KR20160025026A

KR20160025026A - 가교된 히알루론산 생성물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20160025026A
Application number: KR1020167002517A
Authority: KR
Inventors: 모건 칼손; 카타리나 에즈먼
Original assignee: 갈데르마 소시에떼아노님
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2016-03-07
Also published as: CN105473623A; JP2016523303A; US20160376382A1; BR112015031457A2; JP6479783B2; US20190062461A1; MX2015017525A; RU2689559C2; AU2014301493A1; RU2016101736A3; AU2014301493B2; CA2916330A1; MX368941B; CN105473623B; RU2016101736A; US10077320B2; HK1224315A1; CN110003360A; WO2014206701A1

Abstract

히알루론산(HA)의 효율적인 가교는 제조 공정에 의해 제공된다. 본 공정에서, HA는 수용액 중에서 가교 개시에 의해 활성화된다. 미반응된 가교제는 활성화된 HA로부터 제거된다. 활성화된 HA의 가교는 부가적인 가교제의 첨가 없이, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액에서 완료된다. 생성되는 가교된 HA 생성물은 높은 유효 가교제 비율(effective cross-linker ratio) 및 다른 바람직한 특성들을 나타내며, 이로써 생성물은 의학적 수술 및 미용학적 수술에서 임플란트로서 유용해진다.

Description

가교된 히알루론산 생성물의 제조 방법{A PROCESS FOR PREPARING A CROSS-LINKED HYALURONIC ACID PRODUCT}

본 발명은 다당류 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 히알루론산(HA)을 가교시키는 새로운 방법 및 가교 HA 생성물을 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다.

의료용으로 가장 널리 사용되는 생체적합성 폴리머 중 하나가 히알루론산(HA)이다. 이는 글리코스아미노글리칸(GAG) 그룹에 속하는 자연적으로 존재하는 다당류이다. HA 및 그외 GAG는 다량의 물을 흡수하는 능력을 가진 음전하성 헤테로다당류 사슬이다. HA 및 HA 유래의 생성물은 생체의학 분야 및 미용 분야에서, 예를 들어 점조수술(viscosurgery)시 그리고 피부 충진물로서, 널리 사용된다.

흡수성 겔 또는 하이드로겔이 생체의학 분야에서 널리 사용되고 있다. 이들은 일반적으로, 폴리머를 무한정 네트워크로 화학적으로 가교함으로써 제조된다. 천연 HA와 일부 가교된 HA 생성물은 완전히 용해될 때까지 물을 흡수하지만, 가교된 HA 겔은 전형적으로, 포화될 때까지, 즉 한정된 액체 보유 용량 또는 팽윤도(팽윤도)를 가질 때까지, 소정량의 물을 흡수한다.

HA는 대부분의 살아 있는 유기체에서 분자량을 제외하고는 동일한 화학적 구조로 존재하기 때문에, 이는 최소한의 반응을 제공하며 진보된 의학적 용도를 허용한다. 생체 내에서 HA 분자의 내분해성 또는 체류 기간을 개선하기 위해서는, 이의 가교 및/또는 다른 변형이 필요하다. 더욱이, 이러한 변형은 HA 분자의 액체 보유 용량에 영향을 미친다. 그 결과, HA는 많은 변형 시도들의 대상이 되어 왔다.

생체적합성 폴리머로부터 겔의 제조 시, 높은 생체적합성을 유지하기 위해서는 낮은 가교율을 보장하는 것이 유리하다. 그러나, 종종 보다 농후한 겔이 적절한 생체의학적 효과를 가지는 데 필요하며, 이러한 경우, 생체적합성은 종종 상실될 것이다.

임플란트 등의 일부 알려진 연조직 증대 처치는 종종, 임플란트 또는 이의 일부가 원하는 처치 부위로부터 멀리 이동하는 단점을 겪게 된다.

WO 87/07898은 HA 필름의 제조 방법을 개시하고 있다. 임의의 겔 형성은, 에폭시-활성화된 HA 수용액을 필름으로 건조하는 단계를 포함하는 가교 단계까지, 방지되어야 한다. 이 방법에서, 가교 단계의 모든 다른 성분들은 휘발성이어야 하는 것이 고유하다.

WO 2004/092223은 실질적으로 에폭사이드의 제거 없이, HA와 에폭사이드 가교제의 혼합물을 건조함으로써, 가교된 HA를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

유사하게는, WO 2011/109129 및 WO 2011/109130은 비-변성 조건 하에 가교제의 존재 시 HA를 건조함으로써, HA 스레드(thread)를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

US 5,827,937은 가교율이 높은 다당류의 제조 방법을 개시하고 있다.

WO 00/046253은, 각각 가교제의 존재 하에, HA의 가교율을 증가시키기 위한, 2가지 유형의 가교 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다.

US 2007/0066816은 2개 단계에서 각각 에폭사이드 및 카르보다이이미드를 사용하여 HA 기질을 가교하는 단계를 포함하는, 이중 가교된 HA의 제조 방법을 개시하고 있다.

US 6,852,255는, HA 수용액을 가교한 다음, 가교된 HA를 예를 들어 유기 용매의 첨가에 의해 형상화하여, 가교된 HA를 석출하는 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다.

US 4,716,224는 효소적 분해에 대한 저항성이 증가된, 가교된 HA의 제조 방법에 관한 것이다. HA는 가교제의 첨가 전에 석출될 수 있다고 언급되어 있다.

KR 2007/0004159는 고체상의 HA를 유기 용매 중의 가교제로 처리함으로써, 가교된 HA를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

EP 2　199　308은 가교제의 첨가 전에, HA 분말을 수성 알코올에 분산시킴으로써, 가교된 HA를 제조하는 방법에 관한 것이다.

US 6,921,819는 다관능성 가교제가 이의 수화 동안에 고체 상태의 HA와 반응하는, HA의 가교 방법을 개시하고 있다.

본 분야에서의 이들 진전에도 불구하고, 생체적합성을 유지하지만 적절한 액체 보유 용량 및 분해 프로파일을 가진, 가교 HA 생성물의 다른 제조 방법이 요구되고 있다. 특히, 예를 들어 액체 보유 용량으로서 측정될 수 있는, 원하는 겔 강도를 가진 HA 겔 생성물을 수득하는 데 필요한 변형도를 최소화하는 것이 바람직하다.

본 발명의 목적은, 가교된 히알루론산(HA) 생성물의 새로운 제조 방법을 제공하는 것이며, 이는 하기의 요건들 중 하나 이상을 충족한다:

- 가교제의 저 혼입율

- 제한된 부반응, 예를 들어, 주변의 매질 및 할라이드 이온과의 제한된 부반응

- 조절된 반응 조건

- 양호한 공정 재현성

- 산업 공정까지의 규모 증가에 적절함

- 제한된 총 공정 시간

- 이식 시, 변형 및 이동에 저항하기에 충분한 겔 강도

- 공정 단계에서 여러 유형의 제제(예, 완충제, 염기, 산, 염)의 사용을 허용함.

본 명세서로부터 확인되는 이들 목적 및/또는 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 기본적인 목적은 낮은 액체 보유 용량 내지 중간 정도의 액체 보유 용량 또는 팽윤도로 확인되는 바와 같이 높은 겔 강도를 가지는 것과 동시에, 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도를 가진 가교 HA 생성물의 제조 방법을 제공하는 것임이 현실화되었다.

본 발명은, HA를 가진 특정 가교제에 대한 변형 효율을 조절, 즉, 원하는 강도의 겔 제조 시, 가교 절차의 효율을 조절함으로써, HA 가교 공정의 다재다능한 조절을 제공한다. 따라서, 본 발명은, HA의 화학적 변형이 매우 낮으며 원하는 강도(제한된 팽윤도)를 가진 겔이 제조될 수 있게 한다. 이는, 생체적합성으로 인한 문제를 최소화할 뿐만 아니라, HA 가교 공정의 조절을 개선하는 데에도 유리하다.

또한, 본 발명의 목적은 가교 HA 생성물의 제조 방법을 제공하는 것이며, 여기서, 결합된 가교제(들)의 많은 부분들이 (적어도) 2개의 말단에서 연결되며, 즉, 높은 가교 효율을 달성한다.

본 발명의 추가적인 목적은 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도를 가지며 동시에 낮은 액체 보유 용량이나 팽윤도 또는 중간 정도의 액체 보유 용량이나 팽윤도를 가진, 가교 HA 생성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 높은 변형저항성을 가진 가교 HA 생성물을 제공하는 것이다.

본 개시내용으로부터 확인될 이들 목적 및 다른 목적들에 있어서, 본 발명은 제1 측면에 따라, 가교 히알루론산(HA) 생성물의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은, (a) HA를 수용액 중에서 하나 이상의 다관능성 가교제와 반응시킴으로써 HA의 가교를 개시하여, 활성화된 HA를 수득하는 단계; (b) 활성화된 HA로부터 미반응된 가교제(들)를 제거하는 단계; 및 (c) 부가적인 가교제의 첨가 없이, 활성화된 HA를 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써, 활성화된 HA의 가교를 완료하여, 가교된 HA 생성물을 수득하는 단계를 포함하며; 여기서, 가교 완료 단계 (c)는 액체 석출 매질(liquid precipitating medium) 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액에서 수행된다.

본 방법은, 가교가 고체(석출된) 상태에서만 발생하기 때문에, 최종 가교 단계의 양호한 조절을 제공한다. 생성되는 생성물은, HA의 낮은 변형도에도 불구하고 낮은 팽윤도를 가진 겔이라는 점에서 독특하다. 제한된 팽윤도를 가진 겔 생성물이 이러한 낮은 변형도에서 수득될 수 있다는 점은 매우 놀랍다.

본 발명에 따른 공정의 일 구현에에서, 제거 단계 (b)는, (b1) 활성화된 HA를 액체 석출 매질에서 석출하여, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계; 및 (b2) 미반응된 가교제(들)를 석출된, 활성화된 HA를 포함하는 현탁액으로부터 제거하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 제거 하위단계 (b2)는 석출된, 활성화된 HA를 액체 석출 매질로 세정하는 단계를 포함한다. 석출된 형태의 활성화된 HA로부터의 가교제의 제거는, 매우 깨끗한 중간 산물, 즉 잔여의 미반응된 가교제가 없는 산물을 신속하게 제공하기 때문에, 유리하다. 이러한 가교제 제거 단계는 또한, 대규모 공정에 매우 유용하다.

본 발명에 따른 공정의 또 다른 구현에에서, 완료(finalizing) 가교 단계 (c)는, (c1) 활성화된 HA를 액체 석출 매질에서 석출하여, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계; 및 (c2) 부가적인 가교제의 첨가 없이, 석출된, 활성화된 HA 현탁액을 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써, 활성화된 HA의 가교를 완료하여, 가교된 HA 생성물을 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 공정의 특정 구현에에서, 액체 석출 매질은 수용성 유기 용매 65 중량% 초과, 바람직하게는 수용성 유기 용매 70-80 중량% 및 물 20 중량% 내지 30 중량%를 포함한다.

본 발명에 따른 공정의 일부 구현에에서, 수용성 유기 용매는 하나 이상의 저급 알킬 알코올, 바람직하게는 에탄올을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

본 발명에 따른 공정의 특정 구현에에서, 가교 개시 단계 (a)는 겔 형태의 활성화된 HA를 제공한다. 이러한 겔 형태는 다운스트림 단계, 예컨대 취급, 형상화, 세정 및 석출을 촉진한다.

본 발명에 따른 공정의 특정 구현에에서, 가교제는 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다관능성 가교제(들)의 바람직한 군(group)은 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄, 특히 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)로 이루어진 군이다.

본 발명에 따른 특정 구현예에서, 본 방법은, (d) 단계 (c)에서 수득된 석출된 가교 HA 생성물을 비-석출 조건으로 처리하는 단계; 및 (e) 가교된 HA 생성물을 비-석출된 형태로 분리하는 단계를 더 포함한다.

본 발명에 따른 방법의 일부 구현예에서, 본 방법은 가교된 HA 생성물을 멸균하는 단계를 더 포함한다.

제2 측면에 따르면, 본 발명은, 유효 가교제 비율이 0.35 또는 35% 이상, 바람직하게는 35-80%, 예컨대 40-80% 또는 50-80% 범위인 가교된 HA 생성물을 제공한다. 유효 가교제 비율(CrR)은, 2개(또는 그 이상)의 이당류(오로지 HA-X-HA)를 결합시킨, 총 결합된 가교제(HA-X-HA 및 HA-X)의 비율을 기술하며, 여기서, X는 가교제이다. 유효 가교제 비율은 예를 들어, HA 겔의 효소적 분해 후, LC-MS에 의해 확인될 수 있다. 일례로서, 유효 가교제 비율의 확인은 예를 들어, 아스로박터 아 우레센스(Arthrobacter aurescens) 유래의 콘드로이티나제 AC 또는 프로테우스 불 가리 스(Proteus vulgaris ) 유래의 콘드로이티나제 AB를 사용하여 HA 겔을, 주요 이당류로 이루어진 단편(△di-HA)과, 1-8개 이당류를 함유하는 결합된 가교제를 가진 단편(HA-X)으로 분해한 후, LC-MS를 이용해 HA-X 단편들을 확인함으로써 이루어질 수 있다. 그런 다음, 단편들은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리되고, 질량 분광법(MS)을 이용하여 검출될 수 있다. 본 방법은, (Kenne et al., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418)에서 언급된 원리를 이용하고, 사용되는 특정 가교제에 대한 LC-MS 획득 방법에서 HA-X 및 HA-X-HA 단편의 질량을 보정/조정함으로써, 임의의 다관능성 가교제에 대해 쉽게 조정될 수 있다.

본 발명에 따른 가교된 HA 생성물의 일부 구현예에서, 생성물은 팽윤도가 HA 1 g 당 4 mL 내지 500 mL, 바람직하게는 HA 1 g 당 15-300 mL이다.

제3 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 가교된 HA 생성물, 및 선택적으로 완충제 및/또는 장성 제제(tonicity agent)를 포함하는 수성 조성물을 제공한다.

제4 측면에 따르면, 본 발명은, 본 발명에 따른 가교된 HA 생성물 또는 이의 수성 조성물로 사전-충진된, 사전-충진된 주사기를 제공한다.

제5 측면에서, 본 발명은, 피부 충진술, 인체 윤곽술 및 안면 윤곽술과 같은 미용학적 수술, 및 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 채널 형성, 실금 치료 및 정형외과적 적용과 같은 의학적 수술에서와, 피부의 수화 및/또는 활력화를 위한, 본 발명에 따른 가교된 HA 생성물 또는 이의 수성 조성물의 용도를 제공한다.

제6 측면에 따르면, 본 발명은, 본 발명에 따른 가교 HA 생성물 또는 이의 수성 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 미용학적 수술 또는 의학적 수술을 받는 개체의 치료 방법을 제공한다.

도 1은 HA 가교에 대한 도식적인 공정을 도시한 것이다.
도 2는 HA 가교에 대한 공정의 도식적 연속을 도시한 것이다.
도 3은 최종 가교 단계에서 서로 다른 반응 시간 및 온도에 있어서, HA 입자에 대한 유효 가교제 비율(CrR)을 도시한 것이다.
도 4는 가교된 HA 겔의 열-유도성 분해를 도시한 것이다.
도 5는 가교된 HA 겔의 퍼옥시 라디칼-유도성 분해를 도시한 것이다.
구현예 목록
1. 가교된 히알루론산(HA) 생성물의 제조 방법으로서,
(a) HA를 수용액 중에서 하나 이상의 다관능성 가교제와 반응시킴으로써 HA의 가교를 개시하여, 활성화된 HA를 수득하는 단계;
(b) 상기 활성화된 HA로부터 미반응된 가교제(들)를 제거하는 단계; 및
(c) 부가적인 가교제의 첨가 없이, 상기 활성화된 HA를 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써, 활성화된 HA의 가교를 완료하여, 가교된 HA 생성물을 수득하는 단계를 포함하며;
상기 가교 완료 단계 (c)는 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
2. 구현예 1에 있어서,
상기 제거 단계 (b)가,
(b1) 상기 활성화된 HA를 액체 석출 매질에서 석출하여, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계; 및
(b2) 미반응된 가교제(들)를 상기 석출된, 활성화된 HA를 포함하는 현탁액으로부터 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
3. 구현예 2에 있어서,
상기 제거 하위단계 (b2)가 상기 석출된, 활성화된 HA를 액체 석출 매질로 세정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
4. 구현예 1에 있어서,
상기 가교 완료 단계 (c)가,
(c1) 상기 활성화된 HA를 액체 석출 매질에서 석출하여, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계; 및
(c2) 부가적인 가교제의 첨가 없이, 상기 석출된, 활성화된 HA 현탁액을 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써, 활성화된 HA의 가교를 완료하여, 가교된 HA 생성물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 액체 석출 매질이 수용성 유기 용매를 65 중량% 초과로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
6. 구현예 5에 있어서,
상기 액체 석출 매질이 수용성 유기 용매 70 중량% 내지 80 중량% 및 물 20 중량% 내지 30 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
7. 구현예 5 또는 6에 있어서,
상기 수용성 유기 용매가 하나 이상의 저급 알킬 알코올을 포함하는 것임을 특징으로 하는, 제조 방법.
8. 구현예 7에 있어서,
상기 수용성 유기 용매가 에탄올인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 가교 완료 단계 (c)에서 상기 현탁액의 pH가 9 이상인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 가교 완료 단계 (c)가 10℃ 내지 50℃의 온도에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 가교 개시 단계 (a)에서 상기 용액의 pH가 9 이상인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 가교 개시 단계 (a)가 10℃ 내지 55℃의 온도에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 가교 개시 단계 (a)가 활성화된 HA를 겔 형태로 제공하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 단계 (c)의 최종 가교 전에, 상기 단계 (a)에서 수득된 활성화된 HA의 원하는 형상을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
15. 구현예 14에 있어서,
상기 단계 (a)에서 수득된 활성화된 HA의 원하는 형상의 제조가, 상기 단계 (b)에서 미반응된 가교제(들)를 활성화된 HA로부터 제거하기 전에, 발생하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
16. 구현예 14 또는 15에 있어서,
상기 원하는 형상이, 크기가 0.1 mm 내지 5.0 mm인 입자인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
17. 구현예 14 또는 15에 있어서,
상기 원하는 형상이 스트링, 네트 또는 필름인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
18. 구현예 17에 있어서,
상기 원하는 형상이 스트링이고, 상기 스트링은 이의 길이 : 이의 폭의 비율이 5:1 이상인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 가교제가 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
20. 구현예 19에 있어서,
상기 가교제가 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
21. 구현예 20에 있어서,
상기 가교제가 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서,
(d) 상기 단계 (c)에서 수득된 석출된 가교 HA 생성물을 비-석출 조건으로 처리하는 단계; 및
(e) 상기 가교된 HA 생성물을 비-석출된 형태로 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 가교된 HA 생성물을 멸균하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
24. 유효 가교제 비율이 35% 이상인, 가교된 HA 생성물.
25. 구현예 24에 있어서,
유효 가교제 비율이 35-80% 범위인 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
26. 구현예 24 또는 25에 있어서,
팽윤도가 HA 1 g 당 4 mL 내지 500 mL인 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
27. 구현예 26에 있어서,
팽윤도가 HA 1 g 당 13 mL 내지 300 mL인 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
28. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 방법에 의해 제조되는, 가교된 HA 생성물.
29. 구현예 24 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서,
구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 따른 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
30. 구현예 24 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 HA 생성물이 크기가 0.1 mm 내지 5.0 mm인 입자 형상을 가지는 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
31. 구현예 24 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 HA 생성물이 스트링, 네트 또는 필름 형상을 가지는 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
32. 구현예 31에 있어서,
상기 형상이 스트링이며, 상기 스트링은 이의 길이 : 이의 폭의 비율이 5:1 이상인 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
33. 구현예 24 내지 32 중 어느 한 구현예에 있어서,
상기 HA 생성물이 건조된 형태인 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
34. 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 및 선택적으로 완충제 및/또는 장성 제제(tonicity agent)를 포함하는, 수성 조성물.
35. 구현예 34에 있어서,
하나 이상의 의학적 화합물(들)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 수성 조성물.
36. 구현예 35에 있어서,
상기 의학적 화합물(들)이 국소 마취제, 항염증 약물, 항생제 및 골 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 수성 조성물.
37. 구현예 36에 있어서,
상기 의학적 화합물(들)이 리도카인 하이드로클로라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 수성 조성물.
38. 미용학적 수술, 예컨대 피부 충진술, 인체 윤곽술 및 안면 윤곽술에서의, 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 또는 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 따른 수성 조성물의 용도.
39. 구현예 38에 있어서,
상기 미용학적 수술이 안면 윤곽술인 것을 특징으로 하는, 용도.
40. 피부의 수화 및/또는 활력화를 위한, 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 또는 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 따른 수성 조성물의 용도.
41. 약제 또는 의료 기기로서 사용하기 위한, 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 또는 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 따른 수성 조성물.
42. 피부 충진술, 인체 윤곽술 및 안면 윤곽술과 같은 미용학적 수술, 또는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 채널 형성, 실금 치료 및 정형외과적 적용과 같은 의학적 수술에 사용하기 위한, 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 또는 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 따른 수성 조성물.
43. 구현예 42에 있어서,
상기 미용학적 수술이 안면 윤곽술인 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
44. 피부 충진술, 인체 윤곽술 및 안면 윤곽술과 같은 미용학적 수술, 또는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 채널 형성, 실금 치료 및 정형외과적 적용과 같은 의학적 수술에 사용하기 위한 약제 또는 의료 기기의 제조에서의, 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 또는 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 따른 수성 조성물의 용도.
45. 구현예 44에 있어서,
상기 미용학적 수술이 안면 윤곽술인 것을 특징으로 하는, 용도.
46. 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 또는 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 따른 수성 조성물을로 사전-충진된, 사전-충진된 주사기(pre-filled syringe).
47. 구현예 24 내지 33 중 어느 한 구현예에 따른 가교된 HA 생성물, 또는 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 따른 수성 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 미용학적 수술 또는 의학적 수술을 받는 개체의 치료 방법.
48. 구현예 47에 있어서,
상기 미용학적 수술이 안면 윤곽술인 것을 특징으로 하는, 치료 방법.

제1 측면에 따르면, 본 발명은 매우 바람직한 특성을 나타내는 가교된 히알루론산(HA) 생성물의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은, 고체(석출된) 상에서만 발생하기 때문에, 최종 가교 단계의 양호한 조절을 제공한다. 생성되는 생성물은, HA의 낮은 변형도에도 불구하고 낮은 팽윤도를 가진 겔이라는 점에서 독특하다. 제한된 팽윤도를 가진 겔 생성물이 이러한 낮은 변형도에서 수득될 수 있다는 점은 매우 놀랍다. 많은 적용들 중에서, 이러한 방법은, 제조 공정 동안에 유지되는 예정된 형상을 가진 가교된 HA 생성물의 제조를 가능하게 한다. 본 방법은 또한, 생체적합성 성형된 가교 HA 생성물의 제조를 가능하게 한다.

다르게 언급되지 않는 한, 용어 "히알루론산" 및 "HA"는 상호호환적으로 사용되며, 다양한 사슬 길이 및 전하 상태뿐만 아니라 다양한 화학적 변형을 가진 히알루론산 또는 히알루로난의 모든 변이체 및 변이체들의 조합을 포함한다. 즉, 이 용어는 또한, HA의 다양한 히알루로네이트 염, 예컨대 소듐 히알루로네이트(NaHA)를 포함한다. HA의 다양한 변형, 예컨대 산화, 예를 들어 -CH₂OH 기의 -COOH로의 산화; 비시날(vicinal) 하이드록시기의 퍼요오데이트 산화, 선택적으로 환원 또는 이민 형성 등; 예를 들어 -COOH의 -CH₂OH로의 환원; 황화; 탈아미드화, 및 이어서 선택적으로 탈아민화 또는 새로운 산과의 아미드 형성; 에스테르화; 다양한 화합물을 사용한 치환, 예를 들어 가교제 또는 카르보이미드에 의한 치환; 상이한 분자, 예컨대 단백질, 펩타이드 및 활성 약물 성분의 HA에의 커플링; 및 탈아세틸화 또한, 이 용어에 의해 포함된다. 당업자는, 다양한 형태의 HA들이, 화학적 변형 및 분석 동안에 고려되어야 하는 서로 다른 화학적 특성들을 가짐을 잘 알고 있다. 예를 들어, 특정 pH를 가진 HA 용액을 수득하는 것이 바람직한 경우, 용해될 물질의 산성도, 용해성 액체의 산성도 및 임의의 완충 용량 모두가 용액의 결과적인 pH에 영향을 미칠 것이다.

HA 기질은 화학적 변형을 받지 않은, 즉, 본 제조 방법의 시행 전에 가교나 다른 변형을 받은 적이 없는 HA 또는 히알루로네이트 염인 것이 바람직하다.

HA는 동물 및 비-동물 기원의 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 비-동물 기원의 공급원으로는 효모, 바람직하게는 박테리아를 포함한다. 단일 HA 분자의 분자량은 전형적으로 1.5 MDa 내지 3 MDa 범위이지만, 다른 분자량 범위들, 예를 들어 0.5 MDa 내지 10 MDa도 가능하다.

본 방법에 의해 제조되는 생성물은 가교 HA이다. 본 방법은, HA 사슬 간에 가교를 제공하며, 이 가교는, 공유 결합, HA 사슬의 물리적인 꼬임 및 다양한 상호작용, 예컨대 수소 결합, 반데르발스 인력 및 정전기적 상호작용에 의해 함께 고정되는, HA 분자의 연속적인 성형된 네트워크를 형성한다. 본 발명에 따른 가교 HA 생성물은 겔 또는 하이드로겔이다. 즉, 히알루론산 생성물은 수-불용성인 것으로 간주될 수 있지만, 액체, 전형적으로 수성 액체에 놓이는 경우, HA 분자의 실질적으로 희석된 가교 시스템인 것으로 간주될 수 있다.

생성되는 가교 HA 생성물은 바람직하게는 생체적합성이다. 이는, 처치를 받은 개체에서 어떠한 면역 반응도 발생하지 않거나 또는 단지 매우 미미한 면역 반응이 발생함을 의미한다.

가교된 HA 겔 생성물들은 고도로 복잡한 화학적 구조물이기 때문에, 이들은 전형적으로, 이들의 화학적 구조와 이들의 물리적 특성의 조합에 의해 특징화된다. 비변형된 HA로부터의 화학적 구조의 편향은 전형적으로 변형도, 변형율, 가교도, 가교 지수 또는 화학적 변형으로서 보고되며, 이들은 모두 HA에 공유 결합된 가교제의 양에 관한 것이다. 본 내용 전체에서, 용어 변형도가 사용될 것이다.

가교된 HA 겔 생성물의 가장 관련 있는 물리적 특성은, 겔이 흡수할 수 있는 액체의 부피 및 겔의 유동학적 특성이다. 두 특성 모두 겔의 구조적 안정성을 기술하며, 이는 종종 겔 강도 또는 단단성으로서 지칭되지만, 액체의 흡수가 건조 겔에 대해 확인될 수 있는 한편, 유동학적 특성은 원하는 농도로 팽윤되는 겔 상에서 측정되어야 한다. 액체 흡수에 대한 전형적인 표현은 팽윤, 팽윤 능력, 액체 보유 용량, 팽윤도, 팽윤 정도, 최대 액체 흡수율 및 최대 팽윤도이다. 본 내용 전체에서, 용어 팽윤도가 사용될 것이다. 가교된 HA 겔 생성물의 유동학적 특성과 관련하여, 회전 유동측정(rotational rheometry)만이 액체의 유동성을 확인하는 데 유용한 반면, 진동 유동측정(oscillating rheometry)은 겔의 유동성을 확인하는 데 필수적이다. 이러한 측정은 탄성률 및 점성률의 유닛에서 변형에 대한 겔의 저항성을 제공한다. 높은 겔 강도는 원하는 농도로 팽윤된 겔 생성물의 변형에 대한 큰 저항성을 제공할 것이다.

임플란트 등의 일부 알려진 연조직 증대 처치는 종종, 임플란트 또는 이의 일부가 원하는 처치 부위로부터 멀리 이동하는 단점을 겪게 된다. 이러한 문제점을 피하기 위해, 겔은 변형에 저항하도록 특정 겔 강도를 가지는 것이 요구된다. 이러한 특성은 유동측정을 진동 방식으로 사용함으로써 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 3개 이상의 단계를 포함하며, 선택적으로 이로 구성된다: 최초 가교 단계 또는 가교 개시 단계, 가교제 제거 단계, 및 최종 가교 단계 또는 가교 완료 단계. 제1 가교 단계는 많은 서로 다른 온도, 시간 및 농도를 사용하여 수행될 수 있다. 변형도가 확인되고, 보다 작은 부분의 가교가 발생하는 때는 제1 가교 단계에서이다. 제1 가교가 어떻게 수행되는지와 무관하게, 유효 가교제 비율은 제2 가교 단계 동안에, 전형적으로 2 내지 6배, 또는 심지어 그 이상 증가된다.

제1 공정 단계에서, HA 기질의 가교가 개시되거나, 또는 다른 방식으로 발현되며, HA 기질의 가교 개시가 수행된다. HA 기질은 수용액에 존재하며, 하나 이상의 다관능성 가교제와 반응하게 된다. 이로써 HA 기질의 실질적인 가교가 형성되며, 즉, 2개의 서로 다른 HA 분자들 또는 동일한 HA 분자의 2개의 개별 부위들 사이의 공유 커플링이 이 단계에서 이미 달성된다. 다른 공정 단계에 대한 개시내용으로부터 확인되는 바와 같이, 가교제는 이러한 가교 개시 단계 전 또는 도중에만 첨가된다.

바람직한 구현예에서, 가교 개시 단계는 활성화된 HA를 겔 형태로 제공한다. 개별 HA 분자들 사이 또는 동일한 HA 분자의 개별 부위들 사이의 이러한 가교들 외에도, 이는 또한, 많은 가교제들이 단일 위치에서 HA 기질에 공유 커플링되게 하며, 이 단계에서의 HA는 반응성 가교 기능을 나타내는 몇몇 가교제로 치환된다. 따라서, 생성되는 활성화된 HA는 가교된 HA 분자들의 혼합물, 및 반응성 가교 기능을 나타내는, 즉, 전형적으로 여전히 반응성인 가교제를 HA에 단일 공유 커플링하는 것을 포함하는 가교제로 치환된 HA를 포함하며, 여기서, 각각의 가교는 (적어도) 2개의 개별 HA 분자들 사이 또는 동일한 HA 분자의 2개의 개별 부위들 사이의 공유 커플링을 포함한다.

HA 기질은 수용액에 용해된다. 용어 "용해된" 및 "용액"은, HA 기질이 액체와 균질한 혼합물로 존재하며, 이 혼합물에서 에너지적으로 바람직한 상호작용이 발생하는 것으로 이해된다. 액체의 용액에의 첨가는, 용해되는 HA 기질의 농도를 낮춘다. 용액이 수성이며, 즉 용액은 물을 포함한다. 수용액은 단순히 물에 용해된 히알루론산 기질로 이루어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 가교 개시 단계에서 용액의 pH는 9 이상, 예컨대 10 이상 또는 심지어 11 이상이다.

일반적으로, 가교 개시 단계는 HA 및 가교제를 임의의 농도로 사용함으로써 수행될 수 있으며, HA의 가교 개시가 달성되고, HA에 공유 부착된 반응성 가교제가 남아 있는 한, 온도 및 시간은 다양할 수 있다.

가교 개시 단계는 전형적으로, 10-75℃의 온도에서 수행되지만, 이 단계는 실온, 예를 들어 20-25℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 온도 범위는 10-55℃, 예컨대 18-35℃ 및 35-55℃이다.

가교 개시 단계의 수용액은, 다관능성인 하나 이상의 가교제(들), 즉, 가교될 HA 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 2개 이상의 반응 부위를 가진 하나 이상의 가교제(들)를 포함한다. 이러한 제3 단계에서 사용되는 가교제(들)는 이관능성인 것, 즉, 가교될 HA 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 반응 부위가 2개인 것이 바람직하다. 이로 제한하는 것은 아니지만, 유용한 다관능성 가교제로는, 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드, 예컨대 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄, 바람직하게는 BDDE를 포함한다. 하나 이상의 다관능성 가교제(들)가 에테르 가교를 제공하는 것이 바람직하다.

가교 개시 단계는, 수득된 활성화된 HA를 원하는 형상, 예컨대 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 및 비드로 제조하는 단계를 포함하거나 또는 이 단계가 후속될 수도 있다. 이는 다양한 방식들, 예를 들어 압출, 민싱(mincing) 및 성형에 의해 달성될 수 있다. HA 기질의 압출은 전형적으로, HA 기질 용액을 원하는 크기의 개구에 통과시키는 단계를 포함한다. 압출된 히알루론산 기질은 자발적으로, 석출된 섬유, 스트링 또는 가닥을 형성한다. 섬유, 스트링 또는 가닥의 치수, 예를 들어 두께는, 예를 들어, 0.1-2 mm 또는 14-30 G 범위의 다양한 개구 직경, 압출 압력, 압출 속도 및/또는 HA 농도를 사용하여, 개구의 치수 또는 유형을 다양하게 함으로써 조절될 수 있다. 다른 유형의 구멍(orifice) 및 틈(chink)을 사용함으로써, 서로 다른 형상 또는 구조가 생성될 수 있다. 예를 들어, 히알루론산은 필름, 네트, 디스크 또는 비드로서 석출될 수 있다. 다른 예로, 원하는 크기의 입자 또는 비드는, 활성화된 HA의 겔을 민싱함으로써, 예를 들어 활성화된 HA를 원하는 메쉬(개구) 크기를 가진 메쉬 물질을 통해 압축시킴으로써, 제조될 수 있다. HA는 또한, 다양한 형태로, 예를 들어 필름, 네트, 디스크 또는 비드로서 성형될 수 있다.

이러한 형상은 제조 방법 전체 동안과 최종 생성물에서 유지될 수 있다. HA 기질이 생리학적 식염수에서 팽윤된 형태로 존재하는 경우, 형상은 신장을 5 mm 미만, 바람직하게는 1 mm 미만이며, 0.5 mm 초과 또는 심지어 0.8 mm 초과로 가지는 것이 바람직하다. 바람직한 형상은 생리학적 식염수에서 완전히 팽윤되었을 때의 크기가 0.1 - 5.0 mm, 예컨대 0.5-1 mm인 입자 또는 비드이다. 섬유, 스트링, 가닥, 네트 및 필름의 경우, 각각 1차원 또는 2차원에서 5 mm보다 상당히 더 큰 치수가 이용될 수 있다.

가교 개시 및 선택적인 형상화 후, 가교제 제거 단계가 이어진다. 이 단계는 미반응된 가교제(들)를 활성화된 HA로부터 제거하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 가교 개시 단계로부터의 활성화된 HA는, 가교된 HA 분자와, 반응성 가교 기능을 나타내는 가교제로 치환된 HA의 혼합물을 포함한다. 가교 개시 단계 후, 가교제가 전혀 반응하지 않았기 때문에, 또는 가교제가 물 분자 또는 수성 매질의 다른 성분들, 예컨대 염소 이온과 반응하였기 때문에, HA에 공유 커플링되지 않는 가교제가 상당히 존재한다. 미반응된 가교제, 즉, HA에 공유 커플링되지 않는 가교제는 이 단계에서 임의의 적절한 수단, 예컨대 여과, 경사분리 및/또는 원심분리를 비롯한 투석 및 세정에 의해 제거된다. 어떠한 가교제(들)도 이 단계에 첨가되지 않는 것은 당연하다.

바람직한 구현예에서, 미반응된 가교제(들)와 연관된 활성화된 HA는, 미반응된 가교제(들)가 제거되기 전, 또는 제거되는 것과 동시에 액체 석출 매질에서 석출된다.

활성화된 HA는, HA의 용해도 감소로 인해 석출된다. 이는 전형적으로, 활성화된 HA를, 이것이 불용성인 액체 매질에 처리함으로써 달성된다. 당업자가 잘 알고 있는 바와 같이, 이는, 활성화된 HA를 석출 매질에 첨가하거나, 석출 매질을 활성화된 HA에 첨가하거나, 또는 다른 적절한 방법 단계에 의해 달성될 수 있다. 액체 석출 매질은 하나 이상의 수용성 유기 용매(들)를 HA에 대한 석출 조건을 제공하는 양으로 포함한다. 생성되는 고체 HA 석출물은 용질상으로부터 떨어져 나오고, 전형적으로 여과, 경사분리, 원심분리에 의해, 또는 한 쌍의 핀셋 등을 사용하여 수동적으로, 잔여 액체로부터 분리될 수 있다. 생성되는 현탁액은 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함한다. 미반응된 가교제(들)는 임의의 적절한 수단, 예컨대 여과, 경사분리 및/또는 원심분리를 비롯한 투석 및 세정에 의해 씻겨져 나간다. 미반응된 가교제(들)는, 석출된, 활성화된 HA를 액체 석출 매질, 전형적으로 활성화된 HA의 석출에 사용되는 것과 동일한 유형의 액체 석출 매질을 사용하여 세정함으로써, 석출된, 활성화된 HA를 포함하는 현탁액으로부터 제거되는 것이 바람직하다. 석출된 형태의 활성화된 HA로부터의 가교제의 제거는, 매우 깨끗한 중간 산물, 즉 잔여의 미반응된 가교제가 없는 산물을 신속하게 제공하기 때문에, 유리하다. 이러한 가교제 제거 단계는 또한, 대규모 공정에 매우 유용하다.

HA 또는 HA 겔이 존재하는 액체 매질에 따라, HA 또는 HA 겔은 용해 또는 팽윤된 겔 형태 또는 석출된 형태로 존재할 수 있다.

양호한 HA 용매, 즉, HA와 용매 간의 상호작용이 HA 분자들 자체 간의 상호작용보다 에너지적으로 바람직한 용매에서, HA 또는 HA 겔은 용해되거나 또는 팽윤된 겔 형태로 있을 것이다. 양호한 HA 용매의 일례는 물이다.

불량한 HA 용매 또는 HA 비-용매, 즉, HA 분자 자체들 간의 상호작용이 HA와 용매 간의 상호작용보다 에너지적으로 바람직한 용매에서, HA 또는 HA 겔은 석출된 형태로 존재할 것이다. 불량한 HA 용매의 일례는 에탄올이다.

본원에서, 용어 "액체 석출 매질"은, 활성화된 HA가 침지되는 경우 석출물로 존재하게 될 액체 매질을 지칭한다. 즉, 액체 석출 매질은 활성화된 HA에 대해 비-용매이다.

액체 석출 매질은 전형적으로, 물 및 선택적인 다른 구성분, 예컨대 염, 완충제, 염기 및 산에 용해된 수용성 유기 용매를 50 중량% 초과, 예컨대 65 중량% 초과로 포함한다. 수용성 유기 용매는 활성화된 HA의 석출을 달성하기에 충분한 농도로 존재해야 하지만, 본질적으로 과량으로는 존재하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 액체 석출 매질은 수용성 유기 용매 50 중량% 초과 및 물 50 중량% 이하, 바람직하게는 수용성 유기 용매 60-90 중량% 또는 65-85 중량% 및 물 10-40 중량% 또는 15-35 중량%를 포함하거나 또는 함유한다. 특정 구현예에서, 액체 석출 매질은 수용성 유기 용매, 추가적인 구성분, 예컨대 염, 완충제, 염기 및 산 60 중량% 이상, 바람직하게는 60-90 중량% 또는 65-85 중량%와, 총합 100 중량%가 되게 하는 양의 물을 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 유기 용매는 탄소-함유 용매이며, 다양한 극성도를 나타낼 수 있다. "용매"로 지칭되지만, 이들 유기 용매는 제조 방법 동안에 HA의 용해성을 균형 잡고 이동시키는 데 이용되는 것으로 이해되어야 한다. HA는 특정 유기 용매 농도 간격에서 유기 용매에 매우 잘 용해될 수 있지만, 유기 용매 농도가 증가되는 경우 떨어져 나와서 석출물을 형성한다. 예를 들어, HA는 유기 용매, 예를 들어 저급 알킬 알코올과 및 물의 50/50 (wt/wt) 혼합물에 용해될 수 있지만, 90/10 (wt/wt) 혼합물에서는 떨어져 나와 석출물을 형성한다. 비-석출 조건을 받는 경우, 예를 들어 50/50 또는 0/100 혼합물에서 처리되는 경우, HA는 비-석출된, 용해 상태로 되돌아간다. 당업자는, 다른 인자들, 예컨대 온도, pH, 이온 강도 및 유기 용매(들)의 유형이 HA의 석출을 제한하는 유기 용매(들) 농도에 영향을 미칠 수 있음을 잘 알고 있다. 주어진 조건 하에서 HA의 석출에 대한 제한 농도는 잘 알려져 있거나, 당해 기술분야의 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, (물과 에탄올의 혼합물에서) HA의 석출에 대한 제한 농도는 약 65 중량% 에탄올이다.

이로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 유기 용매는 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 1,4-다이옥산, N,N-다이메틸포름아미드, N,N-다이메틸아세타미드, 에틸 아세테이트, 아세타미드, 다이에틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 메틸 에틸 케톤, 아세톤, 저급 알킬 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 유기 용매는 수용성인 것이 바람직하다. 유기 용매의 바람직한 기(group)는 저급 알킬 알코올이다. 용어 저급 알킬 알코올은 탄소수 1 내지 6의 1차, 2차 및 3차 알킬 알코올, 즉, C_1-6 알킬 알코올을 포함한다. 저급 알킬 알코올의 구체적인 예로는, 메탄올, 에탄올, 변성된 증류주, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 및 t-부탄올을 포함한다. 바람직한 저급 알킬 알코올은, 가격, 입수가능성 및 용이한 취급으로 인해, 메탄올 및 에탄올, 특히 에탄올이다.

가교제 제거 단계는 또한, 수득된 활성화된 HA를 원하는 형상, 예컨대 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 또는 비드로 제조하는 것을 포함하거나 또는 이러한 제조가 후속될 수 있다. 활성화된 HA를 원하는 형상으로 제조하는 것은, 단계에서 미반응된 가교제(들)를 활성화된 HA로부터 실제로 제거하기 전에 수행하는 것이 바람직하다. 따라서, 원하는 형상의 제조는 바람직하게는, 활성화된 HA의 임의의 석출 전에 발생할 수 있다.

원하는 형상의 제조는 다양한 방식, 예를 들어 압출, 민싱 및 성형에 의해 달성될 수 있다. HA 기질의 압출은 전형적으로, 이 기질을 원하는 크기의 개구를 통해 압축시키는 단계를 포함한다. 섬유, 스트링 또는 가닥의 치수, 예를 들어 두께는, 예를 들어, 0.1-2 mm 또는 14-30 G 범위의 다양한 개구 직경, 압출 압력, 압출 속도 및/또는 HA 농도를 사용하여, 개구의 치수 또는 유형을 다양하게 함으로써 조절될 수 있다. 다른 유형의 구멍 및 틈을 사용함으로써, 서로 다른 형상 또는 구조가 생성될 수 있다. 다른 예로, 원하는 크기의 입자 또는 비드는, 활성화된 HA의 겔을 민싱함으로써, 예를 들어 활성화된 HA를 원하는 메쉬(개구) 크기를 가진 메쉬 물질을 통해 압축시킴으로써, 제조될 수 있다. HA는 또한, 다양한 형태로, 예를 들어 필름, 네트, 디스크 또는 비드로서 성형될 수 있다.

이러한 형상은 제조 방법 전체 동안과 최종 생성물에서 유지될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, HA 기질이 생리학적 식염수에서 팽윤된 형태로 존재하는 경우, 형상은 신장을 5 mm 미만, 바람직하게는 1 mm 미만이며, 0.5 mm 초과 또는 심지어 0.8 mm 초과로 가진다. 바람직한 형상은, 생리학적 식염수에서 완전히 팽윤되었을 때의 크기가 0.1 - 5.0 mm, 예컨대 0.2-3.0 mm 또는 0.5-1 mm인 입자 또는 비드이다. 특정한 다른 바람직한 구현예에서, 형상은, HA 기질이 생리학적 식염수에서 팽윤될 때, 적어도 하나의 치수에서 5 mm보다 큰 신장, 또는 상당히 더 큰 신장을 가진다. 바람직한 형상은 길이가 수 cm, 예를 들어 1-100 cm인 섬유, 스트링 또는 가닥이다. 이의 길이와 이의 폭 또는 이의 평균 직경 사이의 비율은 5:1 이상, 예컨대 100:1 이상이며, 선택적으로 10　000:1 이하, 예컨대 2500:1 이하인 것이 바람직하다.

가교제 제거 및 선택적인 형상화 후, 최종 가교 단계 또는 가교 완료 단계가 이어진다. 이 공정 단계에서, 활성화된 HA 기질의 가교가 완료된다. 가교 개시 단계에서 HA에 공유 부착되었던 가교제 중의 잔여 반응성 기들은 활성화된 HA 상의 추가적인 이용가능한 부위와 반응하여, 추가적인 가교, 즉, (적어도) 2개의 개별 HA 분자 또는 동일한 HA 분자의 2개의 개별 부위들 사이에서 공유 커플링이 달성된다. 가교 개시 단계에서 수득된 활성화된 HA의 원하는 형상은 이 가교 완료 단계 전에 만들어지는 것이 바람직하다.

이 단계가 HA의 가교를 완료하긴 하지만, 어떠한 자유 가교제 또는 비결합 가교제도 이 단계에 존재하지 않음에 주목해야 한다. 가교 개시 단계로부터의 임의의 잔여 비결합 가교제(들)는 가교제 제거 단계에서 제거되었다. 가교제는 이 단계에서 첨가되어서는 안 되며, 또는 가교 개시 단계 또는 가교제 제거 단계 이후의 임의의 단계에서도 첨가되어서는 안 된다. 최종적인 가교된 HA 생성물이 여러 가지 형상으로 가공될 수 있지만, 활성화된 HA는 최종 가교 단계 전에 원하는 형상으로 가공되는 것이 바람직하다.

활성화된 HA의 가교된 HA 생성물 내로의 가교는, 활성화된 HA를 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써 완료된다. 가교 완료 단계는 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액에서 수행된다. 이는, 유효 가교제 비율(CrR), 즉, 2개(또는 그 이상)의 이당류(오로지 HA-X-HA)를 결합시킨, 총 결합된 가교제(HA-X-HA 및 HA-X)의 비율을 개선하는 것으로 여겨진다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 처음에, HA 사슬이 서로 더 근접하게 되고, 둘째로는 석출된 HA 네트워크 내에 경쟁적인 물 분자가 국소적으로 존재하지 않기 때문일 수 있다. 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액에서 가교 완료 단계를 수행하는 것은 또한, 예를 들어, 주변의 석출 매질 및 할라이드 이온과의 부반응을 제한한다. 어떠한 부가적인 가교제도 이 단계에 첨가되지 않는다.

가교 완료란, 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액에서 가교 조건의 도입 시 발생할 가교를 의미한다. 가교 조건은, 반응성 기능을 나타내는 가교제가 활성화된 HA 상의 이용가능한 부위와 반응하여, 추가적인 가교를 달성하게 될 조건을 의미한다.

용어 최종 또는 완료는 제2 가교 단계를 제1의 개시 가교 단계와 구별하기 위해 사용된다. 가교 완료는, 2개(또는 그 이상)의 이당류(오로지 HA-X-HA)를 결합시킨, 총 결합된 가교제(HA-X-HA 및 HA-X)의 비율을 증가시킨다.

전술한 바와 같이, 활성화된 HA는, 미반응된 가교제(들)가 제거되기 전이나 또는 제거와 동시에 액체 석출 매질에서 석출될 수 있다. 다른 예로, 액체 석출 매질에서의 활성화된 HA의 석출은, 미반응된 가교제의 제거 후, 예를 들어, 활성화된 HA가 최종 가교 단계에서 추가적인 가교 조건을 받기 전에 수행된다. 따라서, 최종 가교 단계는, 활성화된 HA를 액체 석출 매질에서 석출하여, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계; 및 석출된, 활성화된 HA를 포함하는 현탁액이 추가적인 가교 조건을 받게 함으로써, 활성화된 HA의 가교를 완료하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 어떠한 부가적인 가교제도 이 단계에 첨가되지 않는다.

바람직한 구현예에서, 가교 완료 단계에서 현탁액의 pH는 9 이상, 예컨대 10 이상, 11 이상, 또는 심지어 12 이상이다.

가교 완료 단계는 전형적으로, 10-75℃의 온도에서 수행되지만, 이 단계는 실온, 예를 들어 20-25℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 바람직한 온도 범위는 10-50℃, 예컨대 18-40℃이다.

본 발명에 따른 방법은 또한, 하나 이상의 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 공정 단계는 가교 완료 단계로부터의 석출된 가교 HA 생성물을 비-석출 조건으로 처리하는 단계를 포함한다. 이는 전형적으로, 가교 HA 생성물을 액체 매질로 처리한 다음, 이를 비-석출된 상태로 되돌리는 단계를 포함한다. 액체 매질은 전형적으로 물, 식염수 또는 이들의 혼합물 및/또는 조합물이며, 선택적으로 유기 용매, 예를 들어 메탄올 또는 에탄올을 비-석출 농도로 포함하고 있다.

가교로 인해, 생성되는 HA 생성물은 상호연결되고 꼬인 HA 사슬의 연속 네트워크이며, 이는 비-석출 조건 하에 액체를 흡수하며(팽윤되며), 겔을 형성한다. 팽윤은, 겔이 완전히 팽윤되어 더이상 액체가 흡수될 수 없을 때까지 진행시킬 수 있거나, 또는 팽윤은, 부분적으로 팽윤된 겔을 수득하기 위해 조금 더 이른 단계에서 방해를 받을 수 있다. 부분적으로 팽윤된 겔은 겔의 추가적인 가공을 위한 중간산물로서 유용할 수 있으며, 예를 들어, 원하는 크기 및 형상을 가진 겔 구조의 추가적인 기계적 제조가 수행될 수 있다. 예를 들어, 필름은 입자, 슬라이스 또는 조각으로 절단될 수 있으며, 겔 섬유는 보다 짧은 단편들로 절단될 수 있으며, 잘 규정된 불규칙한 형상은 필름 등으로 디자인 될 수 있다. 가교된 HA 섬유, 스트링 또는 가닥은 또한, 가교 완료 후, 건조 전 또는 후에, 함께 짜여져서, 네트 또는 필름을 형성할 수 있다. 또한, 투여를 용이하게 하고 환자의 불편을 최소화하며, 잔여 팽윤 용량의 사용에 의해 이동 용량을 증강시키기 위해, 부분적으로 팽윤된 성형 겔 생성물을 이의 임플란트 동안에 원하는 부위에서 사용하는 것이 편리할 수 있다.

성형된 겔 생성물이 과량의 액체 내에서 비-석출 조건을 받는 경우, 이의 최대 팽윤도(SwD)를 확인하거나, 또는 역으로 이의 최소 HA 농도(C_min), 즉, 겔 생성물이 완전히 팽윤될 때의 HA 농도를 확인하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 제조 방법을 사용하면, HA 1 g 당 4 mL 내지 500 mL, 바람직하게는 HA 1 g 당 15-300 mL의 팽윤도를 수득하는 것이 가능하다. 이는, C_min 값 범위가 0.2-25% (w/w), 즉, 2-250 mg/g, 예컨대 0.3-7% (w/w), 즉, 3-70 mg/g임을 의미한다. 원하는 팽윤도(또는 C_min 값)는 최소의 변형도로써 달성될 수 있지만, 팽윤도를 조절하는 전형적인 방식은 변형도의 다양화에 의한 것임이 매우 유리하다. 따라서, 본 제조 방법은 성형된 겔 생성물의 팽윤 용량을 조절하는 새로운 개념을 제공하며, 이러한 조절은 놀랍게도, 겔의 낮은 변형도와 관련하여 높은 C_min 값(낮은 팽윤도)을 가진 단단한 성형 겔이 생성될 수 있게 한다.

변형 효율(MoE)은, 겔의 최소 HA 농도(C_min) 또는 강성도/강도와, 가교제(들)에 의한 화학적 변형도(MoD) 사이의 비율의 측정값이다. 본 발명에 따른 제조 방법을 사용하면, 변형 효율은 2 이상, 바람직하게는 3-500, 예컨대 5-200 또는 70-100 범위인 가교된 HA 생성물을 수득하는 것이 가능하다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 겔의 유리한 특성은 효과적인 가교가 매우 높은 정도로 이루어진 결과이며, 즉, 결합된 가교제(들) 중 많은 비율(유효 가교제 비율이 전형적으로 35% 이상, 예컨대 40% 이상 또는 심지어 50% 이상임)이 사실상 2개(또는 그 이상의) 부위에서 HA에 결합되어 있으며, 이와 더불어 원하는 목적을 위한 가교의 효과적인 위치화와, 가능하게는 극히 높은 정도의 꼬임 유지의 결과인 것으로 생각된다. 당업자가 생성되는 HA 생성물의 낮은 변형도로부터 예상하는 것과는 달리, 본 발명에 따른 방법은 놀랍게도, 높은 강성도/강도를 가진 겔을 제공한다. 임의의 상황 하에, 본 발명에 따른 방법은 변형도와 관련하여 팽윤도를 추가적으로 조절하는 유용한 방식을 제공한다.

선택적으로, 본 제조 방법은 또한, 가교된 HA 생성물을 분리하는 단계를 포함한다. 생성물이 석출 조건 하에 유지되거나 또는 비-석출 조건을 받았는지의 여부에 따라, 이 단계는 생성물을 석출된 형태 또는 비-석출된 형태로 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 다음, 분리된, 석출 또는 비-석출된 생성물은 멸균, 예를 들어 오토클레이브, 방사선 조사, 가열 등 처리되어, 멸균된 가교 HA 생성물이 수득될 수 있다.

바람직한 경우, 가교된 HA 생성물이 수득된 후, 다른 성분들, 예컨대 국소 마취제(예, 리도카인 하이드로클로라이드), 항염증 약물, 항생제 및 다른 적절한 보조 약제, 예를 들어 골 성장 인자 또는 골 성장 세포가 첨가될 수 있다.

이하 도면을 참조로 하면, 가교된 HA 생성물의 일부 바람직한 제조 공정이 도 1 내지 도 2에 도식적으로 예시되어 있다. 도 1에 도시된 공정 단계들의 각각의 조합(1a-1f)은 가교된 HA 생성물을 제공하지만, 이들 중 임의의 것은 또한, 도 2(2a-2d)에서 점선 화살표로 예시되고 나타낸 바와 같이 추가적인 다운스트림 공정 단계들의 임의이 조합과 조합될 수 있다.

가장 일반적인 공정은 도 1a에 예시되어 있으며, 여기서, HA의 가교는, HA를 수용액 중에서 다관능성 가교제와 반응시켜 활성화된 HA를 수득함으로써 개시된다. 임의의 미반응된 가교제는 활성화된 HA로부터 제거된다. 활성화된 HA의 가교는, 부가적인 가교제의 첨가 없이, 석출된 형태의 활성화된 HA를 액체 석출 매질의 현탁액에서 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써 완료된다. 이들 단계는, 낮은 액체 보유 용량 내지 중간 정도의 액체 보유 용량 또는 팽윤도로 확인되는 바와 같이 높은 겔 강도를 가지는 것과 동시에, 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도를 가진 본 발명에 따른 가교된 HA 생성물을 제공한다.

도 1b-1c 및 1e-1f에서 예시되는 바와 같이, 활성화된 HA의 석출은 용액에서의 가교 개시 단계와 가교 완료 단계 사이에 아무 때나 발생할 수 있다. 따라서, 활성화된 HA의 석출은 비결합된 가교제의 제거 전(도 1b, 1e-1f) 또는 비결합된 가교제의 제거 후(도 1c)에 발생될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 또한, 도 1d-1f에서 예시되는 바와 같이, 활성화된 HA의 형상화를 포함할 수 있다. 형상화는 용액에서의 가교 개시와 가교 완료 사이에 아무 때나 발생할 수 있다. 따라서, 형상화는 비결합된 가교제의 제거 전(도 1d, 1f) 또는 비결합된 가교제의 제거 후(도 1f)에 발생될 수 있다. 형상화는 또한, 활성화된 HA의 석출 전(도 1e) 또는 활성화된 HA의 석출 후(도 1f)에 발생될 수 있다.

가교된 HA 생성물은 또한, 추가적인 다운스트림 공정 단계, 예를 들어, 비-석출 조건 하에서의 재팽윤화 및/또는 생성물의 분리 및/또는 멸균화를 받을 수 있다. 예를 들어, 가교된 HA 생성물은 도 2a에 도시된 바와 같이, 비-석출화 조건을 받고, 제조 매질로부터 분리될 수 있다.

가교된 HA 생성물은 또한, 도 2b-2d에 도시된 바와 같이, 멸균화, 예를 들어 오토클레이브를 받을 수 있다. 많은 적용들의 경우, 주입기와 같이 즉시 사용가능한 기기는 도 2c-2d에 예시된 바와 같이 가교된 HA 생성물이 로딩되어 있는 것이 바람직하다. HA 생성물은 기기 내로 로딩되기 전(도 2d), 또는 기기 내로 로딩된 후(도 2c)에 멸균, 예를 들어 오토클레이브될 수 있다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 가교 HA 생성물을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 제조 방법에 의해 생성물이 제조되거나 또는 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 가교 HA 생성물은 겔 또는 하이드로겔이다. 즉, 이는 수-불용성인 것으로 간주될 수 있지만, 액체, 전형적으로 수성 액체에 놓이는 경우, HA 분자의 실질적으로 희석된 가교 시스템인 것으로 간주될 수 있다. 겔은 대체로 중량 기준으로 액체이며, 예를 들어 물을 90-99.9%로 포함할 수 있지만, 겔은 액체 내에서 3차원의 가교된 HA 네트워크로 인해 고체처럼 거동한다. 이의 상당한 액체 함량으로 인해, 성형된 겔은 구조적으로 유연성이 있으며, 천연 조직과 유사하며, 이는 조직 공학에서 스캐폴드로서 매우 유용하며 조직 증대에도 유용하다. HA 사슬의 자연적인 꼬임과 더불어, 겔에 이의 팽윤도와 밀접하게 관련된 특성 및 구조를 부여하는 것은 가교제와, HA 분자에서의 이의 부착 위치이다.

부착된 가교제(들)의 양은 변형도(MoD), 즉, 반복 HA 이당류 유닛의 총 수에 대한 결합된 가교제(들)의 몰량에 의해 정량화되고 보고될 수 있다. 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물의 변형도는 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 90 유닛(0.1-9%), 바람직하게는 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 40 유닛(0.1-4%)인 것이 바람직하다. 가교 반응의 효과는 하나(또는 그 이상)의 HA 사슬에 대해 (적어도) 2개의 말단에서 연결된 부착된 가교제(들)의 양으로 나타나며, 유효 가교제 비율(CrR)로서 보고된다. 이제, CrR은 유리하게는, 가교 반응을 2개의 개별 단계로 나누고, 특히 최종 가교 단계 전에 HA 석출 단계를 포함시킴으로써, 배수 증가될 수 있다는 것이 놀랍게도 실현되었으며 실험적으로 나타났다. 구체적으로는, CrR은 최종 가교 단계에 의해 적어도 1.5배, 바람직하게는 2-10배, 예를 들어 2-6배 증가된다. 본 발명에 따른 생성물은 유효 가교제 비율이 35% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 예컨대 40-80% 또는 심지어 50-80% 범위인 것이 바람직하다. 결과적으로, 이들 생성물은 생성물에서 효과적인 가교를 제공하지 않는, 적은 수의 가교제를 가진다. 높은 유효 가교제 비율은 겔 강도와 관련하여 매우 낮은 총 변형도를 제공하며, 이는 다시, 높은 생체적합성을 보장하는 데 유리하다.

겔의 또 다른 특징은, 겔이 완전히 팽윤될 때까지 물을 흡수하는 능력이다. 액체를 더 첨가한다고 해서 겔을 더 희석시키지는 않을 것인데, 즉, 겔은 자유 분자의 용액처럼 무한정 희석될 수 없다. 겔이 비-석출 조건을 받는 경우, 겔의 팽윤도를 확인하거나, 또는 역으로 이의 최소 농도(C_min), 즉 겔 생성물이 완전히 팽윤될 때의 HA 농도를 확인하는 것 또한, 가능하다. 더 단단한(저 팽윤성) 겔은 일반적으로, 더 연한(고 팽윤성) 겔보다 점성이 더 낮으며, 보다 탄성이고, 생체 내에서 더 긴 반감기를 가질 것으로 예상된다. 그러나, 더 단단한 겔은, 매우 화학적으로 변형되는 경우, 신체에 의해 외래 물질로서 인식될 수 있다. 본 발명에 따른 생성물은 팽윤도가 HA 1 g 당 4 mL 내지 500 mL, 바람직하게는 HA 1 g 당 15-300 mL인 것이 바람직하다. 이는 C_min 값이 0.2-25% (w/w), 즉, 2-250 mg/g, 예컨대 0.3-7% (w/w), 즉, 3-70 mg/g 범위임을 의미한다. C_min 값은 0.3-5% (w/v), 즉, 3-50 mg/mL인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 가교 HA 생성물은 다관능성인 하나 이상의 가교제(들), 즉, 가교될 HA 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 반응 부위를 2개 이상 가진 하나 이상의 가교제(들)로 가교된다. 가교제(들)는 이관능성인 것, 즉, 가교될 HA 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 반응 부위가 2개인 것이 바람직하다. 이로 제한하는 것은 아니지만, 유용한 다관능성 가교제로는, 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드, 예컨대 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄, 바람직하게는 BDDE를 포함한다. HA 겔 생성물은 적절한 안정성을 제공하는 에테르 가교에 의해 가교되는 것이 바람직하다.

성형된 HA 겔 생성물은 다중 가교될 수 있으며, 즉, 바람직하게는 에테르 결합을 포함한, 2개 이상의 서로 다른 유형의 결합을 함유할 수 있다. HA 생성물은 단일 가교되는 것, 즉, 본질적으로 단일 유형의 가교, 바람직하게는 에테르 가교를 포함한, 2개 이상의 서로 다른 유형의 결합을 함유하는 것이 바람직하다. 단일 가교된 생성물은 화학적으로 잘 정의된 이점을 가진다. 단일 유형의 가교를 가진 생성물은 이러한 바람직한 특성을 나타내는 것이 유리하다. 구체적인 구현예에서, HA 생성물은 에테르 가교에 의해 가교되어, 안정하며 오토클레이브가능한 생성물을 제공한다.

생성물의 원하는 팽윤도(또는 C_min 값)는 최소의 변형도로써 달성될 수 있지만, 팽윤도를 조절하는 전형적인 방식은 변형도의 다양화에 의한 것임이 매우 유리하다. 변형도를 최소화하는 주된 이유는, 겔의 생체적합성이 높도록 보장하는 것이지만, 당업자는 다른 이점들도 잘 알고 있다. 성형된 생성물은, 겔의 변형도와 관련하여 높은 C_min 값(낮은 팽윤도)에 의해 특징화된다. 변형 효율(MoE)은, 겔의 강성도 및 강도를 반영하는 최소 HA 농도(C_min)와, 가교제(들)에 의한 겔의 화학적 변형도 사이의 비율의 측정값이다. 본 발명에 따른 가교 HA 생성물은 변형 효율이 2 이상, 바람직하게는 3-500, 예컨대 5-200 또는 7-100 범위이다. 변형 효율이 10 이상, 예컨대 20-190 범위인 생성물은 처음에 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도와 조합되며, 동시에 낮은 팽윤도 내지 중간 정도의 팽윤도 또는 액체 보유 용량과 조합된다. 이로써, 생체적합성이며 높은 변형저항성을 가진, 단단하며 가교된 HA 생성물을 제공하는 것이 가능하다.

더욱이, 본 발명에 따른 가교 HA 겔 생성물은 점탄성인 것이 바람직하다. 이는, 겔 생성물이 점성과 탄성의 조합을 나타냄을 의미한다. 당업자가 잘 알고 있는 바와 같이, 점탄성 특성은 유량계(rheometer)로 확인될 수 있다. 진동 방식에서, 탄성률(G') 및 점성률(G")은 0.1 Hz 또는 1 Hz의 진동수에서 확인될 수 있다. 본 발명에 따른 특정 점탄성 겔 생성물의 경우, 하기 관계식을 충족시키는 것이 바람직하다:

본 발명에 따른 생성물은 선택적으로 중공성이거나 서로 다른 물질 층들을 포함하는, 예정된 물리적 형태 또는 구조, 예컨대 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 또는 비드로 제조될 수 있다. 형상은, HA 기질이 생리학적 식염수에서 팽윤된 형태로 존재할 때, 신장이 5 mm 미만, 바람직하게는 1 mm 미만이며 0.5 mm 초과 또는 심지어 0.8 mm 초과인 것이 바람직하다. 바람직한 형상은 바람직한 형상은 생리학적 식염수에서 완전히 팽윤되었을 때의 크기가 0.1 - 5.0 mm, 예컨대 0.5-1 mm인 입자 또는 비드이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 가교된 HA 겔 생성물은 약물 전달 기기로서 유용하며, 약물 전달 방법에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 가교된 HA 생성물은 피부의 수화 및/또는 활력화에 유용하다. 이를 위해, 생성물은 예를 들어, 피부 내로 주입될 수 있거나, 피부에 적용되는 크림에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 가교 HA 생성물은 미용학적 수술 또는 의학적 수술에 유용하다. 미용학적 수술의 비제한적인 예는 피부 충진술, 인체 윤곽술 및 안면 윤곽술, 특히 안면 윤곽술이다. 의학적 수술의 비제한적인 예는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 정형외과적 적용, 실금 치료, 방관요관역류(vesicoureteral reflux; VUR)의 치료, 및 예를 들어 안과학에서 그리고 조직을 분리한 채 유지시키기 위한 배수용 채널 형성을 포함한다.

일 측면에 따르면, 본 발명은, 본 발명에 따른 가교 HA 생성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 미용학적 수술 또는 의학적 수술을 받는 개체의 치료 방법을 제공한다. 의학적 수술의 비제한적인 예는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 정형외과적 적용, 예를 들어 엉덩이와 관절 치료, 및 예를 들어 안과학에서 그리고 조직을 분리한 채 유지시키기 위한 배수용 채널 형성을 포함한다.

원하는 형상 및 크기는 생성물의 제조 동안에, 즉, 최종적인 가교 전에 기질을 원하는 형상으로 배열함으로써, 배열된다. 원하는 구조 크기를 수득하는 또 다른 적절한 방식은, 가교 HA 겔 생성물을 원하는 농도로 제조한 다음, 겔을 기계적 교란, 예컨대 민싱 처리, 매싱 처리하거나 또는 팽윤된 겔이나 부분적으로 팽윤된 겔 또는 석출된 가교 생성물을 적절한 기공 크기를 가진 필터 또는 메쉬에 통과시키는 단계를 포함한다. 생성되는 겔 입자 또는 조각은 생리학적 염 용액에서 분산되어, 원하는 크기 및 형상의 입자를 가진 겔 분산액 또는 슬러리가 수득된다. 형상에 따라, 겔 구조의 크기는 임의의 적절한 방식, 예컨대 레이저 회절, 현미경, 여과 등에 의해 확인될 수 있으며, 입자의 2개 말단 사이의 최장 거리에 의해 결정된다. 구형 구조의 경우, 이러한 목적을 위해 직경은 크기와 동일하다.

유용한 겔 구조 크기 범위 및 형상은 의도하는 적용에 따라 다르다. 연조직 증대, 바람직하게는 피하 투여, 근육하 투여 또는 골막상(supraperiostal) 투여에 있어서, 생리학적 염 용액으로 처리되는 경우, 크기가 0.1 mm 초과인 겔 입자, 조각 또는 섬유가 유용하다. 본원에서, 용어 "연조직 증대"는 연조직의 임의의 유형의 부피 증대를 지칭하며, 안면 윤곽술(예, 보다 두드러진 뺨 또는 턱), 오목한 기형(concave deformity)의 보정(예, 외상후, HIV 관련 지방위축병) 및 노화와 관련된 깊은 얼굴 주름의 보정을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 연조직 증대는 예컨대 외상 또는 퇴행성 질환 후, 오로지 미용학적 목적 또는 의학적 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들 두 가지 목적은 당업자에 의해 쉽게 구별된다. 본원에서, 용어 "연조직"은 신체의 다른 장기를 연결하거나, 지지하거나 또는 둘러싸는 조직을 지칭한다. 연조직으로는, 근육, 섬유 조직 및 지방을 포함한다. 연조직 증대는 인간을 포함한 임의의 동물에서 수행될 수 있다. 본 방법은 인간에서 수행되는 것이 바람직하다.

본원에서, 용어 "표피하(subepidermal) 투여" 또는 "피내(subcuticular) 투여"는 피부 표피 아래에의 투여를 지칭하며, 진피(dermis), 피하 조직 또는 그보다 더 깊게, 예컨대 근육 아래로의 투여 또는 적용가능한 골막(periosteum)(골조직 주변에 있음) 내로의 투여를 포함한다.

겔 구조물의 투여는 임의의 적절한 방식, 예컨대 표준 캐뉼러 및 적절한 크기의 바늘로부터의 주입, 또는 예를 들어 필름 투여의 경우 수술적 삽입에 의해 수행될 수 있다. 투여는 연조직 증대가 바람직한 곳, 예컨대 턱, 뺨 또는 얼굴이나 신체 어느 부위에서나 수행된다. 안면 윤곽술에 겔 및 겔 구조물을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 임플란트는, 본 발명에 따른 가교 HA 생성물, 예를 들어 크기가 0.1 mm 이상인 HA 겔 구조물, 예컨대 입자, 비드, 섬유 또는 절단된 스트립, 및 선택적으로 완충제 및/또는 장성 제제를 포함하는 수성 조성물일 수 있다. 본 조성물은 전형적으로 생리학적 염 완충제를 포함한다. 본 조성물은 다른 적절한 활성 성분 및 의학적 화합물, 예컨대 국소 마취제(예, 리도카인 하이드로클로라이드), 항염증 약물, 항생제 및 다른 적절한 보조 약제, 예를 들어 골 성장 인자 또는 골 성장 세포를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 가교 HA 생성물 또는 이의 수성 조성물은 사전-충진된 주사기, 즉, 멸균된 가교 HA 생성물 또는 성형된 생성물을 포함하는 멸균된 수성 조성물로 사전-충진된 주사기에서 제공될 수 있다. 선택적으로, 가교 HA 생성물은 주사기, 백 또는 다른 적절한 용기에서 석출된 형태로 유지될 수 있으며, 주입 전에 또는 주입 후 신체에서 이의 비-석출된 형태로 될 수 있다.

팽윤된 또는 부분적으로 팽윤된, 가교 HA 생성물은, 오토클레이브가 최종 생성물을 멸균하는 가장 편리한 방식이기 때문에, 오토클레이브가능한 것이 바람직하다. 이로써, 멸균된, 가교 HA 생성물이 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 겔 구조물, 예를 들어 섬유의 크기는, 겔이 얼마나 팽윤될 수 있었는지와, 겔 구조물에 포함되고/되거나 이를 둘러싸는 완충제, 용액 또는 담체의 이온 강도에 따라 다른 것은 당연하다. 본 명세서 전체에서, 주어진 구조물 크기는 생리학적 조건, 특히 등장성 조건을 취한다. 겔 구조물이 생리학적 염 용액을 포함하고 이 용액에 분산되는 것이 바람직한 한편, 본 발명에 따른 겔 구조물은, 겔 구조물을 또 다른 장성(tonicity), 상이한 pH 용액으로 처리함으로써 상이한 크기로 될 수 있는 것으로 여겨지는 것, 또는 겔 구조물이 이의 최대 크기로 팽윤될 수 없었는지에 주목해야 한다.

본원에서, 생리학적 또는 등장성 용액은 오스몰 농도(osmolarity)가 200-400 mOsm/l, 바람직하게는 250-350 mOsm/l 범위, 보다 바람직하게는 약 300 mOsm/l인 용액이다.

본 발명에 따른 가교 HA 겔 생성물은 안정하지만, 생리학적 조건 하에서 영구적이지 않다. 본 발명에 따른 일 구현예에서, 가교 HA 겔 생성물 중 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상은 시험관 내에서 2주 이상, 보다 바람직하게는 2주 내지 2년 동안 유지된다. 용어 "분해된"은, 매질 중 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만이 신체에 남아 있음을 의미한다.

본 발명에 따른 가교 HA 겔 생성물은 생체 내에서 천연 HA보다 분해에 대해 더욱 저항성일뿐만 아니라, 실시예 8 및 9를 참조로 하면, 상업적으로 입수가능한 가교된 HA 겔 생성물에 대해서도 저항성이다. 안정한 겔 생성물이 연장되어 존재하는 것은, 처치 사이의 시간이 길어지기 때문에, 환자에게 유리하다. 또한, 생성물은, 천연 HA의 높은 생체적합성을 유지하기 위해, 천연 HA와 매우 유사한 것이 중요하다.

정의

본 개시내용 전체에서, 하기 용어들은 하기와 같이 정의된다.

용어	특성	의미
HA		HA는 소듐 히알루로네이트를 지칭한다
겔-형태 HA		겔-형태 HA는, 추출가능한 HA와는 대조적으로, 예를 들어 식염수를 사용한 헹굼에 의해 겔로부터 추출될 수 없는 가교된 HA이다.
추출가능한 HA		추출가능한 HA는 예를 들어 식염수를 사용한 헹굼에 의해 추출될 수 있는, 가교된 HA 또는 비-가교된 HA이다.
C_HA	HA 농도	mg/g, mg/mL, %(w/w), %(w/v)으로 표현된다.
SwD	팽윤도	SwD는 바람직하게는 g/g, mL/g 또는 무치수(dimensionless) 숫자로 표현된다. SwD는, 0.9% 식염수에서 완전히 팽윤된 겔 내의 겔-형태 HA의 농도의 역수이며, 즉, 건조 가교된 HA 1 g 당 형성될 수 있는 완전히 팽윤된 겔의 부피 또는 질량이다. SwD는 생성물의 최대 액체-흡수(0.9% 식염수) 용량을 기술한다.
C_min	최소 HA 농도	0.9% 식염수에서 완전히 팽윤된 겔 내의 겔-형태 HA의 농도로서, 통상 mg/g 또는 mg/mL로 표현된다.
GelC	겔 함량	g/g, 무치수 숫자 또는 %로 표현된다. 겔 함량은 생성물 내 총 HA 함량 중 겔-형태로 결합된 HA의 비율이다.
MoD	변형도	몰/몰, 무치수 숫자 또는 몰%로서 표현된다. MoD는, HA에 결합된 가교제(들)의 양, 즉, 반복 HA 이당류 유닛의 총 몰량에 대한 결합된 가교제(들)의 몰량을 기술한다. MoD는 HA가 가교제(들)에 의해 화학적으로 변형된 정도를 반영한다.
CrR	유효 가교제 비율	여기서, X는 가교제이다. CrR은 또한, 하기와 같이 표현될 수 있다: 몰/몰, 무치수 숫자 또는 몰%로서 표현된다. CrR은, 2개(또는 그 이상)의 이당류(오로지 HA-X-HA)에 결합된 총 결합된 가교제(HA-X-HA 및 HA-X)의 비율을 기술한다.
MoE	변형 효율	MoE는 mg/g으로 표현되는 C_min와, %로 표현되는 MoD 사이의 비율로서 수득되는 무치수 숫자이다. MoE는, 가교제(들)에 의한 화학적 변형의 특정한 비율에서 달성된, 화학적 변형 및 분자적 꼬임 둘 다에 의해 유발되는 상호작용의 양을 기술한다. 예: C_min=35 mg/mL이고 MoD=1.15%인 생성물의 경우 MoE는 약 30이며, 하기와 같이 계산된다:
G'	탄성률	탄성률은 탄성 변형에 대한 겔의 저항성을 기술하며, Pa(파스칼)로 표현된다. 강한 겔은 약한 겔과 비교하여 더 큰 숫자를 제공할 것이다.
G''	점성률	점성률은 점성 변형에 대한 겔의 저항성을 기술하며, Pa(파스칼) 단위로 표현된다. G'와 더불어, 점성률은 변형에 대한 총 저항성을 기술한다.

이로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명은 하기 실시예에서 예시될 것이다.

실시예

분석 방법

HA 농도의 확인

HA 함량의 확인 방법은 Ph. Eur. 1472에 기술된 소듐 히알루로네이트에 대한 분석 시험으로부터 채택된다. 이 방법의 원리는, 황산에서 가열에 의해 형성되는 푸르푸랄 유도체의 축합 반응은 카르바졸 시약을 사용하여 발생하여, 보라색 생성물을 형성한다는 것이다. 이 반응은 HA의 D-글루쿠론산 부분에 특이적이다. 흡광도를 530 nm에서 측정하고, 글루쿠론산을 표준화에 사용한다.

샘플 내 D-글루쿠론산(GlcA)의 함량으로부터 형성된 생성물을 카르바졸과의 반응으로 확인한다. 균질한 샘플 용액을 얻기 위해, HA의 안정화된 겔을 70℃에서 황산으로 분해하고, 0.9% NaCl-용액으로 희석시킨다. 용액을 95℃에서 황산과 혼합한 다음, 카르바졸 시약과 혼합한다. 반응에 의해 보라색 용액이 수득된다. 색상의 강도는 530 nm에서 비색계(colorimeter)로 측정하고, 각각의 샘플의 흡광도는 GlcA-함량에 정비례한다. HA 함량을 각각의 샘플 내 GlcA-함량으로부터 계산한다.

겔 함량(GelC)의 확인

GelC는 겔 형태로 결합된 총 HA의 비율을 %로 기술한다. 겔 함량은 0.22 ㎛ 필터를 통과하지 못한 샘플에서 HA의 양으로서 정의된다. GelC는 여과물, 본원에서 지칭되는 추출가능한 HA에 수집된 HA의 양으로부터 계산된다. 겔 함량 및 추출가능한 HA 함량은 겔 샘플 내 HA의 총량의 %로 제공한다. 간략하게는, 겔 함량은, 특정 양의 겔 샘플을 시험 튜브에서 0.9% NaCl과 혼합함으로써 확인한다. 겔이 팽윤되도록 놔두며, 이후 NaCl-상을 0.22 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 겔-상으로부터 분리한다. 여과물에서 HA의 농도는, HA 농도의 확인 절차에 따라 확인한다.

팽윤도( SwD )의 확인

SwD는 HA 하이드로겔 생성물의 액체-흡수력, 즉, 0.9% NaCl을 흡수하는 능력을 기술하며, HA 1 g 당 생성되는 완전히 팽윤된 겔의 중량(g)으로서 보고된다. 생성물은 전형적으로 부분적으로 팽윤된 가교된 HA 겔이지만, 건조 상태로도 존재할 수 있다. SwD는 팽윤 인자(SwF)로부터 확인될 수 있다. SwF는, 측정 실린더에서 부분적으로 팽윤된 생성물의 특정 중량(w)을 팽윤시킬 때 형성되는 완전히 팽윤된 겔의 부피(V)로서 측정되며, 하기와 같이 계산된다:

그런 다음, SwD는 하기와 같이 계산된다:

여기서, [HA]는 부분적으로 팽윤된 겔의 HA 농도(g/mL gel)이며, GelC는 겔 함량(%)이다. GelC는, 겔의 팽윤에 기여하지 않을 추출가능한 HA 함량에 대해 보정을 위해 식에 포함된다. 완전히 팽윤된 겔의 밀도는 1.0 g/mL인 것으로 가정된다.

주목하게는, 더 강한 겔은 더 낮은 SwD를 가질 것이며, 한편 더 약한 겔은 더 높은 SwD를 가질 것이다.

최소 농도( C _min )의 확인

C_min(또는 c_min)은 모든 추출가능한 HA를 제거한 후, 0.9% NaCl에서 완전히 팽윤된 가교된 HA 겔 생성물 내의 겔-형태 HA의 농도를 기술한다. 생성물은 더 이상 액체를 흡수할 수 없기 때문에, 이 농도는, 이러한 특정 겔 생성물에 대해 수득될 수 있는 최소 HA 농도이다. 주목하게는, 더 강한 겔은 더 높은 C_min을 가질 것이며, 한편 더 약한 겔은 더 낮은 C_min을 가질 것이다.

C_min(mg/mL 또는 mg/g)은 하기 관계식을 사용하여, 전술한 바와 같이 SwD의 확인과 유사하게 확인된다:

.

변형도(MoD)의 확인

MoD는 반복 HA 이당류 유닛의 총수에 대한 결합된 가교제(들)의 몰량을 기술한다. 이러한 측정은 모노연결된 가교제(들)와 실제로 가교된 가교제(들)를 구별하지 못하며, 즉, 하나 이상의 공유 결합을 통해 HA에 결합된 모든 가교제(들)가 포함된다. 예를 들어, BDDE로 가교된 HA 겔의 경우 1%의 MoD는, HA 겔에서 100개 이당류 유닛 당 BDDE의 결합된(모노연결된 또는 가교된) 분자가 1개 존재함을 의미한다.

MoD는 효소적으로 분해된 겔 생성물 상에서 NMR 분광학을 이용하여 확인한다. 가용성 HA, 잔여(비-결합된) 가교제(들) 및 이들의 유도체는 0.22 ㎛ 필터 상에서의 여과에 의해 겔 분해 전에 세정되어 제거된다. 겔 생성물은 37℃에서 아스로박터 아우레센스(Arthrobacter aurescens) 유래의 콘드로이티나제 AC를 사용한 효소적 처리에 의해 분해된다. 분해된 겔 생성물을, 표준 5 mm 프로브가 구비된 500 MHz 분광계 상에서의 1차원적 ¹H NMR 스펙트럼을 기록함으로써 NMR 분광학 처리한다.

NMR 스펙트럼은 연결된 BDDE 분자 중의 4개 양성자로부터 기원되는 δ_H 1.6 ppm에서의 신호와, HA 이당류의 N-아세틸글루코사민 잔기 상의 CH₃ 기의 3개 양성자로부터 기원되는 δ_H 2.0 ppm에서의 신호를 적분함으로써 평가한다. 이들 2개 신호에 대한 적분값들 사이의 비율은, 각각의 신호에 관여하는 양성자의 신호에 대한 보정 후, 결합된 BDDE의 몰량과 이당류의 몰량 사이의 비율에 비례하며, MoD가 수득된다.

변형 효율(MoE)의 확인

MoE는 최소 HA 농도와 겔의 변형도 사이의 비율, 즉:

이다.

C_min (mg/g 또는 mg/mL) 및 MoD (%)는 전술한 바와 같이 확인된다. C_min은 겔으 강도와 밀접하게 관련되어 있기 때문에, MoE는, 가교 절차가, 원하는 강도의 겔을 생성하는 데 있어서 얼마나 효율적인지의 측정값이다. MoE가 높은 공정은 높은 C_min 및 낮은 MoD를 가진 겔을 생성할 것이며, 즉, HA의 제한된 화학적 변형에도 불구하고, 강한 겔이 생성된다.

유효 가교제 비율( CrR )의 확인

CrR은, 2개(또는 그 이상)의 이당류(HA-X-HA)를 결합시킨, 총 결합된 가교제(들)(HA-X-HA 및 HA-X)의 비율을 기술한다:

여기서, X는 가교제이다.

이 방법은, 아스로박터 아우레센스 유래의 콘드로이티나제 AC 또는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris ) 유래의 콘드로이티나제 AB를 사용하여 HA 겔을, 주요 이당류로 이루어진 단편(△di-HA)과, 1-8개의 이당류를 함유하는 결합된 가교제를 가진 단편(HA-X)으로 분해한 후, LC-MS를 이용한 HA-X 단편들의 확인을 토대로 한다. 단편들을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리하고, 질량 분광법(MS)을 이용하여 검출한다. 각각의 단편 그룹에 대한 피크 영역을 합하고, CrR을 하기와 같이 계산한다:

모든 유형의 HA-X 단편들은 MS 검출기에서 동일한 반응을 가지는 것, 즉, 특정 피크 영역은 모든 유형의 HA-X 단편들에 대해 주어진 몰량에 상응하는 것으로 가정된다(Kenne et al., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418).

CrR의 확인 시, 에테르 연결에 의해 결합된 BDDE를 포함하는 것에 오로지 주의를 기울여야 한다. 가교 동안의 조건에 따라, BDDE는 에테르 연결 및 에스테르 연결 둘 다를 통해 HA에 결합될 수 있다. 에스테르 연결은 쉽게 가수분해되기 때문에, 겔 강도 및 장기간 저장에 기여할 것은 오로지 에테르-결합된 BDDE이다. 에스테르-결합된 BDDE를 가진 단편은 에테르-결합된 BDDE와 동일한 질량을 가지지만, 약간 상이한 크로마토그래피 체류 시간을 가지기 때문에 검출될 수 있다. 임의의 에스테르-결합된 BDDE가 없는 CrR을 확인하기 위해서는, 샘플을 분석 전에 가수분해시켜야 한다. 샘플의 가수분해는 예를 들어, 효소적 분해 전 또는 후에, 염기를 첨가하고/거나 열을 가함으로써 수행될 수 있었다.

현재, CrR의 확인 방법이 예시적인 실시예에서와 같이 BDDE 가교된 HA를 사용하는 것으로 기술되어 있지만, 가교제와 다당류의 이러한 특정 조합으로 제한되는 것은 결코 아니다. 본 방법은, (Kenne et al., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418)에서 언급된 원리를 이용하고, 사용되는 특정 가교제에 대한 LC-MS 획득 방법에서 HA-X 및 HA-X-HA 단편의 질량을 보정/조정함으로써, 임의의 다른 다관능성 가교제에 대해 쉽게 조정될 수 있다.

유동측정

진동 방식의 유동측정을 사용하여, 팽윤된 겔 생성물의 점탄성을 확인하였다. 탄성률(G')은 탄성 변형에 대한 겔의 물리적 저항성의 측면에서 겔 강도를 기술한다. 점성률(G'')은 점성 변형에 대한 겔의 물리적 저항성의 측면에서 겔 강도를 기술한다. 측정은 진동 유량계를 사용하여 수행된다.

유동측정은 하기와 같이 수행한다. 진동수 스윕(frequency sweep)을, 샘플 로딩과 측정 사이에 적어도 15분의 휴식 시간과, 0.1%의 스트레인(strain)(g)을 두고 만든다. 직경이 25 mm인 평행판 프로브를 1 mm 또는 2 mm 간격을 두고 사용한다. 탄성률(G') 및 점성률(G'')의 평균값을 진동수 스윕으로부터 0.1 Hz 및 1 Hz에서 평가한다. 선형 점탄성 범위 내에서의 스트레인(g)에서 진동수 스윕이 수행되었는지 입증하기 위해, 진폭 스윕(amplitude sweep)을 1 Hz에서 만든다.

실시예

실시예 1 - 가교 공정

1 g HA을 7 g 0.25 M NaOH에 용해시켰다. HA를 용해시킨 후, 0.2 g 0.25 M NaOH와 혼합된 50 mg BDDE를 첨가하였다. 가교 개시 반응을 50℃에서 2시간 동안 이루어지도록 하였다. 활성화된 HA를 금속 메쉬를 통해 통과시키고, 단기간 동안 30 g 물에서 팽윤되도록 하였다. 팽윤된 겔을 에탄올에서 석출하고, 에탄올/물/NaOH 혼합물로 3회 세정하였다. 가교는 에탄올과 NaOH의 용액에서 50℃에서 2시간 동안 완료되도록 하였다. 에탄올 농도는 약 70 중량%였으며, NaOH 농도는 50 mM이었다. HCl을 사용하여 겉보기 pH 7로 중화시켰다. 석출물을 세정하고 건조하였다.

생성되는 건조 분말을 완충된 0.9% NaCl에서 20 mg/mL의 HA 농도의 겔로 팽윤되도록 하였다. 겔을 주사기에 충진시키고, 오토클레이브하였다.

참조 겔은, 석출 및 에탄올 혼합물에서의 최종 가교 없이, 상기 방법을 이용하여 제조하였다.

MoD 및 CrR을 분석하였다. 두 겔 모두 MoD가 3.4%였다. 참조용 CrR은 0.1이었으며, 이는 석출된 형태에서 최종적으로 가교되었던 겔보다 3배 더 높았다.

실시예 2 - 비교 실험

가교된 HA 생성물을 4개의 서로 다른 방법 A-D으로 제조하였다:

(A): 가교된 HA 필름을 WO 87/07898의 실시예 24에 따라 제조하였다. 소듐 히알루로네이트 (3% w/v)를 0.75% (v/v) NaOH와 혼합하였다. 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)를 0.22% (w/v)의 농도로 첨가하고, 24시간 동안 반응시켰다. 혼합물을 진행 증류수에 대해 24시간 동안 투석시켰다. 암모니아 (25% v/v)를 투석된 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 폴리스티렌 페트리 디쉬에 부었다. 이를 실온에서 2일 동안 건조시켰다. 투명하고 편평하며 수-불용성인 필름이 수득되었다. 그런 다음, 필름을 입자로 분할하고, 식염수에서 팽윤시키고, 주사기에 충진한 다음, 오토클레이브하였다.

변이체 (B) 내지 (D)는 변이체 (B)에 상응하는 WO 87/07898에 기술된 바와 같은 건조 공정과 변이체 (C) 및 (D)에서 석출 단계를 포함하는 본 발명에 따른 보다 효과적인 가교 공정들 사이에 어떤 차이가 있는지 알아보기 위하여 제조하였다. 변이체 (B)-(D) 모두에서 동일한 MoD가 달성되었다.

(B): 제1 가교 단계는 0.22% 농도의 BDDE 및 0.75% 농도의 NaOH를 사용하였다. 투석, 암모니아의 첨가 및 건조를 변이체 (A)에서와 같이 수행하였다. 생성되는 필름은 변이체 (A)와 유사하게 보였으며, 동일한 방식으로 처리하였다. 생성되는 입자를 식염수에서 팽윤시키고, 주사기에 충진한 다음, 오토클레이브하였다.

(C): 변이체 (B)에서와 같은 제1 가교. 투석을 변이체 (A)에서와 같이 수행하였다. 겔을 에탄올에서 석출한 다음, 제2의 최종 가교를 70% EtOH와 0.23% NaOH의 수용액 중에서 수행하였다. 입자를 식염수에서 팽윤시키고, 주사기에 충진한 다음, 오토클레이브하였다.

(D): 변이체 (C)에서와 같은 제조 공정이지만, 투석 단계를, 석출 후 임의의 미반응된 가교제 분자를 제거하기 위한 세정 단계로 대체하였다.

유효 가교제 비율 (CrR)을 표 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 시험 A-D로부터 생성되는 HA 입자에 대해 확인하였다.

표 1
분석	샘플
분석	A	B	C	D
CrR	0.1	0.2	0.5	0.6

실험 A 및 B의 건조 단계를 석출된 형태 (C-D)의 HA의 최종 가교로 대체하면, MoD를 증가시키지 않고도 CrR을 6배까지 급격하게 증가시킨다고 결론내릴 수 있다. 이는, 공유 혼입된 가교제 대부분이 HA의 실제 가교에 관여하기 때문에, 총 가교 공정의 효율이 크게 증강됨을 의미한다. 또한, 실험 A-C의 투석을 석출된 형태 (D)의 HA의 세정으로 대체하면, 마찬가지로 MoD를 증가시키지 않고도 CrR을 더 증가시키는 것이 명백하다.

실시예 3 - 가교 개시 단계에서 가교제의 농도

BDDE를 가진 가교 HA의 개시 단계를 수행하였다. 참조 샘플(Ref)에서, 석출된 HA의 추가적인 석출 단계 또는 가교를 수행하지 않았다. 하기의 샘플들을 또한 제조하였다:

(A): BDDE 및 HA 농도는 참조와 동일하였으나, 석출된 형태의 활성화된 HA의 가교가 동반되었다.

,(B): A와 동일하지만, BDDE = 2/3*A

(C): A와 동일하지만, BDDE=1/3*A

가교 완료 단계는 50 mM NaOH를 함유하는 70% EtOH에서 23℃에서 45 h 동안 발생하였다. 각 샘플의 입자를 식염수에서 팽윤시키고, 주사기에 충진한 다음, 오토클레이브하였다. 변형도 (MoD), 유효 가교제 비율 (CrR), 팽윤도 (SwD) 및 겔 함량을, 표 2에 나타낸 바와 같이, 각각의 실험 A-D로부터 생성되는 HA 입자에 대해 확인하였다.

표 2
분석	샘플
분석	Ref	A	B	C
MoD	1.0	1.0	0.7	0.4
CrR	0.2	0.6	0.6	0.6
SwD	130	50	110	240
겔 함량	85	98	90	75

변이체 (A)에 가교 완료 단계를 포함시키면, 참조 샘플보다 더 강한 겔(더 낮은 팽윤도) 및 더 높은 CrR이 수득됨이 명백하다. 가교 개시 단계에서 감소된 가교제의 농도는 높은 CrR을 유지시키며, 보다 느슨한 겔(더 높은 팽윤도)을 제공하지만, 겔 함량은 감소한다.

실시예 4 - 가교 완료 단계에서의 pH

(A): NaOH의 첨가 없이, 70% EtOH, 23℃에서 45 시간 동안 가교 완료 단계.

(B): 50 mM NaOH를 함유하는 70% EtOH, 23℃에서 45 시간 동안 가교 완료 단계.

각 실험의 입자를 식염수에서 팽윤시키고, 주사기에 충진한 다음, 오토클레이브하였다. 변형도 (MoD), 유효 가교제 비율 (CrR), 팽윤도 (SwD) 및 겔 함량을, 표 3에 나타낸 바와 같이, 각각의 실험 A-C로부터 생성되는 HA 입자에 대해 확인하였다.

표 3
분석	샘플
분석	Ref	A	B
MoD	0.9	0.9	1.0
CrR	0.2	0.3	0.6
SwD	130	110	50
겔 함량	87	95	98

석출된 형태 (A-B)의 HA의 최종 가교는, 특히 NaOH를 첨가하였을 때(B), MoD를 증가시키지 않고도 CrR을 증가시키는 것으로 나타난다. 또한, 생성되는 생성물의 겔 함량은 석출된 형태의 HA의 최종 가교 시 증가하며, 이는, 이것이 총 가교 공정의 효율을 증강시킴을 가리킨다.

실시예 5 - 가교 완료 단계에서 석출물의 농도 및 pH

BDDE를 가진 가교 HA의 개시 단계를 수행하였다. 참조 샘플(Ref)에서, 석출된 HA의 추가적인 석출 단계 또는 가교를 수행하지 않았다. 샘플 A-E를, 표 4에 나타낸 바와 같이, 60-90% (vol/vol) EtOH 및 30-70 mM NaOH를 이용한 가교 완료 단계로써 23℃에서 45 h 동안 제조하였다.

각 실험의 입자를 식염수에서 팽윤시키고, 주사기에 충진한 다음, 오토클레이브하였다. 변형도 (MoD) 및 유효 가교제 비율 (CrR)을, 표 4에 나타낸 바와 같이, 각각의 실험 A-E로부터 생성되는 HA 입자에 대해 확인하였다.

표 4
파라미터	샘플
파라미터	Ref	A	B	C	D	E
EtOH (%)	NA	60	70	70	70	90
NaOH (mM)	NA	50	30	50	70	50
MoD	0.6	0.6	0.7	0.6	0.6	0.7
CrR	0.24	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6

유효 가교제 비율은 가교 완료 단계에서 석출물(에탄올) 농도 및 pH (NaOH 농도)와는 독립적인 것으로 결론내려진다.

실시예 6 - 가교 완료 단계에서 시간 및 온도

BDDE를 가진 가교 HA의 개시 단계를 수행하였다. 참조 샘플(Ref)에서, 석출된 HA의 추가적인 석출 단계 또는 가교를 수행하지 않았다. 활성화된 HA를 석출시키고, 70% EtOH 및 50 mM NaOH, 23℃ 또는 35℃에서 가교 완료 단계를 수행한 다음, a48시간 이하 동안 진행시켰다. 생성되는 입자를 식염수에서 팽윤시키고, 주사기에 충진한 다음, 오토클레이브하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 유효 가교제 비율을, 서로 다른 반응 시간 및 온도로부터 생성되는 HA 입자에 대해 확인하였다. 유효 가교제 비율은 온도에 의해 특별히 영향을 받지 않으며, 20 시간 미만 후, 안정기(plateau)에 도달하는 것으로 결론내려진다.

실시예 7 - 상업적으로 입수가능한 HA- 겔(비교예)의 가교제 비율 ( CrR )

많은 상업적으로 입수가능한 겔에 대한 CrR을 상기 분석 방법 부문에서 나타낸 바와 같이 확인하였다.

표 5
제품	공급업체	CrR
Restylane	Q-Med/Galderma	~ 0.2
Yvoire Classic	LG	~ 0.3
Teosyal Deep Lines	Teoxane	~ 0.1
Juvederm Ultra 2	Allergan	~ 0.1
Esthelis Basic	Anteis	~ 0.1
Stylage M	Vivacy	~ 0.1
Juvederm Voluma	Allergan	~ 0.1
Emervel Classic	Galderma	~ 0.1

비교로서, 본 발명에 따른 가교된 HA 생성물은 0.35 이상의 CrR, 예컨대 0.35-0.8 범위의 CrR을 나타낸다. 본 발명에 따른 제조 방법은 높은 CrR 값을 가진 새로운 범위의 HA 겔 생성물을 제공하는 것으로 결론내려진다.

실시예 8 - HA 겔의 열분해율

열분해율을, 상기 실시예 3B에 따라 제조된 HA 겔 샘플에 대해 확인하였다. 참조로서, Q-Med/Galderma 사의 상업적으로 입수가능한 생성물 Restylane을 사용하였다. 실험을 2벌 중복으로 수행하였다. 샘플의 CrR은 0.6이었으며, 참조의 CrR은 0.2였다.

샘플 및 참조를 바이얼에 옮기고, 90℃에서 보관하였다. 서로 다른 시점에서, 하나의 샘플 바이얼과 하나의 참조 바이얼을 실온으로 냉각시킨 다음, 겔 함량을 분석하였다. 열-유도성 겔 분해 결과를 도 4에 도시하며, 여기서, 실시예 3B에 따라 제조된 샘플의 값은 기호 (▲)로 표시하고, 상응하는 Restylane 참조 값은 기호 (x)로 표시한다.

분해율은 참조와 비교하여 높은 CrR을 가진 샘플에서 약 2배 더 느린 것으로 결론내려진다. 따라서, 실시예 3B에 따라 제조된 겔은 생체 내에서의 예상 수명(expected duration)이 참조의 예상 수명보다 약 2배 더 길 것이다.

실시예 9 - HA 겔의 퍼옥시 라디칼-유도성 분해율

겔 샘플을 실시예 6에 따라 제조하였다. 가교 완료 단계의 온도는 24시간 동안 35℃였다. 참조로서, Q-Med/Galderma 사의 상업적으로 입수가능한 생성물 Restylane을 사용하였다. 샘플의 CrR은 0.5였으며, 참조의 CrR은 0.2였다.

겔과 참조 샘플에 대해 라디칼 분해율을 확인하였다. 실험은 2벌 중복으로 수행하였다. 라디칼 분해율은, 10 ml 인산염 완충액에 겔 0.25 g을 분산시킴으로써 확인하였다. 라디칼 발생제인 2,2'-아조비스-2-메틸-프로판이미드아미드, 다이하이드로클로라이드를 10 mM의 농도로 첨가하였으며, 반응을 37℃에서 수행하였다. 상층액의 HA 함량을 서로 다른 시점에서 확인하였다. 겔 함량을 겔의 개시 중량 및 서로 다른 시점에서의 상층액 중의 HA 함량으로부터 계산하였다. 퍼옥시 라디칼-유도성 분해 결과를 도 5에 도시하며, 여기서, 실시예 6에 따라 제조된 샘플 겔의 값은 기호 (■)로 표시하고, 상응하는 Restylane 참조 값은 기호 (x)로 표시한다.

분해율은 참조와 비교하여 높은 CrR을 가진 샘플에서 약 2배 더 느린 것으로 결론내려진다. 따라서, 실시예 6에 따라 제조된 겔은 생체 내에서의 예상 수명이 참조의 예상 수명보다 약 2배 더 길 것이다.

Claims

가교된 히알루론산(HA) 생성물의 제조 방법으로서,
(a) HA를 수용액 중에서 하나 이상의 다관능성 가교제와 반응시킴으로써 HA의 가교를 개시하여, 활성화된 HA를 수득하는 단계;
(b) 상기 활성화된 HA로부터 미반응된 가교제(들)를 제거하는 단계; 및
(c) 부가적인 가교제의 첨가 없이, 상기 활성화된 HA를 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써, 활성화된 HA의 가교를 완료하여, 가교된 HA 생성물을 수득하는 단계를 포함하며;
상기 가교 완료 단계 (c)는 액체 석출 매질(liquid precipitating medium) 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 제거 단계 (b)가,
(b1) 상기 활성화된 HA를 액체 석출 매질에서 석출하여, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계; 및
(b2) 미반응된 가교제(들)를 상기 석출된, 활성화된 HA를 포함하는 현탁액으로부터 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제2항에 있어서,
상기 제거 하위단계 (b2)가 상기 석출된, 활성화된 HA를 액체 석출 매질로 세정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 가교 완료 단계 (c)가,
(c1) 상기 활성화된 HA를 액체 석출 매질에서 석출하여, 액체 석출 매질 및 석출된 형태의 활성화된 HA를 포함하는 현탁액을 수득하는 단계; 및
(c2) 부가적인 가교제의 첨가 없이, 상기 석출된, 활성화된 HA 현탁액을 추가적인 가교 조건으로 처리함으로써, 활성화된 HA의 가교를 완료하여, 가교된 HA 생성물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액체 석출 매질이 수용성 유기 용매를 65 중량% 초과로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제5항에 있어서,
상기 수용성 유기 용매가 에탄올인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가교 개시 단계 (a)가 활성화된 HA를 겔 형태로 제공하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가교제가 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제72항에 있어서,
상기 가교제가 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(d) 상기 단계 (c)에서 수득된 석출된 가교 HA 생성물을 비-석출 조건으로 처리하는 단계; 및
(e) 상기 가교된 HA 생성물을 비-석출된 형태로 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가교된 HA 생성물을 멸균하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
유효 가교제 비율(effective cross-linker ratio)이 35% 이상인, 가교된 HA 생성물.
제12항에 있어서,
팽윤도(swelling degree)가 HA 1 g 당 4 mL 내지 500 mL인 것을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.
피부 충진술, 인체 윤곽술 및 안면 윤곽술과 같은 미용학적 수술용으로서의, 제12항 또는 제13항에 따른 가교된 HA 생성물의 용도.
제12항 또는 제13항에 있어서,
피부 충진술, 인체 윤곽술 및 안면 윤곽술과 같은 미용학적 수술, 또는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 채널 형성, 실금 치료 및 정형외과적 적용과 같은 의학적 수술에서, 약제 또는 의료 기기로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 가교된 HA 생성물.