WO2021096217A1 - 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 류마티스 관절염 및 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 류마티스 관절염 및 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant stabilized galectin 9 protein and its use, and specifically relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases including rheumatoid arthritis comprising the protein as an active ingredient.
  • Galectin 9 one of the tandem repeat-type galectins, consists of two sugar chain recognition sites (sugar recognition domain, carbohydrate recognition domain: CRD) and a link peptide region connecting them, and the N-terminal domain (N -terminal Carbohydrate Recognition Domain; NCRD) and C-terminal Carbohydrate Recognition Domain (CCRD) are linked, and various activities have been reported to date.
  • galectin 9 binds to Tim-3, induces apoptosis of Tim-3 positive Th1 cells, and suppresses autoimmune inflammation by inhibiting excessive Th1 response. In addition, it reduces Th17 cells, one of the causes or exacerbations of various intractable diseases such as autoimmune diseases, allergies and cancers expressed by Tim-3.
  • galectin 9 enhances immunity in some cases. It binds to Tim-3 on monocytes or dendritic cells to activate the cells and promote the production of inflammatory cytokines. In addition, the interaction of galectin 9 and Tim-3 in macrophages enhances immunity to exclude Mycobacterium tuberculosis.
  • bone is a dynamic tissue that undergoes continuous removal and reconstruction through bone resorption and formation.
  • This process is carried out by two types of cells: osteoclast and osteoblast, respectively.
  • osteoblasts are responsible for bone formation
  • osteoclasts are responsible for bone removal.
  • bone homeostasis is maintained by the balanced activity of the two cells.
  • homeostasis can be stopped due to abnormal hyperactivity of these two types of cells, especially osteoclasts, resulting in arthritis, osteoporosis, periprosthetic osteolysis and Paget's disease. disease). Therefore, precise control of the differentiation and function of osteoclasts is important in the prevention and treatment of bone diseases.
  • a drug therapy for treating osteoporosis it is a drug that promotes bone formation or inhibits bone resorption to prevent a decrease in the amount of bone or to increase the amount of bone.
  • a bone resorption inhibitor calcium preparations, vitamin D preparations, bisphosphonate preparations (bisphosphonate), an estrogen agonist/antagonist, an estrogen agent, and an injection of teriparatide, a parathyroid hormone agent, as an stimulator of bone formation.
  • rheumatoid arthritis is a typical chronic autoimmune disease, which is caused by inflammation of the synovial tissue surrounding the joint. It can occur in all joints where synovial membranes exist, and it is a chronic inflammatory disease that invades various organs throughout the body, causing severe joint disorders and premature death by destroying joint tissue. In some severe patients, tissues other than joints, such as the lungs, heart, eyes, gastrointestinal tract, skin and kidneys, can be affected, although rare. Moreover, inflammatory mediators, which are generally secreted in large amounts in the body, adversely affect bone metabolism, increasing the risk of osteoporosis and fracture. In fact, the incidence of osteoporosis in rheumatoid arthritis patients is confirmed to be about 15 to 20%.
  • Drug therapy to treat rheumatoid arthritis includes first-line drugs such as non-steroidal anti-inflammatory drugs, steroid drugs, which are hormones, and second-line drugs that inhibit rheumatoid arthritis itself by affecting the body's immune system. Need to be careful about. In particular, in the case of steroid preparations, when they are used, they feel good immediately and are abused, but the side effects are serious. It can also be a risk factor for osteoporosis when taken for a long time.
  • first-line drugs such as non-steroidal anti-inflammatory drugs, steroid drugs, which are hormones
  • second-line drugs that inhibit rheumatoid arthritis itself by affecting the body's immune system. Need to be careful about. In particular, in the case of steroid preparations, when they are used, they feel good immediately and are abused, but the side effects are serious. It can also be a risk factor for osteoporosis when taken for a long time.
  • the present inventors have tried to develop a new therapeutic agent that has an effective therapeutic effect while minimizing the side effects of arthritis and/or osteoporosis therapeutic agents including rheumatoid arthritis.
  • the C-terminal domain of the two sugar chain recognition sites of the existing wild-type galectin 9 (CCRD) and a recombinant stabilized galectin 9 protein in which amino acids of link peptides are deleted and substituted inhibit Th1 and Th17 differentiation, and induce apoptosis of fibroblast-like synoviocytes (FLS),
  • FLS fibroblast-like synoviocytes
  • An object of the present invention is to provide a recombinant stabilized galectin 9 protein and a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases comprising the same.
  • the present invention provides a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding the protein.
  • the present invention provides a transformant into which the recombinant vector has been inserted.
  • the present invention comprises a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient, a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease;
  • a method for treating bone diseases comprising administering to an individual a pharmaceutically effective amount of a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same;
  • a pharmaceutical composition comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for use in the prevention or treatment of bone diseases or a polynucleotide encoding the same;
  • it provides the use of a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease.
  • the present invention is a health functional food for preventing or improving bone disease, comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient;
  • a method for preventing or improving bone disease comprising administering to an individual a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same in a pharmaceutically effective amount;
  • Health functional food comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for use in preventing or improving bone disease or a polynucleotide encoding the same;
  • it provides the use of a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same for the manufacture of a health functional food for preventing or improving bone disease.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein of the present invention exhibits the effect of inhibiting Th1 and Th17 cell differentiation, killing synovial cells (FLS, Fibroblast-like synoviocytes), and inhibiting osteoclast differentiation, so that bone diseases including rheumatoid arthritis It can be usefully used as an active ingredient of a composition for prevention or treatment.
  • FIG. 1 is a diagram confirming the degree of binding of Tim-3 of the recombinant stabilized galectin 9 protein (sGal-9) according to the present invention.
  • Figure 2 is a diagram confirming the effect of inhibiting Th1 and Th17 cell differentiation of sGal-9 according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the apoptosis effect of sGal-9 according to the present invention on FLS (Fibroblast-like synoviocytes; synovial cells).
  • Figure 4 is a diagram confirming the effect of inhibiting osteoclast differentiation of sGal-9 according to the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the effect of inhibiting bone resorption of sGal-9 according to the present invention.
  • the present invention provides a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein has a more stable molecular structure against proteases while maintaining the sugar chain recognition activity of wild type Galectin-9.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein is a link region connecting two CRDs (Carbohydrate Recognition Domains) of wild-type galectin 9 having a structure of NCRD-linker-CCRD and a C-terminal Carbohydrate Recognition Domain (CCRD); C-terminal domain ) Is a recombinant protein produced by modifying.
  • CRD Carbohydrate Recognition Domains
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein has all of the peptides of the linker region deleted, the amino acid sequence at positions 1 to 10 (SEQ ID NO: 3) in CCRD (SEQ ID NO: 2) is deleted, and Ala at position 13 (Alarine; A) is substituted with Pro (Proline; P) and may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and 75% or more, preferably 80% or more, more preferably, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 May comprise an amino acid sequence having sequence homology of 90% or more, most preferably 95% or more, and prepared for a specific purpose to increase targeting sequence, tag, labeled residue, half-life or peptide stability. An amino acid sequence may additionally be included.
  • the recombinant protein of the present invention can be obtained by various methods well known in the art. As an example, it may be prepared using a polynucleotide recombination and protein expression system, or synthesized in vitro through chemical synthesis such as peptide synthesis, and a cell-free protein synthesis method.
  • polynucleotide is a polymer to which nucleotides are bound, and serves to transmit genetic information.
  • the term "homology" used in the present invention is intended to indicate a degree of similarity with a wild-type amino acid sequence or a polynucleotide sequence, and comparison of such homology can be performed using a comparison program well known in the art, 2 The homology between two or more sequences can be calculated as a percentage (%).
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding the protein.
  • the present invention provides a transformant into which the recombinant vector has been inserted.
  • vector refers to a plasmid, virus, or other medium known in the art into which a gene or a base sequence can be inserted or introduced, specifically, a linear DNA plasmid DNA, a recombinant non-viral vector, or a recombinant virus. It may be a sex vector or an inducible gene expression vector system, and the recombinant viral vector is a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, helper-dependent adenovirus, herpes simplex virus, lentiviral vector, or It may be a vaccinia virus, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence according to the present invention may be operably linked to an expression control sequence, and the operably linked nucleotide sequence may be included in one expression vector including a selection marker and a replication origin.
  • the “operably linked” may be a gene and an expression control sequence linked in a manner that allows gene expression when an appropriate molecule is bound to the expression control sequence.
  • “Expression control sequence” refers to a DNA sequence that controls the expression of a nucleotide sequence operably linked in a specific host cell.
  • Such regulatory sequences include promoters for carrying out transcription, any operator sequences for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences controlling termination of transcription and translation.
  • transformation used in the present invention means that the genetic properties of an organism are changed by a given DNA from the outside, that is, DNA, which is a type of nucleic acid extracted from a cell of a certain lineage, is introduced into living cells of another lineage. It means a phenomenon in which DNA enters the cell and changes its genotype.
  • the cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, but is not limited thereto.
  • the gene encoding the recombinant protein is prepared from a known sequence as described above, and a primer that can specifically recognize it is prepared, and using this, through a polymerase chain reaction (PCR).
  • the gene can be amplified and introduced into a cell after introducing it into a vector as described above.
  • Methods of introduction are known and include, for example, liposome-mediated transduction, calcium phosphate method, DEAE-dextran-mediated translocation, positively charged lipid mediated translocation, electroporation, transduction using a phage system, or infection using a virus. Including, but not limited to.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases, comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • prevention refers to any action that suppresses the onset or delays the onset by administration of the composition.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of the disease are improved or beneficially changed by the administration of the composition.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein exhibits any one or more of the following properties, and thus may have an effect of preventing or treating bone diseases:
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein can inhibit helper T cells such as Th1 and Th17 through a mechanism of inducing apoptosis by binding with the Tim-3 protein expressed in T cells.
  • helper T cells such as Th1 and Th17
  • the synovial cells are one of the important pathologies of rheumatoid arthritis along with inflammatory cytokines, and as the disease progresses, abnormal proliferation and activation of synovial cells is a problem, so that inflammation and destruction of joints may continue to occur.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein secretes MMP (matrix methalloproteinase) and cathepsin to destroy the matrix of articular cartilage, fibroblast-like synoviocytes. Can be destroyed.
  • MMP matrix methalloproteinase
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein may inhibit osteoclast differentiation and bone resorption.
  • the osteoclast is a multinuclear cell that destroys and absorbs bone tissue that is unnecessary in bone growth, and when the balance with osteoblasts involved in bone regeneration and regeneration is disrupted, osteoporosis may occur, causing bone loss.
  • the bone resorption (bone resorption) is a phenomenon in which bone is absorbed by the activity of bone-destructive cells, and bisphosphonate, a generally known osteoporosis drug, inhibits the bone resorption and prevents osteoporosis from worsening.
  • the bone diseases are arthritis, osteoporosis, periprosthetic osteolysis, osteolysis due to fatigue remnants of implants, Paget's disease, osteomalacia, rickets, osteopenia, calcium dysregulation, metastatic Bone cancer (metastatic bone cancer), inflammatory bone loss, endocrine disease or secondary bone loss (secondary bone loss) caused by drugs or periodontal disease accompanied by destruction of alveolar bone, but is not limited thereto.
  • the arthritis may be osteoarthritis, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, detachable osteochondritis, joint ligament damage, meniscus damage, joint misalignment, avascular necrosis, or juvenile idiopathic arthritis, but is not limited thereto.
  • the present inventors use a chromatography method after dissolving and purifying E. coli cells that induced the expression of a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a recombinant protein was prepared.
  • the recombinant protein exhibited the effect of inhibiting Th1 and Th17 cell differentiation, the effect of killing fibroblast-like synoviocytes (FLS), and the inhibitory effect of osteoclast differentiation. Therefore, the recombinant protein and the polynucleotide encoding the same can be usefully used as an active ingredient in a composition for preventing or treating bone diseases.
  • the recombinant protein of the present invention or the polynucleotide encoding the same can be transported in a pharmaceutically acceptable carrier such as colloidal suspension, powder, saline, lipids, liposomes, microspheres, or nano-spherical particles. . They can be complexed or associated with the vehicle and are known in the art such as lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation reagents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances or fatty acids. It can be delivered in vivo using known delivery systems.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as colloidal suspension, powder, saline, lipids, liposomes, microspheres, or nano-spherical particles.
  • pharmaceutically acceptable carriers include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, which are commonly used in formulation.
  • a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like may be additionally included in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, or topically applied) according to a desired method, and the dosage is It depends on the condition and weight, the degree of the disease, the form of the drug, the route of administration and the time, but may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug of the patient's disease. Activity, sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent, or may be used in combination with surgery, hormone therapy, drug treatment, and biological response modifier, and may be administered simultaneously, separately or sequentially with the agent, single or It can be administered multiple times. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all of the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate, excretion rate, type of disease, and drugs used in combination, and the route of administration, Obesity may increase or decrease depending on the severity, sex, weight, and age.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving bone diseases, comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the contents of the recombinant stabilized galectin 9 protein and bone disease are the same as those described above, and the detailed descriptions refer to the above.
  • the term “improvement” refers to any action that at least reduces the severity of a parameter related to the condition being treated, for example, symptoms.
  • the health functional food composition may be used before or after the onset stage of the disease in order to prevent or improve bone disease, and simultaneously with or separately from the drug for treatment.
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 inhibits Th1 and Th17 cell differentiation, fibroblast-like-synoviocytes (FLS) killing effect and osteoclasts. Since it was confirmed that the (osteoclast) differentiation inhibitory effect was shown, the recombinant protein can be usefully used as an active ingredient of a health functional food for preventing or improving bone disease.
  • the active ingredient may be added to the food as it is or may be used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (for prevention or improvement).
  • the health functional food of the present invention may be added in an amount of preferably 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range.
  • the health functional food of the present invention may contain other ingredients as essential ingredients without particular limitation in addition to containing the active ingredient.
  • various flavoring agents or natural carbohydrates may be included as additional ingredients.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, and the like; And polysaccharides, for example, common sugars such as dextrin, cyclodextrin, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents taumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • I can.
  • the proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the choice of a person skilled in the art.
  • the health functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavors and natural flavoring agents, coloring agents and heavy weight agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid. And salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonates used in carbonated beverages, and the like. These components may be used independently or in combination, and the proportion of these additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for preventing or treating bone diseases comprising administering to an individual a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same in a pharmaceutically effective amount. do.
  • the present invention provides a method for preventing or improving bone disease, comprising administering to an individual a pharmaceutically effective amount of a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same. do.
  • Recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention or a polynucleotide encoding the same has a synergistic effect of Tim-3 protein binding, an effect of inhibiting Th1 and Th17 cell differentiation, an effect of inhibiting the help of T cells, fiber A cell-like-synovial cell killing effect, an osteoclast differentiation inhibitory effect, and a bone resorption inhibitory effect are shown, and thus, it can be usefully used to treat bone diseases.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same for use in the prevention or treatment of bone disease.
  • the present invention provides a health functional food comprising a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same for use in preventing or improving bone disease.
  • the present invention provides a use of a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease.
  • the present invention provides a use of a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same for the manufacture of a health functional food for preventing or improving bone disease.
  • An expression vector containing a gene encoding a recombinant stabilized galectin 9 protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared, and the expression vector was introduced into E. coli by a heat shock method. Expression of the recombinant protein was carried out by culturing E. coli in an LB medium containing 50 ⁇ g/ml kanamycin, adding arabinose when the absorbance at 600 nm reached 0.7 to induce expression of the recombinant protein.
  • the cells inducing the expression of the recombinant protein were lysed and filtered, and the target protein was captured using a cation exchange method and an affinity column to obtain a highly purified recombinant stabilized galectin 9 protein in high yield.
  • Recombinant human Tim-3 (R&D systems, Cat. No. 10241-TI-050) at a concentration of 0.5 ⁇ g/ml was added 100 ⁇ l to each well of a 96-well ELISA plate (Nunc, Cat. No. 44-2404-21). After adding and reacting overnight at room temperature, it was washed three times with DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline; Welgene, Cat. No. LB011-02) containing 0.05% of Tween 20 (Sigma Cat. No. P9416).
  • DPBS Dynabecco's phosphate-buffered saline
  • Welgene Cat. No. LB011-02
  • Tween 20 Sigma Cat. No. P9416
  • DPBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) was added to each well, incubated for 1 hour at room temperature, and washed three times with a wash buffer.
  • BSA bovine serum albumin
  • the recombinant stabilized galectin 9 protein (sGal-9) obtained in ⁇ Preparation Example 1> was diluted to various concentrations (0, 5, 10 and 20 ⁇ g/ml), and 100 ⁇ l each was added to each well at room temperature. After incubation for 2 hours at, it was washed 3 times with a washing buffer.
  • Gal-9 antibody (R&D systems, Cat. No. 1015238) was diluted 1:1000 with 1% BSA/DPBS, added 100 ⁇ l to each well, and incubated for 1 hour at room temperature, and then used as a washing buffer. Washed twice.
  • anti-mouse HRP antibody (Invitrogen, Cat. No. 31430) was diluted 1:1000 with 1% BSA/DPBS, added to each well, and incubated for 1 hour at room temperature for 1 hour. Washed twice.
  • Anti-CD3 (eBioscience, Cat. No. 16-0031-82) with a concentration of 2 ⁇ g/ml diluted with PBS (Welgene, Cat. No. LB 001-02) was added 100 ⁇ l each to a 96-well plate or 24 wells. After dispensing 500 ⁇ l of each plate and reacting overnight at 4° C., it was washed once with PBS and used for cell culture.
  • IFN- ⁇ cells of Th1 cells and IL-17 cytokines of Th17 cells were measured according to the manufacturer's procedure using an ELISA assay kit (Mouse DuoSet, R&D Systems).
  • FLS cells (cell passage: RA_FLS 2-92#P7) were dispensed into each well of a 48-well plate (SPL, Cat. 100 ⁇ l of sGal-9 at concentrations (2.5, 5, and 10 ⁇ g/ml) was added to each well. After 16 hours, the supernatant was collected and stored in a deep freezer.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • Osteoclasts were passaged 1 ml each at a cell density of 2.5 x 105 cells/ml in each well of a 12-well plate (Corning, Cat. No. 3513), and after 24 hours, various concentrations (0.1, 0.5, 1, 2, 4, and 10 ⁇ g/ml) of sGal-9 and 1 ml of PBS were added to each well as a control group.
  • the stained osteoclasts of the experimental group and the control group were stained with TRAP using a TRAP Staining Kit (K-ASSAY, Cat. No. KT-008) and counted using an optical microscope, and then three or more nuclei were observed.
  • the resulting multinuclear cells (TRAP(+) MNCs) were judged to have differentiated into osteoclasts.
  • osteoclast cells are placed in each well. Passage 1 ml each at a cell density of 2.5 x 105 cells/ml, and after 24 hours, each well with sGal-9 and PBS as a control group as an experimental group of various concentrations (0.1, 0.5, 1, 2, 4 and 10 ⁇ g/ml) 1 ml was added to each.
  • the experimental group (sGal-9), the control group (PBS), and the cell culture solution (MEM-alpha, gibco, Cat. No. 12561-056) were replaced daily until the differentiation was completed.
  • sGal-9 increased the Tim-3 protein binding ability in a concentration-dependent manner, inhibited Th1 and Th17 cell differentiation, and increased synovial cell death effect, and osteoclast differentiation. It was confirmed that bone diseases can be prevented or treated by increasing the inhibitory effect and bone resorption inhibitory effect.

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Abstract

본 발명은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 링커 펩티드의 아미노산이 결실되고 C-말단 도메인(CCRD)의 아미노산이 결실 및 치환된 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 류마티스 관절염 및 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 및 그 용도에 관한 것이며, 구체적으로 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
생체에는 β-갈락토시드 구조를 지닌 당쇄를 특이적으로 인식하는 동물 렉틴이 존재하고 있는 것이 발견되었고, 지금까지 적어도 14종의 유전자가 동정되어 있다. 갈렉틴은 그 구조로부터 프로토형(prototype), 키메라형(chimera) 및 탠덤 리피트형(tandem repeat)으로 분류되어 있다.
탠덤 리피트형 갈렉틴의 하나인 갈렉틴 9는 2개의 당쇄 인식 부위(당 인식 도메인, carbohydrate recognition domain: CRD)와 이들을 잇는 링크 펩티트 영역으로 이루어져 있고, 이 링크 펩티드 영역에 의해 N 말단 도메인(N-terminal Carbohydrate Recognition Domain; NCRD)과 C 말단 도메인(C-terminal Carbohydrate Recognition Domain; CCRD)이 연결된 것으로, 현재까지 다방면에 걸친 활성이 보고되고 있다. T 세포에 관해서 갈렉틴 9은 Tim-3에 결합하여 Tim-3 양성 Th1 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도하고, 과잉의 Th1 반응을 저해시킴으로써 자가 면역성의 염증을 억제한다. 또한, Tim-3가 발현시키는 자가 면역 질환, 알레르기 및 암 등 여러 가지 난치성 질환의 원인 또는 악화 인자의 하나인 Th17 세포를 감소시킨다.
한편, 갈렉틴 9는 경우에 따라 면역을 증진시킨다. 단구나 수상세포상의 Tim-3과 결합하여 상기 세포를 활성화하고 염증성 사이토카인 생성을 촉진한다. 또한, 대식세포에서 갈렉틴 9와 Tim-3의 상호작용으로 결핵균을 배제하는 면역이 증진된다.
더불어, 인간 세포나 조직으로부터 클로닝되는 갈렉틴 9 유전자 사이에서는 유전적 다형 현상의 존재를 시사하는 증거가 확인되고, 대장균을 숙주로 하여 생산된 재조합체 갈렉틴 9는 종양 세포에 대한 직접 작용(종양 세포의 세포간 접착과 아포토시스를 유도하는 활성과 면역계를 통한 작용에 의해서 암의 전이 억제 및 퇴축을 유도 효과 및 활성화 T 세포, 특히 과잉 면역 반응이 원인이 되는 CD4 양성 T 세포의 아포토시스를 유도하는 효과가 밝혀져 있다. 또한, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염 치료 효과, 아토피 및 천식치료효과 및 제1형 당뇨병 치료효과가 알려져있다.
갈렉틴 9을 실제 치료제로서 이용하기 위해 갈렉틴 9의 1) 단백질 분해효소 민감성; 2) 저용해성; 및 3) 적은 수득량이라는 문제를 해결하기 위해 갈렉틴 9의 링커 펩티드를 절단하여 단백질 분해 효소 저항성을 갈렉틴 9 개변체(G9Null; 비특허문헌 1)를 제조하는 등의 연구가 계속되고 있으며, KRAS 돌연변이 결장암종 항종양 활성(비특허문헌 2) 등의 효과가 알려져 있다.
한편, 뼈는 뼈의 흡수와 형성을 통해 지속적인 제거와 재건을 겪는 역동적인 조직이다. 이러한 과정은 두 가지 유형의 세포, 즉 파골세포(osteoclast) 및 조골세포(osteoblast) 각각에 의해 수행된다. 구체적으로, 조골세포는 뼈의 형성을 담당하고, 파골세포는 뼈의 제거를 담당한다. 정상적인 환경에서는 두 세포의 균형 잡힌 활동으로 뼈 항상성이 유지된다. 그러나 항상성은 이들 두 유형의 세포, 특히 파골세포의 비정상적인 과잉 활동으로 인해 중단될 수 있고, 그 결과 관절염(arthritis), 골다공증(osteoporosis), 인공관절 주위 골용해(periprosthetic osteolysis) 및 파제트병(Paget's disease)과 같은 골질환을 초래한다. 따라서 파골세포의 분화 및 기능에 대한 정확한 조절은 골질환의 예방 및 치료에서 중요하다.
예컨대, 골다공증을 치료하는 약물 요법으로는 골형성을 촉진하거나 골흡수를 억제하여 뼈의 양을 감소되는 것을 막거나 뼈의 양을 증가시키는 약물로 골흡수억제제로 칼슘 제제, 비타민 D 제제, 비스포스포네이트 제제(bisphosphonate), 에스트로겐 효능제/길항제, 에스트로겐 제제 및 골형성촉진제로 부갑상선호르몬 제제인 테리파라타이드 주사제가 있다.
또한, 관절염 중에서도 류마티스 관절염은 전형적인 만성 자가면역질환으로, 관절 주위를 둘러싸고 있는 활막조직의 염증으로 발생하는 질환이다. 활막이 존재하는 모든 관절에서 발생할 수 있고, 전신의 다양한 기관을 침범하는 질병으로 관절조직이 파괴되어 심한 관절 장애를 일으키고 조기 사망에 이르게 하는 만성 염증 질환이다. 일부 심한 환자의 경우, 드물지만 관절 이외의 조직, 예컨대 폐, 심장, 눈, 위장관, 피부 및 콩팥까지 침범될 수 있다. 더욱이, 일반적으로 체내 다량으로 분비되는 염증 매개 물질이 뼈 대사에 악영향을 주어 골다공증 및 골절 위험이 높아진다. 실제로 류마티스 관절염 환자에서 골다공증 발생율이 약 15 ~ 20%로 확인된다.
류마티스 관절염을 치료하는 약물 요법으로는 비스테로이드 소염제, 호르몬의 일종인 스테로이드 제제 같은 1차 약물 및 인체의 면역체계에 영향을 주어 류마티스 관절염 자체를 억제하는 2차 약물이 있으며, 대개 장기간 사용하기 때문에 부작용에 대한 주의가 필요하다. 특히 스테로이드 제제의 경우 사용했을 때 당장 좋은 효과를 느껴 남용하는 경우가 있지만 부작용 문제가 심각하다. 또한 장기 복용 시 골다공증의 위험 요인이 될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 류마티스 관절염을 포함한 관절염 및/또는 골다공증 치료제의 부작용을 최소화하면서 유효한 치료 효과를 가지는 새로운 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 기존의 야생형 갈렉틴 9의 2개의 당쇄 인식 부위 중 C 말단 도메인(CCRD) 및 링크 펩티드의 아미노산이 결실 및 치환된 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질이 Th1 및 Th17 분화를 억제하고, 섬유아세포-유사-활막세포(FLS; fibroblast-like synoviocyte)의 세포사멸을 유도하며, 파골세포의 분화를 억제하는 효과를 확인하였고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 및 이를 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 삽입된, 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환 치료방법; 골질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물; 및 골질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품; 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환 예방 또는 개선방법; 골질환 예방 또는 개선에 사용하기 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 건강기능식품; 및 골질환을 예방 또는 개선하는 건강기능식품의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
본 발명의 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 Th1 및 Th17 세포 분화 억제 효과, 활막세포(FLS, Fibroblast-like synoviocytes) 사멸 효과 및 파골세포(osteoclast) 분화억제 효과를 나타내므로, 류마티스 관절염을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질(sGal-9)의 Tim-3의 결합도를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 sGal-9의 Th1 및 Th17 세포분화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 sGal-9의 FLS(Fibroblast-like synoviocytes; 활막세포) 세포사멸 효과를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 sGal-9의 파골세포(osteoclast) 분화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 sGal-9의 뼈흡수(bone resorption) 억제 효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 제공한다.
본 발명에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 야생형 갈렉틴 9(wild type Galectin-9)의 당쇄 인식 활성을 유지하면서도 프로테아제에 대하여 보다 안정적인 분자 구조를 갖는다.
구체적으로, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 NCRD-링커-CCRD의 구조를 가지는 야생형 갈렉틴 9의 2개의 CRD(Carbohydrate Recognition Domain)를 잇는 링크 영역 및 CCRD(C-terminal Carbohydrate Recognition Domain; C 말단 도메인)를 개변하여 제조한 재조합 단백질이다. 보다 구체적으로 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 상기 링커 영역의 펩티드가 전부 결실되고, CCRD(서열번호 2)에서 1 내지 10 위치의 아미노산 서열(서열번호 3)이 결실 및 13 위치의 Ala(Alarine; A)가 Pro(Proline; P)로 치환된 것으로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩티드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 단백질은 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩티드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)"는 뉴클레오티드가 결합된 중합체로서, 유전 정보를 전달하는 역할을 한다. 본 발명의 목적상, 서열번호 1의 재조합 단백질을 코딩하며, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "상동성"은 야생형 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 삽입된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "벡터"는 유전자 또는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체로, 구체적으로 선형 DNA 플라스미드 DNA, 재조합 비바이러스성 벡터, 재조합 바이러스성 벡터 또는 유전자 발현 유도 벡터 시스템(inducible gene expression vector system)일 수 있으며, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스 벡터 또는 백시니아바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 상기 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 염기서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 염기서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에 도입했을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상을 의미한다. 상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 전술한 바와 같이 공지된 서열로부터 이를 특이적으로 인식할 수 있는 프라이머를 제작하고, 이를 이용하여 중합효소연쇄증폭반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 통해 상기 유전자를 증폭하고 이를 상술한 바와 같은 벡터에 도입한 후 세포에 도입할 수 있다. 도입 방법은 공지되어 있으며 예를 들면 리포좀 매개 전달이입, 칼슘포스페이트법, DEAE-덱스트란 매개 전달이입, 양전하 지질 매개 전달이입법, 전기천공, 파아지 시스템을 이용한 트랜스덕션 또는 바이러스를 이용한 감염 방법 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 다음 중 어느 하나 이상의 특성을 나타내어, 골질환 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다:
i) Tim-3 단백질 결합도 상승;
ii) Th1 및 Th17 세포 분화 억제;
iii) 도움 T세포(T helper cell) 억제;
iv) 섬유아세포-유사-활막세포(FLS, Fibroblast-like synoviocytes) 사멸; 및
v) 파골세포(osteoclast) 분화 및 뼈흡수 억제.
구체적으로, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 T세포에 발현되는 Tim-3 단백질과 결합하여 세포사멸 유도 기전을 통해 Th1 및 Th17와 같은 도움 T세포를 억제할 수 있다. 특히, 상기 활막세포는 염증성 사이토카인과 함께 류마티스 관절염의 중요한 병리 중 하나로, 병이 진행될수록 활막세포의 비정상적 증식과 활성화가 문제되어 관절의 염증 및 파괴가 지속적으로 발생할 수 있다.
또한, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 MMP(기질 금속 단백 분해 효소; matrix methalloproteinase)와 카텝신(cathepsin)을 분비하여 관절연골의 기질을 파괴하는 섬유아세포-유사-활막세포(Fibroblast-like synoviocytes)를 사멸할 수 있다.
또한, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 파골세포(osteoclast) 분화 및 뼈흡수를 억제할 수 있다. 특히, 상기 파골세포는 뼈의 성장에서 불필요하게 된 뼈조직을 파괴 및 흡수하는 다핵 세포로, 뼈의 신생 및 재생에 관여하는 조골세포와의 균형이 깨지는 경우 뼈손실이 발생하는 골다공증이 발생할 수 있다. 또한, 상기 뼈흡수(골흡수; bone resorption)는 뼈 파괴 세포의 활성에 의해 뼈가 흡수되는 현상으로, 일반적으로 알려진 골다공증약인 비스포스포네이트는 상기 뼈흡수를 억제하여 골다공증이 악화되는 것을 막는 역할을 한다.
본 발명에서, 상기 골질환은 관절염, 골다공증, 인공관절 주위 골용해(periprosthetic osteolysis), 임플란트의 피로잔해에 의한 골용해, 파제트병(Paget's disease), 골연화증, 구루병, 골감소증, 칼슘조절이상, 전이성 골암(metastatic bone cancer), 염증성 골소실, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골손실(secondary bone loss) 또는 치조골의 파괴가 동반되는 치주질환일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 관절염은 골관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대손상, 반월상 연골판 손상, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증 또는 소아 특발성 관절염일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질의 발현을 유도한 대장균(E. coli) 세포를 용해, 정화한 후 크로마토그래피법을 이용하여 재조합 단백질을 제조하였다. 또한, 상기 재조합 단백질이 Th1 및 Th17 세포 분화 억제 효과, 섬유아세포-유사-활막세포(FLS, Fibroblast-like synoviocytes) 사멸 효과 및 파골세포(osteoclast) 분화억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기 재조합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 골질환 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병용하여 사용될 수 있고, 상기 제제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 및 골질환에 대한 내용은 상기에서 설명한 바와 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때, 상기 건강기능식품 조성물은 골질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질이 Th1 및 Th17 세포 분화 억제 효과, 섬유아세포-유사-활막세포(FLS, Fibroblast-like synoviocytes) 사멸 효과 및 파골세포(osteoclast) 분화억제 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 재조합 단백질을 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품에서, 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 건강기능식품은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들면, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환 예방 또는 개선방법을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 Tim-3 단백질 결합도 상승 효과, Th1 및 Th17 세포 분화 억제 효과, 도움 T세포 억제 효과, 섬유아세포-유사-활막세포 사멸 효과, 파골세포 분화 억제 효과 및 뼈흡수 억제 효과를 나타내는 바, 골질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 골질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 골질환 예방 또는 개선에 사용하기 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 골질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 골질환을 예방 또는 개선하는 건강기능식품의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 제조예 및 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이지 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다.
<제조예 1> 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질의 제조
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하고, 상기 발현 벡터를 heat shock 방법에 의거하여 대장균(E. coli)에 도입하였다. 재조합 단백질의 발현은, 대장균을 50 ㎍/㎖ kanamycin 함유 LB 배지로 배양하고, 600 nm에서의 흡광도가 0.7에 달한 시점에서 아라비노즈를 첨가하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하여 행했다. 그 다음, 재조합 단백질의 발현을 유도한 세포를 용해 및 여과하고, 표적 단백질을 양이온 교환방법 및 affinity 칼럼 등을 사용해 포획하여, 순도가 높은 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 높은 수율로 수득하였다.
<실시예 1> 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질(Recombinant stable Galectin 9 protein, sGal-9)의 Tim-3 단백질 결합능 확인
농도가 0.5 ㎍/㎖인 재조합 인간 Tim-3(R&D systems, Cat. No. 10241-TI-050)를 96웰 ELISA 플레이트(Nunc, Cat. No. 44-2404-21)의 각 웰에 100 ㎕ 씩 넣고 상온에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 0.05%의 트윈 20(Sigma Cat. No. P9416)이 함유된 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline; Welgene, Cat. No. LB011-02)로 3회 세척하였다. 세척 후 1% 소혈정알부민(bovine serum albumin, BSA)이 함유된 DPBS를 각 웰에 200 ㎕ 씩 넣고 상온에서 1시간 동안 배양 후 세정완충액(wash buffer)으로 3회 세척하였다. 3회 세척 후 상기 <제조예 1>에서 획득한 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질(sGal-9)을 다양한 농도(0, 5, 10 및 20 ㎍/㎖)로 희석하여 각 웰에 100 ㎕ 씩 넣고 상온에서 2시간 동안 배양 후 세정완충액으로 3회 세척하였다.
실험군으로는 Gal-9 항체(R&D systems, Cat. No. 1015238)를 1% BSA/DPBS을 이용하여 1:1000로 희석 후 각 웰에 100 ㎕ 씩 넣고 상온에서 1시간 동안 배양 후 세정완충액으로 3회 세척하였다. 대조군으로는 항-마우스 HRP 항체(Invitrogen, Cat. No. 31430)를 1% BSA/DPBS을 이용하여 1:1000로 희석 후 각 웰에 100 ㎕ 씩 넣고 상온에서 1시간 동안 배양 후 세정완충액으로 3회 세척하였다.
세척한 각 웰에 기질시약(Substrate Reagent; R&D systems, Cat. No. DY999) A와 B를 1:1로 혼합한 용액을 100 ㎕ 씩 넣고 빛을 차단한 상온에서 20분 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰에 정지액(2 N H2SO4)을 50 ㎕ 씩 넣고 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm로 측정하여 광학밀도(Optical Density, O.D)값을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, sGal-9의 농도가 상승할수록 광학밀도가 증가하는 것을 확인하여, 농도의존적으로 sGal-9와 Tim-3의 결합도가 우수함을 확인하였다(도 1).
<실시예 2> sGal-9의 도움 T 세포(T helper cell) 분화 억제 효과 확인
PBS(Welgene, Cat. No. LB 001-02)로 희석한 농도가 2 ㎍/㎖인 항-CD3(eBioscience, Cat. No. 16-0031-82)를 96웰 플레이트에 100 ㎕ 씩 또는 24웰 플레이트에 500 ㎕ 씩 분주하고 4 ℃에서 하룻밤 동안 반응한 후, PBS로 1회 세척하여 세포배양에 이용하였다. CD4, CD62L 및 T 세포로 코팅된 96웰 플레이트 또는 24웰 플레이트에 분주하고 37℃ 및 5% CO2 조건에서 4일 동안 배양 후, Th1 세포로 분화를 유도하기 위해서 항 IL-4, 항 IL-2 및 항 IL-12 사이토카인을 첨가하고 Th17 세포로 분화를 유도하기 위해서 항 IFN-γ, 항 IL-4, 항 IL-2 및 항 IL-6 사이토카인을 첨가하였다. 사이토카인 첨가 후 농도가 1 ㎍/㎖인 sGal-9을 첨가하고 37℃ 및 5% CO2 조건에서 4일 동안 배양하였다.
배양 후 Th1 세포의 IFN-γ 세포 및 Th17세포의 IL-17 사이토카인을 ELISA 분석 키트(Mouse DuoSet, R&D Systems)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, sGal-9의 농도가 상승할수록 도움 T 세포인 Th1 및 Th17 세포 분화가 억제되는 것을 확인하여, sGal-9의 도움 T 세포 분화 억제 효과가 우수함을 확인하였다(도 2).
<실시예 3> sGal-9의 섬유아세포-유사-활막세포(FLS, Fibroblast-like synoviocytes) 사멸 효과 확인
FLS 세포(cell passage : RA_FLS 2-92#P7)를 48웰 플레이트(SPL, Cat. No. 30048)의 각 웰에 5 x 104 cells/㎖의 세포밀도로 200 ㎕ 씩 분주하고, 24시간 후 다양한 농도(2.5, 5 및 10 ㎍/㎖)의 sGal-9를 각 웰에 100 ㎕ 씩 넣어주었다. 16시간 후 상층액을 모아 초저온 냉동고(deep freezer)에 보관하였다.
형광-활성화 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)하기 위한 세포는 15 ㎖의 튜브에 담아 세척하고 200 ㎕의 FACS 버퍼를 넣은 후, 4℃에 1시간 동안 보관하고 Annexin V-FITC/7-AAD(Biolegend, Cat. No. 640922)로 염색을 수행하였다. 염색된 세포는 FACS용 튜브에 70 μm의 셀 스트레이너(BD Falcon, Cat. No. 352350)로 걸러주었다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, sGal-9의 농도가 상승할수록 섬유아세포-유사-활막세포 사멸 효과가 증가하는 것을 확인하여, sGal-9의 활막세포 사멸 효과가 우수함을 확인하였다(도 3).
<실시예 4> sGal-9의 파골세포(osteoclast) 분화 억제 효과 확인
파골세포(osteoclast)를 12웰 플레이트(Corning, Cat. No. 3513)의 각 웰에 2.5 x 105 cells/㎖의 세포밀도로 1 ㎖ 씩 계대하고, 24시간 후 다양한 농도(0.1, 0.5, 1, 2, 4 및 10 ㎍/㎖)의 실험군으로 sGal-9 및 대조군으로 PBS를 각 웰에 1 ㎖ 씩 넣어주었다.
분화 완료 후, 실험군 및 대조군의 염색된 파골세포를 TRAP Staining Kit(K-ASSAY, Cat. No. KT-008)를 이용하여 TRAP 염색하고 광학현미경을 이용하여 계수한 후, 3개 이상의 핵이 관찰된 다핵세포(TRAP(+) MNCs)를 파골세포로 분화한 것으로 판단하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, sGal-9의 농도가 상승할수록 염색된 파골세포의 수가 감소하는 것을 확인하여, sGal-9의 파골세포 분화 억제 효과가 우수함을 확인하였다(도 4).
<실시예 5> sGal-9의 뼈흡수(bone resorption)의 억제 효과 확인
파골세포(osteoclast)를 생체 내에서(in vivo) 뼈 구조를 닮은 무기질 3차원 결정질(inorganic 3-dimensional crystalline)이 코팅된 Osteo Assay Surface 멀티 웰 플레이트(Corning, Cat. No. 3987)의 각 웰에 2.5 x 105 cells/㎖의 세포밀도로 1 ㎖ 씩 계대하고, 24시간 후 다양한 농도(0.1, 0.5, 1, 2, 4 및 10 ㎍/㎖)의 실험군으로 sGal-9 및 대조군으로 PBS를 각 웰에 1 ㎖ 씩 넣어주었다. 분화가 종료될 때까지 실험군(sGal-9), 대조군(PBS) 및 세포배양액(MEM-alpha, gibco, Cat. No. 12561-056)을 매일 교체하였다.
분화 완료 후, 20% SDS(Bleaching solution)로 세포를 제거하고 현미경으로 Osteo Assay Surface 멀티 웰 플레이트를 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, sGal-9의 뼈흡수 억제 효과가 우수함을 확인하였다(도 5).
결론적으로, 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 5>의 결과를 통해 sGal-9이 농도 의존적으로 Tim-3 단백질 결합능 상승, Th1 및 Th17 세포 분화 억제 효과 및 활막세포 사멸 효과 상승, 파골세포 분화 억제 효과 및 뼈흡수 억제 효과 상승를 통해 골질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

Claims (18)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 야생형 갈렉틴 9의 당쇄 인식 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는, 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질.
  3. 제 1항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
  4. 제 3항의 재조합 벡터가 삽입된, 형질전환체.
  5. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질은 다음 중 어느 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    i) Tim-3 단백질 결합도 상승;
    ii) Th1 및 Th17 세포 분화 억제;
    iii) 도움 T세포(T helper cell) 억제;
    iv) 섬유아세포-유사-활막세포(FLS, Fibroblast-like synoviocytes) 사멸; 및
    v) 파골세포(osteoclast) 분화 및 뼈흡수 억제.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 골질환은 관절염, 골다공증, 인공관절 주위 골용해(periprosthetic osteolysis), 임플란트의 피로잔해에 의한 골용해, 파제트병(Paget's disease), 골연화증, 구루병, 골감소증, 칼슘조절이상, 전이성 골암(metastatic bone cancer), 염증성 골소실, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골손실(secondary bone loss) 및 치조골의 파괴가 동반되는 치주질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대손상, 반월상 연골판 손상, 관절의 부정정렬, 무혈성 괴사증, 및 소아 특발성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 골질환은 류마티스 관절염 또는 골다공증인 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용, 근육내 투여용, 정맥내 투여용, 복강내 투여용, 피하 투여용, 피내 투여용, 또는 국소 투여용으로 제제화되는 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 유효성분으로 포함하는, 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환 치료방법.
  14. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환 예방 또는 개선방법.
  15. 골질환 예방 또는 치료에 사용하기 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물.
  16. 골질환 예방 또는 개선에 사용하기 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 건강기능식품.
  17. 골질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도.
  18. 골질환을 예방 또는 개선하는 건강기능식품의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 용도.
PCT/KR2020/015782 2019-11-11 2020-11-11 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 류마티스 관절염 및 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2021096217A1 (ko)

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