KR20160072252A

KR20160072252A - 신규 dgat2 억제제

Info

Publication number: KR20160072252A
Application number: KR1020167013324A
Authority: KR
Inventors: 니콜라스 폴 캠프; 매니샤 나익
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2016-06-22
Also published as: JP2016539115A; AR098394A1; WO2015077299A1; CN105764889A; IL245245A0; DOP2016000120A; PH12016500963A1; ES2695302T3; CL2016001172A1; AP2016009230A0; MA39048A1; NZ719444A; CA2928468A1; HK1223367A1; AU2014353109A1; TW201609668A; CR20160216A; EP3074381A1; PE20161099A1; US9073901B2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 Ⅰ의 화합물; 고트리글리세리드혈증 및 이상지혈증 및 아테롬성동맥경화증을 비롯한 심혈관 질환에 대해 환자를 치료하는 방법; 및 화합물의 제조 방법을 제공한다.
<화학식 Ⅰ>

상기 식에서 R은 H 또는 -CH₃이다.

Description

신규 DGAT2 억제제 {NOVEL DGAT2 INHIBITORS}

본 발명은 상승된 트리글리세리드 수준 및 이상지혈증과 아테롬성동맥경화증을 포함하는 심혈관 질환을 치료하기 위한 유용한 요법을 제공할 수 있는, 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제 2 (DGAT2)를 억제하기에 유용한 신규 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

사람에서, 특히 서반구의 인구에서의 평균 트리글리세리드 수준은, 지난 30년 동안 급속도로 증가하였다. 트리글리세리드 수준의 증가 또는 고콜레스테롤혈증은 심혈관 질환, 예컨대 이상지혈증 및 아테롬성동맥경화증의 증가된 위험을 비롯하여 다수의 질환 위험과 연관되어 있다. 트리글리세리드 수준의 증가는 또한 비만, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 간 지방증 및 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)의 급격한 증가와 일치했다. 상승된 트리글리세리드 수준은 다양한 질환 및 상태와 연관되어 있기 때문에, 트리글리세리드 생산 및/또는 수준을 제어하는 것은 대사 질환의 실행가능한 치료를 제공할 수 있다.

디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제 2 (DGAT2)는 많은 조직에서 발현되지만, 주로 간 및 백색 지방 조직에서 발현된다. 그것은 DGAT1과 마찬가지로 트리글리세리드 합성을 위한 최종 단계와 연관되어 있다. 트리글리세리드 수준의 감소로 이어지는 DGAT2 활성의 억제는 ApoB 분비를 통한 생산이나 그들 입자의 침착을 제어함으로써 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-c)을 억제할 것이다. 두 가지 메카니즘은 인간에게 약리적으로 승인되어 있다. 아포지단백질 B (ApoB) 입자의 분비를 제한하는 것은 LDL-c 생산을 감소시킨다. 따라서 DGAT2 활성의 감쇠는 간에서의 순환 및 지질생성에 있어서 트리글리세리드 수준, LDL-c, ApoB, 및 트리글리세리드-풍부 지단백질 농도에 대한 유리한 효과를 갖는다.

WO2013/150416은 DGAT2 억제제로서 퓨린, 피리미딘, 및 피라진 화합물의 특정 유도체, 및 DGAT2 활성과 연관된 질환을 치료함에 있어서 그들의 용도을 개시하고 있다.

고콜레스테롤혈증 및 심혈관 질환, 예컨대 이상지혈증 및 아테롬성동맥경화증의 치료를 위한 추가의 약물에 대한 필요가 존재한다. 식이, 생활방식 변화 및/또는 스타틴 요법을 포함하는 현행 치료 방법은 심혈관 질환 위험이 있는 모든 환자의 LDL-c 수준을 충분히 낮추지 못할 수 있다. 게다가 스타틴 요법에 불내성이 있거나 불내성을 갖게 된 환자들의 하위세트가 존재한다. 본 발명은 심혈관 질환 치료에 적합할 수 있는 대안적 화합물 및 치료 방법을 제공함으로써 이들 필요 중 하나 이상을 해결하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서 R은 H 또는 -CH₃이다.

한 형태에서, 본 발명은 R이 H인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서 투여된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서 투여된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 이상지혈증 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서 투여된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서 투여된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 아테롬성동맥경화증 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서 투여된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서 투여된 화합물 또는 제약상 그의 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

한 형태에서, 본 발명은 고트리글리세리드혈증 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서 투여된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서 투여된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 중 적어도 1종을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, D.B. Troy, Editor, 21^st Edition, Lippinncott, Williams & Wilkins, 2006] 참조).

본 발명은 심혈관 질환, 이상지혈증, 아테롬성동맥경화증 또는 고트리글리세리드혈증 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 화학식 I에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서 투여된 제약 조성물은 R이 H인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 또 다른 실시양태에서 투여된 화합물 또는 제약 조성물은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 한 실시양태에서 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

한 실시양태에서 요법은 심혈관 질환을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 용도를 포함한다. 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 대안적으로, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

한 실시양태에서 요법은 이상지혈증의 치료를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 포함한다. 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 대안적으로, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

또 다른 실시양태에서 요법은 아테롬성동맥경화증의 치료를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 포함한다. 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 대안적으로, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

또 다른 실시양태에서 요법은 고트리글리세리드혈증의 치료를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 포함한다. 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 대안적으로, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

본 발명은 또한 고트리글리세리드혈증, 심혈관 질환, 이상지혈증 및 아테롬성동맥경화증 중 1종 이상을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 화학식 I에 따른 화합물의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 H인 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태에서 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 R이 -CH₃인 화학식 I의 화합물이다.

본 발명은 하기 화학식 2의 화합물의 제조 방법을 제공한다:

<화학식 2>

상기 식에서 R은 H 또는 -CH₃이고, R1은 보호기이다. 방법은 하기 화학식 3의 화합물을

<화학식 3>

하기 화학식 4의 화합물

<화학식 4>

과 반응시키는 것을 포함한다.

제조는 화학식 2의 보호기인 R1을 제거하여 화학식 I의 화합물을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다양한 아미노 보호 관능기의 예는 다음을 포함한다: 카르바메이트, 예컨대 C_1-5 알킬 카르바메이트, C_3-6 시클로알킬 카르바메이트, 바람직하게는 t-부틸 카르바메이트, (BOC) 또는 벤질 카르바메이트 (CBZ); 아미드, 예컨대 C_1-3 알킬아미드, C_1-3 할로알킬아마이드, 포름아미드 또는 아세트아미드 클로로아세트아미드, 트리플루오리도아세트아미드; 및 벤질 아민. 아미노 보호 관능기의 추가 예, 보호된 아미노 치환기의 제조 방법 및 아미노 치환기의 탈보호 방법은 문헌 ["Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Ed. Greene, T.W., Wuts, P.G.M., Eds., John Wiley and Sons, New York, 1999]에서 찾아볼 수 있다. 보호된 아미노 치환기 이외에 아미노기로 용이하게 전환될 수 있는 다른 관능기가 사용될 수 있다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지하고 있을 것이다. 이러한 관능기, 제조 및 이들 기의 변환은 문헌 ["Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations" by Larock. R.C, Wiley VCH, 1999 및 "March's Advanced Organic Chemistry, Reactions, Mechanisms and Structure" Smith, M.B., and March, J., Wiley-Interscience, 6th Ed. 2007]에서 찾아볼 수 있다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 염"은 임상적 및/또는 수의학적 용도에 허용되는 것으로 간주되는 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하기 위한 통상의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); 및 S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

본원에 사용된 용어 화학식 I의 화합물의 "유효량"은 장애, 예컨대 심혈관 질환, 이상지혈증, 아테롬성동맥경화증 또는 고트리글리세리드혈증을 치료하는데 유효한 양, 즉 투여량을 지칭한다. 담당 진단자는, 관련 기술분야의 통상의 기술자로서, 통상의 기술을 사용함으로써 및 유사한 상황에서 얻어진 결과를 관찰함으로써 유효량을 용이하게 결정할 수 있다. 화학식 I의 화합물의 유효량 또는 용량을 결정함에 있어서, 투여될 화학식 I의 화합물; 사용되는 경우에, 다른 작용제의 공-투여; 포유동물의 종; 그의 크기, 연령, 및 전반적 건강; 침범 정도 또는 장애의 중증도; 개별 환자의 반응; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특징; 선택된 투여 요법; 다른 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 환경을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 고려된다.

본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 기존 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 저지, 둔화, 정지, 감소 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 반려 포유동물, 예컨대 개 또는 고양이를 지칭한다.

일반 화학

본원에 사용된 하기 용어는 나타낸 의미를 갖는다: "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "Et₂O"는 디에틸에테르를 지칭하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하고; "hr"은 시간을 지칭하고; "m"은 분을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "MS"는 질량 분광분석법을 지칭하고; "RT"는 실온을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭한다.

달리 나타내지 않는 한, 여기서 설명된 화합물은 엑셀리스 드로우(Accelrys Draw) 4.0을 사용하여 명명되고 넘버링된다.

반응식 1은 화학식 I 및 2의 화합물의 일반적 합성을 설명한다.

<반응식 1>

일반적으로, 술폰아미드, 화합물 1은 아질산나트륨 및 황산을 이용하여 페놀 유도체, 화합물 2로 전환시킬 수 있다. 화합물 2 및 4,6-디클로로-2-메틸피리미딘, 화합물 3의 반응은 에테르 화합물 4를 제공한다.

방법 A에 따르면, 화합물 4의 클로라이드 치환기는 시안화아연 및 팔라듐 촉매를 이용하여 화합물 5에서 시아노 기로 전환시킬 수 있다. 화합물 5 상의 시아노 기는 팔라듐 촉매 및 수소 기체를 이용하여 화합물 6 상의 아미노 기로 환원시킬 수 있다. 아민 화합물 6 및 2,5-디클로로피리미딘, 화합물 7의 반응은 R이 H 또는 메틸 기인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

대안적으로 방법 B에 따르면, 화합물 4의 술폰아미드 질소를 공지된 질소 보호기로 보호하여 화합물 8을 제공할 수 있다. 화합물 8의 클로라이드 치환기는 시안화아연 및 팔라듐 촉매를 이용하여 화합물 9 상의 시아노 기로 전환시킬 수 있다. 화합물 9 상의 시아노 기는 팔라듐 촉매 및 수소 기체를 이용하여 화합물 10 상의 아미노 기로 환원시킬 수 있다. 아민 화합물 10 및 2,5-디클로로피리미딘, 화합물 7의 반응 및 질소의 병용 (또는 후속) 탈보호는 R이 H 또는 메틸 기일 수 있는 화학식 I의 화합물을 제공한다.

실시예 1

1-[4-[6-[[(5-클로로피리미딘-2-일)아미노]메틸]-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드

실시예 1의 화합물은 하기 제시된 바와 같이 방법 A 또는 방법 B 에 의해 만들어질 수 있다.

방법 A

제조예 1

1-(4-히드록시페닐)-N-메틸-메탄술폰아미드

물 (56.2 mL) 중의 1-(4-아미노페닐)-N-메틸-메탄술폰아미드 (7.5 g, 37.5 mmol)의 현탁액에 황산 (2.5 mL, 44.9 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 물 (37.5 mL) 중의 아질산나트륨 (2.8 g; 41.2 mmol)의 용액을 그 슬러리에 천천히 적가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 100℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 과량의 물로 반응을 켄칭시키고 EtOAc로 추출하였다. EtOAc 추출물을 합하고, 추출물을 염수로 세척하고; MgSO₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하여 표제 화합물을 오렌지색 고체 (6.2 g, 66%)로서 수득하였다. MS (m/z):219 (M+H₂O).

제조예 2

1-[4-(6-클로로-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드

질소 분위기 하에 DMSO (192.0 mL) 중의 1-(4-히드록시페닐)-N-메틸-메탄술폰아미드 (19.2 g, 95.4 mmol) 및 4,6-디클로로-2-메틸피리미딘 (15.6 g, 95.4 mmol)의 용액에 탄산칼륨 (26.4 g, 190.8 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 400 mL의 얼음/물 (1:1 v/v)에 넣어 침전을 유도하였다. 생성된 현탁액을 30분 동안 교반하였다. 고체를 수집하고; 물로 세척하고; 감압 하에 밤새 건조시켜 표제 화합물을 연갈색 고체 (27.7 g, 89%)로서 수득하였다. MS (m/z):328 (M+1).

제조예 3

1-[4-(6-시아노-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드

질소 기체를 DMF (266.0 mL) 중의 1-[4-(6-클로로-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드 (26.6, 81.1 mmol)의 용액을 통해 15분 동안 버블링하였다. 그 후에 시안화아연 (14.59 g, 121.2 mmol) 및 (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드 (6.76 g, 8.1 mmol)를 첨가하였다. 현탁액을 질소 분위기 하에서 유지하면서 150℃로 6시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 물 (600 mL)로 희석하고, 혼합물을 EtOAc (3 x 500 mL)로 추출하였다. EtOAc 추출물을 합하였다. 합한 추출물을 순차적으로 물 (500 mL)에 이어서 염수 (500 mL)로 세척하고; 황산나트륨 상에서 건조시키고; 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하였다. 헥산/EtOAc (1:1)로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 표제 화합물을 단리하여 표제 화합물 (18 g, 70%)을 수득하였다. MS (m/z):319 (M+1).

대안적 제조예 3

아세톤 (400.0 mL) 중의 1-(4-히드록시페닐)-N-메틸-메탄술폰아미드 (40.0 g, 165.0 mmol) 및 6-클로로-2-메틸-피리미딘-4-카르보니트릴 (26.6 g, 173.2 mmol)의 혼합물에 탄산칼륨 (325 메쉬, 46.5 g, 329.9 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 22℃에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, 고체를 아세톤으로 헹구었다. 여과물을 합하고, 세척하였다 (고체를 폐기하였다). 여과물을 농축하여 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 메틸 tert-부틸 에테르 (120 mL) 중에 슬러리화하고 여과하였다. 고체를 수집하고, 이를 메틸 tert-부틸 에테르 (80 mL)로 슬러리화한 후 여과하였다. 고체를 메틸 tert-부틸 에테르 (80 mL)로 헹구어 담갈색 고체를 수득하였다. 진공 오븐에서 40℃, 50mbar로 8시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 담갈색 고체 (52.4 g, 97%)로서 수득하였다. MS (m/z):319 (M+1).

제조예 4

1-[4-[6-(아미노메틸)-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드

파르 반응기에서, 팔라듐 (3.6g, 목탄 상 10%), 1-[4-(6-시아노-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드 (18 g, 56.5 mmol), EtOH (270 mL), EtOAc (270 mL) 및 트리에틸아민 (31.5 mL)을 합하였다. 파르 반응기를 밀봉하고 이를 수소 (400 psi)로 충전하고; 반응기를 밤새 실온에서 진탕시켰다. 반응기를 열고, 내용물을 셀라이트(CELITE)®를 통해 여과하고; 셀라이트® 패드를 EtOH (1000 mL)로 세척하고; 여과물을 수집하고; 용매를 증발시켜 표제 화합물을 갈색 고체 (11.1 g, 43%)로서 수득하였다. MS (m/z):323 (M+1).

대안적 제조예 4

파르 반응기에서, 팔라듐 (18.54g, 목탄 상 10%), 1-[4-(6-시아노-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드 (46.34 g, 141.19 mmol), 1,4-디옥산 (278 mL), EtOH (185 mL) 및 트리에틸아민 (78.7 mL)을 합하였다. 파르 반응기를 밀봉하고 이를 수소 (400 psi)로 충전하였다. 반응기를 실온에서 4.5시간 동안 진탕시켰다. 반응기를 열고, 내용물을 셀라이트®를 통해 여과하였다. 여과물을 수집하고 증발시켜 표제 화합물을 황색 고체 (23.8 g, 48%)로서 수득하였다. MS (m/z):323 (M+1). 셀라이트® 패드를 1,4-디옥산/MeOH의 혼합물 (6 x 500 mL)로 세척하고; 여과물을 수집하고; 용매를 증발시켜 표제 화합물의 제2 수확물을 황색 고체 (분홍색빛 고체, 48%)로서 수득하였다. MS (m/z):323 (M+1).

실시예 1

DMSO (111 mL) 중의 1-[4-[6-(아미노메틸)-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드 (11.1 g, 24.10 mmol) 및 2,5-디클로로피리미딘 (4.31 g, 28.92 mmol)의 용액에 플루오린화칼륨 (1.82 g, 31.33 mmol)을 첨가하였다. 120℃에서 2시간 동안 반응 혼합물을 가열하였다. 그 후에 혼합물을 실온으로 냉각시키고; 물 (200 mL)을 첨가하고; EtOAc (3 x 200 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고; 유기 추출물을 순차적으로 물 (300 mL)에 이어서 염수 (300 mL)로 세척하고; 황산나트륨 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하여 표제 화합물을 조 물질로서 수득하였다. 헥산/EtOAc (1:1) - EtOAc (100 %)의 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 표제 화합물을 정제하였다. 표제 화합물을 함유하는 적절한 분획을 수집하고, 분획을 농축하였다. 생성된 물질을 THF (200 mL) 및 EtOAc (300 mL) 중에 용해한 후, 실리아메트에스(SiliaMetS)® 티올 (9.2 g)을 첨가하여 미량의 팔라듐을 제거하였다. 55℃에서 2시간 동안 혼합물을 교반였다. 혼합물을 55℃에서 여과하고; 여과물을 수집하고; 용매를 증발시켜 고체를 수득하였다. 고체를 저온의 EtOAc (20 mL)로 연화처리하고; 고체를 여과에 의해 수집하고; 고체를 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (8 g, 75%)로서 수득하였다. MS (m/z):435 (M+1).

실시예 1에 대한 대안적 제조예

DMSO (236 mL) 중에 1-[4-[6-(아미노메틸)-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드 (23.6 g, 67.3 mmol) 및 2,5-디클로로피리미딘 (10.03 g, 67.3 mmol)을 합하였다. 22℃에서 1시간 동안 혼합물을 교반하였다. 플루오린화칼륨 (5.14 g, 87.5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃로 2시간 동안 가열하였다. 그 후에 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이를 물/얼음 (250 mL)에 넣었다. 추가의 물 (50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 초음파 조에 두었다. 생성된 고체 물질을 수집하였다. 고체를 물 (100 mL)로 슬러리화하고, 고체를 수집하여 표제 화합물을 황색 고체 (25.7 g, 82%)로서 수득하였다. MS (m/z):435 (M+1).

화합물을 플래쉬 크로마토그래피 (1500 g SiO₂ 칼럼; 용리액: 헥산/EtOAc 50:50 - 25:75; 1 L 분획, DCM/MeOH 30:1, 600 mL로 충전)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 수집하고 농축하였다. 생성된 고체를 진공 오븐에서 45℃, 5mbar로 18시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다. MS (m/z):435 (M+1).

방법 B

제조예 5

tert-부틸 N-[[4-(6-클로로-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]메틸술포닐]-N-메틸-카르바메이트

1-[4-(6-클로로-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]-N-메틸-메탄술폰아미드 (2.41 g, 4.6 mmol) (제조예 2 참조)를 DCM (10 mL) 중에 용해시키고, N,N-디메틸-4-피리딘아민 (56.6 mg, 0.46 mmol)을 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고; tert-부톡시카르보닐 tert-부틸 카르보네이트 (1.5 g, 6.8 mmol)를 첨가하고; 1시간 동안 교반하였다. 반응을 과량의 0.5 N HCl로 켄칭시켰다. 혼합물을 DCM으로 추출하였다. DCM 추출물을 합하고; 추출물을 염수로 세척하고; 황산마그네슘 상에서 건조시키고; 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하여 표제 화합물을 오렌지색 오일 (3.03g, 99.4%)로서 수득하였다. MS (m/z):428(M+1).

제조예 6

tert-부틸 N-[[4-(6-시아노-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]메틸술포닐]-N-메틸-카르바메이트

질소 분위기 하에, tert-부틸 N-[[4-(6-클로로-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]메틸술포닐]-N-메틸-카르바메이트 (2.24 g, 3.4 mmol), DMF (2 mL), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (1.9 g, 1.7 mmol) 및 시안화아연 (2.0 g, 16.8 mmol)을 합하였다. 혼합물을 90℃로 가열하고 3시간 동안 교반하였다. 반응을 물과 수산화나트륨으로 켄칭시켰다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고; EtOAc 추출물(들)을 염수로 세척하고; 황산마그네슘 상에서 건조시키고; 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 80 g의 실리카 겔을 이용하고, 0-55% EtOAc/헥산의 구배로 용리하는 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 표제 화합물을 정제하였다. 적절한 분획을 증발시켜 표제 화합물을 황색 오일 (1.2 g, 80.9%)로서 수득하였다. MS (m/z):419(M+1).

제조예 7

tert-부틸 N-[[4-[6-(아미노메틸)-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]메틸술포닐]-N-메틸-카르바메이트

파르 반응기에서, tert-부틸 N-[[4-(6-시아노-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]메틸술포닐]-N-메틸-카르바메이트 (400 mg, 0.96 mmol), 트리에틸아민 (290 mg, 2.9 mmol), MeOH (20 mL) 및 EtOAc (20 mL)를 합하였다. 탄소 상 5% 팔라듐 (203 mg, 0.096 mmol)을 첨가하였다. 파르 반응기를 밀봉하고, 이를 수소 (345 kPa)로 가압하였다. 반응기를 17시간 동안 주위 온도에서 진탕시켰다. 반응기를 감압하고 열었다. 추가량의 탄소 상 5% 팔라듐 (200 mg, 0.094 mmol)을 첨가하고; 반응기를 수소 (414 kPa)로 재가압하고, 반응기를 주위 온도에서 유지하면서 추가 17시간 동안 진탕시켰다. 반응기를 감압하고 열었다. 내용물을 규조토를 통해 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. 정제하기 위해, 톨루엔을 첨가하고 감압 하에 농축하여 오렌지색-적색 잔류물을 수득하였다. 톨루엔 첨가 및 제거를 3회 반복하여 표제 화합물을 분홍색 고체 (0.57 g, 98.8%, 70% 순도)로서 수득하였다. MS (m/z):423(M+1).

실시예 1

DMSO (10 mL) 중의 tert-부틸 N-[[4-[6-(아미노메틸)-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]메틸술포닐]-N-메틸-카르바메이트 (280 mg, 0.46 mmol) 및 2,5-디클로로피리미딘 (69.1 mg, 0.46 mmol)의 용액에 플루오린화칼륨 (53.9 mg, 0.93 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 120℃로 가열하고 그 온도에서 17시간 동안 이를 교반하였다. 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 반응을 물로 켄칭시켰다. 생성된 혼합물을 EtOAc로 추출하고; 추출물(들)을 합하고; 추출물을 황산마그네슘으로 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하여 잔류물을 수득하였다. EtOAc/헥산 (0-100%)의 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 표제 화합물을 정제하였다. 0-10% MeOH/DCM의 구배로 용리하는 제2 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 표제 화합물을 추가로 정제하였다. 적절한 분획을 감압 하에 농축하여 표제 화합물을 유리질 황색 고체 (90 mg, 44.6%)로서 수득하였다. MS (m/z):435(M+1).

실시예 2

[4-[6-(아미노메틸)-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]메탄술폰아미드

실시예 2의 화합물은 하기 제시된 바와 같은 방법에 의해 만들어질 수 있다.

제조예 8

(4-히드록시페닐)메탄술폰아미드

제조예 8은 본질적으로 제조예 1, 방법 A에 의해 제조하였다. MS (m/z):205 (M+H₂O).

제조예 9

에틸 2-메틸-6-옥소-1H-피리미딘-4-카르복실레이트

아세토니트릴 (100 mL) 중의 디에틸 부트-2-인디오에이트 (25 g, 147 mmol)의 용액에 아세트아미드 히드로클로라이드 염 (13.9 g, 147 mmol)을 첨가하고; 이어서, 천천히, 혼합물에 트리에틸아민 (22.5 mL, 162 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 80℃로 가열하고 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 이를 MeOH (50 mL)로 희석하였다. MeOH/DCM (0-10%)의 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 표제 화합물을 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 갈색 고체 (7.4 g, 27.5%)로서 수득하였다. MS (m/z):183 (M+1).

제조예 10

2-메틸-6-옥소-1H-피리미딘-4-카르복스아미드

에틸 2-메틸-6-옥소-1H-피리미딘-4-카르복실레이트 (7.26 g, 39.9 mmol)를 MeOH (70 mL, 7 N) 중의 암모니아의 용액에 용해시키고, 혼합물을 주위 온도에서 17시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 흑색 고체 (5.7 g, 93.4%)로서 수득하였다. MS (m/z):154 (M+1).

제조예 11

6-클로로-2-메틸-피리미딘-4-카르보니트릴

2-메틸-6-옥소-1H-피리미딘-4-카르복스아미드 (46 g, 140 mmol)를 염화 포스포릴 (32.5 mL, 349 mmol)과 합하고; 혼합물을 100℃로 가열하고; 17시간 동안 교반하였다. 잉여량의 염화 포스포릴을 감압 하에 제거하여 흑색 슬러리를 수득하였다. 천천히 슬러리를 물 (700 mL)에 첨가하고, 혼합물을 셀라이트®를 통해 여과하였다. 여과물을 Et₂O로 추출하였다. 추출물을 합하고; 황산마그네슘으로 건조시키고; 휘발성 용매를 여과물에서 감압 하에 제거하여 흑색 고체를 수득하였다. MeOH/DCM (0-10%)의 구배로 용리하는 실리카 겔 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 표제 화합물을 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 황색 고체 (2.5 g, 12%)로서 수득하였다. MS (m/z):154 (M+1).

제조예 12

[4-(6-시아노-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]메탄술폰아미드

6-클로로-2-메틸피리미딘-4-카르보니트릴 (628 mg, 4.1 mmol)을 질소 분위기 하에 실온에서 DMF (15 mL) 중에 용해시켰다. 이 용액에 (4-히드록시페닐)메탄술폰아미드 (859 mg, 4.1 mmol) 및 탄산칼륨 (1.13 g, 8.2 mmol)을 첨가하였다. 주위 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 염수 용액에 넣고, EtOAc로 추출하였다. 추출물을 합하고; 황산마그네슘 상에서 건조시키고; 여과하고; 여과물을 감압 하에 농축하여 표제 화합물 (80% 순도, 1.5 g, 96.4%)을 수득하였다. MS (m/z):305 (M+1).

대안적 제조예 12

22℃에서 아세토니트릴 (605 mL) 중에 (4-히드록시페닐)메탄술폰아미드 (55 g, 269.1 mmol) 및 6-클로로-2-메틸피리미딘-4-카르보니트릴 (45.5 g, 296 mmol)을 합하였다. 혼합물을 5분 동안 초음파 조에 두고, 22℃에서 10분 동안 교반하였다. 이 용액에 탄산칼륨 (325 메쉬) (75.9 g, 538.2 mmol)을 첨가하고, 22℃에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 고체를 아세토니트릴 (3 x 150 mL)로 헹구었다. 여과물을 농축하여 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 메틸-tert-부틸 에테르 (200 mL) 중에 슬러리화하고, 고체를 수집하였다. 고체를 메틸 tert-부틸 에테르 및 물 (2 x 200 mL)로 헹구었다. 고체를 수집하고, 습윤 고체를 진공 오븐에서 45℃, 15mbar로 건조시켜 표제 화합물을 고체 (67.21g, 79%)로서 수득하였다. MS (m/z):305 (M+1).

제조예 13

제조예 13은 본질적으로 제조예 7 (또는 4)의 방법에 의해 제조하였다. MS (m/z):309 (M+1).

파르 반응기에서 트리에틸아민 (117.83 mL) 및 목탄 상 10% 팔라듐 (20.10 g)을 1,4-디옥산 (469 mL) 및 EtOH (201 mL; 159.05 g)의 혼합물 중의 [4-(6-시아노-2-메틸-피리미딘-4-일)옥시페닐]메탄술폰아미드 (67 g, 211.35 mmol)의 용액에 합하였다. 혼합물을 22℃에서 유지하였다. 반응기를 밀봉하고, 이를 수소 (400 PSI)로 가압하였다. 반응기를 22℃에서 유지하면서 18시간 동안 진탕시켰다. 그 후에 반응기를 열고, 고체를 여과하였다. MeOH (1 L), 디옥산/MeOH의 1:1 혼합물 (1 L) 및 MeOH (3 x 1 L)로 고체 잔류물을 헹구었다. 여과물을 수집하고 농축하여 고체를 수득하였다. 고체를 수집하고 진공 오븐 (45℃, 15mbar)에서 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체 (62.41 g, 77%)로서 수득하였다. MS (m/z):309 (M+1).

실시예 2

실시예 2는 본질적으로 상기 실시예 1에 대한 방법 A의 최종 단계에 의해 제조하였다. MS (m/z):421 (M+1).

실시예 2에 대한 대안적 제조예

22℃에서 2,5-디클로로피리미딘 (24.76 g, 162.9 mmol)을 디메틸 술폭시드 (620 mL) 중의 [4-[6-(아미노메틸)-2-메틸-피리미딘-4-일]옥시페닐]메탄술폰아미드 (62 g, 162.9 mmol; 62.00 g)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반하고 플루오린화칼륨 (10.51 g, 179.1 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 120℃로 2 시간 동안 가열하고; 이어서, 이를 22℃로 냉각시켰다. 혼합물을 물-얼음 (1.2 L)에 넣고, 현탁액을 여과하였다. 고체를 수집하고, 이를 물 (100 mL) 중에 슬러리화한 후 고체를 수집하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (1500 g 칼럼; 용리액 : DCM/MeOH 100:0 내지 95:5; 1 L 분획, DCM/MeOH 80:20 (500 mL)로 충전)를 통해 이 고체를 정제하였다. 적절한 분획을 수집하고 농축하여 고체를 수득하였다. 고체를 이소프로필 알콜 (250 mL) 중에 슬러리화하고, 생성된 현탁액을 5분 동안 초음파 조에 두었다. 고체를 수집하고, 이를 이소프로필 알콜로 헹구어 연황색 고체를 수득하였다. 다시 고체를 이소프로필 알콜 (600 mL) 중에 현탁하고, 현탁액을 5분 동안 초음파 조에 두었다. 알콜 현탁액을 80℃에서 회전증발기를 통해 농축하였다. 고체를 수집하고 1시간 동안 진공 (0.5mbar, 22℃) 하에 건조시켰다. 고체를 EtOH (600 mL)에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 초음파 조에 두었다. 혼합물을 60℃에서 회전증발기를 통해 농축하였다. 황색 고체를 수집하고 1시간 동안 진공 (0.5mbar, 22℃) 하에 건조시켰다.

고체를 EtOH (680.2 mL) 중에 현탁하였다. 생성된 현탁액을 95℃로 가온하고, 디메틸 술폭시드 (331.1 mL)를 첨가하여 투명한 황색 용액을 수득하였다. 질소 분위기 하에 딘-스타크/환류 응축기를 사용하여 용매를 증류시킴으로써 EtOH (680 mL)로 물을 제거하였다. 추가의 EtOH (680 mL)를 첨가하여 나머지 물을 공비 제거할 수 있었다. 그 후에 물 (421.8 mL)을 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 22℃로 냉각시키고, 18시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하였다. 고체를 수집하고 물 (2 x 100 mL)로 헹구었다. 고체를 진공 (10mbar, 40℃, 18 h) 하에 건조시켜 표제 화합물을 황색 고체 (41.3 g, 61%)로서 수득하였다. MS (m/z):421 (M+1).

일반 생물학

아테롬성동맥경화성 혈관 질환은 산업 사회에서 사망률 및 이환율의 주요 원인 중 하나로 남아 있다. 그 질환의 널리 알려진 위험 인자 중 하나는 순환계에서의 저밀도 지단백질 (LDL) 콜레스테롤의 고농도이다. 주요 치료제 부류인 스타틴을 비롯한 LDL 콜레스테롤을 낮추는 치료제의 다양한 부류의 유용성에도 불구하고, 주요 심혈관 사건의 발생률은 관상동맥 심장 질환 (CHD)을 갖는 환자에서 높은 채로 남아 있다. 게다가 가장 유효한 요법인 스타틴에 불내성이 있는 환자의 하위세트가 있다 (Gotto, A.M., and Moon, J.E., Nature Rev. Cardiol., (2013) 10:560-570). 그러한 부류로부터의 화합물은 주로 LDL 수용체의 상향 조절 및 LDL의 간으로의 후속 재흡수에 의해 LDL 콜레스테롤을 낮춘다. 대안적, 및 잠재적으로 동등하게 효과적인 방법은 순환계에서 결과적으로 LDL로 전환되는 초저밀도 지단백질 (VLDL)의 분비를 낮출 것이다. 2가지의 새로운 치료제 부류인 마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질 (MTP)의 억제제, 로미타피드 및 ApoB의 합성 억제제, 미포메르센은, 둘 다 VLDL의 분비를 감소시키는데, LDL 콜레스테롤을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 그들 치료제는 각각 그들의 유용성을 제한하는 유해 사례와 연관되어 있다. 특히, 로미타피드를 사용하는 요법은 간 지방 함량의 8배 증가와 연관된다. 대조적으로, DGAT2의 억제는 간에서 트리글리세리드의 생산을 감소시킬 것이며, 이는 결국 VLDL 분비의 감소와 LDL 콜레스테롤의 후속 강하로 이어질 것이다. 게다가, 미국 심장 협회로부터의 과학적 진술은 잔여 심혈관 위험을 감소시키는 수단으로서 상승된 트리글리세리드의 치료적 표적화를 지지한다 (Miller, M. et al., Circulation (2011) 123:2292-2333). DGAT2의 억제는 순환 트리글리세리드를 강하시킬 것이고, 따라서 심혈관 사건에 대한 추가적인 보호를 제공할 것이다.

디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 2 ( DGAT2 ) 생화학적 검정

인간 DGAT2에 대한 화합물의 시험관내 억제 활성을 본 검정에서 평가하였다. 본 검정은, 유전자 조작된 곤충 SF9 세포에서 발현시키고 친화성 크로마토그래피를 통해 정제한, 아미노 말단에 FLAG 태그를 갖는 재조합 인간 DGAT2를 사용하였다.

DGAT2는 아실-조효소 A에서 디아실글리세롤로의 아실 모이어티의 전달을 촉매하여 트리아실글리세롤을 형성한다. 본 검정의 이러한 특정한 실시양태에서 올레에이트가 전달되는 아실 모이어티로서 사용된다. 모든 지질 성분의 혼화를 용이하게 하기 위해, 본 검정에 사용된 모든 지질은 유일한 아실 기로서 올레일 모이어티를 함유하였다.

검정을 시작하기 전에, 디올레오일 글리세롤 (DOG) 및 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC)의 혼합물을 3:7의 몰비로 제조하였다. 보로실리케이트 유리 시험 튜브에서 클로로포름에 용해된 적절한 양의 DOPC 및 DOG를 혼합하였다. 용매를 아르곤의 스트림 하에 증발시켜 지질의 필름을 형성하였다. 후속적으로, 시험-튜브를 2시간 동안 진공 (<1 Torr) 하에 두어 잔류 용매를 제거하였다. 적절한 양의 트리스HCl (pH 7.5, 150 mM) 및 수크로스 (250 mM)를 함유하는 완충제를 첨가하여 총 지질의 20 mM 농도를 달성하였다. 격렬한 볼텍싱에 의해 지질 필름을 완전히 현탁되도록 하였다. 튜브 내용물을 현탁액이 혼탁한 상태에서 투명한 상태로 전환될 때까지 정상파 조건 하에 수조 소니케이터에서 초음파처리하여, 리포솜이 소형 단층 소포 (SUV)로 전환되도록 하였다.

시험 화합물을 DMSO 중에 용해시키고 반-로그 증분으로 연속적으로 희석하여 제조하였다. 각 농도마다 DMSO 중의 화합물 용액을 트리스HCl (pH 7.5, 150 mM) 및 수크로스 (250 mM)를 함유하는 완충제에 10배 단계로 희석하였다.

SUV 현탁액 및 화합물 용액을 본 검정의 다른 성분들과 혼합하여 개별적 성분의 하기 농도를 달성하였다: 30 μL 총 부피에서, 1 nM 내지 100 μM 범위의 시험 화합물 농도로, 트리스HCl (pH 7.5, 150 mM), 수크로스 (250 mM), MgCl₂ (5 mM), 디티오트레이톨 (DTT) (0.5 mM), 올레오일 조효소 A (올레오일-CoA) (12 μM), 1-¹⁴C 올레오일 조효소 A (올레일-CoA-¹⁴C) (8 μM), 디올레오일 글리세롤 (DOG) (0.6 mM), 및 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC) (1.4 mM), DGAT2 단백질 (0.5 nM), DMSO (1%, v/v). 반응물을 실온 (대략 21℃)에서 1시간 동안 384-웰 플레이트의 개별적 웰에서 인큐베이션하였다. 1시간 후에 이소프로판올:EtOH:헵탄:DI수:1 N NaOH (59:12.5:15:11:2.5, 부피비)의 혼합물을 함유하는 23μl 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 42 μL 마이크로신트 E를 첨가하고, 이어서 혼합물을 밤새 인큐베이션하여 트리글리세리드를 신틸런트(scintillant)를 함유하는 유기 용매 층으로 추출하였다. 퍼킨-엘머 탑카운트(Perkin-Elmer TopCount) 기기를 이용하여 방사능을 측정하였다. 반응 혼합물에 효소 또는 시험 화합물을 포함시키지 않고 상기 절차를 반복함으로써 반응에 대한 배경 측정값을 확립하였다. 각각의 화합물에 대해 10가지의 상이한 농도에서 방사능을 측정함으로써 DGAT2의 억제 정도를 계산하였다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 핏을 이용하여 각각의 화합물에 대한 IC₅₀을 결정하였다. 실시예 1 및 2에 대해 계산된 IC₅₀ 값의 기하 평균은 표 1에 수록하였다. 표 1에 수록된 데이터는 실시예 1 및 2 둘 다가 시험관내 완충제 검정에서 인간 DGAT2를 억제함을 입증하였다.

<표 1>

디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 2 ( DGAT2 ) 세포-기반 검정

세포 환경에서 인간 DGAT2에 대한 화합물의 억제 활성을 본 검정에서 평가하였다. 본 검정은 인간 간세포암 세포주인 HepG2를 아실트랜스퍼라제 활성의 공급원으로 사용하였다.

HepG2 세포주는 생체내 인간 간세포에서 발생하는 대사 반응에 대해 통상적으로 사용되는 모델이다. 이 세포주에서의 트리글리세리드의 합성에 이어서 동위원소 표지된 올레에이트의 트리올레인 (3개 올레오일 모이어티를 갖는 트리글리세리드)으로 혼입을 측정한다.

HepG2 세포를 사전에 폴리-D-리신으로 코팅된 96-웰 마이크로플레이트에 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 갖는 100 μL 최소 필수 배지 (MEM) 중 50,000개 세포/웰의 양으로 분배하였다. 37℃에서 16시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. 세포 배양 배지를 2% 소 혈청 알부민을 함유하는 MEM으로 대체하였다. 시험 화합물을 0.5% DMSO중에 용해시키고 반-로그 증분으로 연속 희석물을 제조하였다. 연속적으로 희석된 시험 화합물을 개별 웰에 첨가하였다. 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에 세포 배양 배지를 동일한 조성이나, 50 μM ¹³C₁₈-올레에이트 및 300 μM 히드로프로필-β-시클로덱스트린을 포함하는 배지로 대체하였다. 37℃에서 추가 4시간 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트를 뒤집어 웰의 액체를 따라낸 후, 종이 수건으로 웰로부터 임의의 잔류 배지를 흡수함으로써 세포 배양 배지를 폐기하였다. 주위 온도 (~21℃)에서 10분 동안 마이크로플레이트를 건조시켰다. 각 웰에 125 μL 용매 (이소프로필 알콜:테트라히드로푸란:메탄올:클로로포름, 90:10:2.5:2.5 v/v 비), 포스파티딜콜린 (PC)에 대한 내부 표준, 및 트리아실글리세롤 (TG)에 대한 내부 표준의 분취물을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 주위 온도에서 30분 동안 진탕시켰다. 각 웰의 상부 상의 100 μL 분취물을 딥-웰 플레이트 (웰 당 2 mL)의 웰로 옮겼다. 질량-분광측정법 분석을 이용하여 웰의 내용물을 분석하였다. 단일 ¹³C₁₈-올레에이트 모이어티를 갖는 트리올레인 및 POPC 둘 다를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 방법 (LC/MS)를 이용하여 측정하였다. 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린 (POPC)의 농도로 정규화된, 단일 ¹³C₁₈-올레에이트 모이어티의 트리올레인으로의 혼입의 정도는 DGAT2 활성의 척도로 사용하였다.

4 파라미터 로지스틱 곡선 핏을 이용하여, 각각의 화합물에 대한 IC₅₀을 결정하였다. 실시예 1 및 2에 대해 계산된 IC₅₀ 값의 기하 평균은 표 2에 수록하였다. 표 2에 수록된 데이터는 실시예 1 및 2 둘 다가 세포 기반 검정에서 인간 DGAT2를 억제함을 입증하였다.

<표 2>

생체내 약역학적 검정.

본 검정은 비히클 용액 단독으로 처리된 대조군 동물과 비교하여 시험 화합물로 처리된 마우스에서의 혈장 트리글리세리드의 감소를 측정함으로써 화합물의 효력을 측정하였다. 수컷 C57BL6 마우스 (10-11주령, 각각 약 22 g 중량)가 본 검정에 사용되었다.

간에서 합성된, 트리글리세리드는 초저밀도 지단백질 (VLDL)의 성분으로서 순환계로 분비된다. 지단백질 리파제 (LPL)에 의한 순환계에서의 트리글리세리드의 분해를 방지하기 위해, 본 검정은 LPL의 활성을 억제하는 세제인 틸록사폴의 IV 주사를 이용하였다. 또 다른 효소인 DGAT1이 간 트리글리세리드의 합성에 참여하기 때문에, DGAT1 억제제 (소듐 {트랜스-4-[4-(4-아미노-7,7-디메틸-7H-피리미도[4,5-b][1,4]옥사진-6-일)페닐]시클로헥실}아세테이트, IUPAC ACDLABS 명명 규정, 문헌 [Dow et al. Bioorg. & Med. Chem., (2011) 21(20), 6122-6128] 참조)의 포화 용량이 또한 본 검정에 사용되었다.

10 mL/kg 화합물 현탁액 및 3 mg/kg 용량의 DGAT1 억제제가 투여되도록, 적합한 비히클 중의 DGAT1 억제제와 혼합된 시험 화합물 (DGAT2 억제제)의 현탁액을 제조하였다. 이러한 세트의 실험에서 비히클은 정제수 중의 1% 히드록시에틸셀룰로스, 0.25% 폴리소르베이트 80 및 0.05% 소포제였다. 처리 전 4시간 동안 마우스를 단식시켰다. 시험 화합물 (DGAT2 억제제)의 현탁액을 0.1 내지 10 mg/kg 범위의 5회 용량으로, DGAT1 억제제의 3 mg/kg 용량과 함께 시험 마우스에 위관영양에 의해 투여하였다. 유사하게 한 세트의 대조군 마우스에게는 비히클 (10 mL/g)을 단독으로 투여하였다. 30분 후, 각 마우스에게 안와후 주사에 의해 400 mg/kg 용량의 틸록사폴을 투여하였다. 추가 30분 후에, 마우스를 CO₂로 안락사시켰다.

혈액을 심장 천자를 통해 항응고제 EDTA를 함유하는 튜브에 수집하였다. 혈액을 3,000 g에서 10분 동안 원심분리한 후 혈장을 수집하였다. 혈장 샘플을 분석할 때까지 드라이 아이스 상에서 동결시켰다. 웨트 아이스를 사용하여 샘플을 해동시켰다. 자동화 임상 화학 분석기를 이용하여 혈장에서 트리글리세리드의 농도를 결정하였다. 시험 마우스에서의 총 트리글리세리드 감소는 대조군 마우스에서의 트리글리세리드 농도와 비교하여 계산되었다. 실시예 1 및 2에 대한 결과는 하기 표 3에 수록하였다. 표 3의 데이터는 실시예 1 및 2가 혈장 트리글리세리드의 농도를 감소시킴을 입증하였다.

<표 3>

생체내 효능 모델

본 검정은 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL-c), 초저밀도 지단백질 콜레스테롤 (VLDL-c), 및 트리글리세리드 (TG)의 감소를 측정함으로써 화합물의 효력을 측정하였다. 수컷 LDL 수용체-결핍 마우스 (29주령, 각각 약 30 g 중량)가 본 검정에 사용되었다.

LDL 수용체 결핍 마우스는 LDL 콜레스테롤의 임의의 측정된 감소가 간에서 LDL의 LDL-수용체 매개 흡수와 독립적으로 달성됨을 입증하였다.

마우스에게 투여 전 2주 동안 표준 마우스 사료 식이를 공급하였다. 화합물을 아카시아에 0.3, 1, 및 3 mg/mL로 현탁하여 경구 위관영양을 위한 시험 용액을 제조하였다. 마우스를 시험군 및 대조군으로 분리하였다. 그 후에 제3주의 제1일에 시험군의 마우스에게 시험 용액을 14일 동안 (BID) 투여하였다. 어떠한 시험 화합물도 없이 단독 비히클만을 대조군의 마우스에게 유사하게 투여하였다. 최종 투여 4 시간 후에 마우스를 CO₂로 안락사시켰다. 심장 천자를 통해 즉시 혈액을 수집하였다. 혈청을 단리하여 개별 지단백질 분획에서 콜레스테롤 뿐만 아니라 혈청 트리글리세리드를 측정하였다. 공지된 HPLC 방법에 의해 지단백질 분획을 분리하였다. 표준물로서 기지의 콜레스테롤 농도를 갖는 단리된 지단백질 분획을 이용하여, 비색 방법 (로슈 (Roche) 콜레스테롤/HP 시약 11875540)에 의해 각각의 지단백질 분획과 연관된 콜레스테롤 농도를 측정하였다. 최고 용량인 30 mg/kg BID에서 얻어진 결과는 시험군 마우스의 LDL-c, VLDL-c 및 TG 혈청 농도를 대조군 마우스에 비교하여 변화의 백분율로서 나타내었다. 실시예 1의 결과는 표 4에 수록하였다. 결과는 실시예 1이 LDL-c, VLDL-c 및 TG 혈청 농도를 감소시킴을 입증하였다.

<표 4>

표 5에 수록된 결과는 실시예 2도 또한 LDL-c, VLDL-c 및 TG 혈청 농도를 감소시킴을 입증하였다. 30 mg/kg 용량에서 실시예 2의 흡수를 가능하게 하기 위해서, 화합물을 아카시아 비히클의 첨가 전에 히드록시프로필 메틸셀룰로스와의 1:1 (w/w) 건조 혼합물로서 제조하였다.

<표 5>

치료하는 의사 또는 다른 의료인은 치료를 필요로 하는 사람의 치료를 위한 화합물의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 바람직한 제약 조성물은 경구 투여를 위한 정제 또는 캡슐로서 제제화될 수 있다. 정제 또는 캡슐은 심혈관 질환, 이상지혈증, 아테롬성동맥경화증 또는 고트리글리세리드혈증을 위한 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 유용한 양의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 예시 화합물은 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합되어 사용될 수 있다.

예시 화합물은 심혈관 질환을 치료하기 위해 사용되는 추가의 치료제, 예컨대 니아신, 아스피린, 스타틴, CETP 억제제 및 피브레이트와 조합될 수 있다. 스타틴의 예는 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴을 포함한다. 피브레이트의 예는 베자피브레이트, 시프로피브레이트, 클로피브레이트, 겜피브로질, 및 페노피브레이트를 포함한다.

예시 화합물 및 추가의 치료제(들)은 동일한 전달 경로 및 장치, 예컨대 단일 환제, 캡슐, 또는 정제를 통해 함께 투여되거나; 또는 개별 전달 장치로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

상기 식에서 R은 H 또는 -CH₃이다.
제1항에 있어서, R이 H인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서, R이 -CH₃인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 중 적어도 1종을 포함하는 제약 조성물.
하기 화학식 3의 화합물을
<화학식 3>

하기 화학식 4의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는,
<화학식 4>

하기 화학식 2의 화합물의 제조 방법.
<화학식 2>

상기 식에서 R은 H 또는 -CH₃이고,
R1은 H 또는 질소 보호기이다.
제5항에 있어서, R1이 보호기이고, 보호기를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물.
제7항에 있어서, 상기 요법이 심혈관 질환의 치료인 화합물.
제7항에 있어서, 상기 요법이 이상지혈증의 치료인 화합물.
제7항에 있어서, 상기 요법이 아테롬성동맥경화증의 치료인 화합물.
제7항에 있어서, 상기 요법이 고트리글리세리드혈증의 치료인 화합물.
고트리글리세리드혈증, 심혈관 질환, 이상지혈증 또는 아테롬성동맥경화증을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도