분석은 코어 1 O-글리칸 구조만 동정한다(도 6). 동정된 글리칸을 나타내는 추출된 이온 크로마토그래피는 도 7에 나타나 있다. 시알화된 구조, [M-H]-675가 2개의 주요 피크로서 나타나 있다. 이들은 지연시간 21.4 분에서 두번째 피크를 가지는 β-제거 공정 중에 발생되는 화학적 유도체인 동일한 이성체이다. 술폰화된 구조의 3개의 이성체([M-H]-464)가 동정되었다. 황화 일시알화된 구조의 여러가지 이성체 역시 동정되었다. 이시알화된 구조는 매우 양이 적고, 크로마토그래피에서 관찰할 수 없었다. 동정된 각각의 글리칸의 비율의 측정은 표 1에 나타나 있다(당 구조에 알맞게 만들기 위함, 도6 참조). 이러한 분석은 표 1의 각각의 구조에 대해 모든 이성체, 유도체 및 첨가생성물(adduct)을 조합한다.

<표 1>

재조합된 루브리신에서 동정된 글리칸 각각의 %. 데이터는 표에 나열된 각각의 구조에 대해 모든 이성체, 유도체 및 첨가생성물을 포함한다.

정상의 인간 활액 루브리신은 코어 2 구조 내로 확장되어 있는 넓은 범위의 글리칸을 가진다(도 8). 이러한 구조의 가장 풍부함은 추출된 이온 크로마토그래피 상에 도 9에 나타나 있다.

예를 들어 도 7과 도 9의 비교로부터 쉽게 예측할 수 있는 바와 같이, rh루브리신의 글리코실화된 패턴은 천연 인간 당단백질과 매우 상이하다. 천연 활액 루브리신에서 시알화된 코어 1 구조가 가장 풍부한 글리칸이지만, 다양한 종류의 상당한 코어 2 글리코실화가 존재하고, 황화된 폴리사카라이드는 매우 적은 양으로만 존재한다. 재조합 당단백질에서 시알화되고 변형되지 않은 코어 1이 글리칸의 절반 이상을 구성하고, 황화된 코어 1 구조는 동정된 O-글리칸의 약 3분의 1을 구성하며, 이때 글리칸은 3가지 가능한 이성체 모두 동정된다.

rh 루브리신의 물리화학적 특성

계면활성제-유사 ( 양친매성 ) 특성

rhPRG4의 중요한 측면은 물리화학적 흡착을 통해 생물체 및 비생물체의 표면을 코팅하는 능력이다. 천연 PRG4은 표면 활성이고, 크기가 큰 뮤신-유사 도메인으로부터 분리된 말단 구상 도메인을 포함한다. 이는 당해 구조 내에서 극성 및 비극성 도메인으로 분리시킬 수 있다. 인간 관절 낭액 루브리신의 표면력 기구 연구에 나타난 바와 같이, 중앙 뮤신 도메인은 그 자체를 뒤로 접힐 수 있고, 이는 이러한 정렬이 도달됨으로써 글리코실화가 중지된다는 것을 제시한다. 전체적으로 뮤신 도메인은 N- 또는 C-말단보다 더욱 친수성이 된다. 이의 중요성은 글리코실화의 분해가 윤활성 능력을 제거할 것이라는 사실에 의해 확인된다(문헌 [Jay et al., J Glycobiol 2001]). 이러한 양친매성 성질이 또한 rhPRG4에 존재한다. 이는 지방족 및 수성 계면간의 계면장력의 감소의 평가에 의해 쉽게 측정될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 제조된 rh루브리신의 계면활성 특성을 시험하도록 설계된 실험에서, 희석되지 않은 소수성 시클로헥산으로 덮힌 PBS 용액에 rhPRG4의 농도의 증가가 나타났다. rhPRG4을 함유한 수성 서브-상에 위치한 뒤 노위(Du Nouy) 링을 위쪽으로 당겨서 계면을 통해 링이 깨지는 임계장력(Г_i)을 기록하였다. 측정은 어텐션 시그마(Attension Sigma) 702ET 장력계로 각각의 농도에서 5회 수집되었다. rhPRG4의 농도의 용량 반응 곡선을 Г_i에 대해 플랏(plot)하였다(도 10a를 참조). 도시된 바와 같이, rhPRG4의 농도가 PBS 함유 수성 서브-상에서 증가함에 따라, 표면 장력이 감소한다.

rh루브리신 용액이 잔여 비이온성 계면활성제(트윈 20)를 함유하기 때문에, 시험을 반복하여 이것이 재조합 생성물을 첨가함에 따라 유도되는 표면 장력을 극적으로 감소시키는 역할을 하는지 조사하였는데, 먼저 다양한 농도의 계면활성제를 단독으로 사용하고, 이어서 본 발명의 rhPRG4를 매우 저농도로 사용하였다. 계면활성제와 PRG4의 마이크로리터 양을 15mL의 수성 서브-상에 첨가하였다. 결과는 도 10b 및 도 10c에 나타나 있다. 도시된 바와 같이, PRG4 단독(도 10c)은 0.1%의 상업적인 계면활성제 단독(도 10b)보다 표면장력을 더 잘 감소시킨다. 그러므로, 모두 동일한 양의 용액의 첨가시 0.1% 트윈 함유 및 트윈 미함유 rhPRG4는 0.1 % 트윈 단독보다 PBS 및 사이클로헥산의 계면 장력을 감소시켰다.

이러한 데이타는, 낮은 농도에서일지라도 rhPRG4가 계면 장력을 감소시키면서 바람직하게는 수성-지방성 계면을 생성한다는 것을 나타낸다. 이러한 현상은 마찰을 감소시키는데 요구되는 표면 결합 상호작용을 보여주고, 천연 루브리신의 작용을 모방한다. 게다가 계면 장력을 감소시키는 활성은 rhPRG4 생산의 품질 관리 방법으로 사용될 수 있다.

윤활 특성

연골 윤활

앞서 기재한 바와 같이, 마찰 시험을 위해 골격적으로 성숙한 소 후슬관절(stifle joint)의 슬개-대퇴구로부터 신선 골연골 샘플을 제조하였다(n=16). 요약하면, 코어(반경=6 mm) 및 구환(외반경=3.2 mm 및 내반경=1.5 mm)을 모두 유체 감압이 가능하도록 중앙 홀(반경=0.5 mm)을 가진 골연골 블럭으로부터 채취하였다. 샘플을 4℃, PBS에서 밤새도록 격렬하게 헹구어 관절 표면에서 잔여 관절 낭액을 제거하였고, 이는 윤활 존재에 대한 시험으로 확인하였다. 이어서, 샘플을 -80℃에서 프로테이나 억제제와 PBS에서 냉동시키고, 녹여서, PBS에서 밤새도록 재-교반시켜 표면에서 임의의 잔여 PRG4을 추가적으로 제거하였다. 이어서, 다음날의 윤활 시험 이전에 샘플을 4℃에서 밤새도록 각각의 시험 윤활제(하기 기술한다) 약 0.3ml에 완전히 침지시키고, 각각의 시험 후 다음 시험의 윤활제에서 인큐베이션(incubation)하기 전에 PBS로 다시 헹구었다.

확립된 연골-대-연골 마찰 시험을 이용하여 각각의 PRG4 형태 및 대조군에 대해 경계 윤활 능력을 분석하기 위해 보스 일렉트로포스(Bose Electroforce^®) 시험 기구(ELF 3200, 에덴 프라이리에(Eden Prairie), 미국 미네소타주 소재)를 사용하였다. 요약하면, 모든 샘플을 총 연골 두께의 18%까지 0.002 mm/s의 일정한 속도로 압축하고, 조직간질액을 감압시킬 수 있기 위해 40 분 동안 스트레스-릴렉스를 가하였다. 이어서 샘플을 감압된 연골-연골 계면에서 경계 모드 윤활을 유지하는 것으로 알려진 효과적인 속도(0.3mm/s)에서 회전시켰다(±2 회전). 1200, 120, 12 및 1.2 초의 슬라이딩-전 정상 기간(stationary period)을 둔 후, 샘플을 각각 연속된 정상 기간 후에 회전시켰다(+/- 2 회전). 이어서, 상기 시험 순서를 반대방향 회전으로 반복하였다(-/+ 2 회전).

2회의 시험 순서로 rhPRG4 단독, 및 HA와의 조합의 연골 경계 윤활 능력을 평가하였다. 2개의 시험 순서 모두에서 PBS는 음성 대조군 윤활제로 사용되었고, 소 관절 낭액은 양성 대조군 윤활제로 사용되었다. 2개의 rhPRG4 및 정제된 천연 소 PRG4를 PBS에서 450μg/mL의 농도로 제조하였고, HA(1.5MDA 라이프코어 바이오메디칼(Lifecore Biomedical), 미국 미네소타주 차스카(Chaska) 소재) 역시 PBS에서 3.33 mg/mL의 생리학적 농도로 제조하였다. 윤활제를 가정된 윤활능 (마찰계수 감소시키는) 증가 차수로 시험하였다. 시험 순서 1(rhPRG4 대 nbPRG4)에서 순서는 PBS, rhPRG4, nbPRG4, 관절 낭액(n=7)이었고; 시험 순서 2(rhPRG4 대 rhPRG4+HA)에서 순서는 PBS, rhPRG4, rhPRG4+HA, 관절 낭액(n=4)이었다.

2개의 마찰계수; 정적(μ_정적, N_eq)(정적 조건으로부터 스타트-업(start-up) 운동의 저항) 및 동적(<μ_동적, N_eq>)(정상 슬라이딩 운동의 저항)을 상기 기재한 바와 같이 각각의 윤활제에 대해 계산하였다. 결과는 도 11 및 12에 나타나 있다. 데이타는 평균± SEM으로 나타난다. 아노바(ANOVA)를 사용하여 1.2 초의 슬라이딩-전 정상 기간에서, <μ_동적, N_eq> 상에 터키(Tukey) 사후 검정 시험(post hoc testing)으로, μ_정적, N_eq 및 <μ_동적, N_eq> 상의 반복된 요소로서, 윤활제의 효과 및 정상-이전 기간을 평가하였다. 통계적 분석은 시스타트12(Systat12)(시스타트 소프트웨어 인코포레이티드(Systat Software, Inc.), 미국 캘리포니아주 리치몬드(Richmond) 소재)로 수행되었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 재조합 PRG4의 측정된 윤활 특성, 동적 마찰 계수 및 천연 소 PRG4의 약간 더 낮은 수치 간에 통계학적 유의성은 없었다. 도 12에 나타난 바와 같이, HA와 조합된 rhPRG4은 rhPRG4 단독에 비교하여 정적(도 12A) 및 동적(도 12B) 윤활성 모두 개선시켰다. 모든 측정치가 PBS에서 제일 높았고 소 관절 낭액에서 제일 낮았으며, rh-PRG4 및 rhPRG4 + HA가 중간이었다. rhPRG4 + HA의 혼합 용액은 rhPRG4 단독(p=0.075)보다 상당히 더 낮은 마찰계수를 가지는 경향을 보였고, 통계적으로 소 관절 낭액과 유사했다(0.021±0.001, p=0.20).

관절 베어링(bearing)으로 사용하기 위해 히알루로니다아제로 2 시간 효소 분해하여 소 연골로부터 천연 루브리신을 제거하기 위한 노력이 있어왔다. 히알루로니다아제 분해는 연골 외식편(explant)의 얕은 존으로부터 천연 PRG4(P < 0.050)를 제거하기 위함이다. 이러한 처리는 관절 연골의 기계적 특성에 크게 영향 없이 표면 PRG4을 제거한다. rhPRG4을 이러한 표면에 적용시키고 BSF 및 PBS 대조군과 마찰 반응을 비교하였고, 이로써 본 발명의 rhPRG4로 낮은 COF가 회복될 수 있는 것으로 나타났다. 도 13은 개재(intervening) 윤활제로서 rhPRG4, BSF 및 PBS를 사용시 히알루로니다아제-처리된 소 내측과(medial condyle) 연골 이식편에 대한 COF 수치를 나타낸다. 골연골 이식편을 상기 논의된 프로토콜에 따라 상기 언급된 윤활제로 시험하였다. 나타난 바와 같이 재조합 인간 유사 PRG4는 낮은 COF를 회복시켰다(rhPRG4 N = 18; BSF N = 6; PBS (N = 8)).

안구 표면 윤활

3 mm의 공막을 가진 정상적인 인간의 각막을 써던 알베르타 라이온즈 아이 뱅크(Southern Alberta Lions Eye Bank)로부터 얻었다. 인간의 눈꺼풀은 캘거리(Calgary) 대학의 신체 기증 프로그램으로 새로운 사체로부터 얻었다. 이러한 조직의 사용과 적절성은 의학 연구 윤리 의원회로부터 승인받았다. 각막(n=6)을 4℃에서 콘드로이틴 술페이트-계 각막 저장 배지(옵티솔(Optisol)-GS)에 저장하였고, 2 주 이내에 사용하였다. 눈꺼풀(n=6)을 냉동하고 사용시에 해동하였다.

rhPRG4 종의 순도를 3-8%의 트리스-아세테이트 누페이지(NUPAGE) 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 50%이 되도록 평가하였다. 순도 수준을 고려하여 농축된 rhPRG4 제제의 농도를 검정하고 조정하였다.

조직 샘플을 축형 및 회전형 작동기(actuator) 및 축 하중 및 토크 센서를 장착한 보스(Bose) ELF3200 상에 두었다. 공막에 시아노아크릴레이트 접착제(강력접착제)을 가하여 절제된 각막을 반구형 실리콘 고무 플러그(반경 = 6 mm)의 끝에 고정시켰다. 실리콘 고무 슬리브는 각막-플러그 기구 주변에 끼고, 이는 윤활제 유액을 지지하는 역할을 한다. 이어서, 이 기구를 보스 ELF3200의 회전형 작동기에 부착시켜 하부 굴절식 표면(articulating surface)을 형성하였다. 구환(외반경=3.2 mm, 내반경=1.5 mm)을 모델 PDMS 물질(약 0.4 mm의 두께의 운트실가드(UntrSylgard) 184, 다우코닝(Dow Corning)) 또는 인간 눈꺼풀 조직으로부터 구멍을 뚫거나, 구환 지지대에 접착시켰다. 이러한 구환 지지대를 이어서 선형 작동기에 붙여 상부 굴절식 표면을 형성하였다.

샘플을 장착한 후, 0.3 ml의 시험 윤활제를 각막에 두어 윤활제 배쓰를 형성하고, 굴절식 표면이 최소 5분 동안 시험 윤활제와 평형을 이루도록 하였다. 조직 샘플을 축 부하 0.3±0.02, 0.5±0.03, 및 0.7±0.03 N에 대응되도록 매뉴얼대로 지정된 3개의 축 위치에 접촉되도록 하여, 접촉면(24.6 mm²)에 기초하여 12.2 내지 28.5 kPa 범위의 축 압력을 가하였다. 일단 주어진 축 위치에서, 샘플을 4개의 다른 유효 슬라이딩 속도(ν_유효 = 30, 10, 1.0, 0.3 mm/초)로 양쪽 방향으로 4 회전을 시켰고, 이때 ν_효과 = ω·r_효과 및 r_효과=2/3[(r_o3 - r_i3)/(r_o2 - r_i2)]이다. 축 부하 및 토크는 회전 중 20Hz에서 수집하였다. 각각의 회전 간에는 12초의 지연시간이 있었다. 하기 기술하는 바와 같이, 각각의 연속 시험은 조직이 염용액 배쓰에서 기술된 시험 프로토콜을 수행되는 전처리 단계를 포함한다.

인간 각막-눈꺼풀(시험 1) 및 인간 각막-폴리디메틸실록산(PDMS, 시험 2) 경계에서 rhPRG4 제제의 경계 윤활력을 결정하기 위해, 하기 시험 순서를 사용하였다: 염용액 중 300μg/mL의 PRG4, 염용액 중 300μg/mL의 rhPRG4, 이어서 염용액(센서티브 아이즈 살린 플러스(Sensitive Eyes Saline Plus), 바슈&롬(Bausch & Lomb)).

2개의 계면에서 시험 윤활제의 효과를 평가하기 위해, 동적 및 정적 마찰계수를 계산하였다. 도 14에 설명되어 있는 바와 같이, PRG4 및 rhPRG4 모두 상당히 그리고 유사하게 인간 각막-PDMS 계면에서(도 14C 및 14D 참조), 각막 눈꺼풀 계면(도 14A 및 14B)에서 마찰을 감소시켰다.

SEQUENCE LISTING <110> LUBRIS LLC <120> PRODUCTION OF RECOMBINANT LUBRICIN <130> LUB-025PC <140> PCT/US2014/061827 <141> 2014-10-22 <150> 61/894,366 <151> 2013-10-22 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly 20 25 30 Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr 35 40 45 Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys 50 55 60 Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg 65 70 75 80 Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys 85 90 95 Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser 100 105 110 Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr 115 120 125 Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys 130 135 140 Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val 145 150 155 160 Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 165 170 175 Ser Thr Ile Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg 180 185 190 Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr 195 200 205 Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser 210 215 220 Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr 225 230 235 240 Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys 245 250 255 Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys 260 265 270 Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu 275 280 285 Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr 290 295 300 Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp 305 310 315 320 Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu 325 330 335 Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro 340 345 350 Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro 355 360 365 Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr 370 375 380 Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 385 390 395 400 Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 405 410 415 Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro 420 425 430 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro 435 440 445 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro 450 455 460 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys 465 470 475 480 Glu Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys 485 490 495 Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys 500 505 510 Glu Pro Ser Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys 515 520 525 Ser Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser 530 535 540 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro 545 550 555 560 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro 565 570 575 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 580 585 590 Ala Pro Thr Thr Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 595 600 605 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Leu 610 615 620 Thr Pro Thr Thr Pro Glu Lys Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Lys Pro 625 630 635 640 Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro 645 650 655 Thr Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ala 660 665 670 Ala Pro Asn Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 675 680 685 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr 690 695 700 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Leu Lys Glu Pro 705 710 715 720 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys Glu Leu Ala Pro Thr 725 730 735 Thr Thr Lys Glu Pro Thr Ser Thr Thr Cys Asp Lys Pro Ala Pro Thr 740 745 750 Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr 755 760 765 Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr 770 775 780 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Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys 995 1000 1005 Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys 1010 1015 1020 Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys 1025 1030 1035 Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg 1040 1045 1050 Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile 1055 1060 1065 Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro 1070 1075 1080 Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly 1085 1090 1095 Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val 1100 1105 1110 Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val 1115 1120 1125 Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr 1130 1135 1140 Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg 1145 1150 1155 Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu 1160 1165 1170 Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val 1175 1180 1185 Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn 1190 1195 1200 Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg 1205 1210 1215 Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Phe 1220 1225 1230 Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser 1235 1240 1245 Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys 1250 1255 1260 Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val 1265 1270 1275 Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr 1280 1285 1290 Gly Glu Thr Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile 1295 1300 1305 Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala 1310 1315 1320 Arg Leu Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys 1325 1330 1335 Val Ser Ile Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala 1340 1345 1350 Ile Ser Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr 1355 1360 1365 Ala Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg 1370 1375 1380 Thr Ala Arg Ala Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln 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acaataaagt cagcacatct 780 cccaagatca caacagcaaa accaataaat cccagaccca gtcttccacc taattctgat 840 acatctaaag agacgtcttt gacagtgaat aaagagacaa cagttgaaac taaagaaact 900 actacaacaa ataaacagac ttcaactgat ggaaaagaga agactacttc cgctaaagag 960 acacaaagta tagagaaaac atctgctaaa gatttagcac ccacatctaa agtgctggct 1020 aaacctacac ccaaagctga aactacaacc aaaggccctg ctctcaccac tcccaaggag 1080 cccacgccca ccactcccaa ggagcctgca tctaccacac ccaaagagcc cacacctacc 1140 accatcaagt ctgcacccac cacccccaag gagcctgcac ccaccaccac caagtctgca 1200 cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc accaccaagg agcctgcacc caccactccc 1260 aaggagcctg cacccaccac caccaaggag cctgcaccca ccaccaccaa gtctgcaccc 1320 accactccca aggagcctgc acccaccacc cccaagaagc ctgccccaac tacccccaag 1380 gagcctgcac ccaccactcc caaggagcct acacccacca ctcccaagga gcctgcaccc 1440 accaccaagg agcctgcacc caccactccc aaagagcctg cacccactgc ccccaagaag 1500 cctgccccaa ctacccccaa ggagcctgca cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc 1560 accaccaagg agccttcacc caccactccc aaggagcctg cacccaccac caccaagtct 1620 gcacccacca ctaccaagga gcctgcaccc accactacca agtctgcacc caccactccc 1680 aaggagcctt cacccaccac caccaaggag cctgcaccca ccactcccaa ggagcctgca 1740 cccaccaccc ccaagaagcc tgccccaact acccccaagg agcctgcacc caccactccc 1800 aaggaacctg cacccaccac caccaagaag cctgcaccca ccgctcccaa agagcctgcc 1860 ccaactaccc ccaaggagac tgcacccacc acccccaaga agctcacgcc caccaccccc 1920 gagaagctcg cacccaccac ccctgagaag cccgcaccca ccacccctga ggagctcgca 1980 cccaccaccc ctgaggagcc cacacccacc acccctgagg agcctgctcc caccactccc 2040 aaggcagcgg ctcccaacac ccctaaggag cctgctccaa ctacccctaa ggagcctgct 2100 ccaactaccc ctaaggagcc tgctccaact acccctaagg agactgctcc aactacccct 2160 aaagggactg ctccaactac cctcaaggaa cctgcaccca ctactcccaa gaagcctgcc 2220 cccaaggagc ttgcacccac caccaccaag gagcccacat ccaccacctc tgacaagccc 2280 gctccaacta cccctaaggg gactgctcca actaccccta aggagcctgc tccaactacc 2340 cctaaggagc ctgctccaac tacccctaag gggactgctc caactaccct caaggaacct 2400 gcacccacta ctcccaagaa gcctgccccc aaggagcttg cacccaccac 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ttactatgcc 4140 ttttctaaag atcaatacta taacattgat gtgcctagta gaacagcaag agcaattact 4200 actcgttctg ggcagacctt atccaaagtc tggtacaact gtccttagac tgatgagcaa 4260 aggaggagtc aactaatgaa gaaatgaata ataaattttg acactgaaaa acattttatt 4320 aataaagaat attgacatga gtataccagt ttatatataa aaatgttttt aaacttgaca 4380 atcattacac taaaacagat ttgataatct tattcacagt tgttattgtt tacagaccat 4440 ttaattaata tttcctctgt ttattcctcc tctccctccc attgcatggc tcacacctgt 4500 aaaagaaaaa agaatcaaat tgaatatatc ttttaagaat tcaaaactag tgtattcact 4560 taccctagtt cattataaaa aatatctagg cattgtggat ataaaactgt tgggtattct 4620 acaacttcaa tggaaattat tacaagcaga ttaatccctc tttttgtgac acaagtacaa 4680 tctaaaagtt atattggaaa acatggaaat attaaaattt tacactttta ctagctaaaa 4740 cataatcaca aagctttatc gtgttgtata aaaaaattaa caatataatg gcaataggta 4800 gagatacaac aaatgaatat aacactataa cacttcatat tttccaaatc ttaatttgga 4860 tttaaggaag aaatcaataa atataaaata taagcacata tttattatat atctaaggta 4920 tacaaatctg tctacatgaa gtttacagat tggtaaatat cacctgctca acatgtaatt 4980 atttaataaa actttggaac attaaaaaaa taaattggag gcttaaaaaa aaaaaaaaaa 5040 a 5041 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 1 5

Claims

인간 PRG4 유전자로 형질주입되고 인간 PRG4 유전자를 발현하여 발현 생성물을 번역후 글리코실화시키는 차이니즈 햄스터 오버리(CHO) 세포를, 글리코시드 잔기를 30 중량% 이상 포함하는 루브리신 당단백질을 0.4g/L 이상의 배지내 농도로 제조하기에 충분한 시간 및 배양 조건 하에 배지에서 배양시키는 단계; 및
상기 배지로부터 루브리신 당단백질을 정제하는 단계
를 포함하는, 재조합 루브리신 당단백질의 제조 방법.
제1항에 있어서, CHO 세포가 인간 PRG4 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO-M 세포인, 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, CHO 세포가 염색질 요소를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 인간 PRG4 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터로 형질주입된 것인, 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 염색질 요소가 경계 요소, 기질부착부위, 유전자자리 조절부위 또는 유니버셜 염색질 개시 요소인, 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 염색질 요소가 기질부착부위인, 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루브리신 당단백질을 0.5 g/L 이상의 배지 내 농도로 생산하기에 충분한 시간 및 배양 조건 하에서 세포를 배양시키는 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루브리신 당단백질을 0.8 g/L 이상의 배지 내 농도로 생산하기에 충분한 시간 및 배양 조건 하에서 세포를 배양시키는 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루브리신 당단백질을 1.0 g/L 이상의 배지 내 농도로 생산하기에 충분한 시간 및 배양 조건 하에서 세포를 배양시키는 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루브리신 당단백질을 2.0 g/L 이상의 배지 내 농도로 생산하기에 충분한 시간 및 배양 조건 하에서 세포를 배양시키는 제조 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질의 글리코실화의 95중량% 이상이 코어 1 글리코실화인, 제조 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질의 글리코실화의 99중량% 이상이 코어 1 글리코실화인, 제조 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코시드 잔기가 천연 인간 루브리신과 비교하여 황화된 사카라이드 측쇄가 풍부한 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 연골 대 연골 마찰 시험으로 측정시 정제된 천연 소 루브리신의 정적 마찰계수의 150% 이하의 정적 마찰계수를 나타내는 다량체 단백질을 포함하는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 연골 대 연골 마찰 시험으로 측정시 정제된 천연 소 루브리신의 정적 마찰계수의 120% 이하의 정적 마찰계수를 나타내는 다량체 단백질을 포함하는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 연골 대 연골 마찰 시험으로 측정시 정제된 천연 소 루브리신의 정적 마찰계수의 110% 이하의 정적 마찰계수를 나타내는 다량체 단백질을 포함하는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 상기 배양 배지로부터 공-정제되고 다량체 루브리신 종과 혼합된 단량체성 루브리신 종을 포함하는 것인, 제조 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 이량체 루브리신 종을 포함하는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 이황화-결합되거나 비공유결합된 개개의 글리코실화된 아미노산 사슬을 5개 이상 포함하고, 1200 kDa 이상의 분자량을 갖는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 배지 10 L 이상, 50 L 이상, 또는 100 L 이상에서 배양하는, 제조 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 35중량% 이상의 글리코시드 잔기를 포함하는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제조 방법에 따라 제조된 루브리신 당단백질.
글리코시드 잔기를 30중량% 이상 포함하고, 연골 대 연골 마찰 시험으로 측정시 정제된 천연 소 루브리신의 동적 마찰계수의 150% 이하의 동적 마찰계수를 나타내는, 숙주 세포 배양에서 인간 PRG4 유전자로부터 발현된 재조합 다량체 루브리신 당단백질을 포함하는 조성물.
제22항에 있어서, 루브리신 당단백질이 연골 대 연골 마찰 시험으로 측정시 정제된 천연 소 루브리신의 동적 마찰계수의 120% 이하의 동적 마찰계수를 나타내는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제22항에 있어서, 루브리신 당단백질이 연골 대 연골 마찰 시험으로 측정시 정제된 천연 소 루브리신의 동적 마찰계수의 110% 이하의 동적 마찰계수를 나타내는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 35중량% 이상의 글리코시드 잔기를 포함하는 것인, 조성물.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질이 40중량% 이상의 글리코시드 잔기를 포함하는 것인, 조성물.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신 당단백질의 글리코실화의 99중량% 이상이 코어 1 글리코실화인 조성물.
제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코시드 잔기가 천연 인간 루브리신과 비교하여 황화된 사카라이드 측쇄가 풍부한 것인, 조성물.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체 루브리신 종과 혼합된 단량체성 루브리신을 추가적으로 포함하는 조성물.
제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체 루브리신 종을 포함하는 조성물.
제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이황화-결합되거나 비공유결합된 개개의 글리코실화된 아미노산 사슬을 5개 이상 포함하고, 1200 kDa 이상의 분자량을 가지는 루브리신 종을 포함하는 조성물.
제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루브리신 당단백질과 혼합으로 히알루론산 또는 이의 염을 추가적으로 포함하는 조성물.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 점성보충(viscosupplementation)으로 관절을 치료하는 약제의 제조용 조성물.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 표면에 국부 적용을 위한 약제의 제조용 조성물.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 건조증 치료를 위한 약제의 제조용 조성물.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 외과 수술 중 유착 또는 섬유성 결합조직의 후천적인 형성을 방지하기 위해 신체 표면에 적용하기 위한 약제의 제조용 조성물.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 맥관구조 내의 세포-세포 간 유착 또는 운동성을 방지하기 위한 전신성 주사용 약제의 제조용 조성물.
99중량% 이상이 코어 1 글리코실화인 글리코실화를 포함하는 인간 루브리신 100g을 포함하는 용액을 포함하는 조성물.
제38항에 있어서, 인간 루브리신이 재조합 인간 루브리신인 조성물.
제38항 또는 제39항에 있어서, 용액 내 루브리신의 농도가 0.5 g/L 이상인 조성물.