CN115605217A - 包含重组稳定半乳糖凝集素9蛋白的用于预防或治疗类风湿关节炎及骨病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含重组稳定半乳糖凝集素9蛋白的用于预防或治疗骨病的药物组合物，具体地，涉及包含连接肽的氨基酸被缺失且C末端结构域(CCRD)的氨基酸被缺失及取代的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白作为有效成分的用于预防或治疗包括类风湿关节炎在内的骨病的药物组合物。

Description

包含重组稳定半乳糖凝集素9蛋白的用于预防或治疗类风湿 关节炎及骨病的药物组合物

技术领域

本发明涉及重组稳定半乳糖凝集素9蛋白及其用途，具体地，涉及包含上述蛋白质作为有效成分的用于预防或治疗包括类风湿关节炎在内的骨病的药物组合物。

背景技术

发现了在生物体中存在特异性识别具有β-半乳糖苷结构的糖链的动物凝集素，至今已鉴定出至少14种基因。半乳糖凝集素根据结构分为原型(prototype)、嵌合型(chimera)及串联重复型(tandem repeat)。

串联重复型半乳糖凝集素之一的半乳糖凝集素9由2个糖链识别位点(糖识别结构域，carbohydrate recognition domain：CRD)和连接它们的连接肽区形成，通过该连接肽区连接N末端结构域(N-terminal Carbohydrate Recognition Domain；NCRD)与C末端结构域(C-terminal Carbohydrate Recognition Domain；CCRD)，至今已报告在多方面上的活性。关于T细胞，半乳糖凝集素9与Tim-3结合来诱导Tim-3阳性Th1细胞的凋亡(apoptosis)，通过抑制过度的Th1反应来抑制自身免疫性炎症。并且，还减少Tim-3表达的Th17细胞，该细胞为自身免疫性疾病、过敏及癌症等多种疑难病的病因或恶化因子之一。

另一方面，半乳糖凝集素9根据情况增进免疫。通过与单核细胞或树突细胞状的Tim-3结合来激活上述细胞，从而促进炎性细胞因子的生成。并且，在巨噬细胞中通过半乳糖凝集素9与Tim-3的相互作用来增进排除结核菌的免疫。

同时，已经确认了从人类细胞或组织中克隆的半乳糖凝集素9基因之间存在遗传多样性现象的提示性证据，已查明以大肠杆菌为宿主生产的重组体半乳糖凝集素9通过对肿瘤细胞的直接作用(肿瘤细胞的细胞间粘合、诱导细胞凋亡的活性)及通过免疫系统的作用具有抑制癌症的转移及诱导消退的效果，以及诱导激活T细胞，尤其是诱导作为过度免疫反应的原因的CD4阳性T细胞的凋亡。并且，已知还具有治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的效果、治疗过敏及哮喘的效果，以及治疗I型糖尿病的效果。

为了将半乳糖凝集素9用作实际的治疗剂，应解决半乳糖凝集素9的如下问题，即，1)蛋白质分解酶的敏感性；2)低溶解性；以及3)低获取量。通过切割半乳糖凝集素9的连接肽来制备具有蛋白分解酶抗性的半乳糖凝集素9变异体(G9Null；非专利文献1)等的研究正在持续着，已知KRAS突变具有结肠癌的抗肿瘤活性(非专利文献2)等效果。

另一方面，骨是经过骨的吸收和形成来持续清除与重建的动态组织。这样的过程是通过两种细胞，即，分别通过破骨细胞(osteoclast)及成骨细胞(osteoblast)进行的。具体地，成骨细胞负责骨的形成，破骨细胞负责骨的清除。在正常环境下，通过两种细胞均衡的活动来保持骨的恒久性。但是，恒久性会因两种类型的细胞，尤其会因破骨细胞的非正常的过度活动而被打破，结果导致关节炎(arthritis)、骨质疏松症(osteoporosis)、人工关节假体周围骨溶解(periprosthetic osteolysis)及佩吉特病(Paget'sdisease)之类的骨病。因此，正确调节破骨细胞的分化及功能在骨病的预防及治疗中至为重要。

例如，治疗骨质疏松症的药物疗法有促进骨形成或者抑制骨吸收来阻止骨量的减少或者增加骨量的药物，其中有骨吸收抑制剂，例如钙制剂、维生素D制剂、双膦酸盐制剂(bisphosphonate)、雌激素激动剂/拮抗剂、雌激素制剂，以及骨形成促进剂，例如作为甲状旁腺激素制剂的特立帕肽注射剂。

并且，在关节炎中，类风湿关节炎是典型的慢性自身免疫性疾病，是由包裹关节周围的滑膜组织的炎症引起的疾病。可以发生在具有滑膜的所有关节中，作为侵犯全身多个器官的疾病，破坏关节组织引起严重的关节障碍，是引起早期死亡的慢性炎症疾病。虽很少见，但部分严重的患者还会侵犯除关节外的组织，例如肺、心脏、眼、胃肠道、皮肤及肾脏。进而，通常在体内大量分泌的炎症介导物质给骨代谢带来不良影响而提高患骨质疏松症及骨折的风险。确认实际上类风湿关节炎患者发生骨质疏松症的比例约为15％～20％。

治疗类风湿关节炎的药物疗法有非甾体类消炎剂、作为激素的一种的类固醇制剂之类的一线用药以及通过给人体的免疫系统带来影响来抑制类风湿关节炎本身的二线用药，大多需要长期使用，因此需要注意副作用。尤其是类固醇类制剂因在使用时马上能感受到好的疗效而易于滥用，因此副作用的问题很严重。并且，长期服用可能成为骨质疏松症的风险因素。

于是，本发明人为了开发对包括类风湿关节炎在内的关节炎和/或骨质疏松症具有有效的治疗效果且副作用最小化的新型治疗剂而努力的结果，确认到现有的野生型半乳糖凝集素9的2个糖链识别位点中C末端结构域(CCRD)及连接肽的氨基酸被缺失及取代的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白具有抑制Th1及Th17分化、诱导成纤维细胞样滑膜细胞(FLS；fibroblast-like synoviocyte)的细胞凋亡、抑制破骨细胞的分化的效果，在此基础上完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供包含重组稳定半乳糖凝集素9蛋白及包含其的用于预防或治疗骨病的药物组合物。

解决问题的方案

为了实现本发明的目的，本发明提供具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白。

并且，本发明提供重组载体，包含编码上述蛋白质的基因。

并且，本发明提供转化体，插入有上述重组载体。

并且，本发明提供用于预防或治疗骨病的药物组合物，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸作为有效成分；骨病治疗方法，包括向个体给药药学上有效量的具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的步骤；用于预防或治疗骨病的药物组合物，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸；以及具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备预防或治疗骨病的药物组合物。

同时，本发明提供用于预防或改善骨病的保健功能食品，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白作为有效成分；预防或改善骨病的方法，包括向个体给药药学上有效量的具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的步骤；用于预防或改善骨病的保健功能食品，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸；以及具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备预防或改善骨病的保健功能食品。

发明的效果

本发明的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白表现出抑制Th1及Th17细胞分化的效果、使滑膜细胞(FLS，Fibroblast-like synoviocytes(成纤维样滑膜细胞)凋亡的效果及抑制破骨细胞分化的效果，可以有效用作用于预防或治疗包括类风湿关节炎在内的骨病的组合物的有效成分。

附图说明

图1为确认本发明的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白(sGal-9)的Tim-3的结合度的图。

图2为确认本发明的sGal-9抑制Th1及Th17细胞分化的效果的图。

图3为确认本发明的sGal-9的FLS(Fibroblast-like synoviocytes；滑膜细胞)凋亡效果的图。

图4为确认本发明的sGal-9抑制破骨细胞分化的效果的图。

图5为确认本发明的sGal-9抑制骨吸收(bone resorption)的效果的图。

具体实施方式

以下，进一步详细说明本发明的实施方式以便于本发明所属技术领域的普通技术人员实施本发明。本发明的实施方式是为向本发明所属技术领域的普通技术人员更为全面地说明本发明而提供的。因此，本发明的实施方式可以变形为其他多种形式，本发明的范围不限定于以下说明的实施方式。

在本发明说明书全文中，当提及某部分“包含”某结构要素时，除非在文脉上明确表示不同的含义，否则表示还可以包含其他结构要素，而不是要排除其他结构要素。

本发明提供具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白。

在本发明中，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白在保持野生型半乳糖凝集素9(wild type Galectin-9)的糖链识别活性的同时具有对蛋白酶更为稳定的分子结构。

具体地，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白为通过改变连接具有NCRD-衔接物-CCRD结构的野生型半乳糖凝集素9的2个CRD(Carbohydrate Recognition Domain)的连接区及CCRD(C-terminal Carbohydrate Recognition Domain；C末端结构域)来制备的重组蛋白。更具体地，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白可以通过上述连接区的肽全部缺失、CCRD(序列2)中的1至10位点的氨基酸序列(序列3)缺失及13位点的丙氨酸(Ala，Alanine；A)被脯氨酸(Pro，Proline；P)取代来形成由序列1表示的氨基酸序列，可以包括与上述由序列1表示的氨基酸序列具有75％以上的序列同源性的氨基酸序列，优选地，可以包括与上述由序列1表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，更优选地，可以包括与上述由序列1表示的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的氨基酸序列，最优选地，可以包括与上述由序列1表示的氨基酸序列具有95％以上的序列同源性的氨基酸序列，还可以包括靶向序列、标签(tag)、标记的残基、以增加半衰期或肽稳定性为特定目的制备的氨基酸序列。

并且，本发明的重组蛋白可以通过本发明所属技术领域公知的多种方法获得。作为一例，可以利用多核苷酸重组和蛋白质表达系统来制备，或者通过肽合成之类的化学合成在体外合成的方法以及无细胞蛋白质合成法等来制备。

本发明所使用的术语“多核苷酸(polynucleotide)”为核苷酸结合的聚合物，起到传递遗传信息的作用。出于本发明的目的，本发明可以包括编码序列1的重组蛋白并且与编码上述重组蛋白的多核苷酸序列具有75％以上的序列同源性的序列，优选地，可以包括与编码上述重组蛋白的多核苷酸序列具有85％以上的序列同源性的序列，更优选地，可以包括与编码上述重组蛋白的多核苷酸序列具有90％以上的序列同源性的序列，最优选地，可以包括与编码上述重组蛋白的多核苷酸序列具有95％以上的序列同源性的序列。

本发明所使用的术语“同源性”用于表示与野生型氨基酸序列或多核苷酸序列的相似程度，这种同源性的比较可以通过本发明所属技术领域广为人知的程序进行，两个以上的序列间的同源性能够以百分比(％)计算。

并且，本发明提供重组载体，包含编码上述蛋白质的基因。

并且，本发明提供转化体，插入有上述重组载体。

本发明所使用的术语“载体”可以插入或导入基因或者碱基序列的本发明所属技术领域公知的质粒、病毒或其他媒介，具体地，可以为线性脱氧核糖核酸(DNA)、质粒DNA、重组非病毒性载体、重组病毒性载体或者诱导基因表达载体系统(inducible geneexpression vector system)，上述重组病毒性载体可以为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、辅助病毒依赖型腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒载体或者痘苗病毒，但不限定于此。本发明的上述碱基序列可与表达调控序列可操作地连接，上述可操作地连接的碱基序列可以包含于同时包含选择标志物及复制起始点(replication origin)的一个表达载体内。上述“可操作地连接(operably linked)”可以为适当的分子与表达调控序列结合时以能够表达基因的方式连接的基因及表达调控序列。“表达调控序列(expression controlsequence)”是指在特定宿主细胞中调控可操作地连接的碱基序列的表达的DNA序列。这种调控序列可以包括用于实施转录的启动子、用于调控转录的任意操纵子序列、编码适当的信使核糖核酸(mRNA)核糖体结合位点的序列以及调控转录及解读的终止的序列。

本发明所使用的术语“转化”是指通过从外部注入DNA来改变生物的遗传性质，即，将作为从生物的某系统的细胞中提取的核酸中的一种的DNA导入其他系统的活细胞时，DNA进入该细胞后使遗传性状发生变化的现象。上述细胞可以为原核细胞或真核细胞，但不限定于此。

在本发明中，上述编码重组蛋白的基因从如前所述的公知的序列中制备能够特异性识别其的引物，可以利用其通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)扩增上述基因并将其导入如上所述的载体后再导入细胞中。导入方法是公知的，例如，包括脂质体介导传递移入、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导传递移入、阳离子脂质介导传递移入法、电穿孔、利用噬菌体系统的转导或者利用病毒的感染方法等，但不限定于此。

并且，本发明提供用于预防或治疗骨病的药物组合物，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸作为有效成分。

本发明所使用的术语“预防”是指通过给药组合物来抑制发病或延迟发病的所有行为。

本发明所使用的术语“治疗”是指通过给药组合物来使上述疾病的症状好转或变为痊愈的所有行为。

在本发明中，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白可以通过表现出如下特性中的一种以上来具有预防或治疗骨病的效果：

i)Tim-3蛋白结合度上升；

ii)抑制Th1细胞及Th17细胞的分化；

iii)抑制辅助T细胞；iv)使成纤维细胞样滑膜细胞凋亡；以及

v)抑制破骨细胞分化及骨吸收。

具体地，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白可以通过与T细胞表达的Tim-3蛋白结合以诱导细胞凋亡的机制来抑制Th1及Th17之类的辅助T细胞。尤其，上述滑膜细胞与炎性细胞因子同为类风湿关节炎的重要病理之一，随着疾病的进程，滑膜细胞的非正常增殖和激活成为问题，可以持续发生关节的炎症及破坏。

并且，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白可以通过分泌基质金属蛋白酶(MMP；matrix methalloproteinase)和组织蛋白酶(cathepsin)来使破坏关节软骨的基质的成纤维细胞样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes)凋亡。

并且，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白可以抑制破骨细胞的分化及骨吸收。尤其，上述破骨细胞作为破坏及吸收骨的生长中不必要的骨组织的多核细胞，在其与有关骨的新生及再生的成骨细胞的均衡被打破的情况下，会引起发生骨损失的骨质疏松症。并且，上述骨吸收为通过破骨细胞活性来吸收骨的现象，通常已知的作为骨质疏松症药物的双膦酸盐起到通过抑制上述骨吸收来防止骨质疏松症进一步恶化的作用。

在本发明中，上述骨病可以为关节炎、骨质疏松症、人工关节假体周围骨溶解(periprosthetic osteolysis)、由植入残骸引起的骨溶解、佩吉特病(Paget's disease)、骨软化症、佝偻病、骨质减少症、钙代谢紊乱、骨转移癌(metastatic bone cancer)、炎症性骨质破坏、由内分泌疾病或药物引起的继发性骨破坏(secondary bone loss)或伴有牙槽骨的破坏的牙周疾病，但不限定于此。

并且，上述关节炎可以为骨关节炎、退行性骨关节病、类风湿关节炎、剥脱性骨软骨炎、关节韧带损伤、半月板损伤、关节错位、缺血性坏死或幼年特发性关节炎，但不限定于此。

在本发明的具体实施例中，本发明人在将诱导具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白的表达的大肠杆菌(E.coli)细胞裂解、提纯后，利用色谱法制备了重组蛋白。并且，确认到上述重组蛋白具有抑制Th1及Th17细胞分化的效果、使成纤维细胞样滑膜细胞凋亡的效果以及抑制破骨细胞分化的效果。因此，可以将上述重组蛋白及编码其的多核苷酸有效用作用于预防或治疗骨病的组合物的有效成分。

另一方面，本发明的重组蛋白或编码其的多核苷酸可以通过胶体悬浮液、粉末、生理盐水、脂质、脂质体、微球体(microspheres)或纳米球形粒子之类的药学上可接受的载体来运输。这可以与运输手段和复合物的形成有关，可以使用脂质、脂质体、微粒子、金纳米粒子、聚合物、缩合反应物、多糖类、聚氨基酸、树枝状分子、皂甙、吸附增进物质或脂肪酸之类的本发明所属技术领域公知的运输系统来向生物体内运输。

此外，药学上可接受的载体可以包括制剂时通常使用的乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油等，但不限定于此。并且，除上述成分外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。

本发明的药物组合物可以根据所需要的方法口服给药或胃肠外给药(例如应用于肌肉内、静脉内、腹腔内、皮下、皮内或者局部)，给药量可以根据患者的状态及体重、疾病的严重程度、药物形态、给药途径及时间而不同，可以通过本发明所属技术领域的普通技术人员适当选择。

本发明的药物组合物以药学上有效的量给药。

本发明所使用的术语“药学上有效的量”是指以能够应用于医学治疗的合理的受益/危险比例来治疗疾病的充分的量，有效剂量的水平可以根据包括患者的疾病种类、疾病严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径及代谢比例、治疗时间、并用的药物在内的因素及其他医学领域广为人知的因素来决定。本发明的药物组合物能够以单独治疗剂的方式给药，或者与手术、激素治疗、药物治疗及生物反应调节剂并用来使用，可以与上述制剂同时、单独或者依次给药，可以单次给药或多次给药。重要的是，考虑所有上述因素后能够以无副作用的最小的量来获得最大的效果的剂量来给药，这可以由本发明所属技术领域的普通技术人员轻易决定。

具体地，本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状态、体重、体内活性成分的吸收度、灭活率、排泄速度、疾病种类、并用的药物而不同，可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等来增减。

同时，本发明提供用于预防或改善骨病的保健功能食品，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白作为有效成分。

在本发明中，有关上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白及骨病的内容与上述说明相同，具体说明将引用上述内容。

本发明所使用的术语“改善”是指至少减少与所治疗的状态相关的参数，例如症状的程度的所有行为。在此情况下，上述保健功能食品组合物可以为预防或改善骨病而在相关疾病的发病阶段之前或发病之后，与用于治疗的药物同时或单独使用。

另一方面，在本发明中确认到具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白表现出抑制Th1及Th17细胞分化的效果、使成纤维细胞样滑膜细胞凋亡的效果以及抑制破骨细胞分化的效果，因此可以将上述重组蛋白有效用作用于预防或改善骨病的保健功能食品的有效成分。.

在本发明的保健功能食品中，可以直接将有效成分加入食品中，或者与其他食品或食品成分一同使用，可以根据通常的方法适当使用。有效成分的混合量可以根据其使用的目的(预防或改善)来适当地决定。通常，在制备为食品或饮料时，相对于原料，优选地，可以添加15重量百分比以下量的本发明的保健功能食品，更优选地，可以添加10重量百分比以下量的本发明的保健功能食品。但在以保健及卫生为目的或者以健康调节为目的而长期摄取的情况下，上述量可以为上述范围以下。

本发明的保健功能食品除包含上述有效成分外，还可以不受限制地包含其他成分作为必需成分。例如，可以如普通的饮料一样包含多种香味剂或天然碳水化合物等作为额外成分。上述天然碳水化合物的例可以为单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精之类的普通的糖，以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。除上述成分外，可以有利地使用作为香味剂的天然香味剂(索马甜、甜菊叶提取物(例如莱包迪苷A、甘草酸等))以及合成香味剂(糖精、阿巴斯甜等)。上述天然碳水化合物的比例可以通过本发明所属技术领域的普通技术人员适当地决定。

除上述成分外，本发明的保健功能食品还可以包含多种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独或者组合来使用，这些添加剂的比例也可以通过本发明所属技术领域的普通技术人员适当地选择。

并且，本发明提供预防或治疗骨病的方法，包括向个体给药药学上有效量的具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的步骤。

并且，本发明提供预防或改善骨病的方法，包括向个体给药药学上有效量的具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的步骤。

本发明的具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸表现出Tim-3蛋白结合度上升的效果、抑制Th1及Th17细胞分化的效果、抑制辅助T细胞的效果、使成纤维细胞样滑膜细胞凋亡的效果、抑制破骨细胞分化的效果抑制骨吸收的效果，因此可以有效用于骨病的治疗中。

并且，本发明提供用于预防或治疗骨病的药物组合物，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸。

并且，本发明提供用于预防或改善骨病的保健功能食品，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸。

并且，本发明提供具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备预防或治疗骨病的药物组合物。

并且，本发明提供具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备预防或改善骨病的保健功能食品。

以下，通过制备例及实施例更为详细地说明本发明。但这些制备例及实施例仅用于帮助理解本发明，而不是要以此来限制本发明的发明要求保护范围。

制备例1.制备重组稳定半乳糖凝集素9蛋白

制备了包含编码具有序列1的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白的基因的表达载体，根据热激法(heat shock)将上述表达载体导入大肠杆菌。重组蛋白的表达通过如下方法诱导：在含有50μg/ml的卡那霉素(kanamycin)的LB培养基中培养大肠杆菌，在600nm的波长下当吸光度到达0.7的时间点加入阿拉伯糖来诱导重组蛋白的表达。然后，将诱导重组蛋白的表达的细胞裂解及过滤后，通过阳离子交换法及affinity色谱柱等来捕获目标蛋白质，从而以很高的收率获得高纯度的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白。

实施例1.确认重组稳定半乳糖凝集素9蛋白(Recombinant stable Galectin9protein，sGal-9)的Tim-3蛋白结合能力

向96孔酶联免疫吸附测定(ELISA)培养板(Nunc公司，Cat.No.44-2404-21)的各孔放入100μl的浓度为0.5μg/ml的重组人Tim-3(R&Dsystems公司，Cat.No.10241-TI-050)后在常温下培养过夜后，使用含有0.05％的吐温20(Sigma公司，Cat.No.P9416)的杜氏磷酸盐缓冲溶液(DPBS，Dulbecco's phosphate-buffered saline；Welgene公司，Cat.No.LB011-02)洗涤3次。洗涤后向各孔加入200μl的含有1％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的杜氏磷酸盐缓冲溶液后在常温下培养1小时后，使用洗涤缓冲液(wash buffer)洗涤3次。洗涤3次后，将上述制备例1中获得的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白(sGal-9)稀释为多种浓度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml及20μg/ml)后向各孔加入100μl后在常温下培养2小时后使用洗涤缓冲液洗涤3次。

使用1％的牛血清白蛋白/杜氏磷酸盐缓冲溶液将Gal-9抗体(R&Dsystems公司，Cat.No.1015238)稀释为1∶1000后向各孔加入100μl后在常温下培养1小时后使用洗涤缓冲液洗涤3次后作为实验组。使用1％的牛血清白蛋白/杜氏磷酸盐缓冲溶液将抗-小鼠HRP抗体(Invitrogen公司，Cat.No.31430)稀释为1∶1000后向各孔加入100μl后在常温下培养1小时后使用洗涤缓冲液洗涤3次后作为对照组。

将以1∶1的比例混合基质试剂(Substrate Reagent；R&D systems公司，Cat.No.DY999)A和B的溶液向洗涤的各孔加入100μl后，在遮光的常温条件下培养20分钟。培养后向各孔加入50μl的终止液(2N的H₂SO₄)后使用酶标仪在450nm的波长下进行检测来确认光密度(Optical Density，O.D)值。

结果如图1所示，确认到光密度随sGal-9的浓度的上升而增加，确认到sGal-9以浓度依赖性方式表现出与Tim-3的优异的结合度(图1)。

实施例2.确认sGal-9抑制辅助T细胞(T helper cell)分化的效果

将使用磷酸盐缓冲溶液(PBS；Welgene公司，Cat.No.LB 001-02)稀释的浓度为2μg/ml的抗-CD3(eBioscience，Cat.No.16-0031-82)向96孔培养板各孔分株100μl或者向24孔培养板各孔分株500μl后在4℃的温度下培养过夜后，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤1次后用于细胞培养。分株于涂敷有CD4、CD62L及T细胞的96孔培养板或24孔培养板后在37℃及5％的CO₂的条件下培养4天后，为了诱导分化为Th1细胞，加入抗IL-4、抗IL-2及抗IL-12细胞因子，为了诱导分化为Th17细胞加入抗IFN-γ、抗IL-4、抗IL-2及抗IL-6细胞因子。加入细胞因子后，加入浓度为1μg/ml的sGal-9后在37℃及5％的CO₂的条件下培养4天。

培养后，利用酶联免疫吸附测定分析试剂盒(Mouse DuoSet，R&DSystems公司)根据生产商的步骤检测Th1细胞的IFN-γ细胞及Th17细胞的IL-17细胞因子。

结果如图2所示，确认到作为辅助T细胞的Th1及Th17细胞的分化随sGal-9的浓度的上升而被抑制，从而确认sGal-9抑制辅助T细胞分化的效果优异(图2)。

实施例3.确认sGal-9使成纤维细胞样滑膜细胞(FLS，Fibroblast-likesynoviocytes)凋亡的效果

以5×10⁴cells/ml的细胞密度向48孔培养板(SPL公司，Cat.No.30048)的各孔分株200μl的FLS细胞(细胞传代(cell passage)：RA_FLS 2-92#P7)，24小时后，向各孔加入100μl的不同浓度(2.5μg/ml、5μg/ml及10μg/ml)的sGal-9。16小时后收集上清液并在超低温冷藏柜(deep freezer)中保管。

将用于荧光激活细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)的细胞装入15ml的试管并洗涤后，加入200μl的FACS缓冲液后，在4℃的温度下保管1小时，然后使用Annexin V-FITC/7-AAD(Biolegend公司，Cat.No.640922)进行染色。染色的细胞在FACS用试管中使用70μm的细胞滤网(BD Falcon公司，Cat.No.352350)进行过滤。

结果如图3所示，确认到使成纤维细胞样滑膜细胞凋亡的效果随sGal-9的浓度的上升而增加，从而确认sGal-9使滑膜细胞凋亡的效果优异(图3)。

实施例4.确认sGal-9抑制破骨细胞分化的效果

将破骨细胞(osteoclast)以2.5×10⁵cells/ml的细胞密度向12孔培养板(Corning公司，Cat.No.3513)的各孔加入1ml来传代，24小时后，将1ml的不同浓度(0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml及10μg/ml)的作为实验组的sGal-9加入各孔，并将1ml的磷酸盐缓冲溶液作为对照组加入各孔。

分化结束后，利用TRAP Staining Kit(K-ASSAY公司，Cat.No.KT-008)对实验组及对照组的染色的破骨细胞进行TRAP染色后利用光学显微镜计数后，判断为观察到的具有3个以上核的多核细胞(TRAP(+)MNCs)分化为破骨细胞。

结果如图4所示，确认到染色的破骨细胞的数量随sGal-9浓度的上升而减少，从而确认sGal-9抑制破骨细胞分化的效果优异(图4)。

实施例5.确认sGal-9抑制骨吸收的效果

将破骨细胞(osteoclast)以2.5×10⁵cells/ml的细胞密度向涂敷有与生物体内(in vivo)骨组织相似的无机三维结晶(inorganic 3-dimensional crystalline)的OsteoAssay Surface多孔培养板(Corning公司，Cat.No.3987)的各孔中加入1ml来传代，24小时后，将1ml的不同浓度(0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml及10μg/ml)的作为实验组的sGal-9加入各孔，并将1ml的磷酸盐缓冲溶液作为对照组加入各孔。每日更换实验组(sGal-9)、对照组(PBS)及细胞培养液(MEM-alpha，gibco公司，Cat.No.12561-056)直至分化结束。

分化结束后，使用20％的十二烷基硫酸钠(SDS)(漂白溶液(Bleachingsolution))洗涤细胞后使用显微镜观察Osteo Assay Surface多孔培养板。

结果如图5所示，确认到sGal-9抑制骨吸收的效果优异(图5)。

综上所述，通过上述实施例1至实施例5的结果确认sGal-9以浓度依赖性方式提高Tim-3蛋白结合能力，提高抑制Th1及Th17细胞分化的效果及使滑膜细胞凋亡的效果，提高抑制破骨细胞分化的效果及抑制骨吸收的效果，通过上述效果确认其可以预防或治疗骨病。

SEQUENCE LISTING

<110> G生物股份有限公司

<120> 包含重组稳定半乳糖凝集素9蛋白的用于预防或治疗类风湿关节炎及骨病的药物组合物

<130> OPB2021-017CN

<150> KR 10-2019-0143752

<151> 2019-11-11

<150> PCT/KR2020/015782

<151> 2022-11-11

<160> 3

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 284

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> sGal-9

<400> 1

Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro

1 5 10 15

Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr

20 25 30

Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn

35 40 45

Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro

50 55 60

Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly

65 70 75 80

Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly

85 90 95

Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val

100 105 110

Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe

115 120 125

His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr

130 135 140

Ile Ser Phe Gln His Pro Pro Tyr Pro Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile

145 150 155 160

Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val

165 170 175

Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile Asn Leu Cys Ser Gly Asn His

180 185 190

Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu Asn Ala Val Val Arg

195 200 205

Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro

210 215 220

Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu

225 230 235 240

Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala Val Asp Gly Gln His Leu Phe

245 250 255

Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu

260 265 270

Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His Val Gln Thr

275 280

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> CCRD

<400> 2

Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro Met

1 5 10 15

Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser Ile

20 25 30

Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile Asn

35 40 45

Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe Asp

50 55 60

Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly Ser

65 70 75 80

Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln Ser

85 90 95

Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala Val

100 105 110

Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu Pro

115 120 125

Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His Val

130 135 140

Gln Thr

145

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> CCRD 1-10

<400> 3

Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro

1 5 10

Claims (18)

1.一种重组稳定半乳糖凝集素9蛋白，其特征在于，具有由序列1表示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白，其特征在于，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白保持野生型半乳糖凝集素9的糖链识别活性。

3.一种重组载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白的基因。

4.一种转化体，其特征在于，插入有权利要求3所述的重组载体。

5.一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸作为有效成分。

6.根据权利要求5所述的用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，上述重组稳定半乳糖凝集素9蛋白具有如下特性中的一种以上：

i)Tim-3蛋白结合度上升；

ii)抑制Th1细胞及Th17细胞的分化；

iii)抑制辅助T细胞；

iv)使成纤维细胞样滑膜细胞凋亡；以及

v)抑制破骨细胞分化及骨吸收。

7.根据权利要求5所述的用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，上述骨病为选自由关节炎、骨质疏松症、人工关节假体周围骨溶解、由植入残骸引起的骨溶解、佩吉特病、骨软化症、佝偻病、骨质减少症、钙代谢紊乱、骨转移癌、炎症性骨质破坏、由内分泌疾病或药物引起的继发性骨破坏及伴有牙槽骨的破坏的牙周疾病组成的组中的一种以上。

8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，上述关节炎选自由骨关节炎、退行性骨关节病、类风湿关节炎、剥脱性骨软骨炎、关节韧带损伤、半月板损伤、关节错位、缺血性坏死以及幼年特发性关节炎组成的组中。

9.根据权利要求5所述的用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，上述骨病为类风湿关节炎或者骨质疏松症。

10.根据权利要求5所述的用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，上述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

11.根据权利要求5所述的用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，上述药物组合物配制为口服用、肌肉内给药用、静脉内给药用、腹腔内给药用、皮下给药用、皮内给药用或者局部给药用制剂。

12.一种用于预防或改善骨病的保健功能食品，其特征在于，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白作为有效成分。

13.一种骨病治疗方法，其特征在于，包括向个体给药药学上有效量的具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的步骤。

14.一种预防或改善骨病的方法，其特征在于，包括向个体给药药学上有效量的具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的步骤。

15.一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，其特征在于，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸。

16.一种用于预防或改善骨病的保健功能食品，其特征在于，包含具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸。

17.一种具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗骨病的药物组合物。

18.一种具有由序列1表示的氨基酸序列的重组稳定半乳糖凝集素9蛋白或编码其的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备预防或改善骨病的保健功能食品。

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