KR20160084846A

KR20160084846A - 중합체 입자

Info

Publication number: KR20160084846A
Application number: KR1020167014806A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 플롯킨; 그레고리 엠 크루즈; 에드워드 마이클 킬리; 레니 유; 클레이톤 해리스
Original assignee: 테루모 가부시키가이샤
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2016-07-14
Also published as: US20180298133A1; AU2014346486A1; US20220144990A1; US20150166696A1; CA2929235C; KR102287781B1; JP2016538383A; CN105916495B; BR112016010067A2; WO2015070094A1; US20200131287A1; BR112016010067B1; JP6907283B2; US11261274B2; JP6599323B2; JP2020079386A; US10519264B2; EP3065719A4; CN105916495A; AU2014346486B2

Abstract

중합체 색전물질 입자 및 이의 제조 방법이 기재되어 있다. 색전물질 입자는 색전술 제제로서 사용될 수 있다.

Description

중합체 입자{POLYMER PARTICLES}

관련 출원에 대한 교차참조

본 출원은 2013년 11월 8일에 출원된 미국 가특허출원 제61/902,020호의 이익을 주장하고, 이의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

혈관 부위 및 신체 내의 공동(cavity)의 폐색, 예컨대 과다혈관 종양 또는 동정맥 기형의 색전술용 중합체 입자가 기재되어 있다.

요약

일반적으로 폴리에테르 및 경우에 따라 하나 이상의 단량체를 포함하는 입자가 본원에 기재되어 있다. 이들 폴리머는 색전술을 위해/색전술에 사용될 수 있다. 중합체 입자는 전달의 용이성을 위해 압축성이다. 또한, 일부 구현예에서, 중합체 입자는 생리적 조건에서/생리적 조건 하에서 안정성이다. 일부 구현예에서, 입자는 약물(들) 또는 활성제(들)이 봉입되거나 이로 코팅될 수 있다.

기재된 바와 같은 중합체 입자는 하기를 포함할 수 있다: 2개 이상의 작용기를 포함하는 하나 이상의 폴리에테르 및 경우에 따라 하나 이상의 단량체. 본원에 기재된 바와 같은 입자는 특정 용도에 따라 가변적인 크기를 가질 수 있으나, 일반적으로 약 1,200 ㎛ 미만의 직경을 가질 수 있다.

또한, 다른 구현예에서, 하기를 포함하는 중합체 입자가 기재되어 있다: 약 15% w/w 내지 약 50% w/w 사이의 농도의 하나 이상의 유도체화된 폴리(에틸렌 글리콜) 매크로머, 폴리(프로필렌 글리콜) 매크로머, 폴리(테트라메틸렌 옥사이드) 매크로머, 또는 이들의 조합; 및 n-이소프로필 아크릴아미드 이외의 하나 이상의 단량체.

중합체 입자는 약 40 μm 내지 약 1,200 μm의 평균 직경을 가질 수 있다.

중합체 입자는 하나 이상의 단량체를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 단량체는 작용기를 포함할 수 있다. 작용기는 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 또는 메타크릴아미드일 수 있다. 또한, 하나 이상의 단량체는 글리세롤 모노메타크릴레이트, 아미노 에틸 메타크릴레이트, 3-설포프로필 아크릴레이트, 아미노 프로필 메타크릴레이트, 또는 이들의 조합일 수 있다.

일 구현예에서, 하나 이상의 단량체는 약 68% w/w의 농도의 글리세롤 모노메타크릴레이트이다. 또 하나의 구현예에서, 하나 이상의 단량체는 약 59% w/w의 농도의 3-설포프로필 아크릴레이트이다. 또 하나의 구현예에서, 하나 이상의 단량체는 약 1% w/w의 농도의 아미노 프로필 메타크릴레이트이다. 또 하나의 구현예에서, 하나 이상의 단량체는 약 3% w/w의 농도의 아미노 에틸 메타크릴레이트이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 유도체화된 폴리(에틸렌 글리콜) 매크로머는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴아미드, 또는 이들의 조합일 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 중합체 입자의 제조 방법이 또한 개시되어 있다. 이들 방법은 하기를 포함할 수 있다: 오일 중에서 하나 이상의 유도체화된 폴리에테르 매크로머 및 개시제를 포함하는 수계 예비중합체 용액을 반응시켜 중합체 입자를 형성하는 단계; 여기서 상기 중합체 입자는 약 1,200 μm 미만의 직경을 가진다.

본 방법의 일부 구현예에서, 오일은 미네랄 오일이다. 본 방법의 다른 구현예에서, 개시제는 암모늄 퍼설페이트, 테트라메틸에틸렌 디아민, 또는 이들의 조합이다.

본원에 기재된 방법 및 입자의 구현예에서, 조성물 및 입자는 n-이소프로필 아크릴아미드를 포함하지 않는다.

도 1은 독소루비신 또는 이리노테칸으로 충전된 입자의 평균 약물 봉입량의 도표를 예시한다.
도 2는 22 시간 이후 원위치에서의 입자로부터의 평균 약물 용출의 도표를 예시한다.
도 3은 30% 변형율에서의 입자 압축성의 도표를 예시한다.
도 4는 30% 변형율에서의 입자 압축성의 또 하나의 도표를 예시한다.
도 5는 현탁액 중에서의 입자 시간의 도표를 예시한다.
도 6은 현탁액 중에서의 약물 봉입 입자 시간의 도표를 예시한다.

상세한 설명

일반적으로 하나 이상의 폴리에테르 매크로머, 경우에 따라 하나 이상의 단량체, 경우에 따라 하나 이상의 다작용성 가교결합제, 및 경우에 따라 하나 이상의 개시제의 반응 생성물을 포함하는 중합체 물질로 제조된 입자가 본원에 기재되어 있다. 입자는 본원에서 극미립자, 미세구체, 마이크로비드, 구형체, 미세색전물질, 색전물질 등으로서 지칭될 수 있다. 입자는 약 1,200 μm 미만의 직경을 가질 수 있다. 입자는 또한 전달의 편이성을 위해 압축성, 생체안정성, 및/또는 내구성인 것일 수 있다.

입자는 하기를 포함하는 예비중합체 용액 또는 혼합물로부터 형성될 수 있다: (i) 중합이 가능한 2개 이상의 작용기를 함유하는 하나 이상의 폴리에테르 매크로머, (ii) 경우에 따라 하나 이상의 단량체, 및 (iii) 경우에 따라 하나 이상의 다작용성 가교결합제. 일부 구현예에서, 중합 개시제가 이용될 수 있다.

일 구현예에서, 매크로머는 중합이 가능하고 또는 중합에 적합한 복수개의 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 매크로머는 선형일 수 있다. 디른 구현예에서, 매크로머는 하나 이상의 분지를 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 매크로머는 에틸렌 불포화성 매크로머일 수 있다. 매크로머는 폴리에테르를 포함할 수 있다. 폴리에테르 매크로머는 선형 또는 분지형 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(테트라메틸렌 옥사이드), 그것의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 매크로머는 약 200 그램/몰, 400 그램/몰, 600 그램/몰, 800 그램/몰, 1,000 그램/몰, 2,000 그램/몰, 3,000 그램/몰, 4,000 그램/몰, 5,000 그램/몰, 10,000 그램/몰, 15,000 그램/몰, 20,000 그램/몰, 25,000 그램/몰, 30,000 그램/몰, 35,000 그램/몰, 약 200 그램/몰 내지 약 35,000 그램/몰, 약 200 그램/몰 내지 약 30,000 그램/몰, 약 1,000 그램/몰 내지 약 15,000 그램/몰, 약 200 그램/몰 이상, 약 30,000 g/몰 이하, 또는 약 35,000 그램/몰 이하의 분자량을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 매크로머는 약 10,000 g/몰의 분자량을 가질 수 있다.

이들 폴리에테르의 유도체는 중합이 가능하도록 제조될 수 있다. 임의의 유형의 화학물질, 예를 들면 친핵체/N-하이드록시석신이미드 에스테르, 친핵체/할라이드, 비닐 설폰/아크릴레이트 또는 말레이미드/아크릴레이트가 이용되는 경우, 바람직한 화학은 자유 라디칼 중합이다. 이와 같이, 복수개의 에틸렌 불포화 기, 예컨대 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 메타크릴아미드, 및 비닐을 가진 폴리에테르가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리에테르 매크로머는 약 10,000 g/몰의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드일 수 있다.

또 하나의 구현예에서, 매크로머는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴아미드, 그것의 유도체, 또는 이들의 조합이다.

매크로머는 약 0% w/w, 약 1% w/w, 약 2% w/w, 약 3% w/w, 약 4% w/w, 약 5% w/w, 약 6% w/w, 약 7% w/w, 약 8% w/w, 약 9% w/w, 약 10% w/w, 약 11% w/w, 약 12% w/w, 약 13% w/w, 약 14% w/w, 약 15% w/w, 약 16% w/w, 약 17% w/w, 약 18% w/w, 약 19% w/w, 약 20% w/w, 약 35% w/w, 약 30% w/w, 약 35% w/w, 약 40% w/w, 약 45% w/w, 약 50% w/w, 약 60% w/w, 약 70% w/w, 약 5% w/w 내지 약 10% w/w, 약 5% w/w 내지 약 20% w/w, 약 5% w/w 내지 약 25% w/w, 약 5% w/w 내지 약 15% w/w, 약 6% w/w 내지 약 8% w/w, 또는 약 14% w/w 내지 약 16% w/w의 용액에서의 농도로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 매크로머가 사용될 필요가 없다.

일 구현예에서, 매크로머는 용액에 약 7% w/w의 농도로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 매크로머는 용액에 약 15% w/w의 농도로 포함될 수 있다.

일부 구현예에서, 단량체(들) 및/또는 매크로머(들) 중 하나가 고체인 경우, 색전물질로서 사용하기 위한 입자를 제조할 수 있는 용액을 형성하기 위해 용매가 사용될 수 있다. 액체 단량체 및 매크로머가 이용되는 경우, 용매는 필요하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 단량체 및/또는 매크로머가 사용되는 경우, 용매가 또한 사용될 수 있다. 용매는 폴리에테르 매크로머, 단량체, 다작용성 가교결합제, 및/또는 개시제를 용해시킬 수 있는 또는 실질적으로 용해시킬 수 있는 임의의 액체를 포함할 수 있다. 원하는 단량체(들), 매크로머(들), 다작용성 가교결합제(들) 및/또는 중합 개시제를 용해시키는 임의의 수성 또는 유기 용매를 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 용매는 물일 수 있다. 추가적으로, 용질, 예를 들면, 염화나트륨은 중합 속도를 증가시키기 위해 용매에 부가될 수 있다. 용매 농도는 색전물질 입자의 압축성을 변경하기 위해 사용될 수 있고, 이는 입자의 직경보다 더 작은 내부 직경의 카테터를 통해 전달될 수 있게 한다.

용매 농도는 용액의 약 25% w/w, 약 35% w/w, 약 45% w/w, 약 55% w/w, 약 65% w/w, 약 75% w/w, 약 85% w/w, 약 95% w/w, 약 40% w/w 내지 약 80% w/w, 약 30% w/w 내지 약 90% w/w, 또는 약 50% w/w 내지 약 70% w/w일 수 있다. 일 구현예에서, 용매 농도는 약 50% w/w, 약 51% w/w, 약 52% w/w, 약 53% w/w, 약 54% w/w, 약 55% w/w, 약 56% w/w, 약 57% w/w, 약 58% w/w, 약 59% w/w, 또는 약 60% w/w일 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 용매 농도는 약 65% w/w, 약 66% w/w, 약 67% w/w, 약 68% w/w, 약 69% w/w, 약 70% w/w, 약 71% w/w, 약 72% w/w, 약 73% w/w, 약 74% w/w, 또는 약 75% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 용매 농도는 약 57% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 용매 농도는 약 70% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 용매 농도는 약 75% w/w일 수 있다.

일반적으로, 단량체는 모이어티 예컨대 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 메타크릴아미드 또는 중합이 가능한 다른 모이어티를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 중합체 입자는 하나 이상의 단량체와 조합되는 하나 이상의 매크로머로 구성된다.

경우에 따라, 하나 이상의 단량체는 폴리에테르 매크로머에 부가되어 중합체 입자에 바람직한 화학적 및/또는 기계적 특성을 부여할 수 있다. 양으로 하전된 약물 또는 다른 물질의 결합이 바람직한 경우, 음으로 하전된 모이어티를 갖는 단량체, 예를 들면 카복실산이 입자로 중합될 수 있다. 산성 불포화 단량체는 비제한적으로, 아크릴산, 메타크릴산, 3-설포프로필 아크릴레이트, 3-설포프로필 메타크릴레이트, 그것의 유도체, 이들의 조합, 및 그것의 염을 포함할 수 있다. 음으로 하전된 약물의 결합이 바람직한 경우, 양으로 하전된 모이어티를 갖는 단량체, 예를 들면 아민이 입자로 중합될 수 있다. 염기성 단량체는 아미노 에틸 메타크릴레이트, 2-아미노 에틸 메타크릴레이트, 아미노 프로필 메타크릴아미드, 그것의 유도체, 이들의 조합, 및 그것의 염을 포함할 수 있다.

양성 또는 음성 모이어티를 포함하는 단량체는 약 0.5% w/w, 약 1% w/w, 약 2% w/w, 약 3% w/w, 약 4% w/w, 약 5% w/w, 약 6% w/w, 약 7% w/w, 약 8% w/w, 약 9% w/w, 약 10% w/w, 약 15% w/w, 약 20% w/w, 약 21% w/w, 약 22% w/w, 약 23% w/w, 약 24% w/w, 약 25% w/w, 약 26% w/w, 약 27% w/w, 약 28% w/w, 약 29% w/w, 약 30% w/w, 약 40% w/w, 약 50% w/w, 약 55% w/w, 약 60% w/w, 약 65% w/w, 약 70% w/w, 약 80% w/w, 약 1% w/w 내지 약 10% w/w, 약 1% w/w 내지 약 5% w/w, 약 15% w/w 내지 약 35% w/w, 또는 약 20% w/w 내지 약 30% w/w의 농도로 용액에 존재할 수 있다.

일 구현예에서, 하전된 모이어티를 포함하는 단량체(들)은 용액에 약 14% w/w의 농도로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 하전된 모이어티를 포함하는 단량체(들)은 용액에 약 24% w/w의 농도로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 2-아미노 에틸 메타크릴레이트는 용액에서 약 0.7% w/w의 농도로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 아미노 프로필 메타크릴아미드는 용액에서 약 0.5% w/w의 농도로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 단량체는 n-이소프로필 아크릴아미드 이외의 것이다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 중합체 입자는 n-이소프로필 아크릴아미드를 포함하지 않는다.

원하는 경우, 미하전된 반응성 모이어티는 입자로 도입될 수 있다. 예를 들면, 하이드록실기는 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 글리세롤 모노메타크릴레이트, 글리세롤 모노아크릴레이트, 소르비톨 모노메타크릴레이트, 소르비톨 모노아크릴레이트, 중합가능한 소르비톨 유사 탄수화물, 그것의 유도체, 또는 이들의 조합의 부가로 입자에 도입될 수 있다. 대안적으로, 미하전된 상대적으로 미반응성인 모이어티가 입자에 도입될 수 있다. 예를 들면, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 메틸 메타크릴레이트, 그것의 유도체, 또는 이들의 조합은 폴리에테르 매크로머에 부가될 수 있다. 일부 구현예에서, 단량체(들)은 임상 사용을 위한 입자의 제조에 사용되는 방사선불투과성 조영제 용액에서 입자가 현탁된 채로 유지되게 할 수 있도록 중합체 입자 중의 하이드록실기의 수를 변화시키기 위해 선택될 수 있다.

만약 포함되는 경우, 이러한 미하전된 모이어티는 최종 입자에 (용매, 개시제, 및 염을 포함하지 않음) 약 0% w/w, 약 10% w/w, 약 20% w/w, 약 30% w/w, 약 40% w/w, 약 50% w/w, 약 60% w/w, 약 61% w/w, 약 62% w/w, 약 63% w/w, 약 64% w/w, 약 65% w/w, 약 66% w/w, 약 67% w/w, 약 68% w/w, 약 69% w/w, 약 70% w/w, 약 71% w/w, 약 72% w/w, 약 73% w/w, 약 74% w/w, 약 75% w/w, 약 80% w/w, 약 90% w/w, 약 50% w/w 내지 약 90% w/w, 약 60% w/w 내지 약 70% w/w, 약 65% w/w 내지 약 70% w/w, 또는 약 67% w/w 내지 약 69% w/w로 존재할 수 있다.

일 구현예에서, 미하전된 모이어티는 최종 입자의 약 68% w/w로 존재할 수 있다.

일 구현예에서, 미하전된 모이어티는 글리세롤 모노메타크릴레이트일 수 있다.

중합될 수 있는 1개 초과의 모이어티를 함유하는 다작용성 가교결합제를 부가하는 것은 분자 구조에 가교결합을 부가함으로써 더욱 점착성인 하이드로겔 중합체를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체 입자는 하나 이상의 다작용성 가교결합제 예컨대, 비제한적으로, 글리세롤 디메타크릴레이트, 글리세롤 디아크릴레이트, 소르비톨 디메타크릴레이트, 소르비톨 아크릴레이트, 소르비톨에 유사한 유도체화된 탄수화물, 그것의 유도체, 또는 이들의 조합과 조합되는 매크로머로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 다작용성 가교결합제는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드이다.

사용되는 경우, 가교결합제는 사용되는 용액에 존재하여 약 0.1% w/w, 약 0.25% w/w, 약 0.5% w/w, 약 0.75% w/w, 약 1.0% w/w, 약 1.25% w/w, 약 1.5% w/w, 약 1.75% w/w, 약 2% w/w, 약 3% w/w, 약 4% w/w, 약 5% w/w, 약 6% w/w, 약 7% w/w, 약 10% w/w, 약 20% w/w, 약 25% w/w, 약 30% w/w, 약 0% w/w 내지 약 10% w/w, 약 0% w/w 내지 약 2% w/w, 약 0.5% w/w 내지 약 1.5% w/w, 약 0.25% w/w 내지 약 1.75% w/w, 또는 약 0.1% w/w 내지 약 2% w/w의 농도에서 입자를 형성할 수 있다.

일 구현예에서, 가교결합제는 사용되지 않는다.

일 구현예에서, 가교결합제는 약 1% w/w로 존재할 수 있다.

일 구현예에서, 가교결합제는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드일 수 있다.

임의의 양의 매크로머(들), 단량체(들), 및 다작용성 가교결합제(들)이 원하는 입자에 대해 허용되는, 입자를 형성하기 위해 사용되는 용액에서 사용될 수 있다. 용액에서의 반응성 화합물 또는 고형물의 총 농도는 약 5% w/w, 약 10% w/w, 약 11% w/w, 약 12% w/w, 약 13% w/w, 약 14% w/w, 약 15% w/w, 약 16% w/w, 약 17% w/w, 약 18% w/w, 약 19% w/w, 약 20% w/w, 약 21% w/w, 약 22% w/w, 약 23% w/w, 약 24% w/w, 약 25% w/w, 약 30% w/w, 약 31% w/w, 약 32% w/w, 약 33% w/w, 약 34% w/w, 약 35% w/w, 약 36% w/w, 약 37% w/w, 약 38% w/w, 약 39% w/w, 40% w/w, 약 50% w/w, 약 60% w/w, 약 70% w/w, 약 10% 내지 60%, 약 15% w/w 내지 약 50% w/w, 또는 약 20% w/w 내지 약 40% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 용액에서의 반응성 화합물의 총 농도는 약 20% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 용액에서의 반응성 화합물의 총 농도는 약 41% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 중합체 입자는 중합에 적합한 2개 이상의 작용기를 갖는 매크로머 및/또는 단일 작용기를 갖는 단량체로부터 제조될 수 있다. 작용기는 자유 라디칼 중합에 적합한 것들, 예컨대 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 및 메타크릴아미드를 포함할 수 있다. 다른 중합 도식은 비제한적으로 친핵체/N-하이드록시석신이미드 에스테르, 친핵체/할라이드, 비닐 설폰/아크릴레이트 또는 말레이미드/아크릴레이트를 포함할 수 있다. 단량체의 선택은 수득되는 입자의 원하는 화학적 및 기계적 특성에 좌우된다.

최종 건조시킨 입자 생성물에서의 매크로머의 농도는 약 10% w/w, 약 20% w/w, 약 21% w/w, 약 22% w/w, 약 23% w/w, 약 24% w/w, 약 25% w/w, 약 26% w/w, 약 27% w/w, 약 28% w/w, 약 29% w/w, 약 30% w/w, 약 35% w/w, 약 36% w/w, 약 37% w/w, 약 38% w/w, 약 39% w/w, 약 40% w/w, 약 41% w/w, 약 42% w/w, 약 43% w/w, 약 44% w/w, 약 45% w/w, 약 50% w/w, 약 60% w/w, 약 70% w/w, 약 80% w/w, 약 15% w/w 내지 약 60% w/w, 약 20% w/w 내지 약 50% w/w, 약 25% w/w 내지 약 45% w/w, 약 25% w/w 내지 약 40% w/w, 약 35% w/w 내지 약 45% w/w, 약 37% w/w 내지 약 43% w/w, 약 39% w/w 내지 약 41% w/w, 약 25% w/w 내지 약 35% w/w, 약 26% w/w 내지 약 30% w/w, 또는 약 27% w/w 내지 약 29% w/w의 농도일 수 있다.

일 구현예에서, 최종 건조시킨 입자 생성물에서의 매크로머(들)의 농도는 약 40% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 최종 건조시킨 입자 생성물에서의 매크로머(들)의 농도는 약 27% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드는 약 40% w/w로 최종 건조시킨 입자 생성물에 존재한다.

일 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드는 약 27% w/w로 최종 건조시킨 입자 생성물에 존재한다.

최종 건조시킨 입자 생성물에서의 가교결합제의 농도는 약 0.1% w/w, 약 0.25% w/w, 약 0.5% w/w, 약 0.75% w/w, 약 1% w/w, 약 1.25% w/w, 약 1.5% w/w, 약 1.75% w/w, 약 2% w/w, 약 3% w/w, 약 4% w/w, 약 5% w/w, 약 6% w/w, 약 7% w/w, 약 8% w/w, 약 9% w/w, 약 10% w/w, 약 15% w/w, 약 20% w/w, 약 25% w/w, 약 30% w/w, 약 0% w/w 내지 약 5% w/w, 약 0% w/w 내지 약 2% w/w, 약 0.5% w/w 내지 약 1.5% w/w, 약 0.25% w/w 내지 약 1.75% w/w, 또는 약 0.1% w/w 내지 약 2% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 가교결합제는 약 1% w/w로 최종 건조시킨 입자 생성물에 존재한다.

일 구현예에서, 가교결합제는 최종 건조시킨 입자 생성물에 존재하지 않는다.

최종 건조시킨 생성물에서의 하나 이상의 단량체의 농도는 약 10% w/w, 약 15% w/w, 약 20% w/w, 약 25% w/w, 약 30% w/w, 약 40% w/w, 약 50% w/w, 약 55% w/w, 약 60% w/w, 약 61% w/w, 약 62% w/w, 약 63% w/w, 약 64% w/w, 약 65% w/w, 약 66% w/w, 약 67% w/w, 약 68% w/w, 약 69% w/w, 약 70% w/w, 약 71% w/w, 약 72% w/w, 약 73% w/w, 약 74% w/w, 약 75% w/w, 약 80% w/w, 약 50% w/w 내지 80% w/w, 약 60% w/w 내지 70% w/w, 약 50% w/w 내지 80% w/w, 약 50% w/w 내지 75% w/w, 약 55% w/w 내지 약 65% w/w, 약 57% w/w 내지 63% w/w, 약 59% w/w 내지 61% w/w, 약 63% w/w 내지 73% w/w, 약 65% w/w 내지 71% w/w, 또는 약 67% w/w 및 69% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 최종 건조시킨 생성물에서의 하나 이상의 단량체의 농도는 약 72% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 최종 건조시킨 생성물에서의 하나 이상의 단량체의 농도는 약 60% w/w일 수 있다.

일 구현예에서, 하나 이상의 단량체는 글리세롤 모노메타크릴레이트 및 2-아미노 에틸 메타크릴레이트일 수 있다.

일 구현예에서, 글리세롤 모노메타크릴레이트는 최종 건조시킨 생성물의 약 68% w/w의 농도로 존재할 수 있고, 2-아미노 에틸 메타크릴레이트는 최종 건조시킨 생성물의 약 3% w/w의 농도로 존재할 수 있다.

일 구현예에서, 하나 이상의 단량체는 3-설포프로필 아크릴레이트 및 아미노 프로필 메타크릴아미드일 수 있다.

일 구현예에서, 3-설포프로필 아크릴레이트는 최종 건조시킨 생성물의 약 59% w/w의 농도로 존재할 수 있고, 아미노 프로필 메타크릴레이트는 최종 건조시킨 생성물의 약 1% w/w의 농도로 존재할 수 있다.

당업자는 이미 논의된 용매의 양에 기초하여 최종 농도를 계산하는 방법을 이해할 수 있다.

자유 라디칼 중합을 사용한 매크로머 및 임의의 하나 이상의 단량체의 중합은 반응을 개시하기 위한 하나 이상의 개시제를 요구할 수 있다. 중합 용액은 환원-산화, 방사선, 열, 또는 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 중합될 수 있다. 예비중합체 용액의 방사선 중합은 개시제를 사용하지 않고 이온화 방사선(예를 들면, 전자빔 또는 감마선)으로 또는 적합한 개시제를 사용하여 자외선 또는 가시광선으로 달성될 수 있다. 중합은 열 공급원 예컨대 가열 웰(heating well)을 사용하여 용액을 종래와 같이 가열함으로써, 또는 적외선을 예비중합체 용액에 조사함으로써 열의 조사에 의해 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 중합 방법은 아조비스이소부티로니트릴(AIBN) 또는 다른 수용성 AIBN 유도체 예컨대 (2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)디하이드로클로라이드)를 이용한다. 본 설명에 따라 유용한 다른 개시제는 아조비스이소부티로니트릴을 비롯하여 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민, 암모늄 퍼설페이트, 벤조일 퍼옥사이드, 및 이들의 조합을 포함한다.

또 하나의 구현예에서, 개시제는 각각 약 0.25% w/w 및 약 2% w/w의 농도로의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 및 암모늄 퍼설페이트의 조합일 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 개시제는 약 1.5% 암모늄 퍼설페이트 및 약 0.3% N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민의 조합을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 개시제는 약 1.8% 암모늄 퍼설페이트 및 약 0.2% N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민의 조합을 포함한다.

중합 용액은 용매에서 반응물 예컨대 단량체(들), 매크로머(들), 다작용성 가교결합제(들), 및 경우에 따라 개시제(들)의 조합을 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 색전물질 입자는 에멀젼 중합에 의해 제조될 수 있다. 단량체 용매가 물인 경우, 단량체 용액에 대한 비-용매, 전형적으로 미네랄 오일은 임의의 포집된 산소를 제거하기 위해 초음파처리된다. 미네랄 오일은 반응 용기에 부가된다. 오버헤드 교반기가 반응 용기 내에 배치된다. 반응 용기는 이후 밀봉되고, 진공 하에서 탈기되고, 비활성 가스 예컨대 아르곤이 살포된다. 개시제 성분 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민이 반응 용기에 부가되어 교반이 시작된다. 암모늄 퍼설페이트가 중합 용액에 부가되고, 이 둘은 이후 반응 용기에 부가되고, 이에서 교반은 미네랄 오일에서 중합 용액의 액적을 현탁시킨다. 계면활성제가 중합 용액의 부가 이전, 이후, 또는 그 과정에서 부가되어 현탁액을 안정화시킬 수 있다. 교반 속도는 입자 크기에 영향을 줄 수 있고, 빠른 교반은 더 작은 입자를 생성한다. 교반 속도는 원자는 직경을 갖는 입자를 제조하기 위해 약 100 rpm, 약 200 rpm, 약 300 rpm, 약 400 rpm, 약 500 rpm, 약 600 rpm, 약 700 rpm, 약 800 rpm, 약 900 rpm, 약 1,000 rpm, 약 1,100 rpm, 약 1,200 rpm, 약 1,300 rpm, 약 200 rpm 내지 약 1,200 rpm, 약 400 rpm 내지 약 1,000 rpm, 약 100 rpm 이상, 약 200 rpm 이상, 약 250 rpm 이하, 약 500 rpm 이하, 약 1,000 rpm 이하, 약 1,300 rpm 이하, 또는 약 1,200 rpm 이하일 수 있다.

원하는 수화된 중합체 입자 직경은 약 10 μm, 약 20 μm, 약 30 μm, 약 40 μm, 약 50 μm, 약 100 μm, 약 200 μm, 약 300 μm, 약 400 μm, 약 500 μm, 약 600 μm, 약 700 μm, 약 800 μm, 약 900 μm, 약 1,000 μm, 약 1,100 μm, 약 1,200 μm, 약 1,300 μm, 약 1,400 μm, 약 1,500 μm, 약 1,600 μm, 약 1,700 μm, 약 1,800 μm, 약 1,900 μm, 약 2,000 μm, 약 50 μm 내지 약 1,500 μm, 약 100 μm 내지 약 1,000 μm, 약 50 μm 이상, 약 80 μm 이상, 약 600 μm 미만, 약 1,000 μm 미만, 약 1,200 μm 미만, 또는 약 1,500 μm 미만일 수 있다. 일 구현예에서, 직경은 약 1,200 μm 미만일 수 있다.

중합은 원하는 직경을 갖는 입자를 제조하기 위해 필요에 따라 가능한 길게 진행될 수 있다. 중합은 약 1 hr, 2 hr, 2.5 hr, 3 hr, 4 hr, 5 hr, 6 hr, 7 hr, 8 hr, 9 hr, 10 hr, 11 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr, 약 1 hr 내지 약 12 hr, 약 1 hr 내지 약 6 hr, 약 4 hr 내지 약 12 hr, 약 6 hr 내지 약 24 hr, 약 12 hr 내지 약 72 hr, 또는 적어도 약 6 시간 동안 진행될 수 있다.

중합은 원하는 직경을 갖는 입자를 제조하기 위한 온도에서 실시될 수 있다. 중합은 약 10℃, 약 15℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 60℃, 약 70℃, 약 80℃, 약 90℃, 약 100℃, 약 10℃ 내지 약 100℃, 약 10℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 이상, 약 100℃ 이하의 온도, 또는 약 실온에서 실시될 수 있다. 일 구현예에서, 중합은 실온에서 실시된다.

중합이 완료된 이후, 중합체 입자는 임의의 용질, 미네랄 오일, 미반응된 단량체(들), 및/또는 미결합된 올리고머를 제거하기 위해 세정될 수 있다. 임의의 용매가 이용될 수 있고, 비제한적으로, 헥산, 아세톤, 알코올, 물 및 계면활성제, 물, 유기 용매, 염수, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 세정 용액은 물이다. 또 하나의 구현예에서, 세정 용액은 헥산 이후 물의 조합이다. 또 하나의 구현예에서, 세정 용액은 염수이다. 추가의 구현예에서, 세정 용액은 물 및 계면활성제이다.

본원에 기재된 입자는, 경우에 따라, 비제한적으로 항-증식성 화합물, 세포증식억제성 화합물, 독성 화합물, 항-염증성 화합물, 화학치료제, 진통제, 항생제, 프로테아제 저해제, 스타틴, 핵산, 폴리펩타이드, 성장 인자 및 재조합 마이크로-유기체, 리포좀 등을 비롯한 전달 벡터를 포함하는 약물(들) 및/또는 활성제(들)이 봉입되거나 또는 코팅될 수 있다. 일 구현예에서, 입자에는 독소루비신이 봉입된다. 또 하나의 구현예에서, 입자에는 이리노테칸이 봉입된다. 또 다른 구현예에서, 입자에는 이리노테칸 및 독소루비신이 봉입된다.

약물 및/또는 활성제는 주입시 입자로부터 용출될 수 있다. 용출은 약 1시간, 약 2시간, 약 5시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 7일, 약 2주, 약 1개월, 약 2개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 1년, 또는 약 2년에 걸쳐 일어날 수 있다. 예를 들면, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 20 mg, 약 30 mg, 약 40 mg, 또는 약 50 mg의 약물 또는 활성제는 22 시간 또는 24 시간의 기간 동안 입자로부터 용출될 수 있다.

경우에 따라, 세정된 중합체 입자는 마이크로카테터로의 주사 이전에 가시화를 가능하게 하기 위해 중합 이전에, 그 과정에서, 또는 그 이후에 착색될 수 있다. 색전물질 입자에 공유 결합되는 일종의 반응성 염료로부터의 임의의 염료가 사용될 수 있다. 염료는 비제한적으로, 반응성 블루 21, 반응성 오렌지 78, 반응성 황색 15, 반응성 블루 번호 19, 반응성 블루 번호4, C.l. 리액티브 레드 11, C.l. 반응성 황색 86, C.l. 반응성 블루 163, C.l. 리액티브 레드 180, C.l. 반응성 블랙 5, C.l. 반응성 오렌지 78, C.l. 반응성 황색 15, C.l. 반응성 블루 번호 19, C.l. 반응성 블루 21, 착색제 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 착색제는 FDA 파트 73, 서브파트 D에 의해 사용이 승인된 것이다. 다른 구현예에서, 색전물질 입자의 폴리머 매트릭스에 비가역적으로 결합될 수 있는 염료가 이용된다.

염욕은 물에 나트륨 카보네이트 및 원하는 염료를 용해시킴으로써 만들어질 수 있다. 색전물질 입자는 상기 염욕에 부가되고, 교반된다. 건조 공정 이후, 임의의 미결합된 염료는 세정을 통해 제거된다. 건조 및 세정 이후, 입자는 바이알 또는 주사기에 패키징될 수 있고, 멸균될 수 있다.

본원에 기재된 입자는 중합체를 실질적으로 열화시키지 않으며 멸균될 수 있다. 멸균 이후, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100%의 중합체는 온전하게 유지될 수 있다. 일 구현예에서, 멸균 방법은 고압살균일 수 있고, 투여 이전에 이용될 수 있다.

최종 중합체 입자 제제는 카테터, 마이크로카테터, 주사침, 또는 다른 유사한 전달 장치를 통해 색전화되는 부위에 전달될 수 있다. 방사선불투과성 조영제는 주사기 내에서 입자 제제와 완전하게 혼합될 수 있고, 개입 영상화 기술에 의해 혈류가 상기 부위로부터 폐색된 것으로 결정될 때까지 카테터를 통해 주입될 수 있다.

주사되는 경우 입자는 실질적으로 안정하게 유지될 수 있다. 예를 들면, 중합체 입자는 약 5일, 약 2주, 약 1개월, 약 2개월, 약 6개월, 약 9개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 약 10년, 또는 약 20년 이후에 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100% 초과로 온전하게 유지될 수 있다.

본원에 기재된 중합체 입자는 압축성일 수 있으나, 파단되거나 파쇄되지 않기에 충분하도록 내구성을 가질 수 있다. 입자의 원형도 또는 직경에 있어서의 실질적인 변화가 마이크로카테터를 통한 전달 과정에서 발생되지 않을 것이다. 환언하면, 마이크로카테터의 전달 이후, 본원에 기재된 중합체 입자는 약 60%, 약 70% 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100% 초과로 온전하게 유지된다.

일 구현예에서, 마이크로카테터를 통한 전달 이전에서의 입자는 0.221 ± 0.054 mm의 평균 직경 및 0.226 ± 0.049 mm의 전달 후 직경을 가질 수 있다. 이들 입자는 또한 0.98 ± 0.04의 전달 이전 평균 원형성(formcircle) 및 0.98 ± 0.02의 전달 이후 원형성을 나타낼 수 있다.

또 하나의 구현예에서, 마이크로카테터를 통한 전달 이전의 입자는 395 ± 25 μm의 평균 직경 및 401 ± 30 μm의 전달 후 직경을 가질 수 있다. 이들 입자는 또한 0.98 ± 0.01의 전달 이전 평균 원형성 및 0.98 ± 0.04의 전달 이후 원형성을 나타낼 수 있다.

또한, 입자는 조직에 고정되고/되거나 조직과의 마찰을 통해 그 자리에 유지되도록 충분히 점착성일 수 있다. 다른 구현예에서, 입자는 혈액의 유량 및 압력에 의해 위치에 고정되는 용기에서의 플러그와 같은 역할을 할 수 있다.

하나의 예시적인 구현예에서, 중합체 입자는 폴리에테르, 글리세롤 모노메타크릴레이트, 비스아크릴아미드, 및 아미노에틸 메타크릴레이트의 반응 생성물을 포함할 수 있다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 건조시킨 중합체 입자는 약 28% w/w로의 폴리에테르, 약 68% w/w로의 글리세롤 모노메타크릴레이트, 약 1% w/w로의 비스아크릴아미드, 및 약 3% w/w로의 아미노에틸 메타크릴레이트를 포함할 수 있다.

또 하나의 예시적인 구현예에서, 건조된 중합체 입자는 폴리에테르, 아미노프로필 메타크릴아미드, 및 설포프로필 아크릴레이트의 반응 생성물을 포함할 수 있다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 중합체 입자는 약 40%로의 폴리에테르, 약 1%로의 아미노프로필 메타크릴아미드, 및 약 59%로의 설포프로필 아크릴레이트를 포함할 수 있다.

실시예 1

폴리에테르 매크로머의 제조

폴리에틸렌 글리콜 10,000 (450 g)을 2,400 mL의 톨루엔을 사용한 공비증류에 의해 건조시켰다. 200 mL의 디클로로메탄, 15.6 mL의 트리에틸아민, 및 10.4 mL의 메실 클로라이드를 부가하고, 용액을 4시간 동안 교반하였다. 용액을 여과하고, 생성물을 디에틸 에테르 중에 침전시키고, 여과에 의해 수집하였다. 수득한 생성물을 진공 건조시키고, 25%의 수산화암모늄 3,600 mL에 부가하고, 4일 동안 폐쇄시키고 그리고 3일동안 개방시켜 채로 교반하였다. 물을 제거하고, 생성물을 톨루엔을 사용한 공비증류에 의해 건조하였다. 톨루엔 중의 폴리(에틸렌 글리콜) 디아민을 수득하기 위해, 15.6 mL의 트리에틸아민 및 10.9 mL의 아크릴로일 클로라이드를 부가하고, 반응을 4시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 여과시키고, 에테르 중에 침전시키고, 용매를 제거하여, PEG 10,000 디아크릴아미드를 산출하였다.

실시예 2

폴리에테르 매크로머 및 복수개의 단량체로 제조된 색전물질 입자

20 mL의 탈이온수 중에 0.25 g 2-아미노에틸 메타크릴레이트, 실시예 1로부터의 2.125 g 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 0.07 g N,N'-메틸렌비스아크릴아미드, 및 1.2 g 염화나트륨을 용해시켜 예비중합체 제제를 제조하였다. 용액을 투명한 120 mL 황색병으로 여과시켰다. 2.0 g의 탈이온수 중에 1.0 g 암모늄 퍼설페이트를 용해시켜 개시제 용액을 제조하였다. 이후, 1.0 mL의 암모늄 퍼설페이트 용액을 여과된 예비중합체 용액에 부가하고, 용액을 2분 동안 진공 탈기시키고, 진공을 아르곤으로 대체하였다. 500 mL의 미네랄 오일을 1 시간 동안 초음파처리ㅎ하였고, 이후 오버헤드 교반 부재를 갖는 밀봉된 반응 용기에 부가하였다. 용기를 1시간 동안 진공 탈기시켰고, 이후 진공을 아르곤으로 대체하였다. 1mL의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민을 반응 용기에 부가하였고, 오버헤드 교반을 200 rpm에서 시작하였다. 예비중합체 제형을 반응 용기에 부가하였다. 1분 이후, 0.1 mL의 SPAN® 80(소르비탄 모노올레에이트, Croda International Plc, East Yorkshire, Sigma-Aldrich Company LLC, St. Louis, MO 사제)를 부가하고, 상기 제제를 2시간 이상 동안 중합시켰다. 오일을 경사분리하였고, 입자를 1,000 mL의 탈이온수와 함께 분별 깔때기에 부었다. 하부 물/구체 층을 수집하였다. 입자를 다수의 300 mL의 분량의 헥산으로 세정하였다. 최종 세정 이후, 모든 헥산을 경사분리하고, 입자를 새로운 300 mL 분량의 탈이온수로 세정하였고, 탈이온수가 있는 밀봉된 병에 보관하였다.

실시예 3

폴리에테르 매크로머로 제조된 색전물질 입자

30.0 g의 탈이온수 중에 6.0 g의 염화나트륨 및 15.8 g 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드를 용해시킴으로써 예비중합체 제제를 제조하였다. 1.0 g의 상기 용액을 여과하였다. 2.0 그램의 탈이온수 중에 1.0 g 암모늄 퍼설페이트를 용해시킴으로써 개시제 용액을 제조하였다. 암모늄 퍼설페이트 용액 (1 mL)을 여과된 예비중합체 용액에 부가하였고, 용액을 2분 동안 진공 탈기시키고, 진공을 아르곤으로 대체하였다. 이후, 500 mL의 미네랄 오일을 2시간 동안 초음파처리하였고, 그 다음 0.5 mL의 SPAN® 80 및 오버헤드 교반 부재가 있는 밀봉된 반응 용기에 부가하였다. 용기를 1 시간 동안 진공 탈기시키고, 그 다음 아르곤으로 대체하였다. 이후, 1 mL의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민을 반응 용기에 부가하였고, 오버헤드 교반을 450 rpm에서 시작하였다. 10 g의 예비중합체 제제를 주사기를 사용하여 반응 용기에 부가하였고, 8시간 이상 동안 중합시켰다.

실시예 4

폴리에테르 매크로머 및 단량체로 제조된 색전물질 입자

34.4 g의 탈이온수 중에 실시예 1로부터의 9.2 g 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 13.8 g 3-설포프로필 아크릴레이트 칼륨염, 및 0.248 g n-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로클로라이드를 용해시킴으로써 예비중합체 제제를 제조하였다. 이후, 용액을 여과하였다. 2.0 g의 탈이온수 중에 1.0 g 암모늄 퍼설페이트를 용해시킴으로써 개시제 용액을 제조하였다. 암모늄 퍼설페이트 용액 (0.85 mL)을 여과된 예비중합체 용액에 부가하였고, 용액을 2분 동안 진공 탈기시켰고, 0.14 mL의 SPAN® 80 및 오버헤드 교반 부재가 있는 밀봉된 반응 용기에 부가하였다. 용기를 1시간 동안 진공 탈기시켰고, 그 다음 진공을 아르곤으로 대체하였다. N,N,N'N'-테트라메틸에틸렌디아민 (2 mL)을 반응 용기에 부가하였고, 오버헤드 교반을 400 rpm에서 시작하였다. 예비중합체 제제를 반응 용기에 주사기를 통해 부가하였고, 8시간 이상 동안 중합하였다.

실시예 5

색전물질 입자의 정제

미네랄 오일을 반응 용기로부터 경사분리하였고, 중합체 입자를 새로운 분량의 헥산으로 3회 세정하여 미네랄 오일을 제거하였다. 입자를 이후 물을 사용하여 분별 깔때기로 이동시켰고, 잔류 미네랄 오일 및 헥산과 분리하였다. 그 다음, 입자를 탈이온수로 세정하고 임의의 잔류 반응물을 제거하였다. 입자를 최종 제조 및 염색을 위한 0.9% 염수 용액으로 포장할 수 있다.

실시예 6

색전물질 입자의 염색

입자를 건조시키기 위해서, 50 g의 탄산나트륨 및 0.1 g 반응성 블랙 5 염료 (Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO 사제)을 1,000 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 그 다음, 500 mL의 추출된 입자를 부가하고, 1시간 동안 교반하였다. 잔류 염료가 제거될 때까지 염색된 입자 제제를 탈이온수로 세정하였다. 그 다음 입자를 최종 제조를 위한 0.9% 염수 용액으로 포장할 수 있다.

실시예 7

약물 봉입 색전물질 입자

실시예 4에서 제조된 입자를 100-300 μm로 체질하고, 약물 독소루비신을 봉입하였다. 1 mL 입자 분취량을 용액 중에 37.5 mg의 독소루비신으로 봉입하였다. 입자를 부가하기 이전과 이후에 Agilent 1100 HPLC 시스템에 의해 용액을 분석하여 용액으로부터 입자에 격리된 약물의 양을 결정하였다.

독소루비신: 37.5 mg의 독소루비신을 가진 봉입 입자를 2 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 약물 용액의 액적을 LC 분석을 위해 수집하였다. 염수 보관 유체를 입자의 1 mL 바이알로부터 제거하였고, 입자의 바이알에 약물 용액을 부가하였다. 18 시간 이후, 용액의 샘플을 분석하였고, 약물 봉입을 입자를 부가하기 이전과 이후에 용액에 존재하는 약물의 피크 면적을 비교함으로써 측정하였다.

실시예 4에서 제조된 입자를 약물 이리노테칸을 유사하게 봉입시켰다. 100-300 μm 크기의 입자의 4개의 1 mL 분취량에 시트레이트 완충 용액에 용해된 50.0 mg의 이리노테칸으로 봉입시켰다. 입자를 부가하기 이전과 이후에 용액을 분석하였다.

이리노테칸: 50.0 mg의 이리노테칸을 가진 봉입 입자를 5 mL의 pH 4 시트레이트 완충 용액에 용해시켰다. 용액의 액적을 LC 분석을 위해 수집하였다. 염수 보관 용액을 입자의 1 mL 바이알로부터 제거하였고, 이리노테칸 용액을 부가하였다. 18시간 이후, 용액의 샘플을 분석하였고, 약물 봉입량을 입자를 부가하기 이전과 이후에 용액에 존재하는 약물의 피크 면적과 비교하여 측정하였다 (도 1).

실시예 8

색전물질 입자의 약물 용출

실시예 4에서 제조된 입자를 6개의 1 mL 샘플로 분취하였고, 실시예 7에 대한 약물을 봉입하였다. 과량의 약물 용액을 18 시간의 인큐베이션 기간 이후 입자의 샘플로부터 제거하였다. 샘플을 Sotax CE7 Smart USP 4 용해 장치의 용해 챔버 내에 배치하였다. 염수 용액의 용출 매질을 다양한 시점에서 취득한 샘플을 사용하여 37.5℃에서 22 시간 동안 실시하였다. Agilent 1100 HPLC 시스템으로 샘플을 분석하였고, 용출된 약물의 밀리그램을 계산하였다. 결과를 도 2에 예시하였다.

실시예 9

색전물질 입자의 압축 탄성율

본원에 기재된 바와 같이 제조된 입자를 대개 입자의 평균 외부 직경보다 더 작은 내부 내강(inner lumen)을 가진 카테터를 통해 전달하였다. 이의 명목상 직경의 30%로 입자의 샘플을 압축하는데 필요한 압축 탄성율을 5 N 부하 셀이 구비된 Instron 5543 물질 시험 기계 상에서 시험하였다. 샘플을 시험하기 위해, 염수에 보관된 명목상 800 μm 직경의 크기를 갖는 구체 입자의 대략 1 cm 원형 단층을 평면형 하부 가압판(flat lower platen)에 배치하였다. 과량의 염수를 랩 와이프(lab wipe)로 신중하게 닦아내었다. 평면형 프로브가 비드를 비드의 평균 직경의 30%로 비드를 압축하였고, 영률을 기록하였다. 시험을 각 샘플에 대해 3-5회 반복하였다.

실시예 2 및 실시예 3으로부터의 명목상 800 μm 직경의 크기의 구체 입자의 2개의 샘플을 앞서 기술한 바와 같이 시험하였고, 그 결과를 도 3에 예시하였다.

실시예 4로부터의 명목상 800 μm 크기의 구체 입자의 2개의 1 mL 분취량에 실시예 7에 대한 이리노테칸 및 독소루비신을 봉입하였다. 약물을 봉입하기 이전과 이후에 압축성을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 예시하였다.

실시예 10

방사선불투과성 조영제에서의 입자의 현탁 특성의 측정

색전물질 입자를 방사선불투과성 조영제 용액에서 전달하기 위해 제조하였다. 조용제 용액에 현탁된 입자의 균질한 혼합물은 카테터를 통해 비드의 균일한 주입을 가능하게 할 수 있다. 색전물질 입자의 현탁 특성을 시험하기 위해, 1 mL의 입자 및 2 mL의 완충된 염수를 가진 10 mL 주사기를 3-방향 콕마개에 부착하였다. 3 mL의 OMNIPAQUE® 300 (1mL당 300 mg의 요오드로 제제화된 이오헥솔, GE Healthcare, Norway) 조영제를 함유한 또 하나의 주사기를 콕마개에 부착하였다. 조영제를 입자 주사기 내로 주사하였고 타이머를 개시시켰다. 조영제, 염수, 및 입자를 함유한 주사기를 콕마개로부터 제거하였고, 주사기 꼭지 마개로 밀봉하였다. 내용물을 주사기로 반복적으로 역전시킴으로써 혼합하였다. 일 시점에서, 혼합을 멈추고 제2 타이머를 개시시켰다. 주사기의 3분의 2만을 유지하기 위한 입자에 대해 소요된 시간을 기록하였다. 역전시키는 것에 의한 혼합을 측정 과정에서 지속하였다.

명목상 800 μm 크기의 실시예 2 및 실시예 3으로부터의 입자를 상기 기재된 방법을 사용하여 시험하였고, 그 결과를 도 5에 예시하였다.

독소루비신으로 약물 봉입되고, 명목상 400 μm 크기의 실시예 4로부터의 입자를 현탁 특성에 대해 시험하였다. 이를 위해, 1 mL의 약물 봉입 입자 및 약물이 봉입된 용액을 10 mL 주사기에 배치시켰다. 과량의 약물 용액을 주사기로부터 빼내었고, 주사기를 3-방향 콕마개에 부착하였다. OMNIPAQUE® 300 조영제를 함유한 제2 10 mL 주사기를 3-방향 콕마개에 부착하였다. 충분한 조영제 용액을 입자를 함유한 주사기에 부가하여 6 mL의 총 용적이 되게 하였고, 타이머를 개시시켰다. 조영제 및 입자를 함유한 주사기를 콕마개로부터 분리하고 주사기 꼭지 마개로 밀봉하였다. 내용물을 주사기를 반복하여 역전시킴으로써 혼합하였다. 반복적으로 주사기를 역전시킴으로써 내용물을 혼합하였다. 주사기의 3분의 2만을 유지하기 위한 입자에 대해 소요된 시간을 기록하였다. 역전시키는 것에 의한 혼합을 측정 과정에서 지속하였다.

이리노테칸으로 약물 장입되고, 명목상 400 μm 크기의 실시예 4로부터의 입자를 현탁 특성에 대해 시험하였다. 1 mL의 약물 봉입 입자 및 약물이 봉입된 용액을 10 mL 주사기에 배치하였다. 과량의 약물 용액을 주사기로부터 배출시키고, 주사기를 3-방향 콕마개에 부착시켰다. 탈이온수를 함유한 제2 10 mL 주사기를 3-방향 콕마개에 부착시키고, 약물 봉입 입자를 함유한 주사기로 물을 주입하여 3 mL로의 총 용적이 되게 하였다. 물을 함유한 주사기를 분리하고, OMNIPAQUE® 300 조영제를 함유한 주사기를 3-방향 콕마개에 부착시켰다. 충분한 조영제 용액을 입자를 함유한 주사기에 부가하여 6 mL의 총 용적이 되게 하였고, 타이머를 개시시켰다. 조영제 및 입자를 함유한 주사기를 콕마개로부터 분리하고, 주사기 꼭지 마개로 밀봉하였다. 내용물을 주사기로 반복적으로 역전시킴으로써 혼합하였다. 일 시점에서, 혼합을 멈추고 제2 타이머를 개시시켰다. 주사기의 3분의 2만을 유지하기 위한 입자에 대해 소요된 시간을 기록하였다. 역전시키는 것에 의한 혼합을 측정 과정에서 지속하였다.

독소루비신 및 이리노테칸이 봉입된 입자에 대한 결과를 도 6에 예시하였다.

실시예 11

카테터 전달 이후의 색전물질 입자의 내구성의 측정

사용을 시물레이션하기 위해, 실시예 3에서 제조된 입자의 1 mL 샘플을 Headway 21 카테터 (0.021", 533 μm 내부 내강)을 통해 주사하였다. 2 mL의 염수와 함께 1 밀리리터의 입자가 있는 주사기를 3-방향 콕마개에 부착시켰다. 3 mL의 OMNIPAQUE® 300 조영제 용액을 함유한 주사기 및 카테터를 또한 3-방향 콕마개에 부착시켰다. 콕마개를 주사기 사이에서 개방시켜 비드, 염수, 및 조영제를 혼합하였다. 이러한 입자 제제를 이후 한 주사기에 배치하고, 다른 주사기를 분리하고, 1 mL 주입용 주사기를 카테터에 연결된 콕마개에 부착시켰다. 입자를 카테터를 통해 디시(dish)로 전달하였다. Zeiss Axio Imager A1 현미경을 사용하여 이미지를 얻었고, Zeiss Axiovision 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 원형도 (원형에 대한 근접도)에 대해 점수를 매기고, 스튜던트 t-시험(Student's t-test)을 사용한 통계적 분석은 관찰되는 구체는 손상되지 않은 채로, 전달 이전과 이후에 구체 입자에 있어서 차이가 없음을 나타내었다.

실시예 12

전달 이후 약물 봉입된 색전물질 입자의 내구성의 측정

약물 봉입된 색전물질 입자의 사용을 시뮬레이션하기 위해, 실시예 4에서 제조된 1 mL 샘플의 입자를 Headway 17 카테터 (0.017", 432 μm 내부 내강)을 통해 주사하였다. 2 mL의 탈이온수와 함께 실시예 7에 대한 독소루비신이 봉입된 1 mL의 입자를 충전시킨 주사기를 3-방향 콕마개에 부착시켰다. 3 mL의 OMNIPAQUE® 300 방사선불투과성 조영제 용액을 함유한 주사기 및 카테터를 또한 3-방향 콕마개에 부착시켰다. 콕마개를 주사기 내에서 개방시켜 비드, 염수, 및 조영제를 혼합하였다. 이러한 입자 제제를 이후 한 주사기에 배치하고, 다른 주사기를 분리하고, 1 mL 주입용 주사기를 카테터에 연결된 콕마개에 부착시켰다. 입자를 카테터를 통해 디시로 전달하였다. Zeiss Axio Imager A1 현미경을 사용하여 이미지를 얻었고, Zeiss Axiovision 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 원형도 (원형에 대한 근접도)에 대해 점수를 매기고, 스튜던트 t-시험(Student's t-test)을 사용한 통계적 분석은 관찰되는 구체는 손상되지 않은 채로, 전달 이전과 이후에 구체 입자에서 차이가 없음을 나타내었다.

실시예 13

매크로머 및 복수개의 단량체, 희석된 예비중합체 용액으로 구성되는 중합체 미세구체

40 mL의 탈이온수에서의 0.35 g 2-아미노에틸 메타크릴레이트, 실시예 1로부터의 2.98 g 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 7.16 g 글리세롤 모노메타크릴레이트, 0.098 g N,N'-메틸렌비스아크릴아미드, 및 3.0 g 염화나트륨을 용해시킴으로써 예비중합체 제제를 제조하였다. 용액을 투명한 120 mL 황색병으로 여과시켰다. 2.0 g의 탈이온수 중에 1.0 g 암모늄 퍼설페이트를 용해시킴으로써 개시제 용액을 제조하였다. 이후, 1.0 mL의 암모늄 퍼설페이트 용액을 여과된 예비중합체 용액에 부가하고, 용액을 2분 동안 진공 탈기시키고, 진공을 아르곤으로 대체하였다. 이후, 500 mL의 미네랄 오일을 1시간 동안 초음파처리하고, 그 다음 오버헤드 교반 부재를 가진 밀봉된 반응 용기에 부가하였다. 용기를 1시간 동안 진공 탈기시키고, 이후 진공을 아르곤으로 대체하였다. 이후, 1 mL의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민을 반응 용기에 부가하였고, 오버헤드 교반을 200 rpm에서 시작하였다. 예비중합체 제제를 반응 용기에 부가하였다. 1분 이후, 0.1 mL의 SPAN® 80을 부가하고, 제제를 2시간 이상 동안 중합시켰다. 오일을 경사분리하였고, 입자를 1,000 mL의 탈이온수와 함께 분별 깔때기에 부었다. 하부 물/구체 층을 수집하였다. 입자를 새로운 300 mL 분량의 헥산으로 세정하였다. 최종 세정 이후, 모든 헥산을 경사분리하고, 입자를 새로운 300 mL 분량의 탈이온수로 세정하였고, 탈이온수가 있는 밀봉된 병에 보관하였다.

실시예 14

35.0 g의 탈이온수 중에 실시예 1로부터의 10.0 g 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 및 15.0 g 3-설포프로필 아크릴레이트 칼륨염을 용해시킴으로써 예비중합체 제제를 제조하였다. 이후, 55 g의 상기 용액을 여과시켰다. 2.0 g의 탈이온수 중에 1.0 g 암모늄 퍼설페이트를 용해시켜 개시제 용액을 제조하였다. 암모늄 퍼설페이트 용액 (1 mL)을 여과된 예비중합체 용액에 부가하였고, 용액을 이후 2분 동안 진공 탈기시키고, 진공을 아르곤으로 대체하였다. 이후, 1000 mL의 미네랄 오일을 2시간 동안 초음파처리하였고, 그 다음 0.5 mL의 SPAN® 80 및 오버헤드 교반 부재를 가진 밀봉된 반응 용기에 부가하였다. 용기를 1시간 동안 진공 탈기시키고, 이후 진공을 아르곤으로 대체하였다. N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (1 mL)을 반응 용기에 부가하였고, 오버헤드 교반을 450 rpm으로 시작하였다. 예비중합체 제제 (55 g), 이후 0.35 mL의 SPAN® 80을 주사기를 통해 반응 용기로 부가하였다. 비드를 8 시간 이상 동안 중합시켰다.

선행 개시내용은 예시적인 구현예이다. 본원에 개시된 장치, 기술 및 방법은 본 개시내용의 실시에서 적절하게 작용되는 대표적인 구현예를 설명하는 것으로 본 기술분야의 당업자에게 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 본 기술분야의 당업자는 본 개시내용의 측면에서, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남 없이 유사한 결과가 얻을 수 있는 개시된 특정 구현예에서 수많은 변형이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.

다르게 나타나 있지 않는 한, 본 상세한 설명 및 특허청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에서 용어 "약"으로 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에서 얻기 위해 추구되는 원하는 특성에 따라 변화될 수 있는 근사값이다. 적어도, 특허청구범위의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효숫자의 수치의 면에서 그리고 통상의 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다. 본 발명의 광범위한 사상을 설명하는 수치 범위 및 파라미터들이 근사치임에도 불구하고, 특정 예들에서 기재된 수치 값들은 가능한 정확하게 보고되어 있다. 그러나, 임의 수치 값들은 그들 각자 시험 측정에서 존재하는 표준 편차로부터 필수적으로 생겨나는 일정한 오차들을 고유하게 포함한다.

본 발명을 기술하는 맥락에서(특히, 하기 특허청구범위의 맥락에서) 사용된 용어 단수 표현("a" 및 "an"과 "the") 및 유사한 지시 대상은, 본원에서 달리 표현되거나 문맥에 명백하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서의 수치 범위 인용은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 독립된 값을 개별적으로 언급하는 간단한 방법으로서 소용되도록 의도된다. 본원에서 달리 표현되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼, 본 명세서에 포함된다. 본원에 설명된 모든 방법은 본원에서 달리 표현되거나 문맥에 명백하게 모순되지 않는 한, 임의 적합한 순서로 행해질 수 있다. 본원에서 제공된 임의 및 모든 예, 또는 예시적인 단어(예를 들어, "예컨대(such as)"의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하고자 한 것으로, 달리 주장하지 않는 한, 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 본 명세서에 기술된 단어를 본 발명의 실시에 필수적인 청구하지 않는 임의 요소로서 해석해서는 안 된다.

특허청구범위에서 사용된 "또는(or)"의 사용은 대체품만을 언급하도록 명백하게 표현되지 않는 한 또는 그 대체품들이 서로 배제되지 않는 한, "및/또는(and/or)"을 의미하는 것으로 사용되지만, 기재는 단지 대안 및 "및/또는(and/or)"을 언급하는 정의를 지지한다.

본원에 개시된 본 발명의 대체 요소들 또는 실시예들의 그룹화(grouping)는 제한적으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 멤버는 본원에 존재하는 그룹의 다른 멤버들 또는 다른 요소들을 의미할 수 있으며, 본원에 존재하는 그룹의 다른 멤버들 또는 다른 요소들과의 임의 결합으로 또는 개별적으로 청구될 수 있다. 편의성 및/또는 특허성의 이유로 인해, 그룹의 하나 이상의 멤버들이 그룹에 포함될 수 있거나, 그룹으로부터 삭제될 수 있음이 예기된다. 임의 그러한 포함 또는 삭제가 일어나면, 본원 명세서에서는 변경된 그룹을 포함하여 첨부된 청구범위에서 사용된 모든 마커쉬 그룹(Markush groups)에 대한 서면 설명을 충족시키는 것으로 여겨진다.

본원에서는, 본 발명을 수행하는 본 발명자들에게 공지된 최적의 방식을 포함하여, 본 발명의 바람직한 실시예들이 기술된다. 물론, 당업자들에게는 상기 설명을 이해함으로써 이들 바람직한 실시예들에 대한 변형예가 명백해질 것이다. 본 발명자는 당업자들이 그러한 변형예들을 필요에 따라 채용할 수 있기를 기대하며, 또한 본 발명자들은 본 발명이 본원에서 구체적으로 달리 기술되지 않는 한, 실시될 수 있도록 의도하였다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 첨부된 청구범위에서 인용된 대상의 모든 수정예 및 등가물을 포함한다. 게다가, 본 발명의 모든 가능한 변형예에서 상술한 요소들의 임의 결합들은 본원에서 달리 표현되지 않거나 또는 문맥에 명백하게 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.

본원에 기재된 특정 실시예들은 "이루어지는(consisting of)" 또는 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)" 단어를 이용하여 청구범위에서 더 한정될 수 있다. 출원 시에 또는 보정에 따라 부가되어 청구범위에서 사용된 경우, 이행어(transition term)인 "이루어지는"은 청구범위에서 특정되지 않은 임의 요소, 단계 또는 성분은 제외한다. 이행어인 "본질적으로 이루어지는"는 청구범위의 범주를 특정된 재료 또는 단계들, 및 기본 및 새로운 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 제한한다. 그와 같이 청구된 본 발명의 실시예들은 본원에 고유하거나 명백하게 기술되고 실시가능하다.

또한, 본원에 개시된 본 발명의 실시예들은 본 발명의 원리를 예시하는 것임에 주목해야 한다. 채용될 수 있는 다른 변형예들은 본 발명의 범주 내에 속한다. 그래서, 제한적인 것은 아니지만 일례로, 본원의 교시에 따라 본 발명의 다른 구성들을 활용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 앞서 제시되고 기술된 것으로만 정확하게 제한되는 것은 아니다.

Claims

약 15% w/w 내지 약 50% w/w의 농도의 하나 이상의 유도체화된 폴리(에틸렌 글리콜) 매크로머, 폴리(프로필렌 글리콜) 매크로머, 폴리(테트라메틸렌 옥사이드) 매크로머, 또는 이들의 조합; 및
n-이소프로필 아크릴아미드 이외의 하나 이상의 단량체
를 포함하는 중합체 입자.
제1항에 있어서, 약 40 μm 내지 약 1,200 μm의 직경을 갖는 중합체 입자.
제1항에 있어서, 하나 이상의 단량체를 더 포함하는 중합체 입자.
제3항에 있어서, 하나 이상의 단량체는 작용기를 포함하고, 작용기는 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 또는 메타크릴아미드인 중합체 입자.
제3항에 있어서, 하나 이상의 단량체가 글리세롤 모노메타크릴레이트, 아미노 에틸 메타크릴레이트, 3-설포프로필 아크릴레이트, 아미노 프로필 메타크릴아미드, 또는 이들의 조합인 중합체 입자.
제5항에 있어서, 하나 이상의 단량체가 약 68% w/w의 농도의 글리세롤 모노메타크릴레이트인 중합체 입자.
제5항에 있어서, 하나 이상의 단량체가 약 59% w/w의 농도의 3-설포프로필 아크릴레이트인 중합체 입자.
제5항에 있어서, 하나 이상의 단량체가 약 1% w/w의 농도의 아미노 프로필 메타크릴아미드인 중합체 입자.
제5항에 있어서, 하나 이상의 단량체가 약 3% w/w의 농도의 아미노 에틸 메타크릴레이트인 중합체 입자.
제1항에 있어서, 하나 이상의 유도체화된 폴리(에틸렌 글리콜) 매크로머는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴아미드, 또는 이들의 조합인 중합체 입자.
제6항에 있어서, 하나 이상의 유도체화된 폴리(에틸렌 글리콜) 매크로머는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드 10,000인 중합체 입자.
오일 중에서 하나 이상의 유도체화된 폴리에테르 매크로머 및 개시제를 포함하는 수계 예비중합체 용액을 반응시켜 중합체 입자를 형성하는 단계를 포함하고,
상기 중합체 입자는 약 1,200 μm 미만의 직경을 갖는, 중합체 입자의 제조 방법.
제12항에 있어서, 오일은 미네랄 오일인 제조 방법.
제12항에 있어서, 개시제는 암모늄 퍼설페이트, 테트라메틸에틸렌 디아민, 또는 이들의 조합인 제조 방법.
제12항에 있어서, 중합체 입자는 약 40 μm 내지 약 1,200 μm의 직경을 갖는 제조 방법.
제12항에 있어서, 하나 이상의 유도체화된 폴리에테르 매크로머는 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(테트라메틸렌 옥사이드), 또는 이들의 조합의 유도체인 제조 방법.
제16항에 있어서, 하나 이상의 유도체화된 폴리에테르 매크로머가 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디메타크릴아미드, 또는 이들의 조합인 제조 방법.
제16항에 있어서, 하나 이상의 유도체화된 폴리에테르 매크로머가 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드 10,000인 제조 방법.
제12항에 있어서, 하나 이상의 단량체를 더 포함하는 제조 방법.
제19항에 있어서, 하나 이상의 단량체가 글리세롤 모노메타크릴레이트, 아미노 에틸 메타크릴레이트, 3-설포프로필 아크릴레이트, 아미노 프로필 메타크릴아미드, 또는 이들의 조합인 제조 방법.
제19항에 있어서, 단량체가 n-이소프로필 아크릴아미드 이외의 것인 제조 방법.